PL206384B1 - Izolowany polinukleotyd z bakterii maczugowatych i izolowany polinukleotyd o sekwencji komplementarnej, ich zastosowanie, zawierające je wektor i bakteria oraz sposób wytwarzania L-aminokwasów - Google Patents

Izolowany polinukleotyd z bakterii maczugowatych i izolowany polinukleotyd o sekwencji komplementarnej, ich zastosowanie, zawierające je wektor i bakteria oraz sposób wytwarzania L-aminokwasów

Info

Publication number
PL206384B1
PL206384B1 PL346563A PL34656300A PL206384B1 PL 206384 B1 PL206384 B1 PL 206384B1 PL 346563 A PL346563 A PL 346563A PL 34656300 A PL34656300 A PL 34656300A PL 206384 B1 PL206384 B1 PL 206384B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
seq
gene
leu
ala
glu
Prior art date
Application number
PL346563A
Other languages
English (en)
Other versions
PL346563A1 (en
Inventor
L. K. Dunican
Ashling Mccormack
Cliona Stapelton
Kevin Burke
Bernd Moritz
Lothar Eggeling
Hermann Sahm
Bettina Möckel
Anke Weissenborn
Original Assignee
Degussa
Nat Univ Ireland
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Degussa, Nat Univ Ireland filed Critical Degussa
Publication of PL346563A1 publication Critical patent/PL346563A1/xx
Publication of PL206384B1 publication Critical patent/PL206384B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1022—Transferases (2.) transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 346563 (22) Data zgłoszenia: 05.07.2000 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
05.07.2000, PCT/EP00/006300 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
18.01.2001, WO01/04322 (11) 206384 (13) B1 (51) Int.Cl.
C12N 1/21 (2006.01) C12N 9/04 (2006.01) C12N 15/53 (2006.01) C12P 13/06 (2006.01) C12P 13/08 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) C12R 1/15 (2006.01)
Izolowany polinukleotyd z bakterii maczugowatych i izolowany polinukleotyd (54) o sekwencji komplementarnej, ich zastosowanie, zawierające je wektor i bakteria oraz sposób wytwarzania L-aminokwasów (30) Pierwszeństwo:
09.07.1999, US, 60/142,915 20.03.2000, US, 09/531,267 (43) Zgłoszenie ogłoszono:
11.02.2002 BUP 04/02 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
31.08.2010 WUP 08/10 (73) Uprawniony z patentu:
Evonik Degussa GmbH, Essen, DE NATIONAL UNIVERSITY OF IRELAND, Galway, IE (72) Twórca(y) wynalazku:
L. K. DUNICAN, Zmarł, IE ASHLING MCCORMACK, Athlone, IE CLIONA STAPELTON, Roscrea, IE KEVIN BURKE, Galway, IE
BERND MORITZ, Bochum, DE
LOTHAR EGGELING, J^ich, DE HERMANN SAHM, J^ich, DE BETTINA MOCKEL, Dϋsseldorf, DE ANKE WEISSENBORN, ^bingen, DE (74) Pełnomocnik:
rzecz. pat. Magdalena Tagowska
PL 206 384 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są izolowany polinukleotyd z bakterii maczugowatych i izolowany polinukleotyd o sekwencji komplementarnej, ich zastosowanie, zawierające je wektor i bakteria oraz sposób wytwarzania L-aminokwasów.
Rozwiązania według wynalazku wykorzystują sekwencje nukleotydowe genu opcA oraz sposoby fermentacyjnego wytwarzania aminokwasów, zwłaszcza L-lizyny, przez zastosowanie bakterii maczugowatych, w których wzmocniono gen opcA.
Aminokwasy, zwłaszcza L-lizyna, znajdują zastosowanie w medycynie i przemyśle farmaceutycznym. Są one szczególnie użyteczne w żywieniu zwierząt.
Wiadomo, że aminokwasy można wytwarzać przez fermentację szczepów bakterii maczugowatych (ang. coryneform bacteria), zwłaszcza Corynebacterium glutamicum. Z powodu ich dużego znaczenia, wciąż prowadzone są prace nad ulepszaniem tych sposobów wytwarzania. Ulepszenia tych sposobów mogą dotyczyć procesu fermentacji, np. mieszania i dostarczania tlenu, lub składu pożywek hodowlanych, np. stężenia cukru podczas fermentacji, lub obróbki produktu przez np. chromatografię jonowymienną, lub wewnętrzne właściwości samych mikroorganizmów.
W celu polepszenia właściwości produkcyjnych mikroorganizmów, stosuje się sposoby mutagenezy, selekcji i wyboru mutantów. Otrzymuje się w ten sposób szczepy odporne na antymetabolity, jak np. analog lizyny S-(2-aminoetylo)-cysteinę, albo takie, które są auksotroficzne wobec regulatorowo istotnych metabolitów i wytwarzają L-aminokwasy, np. L-lizynę. Na przestrzeni lat stosowano również techniki rekombinowanego DNA w celu ulepszania szczepów Corynebacterium, które wytwarzają aminokwasy.
Znana jest istotność cyklu fosforanu pentozy dla biosyntezy.
Tak więc, Oishi i Aida (Agricultural and Biological Chemistry, 29: 83-89 (1965)) donoszą o „przenoszeniu monofosforanu heksozy” w Brevibacterium ammoniagenes. Sugimoto i Shio (Agricultural and Biological Chemistry, 51: 101-108 (1987)) donoszą o regulacji dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej w Brevibacterium flavum. Sugimoto i Shio (Agricultural and Biological Chemistry, 51: 1257-11263 (1987)) donoszą o regulacji dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej w Brevibacterium flavum.
JP-A-09224661 ujawnia sekwencję nukleotydową genu dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, zwanego zwf, z Brevibacterium flavum MJ-223 (FERM BP-1497). JP-A-09224661 opisuje sekwencję aminokwasową końca N polipeptydu Zwf jako Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu.
Jednakże, nie było możliwe potwierdzenie powyższych informacji.
Celem wynalazku jest opracowanie nowych środków do fermentacyjnego wytwarzania aminokwasów, w szczególności L-lizyny.
Aminokwasy, zwłaszcza L-lizyna, znajdują zastosowanie w medycynie, przemyśle farmaceutycznym oraz w żywieniu zwierząt. Stąd powszechne jest zainteresowanie nowymi ulepszonymi sposobami wytwarzania aminokwasów, w szczególności L-lizyny.
W znaczeniu tu zastosowanym, określenie L-lizyna albo lizyna obejmuje nie tylko zasady, ale również ich sole, takie jak np. monochlorowodorek lizyny albo siarczan lizyny. Przedmiotem wynalazku jest izolowany polinukleotyd bakterii maczugowatych kodujący polipeptyd o sekwencji aminokwasowej, która jest przynajmniej w 90%, korzystnie w 95% identyczna na całej długości sekwencji z sekwencją aminokwasową z Id. Sekw. nr 3 i Id. Sekw. nr 8, przy czym polipeptyd stanowi podjednostkę OpcA enzymu dehydrogenazy glukozo 6-fosforanowej. Korzystnie koniec N polipeptydu kodowanego przez polinukleotyd według wynalazku ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w Id. Sekw. nr 12. Również korzystnie polipeptyd kodowany przez polinukleotyd według wynalazku ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w Id. Sekw. nr 3 lub Id. Sekw. nr 8. Korzystniej izolowany polinukleotyd według wynalazku ma sekwencję nukleotydową przedstawioną w Id. Sekw. nr 4 lub Id. Sekw. nr 9 lub sekwencję nukleotydową przedstawioną w Id. Sekw. nr 1 lub Id. Sekw. nr 6. Ponadto korzystniej izolowany polinukleotyd według wynalazku jest RNA.
Przedmiotem wynalazku jest także izolowany polinukleotyd, który ma sekwencję nukleotydową w pełni komplementarną do polinukleotydu według wynalazku określonego powyż ej.
Wynalazek dotyczy także wektora obejmującego polinukleotyd według wynalazku oraz bakterii maczugowatej, korzystnie z gatunku Corynebacterium glutamicum, transformowanej przez wprowaPL 206 384 B1 dzenie tego wektora. Również korzystnie bakteria według wynalazku zawiera zintegrowane w chromosomie wielokrotne kopie polinukleotydów według wynalazku.
Polinukleotydy według wynalazku mogą zasadniczo obejmować sekwencje polinukleotydowe możliwe do uzyskania metodą hybrydyzacji w badaniu przesiewowym odpowiadającej biblioteki genów, która zawiera pełny gen obejmujący sekwencję polinukleotydową odpowiadającą Id. Sekw. nr 4 albo Id. Sekw. nr 9, przy użyciu sondy zawierającej sekwencję wskazanych polinukleotydów o Id. Sekw. nr 4 albo Id. Sekw. nr 9 albo ich fragmenty, oraz przez izolowanie wskazanej sekwencji DNA.
Sekwencje polinukleotydowe według wynalazku nadają się do stosowania jako sondy hybrydyzacyjne dla RNA, cDNA i DNA, w celu izolowania cDNA pełnej długości, kodującego białko OpcA, oraz izolowania takich cDNA albo genów, które wykazują duże powinowactwo sekwencji z genem opcA.
Sekwencje polinukleotydowe według wynalazku nadają się ponadto do zastosowania jako startery do wytwarzania DNA z genów, które kodują białko OpcA, przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR).
Przedmiotem wynalazku jest zatem zastosowanie sekwencji polinukleotydowych według wynalazku jako sond hybrydyzacyjnych.
Takie oligonukleotydy służące jako sondy albo startery obejmują około 30, korzystnie około 20, szczególnie korzystnie około 15 kolejnych zasad. Odpowiednimi są także oligonukleotydy o długości około 40 albo 50 par zasad.
„Izolowany” w znaczeniu tu zastosowanym oznacza wydzielony ze środowiska naturalnego.
„Polinukleotydy” dotyczy ogólnie polirybonukleotydów i polidezoksyrybonukleotydów, przy czym mogą one stanowić niemodyfikowany albo modyfikowany RNA albo DNA.
„Polipeptydy” w znaczeniu tu zastosowanym oznaczają peptydy albo białka, które zawierają dwa albo więcej aminokwasów, połączonych ze sobą wiązaniami peptydowymi.
Polipeptydy kodowane przez polinukleotyd według wynalazku obejmują polipeptyd o Id. Sekw. nr 3 albo Id. Sekw. nr 8 o aktywności biologicznej białka stanowiącego produkt genu OpcA, jak również polipeptyd, który jest w przynajmniej 90% identyczny z polipeptydem wskazanym w Id. Sekw. nr 3 albo Id. Sekw. nr 8, korzystnie w co najmniej 95% identyczny z polipeptydem wskazanym w Id. Sekw. nr 3 albo Id. Sekw. nr 8, a który wykazuje taką aktywność.
Niniejszym opisano także białko Zwf, które tworzy podjednostkę Zwf dehydrogenazy glukozo-6fosforanowej. Sekwencja aminokwasowa produktu translacji pokazana jest jako Id. Sekw. nr 2 i Id. Sekw. nr 7. Sekwencja końca N podjednostki Zwf dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, którą można wyizolować, przedstawiona jest jako Id. Sekw. nr 11.
Wynalazek dotyczy dalej fermentacyjnego sposobu wytwarzania aminokwasów, zwłaszcza L-lizyny, przy zastosowaniu bakterii maczugowatych, w szczególności takich, które już wytwarzają aminokwasy oraz w których sekwencje nukleotydowe genu opcA są amplifikowane, w szczególności nadmiernie wyrażane, ewentualnie wraz z genem zwf.
Sposób wytwarzania L-aminokwasów według wynalazku obejmuje następujące etapy:
a) fermentacji bakterii według wynalazku
b) wzbogacania w pożądany produkt pożywki hodowlanej lub komórek bakterii, względnie wzbogaconych bakterii, oraz
c) izolowania pożądanego L-aminokwasu.
Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się bakterie, w których oprócz wspomnianych genów dodatkowo amplifikowano dalszy gen lub geny cyklu fosforanu pentozy. Korzystniej, w celu osiągnięcia amplifikacji, liczba kopii genów albo sekwencji nukleotydowych jest zwiększana przez transformowanie mikroorganizmu wektorami plazmidowymi niosącymi te geny albo sekwencje nukleotydowe.
Określenie „amplifikacja” w znaczeniu tu zastosowanym oznacza zwiększenie aktywności wewnątrzkomórkowej jednego albo wielu enzymów (białek) w mikroorganizmie, które są kodowane przez odpowiedni DNA, na przykład przez zwiększenie liczby kopii genu, z zastosowaniem mocnego promotora albo genu, który koduje enzym (białko) o zwiększonej aktywności, jak również stosując ewentualnie powyższe możliwości w kombinacji.
Mikroorganizmy, stanowiące przedmiot niniejszego wynalazku, potrafią wytwarzać L-aminokwasy, w szczególności L-lizynę z glukozy, sacharozy, laktozy, fruktozy, maltozy, melasy, skrobi, celulozy albo z gliceryny i etanolu. Dotyczy to w szczególności przedstawicieli bakterii maczugowatych, zwłaszcza z rodzaju Corynebacterium. Z rodzaju Corynebacterium w szczególności należy wymienić
PL 206 384 B1 gatunek Corynebacterium glutamicum, który wśród specjalistów jest znany z tego, że wytwarza L-aminokwasy.
Przydatne szczepy rodzaju Corynebacterium, zwłaszcza gatunku Corynebacterium glutamicum są przykładowo znanymi szczepami typu dzikiego:
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Corynebacterium melassecola ATCC 17965 Brevibacterium flavum ATCC 14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 i Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 oraz wytworzone z nich mutanty lub szczepy produkujące L-lizynę, przykładowo Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 i Corynebacterium glutamicum DSM 5715 Corynebacterium glutamicum DM58-1 Corynebacterium glutamicum DSM 12866 oraz wytworzone z nich mutanty lub szczepy wytwarzające L-treoninę, przykładowo Corynebacterium glutamicum ATCC 21649 Brevibacterium flavum BB69
Brevibacterium flavum DSM 5399 Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 269 Brevibacterium lactofermentum TBB-10 oraz wytworzone z nich mutanty lub szczepy wytwarzające L-izoleucynę, przykładowo Corynebacterium glutamicum ATCC 14309 Corynebacterium glutamicum ATCC 14310 Corynebacterium glutamicum ATCC 14311 Corynebacterium glutamicum ATCC 15168 Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871 oraz wytworzone z nich mutanty lub szczepy wytwarzające L-tryptofan, przykładowo Corynebacterium glutamicum ATCC 21850 i Corynebacterium glutamicum KY9218 (pKW9901).
Twórcy wyizolowali nowy gen opcA C. glutamicum, kodujący podjednostkę OpcA enzymu dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (EC 2.7.1.11).
W celu izolowania genu opcA albo innych genów C. glutamicum, tworzy się najpierw bibliotek ę genów tego mikroorganizmu w E. coli. Tworzenie bibliotek genów jest opisane w powszechnie znanych podręcznikach i publikacjach. Przykładowo, można wymienić podręcznik Winnacker: Gene und Klone, Eine Eifthrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Niemcy, 1990) albo podręcznik Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Znane biblioteki genów obejmują np. E. coli K-12 szczep W3110, wytworzony przy użyciu wektorów λ przez Kohara i in., (Cell 50, 495-508 (1987)). Bathe i in., (Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996) opisują bibliotekę genów C. glutamicum ATCC 13032, który wytworzono przy użyciu wektorów kosmidowych SuperCos I (Wahl i in., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164) w E. coli K-12 szczep NM554 (Raleigh i in., 1988, Nucleic Acids Research, 16: 1563-1575). Bormann i in. (Molecular Microbiology, 6(3) 317-326 (1992)) opisują z kolei bibliotekę genów C. glutamicum ATCC 13032 wytworzoną przy zastosowaniu kosmidów pHC79 (Hohn i Collins, Gene 11: 291-298 (1980)). O'Donohue (The Cloning and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genesfrom Corynebacterium glutamicum, teza doktorska, National University of Ireland, Galway, 1997) opisuje klonowanie genów Corynebacterium glutamicum przy użyciu układu ekspresji λ Zap opisanego przez Short i in. (Nucleic Acids Research, 16: 7583). Do wytwarzania biblioteki genów C. glutamicum w E. coli, można również zastosować plazmidy, takie jak pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25: 807-818 (1979)) lub pUC9 (Viera i in., 1982, Gene, 19: 259-268).
PL 206 384 B1
Jako gospodarz, szczególnie nadają się szczepy E. coli wykazujące defekt restrykcyjny i rekombinacyjny. Przykładowo, szczep DH5aamrc opisany przez Grant i in., (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649). Długie fragmenty DNA klonowane przy użyciu kosmidów można następnie subklonować do wektorów odpowiednich do sekwencjonowania i sekwencjonować sposobem opisanym, na przykład, przez Sanger i in., (Proceedings of the National Academy of
Sciences USA, 74 (1977) 5463-5467).
Otrzymane sekwencje DNA można badać następnie znanymi algorytmami lub programami do analizy sekwencji, jak np. opisane przez Staden (Nucleic Acids Research 14: 217-232 (1986)), programem GCG (Butler, Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998)), algorytmem FASTA, Pearson i Lipman (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 85: 2444-2448 (1988)) albo algorytmem BLAST (Altshul i in., Nature Genetics 6: 119-129 (1994)), oraz porównywać z sekwencjami w dostępnych bazach danych. Dostępne powszechnie bazy danych sekwencji nukleotydowych obejmują przykładowo European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Niemcy) albo National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA).
Wynalazek dostarcza nowych sekwencji DNA z C. glutamicum, które zawierają gen opcA i stanowią część niniejszego wynalazku jako sekwencje przedstawione w Id. Sekw. nr 1 i Id. Sekw. nr 4. Sekwencja aminokwasowa odpowiadającego białka została otrzymana z niniejszej sekwencji DNA przy użyciu opisanych wyżej sposobów. Powstałą sekwencję aminokwasową produktu genu opcA przedstawiono jako Id. Sekw. nr 3 i Id. Sekw. nr 5. Ciężar cząsteczkowy otrzymanej sekwencji aminokwasowej produktu OpcA wynosi około 34,7 kDa.
Id. Sekw. nr 1 pokazuje również region kodujący genu zwf. Otrzymana sekwencja aminokwasowa produktu genu Zwf pokazana jest jako Id. Sekw. nr 2. Ciężar cząsteczkowy otrzymanej sekwencji aminokwasowej produktu genu Zwf wynosi około 57,5 kDa.
Biblioteka genów wytworzona w opisany sposób może być dalej badana przez hybrydyzację z sondami nukleotydowymi o znanej sekwencji, takimi jak np. gen zwf (JP-A-09224661). Klonowany DNA klonów, który wykazuje reakcję pozytywną w hybrydyzacji poddaje się sekwencjonowaniu, co prowadzi z kolei do wytworzenia z jednej strony znanej sekwencji nukleotydowej zastosowanej sondy, a z drugiej strony sąsiadujących nowych sekwencji DNA.
Wynalazek dostarcza również nowych sekwencji DNA genu opcA z C. glutamicum, przedstawionych jako Id. Sekw. nr 6 i Id. Sekw. nr 9. Sekwencja aminokwasowa odpowiadającego białka została otrzymana z niniejszej sekwencji DNA przy użyciu opisanych wyżej sposobów. Powstałą sekwencję aminokwasową produktu genu opcA przedstawiono jako Id. Sekw. nr 8 i Id. Sekw. nr 10. Ciężar cząsteczkowy otrzymanej sekwencji aminokwasowej produktu OpcA wynosi około 34,7 kDa.
Id. Sekw. nr 6 pokazuje również region kodujący genu zwf. Powstała sekwencja aminokwasowa produktu genu Zwf pokazana jest jako Id. Sekw. nr 7. Ciężar cząsteczkowy powstałej sekwencji aminokwasowej produktu Zwf wynosi około 57,5 kDa.
Inną procedurą częściowego określania sekwencji aminokwasowej białka OpcA i białka Zwf obejmuje oczyszczanie białka dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej do homogenności metodami chromatograficznymi. Sposoby i instrukcje oczyszczania białka są opisane m.in. w podręcznikach Schleifer i Wensink: Practical Methods in Molecular Biology (Springer Verlag, Berlin, Niemcy, 1981), Harris i Angal: Protein Purification Methods: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1989), Scopes: Protein Purification Methods: Principles and Practice, wyd. 3 (Springer Verlag, New York, USA, 1993) i są ogólnie znane z podręczników i innych publikacji. N-końcową sekwencję aminokwasowa oczyszczonych polipeptydów można określić sposobem sekwencjonowania końca N, opisanym przez Edman (Archives of Biochemistry 22, 475 (1949)). Dalsze sposoby i instrukcje sekwencjonowania białek są opisane np. w Smith: Protein Sequencing Protocols: Methods in Molecular Biology, tom 64 i 112 (Humana Press, Totowa, NJ, USA, 1996) i w Kamp i in., Protein Structure Analysis: Preparation, Characterisation and Microsequencing (Springer Verlag, New York, NY, USA, 1997).
Możliwe było wykazanie w ten sposób, że enzym, dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa obejmuje dwie podjednostki o ciężarze cząsteczkowym około 30 kDa i około 60 kDa. Sekwencja końca N podjednostki OpcA i białka OpcA jest przedstawiona jako Id. Sekw. nr 12. Sekwencja końca N podjednostki Zwf oraz białka Zwf pokazana jest jako Id. Sekw. nr 11.
Kodujące sekwencje DNA wynikające z Id. Sekw. nr 1 albo Id. Sekw. nr 4 albo Id. Sekw. nr 6 albo Id. Sekw. nr 9 na skutek degeneracji kodu genetycznego są również niniejszym ujawnione. W podobny sposób zostały ujawnione sekwencje DNA, które hybrydyzują z Id. Sekw. nr 1 albo Id.
PL 206 384 B1
Sekw. nr 4 albo Id. Sekw. nr 6 albo Id. Sekw. nr 9. W stanie techniki znane są konserwatywne zastąpienia w białkach aminokwasów, jak np. zamiana glicyny na alaninę albo kwasu asparginowego na kwas glutaminowy, jako tzw. „mutacje sensowne”, które nie powodują zasadniczych zmian aktywności białka, tzn. są neutralne czynnościowo. Dalej wiadomo, że zmiany przy końcach N i/lub C białka, nie upośledzają zasadniczo jego czynności, a mogą nawet ją stabilizować. Informacje dotyczące tego zagadnienia można znaleźć w Ben-Bassat i in., (Journal of Bacteriology, 169: 751-757 (1987)); O'Regan i in., (Gene 77: 237-251 (1989)), Sahin-Toth i in., (Protein Sciences, 3: 240-247 (1994)); Hochuli i in., (Bio/Technology, 6: 1321-1325 (1988)) oraz w znanych podręcznikach do genetyki i biologii molekularnej. Sekwencje aminokwasowe, które w ten sposób odpowiadają Id. Sekw. nr 3 albo Id. Sekw. nr 8 również stanowią część wynalazku.
Na koniec, rozwiązania według wynalazku dostarczają także sekwencji DNA, które wytworzono w reakcji ł a ń cuchowej polimerazy (PCR), przy zastosowaniu starterów otrzymanych z Id. Sekw. nr 4 albo Id. Sekw. nr 9. Takie oligonukleotydy mają zwykle długość około 15 nukleotydów.
Sposoby identyfikacji sekwencji DNA przy użyciu hybrydyzacji zostały opisane przede wszystkim w podręczniku „The DIG System Users Guide for Filter Hybridization”, firmy Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Niemcy, 1993) oraz Liebl i in., (International Journal of Systematic Bacteriology, (1991) 41: 255-260). Sposoby amplifikacji sekwencji DNA przy pomocy reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) zostały omówione m.in. w podręczniku Gait: Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) oraz w Newton i Graham: PCR (Spectrum Academischer Verlag, Heidelberg, Niemcy, 1994).
Twórcy stwierdzili, że po nadmiernej ekspresji genu opcA, ewentualnie wraz z genem zwf, bakterie maczugowate wytwarzają aminokwasy, w szczególności L-lizynę, w sposób ulepszony.
W celu wywoł ania nadekspresji moż na zwiększyć liczbę kopii genu albo poddać mutacji regiony promotorawe i regulatorowe albo miejsca przyłączania rybosomów, które znajdują się powyżej genów strukturalnych. W podobny sposób działają kasety ekspresji, które są włączane powyżej genów strukturalnych. Przez zastosowanie indukowalnych promotorów możliwe jest dodatkowo zwiększenie ekspresji w trakcie fermentacyjnego procesu wytwarzania L-lizyny. Ekspresja może być także ulepszona sposobami przedłużającymi czas trwania mRNA. Ponadto, aktywność białek enzymatycznych można zwiększyć przez zapobieganie rozkładowi białek enzymatycznych. Gen albo konstrukt genowy można wyrażać w plazmidach w zmiennej liczbie kopii albo integrować w chromosomie i amplifikować (powielać). Alternatywnie, nadekspresję konkretnego genu można osiągnąć przez zmianę składu pożywki i procedury zgodnie z którą prowadzona jest hodowla.
Specjalista w dziedzinie znajdzie odpowiednie wskazówki na ten temat w Martin i in. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)); Guerrero i in. (Gene 138, 35-41 (1994)); Tsuchiya i Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)); Eikmanns i in. (Gene 102, 93-98 (1991)); europejskim opisie patentowym EP 0472869; patencie USA 4601893; Schwartzer i Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), Reinscheid i in., (Applied Environtal Microbiology 60, 126-132 (1994)); LaBarre i in. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)); zgłoszeniu patentowym WO 96/15246; Malumbres i in. (Gene 134, 15-24 (1993)), japońska publikacja patentowa JP-A-10-229891; Jensen i Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)); Makrides (Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)) oraz w znanych podrę cznikach genetyki i biologii molekularnej.
Przykładowo, gen opcA według wynalazku można wyrażać nadmiernie przy użyciu plazmidu.
Odpowiednimi plazmidami są plazmidy, które replikują w bakteriach maczugowatych. Wiele znanych wektorów plazmidowym, tak jak np. pZl (Menkel i in., Applied Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554); pEKExl (Eikmanns i in., Gene 102: 93-98 (1991)) lub pHS2-1 (Sonnen i in., Gene 107: 69-74 (1991)) wykorzystuje kryptoplazmidy pHM1519, pBLl albo pGAl. Inne wektory plazmidowe, takie jak np. oparte na pCG4 (US-A-4489160), albo pUG2 (Serwold-Davies i in., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), albo pAGl (US-A-5158891), można zastosować w ten sam sposób.
Przykładowo, zastosowano wektor wahadłowy (ang. suttle vector) E. coli - C. glutamicum pECT18mob2 przedstawiony na Fig. 2. Po włączeniu genu opcA i genu zwf w miejsce cięcia SpHI/Sall pEC-T18mob2, wytworzono plazmid pECzwfopcA, przedstawiony na Fig. 3.
Ponadto odpowiednimi wektorami plazmidowymi są te, dzięki którym można osiągnąć amplifikację genu przez zintegrowanie z chromosomem, jak to przykładowo opisali Reinscheid i in. (Applied Environmental Microbiology, 60, 126-132 (1994)) w celu duplikacji, względnie amplifikacji operonu hom-thrB. Tą metodą, klonuje się gen pełnej długości do wektora plazmidowego, który może ulec replikacji w gospodarzu (zwykle E. coli), ale nie w C. glutamicum. Jako wektory można zastosować, na
PL 206 384 B1 przykład, pSUP301 (Simon i in., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob albo pK19mob (Schafer i in., Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1TOPO (Shuman (1994) Journal of Biological Chemistry, 269: 32678-84; US-A 5487993), pCR®Blunt (Invitrogen, Groningen, Holandia; Bernard i in., J. Mol. Biol. 234: 534-541 (1993)), pEMl (Schrumpf i in., 1991, J. Bacteriol. 173: 4510-4516) lub pBGS8 (Spratt i in., 1986, Gene 41: 337-342). Wektor plazmidowy zawierający gen do amplifikacji, przenosi się przez koniugację albo transformację do pożądanego szczepu Corynebacterium glutamicum. Metodę koniugacji opisano, przykładowo, Schafer i in., (Appl. Environ. Microbiol. 60, 756-759 (1994)). Sposoby Transformacji opisane są przez Thierbach i in. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 29, 356-362 (1988)), Dunican i Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) i Tauch i in., (FEMS Microbiol. Lett. 123, 343-347 (1994)). Po rekombinacji homologicznej, powstały szczep otrzymuje na drodze zjawiska „cross over”, przynajmniej dwie kopie odpowiedniego genu.
Ponadto, do wytwarzania aminokwasów, zwłaszcza L-lizyny, oprócz nadekspresji genu opcA, ewentualnie wraz z genem zwf, korzystne może być również nadmierne wyrażanie innych enzymów konkretnego szlaku biosyntezy, glikolizy, anaplerozy, szlaku fosforanu pentozy, lub eksportowania aminokwasów.
Zatem w celu wytwarzania L-lizyny może być korzystna amplifikacja, w szczególności nadekspresja jednego lub większej liczby genów wybranych z grupy składającej się z:
• genu dapA kodujący syntazę dihydrodipikolinanową (EP-B 0 197 335);
• genu lysC kodującego odporną na sprzężenie zwrotne kinazę asparaginianową (Kalinowski i in. (1990) Mol. Gen. Genet 224:317-324);
• gap kodującego dehydrogenazę gliceraldehydo-3-fosforanową (Eikmanns (1992) J. Bacteriol. 174: 6076-6086);
• genu pyc kodującego karboksylazę pirogronianową (DE-A-19831609);
• genu tkt kodującego transketolazę (nr dostępu AB023377 bazy danych EMBL, Heidelberg, Niemcy);
• genu gnd kodującego dehydrogenazę 6-fosfoglukonianową (JP-A-9-224662);
• genu lysE kodującego wydzielanie lizyny (DE-A-19548222);
• genu zwal (DE 19959328.0; DSM 13115); lub • genu eno kodującego enolazę (DE 19941478.5);
• genu tal kodują cego transaldolazę (DSM 13263).
Ponadto do wytwarzania aminokwasów, zwłaszcza L-lizyny, oprócz amplifikacji genu opcA, ewentualnie w kombinacji z genem zwf, może być korzystne równoczesne osłabianie następujących genów:
• genu pck kodującego karboksykinazę fosfoenolopirogronianową (DE 19950409.1, DSM 13047) i/lub;
• genu pgi kodującego izomerazę glukozo-6-fosforanową (US 09/396478, DSM 12969), lub • genu poxB kodują cego oksydazę pirogronianową (DE 19951975.7; DSM 13114), lub • gen zwa2 (DE 19959327.2; DSM 13113).
Ponadto, w celu wytwarzania aminokwasów, zwłaszcza L-lizyny, oprócz nadmiernej ekspresji genu opcA, może być korzystne wyłączenie niepożądanych reakcji (Nakayama: „Breeding of Amino Acids Producing Micro-organisms, w: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (red.), Academic Press, Londyn UK, 1982).
W celu wytwarzania aminokwasów, zwłaszcza L-lizyny, mikroorganizmy wytworzone zgodnie z niniejszym wynalazkiem mogą być hodowane w sposób cią g ł y lub przerywany porcjami (hodowle okresowe, ang. batch culture) albo sposobem okresowym z jednoczesnym dostarczaniem pożywki (proces wsadowy, ang. fed batch process) albo sposobem okresowym z dostarczaniem pożywki w sposób powtarzany (ang. repetitive feed process). Podsumowanie znanych sposobów hodowania opisano w podręczniku Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfijhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) albo w podręczniku Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
Stosowana pożywka hodowlana (podłoże hodowlane) musi spełniać w odpowiedni sposób wymogi konkretnego szczepu. Opis pożywek hodowlanych dla różnych mikroorganizmów można znaleźć w podręczniku „Manual of Methods for General Bacteriology”, Am. Soc. Bacteriol., (Washington D.C., USA, 1981). Jako źródło węgla można stosować cukry i węglowodany, takie jak glukoza, sacharoza, laktoza, fruktoza, maltoza, melasa, skrobia i celuloza, oleje i tłuszcze, takie jak np. olej sojowy, sło8
PL 206 384 B1 necznikowy, z orzechów ziemnych i tłuszcz kokosowy, kwasy tłuszczowe, takie jak np. kwas palmitynowy, stearynowy i linolowy, alkohole, takie jak np. gliceryna i etanol oraz kwasy organiczne, takie jak np. kwas octowy. Te związki można zastosować pojedynczo albo w mieszaninie. Jako źródło azotu można zastosować związki organiczne zawierające azot, takie jak mocznik oraz związki zawarte w peptonie, ekstraktach z drożdży, ekstraktach z mięsa, ekstraktach słodu, płynie po namaczaniu kukurydzy (ang. corn steep liquor) i mące sojowej lub związki nieorganiczne jak siarczan amonu, chlorek amonu, fosforan amonu, węglan amonu i azotan amonu. Źródła azotu można zastosować pojedynczo oraz jako mieszaninę. Jako źródła fosforu można stosować kwas fosforowy, fosforan monopotasowy albo fosforan dipotasowy albo odpowiadające zawierające sód sole. Pożywka hodowlana powinna zawierać również sole metali, jak np. siarczan magnezu albo siarczan żelaza, które są konieczne do wzrostu. Na koniec, oprócz powyższych substancji należy zastosować niezbędne czynniki wzrostowe, takie jak aminokwasy i witaminy. Do podłoża hodowlanego można dodać ponadto odpowiednie prekursory. Powyższe związki można dostarczać do hodowli jednorazowo w postaci jednej porcji lub w odpowiedni sposób w trakcie prowadzenia hodowli.
Do kontrolowania pH stosuje się związki zasadowe, takie jak wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, amoniak lub wodę amoniakalną albo związki kwasowe, takie jak kwas fosforowy albo siarkowy. Aby kontrolować tworzenie się piany można stosować substancje przeciwspieniające, takie jak np. estry poliglikolowe kwasów tłuszczowych. W celu utrzymania stabilności plazmidu, można dodawać do podłoża substancje działające wybiórczo, takie jak np. antybiotyki. Aby utrzymać proces w warunkach tlenowych, do hodowli można doprowadzać tlen albo zawierające tlen mieszaniny gazowe, takie jak np. powietrze. Temperatura hodowli zawiera się zazwyczaj w zakresie od 20°C do 45°C, zaś korzystnie od 25°C do 40°C. Hodowlę prowadzi się do momentu uzyskania maksymalnej ilości lizyny. Cel ten osiąga się to zwykle po 10 do 160 godzinach hodowli.
Analizę L-aminokwasów przeprowadza się przez chromatografię anionowymienną z następującą po niej derywatyzacją ninhydryną zgodnie z metodą opisaną przez Spackman i in. (Analytical Chemistry, 30, (1958) 1190).
Poniższy mikroorganizm zdeponowano w Deutsche Sammlung far Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Niemiecka Kolekcja Mikroorganizmów i Kultur Komórkowych, Braunschweig, Niemcy) zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim:
• Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECzwfopcA jako DSM 13264.
Id. Sekw. nr 1 obejmuje również nowy gen devB. Sposób według wynalazku służy do fermentacyjnego wytwarzania aminokwasów, w szczególności L-lizyny.
Dołączone sekwencje:
Poniższe sekwencje dołączono w postaci Listy Sekwencji:
Id. Sekw. nr: Opis:
Sekwencja DNA wyizolowana z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Sekwencja aminokwasowa białka Zwf otrzymane z Id. Sekw. nr 1
Sekwencja aminokwasowa białka OpcA otrzymana z Id. Sekw. nr 1
Sekwencja DNA genu opcA ATCC 13032 otrzymana z Id. Sekw. nr 1
Sekwencja aminokwasowa białka OpcA otrzymana z Id. Sekw. nr 4
Sekwencja DNA wyizolowana z Corynebacterium glutamicum AS019
Sekwencja aminokwasowa białka Zwf otrzymana z Id. Sekw. nr 6
Sekwencja aminokwasowa białka OpcA otrzymana z Id. Sekw. nr 6
Sekwencja DNA genu opcA AS019 otrzymana z Id. Sekw. nr 6
Sekwencja aminokwasowa białka OpcA otrzymana z Id. Sekw. nr 9
Możliwa do wyizolowania sekwencja aminokwasowa końca N białka Zwf dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej z ATCC 13032
Dołączono następujące Figury:
Fig. 1: Mapa plazmidu pBOB102
Fig. 2: Mapa plazmidu pEC-T18mob2
Fig. 3: Mapa plazmidu pECzwfopc A
Zastosowano skróty i opisy mają następujące znaczenie:
Fig. 1
Neo r: oporność na neomycynę/kanamycynę
ColEl ori: początek replikacji plazmidu ColEl
CMV: promotor wirusa cytomegalii
PL 206 384 B1 lacP:
lacZ:
SV40 3' splice SV40 polyA: fl(-)ori:
SV40 ori:
Fig. 2 i 3
Tet:
oriV:
RP4mob:
rep:
per:
lacZ-alfa:
lacZalfa':
'lacZalfa:
Zwf:
opcA:
promotor operonu lac koniec 5' genu β-galaktozydazy (fragment genu lacZa) miejsce 3' składania transkryptu wirusa małpiego 40 miejsce poliadenylacji wirusa małpiego 40 początek replikacji faga nitkowatego fl początek replikacji wirusa małpiego 40 gen oporności na tetracyklinę kodowany przez plazmid początek replikacji E. coli region mob mobilizacji plazmidu kodowany przez plazmid początek replikacji plazmidu pGAl z C. glutamicum gen kontrolujący liczbę kopii z pGAl fragment genu lacZa (koniec N) genu β-galaktozydazy koniec 5' fragmentu genu lacZa koniec 3' fragmentu genu lacZa gen zwf gen opcA
Poniżej przedstawiono wyjaśnienia dalszych skrótów:
Apal: miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego Apal
BamHI: miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego BamHI
Cial: miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego Cial
EcoRI: miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego EcoRI
Hindlll: miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego Hindlll
Mstll: miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego Mstll
Nhel: miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego Nhel
Nsil: miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego Nsil
SacI: miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego SacI
Sall: miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego Sall
Spel: miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego Spel
SphI: miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego SphI
Sspl: miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego Sspl
Xbal: miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego Xbal
P r z y k ł a d y
Poniższe przykłady wyjaśniają dalej rozwiązania według wynalazku. O ile nie zaznaczono inaczej, zastosowano techniki biologii molekularnej, np. izolowanie plazmidowego DNA, trawienie restrykcyjne, ligacje, standardowe transformowanie E. coli itp. jak opisano w Sambrook i in., (Molecular Cloning: A Laboroatory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)).
P r z y k ł a d 1
Konstruowanie biblioteki genów w szczepie AS019 Corynebacterium glutamicum
Bibliotekę DNA szczepu AS019 Corynebacterium glutamicum (Yoshima i in., J. Bacterid., 162, 591-597 (1985)) skonstruowano stosując układ A, ZAP Express™ (Short i in., (1988) Nuci. Acids Res. 16: 7583-7600), jak opisał O'Donohue (O'Donohue, M. (1997), The Cloning and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutamicum, teza doktorska, National University of Ireland, Galway, 1997). Układ λ Zap Express™ zakupiono w Stratagene (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Rd., La Jolla, CA 92037) i zastosowano zgodnie z instrukcjami producenta. DNA AS019 trawiono enzymem restrykcyjnym Sau3A i poddano ligacji do trawionych BamHI i defosforylowanych ramion λ Zap Express™.
P r z y k ł a d 2
Klonowanie i sekwencjonowania genu opcA i zwf
1. Konstruowanie sondy zwf
Znakowany radioaktywnie oligonukleotyd wewnętrzny genu zwf zastosowano do sondowania biblioteki AS019 λ Zap Express™ opisanej wyżej. Oligonukleotyd wytworzono stosując zdegenerowane startery PCR wewnętrzne wobec genu zwf. Zastosowano następujące zdegenerowane startery nukleotydowe zaprojektowane do amplifikacji PCR fragmentów DNA zwf:
zwf1: 5' ATY GAY CAC TAY YTS GGY AAR GA 3'
PL 206 384 B1 zwf2: 5' RAA WGG MAC RCC YKS CCA 3' przy czym R=A+G; Y=C+T; W=A+T; M=A+C; S=G+C; K=T+G.
Przewidywana wielkość otrzymanego produktu PCR wynosiła około 480 bp.
Ustalono następujące optymalne warunki PCR:
cykli
94°C przez 1 minutę
60°C przez 1 minutę
72°C przez 30 sekund
2,5-3,5 mM MgCl2
100-150 ng genomowego DNA AS019.
Analiza sekwencji otrzymanego produktu PCR potwierdziła, że produkt jest wewnętrzną częścią genu zwf. Analizę sekwencji przeprowadzono stosując uniwersalne startery „naprzód” i „wstecz”, oraz zestaw T7 z Pharmacia Biotech (St. Albans, Herts, UK).
2. Klonowanie
Badanie przesiewowe biblioteki λ Zap Express™ AS019 przeprowadzono zgodnie z protokołem układu λ. Zap Express™ (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Rd., La Jolla, CA 92037). Analizę Southern blot przeprowadzono na wyizolowanych klonach. Transfer DNA został opisany w protokole Schleicher i Schuell z zastosowanie Nytran™ jako błony („Nytran, Modified Nylon-66 Membrane Filters” (marzec 1987) Schleicher i Schuell, Dassel, Niemcy). Dwuniciowe fragmenty DNA wytworzone z użyciem tych samych starterów i optymalnych warunków PCR jak opisano wyż ej, znakowano radioaktywnie a-32P-dCTP przy użyciu zestawu do znakowania Multiprime™ DNA Labelling Kit z Amersham Life Sciences (Amersham Pharmacia Biotech UK, Ltd., Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) według instrukcji producenta. Hybrydyzację wstępną, hybrydyzację i płukanie przeprowadzono w warunkach opisanych w instrukcji Schleicher i Schuell. Autoradiografię prowadzono według instrukcji w podręczniku Sambrook i in., stosując film AGFA Curix RPIL. Zidentyfikowano kilka klonów zwf. Plazmidowy DNA wyizolowano z jednego z klonów, oznaczonego pBOB102 (Fig. 1) i wybranego do dalszej analizy.
3. Sekwencjonowanie
W celu sekwencjonowania wstawki klonu pBOB102 zastosowano metodę Sangera i in., dideoksylowego zakończenia łańcucha, (ang. the Sanger Dideoxy chain termination method) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977)). Sposób przeprowadzono stosując zestaw do sekwencjonowania T7 i a-35S-dCTP z Pharmacia Biotech (St. Albans, Herts, UK). Próbki poddano elektroforezie przez 3-8 godzin na 6% żelu poliakrylamid/mocznik w buforze TBE przy prądzie stałym 50 mA, według instrukcji klonowania i sekwencjonowania dostarczonych przez Pharmacia („T7 Sequencing™ Kit”, nr XY-010-00-19, Pharmacia Biotech, 1994). Początkowa analiza sekwencji została przeprowadzona przy użyciu uniwersalnego startera „naprzód” i startera „wstecz” M13 otrzymanego z Pharmacia Biotech:
Starter uniwersalny naprzód:
5' GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C 3'
Starter M13 wstecz:
5' GGA AAC AGC TAT GAC CAT G 3'
Startery wewnętrzne zaprojektowano na podstawie uzyskanej sekwencji, która umożliwiała wywnioskowanie całej sekwencji genu opcA. Sekwencje starterów wewnętrznych były następujące:
Starter wewnętrzny 1: 5' TCA ACC CTG AGT CCA CC 3'
Starter wewnętrzny 2: 5' CTG ACC ACG AGC GGA GG 3'
Starter wewnętrzny 3: 5' ATG GTG ATC TGG ACG TG 3'
Starter wewnętrzny 4: 5' CTG GCG ACT TGG CTC GA 3'
Starter wewnętrzny 5: 5' CTT CCG GAT ACC ACC ACC 3'
Uzyskaną sekwencję analizowano stosując program DNA Strider (Marek (1988), Nucl. Acids Res., 16: 1829-1836) wersja 1.0 na komputer Apple Macintosh. Program ten umożliwia analizę wykorzystania miejsc restrykcyjnych, analizę otwartej ramki odczytu i określenie wykorzystania kodonów. Porównanie otrzymanej sekwencji DNA z sekwencjami w bazach danych EMBL i Genbank przeprowadzono stosując program BLAST (Altschul i in., (1997) Nuci. Acids Res., 25: 3389-3402). Sekwencje DNA i białka przyrównano stosując programy Clustal V i Clustal W (Higgins i Sharp, 1988, Gene 73: 237-244).
PL 206 384 B1
Otrzymaną sekwencję przedstawiono jako Id. Sekw. nr 6. Analiza otrzymanej sekwencji nukleotydowej wykazała otwartą ramkę odczytu wielkości 957 par zasad, którą oznaczono jako gen opcA. Koduje ona białko wielkości 319 aminokwasów, przedstawione jako Id. Sekw. nr 8 i Id. Sekw. nr 10. Region kodujący genu zwf pokazano również na Id. Sekw. nr 6. Sekwencja aminokwasowa białka Zwf, obejmująca 514 aminokwasów została pokazana jako Id. Sekw. nr 7.
P r z y k ł a d 3
Wytwarzanie kosmidowej biblioteki genomowej Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Chromosomalny DNA z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 izolowano sposobem opisanym przez Tauch i in., (1995, Plazmid 33: 168-179) i częściowo trawiono enzymem restrykcyjnym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy, opis produktu Sau3AI, kod nr 27-0913-02). Fragmenty DNA defosforylowano fosfatazą alkaliczną z krewetek (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Niemcy, opis produktu SAP, kod nr 1758250). DNA wektora kosmidowego SuperCosl (Wahl i in., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2160-2164), wytworzony przez Stratagene (La Jolla, USA, opis produktu SuperCos1 Cosmid Vector Kit, kod nr 251301) cięto enzymem restrykcyjnym Xbal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy, opis produktu Xbal, kod nr 27-0948-02) i defosforylowano podobnie fosfatazą alkaliczną z krewetek. Następnie kosmidowy DNA cięto enzymem restrykcyjnym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy, opis produktu BamHI, kod nr 27-0868-04). Traktowany w ten sposób DNA kosmidowy zmieszano z DNA ATCC 13032 i serię traktowano ligazą DNA T4 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy, opis produktu T4-DNA-Ligase, kod nr 27-0870-04). Mieszaninę ligacyjną pakowano do fagów przy użyciu ekstraktu Gigapack II XL (Stratagene, La Jolla, USA, opis produktu Gigapack II XL Packing Extract, kod nr 200217). W celu zakażania E. coli szczepu NM554 (Raleigh i in., 1988, Nuci. Acids Res., 16: 1563-1575), komórki pobrano w 10 mM MgSO4 i zmieszano z porcją zawiesiny fagów. Zakaż enie i miareczkowanie biblioteki kosmidowej przeprowadzono sposobem opisanym w Sambrook i in. (Molecular Cloning: A Laboroatory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1989), przy czym komórki wysiano na agar LB (Lennox, 1955, Virology
1:190) z dodatkiem 100 μg/ml ampicyliny. Po inkubacji przez noc w 37°C selekcjonowano pojedyncze rekombinowane kolonie.
P r z y k ł a d 4
Izolowanie i sekwencjonowanie genu opcA i zwf ATCC 13032
Kosmidowy DNA pojedynczych kolonii izolowano przy użyciu zestawu Qiaprep Spin Miniprep Kit (produkt nr 27106, Qiagen, Hilden, Niemcy) według instrukcji producenta i częściowo cięto enzymem restrykcyjnym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy, opis produktu Sau3AI, kod nr 27-0913-02). Fragmenty DNA defosforylowano fosfatazą alkaliczną z krewetek (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Niemcy, opis produktu SAP, kod nr 1758250). Po rozdziale elektroforezą żelową izolowano fragmenty kosmidów w zakresie wielkości 1500 do 2000 bp stosując zestaw QiaExll Gel Extraction Kit (produkt nr 20021, Qiagen, Hilden, Niemcy). DNA wektora sekwencjonującego pZero-1 otrzymany z Invitrogen (Groningen, Holandia, opis produktu Zero Background Cloning Kit, produkt nr K2500-01) cięto enzymem restrykcyjnym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy, opis produktu BamHI, kod nr 27-0868-04). Ligację fragmentów kosmidowych w wektorze do sekwencjonowania pZero-1 przeprowadzono sposobem opisanym przez Sambrook i in., (Molecular Cloning: A Laboroatory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), w którym mieszaninę DNA inkubowano przez noc z ligazą DNA T4 (Pharmacia Biotech, Freiburg, Niemcy). Tę mieszaninę ligacyjną wprowadzono następnie przez elektroporację (Tauch i in., 1994, FEMS Microbiol. Letters, 123: 343-7) do bakterii E. coli szczep DH5aMCR (Grant i in., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4645-4649), które potem wysiano na agar LB (Lennox, 1955, Virology 1:190) z dodatkiem 50 μg/ml zeocyny. Preparaty plazmidowe rekombinowanych klonów otrzymano przy użyciu Biorobot 9600 (produkt nr 900200, Qiagen, Hilden, Niemcy). Sekwencjonowanie przeprowadzono metodą dideoksylowego zakończenia łańcucha Sangera i in. (1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467) z modyfikacjami Zimmermanna i in., (1990, Nucl. Acids Res. 18: 1067). Zastosowano zestaw „RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit” z PE Applied Bio-systems (nr produktu 403044, Weitrstadt, Niemcy). Rozdział przez elektroforezę żelową i analizę reakcji sekwencjonowania przeprowadzono przy użyciu żelu „Rotiophoresis NF Acrylamid/Bisacrylamid” (29:1) (kod produktu A124.1, Roth, Karlsruhe, Niemcy) przy użyciu urządzenia do sekwencjonowania „ABI Prism 377” z PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Germany).
Otrzymane surowe sekwencje opracowywano przy użyciu pakietu oprogramowania (1986, Nucl. Acids Res. 14: 217-231) wersja 97-0. Pojedyncze sekwencje pochodnej pZero01 łączy się w postaci
PL 206 384 B1 pojedynczego kontigu (ang. contig). Wspomaganą komputerowo analizę regionu kodującego przeprowadzono z zastosowaniem programu XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231). Dalszą analizę przeprowadzono „programem poszukującym BLAST” (Altshul i in., 1997, Nucl. Acids Res., 25: 3389-3402) względem nienadmiarowej bazy danych genów „National Center for Biotechnology Information” (NCBI, Bethesda, MD, USA).
Otrzymaną sekwencję nukleotydową przestawiono na Id. Sekw. nr 1. Analiza sekwencji wykazała region kodujący wielkości 957 par zasad, określony jako gen opcA. Gen opcA, obejmujący kodon stop, przedstawiono na Id. Sekw. nr 4. Gen opcA koduje białko wielkości 319 aminokwasów, przedstawione jako Id. Sekw. nr 3 i Id. Sekw. nr 5.
P r z y k ł a d 5
Oczyszczanie i sekwencjonowanie końca N dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej Corynebacterium glutamicum ATCC13032 1
1. Hodowla szczepu ATCC 13032
W celu oczyszczania dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 hodowano w warunkach aerobowych na pożywce minimalnej w 30°C w układzie fermantacyjnym Labfors (Infors AG, Bottmingen, Szwajcaria). Hodowlę wstępną (pożywka Bacto® Brain Heart Infusion, Difco Laboratories, Detroit, USA) inkubowano przez 15 godzin w 30°C i zastosowano do zaszczepienia 2,5 l pożywki minimalnej. Pożywka zawierała następujące składniki (na litr): 20 g (NH4)2SO4; 1 g KH2PO4; 1 g K2HPO4; 0,25 g MgSO4 x 7 H2O; 10 mg CaCl2; 0,2 mg biotyny; 30 mg kwasu protokatechowego; 1 mg FeSO4 x 7 H2O; 1 mg MnSO4 x H2O; 0,1 mg ZnSO4 x 7 H2O; 0,02 mg CuSO4; 0,002 mg NiCl2 x 6 H2O; 1,2 g HCl; 0,2 g poliglikolu propylenowego; 75 mg tritriplexu II i 100 g glukozy. Podczas fermentacji dodawano w sposób ciągły wodorotlenek sodu w celu utrzymania wartości pH na stałym poziomie 7,0. Komórki zebrano w późnej fazie wzrostu wykładniczego. Po odwirowaniu w wirówce Avanti J-25 i rotorze Beckman JA 10 (Fullerton, USA) przy 6400 g przez 15 minut w 4°C i przepł ukaniu 100 mM Tris-HCl pH 7,5 zawieraj ą cym 10 mM MgCl2, osad przechowywano w -20°C do dalszego stosowania.
2. Oczyszczanie enzymu
Przerywanie komórek prowadzono w układzie do niszczenia (Disintegrator S, BlOmatic, Rodgau-Hainhausen, Niemcy). Komórki uprzednio zawieszono w buforze o pH 7,5 zawierającym 100 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 0,75 mM DTT i mieszaninę kilku inhibitorów proteaz (complete™, Roche, Mannheim, Niemcy). Stosunek ciężaru osadu komórkowego do całkowitej masy mieszaniny wynosił 0,3. Po dodaniu 100 ml szklanych perełek o średnicy 0,1-0,25 mm (Fisher Scientific, Dusseldorf, Niemcy) na 100 ml całkowitej objętości zawiesiny, przerywanie komórek prowadzono przez 12 minut przy 5000 obrotów na minutę. Wzrostowi temperatury zapobiegano przez chłodzenie lodem. Po usunięciu perełek przeprowadzono ultrawirowanie na wirówce L8-70 M i rotorze Beckman Ti45 (Fullerton, USA) przy 235000 g przez 90 minut w 4°C. Nadsącz zastosowano jako surowy ekstrakt do oczyszczania dehydrogenazy glukozo-6-fosforananowej. Wszystkie etapy oczyszczania przeprowadzono w ukł adzie Biosys2000 Beckmann (Fullerton, USA).
Surowy ekstrakt naniesiono na kolumnę XK 50/30 (Pharmacia, Freiburg, Niemcy), zawierającej złoże Fractogel EMD DEAE-650 (S) (Merck, Darmstadt). Całkowita objętość złoża wynosiła 500 ml. Kolumnę uprzednio zrównoważono 50 mM Tris-Hcl pH 7,5, zawierającym 30 mM MgCl2 i 0,75 mM DTT. Po wprowadzeniu surowego ekstraktu, kolumnę przemywano buforem zawierającym 144 mM KCl. Elucję prowadzono przez 95 minut liniowym gradientem KCl od 144 mM do 320 mM. Przepływ wynosił 7,4 ml/min. Aktywne frakcje zlewano i zatężano na zatężaczu centriprep® 30 (Amicon, Beverly, USA) stosując Varifuge 3.0R (Heraeus, Hanau, Niemcy) przy 1500 g i 4°C. Przez rozcieńczenie 50 mM Tris-HCl pH 7,5 zawierającym 30 mM MgCl2 i 0,75 mM DTT, stężenie KCl doprowadzono do 40 mM. Po częściowym oczyszczeniu dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, wprowadzono ją do kolumny XK 26/20 (Pharmacia, Freiburg, Niemcy) wypełnionej 65 ml złożem Red-Sepharose CL6B (Pharmacia, Freiburg, Germany). Kolumnę równoważono 50 mM Tris-HCl pH 7,5 z dodatkiem 30 mM MgCl2 i 0,75 mM DTT. Elucję prowadzono przez 590 minut liniowym gradientem 0-800 mM KCl przy przepływie 0,87 ml/min.
Po zebraniu aktywnych frakcji dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, stężenie KCl zmniejszono do 10 mM w opisany wyżej sposób. Następnie, roztwór wprowadzono do kolumny XK 16/20 (Pharmacia, Freiburg, Germany) zawierające 20 ml złoża 2'5'-ADP-Sepharose (Pharmacia, Freiburg, Germany). Kolumnę równoważono tym samym buforem co kolumnę Red-Sepharose CL6B. Elucję
PL 206 384 B1 prowadzono liniowym gradientem 0-2 mM NADP. Aktywne frakcje dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej pulowano i nakładano na kolumnę filtracyjną.
Do filtracji żelowej zastosowano kolumnę Superdex G200p (Pharmacia, Freiburg, Germany) o średnicy 1,6 cm i objętości złoża 114 ml. Elucję przy przepływie 1 ml/min prowadzono 50 mM TrisHCl pH 7,5 zawierającym 30 mM MgCl2, 200 mM KC1 i 0,75 mM DTT. Aktywne frakcje pulowano i zatężano przez ultrafiltrację na zatężaczu centriprep® (Amicon, Beverly, USA). Po dodaniu 50% obj. gliceryny, roztwór dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej przechowywano w -20°C.
Podczas całego procesu oczyszczania mierzono aktywność dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej i stężenie białka.
Układ testowy do określania aktywności dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej zawierał 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM NADP i 200 mM glutaminianu potasu. Reakcję zapoczątkowano przez dodanie 4 mM dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej i śledzono powstawanie NADPH przez pomiar absorbancji przy 340 nm w 30°C. Stężenie białka określano spektrofotometrycznie po barwieniu błękitem Coomassie (Stoscheck, Meth. Enzymol. 182: 50-68 (1990)). Jako standard zastosowano albuminę surowicy bydlęcej. Wszystkie pomiary przeprowadzono na spektrofotometrze UV-160 A (Shimadzu, Kyoto, Japonia).
Czystość dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej testowano przez nieciągłą denaturyzującą elektroforezę na żelu z SDS metodą Laemmli (Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970)). Po trzecim etapie oczyszczania z użyciem ligandu 2'5'-ADP-Sepharose otrzymano dwa białka o ciężarze cząsteczkowym około 60 kDa i o 30 kDa. Te dwa białka można było rozdzielić przez filtrację żelową. Aktywność właściwa preparatu wynosiła 213 U/mg białka.
3. Sekwencjonowanie końca N
Sekwencjonowanie końca N oczyszczonej dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej przeprowadzono metodą Edmana (Edman i Begg, Eur. J. Biochem., 1, 80-91 (1967)) stosując układ Procise® Protein Sequencing System (Applied Biosystems, Foster City, USA).
Dla 60 kDa białka otrzymano następującą sekwencję końca N: Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Trp Xaa Asn Pro Leu Arg Asp. Pokazano ją również na Id. Sekw. nr 11.
Dla 30 kDa białka otrzymano następującą sekwencję końca N: Met Ile Phe Xaa Leu Pro Asp Xaa Xaa Xaa Gln Gln Ile Ser Lys. Pokazano ją również na Id. Sekw. nr 12.
P r z y k ł a d 6
Klonowanie genów zwf i opcA w wektorze T pGEM
PCR zastosowano w celu amplifikowania fragmentów DNA zawierających cały gen zwf i opcA C. glutamicum ATCC13032 i flankujące regiony powyżej i poniżej genu. Reakcje PCR przeprowadzono stosując startery oligonukleotydowe opracowane w oparciu o Id. Sekw. nr 1 i Id. Sekw. nr 6. Genomowy DNA izolowano z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 zgodnie z ujawnieniem Heery i Dunican (Appl. Environ. Microbiol. 59: 791-799 (1993)) i stosowano jako matrycę . Startery miał y następującą sekwencję:
starter naprzód zwf: 5 AGA ATC AGC ACG CTG CAT CAG 3' starter wstecz opcA: 5' AGT ATG GTG CGC GTA CTA 3'
Zastosowano następujące parametry PCR:
cykli
95°C przez 3 minuty
94°C przez 1 minutę
47°C przez 1 minutę
72°C przez 45 sekund
2,5 mM MgCl2 około 150-200 ng matrycy DNA.
Otrzymany produkt PCR klonowano do dostępnego na rynku wektora pGEM-T, zakupionego z Promega Corp. (pGEM-T Easy Vector System 1, nr kat. A1360, Promega UK, Southampton) stosując szczep JM109 E. coli (Yanisch-Perron i in., Gene 33: 103-119 (1985)) jako gospodarza.
P r z y k ł a d 7
Wytwarzanie wektora wahadłowego pEC-T18mob2
Wektor wahadłowy E. coli - C. glutamicum wytworzono w sposób znany ze stanu techniki.
Wektor zawierał region replikacji rep plazmidu pGA1 łącznie z efektorem transkrypcji per (USA 5175108; Nesvera i in., J. Bacteriol. 179, 1525-1532 (1997)), gen zapewniający oporność na tetracyklinę tetA(Z) z plazmidu pAG1 (US-A-5158891; wpis w bibliotece genowej the National Center for Bio14
PL 206 384 B1 technology Information (NCB1, Bethesda, MD, USA) z numerem dostępu AF121000), region replikacji oriV plazmidu pMB1 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantative Biology 43, 77-90 (1979)), fragment genu lacZa po promotorze lac i miejsce wielokrotnego klonowania (mes) (Norrander i in., Gene 26, 101-106 (1983)) oraz region mob plazmidu RP4 (Simon i in., Bio/Technology 1: 784791 (1983)).
Skonstruowany wektor transformowano do E. coli szczepu DH5a (Hanahan, w: DNA cloning: A practical approach. Tom I, IRL Press, Oxford, Washington DC, USA). Selekcję komórek niosących plazmid przeprowadzono przez wysianie mieszaniny na agarze LB (Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) z 5 mg/l tetracykliny. Po inkubacji przez noc w 37°C selekcjonowano pojedyncze klony rekombinowane. Plazmidowy DNA izolowano z transformantów zestawem QIAprep Spin Miniprep Kit z Qiagen i sprawdzano przez trawienie restrykcyjne EcoRI i Hindll i elektroforezę na żelu agarozowym (0,8%).
Plazmid nazwano pEC-T18mob2 i przedstawiano na Fig. 2. Został on zdeponowany w postaci szczepu E. coli K-12 DH5a/pEC-T18mob2 w DSMZ (Deutsche Sammlung far Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Niemcy) jako DSM 13244.
P r z y k ł a d 8
Ekspresja dehydrogenazy głukozo-6-fosforanowej w Corynebacterium glutamicum
Całe geny zwf i opcA były następnie izolowane z zawierającego je wektora T pGEM (patrz, Przykład 6) jako fragment SphI/Sall i klonowano w miejsce SphI/Sall lacZa wektora wahadłowego E. coli - C. glutamicum pEC-T18mob2 (Przykład 7 i Fig. 2). Wektor ten zawierał dwa miejsca SphI. Pierwsze jest położone w miejscu wielokrotnego klonowania lacZa, zaś drugie w genie niosącym oporność na tetracyklinę. Stąd, zastosowano tetracyklinę (Sigma-Aldrich, PO BOX 2424, Wimborne, Dorset BH21 7YR, UK) (5 mg/l) jako czynnik selekcyjny, ponieważ wzrastać będą wyłącznie klony zawierające kompletny gen oporności na tetracyklinę. Ten nowy konstrukt oznaczono jako pECzwfopcA (Fig. 3). Analiza enzymami restrykcyjnymi przy użyciu SacI (Boehringer Mannheim, Niemcy) wykazała prawidłowe położenie genów zwf i opcA w genie lacZa pEC-T18mob2, tj. poniżej promotora lac. Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (American Type Culture Collection, Manasas, VA, USA) transformowano tym konstruktem i elektrotransformanty selekcjonowano na agarze Luria z dodatkiem izopropylo-tiogalaktopiranozydu (IPTG), 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-galaktopiranozydu (XGAL) i tetracykliny w stężeniach, odpowiednio, 1 mM, 0,02% i 5 mg/ml. Płytki agarowe inkubowano przez 48 godzin w 30°C. Szybką ekstrakcję plazmidu przeprowadzono metodą opisaną przez O'Gara i Dunican (Appl. Environ. Microbiol., 61: 4477-4479 (1995)) i trawieniem SacI potwierdzono obecność pożądanego klonu. Jeden z klonów oznaczono ATCC13032/pECzwfopcA.
P r z y k ł a d 9
Wytwarzanie producentów aminokwasów, przy użyciu amplifikowanego genu opcA
Wytwarzający L-lizynę szczep Corynebacterium glutamicum DSM5715 jest opisany w EP-B-0435132, zaś wytwarzający L-treoninę szczep Brevibacterium flavum DSM5399 opisano w EP-B-0385940. Oba szczepy zdeponowano w DSMZ zgodnie z postanowieniami Traktatu Budapeszteńskiego.
Szczepy DSM5715 i DSM5399 transformowano plazmidem pECzwfopcA (Przykład 8) stosując elektroporację opisaną przez Liebl i in., (FEMS Microbiol. Lett. 53:299-303 (1989)). Selekcję transformantów przeprowadzono na agarze LBHIS zawierającymi 8,5 g/l bulionu z mózgu i serca, 0,5 M sorbitolu, 5 g/l Bacto-Tryptonu, 2,5 g/l ekstraktu drożdżowego Bacto, 5 g/l NaCl i 18 g/l agaru Bacto, z dodatkiem 25 mg/l kanamycyny. Inkubację przeprowadzono przez 2 dni w 33°C.
Otrzymane szczepy nazwano DSM5715/pECzwfopcA i DSM5399/pECzwfopcA.
P r z y k ł a d 10
Wytwarzanie L-treoniny
Szczep C. glutamicum DSM5399/pECzwfopcA otrzymany w Przykładzie 9, hodowano na pożywce odpowiedniej do wytwarzania treoniny i określano zawartość treoniny w nadsączu. W tym celu, szczep wysiano na płytkę agarową z odpowiednim antybiotykiem (agar z wyciągiem z mózgu i serca z tetracykliną (5 mg/l)) przez 24 godziny w 33°C. Z płytki agarowej wykonano hodowlę wstępną (10 ml pożywki w 100 ml kolbie Erlenmeyera). Jako pożywkę do hodowli wstępnej zastosowano pożywkę Cg III.
Pożywka Cg III NaCl
Bacto-Pepton
2,5 g/l 10 g/l
PL 206 384 B1
Ekstrakt drożdżowy Bacto 10 g/l
Glukoza (autoklawowana osobno) 2% (wag./obj.) pH ustalono przy wartości 7,4.
Następnie dodano tetracyklinę (5 mg/l). Hodowlę wstępną inkubowano wytrząsając z szybkością 240 obrotów na minutę w 33°C na wytrząsarce przez 16 godzin. Tą hodowlą wstępną zaszczepiono główną hodowlę, tak że jej wstępna wartość OD (660 nm) wynosiła 0,1. Do hodowli głównej zastosowano pożywkę MM.
Pożywka MM
CSL (ang. Corn Steep Liquor) 5 g/l
MOPS (kwas morfolinopropanosulfonowy) 20 g/l
glukoza (autoklawowana osobno) 50 g/l
(NH4)2SO4 25 g/l
KH2PO4 0,1 g/l
MgSO4 x 7H2O 1,0 g/l
CaCl2 x 2H2O 10 mg/l
FeSO4 x 7H2O 10 mg/l
MnSO4 x H2O 5,0 mg/l
Biotyna (sterylizowana przez filtrację) 0,3 mg/l
Tiamina x HCl (sterylizowana przez filtrację) 0,2 mg/l
L-leucyna (sterylizowana przez filtrację) 0,1 g/l
CaCO3 25 g/l
CSL, MOPS i roztwór soli doprowadzono do pH 7 przy użyciu wody amoniakalnej i autoklawo-
wano. Na koniec, dodano sterylizowany roztwór substratów i witamin, jak również autoklawowany CaCO3 w postaci suchej.
Hodowlę prowadzono w 10 ml objętości w 100 ml kolbie Erlenmeyera z przegrodami. Dodano tetracyklinę (5 mg/l). Hodowlę prowadzono w 33°C i 80% wilgotności powietrza.
Po 72 godzinach określono OD przy długości fali 660 nm na urządzeniu Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Monachium). Ilość wytworzonej treoniny określano przy użyciu analizatora aminokwasów z Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Niemcy) przez chromatografię jonowymienną i następującą po chromatografii derywatyzację z wykrywaniem metodą ninhydrynową.
Wyniki doświadczenia przedstawiono w Tabeli 1.
T a b e l a 1
Szczep OD L-treonina g/l
DSM5399 12,3 0,74
DSM5399/pECzwfopcA 9,9 1,0
P r z y k ł a d 11
Wytwarzanie L-lizyny
Szczep C. glutamicum DSM5715/pECzwfopcA otrzymany w Przykładzie 9, hodowano na pożywce odpowiedniej do wytwarzania lizyny i określano zawartość lizyny w nadsączu.
W tym celu, szczep wysiano na płytkę agarową z odpowiednim antybiotykiem (agar z wyciągiem z mózgu i serca z tetracykliną (5 mg/l)) na 24 godziny w 33°C. Z płytki wykonano hodowlę wstępną (10 ml pożywki w 100 ml kolbie Erlenmeyera). Jako pożywkę do hodowli wstępnej zastosowano pożywkę Cg III.
Pożywka Cg III
2,5 g/l g/l 10 g/l
2% (wag./obj.) pH
NaCl
Bacto-Pepton Ekstrakt drożdżowy Bacto Glukoza (autoklawowana osobno) pH ustalono przy wartości 7,4.
Następnie dodano tetracyklinę (5 mg/l). Hodowlę wstępną inkubowano wytrząsając z szybkością 240 obrotów na minutę w 33°C na wytrząsarce przez 16 godzin. Tą hodowlą wstępną zaszczepiono główną hodowlę, tak że jej wstępna wartość OD (660 nm) wynosiła 0,1. Do hodowli głównej zastosowano pożywkę MM.
PL 206 384 B1
Pożywka MM
CSL (ang. Corn Steep Liquor) 5 g/l
MOPS (kwas morfolinopropanosulfonowy) 20 g/l
glukoza (autoklawowana osobno) 58 g/l
(NH4)2SO4 25 g/l
KH2PO4 0,1 g/l
MgSO4 x 7H2O 1,0 g/l
CaCl2 x 2H2O 10 mg/l
FeSO4 x 7H2O 10 mg/l
MnSO4 x H2O 5,0 mg/l
Biotyna (sterylizowana przez filtrację) 0,3 mg/l
Tiamina x HCl (sterylizowana przez filtrację) 0,2 mg/l
L-leucyna (sterylizowana przez filtrację) 0,1 g/l
CaCO3 25 g/l
CSL, MOPS i roztwór soli doprowadzono do pH 7 przy użyciu wody amoniakalnej i autoklawo-
wano. Następnie dodano sterylizowany roztwór substratów i witamin, jak również autoklawowany CaCO3 w postaci suchej.
Hodowlę prowadzono w 10 ml objętości w 100 ml kolbie Erlenmeyera z przegrodami. Dodano tetracyklinę (5 mg/l). Hodowlę prowadzono w 33°C i przy 80% wilgotności powietrza.
Po 72 godzinach określono OD przy długości fali 660 nm na urządzeniu Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Monachium). Wytworzoną lizynę określono przy użyciu analizatora aminokwasów Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Niemcy) przez chromatografię jonowymienną i następującą po chromatografii derywatyzację z wykrywaniem metodą ninhydrynową.
Wyniki doświadczenia przedstawiono w Tabeli 2.
T a b e l a 2
Szczep OD L-lizyna g/l
DSM5715 10,8 16,0
DSM5715/pECzwfopcA 8,1 17,1
PL 206 384 B1
Lista sekwencji <110> National University of Ireland, Galway Degussa-Hiils AG Forschungszentrum Juelich GmbH <12O> ’ Sekwencje nukleotydowe- kodujące gen opcA e <130> 990213 BT <140>
<141>
<160> 12 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 . <211> 6995 ' <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <220>
<221> CDS <222> (3658)..(5202) <223> zwf <220>
<221> CDS <222> (5217)..(6173) <223> opcA <400> 1
cacatttgaa ccacagttgg ttataaaatg ggttcaacat cactatggtt agaggtgttg 60
acgggtcaga ttaagcaaag actactttcg gggtagatca cctttgccaa atttgaacca 120
attaacctaa gtcgtagatc tgatcatcgg atctaacgaa aacgaaccaa aactttggtc 180
ccggtttaac ccaggaagga ttgaccaćct tgacgctgtc acctgaactt caggcgctca 240
ctgtacgcaa ttacccctct gattggtccg atgtggacac caaggctgta gacactgttc 300
gtgtcctcgc tgcagacgct gtagaaaact gtggctccgg ccacccaggc accgcaatga 360
gcctggctcc ccttgcatac accttgtacc agcgggttat gaacgtagat ccacaggaca 420
ccaactgggc aggccgtgac cgcttcgttc tttcttgtgg ccactcctct ttgacccagt 480
acatccagct ttacttgggt ggattcggcc ttgagatgga tgacctgaag gctctgcgca 540
cctgggattc cttgacccca ggacaccctg agtaccgcca caccaagggc gttgagatca 600
ccactggccc tcttggccag ggtcttgcat ctgcagttgg tatggccatg gctgctcgtc 660
gtgagcgtgg cctattcgac ccaaccgctg ctgagggcga atccccattc gaccaccaca 720
tctacgtcat tgcttctgat ggtgacctgc aggaaggtgt cacctctgag gcatcctcca 780
tcgctggcac ccagcagctg ggcaacctca tcgtgttctg ggatgacaac cgcatctcca 840
tcgaagacaa cactgagatc gctttcaacg aggacgttgt tgctcgttac aaggcttacg 900
PL 206 384 B1
gctggcagac cattgaggtt gaggctggcg aggacgttgc agcaatcgaa gctgcagtgg 960
ctgaggctaa gaaggacacc aagcgaccta ccttcatccg cgttcgcacc atcatcggct 1020
tcccagctcc aactatgatg aacaccggtg ctgtgcacgg tgctgctctt ggcgcagctg 1080
aggttgcagc aaccaagact gagcttggat tcgatcctga ggctcacttc gcgatcgacg 1140
atgaggttat cgctcacacc cgctccctcg cagagcgcgc tgcacagaag aaggctgcat 1200
ggcaggtcaa gttcgatgag tgggcagctg ccaaccctga gaacaaggct ctgttcgatc 1260
gcctgaactc ccgtgagctt ccagcgggct acgctgacga gctcccaaca tgggatgcag 1320
atgagaaggg cgtcgcaact cgtaaggctt ccgaggctgc acttcaggca ctgggcaaga 1380
cccttcctga gctgtggggc ggttccgctg acctcgcagg ttccaacaac accgtgatca 1440
agggctcccc ttccttcggc cctgagtcca tctccaccga gacctggtct gctgagcctt 1500
acggccgtaa cctgcacttc ggtatccgtg agcacgctat gggatccatc ctcaacggca 1560
tttccctcca cggtggcacc cgcccatacg gcggaacctt cctcatcttc tccgactaca 1620
tgcgtcctgc agttcgtctt gcagctctca tggagaccga cgcttactac gtctggaccc 1680
acgactccat cggtctgggc gaagatggcc caacccacca gcctgttgaa accttggctg 1740
cactgcgcgc catcccaggt ctgtccgtcc tgcgtcctgc agatgcgaac gagaccgccc 1800
aggcttgggc tgcagcactt gagtacaagg aaggccctaa gggtcttgca ctgacccgcc 1B60
agaacgttcc tgttctggaa ggcaccaagg agaaggctgc tgaaggcgtt cgccgcggtg 1920
gctacgtcct ggttgagggt tccaaggaaa ccccagatgt gatcctcatg ggctccggct 1980
ccgaggttca gcttgcagtt aacgctgcga aggctctgga agctgagggc gttgcagctc 2040
gcgttgtttc cgttccttgc atggattggt tccaggagca ggacgcagag tacatcgagt 2100
ccgttctgcc tgcagctgtg accgćtcgtg tgtctgttga agctggcatc gcaatgcctt 2160
ggtaccgctt cttgggcacc cagggccgtg ctgtctccct tgagcacttc ggtgcttctg 2220
cggattacca gaccctgttt gagaagttcg gcatcaccac cgatgcagtc gtggcagcgg 2280
ccaaggactc cattaacggt taattgccct gctgttttta gcttcaaccc ggggcaatat 2340
gattctccgg aattttattg ccccgggttg ttgttgttaa tcggtacaaa gggtcttaag 2400
cacatccctt acttgcctgc tctccttgag cacagttcaa gaacaattct tttaaggaaa 2460
atttagtttc atgtctcaca ttgatgatct tgcacagctc ggcacttcca cttggctcga 2520
cgacctctcc cgcgagcgca ttacttccgg caatctcagc caggttattg aggaaaagtc 2580
tgtagtcggt gtcaccacca acccagctat tttcgcagca gcaatgtcca agggcgattc 2640
ctacgacgct cagatcgcag agctcaaggc cgctggcgca tctgttgacc aggctgttta 2700
cgccatgagc atcgacgacg ttcgcaatgc ttgtgatctg ttcaccggca tcttcgagtc 2760
ctccaacggc tacgacggcc gcgtgtccat cgaggttgac ccacgtatct ctgctgaccg 2820
PL 206 384 B1
cgacgcaacc ctggctcagg ccaaggagct gtgggcaaag gttgatcgtc caaacgtcat 2880
gatcaagatc cctgcaaccc caggttcttt gccagcaatc accgacgctt tggctgaggg 2940
catcagcgtt aacgtcacct tgatcttctc cgttgctcgc taccgcgagg tcatcgctgc 3000
gttcatcgag ggcatcaagc aggctgctgc aaacggccac gacgtctcca agatccactc 3060
tgtggcttcc ttcttcgtct cccgcgtcga cgttgagatc gacaagcgcc tcgaggcaat 3120
cggatccgat gaggctttgg ctctgcgcgg caaggcaggc gttgccaacg ctcagcgcgc 3180
ttacgctgtg tacaaggagc ttttcgacgc cgccgagctg cctgaaggtg ccaacactca 3240
gcgcccactg tgggcatcca ccggcgtgaa gaaccctgcg tacgctgcaa ctctttacgt 3300
ttccgagctg gctggtccaa acaccgtcaa caccatgcca gaaggcacca tcgacgcggt 3360
tctggagcag ggcaacctgc acggtgacac cctgtccaac tccgcggcag aagctgacgc 3420
tgtgttctcc cagcttgagg ctctgggcgt tgacttggca gatgtcttcc aggtcctgga 3480
gaccgagggt gtggacaagt tcgttgcttc ttggagcgaa ctgcttgagt ccatggaagc 3540
tcgcctgaag tagaatcagc acgctgcatc agtaacggcg acatgaaatc gaattagttc 3600
gatcttatgt ggccgttaca catctttcat taaagaaagg atcgtgacac taccatc 3657
gtg Val 1 agc Ser aca Thr aac acg acc Thr ccc tcc Pro Ser agc Ser tgg Trp 10 aca Thr aac Asn cca Pro ctg Leu ege Arg 15 gac Asp 3705
Asn Thr 5
ccg cag gat aaa ega ctc ccc ege atc gct ggc cct tcc ggc atg gtg 3753
Pro Gin Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val
20 25 30
atc ttc ggt gtc act ggc gac ttg gct ega aag aag ctg ctc ccc gcc 3801
Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala
35 40 45
att tat gat eta gca aac ege gga ttg ctg ccc cca gga ttc teg ttg 3849
Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu
50 55 60
gta ggt tac ggc ege ege gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac 3897
Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr
65 70 75 80
PL 206 384 B1
gta Val cgc gat gcc gca Ala Ala 85 agt Ser get Ala ggt Gly get Ala cgt Arg 90 acg Thr gaa Glu ttc Phe cgt Arg gaa Glu 95 aat Asn 3945
Arg Asp
gtt tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt 3993
Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe
100 105 110
gat gat gat gca get ttc gac aac ctc get gca aca ctc aag cgc atc 4041
Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile
115 120 125
gac aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg get tac tac ctg tcc att 4089
Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile
130 135 140
cca cca gat tcc ttc aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc 4137
Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gin Leu Glu Arg Ser Gly
145 150 155 160
atg get gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag 4185
Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys
165 170 175
cct ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc 4233
Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gin Leu Val
180 185 190
aac gca gtc ttc cca gaa tet tet gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg 4281
Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu
195 200 205
ggc aag gaa aca gtt caa aac atc ctg get ctg cgt ttt get aac cag 4329
Gly Lys Glu Thr Val Gin Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gin
210 215 220
ctg ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc 4377
Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gin Ile
225 230 235 240
acc atg get gaa gat att ggc ttg ggt gga cgt get ggt tac tac gac 4425
Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp
245 250 255
ggc atc ggc gca gcc cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc 4473
Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gin Asn His Leu Ile Gin Leu
260 265 270
ttg get ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tet ttc gtg cca gcg cag 4521
Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gin
275 280 285
ctg cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tet gcg aca aag ccg tgc tac 4569
Leu Gin Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr
290 295 300
PL 206 384 B1
cca ttg gat aaa acc tcc get cgt ggt
Pro 305 Leu Asp Lys Thr Ser 310 Ala Arg Gly
ggc tet gag tta gtc aag gga ctt ege
Gly Ser Glu Leu Val 325 Lys Gly Leu Arg
gag tcc acc act gag act ttt gcg get
Glu Ser Thr Thr 340 Glu Thr Phe Ala Ala 345
cgt ege tgg get ggt gtg ccg ttc tac
Arg Arg Trp 355 Ala Gly Val Pro Phe 360 Tyr
ggt ege cgt gtt act gag att gcc gtg
Gly Arg 370 Arg Val Thr Glu Ile 375 Ala Val
cag cct ttc gac ggc gac atg act gta
Gin 385 Pro Phe Asp Gly Asp 390 Met Thr Val
gtg att ege gtg cag cct gat gaa ggt
Val Ile Arg Val Gin 405 Pro Asp Glu Gly
aag gtt cca ggt tet gcc atg gaa gtc
Lys Val Pro Gly 420 Ser Ala Met Glu Val 425
tcc tac tea gaa tcc ttc act gaa gaa
Ser Tyr Ser 435 Glu Ser Phe Thr Glu 440 Glu
ctc att ttg gat gcg ctg tta gat gaa
Leu Ile 450 Leu Asp Ala Leu Leu 455 Asp Glu
gag gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att
Glu 485 Glu Val Glu Leu Ser 470 Trp Lys Ile
tgg gat gcc gat gga gaa cca gag gat
Trp Asp Ala Asp Gly 485 Glu Pro Glu Asp
cca aag agc get gat gaa atg ctt tcc
Pro Lys Ser Ala 500 Asp Glu Met Leu Ser 505
agg Arg cca Pro taa 515 tttaggggca aaaa atg Met atc Ile
cag Gin tac Tyr 315 get Ala gcc Ala ggt Gly tgg Trp cag Gin 320 4617
gaa gaa gat ggc ttc aac cct 4665
Glu 330 Glu Asp Gly Phe Asn 335 Pro
tgt acc tta gag atc acg tet 4713
Cys Thr Leu Glu Ile 350 Thr Ser
ctg ege acc ggt aag cgt ctt 4761
Leu Arg Thr Gly 365 Lys Arg Leu
gtg ttt aaa gac gca cca cac 4809
Val Phe Lys 380 Asp Ala Pro His
tcc ctt ggc caa aac gcc atc 4857
Ser Leu 395 Gly Gin Asn Ala Ile 400
gtg ctc atc ege ttc ggt tcc 4905
Val 410 Leu Ile Arg Phe Gly 415 Ser
cgt gac gtc aac atg gac ttc 4953
Arg Asp Val Asn Met 430 Asp Phe
tea cct gaa gca tac gag ege 5001
Ser Pro Glu Ala 445 Tyr Glu Arg
tcc agc ctc ttc cct acc aac 504 9
Ser Ser Leu 4 60 Phe Pro Thr Asn
ctg gat cca att ctt gaa gca 5097
Leu Asp 475 Pro Ile Leu Glu Ala 480
tac cca gcg ggt acg tgg ggt 5145
Tyr 490 Pro Ala Gly Thr Trp 495 Gly
ege aac ggt cac acc tgg ege 5193
Arg Asn Gly His Thr 510 Trp Arg
ttt gaa ctt ccg gat acc acc 5243
Phe Glu Leu 520 Pro Asp Thr Thr
PL 206 384 B1
acc Thr 525 cag Gin caa Gin att Ile tcc Ser aag Lys 530 acc Thr eta Leu act Thr ega Arg ctg Leu 535 cgt Arg gaa tcg ggc acc Glu Ser Gly Thr 540 5291
cag gtc acc acc ggc ega gtg ctc acc ctc atc gtg gtc act gac tcc 5339
Gin Val Thr Thr Gly Arg Val Leu Thr Leu Ile Val Val Thr Asp Ser
545 550 555
gaa agc gat gtc get gca gtt acc gag tcc acc aat gaa gcc tcg cgc 5387
Glu Ser Asp Val Ala Ala Val Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala Ser Arg
560 565 570
gag cac cca tct cgc gtg atc att ttg gtg gtt ggc gat aaa act gca 5435
Glu His Pro Ser Arg Val Ile Ile Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala
575 580 585
gaa aac aaa gtt gac gca gaa gtc cgt atc ggt ggc gac get ggt get 5483
Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu Val Arg Ile Gly Gly Asp Ala Gly Ala
590 595 600
tcc gag atg atc atc atg cat ctc aac gga cct gtc get gac aag ctc 5531
Ser Glu Met Ile Ile Met His Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu
605 610 615 620
cag tat gtc gtc aca cca ctg ttg ctt cct gac acc ccc atc gtt get 5579
Gin Tyr Val Val Thr Pro Leu Leu Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala
625 630 635
tgg tgg cca ggt gaa tea cca aag aat cct tcc cag gac cca att gga 5627
Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro Lys Asn Pro Ser Gin Asp Pro Ile Gly
640 645 650
cgc atc gca caa ega cgc atc act gat get ttg tac gac cgt gat gac 5675
Arg Ile Ala Gin Arg Arg Ile Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp
655 660 665
gca eta gaa gat cgt gtt gag aac tat cac cca ggt gat acc gac atg 5723
Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met
670 675 680
acg tgg gcg cgc ctt acc cag tgg cgg gga ctt gtt gcc tcc tea ttg 5771
Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gin Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu
685 690 695 700
gat cac cca cca cac agc gaa atc act tcc gtg agg ctg acc ggt gca 5819
Asp His Pro Pro His Ser Glu Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala
705 710 715
agc ggc agt acc tcg gtg gat ttg get gca ggc tgg ttg gcg cgg agg 5867
Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg
720 725 730
ctg aaa gtg cct gtg atc cgc gag gtg aca gat get ccc acc gtg cca 5915
Leu Lys Val Pro Val Ile Arg Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro
735 740 745
PL 206 384 B1
5963
acc gat gag ttt ggt act
Thr Asp Glu Phe Gly Thr
750
gtt cgc acc acc gg<= tcg
Val Arg Thr Thr Gly Ser
765 770
ctt cag gta gag atg ccg
785
att ggt cgt ega agt gag
Ile Gly Arg Arg Ser Glu
800
atg gat cca gat ttg ggc
815
cca ctg ctg gct atc cag cgc ctg gag atc
Pro Leu Leu Ala Ile Gin Arg Leu Glu Ile
755 7 60
atc atc atc acc atc tat gac gct cat acc
Ile Ile Ile Thr Ile Tyr Asp Ala His Thr
775 780
gaa tcc ggc aat gcc cca tcg ctg gtg gct
Glu Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala
790 795
tcc gac tgc ttg tct gag gag ctt cgc cac
Ser Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His
805 810
tac cag cac gca eta tcc ggc ttg tcc agc
Tyr Gin His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser
820 825
6011
6059
6107
6155 gtc aag ctg gaa acc gtc taaggagaaa tacaacacta tggttoatot Val Lys Leu Glu Thr Val
830
6203
agtacgcgca cgcgatactg aagatttggt tgcacaggct gcctccaaat tcattgaggt 6263
tgttgaagca gcaactgcca ataatggcac cgcacaggta gtgctcaccg gtggtggcgc 6323
cggcatcaag ttgctggaaa ageteagegt tgatgcggct gaccttgcct gggategeat 6383
tcatgtgttc ttcggcgatg agcgcaatgt ccctgtcagt gattctgagt ccaatgaggg 6443
ccaggctcgt gaggcactgt tgtccaaggt ttctatccct gaagccaaca ttcacggata 6503
tggtctcggc gacgtagatc ttgcagaggc agcccgcgct tacgaagctg tgttggatga 6563
attcgcacca aacggctttg atcttcacct geteggeatg ggtggcgaag gccatatcaa 6623
ctccctgttc cctcacaccg atgcagtcaa ggaatcctcc gcaaaggtca tcgcggtgtt 6683
tgattcccct aagcctcctt cagagcgtgc aactctaacc cttcctgcgg ttcactccgc 6743
aaagcgcgtg tggttgctgg tttctggtgc ggagaaggct gaggcagctg cggcgatcgt 6803
caacggtgag cctgctgttg agtggcctgc tgctggagct accggatctg aggaaacggt 6863
attgttcttg gctgatgatg ctgcaggaaa tctctaagca gcgccagctc taacaagaag 6923
ctttaacaag aagctctaac gaaaagcact aacaaactaa tccgggtgcg aaccttcatc 6983
tgaatcgatg ga 6995
<210> 2 <211> 514 <212> PRT <213> Corynebacteriura glutamicum ATCC13032 <400> 2
Val Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arq Asd 1 5 10 15
PL 206 384 B1
Pro Gin Asp Lys 20 Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro. Ser 25 Gly 30 Met Val
Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala
35 40 45
Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu
50 55 60
Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr
65 70 75 80
Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn
85 90 95
Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe
100 105 110
Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile
115 120 125
Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile
130 135 140
Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gin Leu Glu Arg Ser Gly
145 150 155 160
Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys
165 170 175
Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gin Leu Val
180 185 190
Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu
195 200 205
Gly Lys Glu Thr Val Gin Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gin
210 215 220
Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gin Ile
225 230 235 240
Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp
245 250 255
Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gin Asn His Leu Ile Gin Leu
260 265 270
Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gin
275 280 285
Leu Gin Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr
290 295 300
PL 206 384 B1
Pro 305 Leu Asp Lys Thr Ser 310 Ala Arg Gly Gin Tyr 315 Ala Ala Gly Trp Gin 320
Gly Ser Glu Leu Val 325 Lys Gly Leu Arg Glu 330 Glu Asp Gly Phe Asn 335 Pro
Glu Ser Thr Thr 340 Glu Thr Phe Ala Ala 345 Cys Thr Leu Glu Ile 350 Thr Ser
Arg Arg Trp 355 Ala Gly Val Pro Phe 360 Tyr Leu Arg Thr Gly 365 Lys Arg Leu
Gly Arg 370 Arg Val Thr Glu Ile 375 Ala Val Val Phe Lys 380 Asp Ala Pro His
Gin 385 Pro Phe Asp Gly Asp 390 Met Thr Val Ser Leu 395 Gly Gin Asn Ala Ile 400
Val Ile Arg Val Gin 405 Pro Asp Glu Gly Val 410 Leu Ile Arg Phe Gly 415 Ser
Lys Val Pro Gly 420 Ser Ala Met Glu Val 425 Arg Asp Val Asn Met 430 Asp Phe
Ser Tyr Ser 435 Glu Ser Phe Thr Glu 440 Glu Ser Pro Glu Ala 445 Tyr Glu Arg
Leu Ile 450 Leu Asp Ala Leu Leu 455 Asp Glu Ser Ser Leu 4 60 Phe Pro Thr Asn
Glu 465 Glu Val Glu Leu Ser 470 Trp Lys Ile Leu Asp 475 Pro Ile Leu Glu Ala 480
Trp Asp Ala Asp Gly 485 Glu Pro Glu Asp Tyr 490 Pro Ala Gly Thr Trp 4 95 Gly
Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg
500 505 510
Arg Pro <210> 3 <211> 319 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <400> 3
Met 1 Ile Phe Glu Leu 5 Pro Asp Thr Thr Thr 10 Gin Gin Ile Ser Lys 15 Thr
Leu Thr Arg Leu 20 Arg Glu Ser Gly Thr 25 Gin Val Thr Thr Gly 30 Arg Val
Leu Thr Leu 35 Ile Val Val Thr Asp 40 Ser Glu Ser Asp Val 45 Ala Ala Val
Thr Glu 50 Ser Thr Asn Glu Ala 55 Ser Arg Glu His Pro 60 Ser Arg Val Ile
Ile Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu
PL 206 384 B1
65 70 75 80
Val Arg Ile Gly Gly 85 Asp Ala Gly Ala Ser 90 Glu Met Ile Ile Met 95 His
Leu Asn Gly Pro 100 Val Ala' Asp Lys Leu 105 Gin Tyr Val Val Thr 110 Pro Leu
Leu Leu Pro 115 Asp Thr Pro Ile Val 120 Ala Trp Trp Pro Gly 125 Glu Ser Pro
Lys Asn 130 Pro Ser Gin Asp Pro 135 Ile Gly Arg Ile Ala 140 Gin Arg Arg Ile
Thr 145 Asp Ala Leu Tyr Asp 150 Arg Asp Asp Ala Leu 155 Glu Asp Arg Val Glu 160
Asn Tyr His Pro Gly 165 Asp Thr Asp Met Thr 170 Trp Ala Arg Leu Thr 175 Gin
Trp Arg Gly Leu 180 Val Ala Ser Ser Leu 185 Asp His Pro Pro His 190 Ser Glu
Ile Thr Ser 195 Val Arg Leu Thr Gly 200 Ala Ser Gly Ser Thr 205 Ser Val Asp
Leu Ala 210 Ala Gly Trp Leu Ala 215 Arg Arg Leu Lys Val 220 Pro Val Ile Arg
Glu 225 Val Thr Asp Ala Pro 230 Thr Val Pro Thr Asp 235 Glu Phe Gly Thr Pro 240
Leu Leu Ala Ile Gin 245 Arg Leu Glu Ile Val 250 Arg Thr Thr Gly Ser 255 Ile
Ile Ile Thr Ile 260 Tyr Asp Ala His Thr 265 Leu Gin Val Glu Met 270 Pro Glu
Ser Gly Asn 275 Ala Pro Ser Leu Val 280 Ala Ile Gly Arg Arg 285 Ser Glu Ser
Asp Cys 290 Leu Ser Glu Glu Leu 295 Arg His Met Asp Pro 300 Asp Leu Gly Tyr
Gin 305 His Ala Leu Ser Gly 310 Leu Ser Ser Val Lys 315 Leu Glu Thr Val
<210> 4 <211> 960 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <220>
<221> CDS <222> (1)..(957) <223> opcA <400> 4 atg atc ttt gaa ctt ccg gat acc acc acc cag caa att tcc aag acc 48
Met Ile Phe Glu Leu Pro Asp Thr Thr Thr Gin Gin Ile Ser Lys Thr
5 10 15
PL 206 384 B1
eta Leu act Thr ega Arg ctg Leu 20 cgt Arg gaa tcg ggc acc cag gtc Gly Thr Gin Val 25 acc Thr acc Thr ggc Gly 30 ega Arg gtg Val 96
Glu Ser
ctc acc ctc atc gtg gtc act gac tcc gaa agc gat gtc gct gca gtt 144
Leu Thr Leu Ile Val Val Thr Asp Ser Glu Ser Asp Val Ala Ala Val
35 40 45
acc gag tcc acc aat gaa gcc tcg cgc gag cac cca tct cgc gtg atc 192
Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala Ser Arg Glu His Pro Ser Arg Val Ile
50 55 60
att ttg gtg gtt ggc gat aaa act gca gaa aac aaa gtt gac gca gaa 240
Ile Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu
65 70 75 80
gtc cgt atc ggt ggc gac gct ggt gct tcc gag atg atc atc atg cat 288
Val Arg Ile Gly Gly Asp Ala Gly Ala Ser Glu Met Ile Ile Met His
85 90 95
ctc aac gga cct gtc gct gac aag ctc cag tat gtc gtc aca cca ctg 336
Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gin Tyr Val Val Thr Pro Leu
100 105 110
ttg ctt cct gac acc ccc atc gtt gct tgg tgg cca ggt gaa tca cca 384
Leu Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro
115 120 125
aag aat cct tcc cag gac cca att gga cgc atc gca caa ega cgc atc 432
Lys Asn Pro Ser Gin Asp Pro Ile Gly Arg Ile Ala Gin Arg Arg Ile
130 135 140
act gat gct ttg tac gac cgt gat gac gca eta gaa gat cgt gtt gag 480
Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu
145 150 155 160
aac tat cac cca ggt gat acc gac atg acg tgg gcg cgc ctt acc cag 528
Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gin
165 170 175
tgg cgg gga ctt gtt gcc tcc tca ttg gat cac cca cca cac agc gaa 576
Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His Pro Pro His Ser Glu
180 185 190
atc act tcc gtg agg ctg acc ggt gca agc ggc agt acc tcg gtg gat 624
Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp
195 200 205
PL 206 384 B1
ttg Leu gct Ala 210 gca Ala ggc Gly tgg Trp ttg Leu gcg Ala 215 cgg Arg agg Arg ctg Leu aaa Lys gtg Val 220 cct Pro gtg Val atc Ile cgc Arg 672
gag gtg aca gat gct ccc acc gtg cca acc gat gag ttt ggt act cca 720
Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro
225 230 235 240
ctg ctg gct atc cag cgc ctg gag atc gtt cgc acc acc ggc tcg atc 768
Leu Leu Ala Ile Gin Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile
245 250 255
atc atc acc atc tat gac gct cat acc ctt cag gta gag atg ccg gaa 816
Ile Ile Thr Ile Tyr Asp Ala His Thr Leu Gin Val Glu Met Pro Glu
260 265 270
tcc ggc aat gcc cca tcg ctg gtg gct att ggt cgt ega agt gag tcc 864
Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala Ile Gly Arg Arg Ser Glu Ser
275 280 285
gac tgc ttg tct gag gag ctt cgc cac atg gat cca gat ttg ggc tac 912
Asp cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr
290 295 300
cag cac gca eta tcc ggc ttg tcc agc gtc aag ctg gaa acc gtc taa 960
Gin His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val
305 310 315
<210> 5 <211> 319 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <400> 5
Met 1 Ile Phe Glu Leu 5 Pro Asp Thr Thr Thr 10 Gin Gin Ile Ser Lys 15 Thr
Leu Thr Arg Leu 20 Arg Glu Ser Gly Thr 25 Gin Val Thr Thr Gly 30 Arg Val
Leu Thr Leu 35 Ile Val Val Thr Asp 40 Ser Glu Ser Asp Val 45 Ala Ala Val
Thr Glu 50 Ser Thr Asn Glu Ala 55 Ser Arg Glu His Pro 60 Ser Arg Val Ile
Ile 65 Leu Val Val Gly Asp 70 Lys Thr Ala Glu Asn 75 Lys Val Asp Ala Glu 80
Val Arg Ile Gly Gly 85 Asp Ala Gly Ala Ser 90 Glu Met Ile Ile Met 95 His
Leu Asn Gly Pro 100 Val Ala Asp Lys Leu 105 Gin Tyr Val Val Thr 110 Pro Leu
Leu Leu Pro 115 Asp Thr Pro Ile Val 120 Ala Trp Trp Pro Gly 125 Glu Ser Pro
Lys Asn 130 Pro Ser Gin Asp Pro 135 Ile Gly Arg Ile Ala 140 Gin Arg Arg Ile
PL 206 384 B1
Thr Asp 145 Ala Leu Tyr Asp 150 Arg Asp Asp Ala Leu 155 Glu Asp Arg Val Glu 160
Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gin
165 170 175
Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His Pro Pro His Ser Glu
180 185 190
Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp
195 200 205
Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Lys Val Pro Val Ile Arg
210 215 220
Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro
225 230 235 240
Leu Leu Ala Ile Gin Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile
245 250 255
Ile Ile Thr Ile Tyr Asp Ala His Thr Leu Gin Val Glu Met Pro Glu
260 265 270
Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala Ile Gly Arg Arg Ser Glu Ser
275 280 285
Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr
290 295 300
Gin His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val
305 310 315
<210> 6 <211> 3038 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum AS019 <220>
<221> CDS <222> (115)..(1659) <223> zwf <220>
<221> CDS <222> (1672)..(2628) <223> opcA <400> 6 cctgaagtag aatcagcacg ctgcatcagt aacggcgaca tgaaatcgaa ttagttcgat 60
PL 206 384 B1 cttatgtggc cgttacacat ctttcattaa agaaaggatc gtgacactac catc gtg 117 Val . 1
agc Ser aca Thr aac Asn acg Thr 5 acc Thr ccc Pro tcc Ser agc Ser tgg Trp 10 aca Thr aac Asn cca Pro ctg Leu cgc Arg 15 gac Asp ccg Pro 165
cag gat aaa ega ctc ccc cgc atc get ggc cct tcc ggc atg gtg atc 213
Gin Asp Lys 20 Arg Leu Pro Arg Ile 25 Ala Gly Pro Ser Gly 30 Met Val Ile
ttc ggt gtc act ggc gac ttg get ega aag aag ctg ctc ccc gcc att 261
Phe Gly 35 Val Thr Gly Asp Leu 40 Ala Arg Lys Lys Leu 45 Leu Pro Ala Ile
tat gat eta gca aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc teg ttg gta 309
Tyr 50 Asp Leu Ala Asn Arg 55 Gly Leu Leu Pro Pro 60 Gly Phe Ser •Leu Val 65
ggt tac ggc cgc cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac gta 357
Gly Tyr Gly Arg Arg 70 Glu Trp Ser Lys Glu 75 Asp Phe Glu Lys Tyr 80 Val
cgc gat gcc gca agt get ggt get cgt acg gaa ttc cgt gaa aat gtt 405
Arg Asp Ala Ala 85 Ser Ala Gly Ala Arg 90 Thr Glu Phe Arg Glu 95 Asn Val
tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt gat 453
Trp Glu Arg 100 Leu Ala Glu Gly Met 105 Glu Phe Val Arg Gly 110 Asn Phe Asp
gat gat gca get ttc gac aac ctc get gca aca ctc aag cgc atc gac 501
Asp Asp 115 Ala Ala Phe Asp Asn 120 Leu Ala Ala Thr Leu 125 Lys Arg Ile Asp
aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg get tac tac ctg tcc att cca 549
Lys 130 Thr Arg Gly Thr Ala 135 Gly Asn Trp Ala Tyr 140 Tyr Leu Ser Ile Pro 145
cca gat tcc ttc aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc atg 597
Pro Asp Ser Phe Thr 150 Ala Val Cys His Gin 155 Leu Glu Arg Ser Gly 160 Met
get gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag cct 645
Ala Glu Ser Thr 165 Glu Glu Ala Trp Arg 170 Arg Val Ile Ile Glu 175 Lys Pro
ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc aac 693
Phe Gly His 180 Asn Leu Glu Ser Ala 185 His Glu Leu Asn Gin 190 Leu Val Asn
gca gtc ttc cca gaa tet tet gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg ggc 741
Ala Val 195 Phe Pro Glu Ser Ser 200 Val Phe Arg Ile Asp 205 His Tyr Leu Gly
aag gaa aca gtt caa aac atc ctg get ctg cgt ttt get aac cag ctg 789
Lys 210 Glu Thr Val Gin Asn 215 Ile Leu Ala Leu Arg 220 Phe Ala Asn Gin Leu 225
ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc acc 837
Phe Glu Pro Leu Trp 230 Asn Ser Asn Tyr Val 235 Asp His Val Gin Ile 240 Thr
PL 206 384 B1
atg Met get Ala gaa Glu gat att Asp Ile 245 ggc ttg ggt gga Gly 250 cgt Arg get Ala ggt Gly tac tac gac ggc 885
Gly Leu Gly Tyr Tyr 255 Asp Gly
atc ggc gca ccg cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc ttg 933
Ile Gly Ala Pro Arg Asp Val Ile Gin Asn His Leu Ile Gin Leu Leu
260 265 270
get ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg gca cgg 981
Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Ala Arg
275 280 285
cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac cca 1029
Gin Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr Pro
290 295 300 305
ttg gat aaa acc tcc get cgt ggt cag tac get gcc ggt tgg cag ggc 1077
Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gin Tyr Ala Ala Gly Trp Gin Gly
310 315 320
tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct gag 1125
Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro Glu
325 330 335
tcc acc act gag act ttt gcg get tgt acc tta gag atc acg tct cgt 1173
Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser Arg
340 345 350
cgc tgg get ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt ggt 1221
Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu Gly
355 360 365
cgc cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac cag 1269
Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His Gin
370 375 380 385
cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc gtg 1317
Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gin Asn Ala Ile Val
390 395 400
att cgc gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc aag 1365
Ile Arg Val Gin Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser Lys
405 410 415
gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc tcc 1413
Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe Ser
420 425 430
tac tea gaa tcc ttc act gaa gaa tea cct gaa gca tac gag cgc ctc 1461
Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg Leu
435 440 445
PL 206 384 B1
att ttg gat gcg ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct acc aac gag 1509
Ile 450 Leu Asp Ala Leu Leu 455 Asp Glu Ser Ser Leu 460 Phe Pro Thr Asn Glu 465
gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca tgg 1557
Glu Val Glu Leu Ser 470 Trp Lys Ile Leu Asp 475 Pro Ile Leu Glu Ala 480 Trp
gat gcc gat gga gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg tgg ggt cca 1605
Asp Ala Asp Gly 485 Glu Pro Glu Asp Tyr 4 90 Pro Ala Gly Thr Trp 495 Gly Pro
aag agc gct gat gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc agg 1653
Lys Ser Ala 500 Asp Glu Met Leu Ser 505 Arg Asn Gly His Thr 510 Trp Arg Arg
cca Pro taa 515 tttaggggca aa atg atc ttt gaa ctt ccg gat acc acc.acc cag Met Ile Phe Glu Leu Pro Asp Thr Thr Thr Gin 520 525 1704
caa att tcc aag acc eta act ega ctg cgt gaa tcg ggc acc cag gtc 1752
Gin Ile Ser Lys 530 Thr Leu Thr Arg Leu 535 Arg Glu Ser Gly Thr 540 Gin Val
acc acc ggc ega gtg ctc acc ctc atc gtg gtc act gac tcc gaa agc 1800
Thr Thr Gly 545 Arg Val Leu Thr Leu 550 Ile Val Val Thr Asp 555 Ser Glu Ser
gat gtc gct gca gtt acc gag tcc acc aat gaa gcc tcg cgc gag cac 1848
Asp Val 560 Ala Ala Val Thr Glu 565 Ser Thr Asn Glu Ala 570 Ser Arg Glu His
cca tct cgc gtg atc att ttg gtg gtt ggc gat aaa act gca gaa aac 1896
Pro 575 Ser Arg Val Ile Ile 580 Leu Val Val Gly Asp 585 Lys Thr Ala Glu Asn 590
aaa gtt gac gca gaa gtc cgt atc ggt ggc gac gct ggt gct tcc gag 1944
Lys Val Asp Ala Glu 595 Val Arg Ile Gly Gly 600 Asp Ala Gly Ala Ser 605 Glu
atg atc atc atg cat ctc aac gga cct gtc gct gac aag ctc cag tat 1992
Met Ile Ile Met 610 His Leu Asn Gly Pro 615 Val Ala Asp Lys Leu 620 Gin Tyr
gtc gtc aca cca ctg ttg ctt cct gac acc ccc atc gtt gct tgg tgg 2040
Val Val Thr 625 Pro Leu Leu Leu Pro 630 Asp Thr Pro Ile Val 635 Ala Trp Trp
cca ggt gaa tea cca aag aat cct tcc cag gac cca att gga cgc atc 2088
Pro Gly 640 Glu Ser Pro Lys Asn 645 Pro Ser Gin Asp Pro 650 Ile Gly Arg Ile
gca caa ega cgc atc act gat gct ttg tac gac cgt gat gac gca eta 2136
Ala 655 Gin Arg Arg Ile Thr 660 Asp Ala Leu Tyr Asp 665 Arg Asp Asp Ala Leu 670
PL 206 384 B1
gaa Glu gat Asp cgt gtt gag aac tat Tyr cac cca ggt gat Gly Asp 680 acc gac atg acg tgg Trp 2184
Arg Val Glu Asn 675 His Pro Thr Asp Met Thr 685
gcg cgc ctt acc cag tgg cgg gga ctt gtt gcc tcc tca ttg gat cac 2232
Ala Arg Leu Thr Gin Trp 690 Arg Gly Leu 695 Val Ala Ser Ser Leu Asp 700 His
cca cca cac agc gaa atc act tcc gtg agg ctg acc ggt gca agc ggc 2280
Pro Pro His 705 Ser Glu Ile Thr Ser 710 Val Arg Leu Thr Gly 715 Ala Ser Gly
agt acc teg gtg gat ttg gct gca ggc tgg ttg gcg cgg agg ctg aaa 2328
Ser Thr 720 Ser Val Asp Leu Ala 725 Ala Gly Trp Leu Ala 730 Arg Arg Leu Lys
gtg cct gtg atc cgc gag gtg aca gat gct ccc acc gtg cca aćc gat 2376
Val 735 Pro Val Ile Arg Glu 740 Val Thr Asp Ala Pro 745 Thr Val Pro Thr Asp 750
gag ttt ggt act cca ctg ctg gct atc cag cgc ctg gag atc gtt cgc 2424
Glu Phe Gly Thr Pro Leu 755 Leu Ala Ile Gin Arg 760 Leu Glu Ile Val 765 Arg
acc acc ggc teg atc atc atc acc atc tat gac gct cat acc ctt cag 2472
Thr Thr Gly Ser Ile Ile 770 Ile Thr Ile 775 Tyr Asp Ala His Thr Leu 780 Gin
gta gag atg ccg gaa tcc ggc aat gcc cca teg ctg gtg gct att ggt 2520
Val Glu Met 785 Pro Glu Ser Gly Asn 790 Ala Pro Ser Leu Val 795 Ala Ile Gly
cgt ega agt gag tcc gac tgc ttg tct gag gag ctt cgc cac atg gat 2568
Arg Arg 800 Ser Glu Ser Asp Cys 805 Leu Ser Glu Glu Leu 810 Arg His Met Asp
cca gat ttg ggc tac cag cac gca eta tcc ggc ttg tcc agc gtc aag 2616
Pro 815 Asp Leu Gly Tyr Gin 820 His Ala Leu Ser Gly 825 Leu Ser Ser Val Lys 830
ctg Leu gaa Glu acc Thr gtc taaggagaaa ' Val tacaacacta tggttgatgt agtacgcgca 2668
cgcatactga agatttggtt gcacaggctg cctccaaatt cattgaggtt gttgaagcag 2728
caactgccaa taatggcacc gcacaggtag tgctcaccgg tggtggcgcc ggcatcaagt 2788
tgctggaaaa geteagegtt gatgeggetg accttgcctg ggategeatt catgtgttct 2848
teggegatga gcgcaatgtc cctgtcagtg attctgagtc caatgagggc caggctcgtg 2908
aggcactgtt gtccaaggtt tctatccctg aagccaacat tcacggatat ggtctcggcg 2968
acgtagatct tgcagaggca gcccgcgctt acgaagctgt gttggatgaa ttcgcaccaa 3028
acggctttga 3038
<210> 7 <211> 514 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum AS019
PL 206 384 B1
<400> Ί Asn Thr 5 Thr Pro Ser Ser Trp 10 Thr Asn Pro Leu Arg 15 Asp
Val 1 Ser Thr
Pro Gin Asp Lys 20 Arg Leu Pro Arg Ile 25 Ala Gly Pro Ser Gly 30 Met Val
Ile Phe Gly 35 Val Thr Gly Asp Leu 40 Ala Arg Lys Lys Leu Leu 45 Pro Ala
Ile Tyr 50 Asp Leu Ala Asn Arg 55 Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe 60 Ser Leu
Val 65 Gly Tyr Gly Arg Arg 70 Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu 75 Lys Tyr 80
Val Arg Asp Ala Ala 85 Ser Ala Gly Ala Arg 90 Thr Glu Phe Arg Glu 95 Asn
Val Trp Glu Arg 100 Leu Ala Glu Gly Met 105 Glu Phe Val Arg Gly 110 Asn Phe
Asp Asp Asp 115 Ala Ala Phe Asp Asn 120 Leu Ala Ala Thr Leu Lys 125 Arg Ile
Asp Lys 130 Thr Arg Gly Thr Ala 135 Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu 140 Ser Ile
Pro 145 Pro Asp Ser Phe Thr 150 Ala Val Cys His Gin Leu Glu Arg 155 Ser Gly 160
Met Ala Glu Ser Thr 165 Glu Glu Ala Trp Arg 170 Arg Val Ile Ile Glu 175 Lys
Pro Phe Gly His 180 Asn Leu Glu Ser Ala 185 His Glu Leu Asn Gin 190 Leu Val
Asn Ala Val 195 Phe Pro Glu Ser Ser 200 Val Phe Arg Ile Asp His 205 Tyr Leu
Gly Lys 210 Glu Thr Val Gin Asn 215 Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala 220 Asn Gin
Leu 225 Phe Glu Pro Leu Trp 230 Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val 235 Gin Ile 240
Thr Met Ala Glu Asp 245 Ile Gly Leu Gly Gly 250 Arg Ala Gly Tyr Tyr 255 Asp
Gly Ile Gly Ala 260 Pro Arg Asp Val Ile 265 Gin Asn His Leu Ile 270 Gin Leu
Leu Ala Leu 275 Val Ala Met Glu Glu 280 Pro Ile Ser Phe Val Pro 285 Ala Ala
Arg Gin 290 Ala Glu Lys Ile Lys 295 Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro 300 Cys Tyr
Pro 305 Leu Asp Lys Thr Ser 310 Ala Arg Gly Gin Tyr Ala Ala Gly 315 Trp Gin 320
Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu *·* Glu Asp Gly Phe Asn Pro
PL 206 384 B1
325 330 335
Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser
340 345 350
Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu
355 360 365
Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His
370 375 380
Gin Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gin Asn Ala Ile
385 390 395 400
Val Ile Arg Val Gin Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser
405 410 415
Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe
420 425 430
Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg
435 440 445
Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn
450 455 4 60
Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala
4 65 470 475 480
Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly
485 4 90 495
Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg
500 505 510
Arg Pro <210> 8 <211> 319 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum AS019 <400> 8
Met 1 Ile Phe Glu Leu 5 Pro Asp Thr Thr Thr 10 Gin Gin Ile Ser Lys 15 Thr
Leu Thr Arg Leu Arg Glu Ser Gly Thr Gin Val Thr Thr Gly Arg Val
20 25 30
PL 206 384 B1
Leu Thr Leu 35 Ile Val Val Thr Asp 40 Ser Glu Ser Asp Val Ala 45 Ala Val
Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala Ser Arg Glu His Pro Ser Arg Val Ile
50 55 60
Ile Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu
65 70 75 80
Val Arg Ile Gly Gly Asp Ala Gly Ala Ser Glu Met Ile Ile Met His
85 90 95
Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gin Tyr Val Val Thr Pro Leu
100 105 110
Leu Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro
115 120 125
Lys Asn Pro Ser Gin Asp Pro Ile Gly Arg Ile Ala Gin Arg Arg Ile
130 135 140
Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu
145 150 155 160
Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gin
165 170 175
Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His Pro Pro His Ser Glu
180 185 190
Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp
195 200 205
Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Lys Val Pro Val Ile Arg
210 215 220
Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro
225 230 235 240
Leu Leu Ala Ile Gin Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile
245 250 255
Ile Ile Thr Ile Tyr Asp Ala His Thr Leu Gin Val Glu Met Pro Glu
260 265 270
Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala Ile Gly Arg Arg Ser Glu Ser
275 280 285
Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr
290 295 300
Gin His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val
305 310 315
<210> 9 <211> 960 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum AS019 <220>
PL 206 384 B1
atc Ile act Thr tcc gtg agg ctg acc Thr ggt Gly 200 gca agc ggc agt Ser acc Thr 205 teg Ser gtg Val gat Asp 624
Ser 195 Val Arg Leu Ala Ser Gly
ttg gct gca ggc tgg ttg gcg cgg agg ctg aaa gtg cct gtg atc cgc 672
Leu Ala Ala Gly Trp Leu· Ala Arg Arg Leu Lys Val Pro Val Ile Arg
210 215 220
gag gtg aca gat gct ccc acc gtg cca acc gat gag ttt ggt act cca 720
Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro
225 230 235 240
ctg ctg gct atc cag cgc ctg gag atc gtt cgc acc acc ggc teg atc 768
Leu Leu Ala Ile Gin Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile
245 250 255
atc atc acc atc tat gac gct cat acc ctt cag gta gag atg ccg gaa 816
Ile Ile Thr Ile Tyr Asp Ala His Thr Leu Gin Val Glu Met Pro Glu
260 265 270
tcc ggc aat gcc cca teg ctg gtg gct att ggt cgt ega agt gag tcc 864
Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala Ile Gly Arg Arg Ser Glu Ser
275 280 285
gac tgc ttg tct gag gag ctt cgc cac atg gat cca gat ttg ggc tac 912
Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr
290 295 300
cag cac gca eta tcc ggc ttg tcc agc gtc aag ctg gaa acc gtc taa 960
Gin His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val
305 310 315 <210> 10 <211> 319 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum AS019 <400> 10
Met 1 Ile Phe Glu Leu 5 Pro Asp Thr Thr Thr 10 Gin Gin Ile Ser Lys 15 Thr
Leu Thr Arg Leu 20 Arg Glu Ser Gly Thr 25 Gin Val Thr Thr Gly 30 Arg Val
Leu Thr Leu 35 Ile Val Val Thr Asp 40 Ser Glu Ser Asp Val 45 Ala Ala Val
Thr Glu 50 Ser Thr Asn Glu Ala 55 Ser Arg Glu His Pro 60 Ser Arg Val Ile
Ile 65 Leu Val Val Gly Asp 70 Lys Thr Ala Glu Asn 75 Lys Val Asp Ala Glu 80
Val Arg Ile Gly Gly 85 Asp Ala Gly Ala Ser 90 Glu Met Ile Ile Met 95 His
Leu Asn Gly Pro 100 Val Ala Asp Lys Leu 105 Gin Tyr Val Val Thr 110 Pro Leu
Leu Leu Pro 115 Asp Thr Pro Ile Val 120 Ala Trp Trp Pro Gly 125 Glu Ser Pro
PL 206 384 B1
Lys Asn 130 Pro Ser Gin Asp Pro 135 Ile Gly Arg Ile Ala 140 Gin Arg Arg Ile
Thr 145 Asp Ala Leu Tyr Asp 150 Arg Asp Asp Ala Leu 155 Glu Asp Arg Val Glu 160
Asn Tyr His Pro Gly 165 Asp Thr Asp Met Thr 170 Trp Ala Arg Leu Thr 175 Gin
Trp Arg Gly Leu 180 Val Ala Ser Ser Leu 185 Asp His Pro Pro His 190 Ser Glu
Ile Thr Ser 195 Val Arg Leu Thr Gly 200 Ala Ser Gly Ser Thr 205 Ser Val Asp
Leu Ala 210 Ala Gly Trp Leu Ala 215 Arg Arg Leu Lys Val 220 Pro Val Ile Arg
Glu 225 Val Thr Asp Ala Pro 230 Thr Val Pro Thr Asp 235 Glu Phe Gly Thr Pro 240
Leu Leu Ala Ile Gin 245 Arg Leu Glu Ile Val 250 Arg Thr Thr Gly Ser 255 Ile
Ile Ile Thr Ile 260 Tyr Asp Ala His Thr 265 Leu Gin Val Glu Met 270 Pro Glu
Ser Gly Asn 275 Ala Pro Ser Leu Val 280 Ala Ile Gly Arg Arg 285 Ser Glu Ser
Asp Cys 290 Leu Ser Glu Glu Leu 295 Arg His Met Asp Pro 300 Asp Leu Gly Tyr
Gin 305 His Ala Leu Ser Gly 310 Leu Ser Ser Val Lys 315 Leu Glu Thr Val
<210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <400> 11
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Trp Xaa Asn Pro Leu Arg Asp 15 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Corynebacterium·glutamicum ATCC13032 <400> 12
Met Ile Phe Xaa Leu Pro Asp Xaa Xaa Xaa Gin Gin Ile Ser Lys 15 10 15
PL 206 384 B1

Claims (18)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Izolowany polinukleotyd z bakterii maczugowatych kodujący polipeptyd o sekwencji aminokwasowej, która jest przynajmniej w 90% identyczna na całej długości sekwencji z sekwencją aminokwasową z Id. Sekw. nr 3 i Id. Sekw. nr 8, przy czym polipeptyd stanowi podjednostkę OpcA enzymu dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej.
  2. 2. Izolowany polinukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że polipeptyd ma sekwencję aminokwasową, która jest przynajmniej w 95% identyczna z sekwencją aminokwasową z Id. Sekw. nr 3 i Id. Sekw. nr 8.
  3. 3. Izolowany polinukleotyd według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że koniec N polipeptydu ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w Id. Sekw. nr 12.
  4. 4. Izolowany polinukleotyd według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienny tym, że polipeptyd ma sekwencję aminokwasową przedstawioną w Id. Sekw. nr 3 lub Id. Sekw. nr 8.
  5. 5. Izolowany polinukleotyd według zastrz. 1 do 4, znamienny tym, że ma sekwencję nukleotydową przedstawioną w Id. Sekw. nr 4 lub Id. Sekw. nr 9.
  6. 6. Izolowany polinukleotyd według zastrz. 1 do 4, znamienny tym, że ma sekwencję nukleotydową przedstawioną w Id. Sekw. nr 1 lub Id. Sekw. nr 6.
  7. 7. Izolowany polinukleotyd według zastrz. 1 do 6, znamienny tym, że jest RNA.
  8. 8. Izolowany polinukleotyd, który ma sekwencję nukleotydową w pełni komplementarną do polinukleotydu określonego w dowolnym z zastrz. 1 do 6.
  9. 9. Wektor obejmujący polinukleotyd określony w dowolnym z zastrzeżeń 1 do 6 i 8.
  10. 10. Bakteria maczugowata transformowana przez wprowadzenie wektora określonego w zastrz. 9.
  11. 11. Bakteria maczugowata według zastrz. 10, znamienna tym, że zawiera zintegrowane w chromosomie wielokrotne kopie polinukleotydów określonych w zastrz. 1 do 6 i 8.
  12. 12. Bakteria maczugowata według zastrz. 10 albo 11, znamienna tym, że jest z gatunku Corynebacterium glutamicum.
  13. 13. Sposób wytwarzania L-aminokwasów, znamienny tym, że prowadzi się następujące etapy:
    a) fermentacji bakterii określonych w zastrz. 10 do 12
    b) wzbogacania w pożądany produkt pożywki hodowlanej lub komórek bakterii, względnie wzbogaconych bakterii, oraz
    c) izolowania pożądanego L-aminokwasu.
  14. 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że stosuje się bakterie, w których oprócz wspomnianych genów dodatkowo amplifikowano dalszy gen lub geny cyklu fosforanu pentozy.
  15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że w celu osiągnięcia amplifikacji, liczba kopii genów albo sekwencji nukleotydowych jest zwiększana przez transformowanie mikroorganizmu wektorami plazmidowymi niosącymi te geny albo sekwencje nukleotydowe.
  16. 16. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że do wytwarzania lizyny, oprócz genu opcA amplifikacji w bakteriach ulega jeden albo więcej genów wygranych z grupy składającej się z:
    16.1 genu dapA kodującego syntazę dihydrodipikolinianową:
    16.2 genu lysC kodującego odporną na sprzężenie zwrotne kinazę asparaginianową;
    16.3 genu gap kodującego dehydrogenazę gliceraldehydo-3-fosforanową;
    16.4 genu pyc kodującego karboksylazę pirogronianową;
    16.5 genu tkt kodującego transketolazę;
    16.6 genu gnd kodującego dehydrogenazę 6-fosfoglukonianową;
    16.7 genu lysE kodującego wydzielanie lizyny;
    16.8 genu zwa1;
    16.9 genu eno kodującego enolazę;
    16.10 genu tal kodującego transaldolazę,
    16.11 genu zwf.
  17. 17. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że do wytwarzania L-lizyny fermentacji poddaje się bakterie, w których w tym samym czasie osłabiono jeden albo wiele genów wybranych z grupy składającej się z:
    17.1 genu pck kodującego karboksykinazę fosfoenolopirogronianowa;
    17.2 genu pgi kodującego izomerazę glukozo-6-fosforanową;
    PL 206 384 B1
    17.3 genu poxB kodującego oksydazę pirogronianową, oraz
    17.4 genu zwa2.
  18. 18. Zastosowanie sekwencji polinukleotydowych określonych w zastrz. 1, jako sond hybrydyzacyjnych.
PL346563A 1999-07-09 2000-07-05 Izolowany polinukleotyd z bakterii maczugowatych i izolowany polinukleotyd o sekwencji komplementarnej, ich zastosowanie, zawierające je wektor i bakteria oraz sposób wytwarzania L-aminokwasów PL206384B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14291599P 1999-07-09 1999-07-09
US53126700A 2000-03-20 2000-03-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL346563A1 PL346563A1 (en) 2002-02-11
PL206384B1 true PL206384B1 (pl) 2010-08-31

Family

ID=26840529

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL346563A PL206384B1 (pl) 1999-07-09 2000-07-05 Izolowany polinukleotyd z bakterii maczugowatych i izolowany polinukleotyd o sekwencji komplementarnej, ich zastosowanie, zawierające je wektor i bakteria oraz sposób wytwarzania L-aminokwasów

Country Status (17)

Country Link
US (2) US6825029B2 (pl)
EP (1) EP1109913B1 (pl)
JP (1) JP2003504065A (pl)
KR (1) KR100731525B1 (pl)
CN (1) CN100352926C (pl)
AT (1) ATE338131T1 (pl)
AU (1) AU772563B2 (pl)
BR (1) BR0006909A (pl)
CA (1) CA2348365A1 (pl)
DE (1) DE60030400T2 (pl)
DK (1) DK1109913T3 (pl)
HU (1) HUP0104068A3 (pl)
ID (1) ID29569A (pl)
MX (1) MX240992B (pl)
PL (1) PL206384B1 (pl)
SK (1) SK3012001A3 (pl)
WO (1) WO2001004322A1 (pl)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SK284235B6 (en) * 1997-10-04 2004-11-03 Forschungszentrum Juelich Gmbh Method for microbial production of amino acids of the aspartate and/or glutamate family and agents which can be used in the said method
US7270984B1 (en) * 1999-06-25 2007-09-18 Basf Aktiengesellschaft Polynucleotides encoding a 6-phosphogluconolactonase polypeptide from corynebacterium glutamicum
US6822084B1 (en) * 1999-06-25 2004-11-23 Basf Aktiengesellschaft Corynebacterium glutamicum genes encoding stress, resistance and tolerance proteins
US6797509B1 (en) * 1999-07-09 2004-09-28 Degussa-Huls Ag Nucleotide sequences which code for the tal gene
US20060014259A9 (en) * 1999-07-09 2006-01-19 Kevin Burke Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene
US6713289B2 (en) 1999-10-05 2004-03-30 Degussa Ag Nucleotide sequences which code for the eno gene
DE19947791A1 (de) * 1999-10-05 2001-04-12 Degussa Neue für das eno-Gen codierende Nukleotidsequenzen
CA2374265A1 (en) * 2000-03-20 2001-09-27 Degussa Ag Process for the fermentative preparation of l-amino acids with amplification of the gnd gene
US20050112733A1 (en) * 2000-03-20 2005-05-26 Degussa Ag Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene
EP1302537B1 (en) * 2000-06-21 2010-03-24 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Novel glucose-6-phosphate dehydrogenase
US20030017554A1 (en) * 2000-11-15 2003-01-23 Mechthild Rieping Process for the fermentative preparation of L-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family
DE10154180A1 (de) 2001-11-05 2003-05-15 Basf Ag gene die für genetische Stabilitäts-, genexpressions-und Faltungsproteine codieren
DE10155505A1 (de) * 2001-11-13 2003-05-22 Basf Ag Gene die für Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Proteine codieren
DE10210527A1 (de) 2002-03-09 2003-09-18 Degussa Allele des aceA-Gens aus coryneformen Bakterien
US20070092951A1 (en) 2005-03-24 2007-04-26 Degussa Ag Alleles of the zwf gene from coryneform bacteria
DE102005023829A1 (de) 2005-05-24 2006-11-30 Degussa Ag Allele des opcA-Gens aus coryneformen Bakterien
US8647642B2 (en) 2008-09-18 2014-02-11 Aviex Technologies, Llc Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment
US20120270285A1 (en) * 2009-06-23 2012-10-25 Montelione Gaetano T Stereospecific carbonyl reductases
CN104845923B (zh) * 2014-02-14 2018-03-23 中国科学院微生物研究所 生产l‑组氨酸的方法及其专用重组菌
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11370746B2 (en) 2018-03-23 2022-06-28 Cj Cheiljedang Corporation Granules comprising L-amino acid and method for preparing the same
EP3847270A1 (en) 2018-09-07 2021-07-14 Archer Daniels Midland Company Engineered strains of corynebacteria
CN116254242B (zh) * 2022-12-21 2024-01-30 江南大学 一种atp磷酸核苷转移酶突变体及产l-组氨酸的谷氨酸棒杆菌

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07121227B2 (ja) * 1986-10-17 1995-12-25 協和醗酵工業株式会社 Ｌ−グルタミン酸の製造法
JP3336162B2 (ja) * 1995-07-11 2002-10-21 株式会社リコー デジタル複写機のネットワークシステム
JPH09224661A (ja) * 1996-02-23 1997-09-02 Mitsubishi Chem Corp グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびそれをコードするｄｎａ
CZ20014659A3 (cs) 1999-06-25 2002-09-11 Basf Aktiengesellschaft Geny Corynebacterium glutamicum kódující proteiny účastnící se metabolismu uhlíku a produkce energie
US6962989B1 (en) * 1999-07-08 2005-11-08 Basf Aktiengesellschaft Corynebacterium glutamicum genes encoding novel proteins
JP4623825B2 (ja) 1999-12-16 2011-02-02 協和発酵バイオ株式会社 新規ポリヌクレオチド

Also Published As

Publication number Publication date
AU5982100A (en) 2001-01-30
US6825029B2 (en) 2004-11-30
WO2001004322A9 (en) 2002-09-12
PL346563A1 (en) 2002-02-11
US7504242B2 (en) 2009-03-17
ID29569A (id) 2001-09-06
DE60030400T2 (de) 2007-09-13
DK1109913T3 (da) 2007-01-02
WO2001004322A1 (en) 2001-01-18
JP2003504065A (ja) 2003-02-04
CA2348365A1 (en) 2001-01-18
DE60030400D1 (de) 2006-10-12
US20030138917A1 (en) 2003-07-24
US20050112730A1 (en) 2005-05-26
KR100731525B1 (ko) 2007-06-25
HUP0104068A2 (hu) 2002-03-28
CN100352926C (zh) 2007-12-05
ATE338131T1 (de) 2006-09-15
EP1109913B1 (en) 2006-08-30
HUP0104068A3 (en) 2003-09-29
BR0006909A (pt) 2001-06-12
KR20010086398A (ko) 2001-09-10
SK3012001A3 (en) 2002-07-02
EP1109913A1 (en) 2001-06-27
MXPA01002410A (es) 2003-09-10
CN1317049A (zh) 2001-10-10
MX240992B (es) 2006-10-10
AU772563B2 (en) 2004-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8445241B2 (en) Process for the preparation of L-amino acids
US6825029B2 (en) Nucletoide sequences which code for the opcA gene
EP1179073B1 (en) Process for the fermentative preparation of l-amino acids with amplification of the zwf gene
US6670156B1 (en) Polynucleotide encoding a diaminopimelate epimerase from Corynebacterium glutamicum
US20050100927A1 (en) Nucleotide sequence encoding the dapC gene and process for the production of L-lysine
US6759218B2 (en) Nucleotide sequences coding for the glbO gene
US6939695B2 (en) Nucleotide sequences which code for the rpsL gene
US20020086372A1 (en) Nucleotide sequences which code for the citB gene
US20020106758A1 (en) Nucleotide sequences which code for the gorA gene
US6825030B2 (en) Nucleotide sequences encoding a sensor kinase, citA, from corynebacterium glutamicum
US6689586B2 (en) Nucleotide sequences which code for the CcpA2 gene
US6746854B2 (en) Nucleotide sequences encoding histidine kinase from corynebacterium glutamicum
CA2324485A1 (en) Novel nucleotide sequences coding for the pfka gene
US20020106749A1 (en) Nucleotide sequences which code for the mikE17 gene
US20020106750A1 (en) Nucleotide sequences which code for the def gene
US20020042107A1 (en) Nucleotide sequences which code for the fadD15 gene
KR20010062078A (ko) ｇｌｋ 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열
CA2323750A1 (en) New nucleotide sequences which code for the pfk gene
EP1731613A2 (en) Nucleotide sequence for the zwf gene
US20020042106A1 (en) Nucleotide sequences which code for the cma gene
AU7174500A (en) Novel nucleotide sequences coding for the pfkA gene
ZA200101678B (en) Nucleotide sequences which code for the opcA gene.