SK3012001A3 - Nucleotide sequences which code for the opca gene and a process for the fermentative preparation of l-amino acids - Google Patents

Nucleotide sequences which code for the opca gene and a process for the fermentative preparation of l-amino acids Download PDF

Info

Publication number
SK3012001A3
SK3012001A3 SK301-2001A SK3012001A SK3012001A3 SK 3012001 A3 SK3012001 A3 SK 3012001A3 SK 3012001 A SK3012001 A SK 3012001A SK 3012001 A3 SK3012001 A3 SK 3012001A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
gene
seq
leu
ala
thr
Prior art date
Application number
SK301-2001A
Other languages
English (en)
Inventor
L K Dunican
Ashling Mccormack
Cliona Stapelton
Kevin Burke
Bernd Moritz
Lothar Eggeling
Hermann Sahm
Bettina Mockel
Anke Weissenborn
Original Assignee
Degussa
Forschungszentrum Juelich Gmbh
Nat Univ Ireland
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Degussa, Forschungszentrum Juelich Gmbh, Nat Univ Ireland filed Critical Degussa
Publication of SK3012001A3 publication Critical patent/SK3012001A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1022—Transferases (2.) transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Oblasť techniky
Vynález popisuje nukleotidové sekvencie kódujúce gén opcA. Ďalej vynález popisuje spôsob fermentatívnej výroby aminokyselín, zvlášť potom L-lyzínu za použitia koryneformných baktérií, v ktorých je zosilený gén opcA.
Doterajší stav techniky
L-aminokyseliny, zvlášť potom L-lyzín, sú významnými surovinami pre humánnu medicínu a farmaceutický priemysel, ale predovšetkým sú používané ako vhodné krmivá pre zvieratá.
Je známe, že tieto aminokyseliny môžu byť vyrobené fermentáciou vhodných kmeňov koryneformných baktérií, zvlášť baktérií druhu Corynebacterium glutamicum. Na zlepšenie spôsobu výroby sa sústavne pracuje vďaka významu, ktorý tieto aminokyseliny majú. Zlepšenie spôsobu výroby týchto aminokyselín môže byť dosiahnuté prostredníctvom zmeny techniky fermentácie ako napríklad zmenou miešania a prevzdušňovania kyslíkom, či zmenou zloženia živného média ako napríklad zmenou koncentrácie cukru v priebehu fermentácie, či zmenou v spôsobu spracovania na výslednú formu napríklad dodatočným čistením pomocou chromatografie na iónovom vymieňači, či zmenou produkčných vlastností samotného fermentujúceho mikroorganizmu.
K zlepšeniu výkonnosti produkčných mikroorganizmov sa používajú spôsoby mutagenézy, selekcie a vyhľadávania mutantných klonov. Týmto spôsobom možno získať kmene, ktoré sú odolné k antimetabolitom ako je napríklad analóg lyzínu S-(2aminoetyl)-cysteín alebo sú auxotrofné vzhladom k regulačné dôležitým metabolitom a produkujú požadované, L-aminokyseliny ako napríklad L-lyzín.
Je znám význam pentóza-fosfátového cyklu pre biosyntézu aminokyselín. Ako napríklad Oishi a Aida popisujú (Agricultural and Biological Chemistry 29, strana 83 až 89 (1965)) hexóza monofosfátový posun - hexose monophosphate shunt” v baktériách Brevibacterium ammoniagenes. Sugimoto a Shio (Agricultural and Biological Chemistry 51, strana 101 až 108 (1987)) popisujú reguláciu glukóza-6-fosfát dehydrogenázy u baktérií Brevibacterium flavum. Sugimoto a Shio (Agricultural and Biological Chemistry 51, strana 1257 až 1263 (1987)) ďalej popisujú reguláciu glukóza-6-fosfát dehydrogenázy v baktériách Brevibacterium flavum.
V dokumente JP-A-09224661 je popísaná nukleotidová sekvencia génu pre glukóza-6-fosfát dehydrogenázu z baktérií Brevibacterium flavum MJ-223 (FERM BP-1997). Tento gén bol pomenovaný zwf. Dokument JP-A-09229661 ďalej popisuje Nterminálnu aminokyselinovú sekvenciu polypeptidu Zwf ako Met Val íle Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu. Jednako len tieto údaje nebolo možno potvrdiť.
Podstata vynálezu
Vynález popisuje nové spôsoby vylepšenej fermentatívnej výroby aminokyselín, zvlášť L-lyzínu.
Aminokyseliny, zvlášť potom L-lyzín, nachádzajú významné uplatnenie v humánnej medicíne a vo farmaceutickom priemysle, ale predovšetkým sú používané ako vhodné krmivá pre zvieratá. Z toho plynie všeobecný záujem o vylepšený spôsob výroby aminokyselín, zvlášť potom L-lyzínu. ,
V nasledujúcom texte je pod pojmom L-lyzín alebo lyzín mienená nie len voľná báza, ale tiež jej soli ako napríklad monohydrochlorid lyzínu alebo sulfát lyzínu.
I. Predmetom vynálezu je polynukleotid izolovaný z koryneformných baktérii, ktorý obsahuje polynukleotidovú sekvenciu, vybranú zo skupiny tvorenej:
a) polynukleotidmi, ktoré sú aspoň z 70 % identické s polynukleotidom kódujúcim peptid, ktorého aminokyselinová sekvencia je uvedená v Sekvencií id. č.: 3 alebo id.č.: 5 alebo id. č.: 8 alebo id. č.: 10.
b) polynukleotidmi, kódujúcimi peptidy, ktoré obsahujú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň z 70 % identická so sekvenciou aminokyselín podlá Sekvencií id.č.: 3 alebo id.č.: 5 alebo id. č.: 8 alebo id. č.: 10.
c) polynukleotidmi komplementárnymi k polynukleotidu podlá
a) alebo b) a
d) polynukleotidmi,·obsahujúcimi aspoň 15 za sebou idúcich báz z polynukleotidovej sekvencie podía bodov a),
b) alebo c)
II. Predmetom vynálezu je ďalej polynukleotid podľa bodu I., pričom vo výhodnom prevedení ide o replikovatelnú DNA obsahujúcu:
(i)jednu alebo viacej nukleotidových sekvencií vybranú zo skupiny tvorenej Sekvenciami id.č.:1, id.č.:4, id.č.:6, id.č.:9, alebo (ii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá odpovedá sekvencii podía bodu (i) vzhladom k degenerácii genetického kódu, alebo (iii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá hybridizuje so sekvenciami komplementárnymi so sekvenciou podía bodu (i) alebo (ii), a poprípade (iv) funkčne neutrálne mutácie v sekvencii podía bodu (i).
Vynález ďalej popisuje:
• polynukleotid podlá nároku 4., obsahujúci nukleotidovú sekvenciu odpovedajúcu Sekvencii id.č.: 4 alebo Sekvencii id.č.: 9 • polynukleotid podía nároku 6., kódujúci polypeptid, ktorý obsahuje najmenej jednu z aminokyselinových sekvencií odpovedajúcich Sekvencii id.č.: 3, Sekvencii id.č.: 5, Sekvencii id.č.: 8 alebo Sekvencii id.č.: 10.
• vektor, obsahujúci polynukleotid podía nároku 1 • koryneformné baktérie slúžiace ako hostitelské bunky, ktoré obsahujú tento vektor.
Predmetom vynálezu sú taktiež polynukleotidy, ktoré podstatným spôsobom zostávajú zo sekvencie, ktorou možno získať pomocou hybridizačného skríningu odpovedajúcej knižnice obsahujúcej úplný gén s polynukleotidovou sekvenciou podía Sekvencie id.č.4 alebo Sekvenciu id.č.: 9, za použitia hybridizačnej sondy, ktorá má sekvenciu podía Sekvencie id.č.:
alebo Sekvencie id.č.: 9 alebo aspoň jej fragmentu, ako aj izoláciu uvedenej sekvencie DNA z knižnice.
Polynukleotidové sekvencie podľa vynálezu sú vhodné ako hybridizačné sondy pre RNA, cDNA a DNA,, v prípade cDNA pre izoláciu sekvencie o úplnej dĺžke (full-length) kódujúcich OpcA proteín a pre izoláciu takých cDNA alebo génov, ktoré vykazujú vysokú sekvenčnú homológiu s opcA.
Polynukleotidové sekvencie podlá vynálezu sú ďalej vhodné ako priméry pre prípravu DNA génov kódujúcich OpcA proteín pomocou polymerázové reťazové reakcie (PCR).
Oligonukleotidy slúžiace ako sondy alebo priméry obsahujú aspoň 30, vo výhodnom prevedení aspoň 20, v celkom zvlášť výhodnom prevedení aspoň 15 po sebe idúcich báz. Vhodné sú taktiež oligonukleotidy o dĺžke aspoň 40 alebo 50 báz.
Izolovaný znamená oddelený od svojho prirodzeného pozadia, respektíve okolia.
Polynukleotid sa vzťahuje obecne na polyribonukleotidy a polydeoxyribonukleotidy, pričom sa môže jednať o nemodifikovanú RNA alebo DNA alebo modifikovanú RNA alebo DNA.
Pod pojmom polypeptid sa rozumie peptid alebo proteín, ktorý obsahuje dve alebo viacej aminokyselín viazaných peptidovými väzbami.
Polypeptidy Sekvencie id.č.: alebo Sekvencie podlá vynálezu zahrnujú polypeptid podlá 3, Sekvencie id.č.: 5, Sekvencie id.č.: 8 id.č.: 10 a zvlášť také s biologickou aktivitou produktu génu opcA a taktiež také, ktoré sú aspoň zo 70 % identické s polypeptidom podlá Sekvencie id.č.: 3,
Sekvencie id.č.: 5, Sekvencie id.č.: 8 alebo Sekvencie id.č.: 10 a vo výhodnom prevedení aspoň z 80 % identické a v zvlášť výhodnom prevedení aspoň z 90 % až 95 % identické s polypeptidom podlá Sekvencie id.č.: 3, Sekvencie id.č.: 5, Sekvencie id.č.: 8 alebo Sekvencie id.č.: 10 a ktoré vykazujú uvedenú aktivitu.
Predmetom vynálezu je ďalej proteín Zwf, ktorý tvorí Zwf podjednotku glukózo 6-fosfát dehydrogenázy. Aminokyselinová sekvencia translačného produktu je podlá Sekvencie id.č.:2 a Sekvencie id.č.:7. N-koncová aminokyselinová sekvencia Zwf podjednotky, ktorá môže byť izolovaná z glukózo 6-fosfát dehydrogenázy, je podlá Sekvencie id.č.:ll.
Vynález ďalej popisuje fermentačný spôsob výroby aminokyselín, zvlášť L-lyzínu, za použitia koryneformných baktérií, najmä potom takých, ktoré požadované aminokyseliny už produkujú, a v ktorých sú nukleotidové sekvencie kódujúce opcA gén amplifikované, zvlášť tým, že je zvýšená expresia tohto génu, prípadne spolu s zvýšením expresie génu zwf.
Výrazom zosilenie sa v tomto prípade rozumie zvýšenie intracelulárnej aktivity jedného alebo niekolkých enzýmov (proteínov), ktoré sú v mikroorganizmu kódované príslušnými DNA, napríklad tým, že sa zvýši počet kópií génu (génov) na bunku, použije sa silný promótor, alebo sa použije gén kódujúci enzým s zvýšenou aktivitou, poprípade kombinácie týchto účinkov.
Predmetom vynálezu sú ďalej mikroorganizmy, ktoré sú schopné vytvárať L-aminokyseliny, obzvlášť L-lyzín z glukózy, sacharózy, laktózy, fruktózy, maltózy, melázy, škrobu, celulózy alebo z glycerínu a etanolu. Môže ísť o rôzne koryneformné baktérie zvlášť potom o baktérie rodu
Ί
Corynebacterium. Z rodu Corynebacterium je treba spomenúť predovšetkým baktérie druhu Corynebacterium glutamicum, ktoré sú odborníkom známe pre svoju schopnosť produkovať Laminokyseliny.
Vhodnými kmeňmi baktérií rodu Corynebacterium, zvlášť druhu Corynebacterium glutamicum, sú napríklad tieto prirodzene sa vyskytujúce kmeňa;
Corynebacterium Corynebac terium Corynebacterium Corynebacterium Corynebacterium Brevibacterium Brevibacterium Brevibacterium glutamicum ATCC13032 acetoglutamicum. ATCC15806 acetoacidophilum ATCC13870 thermoaminogenes FERM BP-1539 melassecola ATCC17965 flavum ATCC14067 lactofermentum ATCC13869 a divaricatum ATCC14020 a od nich odvodené mutantné kmene produkujúce L-lyzín, ako napríklad:
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 a Corynebacterium glutamicum DSM5715 Corynebacterium glutamicum DM58-1 Corynebacterium glutamicum DSM12866.
a ďalej od koryneformných baktérií odvodené mutantné kmene produkujúce L-treonín, ako napríklad:
Corynebacterium glutamicum ATCC21649 δ
Brevibacterium flavum BB69
Brevibacterium flavum DSM5399
Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 269
Brevibacterium lactofermentum TBB-10 a ďalej od koryneformných baktérií odvodené mutantné kmene produkujúci L-izoleucín, ako napríklad:
Corynebacterium glutamicum ATCC 14309
Corynebacterium glutamicum ATCC 19310
Corynebacterium glutamicum ATCC 14311
Corynebacterium glutamicum ATCC 15168
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871 a ďalej mutantné kmene odvodené od koryneformných baktérií produkujúcich L-tryptofán, ako napríklad:
Corynebacterium glutamicum ATCC21850
Corynebacterium glutamicum KY9218 (pKW9901)
Autorom vynálezu sa podarilo izolovať z baktérie C. glutamicum nový gén opcA, ktorý kóduje OpcA podjednotku enzýmu glukózo 6-fosfát dehydrogenázu (EC 2.7.1.11).
Pre izoláciu tohto génu opcA respektíve pre izoláciu ďalších génov z baktérií C. glutamicum je treba najprv vytvoriť génovú knižnicu tohto mikroorganizmu v baktériách E. coli. Vytvorenie takej knižnice je popísané v obecne známych učebniciach a príručkách. Ako príklad možno uviesť učebnicu Winnacker: Gény a klony: Úvod do genetických technológií (Gene und Klone: Eine Einfíihrung in die Gentechnologie, nakladateľstvo Chemie, Weinheim, Nemecko, 1990) alebo príručku
Sambrook a ďalšie: Laboratórny manuál molekulárneho klonovania (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989). Príkladom jednej velmi známej knižnice je E. coli K-12 kmeňa W3110 v λ vektoroch vytvorená a popísaná Koharou a ďalšími (viď Celí 50, strana 495 až 508 (1987)). Bathe a ďalší popisujú (viď Molecular and General Genetics, 252: ,strana 255 až 265, 1996) DNA knižnicu baktérie C. glutämicum ATCC13032, vytvorenú pomocou kozmidu SuperCos I (Wahl a ďalšie 1987), Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: strana 2160 až 2164) v baktériách E. coli K12 kmeňa NM554 (viď Raleigh a ďalší 1988, Nucleic Acids Research 16: strana 1563 až 1575). Bormann a ďalší. (Molecular Microbiology 6(3), strana 317 až 326)) ďalej popisujú knižnicu baktérií Corynebacterium glutämicum ATCC13032 vytvorenú za použitia kozmidu pHC79 (Hohn a Collins, Gene 11, strana 291 až 298 (1980)). O'Donohue (The Cloning and
Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutämicum. Ph.D. Thesis, National University of Ireland, Galway, 1997) popisuje klonovanie génov C. glutämicum za použitia λ Zap expresného systému, viď Short a ďalší (Nucleic Acids Research, 16: strana 7583). K príprave DNA knižnice baktérie C. glutämicum v E. coli môžu byť použité tiež plazmidy ako napríklad pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, strana 807 až 818 (1979)) alebo pUC9 (Vieira a ďalší, 1982, Gene, 19: strana 259 až 268). Ako hostitelské sú vhodné zvlášť také kmene E. coli, ktoré sú reštrikčné a rekombinačne deficientné. Príkladom takého kmeňa sú bunky kmeňa DH5omcr, viď Grant a ďalší (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990), strana 4645 až
4649). Dlhé fragmenty DNA klonované pomocou kozmidov môžu byť následne použité pre subklonovanie do vektorov vhodných pre sekvenáciu a inzerty následne sekvenované napríklad spôsobom podlá Sangera a ďalších (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: strana 5463 až 5467, 1977).
Získané sekvencie DNA sa môžu potom spracovať známymi algoritmami respektíve programami pre analýzu sekvencií- ako je napríklad Stadenov balík programov (Nucleic Acids Research 14, strana 217 až 232 (1986) ) , balík GCG (Butler, Methods of Biochemical Analysis 39, strana 74 až 97 (1998)), algoritmus FASTA (Pearson a Lipman, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 85, strana 2444 až 2448 (1988)) alebo alqoritmus BLAST (Altschul a ďalši, (Náture Genetics 6, strana 119 až 129 (1994)). Ďalej môžu byť získané sekvencie porovnané s verejne prístupnými databázami. Verejne prístupnou databázou nukleotidových sekvencii je napríklad databáza Európskeho laboratória pre molekulárnu biológiu (EMBL, Heidelberg, Nemecko) alebo databáza Národného centra pre biotechnologické informácie (NCBI, Bethesda, MD, USA).
Vynález popisuje novú sekvenciu DNA kódujúci gén opcA z baktérií C. glutamicum. Táto sekvencia je súčasťou vynálezu a je uvedená ako Sekvencia id.č.:l a Sekvencia id.č.:4. Ďalej bola od tejto sekvencie DNA vyššie popísanými spôsobmi odvodená sekvencia aminokyselín odpovedajúceho proteínu. V sekvencii id.č.:3 a v Sekvencii id.č.:5 podlá vynálezu je uvedená práve sekvencia aminokyselín proteínu OpcA. Molekulová váha odpovedajúca aminokyselinovej sekvencii OpcA proteínu je zhruba 34.7 kDa.
Sekvencia id.č.:l ďalej obsahuje kódujúcu oblasť zwf génu. Výsledná amínokyselinová sekvencia Zwf proteínu je uvedená v Sekvencii id.č.:2. Molekulová váha odpovedajúca aminokyselinovej sekvencii Zwf proteínu je zhruba 57.5 kDa.
Génová knižnica vyrobená vyššie uvedeným spôsobom môže byť ďalej študovaná hybridizáciou s nukleotidovými sondami známej sekvencie ako je napr. zwf gén (JP-A-09224661) . Klonovaná DNA klonov, ktoré vykazujú pozitívnu hybridizačnú reakciu, je sekvenovaná, čím sa získa jednak známa nukleotidová sekvencia použitej sondy a ďalej prilahlej DNA sekvencie.
Vynález ďalej popisuje novú DNA sekvenciu z C. glutamicum, ktorá kóduje opcA gén a ktorá je súčasťou tohto vynálezu a je uvedená ako Sekvencia id.č.:6 a Sekvencia id.č.:9. Metódami uvedenými vyššie bola odvodená z danej DNA sekvencie aminokyselinová sekvencia odpovedajúceho proteínu. Výsledná aminokyselinová sekvencia OpcA proteínu je uvedená v Sekvencii id.č.:8 a Sekvencii id.č.:10. Molekulová váha odpovedajúca aminokyselinovej sekvencii OpcA proteínu je zhruba 34.7 kDa.
Sekvencia id.č.:6 ďalej obsahuje kódujúcu oblasť zwf génu. Výsledná aminokyselinová sekvencia Zwf proteínu je uvedená v Sekvencii id.č.:7. Molekulová váha odpovedajúca aminokyselinovej sekvencii Zwf proteínu je zhruba 57.5 kDa.
Ďalšia metóda pre aspoň čiastočné stanovenie aminokyselinovej sekvencie OpcA proteínu a Zwf proteínu zahrnuje purifikáciu glukózo 6-fosfát dehydrogenázy pomocou chrómatografických metód. Návody k purifikácii a preparácii proteínov sú napríklad v knihe Schleifera Wensinka: Practical Methods in Molecular Biology (Springer Verlag, Berlín, Germany, 1981), ďalej v knihe Harrise and Angala: Protein Purification Methods: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1989), a v knihe Scopese: Protein Purification:Principles and Practice, 3rd ed. (Springer Verlag, New York, USA, 1993) a v obecne. známych učebniciach a manuáloch. N koncovú aminokyselinovú sekvenciu purifikovaného polypeptidu možno stanoviť metódou N koncového sekvenovania podľa Edmana (Archives of Biochemistry 22, strana 475 (1949)). Ďalšie spôsoby sekvenovania proteínov uvádza napríklad Smith: Protein Sequencing Protocolls: Methods in Molecular Biology, Vol. 64 and Vol. 112 (Humana Press, Totowa, NJ, USA, 1996) a Kamp a ďalší: Protein Structure Analysis: Preparation, Characterization, and Microsequencing (Springer Verlag, New York, NY, USA, 1997).
Týmto spôsobom bolo možné ukázať, že sa enzým glukózo 6fosfát dehydrogenáza skladá z dvoch podjednotiek o molekulovej váhe približne 30 kDa a 60 kDa. N koncová aminokyselinová sekvencia OpcA podjednotky a OpcA proteínu je uvedená v Sekvencií id.č.:12. N koncová aminokyselinová sekvencia Zwf podjednotky a Zwf proteínu je uvedená v Sekvencií id.č.:ll.
Súčasťou vynálezu sú ďalej kódujúce sekvencie , ktorý vďaka degenerácii genetického kódu odpovedajú Sekvencií id.č.: 1, Sekvencií id.č.:4, Sekvencií id.č.:6 alebo Sekvencií id.č.:9.
Rovnako tak sú súčasťou vynálezu DNA sekvencie, ktoré hybridizujú so Sekvenciou id.č.:4 alebo Sekvenciou id.č.:9 alebo ich časťami. Odborníkom sú ďalej známe konzervatívne výmeny aminokyselín ako je napríklad výmena glycínu za alanín alebo výmena kyseliny asparágovej za kyselinu glutámovú. Tieto výmeny aminokyselín sa nazývajú sense mutations a vzhľadom k tomu, že nevedú k zásadnej zmene aktivity proteínu nazývajú sa taktiež funkčne neutrálne. Ďalej je známe, že zmeny v Na/alebo C-konci proteínu nemávajú zásadný negatívny vplyv na funkciu proteínu ba v niektorých prípadoch môže dôjsť aj k jej stabilizácii. Odborník môže nájsť údaje, ktoré to potvrdzujú mimo iné v práci Ben-Bassata a ďalších v časopise Journal of Bacteriology 169: strana 751 až 757 (1987), O'Regana a ďalších v časopise Gene 77: strana 237 až 251 (1989), Sahin-Totha a ďalších v časopise Protein Sciences 3: strana 240 až 247 (1994), Hochuliho a ďalších v Bio/Technology 6: strana 1321 až 1325 (1988) a v známych učebniciach genetiky a molekulárnej biológie. Aminokyselinové sekvencie, ktoré sú v tomto zmysle analogické Sekvencií id. č.:3, Sekvencií id. č.:5, Sekvencií id. č.:8 alebo Sekvencii id. č.:10 sú taktiež predmetom vynálezu.
A konečne sú predmetom vynálezu sekvencie DNA amplifikované zo Sekvencie id.č.: 4 alebo Sekvencie id.č.: 9 pomocou polymerázovej reťazcovej reakcie (PCR) a špecifických primérov. Také oligonukleotidové priméry majú typicky dĺžku aspoň 15 párov báz.
Návody na identifikáciu DNA pomocou hybridizácie môžu odborníci nájsť napríklad v príručke The DIG System Users Guide for Filter Hybridization (Príručka užívatela systému DIG pre hybridizáciu) od firmy Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Nemecko, 1993) a ďalej v článku Liebl a ďalší. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41:
strana 255 až 260) . Návody na amplifikáciu DNA pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) nájde odborník napríklad v príručke Gait: Oligonucleotide synthesis: a practical approach (Syntéza oligonukletidov: praktický prístup, IRL Press, Oxford, Spojené kráľovstvo 1984) a v knihe Newton a Graham: PCR (Akademické nakladateľstvo Spektrum, Heidelberg, Nemecko, 1994).
Pôvodcovia vynálezu zistili, že zvýšená expresia opcA génu a prípadne zároveň zvýšená expresia zwf génu, vedie u koryneformných baktérií k zvýšeniu produkcie aminokyselín, najmä L-lyzínu.
Tejto zvýšenej expresie možno dosiahnuť rôznymi spôsobmi. Buď možno zvýšiť počet kópií odpovedajúceho génu alebo možno zaviesť mutáciu do oblasti promótora a regulačnej oblasti či do väzobného miesta pre ribozóm, ktoré sa nachádza proti smeru transkripcie štruktúrneho génu. Rovnakým spôsobom môžu účinkovať expresné kazety zabudované proti smeru transkripcie od štruktúrneho génu. Pomocou indukovatelných promótorov možno ďalej zosiliť expresiu v priebehu fermentatívnej produkcie Llyzínu. Expresiu možno ďalej zlepšiť predĺžením životnosti mRNA v bunke alebo inhibíciou rozkladu enzymatických proteínov. Gény alebo rekombinantné génové konštrukty podlá vynálezu sa pritom nachádzajú v plazmidovom vektore s rôznym počtom kópií na bunku alebo sú integrované v chromozóme a amplifikované. Alternatívne môže byť expresia príslušného génu ďalej zvýšená zmenou zloženia média a spôsobu kultivácie.
Návody k tomu môžu odborníci nájsť okrem iného v publikáciách Martin a ďalší (Bio/Technology 5, strana 137 až
146 (1987) ), Guerrero a ďalší (Gene 138, strana 35 až 41 (1994)), Tsuchiya a Morinaga (Bio/Technology 6, strana 428 až
430 (1988)), Eikmanns a ďalší (Gene 102, strana 93 až 98 (1991)), v Európskom patentovom spise EPS 0 472 869, v patente USA č.: 4,601,893, Schwarzer a Ptihler (Bio/Technology 9, strana 84 až 87 (1991), Reinscheid a ďalší (Applied and
Environmental Microbiology 60, strana 126 až 132 (1994)),
LaBarre a ďalší (Journal of Bacteriology 175, strana 1001 až 1007 (1993)), v patentovej prihláške WO 96/15246, v publikácii Malumbres a ďalší. (Gene 134, strana 15 až 24 (1993)), v Japonskej otvorenej (laid open) špecifikácii JP-A-10229891, v publikácii Jensen a Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, strana 191 až 195 (1998)), v publikácii Makrides
Microbiological Reviews 60: strana 512 až 538 (1996)) a v známych učebniciach genetiky a molekulárna biológie.
Expresia génu opcA podlá vynálezu bola napríklad zvýšená pomocou plazmidov:
Je výhodné použiť taký plazmid, ktorý sa replikuje v koryneformných baktériách, ako sú napríklad zo stavu techniky známe vektory pZl (Menkel a ďalší, Applied and Environmental
Microbiology (1989) 64: strana 549 až 554), alebo vektor pEKExl (Eikmanns a ďalší, Gene 102 (1991) , strana 93 až 98) , alebo pHS2-l (Sonnen a ďalší, Gene 107: strana 69 až 79, (1991)), ktoré sú založené na kryptických plazmidoch pHM1519, pBLl alebo pGAl. Ďalej môžu byť rovnakým spôsobom použité ďalšie plazmidy, napríklad také, ktoré sú založené na vektore pCG4 (US - A 4,489,160), alebo pNG2 (Serwold-Davis a ďalší, FEMS Microbiology Letters 66, strana 119 až 124 (1990)), alebo pAGl 30 (US - A 5,158,891).
Bol použitý napríklad kyvadlový vektor pEC-T18mob2 pre baktérie E. coli a C. glutamicum podía obrázku 2. Plazmid pECzwfopcA znázornený na obrázku 3 vznikol vložením génov opcA a zwf do reštrikčných miest Sphl/Sall v plazmidu. pEC-T18mob2.
Ďalšími vektormi, ktoré možno použiť pre zosilenie génov v baktériách sú také, ktoré využívajú integrácie do bakteriálneho chromozómu, tak ako bolo popísané napríklad Reinscheidom a ďalšími (Applied and Environmental Microbiology 60, strana 126 až 132 (1994)), ktoré zdvojili a zosilili operón hom-thrB. V tomto spôsobu sa naklonuje kompletný gén do plazmidového vektora, ktorý sa môže replikovať v niektorom hostiteľovi (typicky v E. coli), ale nie v baktériách C. glutamicum. Ako vektory pre tento spôsob prichádzajú v úvahu napríklad pSUP301 (Šimon a ďalší Bio/Technology 1, strana 784 až 791 (1983)), pK18mob alebo pK19mob (Schäfer a ďalší gén
145, strana 69 až 73 (1994) ) , pGEM-T (Promega Corporation,
Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994), Journal of Biological Chemistry 269:. strana 32678 až 32684; patent Spojených štátov č.5, 4 87, 993), plazmid pCR® Blunt (Invitrogen, Groningen, Nizozemie; Bernard a ďalšie Journal of Molecular Biology, 234: strana 534 až 541 (1993)) alebo pEMl (Schrumpf sa a ďalší, 1991, Journal of Bacteriology 173: strana 4510 až 4516) alebo pBGS8 (Spratt a ďalší, 1986, Gene 41: strana 337 až 342) . Vektor, obsahujúci gén určený k zosileniu, sa potom prevedie do požadovaného kmeňa C. glutamicum pomocou konjugácie alebo transformácie. Konjugácia je popísaná napríklad v publikácia Schäfera a ďalších (viď Applied and Environmental Microbiology 60, strana 756 až 759 (1994)). Transformácia je popísaná napríklad v publikácii Thierbacha a ďalších (viď Applied Microbiology and Biotechnology 29, strana 356 až 362 (1988)), Dunicana a Shivnana (viď Bio/Technology 7, strana 1067 až 1070 (1989)) a Taucha a ďalších (FEMS Microbiological Letters 123, strana 343 až 347 (1994)). Po homologne rekombinácii spôsobenej jednou cross-over udalosťou obsahuje výsledný kmeň dve kópie príslušného génu.
Okrem zosilenia génu opcA môže byť pre produkciu aminokyselín a zvlášť potom L-lyzínu ďalej výhodné ešte zosiliť jeden alebo niekolko enzýmov podieľajúcich sa na biosyntéze aminokyselín, glykolýze alebo enzýmov účastniacich sa doplňovacích (anaplerotických) biochemických pochodov, pentóza-fosfátového cyklu alebo sa podieľajúcich na transportu aminokyselín.
Produkcia L-lyzínu môže napríklad takto:
byť podľa vynálezu zvýšená • súčasným zvýšením expresie génu kódujúceho dihydrodipikolinát-syntázu, dapA (EP-B alebo
197 335) • súčasným zvýšením expresie génu lysC, ktorý kóduje aspartátkinázu rezistentnú k spätnoväzobnej regulácii (viď Kalinowski a ďalší (1990), Molecular and General Genetics 224: strana 317 až 324), • súčasným zvýšením expresie génu gap (viď Eikmanns (1992) Journal of Bacteriology 174: strana 6076 až 6086) kódujúceho glyceraldehyd-3-fosfát-dehydrogenázu, alebo • súčasným zvýšením expresie génu pyc (DE-A-19 831 609), kódujúceho pyruvát-karboxylázu alebo
I ( • súčasným zvýšením expresie génu tkt kódujúceho transketolázu (prístupové číslo AB023377 v databáze EMBL, Heidelberg, Nemecko), alebo • súčasným zvýšením expresie génu gnd kódujúceho 6fosfoglukonát-dehydrogenázu (JP-A-9-224662), • súčasným zvýšením expresie génu lysE (DE-A-195 48 222), ktorý kóduje proteín podieľajúci sa na exporte lyzínu, alebo • súčasným zvýšením expresie génu zwal (DE 199 59 328.0; DSM 13115), alebo súčasným zvýšením expresie génu eno kódujúceho enolázu (DE: 199 41 478.5), alebo • súčasným zvýšením expresie génu tal kódujúceho transaldolázu (DSM 13263).
Okrem zosilenia expresie génu opcA, poprípade aj génu zwf, môže byť pre produkciu aminokyselín a zvlášť L-lyzínu, výhodné súčasné zoslabenie expresie génu:
pck kódujúceho fosfopyruvát-karboxykinázu (viď DE 199 50
409.1; DSM 13047) a/alebo pgi kódujúceho glukóza-6-fosfát-izomerázu 09/396,478; DSM 12969) alebo (viď
US • poxB kódujúceho pyruvát-oxidázu (viď DE: 19951975.7 . DSM 13114) alebo • génu zwa2 (viď DE:19959327.2, DSM 13113).
Okrem zvýšené expresie génu opcA, môže byť ďalej pre produkciu aminokyselín podľa vynálezu, zvlášť potom L-lyzínu, výhodné, ešte inhibovať nežiadúce vedľajšie reakcie (viď Nakayama: Breeding of amino Acid Producing Micro-organisms (Pestovanie mikroorganizmov produkujúcich aminokyseliny) v knihe: Overproduction of Microbial Products, (Výroba mikrobiálnych produktov) editorov Krumphanzla, Sikyty a Vanka, Academic Press, Londýn, Spojené kráľovstvo, 1982).
Mikroorganizmy podľa vynálezu môžu byť za účelom produkcie aminokyselín, a zvlášť L-lyzínu, kultivované kontinuálnym spôsobom, alebo spôsobmi diskontinuálnymi, nech už vsádzkovou (batch) kultiváciou alebo vsádzkovou kultiváciou s prítokom živín (fed batch) alebo vsádzkovou kultiváciou s opakovaným prídavkom živín (repeated fed batch). Prehľad známych spôsobov kultivácie je uvedený v učebnici Chmiel: Bioprozesstechnik 1. Einfíihrung in die Bioverfahrenstechnik (Úvod do biotechník, nakladateľstvo Gustáv Fischer, Stuttgart, 1991) alebo v učebnici Storhas: Bioreaktoren und Periphere Einrichtungen (Bioreaktory a periférne zariadenia, nakladateľstvo Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994).
Použité kultivačné médium musí patričným spôsobom vyhovovať nárokom príslušného mikroorganizmu. Popisy rôznych známych kultivačných médií pre mikroorganizmy sú uvedené v príručke Manual of Methods for General Bacteriology (Metodický manuál pre obecnú bakteriológiu) vydaný Americkou bakteriologickou spoločnosťou (American Society for Bacteriology), Washington D.C., USA, v roku 1981. Ako zdroja uhlíka môžu byť použité cukry a uhľohydráty ako napríklad glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, škrob a celulóza; oleje a tuky ako napríklad sójový olej, slnečnicový olej, podzemnicový olej a kokosový tuk; mastné kyseliny ako napríklad kyselina palmitová, kyselina stearová a kyselina linolová, alkoholy ako napríklad glycerín a etanol a organické kyseliny ako napríklad kyselina octová. Tieto látky môžu byť použité buď jednotlivo alebo v zmesi. Ako zdroja dusíka môžu byť použité zlúčeniny obsahujúce organický dusík ako napríklad peptón, kvasničný extrakt, mäsový extrakt, sladový extrakt, kukuričný extrakt, sójová múčka a močovina alebo anorganické zlúčeniny ako napríklad síran amónny, chlorid amónny, fosforečnan amónny, uhličitan amónny a dusičnan amónny. Tieto zdroje dusíka môžu byť použité buď jednotlivo alebo v zmesi. Ako zdroja fosforu možno použiť hydrogenfosforečnan alebo dihydrogenfosforečnan draselný či odpovedajúce sodné soli. Kultivačné médium musí ďalej obsahovať soli kovov, ktoré sú nezbytné pre rast, ako napríklad síran horečnatý alebo síran železnatý. A konečne môže byť kultivačné médium okrem vyššie uvedených látok obohatené esenciálne rastové látky ako napríklad aminokyseliny a o vitamíny. Pre zvýšenie tvorby aminokyselín možno kultivačné médium ešte obohatiť o ich prekurzory. Uvedené zložky môžu byť pridané do média jednorázovo na počiatku, alebo vhodným spôsobom v priebehu kultivácie.
Pre kontrolu pH v priebehu kultivácie sú vhodné zásadité zlúčeniny, ako napríklad hydroxid sodný, hydroxid draselný a amoniak alebo kyslé zlúčeniny, ako napríklad kyselina fosforečná alebo kyselina sírová. Penenie kultivačnej zmesi možno kontrolovať prídavkom činidiel potlačujúcich tvorbu peny ako sú napríklad polyglykolestery mastných kyselín. Stabilitu plazmidov možno udržať prostredníctvom vhodného selekčného činidla napríklad antibiotika. Vhodné aerobné podmienky možno udržovať privádzaním kyslíka alebo kyslíkobsahujúcej zmesi plynov, napríklad vzduchu, do kultivačného média. Vhodná teplota pre pestovanie baktérií sa normálne pohybuje od 20°C do 45°C a výhodne od 25°C do 40°C. Doba kultivácie by mala byť taká, aby bolo dosiahnuté maxima tvorby lyzínu. Tohto maxima je obvykle dosiahnuté počas 10 až 160 hodín.
Analýza produkovaného L-lyzínu sa môže prevádzať pomocou ionexovej chrómatografie na anexu s následnou derivatizáciou pomocou ninhydrínu, tak ako je popísané v práci Spáckmana a ďalších (Analytical : Chemistry, 30, (1958), strana 1190).
Nasledujúce mikroorganizmy boli uložené v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunečných kultúr (Deutsche Sammlunq fúr Mikrorganismen und Zellkulturen”-DSMZ, Braunschweig, SRN) podía ustanovenia Budapešťanskej zmluvy: ii baktérie Corynebacterium glutamicum kmeňa ATCC13032/pECzwfopcA pod číslom DSM 13269.
Sekvencia id.č.:l taktiež obsahuje nový gén devB. Spôsob podía vynálezu je použitý k fermentatívnej výrobe aminokyselín, zvlášť potom L-lyzínu.
Súčasťou vynálezu sú k aj nižšie popísané sekvencie:
1. Sekvencie DNA glutamicum ATCC13032 vyizolované z baktérií Corynebacterium
2. Aminokyselinová Sekvencie id.č.:l sekvencia proteínu Zwf odvodená od
3. Aminokyselinová Sekvencie id.č.:l sekvencia proteínu OpcA odvodená od
4. Sekvencia DNA génu opcA z baktérie ATCC13032 odvodená od Sekvencie id.č.:l
5. Aminokyselinová sekvencia proteínu OpcA odvodená od
Sekvencie id.č.:4 !
6. ' Sekvencie DNA vyizolované z baktérií Corynebacterium glutamicum AS019
7. Aminokyselinová sekvencia proteínu Zwf odvodená od
Sekvencie id.č.:6
8. Aminokyselinová sekvencia proteínu OpcA odvodená od
Sekvencie id.č.:6
9. Sekvencia DNA kódujúca gén opcA z baktérií AS019 odvodená zo Sekvencie id.č.:6
10. Aminokyselinová sekvencia proteínu OpcA odvodená od Sekvencie id.č.:9
11. Aminokyselinová sekvencia N-terminálnej časti proteínu Zwf glukóza 6-fosfát dehydrogenázy z baktérií ATCC13032
12. Aminokyselinová sekvencia N-terminálnej časti proteínu OpcA glukóza 6-fosfát dehydrogenázy z baktérií ATCC13032
Popis obrázkov:
Obrázok 1: Obrázok 2: Obrázok 3:
Reštrikčná mapa Reštrikčná mapa Reštrikčná mapa plazmidu plazmidu plazmidu pBOB102.
pEC-T18mob2 pECzwfopcA
Použité skratky a označenie majú nasledujúci význam:
Obrázok 1:
Neo r:
ColEl:
CMV:
lacP: lacZ:
(lacZa)
SV40 3'splice SV40 polyA: fl (-)ori:
5V40 ori:
gén pre rezistenciu k neomycínu/kanamycínu replikačný počiatok z plazmidu ColEl promótor cytomegalovírusu promótor lac operónu
5’-koncový fragment génu pre β-galaktozidázu namiesto zostrihu 3'konca genómu vírusu SV'40 polyadenylačný signál vírusu SV40 replikačný počiatok filamentárneho fága fl replikačný počiatok vírusu SV40
Obrázky 2 a 3:
Tet:
oriV:
RP4mob:
rep:
per:
lacZalpha' 'lacZalpha gén pre rezistenciu k tetracyklínu na plazmidu umiestnený replikačný počiatok z baktérií E. coli oblasť pre mobilizáciu plazmidu mob replikačný počiatok z plazmidu pGAl baktérie C. glutamicum gén kontrolujúci počet kópií plazmidu pGAl lacZ-alpha: fragment génu lacZa (N-koniec) génu pre β-galaktozidázu
5'- koniec fragmentu génu lacZa
3'- koniec fragmentu génu lacZa zwf: zwf gene opcA: opcA gene
Ďalšie skratky:
Apal: cieľové miesto reštrikčného enzýmu Apal
BamHI: cielové miesto reštrikčného enzýmu1 BamHI
Clal: cieľové miesto reštrikčného enzýmu Clal
EcoRI: cielové miesto reštrikčného enzýmu EcoRI
HindlII: cielové miesto reštrikčného enzýmu HindlII
MstlI: cielové miesto reštrikčného enzýmu MstlI
NheI: cielové miesto reštrikčného enzýmu NheI
Nsil: cieľové miesto reštrikčného enzýmu Nsil
Sací: cielové miesto reštrikčného enzýmu Sací
Sali: cielové miesto reštrikčného enzýmu Sali
Spel: cieľové miesto reštrikčného enzýmu Spel
Sphl: cielové miesto reštrikčného enzýmu Sphl
SspI: cielové miesto reštrikčného enzýmu SspI
Xbal: cielové miesto reštrikčného enzýmu Xbal
Príklady prevedenia vynálezu
Vynález ďalej popisujú nasledujúce príklady. Boli použité molekulárne biologické metódy ako napríklad izolácia DNA plazmidov, štepenie reštrikčnými enzýmami, ligácia, štandardná transformácia E.coli (pokial nie je uvedené inak) popisované Samrookom a ďalšími (Molecular cloning: A laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratories, USA) .
Príklad 1: Konštrukcia génovej knižnice Corynebacterium glutämicum kmeňa AS019
DNA knižnica Corynebacterium glutämicum kmeňa AS019 (Yoshihama a ďalší, Journal of Bacteriology 162, strana 591 až
597 (1985)) boli konštruované za pomoci λ Zap Express™ systému (Short a ďalší., (1988) Nucleic Acids Research, 16: strana 7583 až 7600), ako popisuje O’Donohue (O’Donohue, M. (1997). The Cloning and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutamicum. Ph.D. Thesis, National University of Ireland, Galway). A Zap Express™ kit zakúpený od firmy Stratagene (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Rd., La Jolla, California 92037) a pri použití bolo postupované podlá inštrukcií výrobca. AS019-DNA bol štiepený reštrikčným enzýmom Sau3A a ligáciou vložený do defosforylovaných BamHI koncov Zap Express™ .
Príklad 2: Klonovanie a sekvenovanie génov opcA a zwf
Konštrukcia zwf sondy
K testovaniu vyššie popisované AS019 λ Zap Express™ knižnice bol použitý rádioaktívne označený oligonukleotíd odpovedajúci internej sekvencii zwf génu. Oligonukleotíd bol vyrobený pomocou degenerovaných PCR primérov komplementárnych k vnútorným úsekom zwf génu. Degenerované nukleotidové priméry navrhnuté pre PCR amplifikáciu zwf fragmentov boli nasledujúce:
zwf 1: 5' ATY GAY CAC TAY YTS GGY AAR GA 3' zwf 2: 5’ RAA WGG MAC RCC YKS CCA 3' pričom R=A+G; Y=C+T; W=A+T; M=A+C; S=G+C; K=T+G.
Odhadovaná velkosť výsledného PCR produktu bola približne 480bp.
Optimálne podmienky PCR reakcie boli nasledujúce:
cyklov °C po dobu 1 minúty
60°C po dobu 1 minúty
72°C po dobu 30 sekúnd
2,5 až 3,5 mM MgCl2
100 až 150 ng AS019 genómovej DNA
Analýza, sekvencie získaného PCR produktu potvrdila, že produkt odpovedá vnútorné oblasti génu zwf. Pre sekvenovanie boli použité univerzálne a reverzné sekvenačné priméry a sekvenačný kit obsahujúci T7 polymerázu od firmy Pharmacia Biotech (St. Albans, Herts, UK)
2. Klonovanie
Skríning knižnice AS019 λ Zap Express™ bol prevedený pódia' protokolu systému λ Zap Express™' (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Rd., La Jolla, California 92037.). Analýza pomocou Southern blotu bola prevádzaná na izolovaných klonoch. Prenos DNA pri Southern blotu bol prevádzaný podlá protokolu firmy Schleicher a Schuell, ktorý používa Nytran™ membránu (Nytran, Modified Nylon-66 Membráne Filters (March 1987), Schleicher and Schuell, Dassel, Germany). Dvojreťazcové DNA fragmenty, získané za použitia rovnakých primérov a PCR podmienok, aké boli popísané vyššie, boli rádioaktívne označené a- 32P-dCTP. K označeniu bol použitý kit Multiprime™ DNA labelling kit od firmy Amersham Life Science (Amersham Pharmacia Biotech UK Limited, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) . Pri rádioaktívnom označení bol dodržaný postup popisovaný výrobcom. Podmienky prehybridizácie, hybridizácie a premývania boli podlá manuálu firmy Schleicher a Schuell. Autorádiografia bola prevádzaná podľa návodu z knihy Sambrooka a ďalších za použitia filmu AGFA Curix RPIL. Takto bolo identifikované niekolko klonov obsahujúcich gén zwf. Z jedného z týchto klonov bola izolovaná plazmidová DNA a označená ako pBOB102 (viď Obrázok 1) . Táto DNA potom bola použitá k ďalšej analýze.
3.Sekvenovanie
K sekvenovaniu klonovaného inzertu pBOB102 bolo použité Sangerovo dideoxy-terminačné sekvenovanie (Sanger a ďalší, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, strana 5463 až 5467 (1977) ) . Pri sekvenovaní bol použitý T7 sekvenačný kit a a- 35S-dCTP od Pharmacia Biotech (St.Albans, Herts, UK). Vzorky boli elektroforeticky delené po dobu 3 až 6 hodín na 6 % polyakrylamidových močovinových géloch v TBE pufre za konštantného prúdu 50mA podľa návodu firmy Pharmacia (Pharmacia cloning and sequencing instructions manual, T* Sequencing™ Kit, Pharmacia Biotech, 1994). Prvá sekvenačná analýza bola prevedená za použitia M13 univerzálneho a M13 reverzného priméru od firmy Pharmacia Biotech:
Univerzálny primér: 5’ GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C 3’
M13 reverzný primér: 5' GGA AAC AGC TAT GAC CAT G 3'
Na základe získanej sekvencie boli postupne navrhované ďalšie interné priméry, tak aby bolo možné odvodiť sekvenciu celého génu opcA. Sekvencie interných primérov boli následujúce:
Interný primér 1: 5' TCA ACC CTG AGT CCA CC 3'
Interný primér 2: 5’ CTG ACC ACG AGC GGA GG 3’
Interný primér 3: 5' ATG GTG ATC TGG ACG TG 3’
Interný primér 4: 5’ CTG GCG ACT TGG CTC GA 3'
Interný primér 5: 5' CTT CCG GAT ACC ACC ACC 3'
Získaná sekvencia bola ďalej analyzovaná pomocou programu DNA Strider (Marek (1988), Nucleic Acids Research 16: strana 1829 až 1836), verzia 1.0 na počítači Apple Macintosh. Pomocou tohto programu možno prevádzať analýzu reštrikčných miest, analýzu otvorených čítacích rámcov a použitie kodónov. Zrovnanie získanej DNA sekvencie a sekvencie z EMBL a GenBank databázou bolo prevedené pomocou programu BLAST (Altschul a ďalší, (1997) Nucleic Acids Research, 25: strana 3389 až 3402). Sekvencie DNA a proteínu boli vyrovnané pomocou programov Clustal V a Clustal W (Higgins a Sharp, 1988 Gene 73: strana 237 až 244).
Takto získaná sekvencia je uvedená v Sekvencii id.č.:6. Analýzou získanej sekvencie bol odhalený otvorený čítací rámec o dĺžke 957 párov báz, ktorý bol označený ako gén opcA. Tento čítací rámec kóduje proteín o dĺžke 319 aminokyselín, ako je znázornené v Sekvencii id.č.: 8 a v Sekvencii id.č.:10. Kódujúca oblasť génu zwf je tiež obsiahnutá v Sekvencii id.č.:6. Aminokyselinová sekvencia Zwf proteínu o 514 aminokyselinách odpovedá Sekvencii id.č.:7.
Príklad 3: Príprava kozmidovej genómovej knižnice baktérie Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Chromozomálna DNA baktérie Corynebacterium glutamicum kmeňa ATCC 13032 bola najskôr izolovaná a čiastočne naštiepená (viď Tauch a ďalší (1995), Plasmid 33: strana 168 až 179) reštrikčným enzýmom Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č: 27-0913-02). Izolované fragmenty DNA boli defosforylované alkalickou fosfatázou z morských garnátov (shrimp alkaline phosphatase, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Nemecko, katalógové číslo 1758250). DNA kozmidového vektora SuperCos I (viď Wahl a ďalší, (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: strana 2160 až 2164) získaného od firmy Stratagene (La Jolla, USA, SuperCosI Cosmíd Vector Kit, katalógové číslo 251301) bola naštiepená reštrikčným enzýmom Xbal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové číslo 27-0948-02) a taktiež defosforylovaná alkalickou fosfatázou. Potom bola kozmidová DNA naštiepená reštrikčným enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové číslo 27-086804). Takto získané fragmenty kozmidovej DNA boli zmiešané s fragmentmi genómovej DNA Corynobacterium glutamicum ATCC13032 a potom spojené pomocou T4-DNA ligázy (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č.27-0870-04) . Ligačná zmes bola potom zabalená do fágových častíc pomocou pakážovacieho extraktu Gigapack II XL (Stratagene, La Jolla, USA, Gigapack II XL Packing Extract, katalógové číslo 200217). Tieto fágové častice boli použité pre infekciu E. coli kmeňa NM554 (viď Raleigh a ďalší. 1988, Nucleic Acid Res. 16: strana 1563 až 1575). Bunky boli resuspendované v 10 mM MgSO4 a zmiešané s alikvótom fágovej suspenzie. Infekcia a titrácia kozmidovej knižnice bola prevedená podlá príručky Sambrooka a ďalších (1989), Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor), pričom bunky boli vysiaté na LB-agar (viď Lennox, 1955, Virology, 1: strana 190) s prídavkom 100 pg/ml ampicilínu. Po inkubácii cez noc pri teplote 37°C boli vybrané jednotlivé rekombinantné klony.
Príklad 4: Izolácia a sekvenovanie génov opcA a zwf z baktérií Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Najskôr bola izolovaná DNA z jednej dobre oddelenej kolónie pomocou súpravy Qiaprep Spin Miniprep Kit (katalógové číslo 27106, Qiagen, Hilden, Nemecko) podľa inštrukcií výrobca a tá bola potom čiastočne naštiepená reštrikčným enzýmom Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové číslo 270913-02). Získané fragmenty DNA boli defosforylované alkalickou fosfatázou (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Nemecko, katalógové číslo 1758250). 'Po elektroforetickej separácii nasledovala izolácia fragmentov kozmidu o velkosti medzi 1500 a 2000 bp pomocou kitu QiaExII Gel. Extraction Kit (katalógové číslo 20021, Qiagen, Hilden, Nemecko).
Potom bol reštrikčným enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové číslo: 27-0868-04) naštiepený sekvenačný vektor pZero-1 od firmy Invitrogen (Groningen, Nízozemsko, katalógové číslo K2500-01). Ligácia fragmentov kozmidu do sekvenačného vektora pZero-1 bola prevedená podľa príručky Sambrook a ďalší (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), pričom bola zmes DNA s T4-ligázou (Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko) inkubovaná cez noc. Ligačnou zmesou bpli potom elektroporačne (Tauch a ďalší 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: strana 343 až 347) transformované baktérie E. coli kmeňa DHSaMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87:
strana 4645 až 4649). Transformované baktérie boli vysiate na LB-agar (Lennox, 1955, Virology, 1: strana 190) s prídavkom 50 pg/ml zeocínu.
Izolácia plazmidov z rekombinantných klonov bola prevádzaná pomocou zariadenia Biorobot 9600 (katalógové číslo 900200, Qiagen, Hilden, Nemecko). Dideoxy-terminačné sekvenovanie plazmidov (Sanger a ďalší. 1977, Proceedings of the National Academies of Sciences U.S.A., 74; strana 5463 až 5467) s modifikáciami podlá Zimmermanna a ďalších (1990, Nucleic Acids Research, 18: strana 1067) bolo prevedené s využitím sekvenačného kitu RR dRhodamin Terminátor Cycle
Sequencing Kit od firmy PE Applied Biosystems (katalógové číslo 403044, Weiterstadt, Nemecko). Elektroforetická separácia a analýza sekvenačnej reakcie bola prevedená na géle Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid (29:1) (katalógové číslo A124.1, Roth, Karlsruhe, Nemecko) v prístroji ABI Prism 377 od firmy PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Nemecko).
Získané hrubé sekvenčné dáta boli spracované pomocou Stadenova programového balíka (1986, Nucleic Acids Research, 14: strana 217 až 231) verzia 97-0. Jednotlivé sekvencie derivátov plazmidu pZerol boli zostavené v súvislý kontig. Počítačová analýza kódujúcich oblastí bola prevedná programom XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: strana 217 až 231) . Ďalšie analýzy boli prevedené programom BLAST (Altschul a ďalší 1997, Nucleic Acids Research, 25: strana 3389 až 3402), proti nie-redundantnej databáze NCBI uloženej v Národnej lekárskej knižnici USA (National Library of Medicíne).
Takto bola získaná nukleotidová sekvencia, ktorá je uvedená vo vynáleze ako Sekvencia id.č.:l. Analýza tejto nukleotidovej sekvencie odhalila jeden otvorený čítací rámec o velkosti 957 párov báz, ktorý bol označený ako gén opcA. Gén opcA vrátane stop-kodónu je súčasťou vynálezu ako Sekvencia id. č.: 4. Gén opcA kóduje polypeptid o velkosti 319 aminokyselín, ktorý je súčasťou vynálezu ako Sekvencia id.č.3 a 5.
Príklad 5: Purifikácia a N-terminálne sekvenovanie glukóza-6
-fosfát dehydrogenázy z baktérie C. glutamicum
ATCC13032.
1. Kultivácia baktérií kmeňa ATCC 13032
Baktérie Corynebacterium glutamicum ATCC13032 určené pre purifikáciu glukóza-6-fosfát dehydrogenázy boli aerobne kultivované v minimálnom médiu pri teplote 30°C vo fermentore Labfors (Infors AG, Bottmingen, Švajčiarsko). Predkultúra bola 15 hodín pestovaná na médiu Bacto® Brain-Heart Infusion (BHIM, Difco, Detroit, USA) pri teplote 30°C a potom použitá pre inokuláciu 2,5 1 minimálneho média. 1 liter média obsahoval nasledujúce zložky: 20 g (NH4)2SO4; 1 g KH2PO4 ; 1 g K2HPO4;
0,25 g MgSO4.7 H2O; 10 mg CaCl2; 0,2 mg biotínu; 30 mg protokatechovej kyseliny; 1 mg FeSO4.7 H2O; 1 mg MnSO4. H2O; 0,1 mg ZnSO4.7 H2O; 0,02 mg CuSO4; 0, 002 mg NiCl2.6 H20; 1,2 g HCI; 0,2 g polypropylénglykolu; 75 mg tritriplexu II a 100 g glukózy. Počas fermentácie bol kontinuálne pridávaný hydroxid sodný kvôli regulácii pH = 7,0. Bunky boli spratané v pozdnej exponenciálnej fáze 15 minútovou centrifugáciou pri 6400 g v odstredivke Avanti J-25 a v rotoru Beckman JA10 (Beckman, Fullerton, USA) pri teplote 4°C. Peleta bola premytá v 100 mM Tris-HCl, pH=7, 5 s prídavkom 10 mM MgCl2 a potom skladovaná pri teplote -20°C až do doby použitia.
Purifikácia enzýmu
Lýza buniek bola prevedená pomocou prístroje Desintegrator S (BlOmatic, Rodgau-Hainhausen, Nemecko). Bunky boli predtým resuspendované v pufre obsahujúcom 100 mM TriS-HCl, 10 mM MgCl2, 0, 75 mM DTT, O pH 7,5 a s prídavkom niekoľkých inhibítorov proteáz (Complete coctailTM, Roche, Mannheim, Nemecko). Pomer čerstvej hmotnosti buniek k celkovej hmotnosti suspenzie bol 0,3. Potom bolo na 100 ml bunečnej suspenzie pridané 100 ml sklenených častíc o priemere 0,1 až 0,25 mm (Fischer Scientific, Diisseldorf, Nemecko) . Lýza buniek bola potom prevedená 12 minútovou inkubáciou pri 5000 otáčkach v minúte. Zvýšenie teploty počas lýzy bolo zabránené chladením ľadom. Potom boli po oddelení sklenenej častice a bunečný lyzát bol rozdelený 90 minútovou ultracentrifugáciou pri 235.000 g v centrifúge L8-70 M a v rotore Beckman Ti45 (Beckman, Fullerton, USA). Centrifugácia prebiehala pri teplote 4°C. Supernatant po centrifugácii bol použitý ako hrubý extrakt pre purifikáciu glukóza-6-fosfát dehydrogenázy. Všetky purifikačné kroky boli prevedené s pomocou systému Biosys2000 (Beckman, Fullerton, USA).
Hrubý extrakt bol nanesený na kolónu XK 50/30 (Pharmacia, Freiburg, Nemecko) naplnenú materiálom Fractogel EMD DEAE650(S) (Merck, Darmstadt). Celkový objem činil 500 ml. Kolóna bola predtým ekvilibrovaná 50 mM TrisHCl pufrom o pH=7,5 s prídavkom 30 mM MgCl2 a 0,75 mM DTT.
Po nanesení hrubého extraktu bola kolóna premytá rovnakým pufrom obsahujúcim 144 mM KC1. Elúcia prebiehala v lineárnom gradientu KC1 od 144 mM do 320 mM, ktorý bol aplikovaný v priebehu 95 minút. Prietoková rýchlosť činila 7,4 ml/minúty. Frakcia s detekovatelnou aktivitou boli spojené a zakoncentrované v koncentrátore Centriprep©30 (Amicon, Beverly, USA) v centrifúge Varifuge 3.OR (Heraeus, Hanau, Nemecko) pri 1500 g a teplote 4°C. Potom bola koncentrácia KCl upravená na 40mM nariedením 50mM Tris-HCl, pH=7,5 s prídavkom 30 mM MgCl2 a 0,75 mM DTT. Čiastočne purifikovaná glukóza-6fosfát dehydrogenáza bola nanesená na kolónu XK26/20 (Pharmacia, Freiburg, Nemecko) naplnenú 65 ml RED-Sepharosy CL6B (Pharmacia, Freiburg, Nemecko). Kolóna bola ekvilibrovaná 50mM Tris-HCl o pH=7,5 s prídavkom 30 mM MgCl2 a 0,75 mM DTT. Elúcia prebiehala v lineárnom gradientu KCl 0 až 800 mM, ktorý bol aplikovaný v priebehu 590 minút pri prietokovej rýchlosti 0,87 ml/min.
Po spojení frakcií s glukóza-6-fosfát dehydrogenázovou aktivitou bol vyššie popísaným spôsobom znížená koncentrácia
KCI na 10 mM. Potom bol roztok nanesený na kolónu XK16/20 (Pharmacia, Freiburg, Nemecko) obsahujúci 20 ml matrice 2'5'ADP Sepharose (Pharmacia, Freiburg, Nemecko) . Kolóna bola ekvilibrovaná rovnakým pufrom ako kolóna s RED-Sepharosou CL6B. Elúcia bola prevedená lineárnym gradientom NADP od 0 po
I , mM. Frakcie s glukóza-6-fosfát dehydrogenázôvou aktivitou boli spojené a aplikované na kolónu pre gélovú filtráciu.
Gélová filtrácia bola prevedená na kolóne Superdex G200pg (Pharmacia, 30 Freiburg, Nemecko) o priemere 1,6 cm a objemu 114 ml. Elúcia bola prevedená pufrom 50 mM Tris-HCl, pH=7,5 s prídavkom 30 mM MgCl2 , 200 mM KCI a 0,75 mM DTT pri prietokovej rýchlosti 1 ml/min. Aktívne frakcie boli spojené a zakoncentrované ultrafiltráciou na kolónke centriprep® 30 (Amicon, Beverly, USA). K purifikovanému roztoku glukóza-6 fosfát dehydrogenázy bol pridaný glycerol do 50 objemových % a preparát bol potom skladovaný pri -20°C.
Počas celej purifikácie bola meraná aktivita glukóza-6fosfát dehydrogenázy a koncentrácia proteínu.
Stanovenie aktivity glukóza-6-fosfát dehydrogenázy bolo prevádzané v pufre 50 mM Tris-HCl o pH=7,5, 10 mM MgCl2 , 1 mM NADP s prídavkom 200 mM glutamátu draselného. Reakcia bola spustená prídavkom 4mM glukóza-6-fosfátu a vznikajúce NADPH bolo sledované meraním absorbancie pri 340 nm. Reakcia prebiehala pri teplote 30°C. Koncentrácia proteínov bola stanovovaná spektrofotometricky pomocou Coomassie modrej (Stoscheck, Methods in Enzymology 182, strana 50 až 68 (1990)). Ako proteínový štandard bol použitý hovädzí sérový albumín. Všetky merania boli prevádzané na spektrofotometre UV-160 (Shimadzu, Kyoto, Japonsko).
Čistota glukóza-6-fosfát dehydrogenázy bola sledovaná pomocou diskontinuálnej elektroforézy za denaturujúcich podmienok v prítomnosti SDS podlá Laemmliho (Laemmli, Náture 227, strana 680 až 685 (1970)). Po treťom purifikačnom kroku, ktorý využíval afinitnej kolóny s 2'5’-ADP-Sepharosou, boli získané dva rôzne proteíny s relatívnou molekulovou hmotnosťou približne 60 kDa a 30 kDa. Tieto dva proteíny nemohli byť oddelené gélovou filtračnou chromatografiou. Špecifická aktivita tohto preparátu bola stanovená na 213 U/mg proteínu.
3. N-terminálne sekvenovanie
Stanovenie N-terminálnej sekvencie purifikované glukóza-6P dehydrogenázy bolo prevedené Edmanovým odbúravaním (Edman a Begg, European Journal of Biochemistry 1, strana 80 až 91 (1967) ) za použitia sekvenačného systému Procise® (Applied Biosystems, Foster City, USA).
U 60 kDa proteínu bola získaná nasledujúca N-terminálna sekvencia: Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Trp Xaa Asn Pro Leu Arg Asp. Táto sekvencia je ako Sekvencia id.č.: 11 súčasťou vynálezu. 30 kDa proteín mal nasledujúcu N-terminálnu sekvenciu: Met íle Phe Xaa Leu Pro Asp Xaa Xaa Xaa Gin Gin íle Ser Lys. Táto sekvencia je ako Sekvencia id.č.: 12 taktiež súčasťou vynálezu.
Príklad 6: Klonovanie génov zwf a opcA do vektoru pGEM-T
K amplifikácii fragmentov DNA obsahujúcich celé gény zwf a opcA z baktérie C. glutamicum kmeňa ATCC13032 ako aj hraničné oblasti proti a po smeru transkripcie bola použitá PCR. PCR reakcia bola prevedená s primérmi navrhnutými podľa Sekvencie id.č.: 1 a id.č.: 6. Ako matrica bola použitá genómová DNA izolovaná z baktérií Corynebacterium glutamicum ATCC13032 postupom podľa Heery s Dunicana (Applied and Environmental Microbiology. 59: strana 791 až 799 (1993)). Použité priméry mali nasledujúce sekvencie:
zwf dopredný primér: 5' AGA ATC AGC ACG CTG CAT CAG 3’ opcA reverzný primér: 5’ AGT ATG GTG CGC GTA CTA 3'
Parametre PCR reakcie boli nasledujúce:
95°C po dobu 3 minút cyklov:
94°C po dobu 1 minúty 47°C po dobu 1 minúty 72°C po dobu 45 sekúnd
2,5 mM MgCl2 , približne 150 až 200 ng DNA templátu.
Získaný PCR produkt bol naklonovaný do komerčne dostupného vektoru pGEM-T od firmy Promega Corp (pGEM-T Easy Vector System 1, kat.č.: A1360, Promega UK, Southampton). Týmto vektorom boli potom transformované bunky E. coli kmeňa JM109 (Yanisch-Perron a ďalší, Gene 33: strana 103 až 119 (1985))
Príklad 7: Príprava kyvadlového vektoru pEC-Tl8mob2
Kyvadlový vektor pEC-T18mob2 pre baktérie E. coli a C. glutamicum bol skonštruovaný spôsobom známym zo stavu techniky.
Vektor obsahuje replikačnú oblasť rep z plazmidu pGAI vrátane efektora replikácie per (viď US-A 5,175,108; Nesvera a ďalší, Journal of Bacteriology 179, strana 1525 až 1532 (1997)), gén pre rezistencie k tetracyklínu tetA(Z) z plazmidu pAGI (US-A- 5,158,891; sekvenciu viď prístupové číslo AF121000 databáze GenBank Národného centra pre biotechnologické informácie (NCBI) Bethesda, Maryland, USA), ďalej replikačná oblasť oriV z plazmidu pMBI (viď Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, strana 77 až 90 (1979)), gen pro lacZa fragment vrátane lac promótora, mnohonásobného klonovacieho miesta (MCS) (viď Norrander a ďalší, Gene 26, strana 101 až 106 (1983) ) a oblasti mob z plazmidu RP4 (Šimon a ďalší, (1983) Bio/Technology 1: strana 784 až 791) .
Skonštruovaným vektorom boli transformované bunky E. coli kmeňa DH5oí (viď Hanahan, v knihe: DNA cloning. A practical approach (DNA klonovanie: Praktický prístup) 1. zväzok, IRLPress, Oxford, Washington DC, USA). Bunky nesúce daný plazmid boli vyselektované na LB agaru obsahujúcom 5 mg/1 tetracyklínu (Sambrook a ďalší, Molecular cloning: a laboratory manual. 2. vydanie Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Plazmidová DNA bola z transformovaných buniek izolovaná pomocou kitu QIAprep
Spin Miniprep Kit od firmy Qiagen. Izolovaná DNA potom bola testovaná reštrikciou pomocou enzýmov EcoRI a HindlII a následnou elektroforézou na 0,8g agarózovom gélu.
Plazmid bol nazývaný pEC-Tl8mob2 a je znázornený na Obrázku č. 2. Uložený je v bunkách E. coli kmeňa K-12 ako DH5oť/pEC-T18mob2 v Nemecké zbierke mikroorganizmov a bunečných kultúr, (Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen and Zellkulturen, DSMZ, Braunschweig, Nemecko) pod označením DSM 13244.
Príklad 8: Expresia glukóza-6-fosfát dehydrogenázy v baktériách Corynebacterium glutamicum
Celé gény zwf a opcA boli v ďalším postupu izolované z vektoru pGEM-T, do ktorého boli predtým naklonované (viď Príklad 6) . Tento vektor obsahuje uvedené gény na fragirientu, ktorý možno vyštiepiť reštrikčnými enzýmami Sphl a Sali. Po vystépení byl tento fragment klonován do Sphl/Sall miest v génu lacZoc kyvadlového vektora pEC-T18mob2 pre baktérie E. coli a C.glutamicum (viď príklady 7 a 2) . Tento kyvadlový vektor obsahuje dve Sphl miesta. Prvé sa nachádza v oblasti polylinkéra v géne lacZa a druhé je vnútri génu nesúceho tetracyklinovú rezistenciu. Tetracyklín (Sigma-Aldrich, PO Box 2424, Wimborne, Dorset PH21 7YR, UK) (5mg/l) bol teda použitý pre selekciu, lebo iba tie klony, ktoré obsahovali intaktný gén pre tetracyklinovú rezistenciu, boli schopné rásť. Tento nový konštrukt bol označený ako pECzwfopcA (viď obrázok 3) . Reštrikčná analýza pomocou enzýmu Sací (Boehringer Mannheim GmbH, Germany) ukázala správnú orientáciu génov zwf a opcA vzhladom k fragmentu génu lacZa vo vektore pEC-T18mob2, tzn. v smere transkripcie od lac promótora. Uvedeným konštruktom boli transformované baktérie Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (American Type Culture Collection - Americká zbierka bunečných kultúr, Manasas, VA, USA). Elektrotransformanty boli selektované na Luria agare obsahujúcom izopropyltiogalaktopyranozid (IPTG), 5-bromo4-cfyloro-3-indolylgalaktopyranozid (X-Gal) a tetracyklín o koncentráciách 1 mM, 0,02%, respektíve 5 mg/1. Agarové platne boli inkubované 48 hodín pri 30°C. Rýchla izolácia plazmidov bola prevedená podía O’Gara a Dunicana, (Applied and Environmental Microbiology 61: 4477-4479 (1995)). Reštrikcia pomocou enzýmu Sací potvrdila prítomnosť požadovaných klonov. Jeden z týchto klonov bol označený ako ATCC13032/pECzwfopcA.
Príklad 9: Príprava baktérií s amplifikovaným génom opcA produkujúcich aminokyseliny
Kmeň baktérií Corynebacterium glutamicum DSM5715 produkujúci L-lyzín je popísaný v 'dokumente EP-B-0435132 ' a kmeň baktérií Brevibacterium flavum D5M5399 produkujúci Ltreonín je popísaný v dokumente EP-B-0385940. Oba kmene sú uložené v Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen and Zellkulturen [Nemecká zbierka mikroorganizmov a bunečných kultúr] v Braunschweigu (Nemecko) podľa , ustanovenia Budapešťanskej zmluvy.
Kmene DSM5715 a DSM5399 boli transformované plazmidom pECzwfopcA. (Príklad 8) za použitia elektroporačnej metódy popisovanej Lieblom a ďalšími., (FEMS Microbiology Letters, 53: strana 299 až 303 (1989)) Selekcia trans formantov bola prevedená na agare LBHIS obsahujúcom 18.5 g/1 BHIM, 0,5 M sorbitol, 5 g/1 Bacto-tryptónu, 2,5 g/1 kvasničného extraktu Bacto, 5 g/1 NaOl a 18 g/1 Bacto-agaru, s prídavkom 5 mg/1 tetracyklínu. Baktérie boli inkubované po dobu dvoch dní pri 33°C.
Takto získané kmene boli pomenované DSM5715/pECzwfopcA a DSM5399/pECzwfopcA.
Príklad 10: Príprava L-treonínu
Baktérie C. glutamicum kmeňa DSM5399/pECzwfopcA, získané tak, ako je uvedené v Príkladu 9, boli kultivované v živnom médiu vhodnom pre produkciu L-treonínu. Bol stanovený obsah Ltreonínu v supernatantu kultivačného média.
Za týmto účelom bol daný kmeň najskôr inkubovaný na agarovej platni s odpovedajúcim antibiotikom (agar s vývarom z mozgu a srdca (Brain-Heart agar) s prídavkom tetracyklínu (5 mg/1)) podobu 24 hodín pri 33°C. Z tejto kultúry narastanej na agarovej platni potom bolo naočkované ihokulum (10 ml média v 100 ml Erlenmeyerovej banke) . Ako médium pre toto inokulum bolo použito kompletní médium Cg III:
Médium Cg III
NaCl 2,5 g/1
Bacto-peptón 10 g/1
Bacto-kvasničný extrakt 10 g/1
Glukóza (autoklávovaná oddelene) 2% (w/v) pH bolo upravené na pH=7,4
K takto pripravenému médiu bol pridaný tetracyklín (5 mg/1) . Kultúra bola inkubovaná na trepačke po dobu 16 hodín pri 33°C a 240 otáčkach za minútu. Z tejto prvej kultúry potom bola vysiata hlavná produkčná kultúra. Počiatočné OD (660nm) tejto hlavnej kultúry činila 0,1.
Pre pestovanie hlavnej kultúry bolo použité médium MM.
Médium MM
CSL (corn steep liquor) 5 g/1
MOPS (kyselina morfolinopropánsulfónová) 20 g/1
Glukóza (autoklávovaná oddelene) 50g/l
Soli:
(NH4) 2SO4 25 g/1
KH2PO4 0,1 g/1
Mg S04 *7 H20 1,0 g/1
CaCl2*2 H2O 10 mg/1
FeSO4*7 H2O 10 mg/1
MnSO4* H2O 5, Omg/1
Biotín (sterilné filtrovaný) 0, 3mg/1
Tiamín*HCl (sterilné filtrovaný) 0,2mg/1
Leucín (sterilné filtrovaný) 0,1 g/1
CaCO3 25 g/1
CSL, MOPS a roztok solí bol upravený vodným roztokom amoniaku na pH=7 a autoklávovaný. Potom boli pridané sterilné roztoky substrátov a vitamínov, ako aj suchý autoklávovaný CaCC>3.
Kultivácia prebiehala v 10 ml média v 100 ml Erlenmeyerovej banke s miešacou zarážkou. K médiu bol pridaný tetracyklín (5 mg/1). V priebehu kultivácie bola udržovaná teplota 33°C a 80% vzdušná vlhkosť.
Po 72 hodinách bola nameraná OD pri vlnovej dĺžke 660 nm na spektrofotometru Biomek 1000 od firmy Beckmann Instruments GmbH (Mníchov). Množstvo vzniklého treonínu bolo stanovené aminokyselinovým analyzátorom spoločnosti Eppendorf-Bioľronik (Hamburk, Nemecko) používajúcom chromatografiu na ionexe s následnou ninhydrínovou detekciou.
Výsledok tohto pokusu je uvedený v tabulke 1.
Tabulka 1
Kmeň OD L-treonín
g/i
D5M5399 12,3 0, 74
DSM5399/pECzwfopcA 9,9 1,0
Príklad 11: Príprava L-lyzínu
Baktérie C. glutamicum kmeňov DSM5715/pECzwfopcA získané v príklade 9 boli kultivované v živnom médiu vhodnom pre produkciu lyzínu a po tejto kultivácii bol stanovený obsah lyzínu v supernatantu kultivačného média.
Baktérie uvedených kmeňov boli najskôr vysiate na agarovú platňu s odpovedajúcim antibiotikom (agar s vývarom z mozgu a srdca (Brain-Heart agar) s prídavkom tetracyklínu (5 mg/1) a inkubované 24 hodín pri 33°C. Z tejto agarózovej platne bolo naočkované inokulum (10 ml média v 100 ml Erlenmeyerovej banke) . Ako médium pre toto inokulum bolo použité komplexné médium CglII.
Médium Cg III
NaCl Bacto-peptón Bacto-kvasničný extrakt 2,5 g/1 10 g/1 10 g/1
Glukóza (autoklávovaná oddelene) 2 %
pH bolo upravené na pH = 7,4
Toto CglII médium obsahovalo tetracyklín (5 mg/1).
Inokulum bolo inkubované na trepačke 24 hodín pri teplote 33
°C a pri 240 otáčkach za minútu.
Týmto inokulom bola naočkovaná hlavná produkčná kultúra. Počiatočná OD(660 nm) hlavnej produkčnej kultúry robila 0,2. Ako živné médium bolo použité médium MM.
Médium MM
CSL (corn steep liquor) 5 g/1
MOPS (kyselina morfolinopropánsulfónová) 20 g/1
Glukóza (autoklávovaná oddelene) 50g/l
Soli:
(NH4)2SO4 25 g/1
KH2PO4 0,1 g/1
Mg S04 *7H2O 1,0 g/1
CaCl2*2H2O 10 mg/1
FeSO4*7H2O 10 mg/1
MnS04* H20 5,0mg/l
Biotín (sterilné filtrovaný) 0,3mg/l
Tiamín*HCl (sterilné filtrovaný) 0,2mg/l
Leucín (sterilné filtrovaný) 0,1 g/1
CaCO3 25 g/1
CSL, MOPS a roztok solí bol upravený vodným roztokom amoniaku na pH=7 a autoklávovaný. Potom boli pridané sterilné roztoky substrátov a vitamínov, ako aj suchý autoklávovaný CaCOa.
Kultivácia prebiehala v 10 ml média v 100 ml Erlenmeyerove banke s retardérom. K médiu bolo pridané 5 mg/1 tetracyklínu. V priebehu kultivácie bola udržovaná teplota 33°C a 80 % vzdušná vlhkosť.
Po 72 hodinách bola nameraná OD pri vlnovej dĺžke 660 nm na spektrometre Biomek 1000 od firmy Beckmann Instruments GmbH (Mníchov). Množstvo vzniklého lyzínu bolo stanovené aminokyselinovým analyzátorom spoločnosti Eppendorf-Bioľronik (Hamburk, Nemecko) používajúcom chromatografiu na ionexe s následnou ninhydrínovou detekciou.
Výsledok tohto pokusu je uvedený v tabulke 2.
Tabulka 2
Kmeň OD L-lyzín HCI (g/1)
DSM5715 10, 8 16,0
DSM5715/pECzwfopcA 8,1 17,1
Popis sekvencii
INFORMÁCIE 0 SEKVENCII ID.Č. 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 6995 párov báz
(B) TYP: deoxyribonukleová kyselina
(C) POČET VLÁKIEN: dve
(D) TOPOLÓGIA: lineárna
(vi) PÔVOD:
(A) ORGANIZMUS: Corynobacterium glutamicum ATCC13032 (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) MENO/KĽÚČ: gén zwf (B) POLOHA: 3658..5202 (A) MENO/KIÚČ: gén opcA (B) POLOHA: 5217..6173 (xi) POPIS SEKVENCIE ID:Č:1
cacatttgaa ccacagttgg ttataaaatg ggttcaacat cactatggtt agaggtgttg 60
acgggtcaga ttaagcaaag actactttcg gggtagatca cctttgccaa atttgaacca 120
attaacctaa gtcgtagatc tgatcatcgg atctaacgaa aacgaaccaa aactttggtc 180
ccgatttaac ccaggaagga ttgaccačct tgacgctgtc acctgaactt caggcgctca 240
ctgtacgcaa ttacccctct gattggtccg atgtggacac caaggctgta gacactgttc 300
gtgtcctcgc tgcagacgct gtagaaaact gtggctccgg ccacccaggc accgcaatga 360
gcctggctcc ccttgcatac accttgtacc agcgggttat gaacgtagat ccacaggaca 420
ccaactgggc aggccgtgac cgcttcgttc tttcttgtgg ccactcctct ttgacccagt 480
acatccagct ttacttgggt ggattcggcc ttgágatgga tgacctgaag gctctgcgca 540
cctgggattc cttgacccca ggacaccctg agtaccgcca caccaagggc gttgagatca 600
ccactggccc tcttggccag ggtcttgcat ctgcagttgg tatggccatg gctgctcgtc 660
gtgagcgtgg cctattcgac ccaaccgctg ctgagggcga atccccattc gaccaccaca 720
tctacgtcat tgcttctgat ggtgacctgc aggaaggtgt cacctctgag gcatcctcca 780
tcgctggcac ccagcagctg ggcaacctca tcgtgttctg ggatgacaac cgcatctcca 840
tcgaagacaa cactgagatc gctttcaacg aggacgttgt tgctcgttac aaggcttacg 900
gctggcagac cattgaggtt gaggctggcg aggacgttgc agcaatcgaa gctgcagtgg 960 ctgaggctaa gaaggacacc aagcgaccta ccttcatccg cgttcgcacc atcatcggct 1020 tcccagctcc aactatgatg aacaccggtg ctgtgcacgg tgctgctctt ggcgcagctg 1080 aggttgcagc aaccaagact gagcttggat tcgatcctga ggctcacttc gcgatcgacg 1140 atgagcttat cgctcacacc cgctccctcg cagagcgcgc tgcacagáag aaggctgcat 1200 ggcaggtcaa gttcgatgag tgggcagctg ccaaccctga gaacaaggct ctgttcgatc 1260 gcctgaactc ccgtgagctt,ccagcgggct acgctgacga gctcccaaca tgggatgcag 1320 atgagaaggg cgtcgcaact cgtaaggctt ccgaggctgc acttcaggca ctgggcaaga 1380 cccttcctga gctgtggggc ggttccgctg acctcgcagg ttccaacaac accgtgatca 1440 agggetcccc ttccttcggc cctgagtcca tctccaccga gacctggtct gctgagcctt 1500 acggccgtaa cctgcacttc ggtatccgtg agcacgctat gggatccatc ctcaacggca 1560
tttccctcca cggtggcacc i cgcccatacg i gcggaacctt cctcatcttc tccgactaca 1620
tgcgtcctgc ; agttcgtctt gcagctctca tggaqaccga cgcttactac gtctggaccc 1680
acgactccat cggtctgggc gaagatggcc caacccacca gcctgttgaa accttggctg 1740
cactgcgcgc catcccaggt ctgtccgtcc tgcgtcctgc agatgcgaac gagaccgccc 1800
aggcttgggc tgcagcactt gagtacaagg aaggccctaa gggtcttgca ctgacccgcc 1860
agaacgttcc tgttctggaa ggcaccaagg agaaggctgc tgaaggcgtt cgccgcggtg 1920
gctacgtcct ggttgagggt tccaaggaaa ccccagatgt gatcctcatg ggctccggct 1980
ccgaggttca gcttgcagtt aacgctgcga aggctctgga agctgagggc gttgcagctc 2040
gcgttgtttc cgttccttgc atggattggt tccaggagca ggacgcagag tacatcgagt 2100
ccgttctgcc tgcagctgtg accgctcgtg tgtctgttga agctggcatc gcaatgcctt 2160
ggtaccgctt cttgggcacc cagggccgtg ctgtctccct tgagcacttc ggtgcttctg 2220
cggattacca gaccctgttt gagaagttcg gcatcaccac cgatgcagtc gtggcagcgg 2280
ccaaggactc cattaacggt taattgccct gctgttttta gcttcaaccc ggggcaatat 2340
gattctccgg aattttattg ccccgggttg ttgttgttaa tcggtacaaa gggtcttaag 2400
cacatccctt acttgcctgc tctccttgag cacagttcaa gaacaattct tttaaggaaa 2460
atttagtttc atgtctcaca ttgatgatct tgcacagctc ggcacttcca cttggctcga 2520
cgacctctcc cgcgagcgca ttacttccgg caatctcagc caggttattg aggaaaagtc 2580
tgtagtcggt gtcaccacca acccagctat tttcgcagca gcaatgtcca agggcgattc 2640
ctacgacgct cagatcgcag agctcaaggc cgctggcgca tctgttgacc aggctgttta 2700
cgccatgagc atcgacgacg ttcgcaatgc ttgtgatctg ttcaccggca tcttcgagtc 2760
ctccaacggc : tacgacggcc : gcgtgtccat cgaqgttgac ccacgtatct ctgctgaccg 2820
cgacgcaacc ctggctcagg ccaaggagct gtgggcaaag gttgatcgtc caaacgtcat 2880 gatcaagatc cctgcaaccc caggttcttt gccagcaatc accgacgctt tggctgaggg 2940 catcagcgtt aacgtcacct tgatcttctc cgttgctcgc taccgcgagg tcatcgctgc 3000 gttcatcgag ggcatcaagc aggctgctgc aaacggccac gacgtctcca agatccactc 3060 tgtggcttcc ttcttcgtct cccgcgtcga cgttgagatc gacaagcgcc tcgaggcaat 3120 cggatccgat gaggctttgg ctctgcgcgg caaggcaggc gttgccaacg ctcagcgcgc 3180 ttacgctgtg tacaaggagc ttttcgacgc cgccgagctg cctgaaggtg ccaacactca 3240 gcgcccactg tgggcatcca ccggcgtgaa gaaccctgcg tacgctgcaa ctctttacgt 3300 ttccgagctg gctggtccaa acaccgtcaa caccatgcca gaaggcacca tcgacgcggt 3360 tctggagcag ggcaacctgc acggtgacac cctgtccaac tccgcggcag aagctgacgc 3420 tgtgttctcc cagcttgagg ctctgggcgt tgacttggca gatgtcttcc aggtcctgga 3480 gaccgagggt gtggacaagt tcgttgcttc ttggagcgaa ctgcttgagt ccatggaagc 3540 tcgcctgaag tagaatcagc acgctgcatc agtaacggcg acatgaaatc gaattagttc 3600 gatcttatgt ggccgttaca catctttcat taaagaaagg atcgtgacac taccatc 3657
gtg Val 1 agc aca aac acg acc ccc tcc agc tgg aca aac cca ctg ege gac 3705
Ser Thr Asn Thr 5 Thr Pro Ser Ser Trp 10 Thr Asn Pro Leu Arg 15 Asp
ccg cag gat· aaa ega ctc ccc ege atc get ggc cct tcc ggc atg gtg 3753
Pro Gin Asp Lys Arg Leu Pro Arg íle Ala Gly Pro Ser Gly Met Val
20 25 30
atc ttc ggt gtc act ggc gac ttg get ega aag aag ctg ctc ccc gcc 3801
íle Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala
35 40 45
att tat gat cta gca aac ege gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg 3849
íle Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu
50 55 60
gta ggt tac ggc ege ege gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac 3897
Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr
70 75 80
gta Val cgc gat gcc gca Ala 85 agt Ser get Ala ggt get cgt acg Thr gaa ttc cgt gaa Glu 95 aat Asn 3945
Arg Asp Ala Gly Ala Arg 90 Glu Phe Arg
gtt tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt 3993
Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe
100 105 110
gat gat gat gca get ttc gac aac ctc get gca aca ctc aag cgc atc 4041
Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg íle
115 120 125
gac aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg get tac tac ctg tcc att 4089
Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser íle
130 135 140
cca cca gat tcc ttc aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc 4137
Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gin Leu Glu Arg Ser Gly
145 150 155 160
atg get gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag 4185
Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val lle íle Glu Lys
165 170 175 cct ttc Pro Phe ggc cac aac ctc gaa Gly His Asn Leu Glu
180 tcc gca cac Ser Ala His 185 gag ctc aac cag Glu Leu Asn Gin
190 ctg gtc Leu Val
4233
aac gca gtc ttc Val Phe 195 cca Pro gaa tct tct Ser 200 gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg Leu 4281
Asn Ala Glu Ser Val Phe Arg íle Asp His 205 Tyr
ggc aag gaa aca gtt caa aac atc ctg get Ctg cgt ttt get aac cag 4329
Gly Lys Glu Thr Val Gin Asn íle Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gin
210 215 220
ctg ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc 4377
Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gin íle
225 230 235 240
acc atg get gaa gat att ggc ttg ggt gga cgt get ggt tac tac gac 4425
Thr Met Ala Glu Asp íle Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp
245 250 255
ggc atc ggc gca gcc cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc 4473
Gly íle Gly Ala Ala Arg Asp Val íle Gin Asn His Leu íle Gin Leu
260 265 270
ttg get ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag 4521
Leu Ala Leu Val Ala Met .Glu Glu Pro íle Ser Phe Val Pro Ala Gin
275 280 285 ctg cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac 4569
Leu Gin Ala Glu Lys íle Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr
290 295 300
cca ttg Pro Leu 305 gat aaa acc Asp Lys Thr tcc get cgt ggt Arg Gly eag Gin tac get gcc ggt Ala Gly tgg eag 4617
Ser 310 Ala Tyr 315 Ala Trp Gin 320
ggc tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct 4665
Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro
325 330 335
gag tcc acc act gag act ttt gcg get tgt acc tta gag atc acg tct 4713
Glu Sex Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu íle Thr Ser
340 345 350
cgt cgc tgg get ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt 4761
Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu
355 360 365
ggt cgc cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac His 4809
Gly Arg Arg Val Thr Glu íle Ala Val Val Phe Lys 380 Asp Ala Pro
370 375
eag cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc 4857
Gin Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gin Asn Ala íle
385 390 395 400
gtg att cgc gtg eag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc 4905
Val íle Arg Val Gin Pro Asp Glu Gly Val Leu íle Arg Phe Gly Ser
405 410 415
aag gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc 4953
Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe
420 425 430
tcc tac tca gaa tcc ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc 5001
Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg
435 440 445
ctc att ttg gat gcg ctg tta gat gaa tcc age ctc ttc cct acc aac 5049
Leu íle Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn
450 455 4 60
gag gaa gtg gaa ctg age tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca 5097
Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys íle Leu Asp Pro íle Leu Glu Ala
465 470 475 480
tgg Trp gat Asp gcc gat gga Gly 485 gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg tgg ggt 5145
Ala Asp Glu Pro Glu Asp Tyr 4 90 Pro Ala Gly Thr Trp Gly 495
cca aag age get gat gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc 5193
Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg
500 505 510
agg cca taa tttaggggca aaaa atg atc ttt gaa ctt ccg gat acc acc 5243
Arg Pro Met íle Phe Glu Leu Pro Asp Thr Thr
515 520
acc Thr 525 cag Gin caa Gin att íle tcc aag acc cta Thr Leu act Thr ega ctg cgt gaa Glu tcg Ser ggc acc Gly Thr 540 5291
Ser Lys 530 Arg Leu 535 Arg
cag gtc acc acc ggc ega gtg ctc acc ctc atc gtg gtc act gac tcc 5339
Gin Val Thr Thr Gly Arg Val Leu Thr Leu íle Val Val Thr Asp Ser
545 550 555
gaa ' agc gat gtc get gca gtt acc gag tcc acc aať gaa gcc tcg ege 5387
Glu Ser Asp Val Ala Ala Val Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala Ser Arg
560 565 570
gag cac cca •tet ege gtg atc att ttg gtg gtt ggc gat aaa act gca 5435
Glu His Pro Ser Arg Val íle íle Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala
575 580 585
gaa aac aaa gtt gac gca gaa gtc cgt atc ggt ggc gac get ggt get 5483
Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu Val Arg íle Gly Gly Asp Ala Gly Ala
590 595 600
tcc gag atg atc atc atg cat ctc aac gga cct gtc get gac aag ctc 5531
Ser Glu Met íle íle Met His Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu
605 610 615 620
cag tat. gtc gtc aca cca ctg ttg ctt cct gac acc ccc atc gtt get 5579
Gin Tyr Val Val Thr Pro Leu Leu Leu Pro Asp Thr Pro íle Val Ala
625 630 635
tgg tgg cca ggt gaa tca cca aag aat cct tcc cag gac cca att gga 5627
Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro Lys Asn Pro Ser Gin Asp Pro íle Gly
640 645 650
ege atc gca caa ega ege atc act gat get ttg tac gac cgt gat gac 5675
Arg íle Ala Gin Arg Arg íle Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp
655 660 665
gca cta gaa gat cgt gtt gag aac tat cac cca ggt gat acc gac • atg 5723
Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met
670 675 680
acg Thr 685 tgg Trp gcg Ala ege ctt Arg Leu acc Thr 690 cag tgg cgg gga ctt gtt gcc tcc tca ttg Leu 700 5771
Gin Trp Arg Gly Leu Val 695 Ala Ser Ser
gac cac cca cca cac agc gaa atc act tcc gtg agg ctg acc ggt gca 5819
Asp His Pro Pro His Ser Glu íle Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala
705 710 715
agc ggc agt acc tcg gtg gat ttg get gca ggc tgg ttg gcg cgg agg 5867
Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg
720 725 730
ctg aaa gtg cct gtg atc ege gag gtg aca gat get ccc acc gtg cca 5915
Leu Lys Val Pro Val íle Arg Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro
735 740 745
acc Thr gat Asp 750 gag Glu ttt Phe ggt act Gly Thr cca Pro 7 55 ctg Leu ctg get Leu Ala atc cag cgc ctg gag Leu Glu atc íle 5963
íle Gin 7 60 Arg
gtt cgc acc acc ggc tcg atc atc atc acc atc tat gac get cat acc 6011
Val Arg Thr Thr Gly Ser Íle íle Íle Thr íle Tyr Asp Ala His Thr
765 770 775 780
ctt cag gta gag atg ccg gaa tcc ggc aat gcc cca tcg ctg gtg get 6059
Leu Gin Val Glu Met Pro Glu Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala 1
785 790 795
att ggt cgt ega agt gag tcc gac tgc ttg tet gag gag ctt cgc cac 6107
Íle Gly Arg Arg Ser Glu Ser Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His
800 • 805 810
atg gat cca gat ttg ggc tac cag cac gca cta tcc ggc ttg tcc age 6155
Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr Gin His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser
815 820 825
gtc aag ctg gaa acc gtc taaggagaaa tacaacacta tggttgatgt 6203
Val Lys Leu Glu Thr Val
830
agtacgcgca cgcgatactg aagatttggt tgcacaggct gcctccaaat tcattgaggt 6263
tgttgaagca gcaactgcca ataatggcac cgcacaggta gtgctcaccg gtggtggcgc 6323
cggcatcaag ttgctggaaa agctcagcgt tgatgcggct gaccttgcct gggatcgcat 6383
tcatgtgttc ttcggcgatg agcgcaatgt ccctgtcagt gattctgagt ccaatgaggg 6443
ccaggctcgt gaggcactgt tgtccaaggt ttctaťccct gaagccaaca ttcacggsta 6503
tggtctcggc gacgtagatc ttgcagaggc agcccgcgct tacgaagctg tgttggatga 6563
attcgcacca aacggctttg atcttcacct gctcggcatg ggtggcgaag gccatatcaa 6623
ctccctgttc cctcacaccg atgcagtcaa ggaatcctcc gcaaaggtca tcgcggtgtt 6683
tgattcccct aagcctcctt cagagcgtgc aactctaacc cttcctgcgg ttcactccgc 6743
aaagcgcgtg tggttgctgg tttctggtgc ggagaaggct gaggcagctg cggcgatcgt 6803
caacggtgag cctgctgttg agtggcctgc tgctggagct accggatctg aggaaacggt 6863
attgttcttg gctgatgatg ctgcaggaaa tetetaagea gcgccagctc taacaagaag 6923
ctttaacaag aagctctaac gaaaagcact aacaaactaa tccgggtgcg aaccttcatc 6983
tgaatcgatg ga 6995
INFORMÁCIE O SEKVENCII ID.Č. 1:
(A) DĹŽKA: 514 aminokyselín (B) TYP: proteín (C) ORGANIZMUS: Corynobacterium glutamicum
ATCC13032
Val Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp 15 10 15
Pro Gin Asp Lys Arg Leu Pro Arg íle Ala Gly Pro. Ser Gly Met Val 20 ,25 30 íle Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala 35 40 45
Íle Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu 50 55 60
Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr 65 70 . 75 80
Val Arg Asp Ala Ala 85 Ser Ala Gly Ala Arg 90 Thr Glu Phe Arg Glu 95 Asn
Val Trp Glu Arg 100 Leu Ala Glu Gly Met 105 Glu Phe Val Arg Gly 110 Asn Phe
Asp Asp Asp 115 Ala Ala Phe Asp Asn 120 Leu Ala Ala Thr Leu 125 Lys Arg íle
Asp Lys 130 Thr Arg Gly Thr Ala 135 Gly Asn Trp Ala Tyr 140 Tyr Leu Ser íle
Pro 145 Pro Asp Ser Phe Thr 150 Ala Val Cys His Gin 155 Leu Glu Arg Ser Gly 160
Met Ala Glu Ser Thr 165 Glu Glu Ala Trp Arg 170 Arg Val íle íle Glu 175 Lys
Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gin Leu Val
180 185 190
Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg íle Asp His Tyr Leu 195 200 205
Gly Lys Glu Thr Val Gin Asn íle Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gin 210 215 220
Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gin íle
225 230 235 240
Thr Met Ala Glu Asp íle Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp
245 250 255
Gly íle Gly Ala Ala Arg Asp Val íle Gin Asn His Leu íle Gin Leu 260 265 270
Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro íle Ser Phe Val Pro Ala Gin 275 280 285
Leu Gin Ala Glu Lys íle Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr 290 295 300
Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gin Tyr Ala Ala Gly Trp Gin 320
305 310 315
Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu . Asp Gly Phe Asn Pro
325 330 335
Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu íle Thr Ser
340 345 350
Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu
355 360 365
Gly Arg Arg Val Thr Glu íle Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His
370 375 380
Gin Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gin Asn Ala íle
385 390 395 400
Val íle Arg Val Gin Pro Asp Glu Gly Val Leu íle Arg Phe Gly Ser
405 410 415
Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe
420 425 430
Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg
435 440 445
Leu íle 450 Leu Asp Ala Leu Leu 455 Asp Glu Ser Ser Leu 460 Phe Pro Thr Asn
Glu Glu 465 Val Glu Leu Ser 470 Trp Lys íle Leu Asp 475 Pro íle Leu Glu Ala 480
Trp Asp Ala Asp Gly 485 Glu Pro Glu Asp Tyr 490 Pro Ala Gly Thr Trp 495 Gly
Pro Lys Ser Ala 500 Asp Glu Met Leu Ser 505 Arg Asn Gly His Thr 510 Trp Arg
Arg Pro
INFORMÁCIE O SEKVENCII ID.Č. 3:
(C) DĹŽKA: 319 aminokyselín (D) TYP: proteín (C) ORGANIZMUS: Corynobacterium glutamicum ATCC13032
Met 1 íle Phe Glu Leu 5 Pro Asp Thr Thr Thr 10 Gin Gin íle Ser Lys 15 Thr
Leu Thr Arg Leu 20 Arg Glu Ser Gly Thr 25 Gin Val Thr Thr Gly 30 Arg Val
Leu Thr Leu 35 íle Val Val Thr Asp 40 Ser Glu Ser Asp Val 45 Ala Ala Val
Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala Ser Arg Glu His Pro Ser Arg Val íle
55 60 íle Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu
65 70 75 80
Val Arg Íle Gly Gly . Asp Ala Gly Ala Ser Glu Met Íle íle Met His
85 90 95
Leu Asn Gly Pro Val Ala- Asp Lys Leu Gin Tyr Val Val Thr Pro Leu
100 105 110
Leu Leu Pro Asp Thr Pro íle Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro
115 120 125
Lys Asn Pro Ser Gin Asp Pro Íle Gly Arg Íle Ala Gin Arg Arg íle
130 135 140
Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu
145 150 155 160
Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gin
165 170 175
Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His Pro Pro His Ser Glu
180 185 190
Íle Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp
195 200 205
Leu Ala 210 Ala Gly Trp Leu Ala 215 Arg Arg Leu Lys Val 220 Pro Val íle Arg
Glu 225 Val Thr Asp Ala Pro 230 Thr Val Pro Thr Asp 235 Glu Phe Gly Thr Pro 240
Leu Leu Ala íle Gin 245, Arg Leu Glu íle Val 250 Arg Thr Thr Gly Ser 255 íle
íle íle Thr íle 260 Tyr Asp Ala His Thr 265 Leu Gin Val Glu Met 270 Pro Glu
Ser Gly Asn 275 Ala Pro Ser Leu Val 280 Ala íle Gly Arg Arg 285 Ser Glu Ser
Asp Cys 290 Leu Ser Glu Glu Leu 295 Arg His Met Asp Pro 300 Asp Leu Gly Tyr
Gin His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val
305 310 315
INFORMÁCIE O SEKVENCII ID.Č. 4:
(A) TYP: deoxyribonukleová kyselina (B) ORGANIZMUS: Corynobacterium glutamicum
ATCC13032 (C) MENO/KĽÚČ: CDS (D) POLOHA: 1. . 957 (E) NÁZOV: opcA (xi) POPIS SEKVENCIE ID:Č:4 atg atc ttt gaa ctt ccg gat acc acc acc cag caa att tcc aag acc
Met íle Phe Glu Leu Pro Asp Thr Thr Thr Gin Gin íle Ser Lys Thr 1 5 10 i5
cta Leu act Thr ega Arg ctg Leu 20 cgt Arg gaa Glu tcg ggc acc Thr 25 cag gtc acc acc ggc ega Arg gtg Val 96
Ser Gly Gin Val Thr Thr Gly 30
ctc acc ctc atc gtg gtc act gac tcc gaa age gat gtc get gca gtt 144
Leu Thr Leu íle Val Val Thr Asp Ser Glu Ser Asp Val Ala Ala Val
35 40 45
acc gag tcc acc aat gaa gcc tcg ege gag cac cca tet ege gtg atc 192
Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala Ser Arg Glu His Pro Ser Arg Val íle
55 60 att ttg gtg gtt ggc gat aaa act gca gaa aac aaa gtt gac gca gaa 240 íle Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu
70 75 80 gtc cgt atc ggt ggc gac get ggt get tcc gag atg atc atc atg cat 288
Val Arg íle Gly Gly Asp Ala Gly Ala Ser Glu Met íle íle Met His
90 95 .
ctc aac gga cct gtc get gac aag ctc cag tat gtc gtc aca cca ctg 336
Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gin Tyr Val Val Thr Pro Leu
100 105 110
ttg ctt cct gac acc ccc atc gtt get tgg tgg cca ggt gaa tca cca Pro 384
Leu Leu Pro Asp 115 Thr Pro íle Val Ala Trp 120 Trp Pro Gly Glu Ser 125
aag aat cct tcc cag gac cca att gga ege atc gca caa ega ege atc 432
Lys Asn Pro Ser Gin Asp Pro íle Gly Arg íle Ala Gin Arg Arg íle
130 135 140
act gat get ttg tac gac cgt gat gac gca cta gaa gat cgt gtt gag 480
Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu
145 150 155 160
aac tat cac cca ggt gat acc gac atg acg tgg gcg ege ctt acc cag 528
Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gin
165 170 175
tgg cgg gga ctt gtt gcc tcc tca ttg gat cac cca cca cac age gaa 57 6
Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His Pro Pro His Ser Glu
180 185 190
atc act tcc gtg agg ctg acc ggt gca age ggc agt acc tcg gtg gat 624
íle Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp
195 200 205
ttg Leu get Ala 210 gca Ala ggc tgg ttg Leu gcg cgg Ala Arg 215 agg Arg ctg Leu aaa Lys gtg Val 220 cct Pro gtg Val atc íle cgc Arg 672
Gly Trp
gag gtg aca gat get ccc acc gtg cca acc gat gag ttt ggt act cca 720
Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro
225 230 235 240
ctg ctg get atc cag cgc ctg gag atc gtt ege acc acc ggc tcg atc 768
Leu Leu Ala íle Gin Arg Leu Glu íle Val Arg Thr Thr Gly Ser íle
245 250 255
atc atc acc atc tat gac get cat acc ctt cag gta gag atg ccg gaa 816
íle íle Thr íle Tyr Asp Ala His Thr Leu Gin Val Glu Met Pro Glu
260 265 270
tcc ggc aat gcc cca tcg ctg gtg get att ggt cgt ega agt gag tcc 864
Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala íle Gly Arg Arg Ser Glu Ser 275 280 285 gac tgc ttg Asp Cys Leu 290 tct gag gag Ser Glu Glu ctt cgc Leu Arg 295 cac
His atg gat cca gat ttg ggc tac Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr
300
912 cag cac gca cta tcc ggc ttg tcc agc Gin His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser 305 310 gtc aag ctg gaa acc gtc taa Val Lys Leu Glu Thr Val
315
960
INFORMÁCIE 0 SEKVENCIÍ ID.C. 5:
(A) DĹŽKA: 319aminokyselín (B) TYP: proteín (C) ORGANIZMUS: Corynobacterium glutamicum
ATCC13032
Met 1 íle Phe GlU Leu 5 Pro Asp Thr Thr Thr 10 Gin Gin íle Ser Lys 15 Thr
Leu Thr Arg Leu 20 Arg Glu Ser Gly Thr 25 Gin Val Thr Thr Gly 30 Arg Val
Leu Thr Leu 35 íle Val Val Thr Asp 40 Ser Glu Ser Asp Val 45 Ala Ala Val
Thr Glu 50 Ser Thr Asn Glu Ala 55 Ser Arg Glu His Pro 60 Ser Arg Val íle
íle 65 Leu Val Val Gly Asp 70 Lys Thr Ala Glu Asn 75 Lys Val Asp Ala Glu 80
Val Arg íle Gly Gly 85 Asp Ala Gly Ala Ser 90 Glu Met íle íle Met 95 His
Leu Asn Gly Pro 100 Val Ala Asp Lys Leu 105 Gin Tyr Val Val Thr 110 Pro Leu
Leu Leu Pro 115 Asp Thr Pro íle Val 120 Ala Trp Trp Pro Gly 125 Glu Ser Pro
Lys Asn 130 Pro Ser Gin. Asp Pro 135 íle Gly Arg íle Ala 140 Gin Arg Arg íle
Thr 145 Asp Ala Leu Tyr Asp 150 Arg Asp Asp Ala Leu 155 Glu Asp Arg Val Glu 160
Asn Tyr His Pro Gly 165 Asp Thr Asp Met Thr 170 Trp Ala Arg Leu Thr 175 Gin
Trp Arg Gly Leu 180 Val Ala Ser Ser Leu 185 Asp His. Pro Pro His 190 Ser Glu
íle Thr Ser 195 Val Arg Leu Thr Gly 200 Ala Ser Gly Ser Thr 205 Ser Val Asp
Leu Ala 210 Ala Gly Trp Leu Ala 215 Arg Arg Leu Lys Val 220 Pro Val íle Arg
Glu 225 Val Thr Asp Ala Pro 230 Thr Val Pro Thr Asp 235 Glu Phe Gly Thr Pro 240
Leu Leu Ala íle Gin Arg Leu Glu íle Val Arg Thr Thr Gly Ser íle
245 250 255
íle íle Thr íle 260 Tyr Asp Ala His Thr 265 Leu Gin Val Glu Met 270 Pro Glu
Sér Gly Asn 275 Ala Pro Ser Leu Val 280 Ala íle Gly Arg Arg 285 Ser Glu Ser
Asp Cys 290 Leu Ser Glu Glu Leu 295 Arg His Met Asp Pro 300 Asp Leu Gly Tyr
Gin 305 His Ala Leu Ser Gly 310 Leu Ser Ser Val Lys Leu 315 Glu Thr Val
INFORMÁCIE O SEKVENCII ID.Č. 6:
(A) DĹŽKA: 3038 párov báz (B) TYP: deoxyribonukleová kyselina (vi) ORGANIZMUS: Corynobacterium glutämicum ASO19 (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) MENO/KĽÚČ: gén zwf
(B) POLOHA: 115 .. 1569
(A) MENO/K1ÚČ: gén opcA
(B) POLOHA: 1672 .. 2628
(xi) POPIS SEKVENCIE ID:Č:6
cctgaagtag aatcagcacg ctgcatcagt aacggcgaca tgaaatcgaa ttagttcgat 60 cttatgtggc cgttacacat ctttcattaa agaaaggatc gtgacactac catc gtg 117
Val
agc aca aac acg acc Thr ccc tcc age tgg aca Thr aac cca Asn Pro ctg Leu ege Arg 15 gac Asp ccg Pro 165
Ser Thr Asn Thr 5 Pro Ser Ser Trp 10
cag gat S 55 ega čtc ccc ege atc get ggc cct tcc ggc 'atg gtg atc 213
Gin Asp Lys Arg Leu Pro Arg íle Ala Gly Pro Ser Gly Met Val íle
20 25 30
ttc ggt gtc act ggc gac ttg get ega aag aag ctg ctc ccc gcc att 261
Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala íle
35 40 45
tat gat cta gca aac ege gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg gta 309
Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser •Leu Val
55 60 65
ggt tac ggc ege ege gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa Glu Lys tac gta 357
Gly Tyr Gly Arg Arg 70 Glu Trp Ser Lys Glu 15 Asp Phe Tyr 80 Val
ege gat gcc gca agt get ggt get cgt acg gaa ttc cgt gaa aat gtt 405
Arg Asp A.la Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn Val
85 90 95
tgg gag ege ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt ege ggc aac ttt gat 453
Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe Asp
100 105 110
gat gat Asp Asp gca get ttc gac Asp aac Asn 120 ctc get gca aca ctc aag ege atc gac 501
Ala Ala Phe Leu Ala Ala Thr Leu Lys 125 Arg íle Asp
115
aaa acc ege ggc acc gcc ggc aac tgg get tac tac ctg tcc att cca 549
Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser íle Pro
130 135 140 145
cca gat tcc ttc aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc atg 597
Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gin Leu Glu Arg Ser Gly Met
150 155 160
get Ala gaa Glu tcc acc gaa gaa Glu gca tgg ege ege gtg Val atc íle atc íle gag Glu 175 aag Lys cct Pro 645
Ser Thr 165 Glu Ala Trp Arg Arg 170
ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc aac 693
Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gin Leu Val Asn
180 185 190
gca gtc ttc cca gaa tet tet gtg ttc ege atc gac cac tat ttg ggc 741
Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg íle Asp His Tyr Leu Gly
195 200 205
aag gaa aca gtt caa aac atc ctg get ctg cgt ttt get aac cag ctg 789
Lys Glu Thr Val Gin Asn íle Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gin Leu
210 215 220 225
ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc acc 837
Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gin íle Thr
230 235 240
atg get gaa gat att íle ggc Gly ttg ggt Leu Gly gga cgt get ggt tac tac gac ggc Gly 885
Met Ala Glu Asp 245 Gly 250 Arg Ala Gly Tyr Tyr 255 Asp
atc ggc gca ccg ege gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc ttg 933
íle Gly Ala Pro Arg Asp val íle Gin Asn His Leu íle Gin Leu Leu
260 265 270
get ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg gca cgg 981
Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro íle Ser Phe Val Pro Ala Ala Arg
275 280 285
cag gca gaa aag atc aag Lys 295 gtg Val ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac cca 1029
Gin 290 Ala Glu Lys íle Leu Ser Ala Thr 300 Lys Pro Cys Tyr Pro 305
ttg gat aaa acc tcc get cgt ggt cag tac get gcc ggt tgg cag ggc 1077
Leu Asp Lys Thr Ser AJLa Arg Gly Gin Tyr Ala Ala Gly Trp Gin Gly
310 315 320
tct gag tta gtc aag gga ctt ege gaa gaa gat ggc ttc aac cct gag 1125
Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro Glu
325 330 335
tcc acc act gag Glu act Thr ttt gcg get tgt acc tta Thr Leu gag atc acg tct cgt Arg 1173
Ser Thr Thr 340 Phe Ala Ala 345 Cys Glu íle Thr 350 Ser
ege tgg get ggt gtg ccg ttc tac ctg ege acc ggt aag cgt ctt ggt 1221
Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu Gly
355 360 365
ege cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac cag 1269
Arg Arg Val Thr Glu íle Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His Gin
370 375 380 385
cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc gtg 1317
Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gin Asn Ala íle Val
390 395 400
att ege gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc ege ttc ggt tcc aag 1365
íle Arg Val Gin Pro Asp Glu Gly Val Leu íle Arg Phe Gly Ser Lys
405 410 415
gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc tcc 1413
Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe Ser
420 • 425 430
tac tca gaa tcc ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag ege ctc 1461
Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg Leu
435 440 445
att ttg gat gcg ctg Ala Leu tta gat gaa Leu Asp Glu 455 tcc agc ctc ttc Phe cct acc aac Pro Thr Asn gag Glu 465 1509
íle Leu 450 Asp Ser Ser Leu 460
gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca tgg 1557
Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys íle Leu Asp Pro ,Ile Leu Glu Ala Trp
470 475 480
gat gcc gat gga gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg tgg ggt cca 1605
Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu. Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly Pro
485 4 90 495
aag agc get gat gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc agg 16S3
Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg Arg
500 505 510
cca taa tttaggggca aa atg atc ttt gaa ctt ccg gat acc acc acc cag 1704 Pro Met íle Phe Glu Leu Pro Asp Thr Thr Thr Gin
515 520 525
caa att tcc aag acc cta . act - ega ctg cgt gaa tcg ggc acc cag gtc 1752
Gin íle Ser Lys Thr Leu 1 530 Thr . Arg Leu 535 Arg Glu Ser Gly Thr 540 Gin Val
acc acc ggc ega gtg ctc acc ctc atc gtg gtc ačt gac tcc gaa agc 1800
Thr Thr Gly Arg Val Leu 545 Thr Leu 550 íle Val Val Thr Asp 555 Ser Glu Ser
gat gtc get gca gtt acc gag tcc acc aat gaa gcc tcg cgc gag cac 1848
Asp Val 560 Ala Ala Val Thr Glu 565 Ser Thr. Asn Glu Ala 570 Ser Arg Glu His
cca tct cgc gtg atc att ttg gtg gtt ggc gat aaa act gca gaa aac 1896
Pro 575 Ser Arg Val íle íle 580 Leu Val Val Gly Asp 585 Lys Thr Ala Glu Asn 590
aaa gtt gac gca gaa gtc cgt atc ggt ggc gac get ggt get tcc gag 1944
Lys Val Asp Ala Glu Val 595 Arg íle Gly Gly 600 Asp Ala Gly Ala Ser 605 Glu
atg atc atc atg cat ctc aac gga cct gtc get gac aag ctc cag tat 1992
Met íle íle Met His Leu 610 Asn Gly Pro 615 Val Ala Asp Lys Leu 620 Gin Tyr
gtc gtc aca cca ctg ttg ctt cct gac acc ccc atc gtt get tgg tgg 2040
Val Val Thr Pro Leu Leu 625 Leu Pro 630 Asp Thr Pro íle Val 635 Ala Trp Trp
cca ggt gaa tca cca aag aat cct tcc cag gac cca att gga cgc atc 2088
Pro Gly 640 Glu Ser Pro Lys Asn 645 Pro Ser Gin Asp Pro 650 íle Gly Arg íle
gca caa ega cgc atc act gat get ttg tac gac cgt gat gac gca cta 2136
Ala 655 Gin Arg Arg íle Thr 660 Asp 1 Ala Leu Tyr Asp 665 Arg Asp ’ Asp Ala Leu 670
gaa Glu gat cgt gtt gag aac tat cac cca ggt gat acc gac atg acg tgg Trp 2184
Asp Arg Val Glu Asn Tyr 675 His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr
680 685
gcg cgc ctt acc cag tgg cgg gga ctt gtt gcc tcc tca ttg gat cac 2232
Ala Arg Leu Thr Gin Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His
690 695 700
cca cca cac agc gaa atc act tcc gtg agg ctg acc ggt gca agc ggc 2280
Pro Pro His Ser Glu íle Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly
705 710 715
agt acc tcg gtg gat ttg get gca ggc tgg ttg gcg cgg agg ctg aaa 2328
Ser Thr Ser Val Asp Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Lys
720 725 730
gtg cct gtg atc cgc gag gtg aca gat get ccc acc gtg cca acc gat 2376
Val Pro Val íle Arg Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp
735 740 745 750
gag ttt ggt act cca ctg ctg get atc cag cgc ctg gag atc gtt cgc 2424
Glu Phe Gly Thr Pro Leu Leu Ala íle Gin Arg Leu Glu Íle Val Arg
755 760 765
acc acc ggc tcg atc atc atc acc atc tat gac get cat acc ctt cag 2472
Thr Thr Gly Ser íle íle íle Thr íle Tyr Asp Ala His Thr Leu Gin
770 775 780
gta gag atg ccg gaa tcc ggc aat gcc cca tcg ctg gtg get att ggt 2520
Val Glu Met Pro Glu Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala íle Gly
785 790 795
cgt ega agt gag tcc gac tgc ttg tct gag gag ctt cgc cac atg gat 2568
Arg Arg Ser Glu Ser Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp
800 805 810
cca gat ttg ggc tac cag cac gca cta tcc ggc ttg tcc agc gtc aag 2616
Pro Asp Leu Gly Tyr Gin His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser -Val Lys
815 820 825 830
ctg gaa acc gtc taaggagaaa tacaacacta tggttgatgt agtacgcgca 2668 Leu Glu Thr Val cgcatactga agatttggtt gcacaggctg cctccaaatt cattgaggtt gttgaagcag 2728 caactgccaa taatggcacc gcacaggtag tgctcaccgg tggtggcgcc ggcatcaagt 2788 tgctggaaaa gctcagcgtt gatgcggctg accttgcctg ggatcgcatt catgtgttct 2848 tcggcgatga gcgcaatgtc cctgtcagtg attctgagtc caatgagggc caggctcgtg 2908 aggcactgtt gtccaaggtt tctatccctg aagccaacat tcacggatat ggtctcggcg 2968 acgtagatct tgcagaggca gcccgcgctt acgaagctgt gttggatgaa ttcgcaccaa 3028 acggctttga 3038
INFORMÁCIE O SEKVENCII ID.Č. 7:
(A) DĹŽKA: 514 aminokyselín (B) TYP: proteín (C) ORGANIZMUS: Corynobacterium glutamicum
AS019
Val 1 Ser Thr Asn Thr 5 Thr Pro Ser Ser Trp Thr 10, Asn Pro Leu Arg 15 Asp
Pro Gin Asp Lys 20 Arg Leu Pro Arg íle 25 Ala Gly Pro Ser Gly 30 Met Val
íle Phe Gly 35 Val Thr Gly Asp Leu 40 Ala Arg Lys Lys Leu 45 Leu Pro Ala
Íle Tyr 50 Asp Leu Ala Asn Arg 55 Gly Leu Leu Pro Pro 60 Gly Phe Ser Leu
Val 65 ,Gly Tyr Gly Arg Arg 70 Glu Trp Ser Lys Glu 75 Asp Phe Glu Lys Tyr 80
Val Arg Asp Ala Ala 65 Ser Ala Gly Ala Arg 90 Thr Glu Phe Arg Glu 95 Asn
Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe
100 105 110
Aáp Asp Asp 115 Ala Ala Phe Asp Asn 120 Leu Ala Ala Thr Leu 125 Lys Arg íle
Asp Lys 130 Thr Arg Gly Thr Ala 135 Gly Asn Trp Ala Tyr 140 Tyr Leu Ser íle
Pro 145 Pro Asp Ser Phe Thr 150 Ala Val Cys His Gin 155 Leu Glu Arg Ser Gly 160
Met Ala Glu Ser Thr 165 Glu Glu Ala Trp Arg 170 Arg Val íle íle Glu 175 Lys
Pro Phe Gly His 180 Asn Leu Glu Ser Ala 185 His Glu Leu Asn Gin 190 Leu Val
Asn Ala Val 195 Phe Pro Glu Ser Ser 200 Val Phe Arg íle Asp 205 His Tyr Leu
Gly Lys 210 Glu Thr Val Gin Asn 215 íle Leu Ala Leu Arg 220 Phe Ala Asn Gin
Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gin íle
225 230 235 240
Thr Met Ala Glu Asp íle Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp
245 250 255
Gly íle Gly Ala Pro Arg Asp Val íle Gin Asn His Leu. íle Gin Leu
260 265 270
Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro íle Ser Phe Val Pro Ala Ala
275 280 285
Arg Gin Ala Glu Lys íle Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr
290 295 300
Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gin Tyr Ala Ala Gly Trp Gin
305 310 315 320
Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro
325 330 335
Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu íle Thr Ser
340 345 350
Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu
355 360 365
Gly Arg Arg Val Thr Glu íle Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His
370 375 380
Gin Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gin Asn Ala íle
385 390 395 400
Val íle Arg Val Gin Pro Asp Glu Gly Val Leu íle Arg Phe Gly Ser
405 410 415
Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe
420 425 430
Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg
4.35 440 445
Leu íle Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn 450 455 460
Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys íle Leu Asp Pro íle Leu Glu Ala
465 470 475 480
Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly
485 490 495
Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg 500 505 510
Arg Pro
INFORMÁCIE 0 SEKVENCII ID.Č. 8:
(A) DĹŽKA: 319 aminokyselín (B) TYP: proteín (C) ORGANIZMUS: Corynobacterium glutamicum
AS019
Leu Thr Arg Leu Arg Glu Ser Gly Thr Gin Val Thr Thr Gly Arg Val 20 25 3o
Leu Thr Leu 35 íle Val Val Thr Asp 40 Ser Glu Ser Asp Val 45 Ala Ala Val
Thr Glu 50 Ser Thr Asn Glu Ala 55 Ser Arg Glu His Pro 60 Ser Arg Val íle
íle 65 Leu Val Val Gly Asp 70 Lys Thr Ala Glu Asn 7S Lys Val Asp Ala Glu 80
Val Arg íle Gly Gly 85 Asp Ala Gly Ala Ser 90 Glu Met íle íle Met 95 His
Leu Asn Gly Pro 100 Val Ala Asp Lys Leu 105 Gin Tyr Val Val Thr 110 Pro Leu
Leu Leu Pro 115 Asp Thr Pro íle Val 120 Ala Trp Trp Pro Gly 125 Glu Ser Pro
Lys Asn 130 Pro Ser Gin Asp Pro 135 íle Gly Arg íle Ala 140 Gin Arg Arg íle
Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu
145 150 155 160
Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gin 165 170 175
Trp Arg Gly Leu 180 Val Ala Ser Ser Leu 185 Asp Hiš Pro Pro His 190 Ser Glu
íle Thr Ser 195 Val Arg Leu Thr Gly 200 Ala Ser Gly Ser Thr 205 Ser Val Asp
Leu Ala 210 Ala Gly Trp Leu Ala 215 Arg Arg Leu Lys Val 220 Pro Val íle Arg
Glu 225 Val Thr Asp Ala Pro 230 Thr Val Pro Thr Asp 235 Glu Phe Gly Thr Pro 240
Leu Leu Ala íle Gin 245 Arg Leu Glu íle Val 2S0 Arg Thr Thr Gly Ser 255 íle
íle íle Thr íle 260 Tyr Asp Ala His Thr 265 Leu Gin Val Glu Met 270 Pro Glu
Ser Gly Asn 275 Ala Pro Ser Leu Val 280 Ala íle Gly Arg Arg 285 Ser Glu Ser
Asp Cys 290 Leu Ser Glu Glu Leu 295 Arg His Met Asp Pro 300 Asp Leu Gly Tyr
Gin His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val
305 310 315
INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ ID.Č. 9:
(A) DĹŽKA: 960 párov báz (B) TYP: DNA (C) ORGANIZMUS: Corynobac téri um glutamicum
AS019
atc íle act Thr tcc Ser 195 gtg agg Val Arg ctg Leu acc Thr ggt gca Gly Ala 200 agc Ser ggc Gly agt Ser acc Thr 205 tcg Ser gtg Val gat Asp 624
ttg get gca ggc tgg ttg gcg cgg agg ctg aaa gtg cct gtg atc ege 672
Leu Ala Ala Gly Trp Leu· Ala Arg Arg Leu Lys Val Pro Val íle Arg
210 215 220
gag gtg aca gat get ccc acc gtg cca acc gat gag ttt ggt act cca 720
Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro
225 230 235 240
ctg ctg get atc cag ege ctg gag atc gtt ege acc acc ggc tcg atc 768
Leu Leu Ala íle Gin Arg Leu Glu íle Val Arg Thr Thr Gly Ser íle
245 250 255
atc atc acc atc tat gac get cat acc ctt cag gta gag atg ccg gaa 816
íle íle Thr íle Tyr Asp Ala His Thr Leu Gin Val Glu Met Pro Glu
260 265 270
tcc ggc aat gcc cca tcg ctg gtg get att ggt cgt ega agt gag tcc 864
Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala íle Gly Arg Arg Ser Glu Ser
275 280 285
gac tgc ttg tct gag gag ctt ege cac atg gat cca gat ttg ggc tac 912
Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr
290 295 300
cag cac gca cta tcc ggc ttg tcc agc gtc aag ctg gaa acc gtc taa 960
Gin His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val
305 310 315
INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ ID.Č. 10:
(A) DĹŽKA: 319 aminokyselín (B) TYP: proteín (C) ORGANIZMUS: Corynobacterium glutamicum
AS019
Met íle Phe Glu Leu Pro Asp Thr Thr Thr Gin Gin íle Ser Lys Thr 15 10 15
Leu Thr Arg Leu Arg Glu Ser Gly Thr Gin Val Thr Thr Gly Arg Val 20 25 30
Leu Thr Leu íle Val Val Thr Asp Ser Glu Ser Asp Val Ala Ala Val 35 40 45
Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala Ser Arg Glu His Pro Ser Arg Val íle 50 55 60 íle Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu 65 70 75 80
Val Ara íle Gly Gly Asp Ala Gly Ala Ser Glu Met íle íle Met His 85 90 95
Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gin Tyr Val Val Thr Pro Leu 100 105 11°
Leu Leu Pro Asp Thr Pro Íle Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro 115 120 125
atc act tcc gtg agg ctg acc íle Thr Ser Val Arg Leu Thr 195 ggt gca agc ggc Gly Ala Ser Gly 200 agt acc tcg gtg Ser Thr Ser Val 205 gat Asp 624
ttg get gca ggc tgg ttg gcg cgg agg ctg aaa gtg cct gtg atc cgc 672
Leu Ala Ala Gly Trp Leu· Ala Arg Arg Leu Lys Val Pro Val íle Arg
210 215 220
gag gtg aca gat get ccc acc gtg cca acc gat gag ttt ggt act cca 720
Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro
225 230 235 240
ctg ctg get atc cag cgc ctg gag atc gtt cgc acc acc ggc tcg atc 768
Leu Leu Ala íle Gin Arg Leu Glu íle Val Arg Thr Thr Gly Ser íle
245 250 255
atc atc acc atc tat gac get cat acc ctt cag gta gag atg ccg gaa 816
íle íle Thr íle Tyr Asp Ala His Thr Leu Gin Val Glu Met Pro Glu
260 265 270
tcc ggc aat gcc cca tcg ctg gtg get att ggt cgt ega agt gag tcc 864
Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala íle Gly Arg Arg Sex Glu Ser
275 280 285
gac tgc ttg tct gag gag ctt cgc cac atg gat cca gat ttg ggc tac 912
Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp Pró ’ Asp Leu Gly Tyr
290 295 300
cag cac gca cta tcc ggc ttg tcc agc gtc aag ctg gaa acc gtc taa 960
Gin . His Ala Leu i Ser Gly • Leu i Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val
305 310 315
INFORMÁCIE 0 SEKVENCIÍ ID.C. 11:
(A) DĹŽKA: 15 aminokyselín
(B) TYP: proteín
(C) ORGANIZMUS: Corynobacterium glutamicum
ATCC13032
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Trp Xaa Asn 1 5 10
Pro Leu Arg Asp 15
INFORMÁCIE 0 SEKVENCIÍ ID.Č. 12:
(A) DĹŽKA: 514 aminokyselín (B) TYP: proteín (C) ORGANIZMUS: Corynobacterium glutamicum
ATCC13032
Met íle Phe Xaa Leu Pro Asp Xaa Xaa Xaa Gin Gin íle Ser Lys 1 5 10 15

Claims (14)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Polynukleotid izolovaný z koryneformných baktérii, ktorý obsahuje polynukleotidovú sekvenciu, vybranú zo skupiny tvorenej:
    a) polynukleotidmi, ktoré sú aspoň z 70 % identické s polynukleotidom kódujúcim peptid, ktorého aminokyselinová sekvencia je uvedená v Sekvencii id. č.: 3 alebo id.č.: 5 alebo id. č.: 8 alebo id. č.: 10.
    b) polynukleotidmi, kódujúcimi peptidy, ktoré obsahujú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň z 70 % identická so sekvenciou aminokyselín podľa Sekvencii id.č.: 3 alebo id.č.: 5 alebo id. č.: 8 alebo id. č.: 10.
    c) polynukleotidmi komplementárnymi k polynukleotidom podľa a) alebo b) a
    d)polynukleotidmi, obsahujúcimi aspoň 15 za sebou idúcich báz z polynukleotidovej sekvencie podľa bodov a), b) alebo c).
  2. 2. Polynukleotid podľa nároku 1, pričom vo výhodnom prevedení ide o rekombinantnú DNA, ktorá je schopná autonómnej replikácie v koryneformných baktériách a naviac obsahuje aspoň jednu z nukleotidových sekvencii génov tal, tkt, zwf a devB.
  3. 3. Polynukleotid podľa nároku 1, ktorý je tvorený RNA.
  4. 4. Polynukleotid podľa nároku 1, obsahujúce nukleotidovú sekvenciu podľa Sekvencie id.č.:4 alebo id.č.:9.
  5. 5. Autonómne sa replikujúcu DNA podľa nároku 2, ktorá obsahuje:
    i. jednu alebo viacej nukleotidových sekvencii vybranú zo skupiny tvorenej Sekvenciami id.č.:4, alebo id.č.: 9, alebo ii. aspoň jednu sekvenciu, ktorá odpovedá sekvencii podľa bodu (i) vzhľadom k degenerácii genetického kódu, alebo iii. aspoň jednu sekvenciu, ktorá hybridizuje so sekvenciami komplementárnymi so sekvenciou podľa bodu (i) alebo (ii), a poprípade iv. funkčne neutrálne mutácie v sekvencii podľa bodu (i) .
  6. 6. Polynukleotid podľa nároku 1, ktorý kóduje polypeptid, ktorého aminokyselinová sekvencia obsahuje aspoň jednu zo sekvencii uvedených v Sekvencii id.č.:3, id. č. 5, id.č. 8 a id.č. 10.
  7. 7. Koryneformný mikroorganizmus, zvlášť rodu Corynebacterium, ktorý je transformovaný vložením autonómne sa replikujúcej DNA podľa jedného z nárokov 1 alebo 5.
  8. 8. Spôsob fermentatívnej výroby L-aminokyselín vyznačujúci sa tým, že sa prevedú nasledujúce kroky:
    a) fermentujú sa koryneformné baktérie, ktoré produkujú
    L-aminokyselinu, a v ktorých je okrem zosilenia génu opcA výhodne zosilený aspoň gén zwf a poprípade ešte jeden z génov tkt alebo devB
    b) kultivačné médium alebo samotné baktérie sa obohatia o požadovaný produkt
    c) izoluje sa požadovaná L-aminokyselina.
  9. 9. Spôsob podľa nároku 8vyznačujúci sa tým, že okrem uvedených génov je zosilený ešte aspoň jeden ďalší gén z pentózafosfátového cyklu, výhodne zosilením expresie.
  10. 10. Spôsob podľa nárokov 8a 9., vyznačujúci sa t ý m , že zosilenie génu je dosiahnuté zvýšením počtu kópií génu na bunku transformáciou mikroorganizmu plazmidom, ktorý nesie tento gén.
  11. 11. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa t ý m , že sa k výrobe aminokyselín a zvlášť potom lyzínu použije baktérií, v ktorých je v priebehu fermentácie okrem génu opcA zosilený ešte jeden alebo viacej génov vybratých zo skupiny tvorenej:
    11.1 génom dapA, ktorý kóduje dihydrodipikolinát-syntázu,
    11.2 génom lysC, ktorý kóduje aspartát-kinázu rezistentnú k spätnoväzobnej regulácii,
    11.3 génom gap, ktorý kóduje glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu,
    11.4 génom pyc, ktorý kóduje pyruvát-karboxylázu
    11.5 génom tkt, ktorý kóduje transketolázu
    11.6 génom gnd, ktorý kóduje 6-fosfoglukonátdehydrogenázu,
    11.7 génom lysE, ktorý kóduje proteín podielajúci sa na exportulyzínu,
    11.8 génom zwal
    11.9 génom eno, ktorý kóduje enolázu
    11.10 génom tal, ktorý kóduje transaldolázu,
    11.11 vo výhodnom prevedení génom zwf.
  12. 12. Spôsob podlá nároku 8vyznačujúci sa tým, že sa výrobe aminokyselín a zvlášť potom lyzínu použije baktérií, v ktorých je v priebehu fermentácie okrem génu opcA. zoslabený ešte jeden alebo viacej génov vybraných zo skupiny tvorenej:
    12.1 génom pck, ktorý kóduje fosfopyruvát-karboxykinázu,
    12.2 génom pgi, ktorý kóduje glukóza-6-fosfát-izomerázu,
    12.3 génom poxB, ktorý kóduje pyruvát-oxidázu,
    12.4 génom zwa2
  13. 13. Použitie polynukleotidových sekvencii podlá nároku 1 ako primérov pre prípravu DNA génov, ktoré vykazujú efekt odpovedajúci génu opcA pomocou polymerázovej reťazovej reakcie.
  14. 14. Použitie polynukleotidových sekvencii podía nároku 1 ako hybridizačných sond.
SK301-2001A 1999-07-09 2000-07-05 Nucleotide sequences which code for the opca gene and a process for the fermentative preparation of l-amino acids SK3012001A3 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14291599P 1999-07-09 1999-07-09
US53126700A 2000-03-20 2000-03-20
PCT/EP2000/006300 WO2001004322A1 (en) 1999-07-09 2000-07-05 Nucleotide sequences which code for the opca gene

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK3012001A3 true SK3012001A3 (en) 2002-07-02

Family

ID=26840529

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK301-2001A SK3012001A3 (en) 1999-07-09 2000-07-05 Nucleotide sequences which code for the opca gene and a process for the fermentative preparation of l-amino acids

Country Status (17)

Country Link
US (2) US6825029B2 (sk)
EP (1) EP1109913B1 (sk)
JP (1) JP2003504065A (sk)
KR (1) KR100731525B1 (sk)
CN (1) CN100352926C (sk)
AT (1) ATE338131T1 (sk)
AU (1) AU772563B2 (sk)
BR (1) BR0006909A (sk)
CA (1) CA2348365A1 (sk)
DE (1) DE60030400T2 (sk)
DK (1) DK1109913T3 (sk)
HU (1) HUP0104068A3 (sk)
ID (1) ID29569A (sk)
MX (1) MX240992B (sk)
PL (1) PL206384B1 (sk)
SK (1) SK3012001A3 (sk)
WO (1) WO2001004322A1 (sk)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI9813021B1 (pt) * 1997-10-04 2016-04-05 Degussa processo para a preparação microbiana de aminoácidos de l-lisina, l-treonina, l-homosserina e glutamato, vetor, e célula transformada
US6822084B1 (en) * 1999-06-25 2004-11-23 Basf Aktiengesellschaft Corynebacterium glutamicum genes encoding stress, resistance and tolerance proteins
US7270984B1 (en) * 1999-06-25 2007-09-18 Basf Aktiengesellschaft Polynucleotides encoding a 6-phosphogluconolactonase polypeptide from corynebacterium glutamicum
US6797509B1 (en) * 1999-07-09 2004-09-28 Degussa-Huls Ag Nucleotide sequences which code for the tal gene
US20060014259A9 (en) * 1999-07-09 2006-01-19 Kevin Burke Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene
DE19947791A1 (de) * 1999-10-05 2001-04-12 Degussa Neue für das eno-Gen codierende Nukleotidsequenzen
US6713289B2 (en) 1999-10-05 2004-03-30 Degussa Ag Nucleotide sequences which code for the eno gene
BR0010817A (pt) * 2000-03-20 2002-03-05 Degussa Processo para a preparação fermentativa de l-aminoácidos com amplificação do gene gnd
US20050112733A1 (en) * 2000-03-20 2005-05-26 Degussa Ag Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene
ATE461997T1 (de) 2000-06-21 2010-04-15 Kyowa Hakko Bio Co Ltd Neuartige glukose-6-phosphat dehydrogenase
US20030017554A1 (en) * 2000-11-15 2003-01-23 Mechthild Rieping Process for the fermentative preparation of L-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family
DE10154180A1 (de) * 2001-11-05 2003-05-15 Basf Ag gene die für genetische Stabilitäts-, genexpressions-und Faltungsproteine codieren
DE10155505A1 (de) * 2001-11-13 2003-05-22 Basf Ag Gene die für Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Proteine codieren
DE10210527A1 (de) 2002-03-09 2003-09-18 Degussa Allele des aceA-Gens aus coryneformen Bakterien
US20070092951A1 (en) * 2005-03-24 2007-04-26 Degussa Ag Alleles of the zwf gene from coryneform bacteria
DE102005023829A1 (de) 2005-05-24 2006-11-30 Degussa Ag Allele des opcA-Gens aus coryneformen Bakterien
US8647642B2 (en) 2008-09-18 2014-02-11 Aviex Technologies, Llc Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment
CN102482649B (zh) * 2009-06-23 2014-09-03 江南大学 立体专一性羰基还原酶
CN104845923B (zh) * 2014-02-14 2018-03-23 中国科学院微生物研究所 生产l‑组氨酸的方法及其专用重组菌
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
BR112020018947B1 (pt) 2018-03-23 2023-05-02 Cj Cheiljedang Corporation Grânulos que compreendem l-aminoácido e método para preparar os mesmos
WO2020051420A1 (en) 2018-09-07 2020-03-12 Archer Daniels Midland Company Engineered strains of corynebacteria
CN116254242B (zh) * 2022-12-21 2024-01-30 江南大学 一种atp磷酸核苷转移酶突变体及产l-组氨酸的谷氨酸棒杆菌

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07121227B2 (ja) * 1986-10-17 1995-12-25 協和醗酵工業株式会社 Ｌ−グルタミン酸の製造法
JP3336162B2 (ja) * 1995-07-11 2002-10-21 株式会社リコー デジタル複写機のネットワークシステム
JPH09224661A (ja) * 1996-02-23 1997-09-02 Mitsubishi Chem Corp グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびそれをコードするｄｎａ
KR20070087093A (ko) 1999-06-25 2007-08-27 바스프 악티엔게젤샤프트 탄소 대사 및 에너지 생산과 관련된 단백질을 코딩하는코리네박테리움 글루타미쿰 유전자
US6962989B1 (en) * 1999-07-08 2005-11-08 Basf Aktiengesellschaft Corynebacterium glutamicum genes encoding novel proteins
JP4623825B2 (ja) 1999-12-16 2011-02-02 協和発酵バイオ株式会社 新規ポリヌクレオチド

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0104068A2 (hu) 2002-03-28
EP1109913B1 (en) 2006-08-30
CA2348365A1 (en) 2001-01-18
AU5982100A (en) 2001-01-30
US7504242B2 (en) 2009-03-17
PL206384B1 (pl) 2010-08-31
DE60030400D1 (de) 2006-10-12
KR20010086398A (ko) 2001-09-10
US6825029B2 (en) 2004-11-30
CN100352926C (zh) 2007-12-05
WO2001004322A9 (en) 2002-09-12
EP1109913A1 (en) 2001-06-27
AU772563B2 (en) 2004-04-29
CN1317049A (zh) 2001-10-10
MXPA01002410A (es) 2003-09-10
HUP0104068A3 (en) 2003-09-29
DK1109913T3 (da) 2007-01-02
ATE338131T1 (de) 2006-09-15
US20030138917A1 (en) 2003-07-24
US20050112730A1 (en) 2005-05-26
PL346563A1 (en) 2002-02-11
ID29569A (id) 2001-09-06
DE60030400T2 (de) 2007-09-13
JP2003504065A (ja) 2003-02-04
WO2001004322A1 (en) 2001-01-18
MX240992B (es) 2006-10-10
BR0006909A (pt) 2001-06-12
KR100731525B1 (ko) 2007-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8445241B2 (en) Process for the preparation of L-amino acids
US7504242B2 (en) Process for the fermentative production of amino acids using coryneform bacteria in which OpcA gene expression is amplified
US20040063180A1 (en) Nucleotide sequences which code for the zwa1 gene
US7759056B2 (en) Nucleotide sequence encoding the dapC gene and process for the production of L-lysine
SK16542001A3 (sk) Spôsob fermentačnej prípravy L-aminokyselín pomocou zosilnenia génu gnd
US6916636B2 (en) Nucleotide sequences which code for the oxyR gene
EP1287143B1 (en) Corynebacterium glutamicum nucleotide sequences coding for the glbo gene
SK362001A3 (en) Nucleotide sequences which code for the ptsh gene
US20020182689A1 (en) Nucleotide sequences which code for the luxS gene
SK17942000A3 (sk) Nukleotidové sekvencie kódujúce gén glk
SK17372000A3 (sk) Nukleotidové sekvencie kódujúce gén pfka
US6987015B1 (en) Nucleotide sequences encoding the pfkA gene
US6638753B2 (en) Nucleotide sequences which code for the cma gene
US20020155555A1 (en) Nucleotide sequences which code for the pgsA2 gene
SK17952000A3 (sk) Nukleotidové sekvencie kódujúce gén gpm a spôsob fermentatívnej výroby L-aminokyselín
EP1731613A2 (en) Nucleotide sequence for the zwf gene
ZA200101678B (en) Nucleotide sequences which code for the opcA gene.