JP2003504065A - Ｏｐｃａ遺伝子をコードするヌクレオチド配列 - Google Patents

Ｏｐｃａ遺伝子をコードするヌクレオチド配列

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ａ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.３またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.５またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.８またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１０のアミノ酸配列の少なくとも１つを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％の範囲で同一である、ポリヌクレオチド、ｂ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.３またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.５のアミノ酸配列あるいはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.８またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１０のアミノ酸配列と少なくとも７０％の範囲で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ｃ）ポリヌクレオチドａ）またはｂ）と相補的なポリヌクレオチド、またはｄ）ポリヌクレオチド配列ａ）、ｂ）またはｃ）の少なくとも１５の連続したヌクレオチドから成るポリヌクレオチドを含有するコリネバクテリウム グルタミカムから単離されたポリヌクレオチドに関し、さらに、すでにＬ−アミノ酸を製造するコリネフォルム微生物中でａ）ｏｐｃＡ遺伝子に加え、有利に少なくともｚｗｆ遺伝子および場合によりｔｋｔ遺伝子またはｄｅｖＢ遺伝子の１つ以上の遺伝子を増幅し、ｂ）培地中またはバクテリアの細胞で所望の生成物を濃度を高め、ｃ）所望のＬ−アミノ酸を単離することから成る、Ｌ−アミノ酸の発酵的産生方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、ｏｐｃＡ遺伝子をコードするヌクレオチド配列ならびにｏｐｃＡ遺
伝子を増幅させたコリネフォルムバクテリアを使用したアミノ酸、特にＬ−リジ
ンの発酵的生産に関する。
【０００２】 従来技術 アミノ酸、特にＬ−リジンは、ヒト医学および製薬工業、しかしながら特に動
物栄養学において使用される。
【０００３】 コリネフォルムバクテリア、特にコリネバクテリウム グルタミカム株を発酵
することによりアミノ酸が生産されることは公知である。これが極めて重要であ
るために、生産方法を改善するための努力が常になされている。方法の改善は、
発酵方法、例えば、撹拌および酸素の供給、または栄養培地の組成、例えば発酵
中の糖濃度、または、例えばイオン交換クロマトグラフィーによる生成物形態の
後処理、または微生物そのものの固有の生産特性に関するものであってもよい。
【０００４】 これら微生物の生産特性の改善のために、突然変異誘発法、選択法および突然
変異体選択法が使用される。この方法により、代謝拮抗物質、例えばリジンアナ
ログＳ−（２−アミノエチル）−システインに耐性の株または調節に重要な代謝
産物に対して栄養要求性でありかつリジンのようなアミノ酸を生産する株が得ら
れる。
【０００５】 生合成におけるペントースリン酸回路の重要性は公知である。
【０００６】 従って、OishiおよびAida（Agricultural and Biological Chemistry 29, 83
〜89（1965））は、ブレビバクテリウム アンモニアジーンズの“ヘキソースモ
ノホスフェート分路（shunt）”について報告している。SugimotoおよびShio（A
gricultural and Biological Chemistry 51, 101〜108（1987））は、ブレビバ
クテリウム フラバム中のグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼの調節につい
て報告している。SugimotoおよびShio（Agricultural and Biological Chemistr
y 51, 1257〜11263（1987））はブレビバクテリウム フラバム中のグルコース
６−リン酸デヒドロゲナーゼの調節について報告している。
【０００７】 ＪＰ−Ａ−０９２２４６６１は、ブレビバクテリウム フラバム ＭＪ−２２
３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）のグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝
子、すなわちｚｗｆのヌクレオチド配列を記載している。ＪＰ−Ａ−０９２２４
６６１は、ＺｗｆポリペプチドのＮ−末端アミノ酸配列
【０００８】
【外１】
【０００９】 を記載している。
【００１０】 しかし、これを確認することは不可能であった。
【００１１】 本発明の課題 本発明の課題は、アミノ酸、特にＬ−リジンの改良された新規発酵生産法を提
供することである。
【００１２】 本発明の詳細 アミノ酸、特にＬ−リジンは、ヒト医学および製薬工業、しかしながら特に動
物栄養学において使用される。従って、アミノ酸、特にＬ−リジンの改良された
新規生産法の提供に一般的な関心が集まっている。
【００１３】 以下にＬ−リジンまたはリジンと記載した場合、これは塩基だけでなくリジン
モノヒドロクロライドまたはリジンスルフェートのような塩をも意味する。
【００１４】 本発明は、 ａ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.３またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.５またはＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ.８またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１０のアミノ酸配列の少なくとも１つを含有
するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％の範囲で同
一である、ポリヌクレオチド、 ｂ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.３またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.５のアミノ酸配列または
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.８またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１０のアミノ酸配列と少なく
とも７０％の範囲で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド、 ｃ）ポリヌクレオチドａ）またはｂ）と相補的なポリヌクレオチド、または ｄ）ポリヌクレオチド配列ａ）、ｂ）またはｃ）の少なくとも１５の連続したヌ
クレオチドから成るポリヌクレオチド の群から選択される、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含有するコリネフォ
ルムバクテリアから単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１５】 本発明はまた、請求項１のポリヌクレオチドをも提供し、これは有利に複製可
能なＤＮＡであり、 （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.４、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.
６、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.９の群から選択される１つ以上のヌクレオチド配列、
（ｉｉ）遺伝子暗号の縮重の範囲内で、配列（ｉ）に相当する、少なくとも１つ
の配列、または （ｉｉｉ）配列（ｉ）または（ｉｉ）に相補的な配列とハイブリダイズする、少
なくとも１つの配列、および場合により （ｉｖ）（ｉ）の機能中立なセンス突然変異 を含有する。
【００１６】 本発明は、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.４またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.９のヌクレオチド配列を含む
、請求項４記載のヌクレオチド、 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.８また
はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１０のアミノ酸配列の少なくとも１つを含有するポリペ
プチドをコードする、請求項６記載のポリヌクレオチド、 請求項１記載のポリヌクレオチドを含むベクター、および 該ベクターを含有し、宿主細胞として機能するコリネフォルムバクテリアをも提
供する。
【００１７】 本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.４またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.９に相当す
るヌクレオチド配列を有する完全な遺伝子から成る相当の遺伝子ライブラリーを
、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.４またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.９またはその断片のような
前記のポリヌクレオチド配列を有するプローブでハイブリダイズし、前記ＤＮＡ
配列を単離する方法によりスクリーニングして得られるポリヌクレオチド配列を
実質的に含有する、ポリヌクレオチドを提供する。
【００１８】 本発明のポリヌクレオチド配列は、ＯｐｃＡタンパク質をコードするｃＤＮＡ
を全長で単離するため、ならびにｏｐｃＡ遺伝子の配列と非常に良く類似したこ
れらのｃＤＮＡおよび遺伝子を単離するための、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡ
のハイブリダイゼーションプローブとして好適である。
【００１９】 本発明のポリヌクレオチド配列はさらに、ＯｐｃＡタンパク質をコードする遺
伝子ＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって製造する際のプライ
マーとして好適である。
【００２０】 プローブまたはプライマーとして機能するこのようなオリゴヌクレオチドは、
少なくとも３０，有利には少なくとも２０，特に有利には少なくとも１５の連続
したヌクレオチドを有する。少なくとも４０または５０ヌクレオチド長さを有す
るオリゴヌクレオチドも好適である。
【００２１】 “単離”とはその本来の環境から分離されたことを意味する。
【００２２】 “ポリヌクレオチド”とは一般にポリリボヌクレオチドおよびポリデオキシリ
ボヌクレオチドに関し、これらは未修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであるか修飾ＲＮＡ
またはＤＮＡであってよい。
【００２３】 “ポリペプチド”はペプチドまたはペプチド結合を介して２つ以上のアミノ酸
が連結して含有されるタンパク質として認識される。
【００２４】 本発明のポリペプチドには、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.５
、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.８またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１０のポリペプチド、特に
ＯｐｃＡ遺伝子産物の生物学的活性を有するポリペプチドが含まれ、さらにまた
、本発明のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ.８またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１０のポリペプチドと少なくとも７０％の範囲
で同一であり、有利にはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.５、ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ.８またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１０のポリペプチドと少なくとも
８０％、特に有利には少なくとも９０〜９５％の範囲で同一でありかつ前記の活
性を有するポリペプチドも含まれる。
【００２５】 本発明はまた、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼのＺｗｆサブユニット
を形成する新規Ｚｗｆタンパク質を提供する。翻訳産物のアミノ酸配列をＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ.２およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.７に示す。グルコース６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼの、単離可能な、ＺｗｆサブユニットＮ−末端アミノ酸配列を、
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１１に示す。
【００２６】 本発明は、すでにアミノ酸を生産しかつｏｐｃＡ遺伝子をコードするヌクレオ
チド配列が場合によりｚｗｆ遺伝子といっしょに増幅、特に過剰発現されたコリ
ネ細菌を用いて、アミノ酸、特にＬ−リジンを発酵生産するための方法を提供す
る。
【００２７】 “増幅”の用語に関連しては、相当するＤＮＡでコードされる微生物の１つ以
上の酵素の細胞内活性を増加させることを意味し、例えば１つまたは複数の遺伝
子のコピー数を増加させるか、強いプロモーターを用いるか、あるいは高い活性
を有する相当の酵素（タンパク質）をコードする遺伝子を用いて、かつ場合によ
ってはこれらの方法を組み合わせることによって実施する。
【００２８】 本発明によって提供された微生物は、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リジンをグルコ
ース、ショ糖、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、セル
ロースからまたはグリセロールおよびエタノールから生産することができる。前
記微生物はコリネフォルムバクテリアの典型的なものであってよく、特にコリネ
バクテリウム属であってよい。コリネバクテリウム属の中でも特にコリネバクテ
リウムグルタミカム種が挙げられ、そのＬ−アミノ酸生産能力は当業者に公知で
ある。
【００２９】 コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウムグルタミカム種の好適な株は
次の公知の野生株： コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２ コリネバクテリウム アセトグルタミカム （Corynebacterium acetoglutamicum） ＡＴＣＣ１５８０６ コリネバクテリウム アセトアシドフィルム （Corynebacterium acetoacidphilum） ＡＴＣＣ１３８７０ コリネバクテリウム サーモアミノジーンズ （Corynebacterium thermoaminogenes） ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９ コリネバクテリウム メラッセコラ （Corynebacterium melassecola） ＡＴＣＣ１７９６５ ブレビバクテリウム フラバム （Brevibacterium flavum） ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム （Brevibacterium lactofermentum） ＡＴＣＣ１３８６９および ブレビバクテリウム ジバリカタム （Brevibacterium divaricatum） ＡＴＣＣ１４０２０ およびＬ−リジン生産突然変異株またはこれから製造された株、例えば： コリネバクテリウム グルタミカム ＦＥＲＭ−Ｐ １７０９ ブレビバクテリウム フラバム ＦＥＲＭ−Ｐ １７０８ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム ＦＥＲＭ−Ｐ １７１２ コリネバクテリウム グルタミカム ＦＥＲＭ−Ｐ ６４６３ コリネバクテリウム グルタミカム ＦＥＲＭ−Ｐ ６４６４および コリネバクテリウム グルタミカム ＤＳＭ ５７１５ コリネバクテリウム グルタミカム ＤＭ５８−１ コリネバクテリウム グルタミカム ＤＳＭ１２８６６ およびＬ−スレオニン生産突然変異株またはこれから製造された株、例えば： コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ２１６４９ ブレビバクテリウム フラバム ＢＢ６９ ブレビバクテリウム フラバム ＤＳＭ５３９９ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム ＦＥＲＭ−ＢＰ ２６９ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム ＴＢＢ−１０ およびＬ−イソロイシン生産突然変異株またはこれから製造された株、例えば： コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ １４３０９ コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ １４３１０ コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ １４３１１ コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ １５１６８ コリネバクテリウム アンモニアジーンズ ＡＴＣＣ ６８７１ およびＬ−トリプトファン生産突然変異株またはこれから製造された株、例えば
： コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ２１８５０および コリネバクテリウム グルタミカム ＫＹ９２１８（ｐＫＷ９９０１） である。
【００３０】 本発明は、酵素グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ２.７.１.１１
）のＯｐｃＡサブユニットをコードするコリネバクテリウム グルタミカムの新
規ｏｐｃＡ遺伝子の単離を成功させた。
【００３１】 ｏｐｃＡ遺伝子またはコリネバクテリウム グルタミクムの他の遺伝子を単離
するため、最初にこの微生物の遺伝子ライブラリーをＥ．ｃｏｌｉ中に構築する
。遺伝子ライブラリーの構築は、一般に公知の教科書および解説書中に記載され
ている。その例として、Winnacker等による教科書：Gene und Klone, Eine Einf
uehrung in die Gentechnologie（Gene and Clones, An Introduction to Genet
ic Engineering（Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990））またはSambrook
等の解説書：Molecular Cloning, a laboratory Manual（Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989）が挙げられる。良く知られた遺伝子ライブラリーはＥ
．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株Ｗ３１１０のものであり、これは、Kohara等によってλ
ベクター中に構築された（Cell 50, 495〜508（1987））。Bathe等はコリネバク
テリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子ライブラリーを記載して
おり（Molecular and General Genetics 252, 255〜265, 1996）、これはコスミ
ドベクターＳｕｐｅｒＣｏｓＩ（Wahl等, 1987, Proceedings of the National
Academy of Sciences USA 84, 2160〜2164）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２
株ＮＭ５５４（Raleigh等, 1988, Nucleic Acids Research 16, 1563〜1575）中
で構築された。同様にBoermann等（Molecular Microbiology 6(3), 317〜326）
は、コスミドｐＨＣ７９（HohnおよびCollins, Gene 11, 291〜298 (1980)）を
用いたコリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子ライブ
ラリーを記載している。O'donohue（The Cloning and Molecular Analysis of F
our Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genes from Corynebacterium g
lutamicum. ph. D. Thesis, National University of Ireland, Galway, 1997）
は、Shorts等の記載するλＺａｐ発現系（Nucleic Acids Research, 16：7583）
を使用したコリネバクテリウム グルタミカムのクローニングについて記載して
いる。Ｅ．ｃｏｌｉ中のコリネバクテリウム グルタミクムの遺伝子ライブラリ
ーは、また、ｐＢＲ３２２（Bolivar, Life sciences 25, 807〜818 (1979)）ま
たはｐＵＣ９（Viera et al., 1982, Gene 19, 259〜268）のようなプラスミド
を用いて構築されてもよい。制限による欠損および組み換えによる欠損を有する
Ｅ．cｏｌｉ株はホストとして特に好適である。この例はGrant等（Proceedings
of the national Academy of sciences USA 87 (1990) 4645〜4649）によって記
載されているＤＨ５αｍｃｒ株である。コスミドの助成によりクローン化された
長いＤＮＡフラグメントを、順にサブクローニングし、引き続きシークエンシン
グに適した市販のベクター中で例えばSanger等によって記載されたようにして塩
基配列を決定してよい（Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America 74, 5463〜5467, 1977）。
【００３２】 得られたＤＮＡ配列を、次いで、公知のアルゴリズムまたは配列分析プログラ
ム、例えばStadenのプログラム（Nucleicd Acids Research 14, 217〜232（1986
））、ButlerのＧＣＧプログラム（Methods of Biochemical Analysis 39, 74〜
97（1998））、PearsonおよびLipmanのＦＡＳＴＡアルゴリズム（Proceedings o
f the National Academy of Sciences USA 85, 2444〜2448（1988））またはAlt
schul等のＢＬＡＳＴアルゴリズム（Nature Genetics 6, 119〜129（1994））に
より調査されてもよく、公的にアクセス可能なデータバンクに登録された配列と
比較してもよい。公的にアクセスできるヌクレオチド配列データバンクは、例え
ばヨーロピアン・モレキュラーバイオロジー・ラボラトリー・データーベース（
European Molecular Biology Laboratory detabase (EMBL)., Heidelberg, Germ
any）またはナショナルセンター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメー
ション・データーベース（National Center for Biotechnology Information de
tabase (NCBI)., Bethesda, MD, USA）である。
【００３３】 本発明は、ｏｐｃＡ遺伝子をコードしかつ本発明のＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１お
よびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.４の構成要素である、コリネバクテリウム グルタミ
カムの新規ＤＮＡ配列を提供する。さらに、相当するタンパク質のアミノ酸配列
は、前記の方法により該ＤＮＡ配列から誘導される。得られたＯｐｃＡ遺伝子産
物のアミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.３およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.５に示
す。得られたＯｐｃＡ遺伝子産物のアミノ酸配列の分子量は、約３４.７キロダ
ルトンである。
【００３４】 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１は、ｚｗｆ遺伝子のコード領域も示す。得られたＺｗ
ｆ遺伝子産物のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.２に示す。得られたＺｗｆ
遺伝子産物のアミノ酸配列の分子量は、約５７.５キロダルトンである。
【００３５】 前記の方法で製造した遺伝子ライブラリーをさらに、ｚｗｆ遺伝子のような公
知の配列のヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせることにより詳細に調べ
てよい（ＪＰ−Ａ−０９２２４６６１）。ハイブリダイゼーションで陽性反応を
示すクローンのクローン化ＤＮＡの配列を分析すると、順に、一方で使用される
プローブの公知のヌクレオチド配列が明かになり、他方で隣接の新規ＤＮＡ配列
が明かとなる。
【００３６】 本発明はまた、ｏｐｃＡ遺伝子をコードしかつ本発明のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.
６およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.９の構成要素である、コリネバクテリウム グル
タミカムの新規ＤＮＡ配列に関する。さらに、相当するタンパク質のアミノ酸配
列は、前記の方法により本発明のＤＮＡから誘導される。得られたＯｐｃＡ遺伝
子産物のアミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.８およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１
０に示す。得られたＯｐｃＡ遺伝子産物のアミノ酸配列の分子量は約３４.７キ
ロダルトンである。
【００３７】 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６は、ｚｗｆ遺伝子のコード領域も示す。得られたＺｗ
ｆ遺伝子産物のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.７に示す。得られたＺｗｆ
遺伝子産物のアミノ酸配列の分子量は、約５７.５キロダルトンである。
【００３８】 ＯｐｃＡタンパク質およびＺｗｆタンパク質のアミノ酸配列を少なくとも部分
的に決定するための別の方法は、クロマトグラフ法によりグルコース６−リン酸
デヒドロゲナーゼ酵素タンパク質を均質になるまで精製することから成る。
【００３９】 タンパク質の精製および製造のための方法および解説は、例えばSchleiferお
よびWensink等の教科書：Practical Methods in Molecular Biology（Springer
Verlag, Berlin, Germany, 1981）、HarrisおよびAngalの解説書：Protein Puri
ficaton Methods：A Practical Approach（IRL Press, Oxford, UK, 1989）、Sc
opesの教科書：Protein Purification：Principles and Practice第３版（Sprin
ger Verlag, New York, USA, 1993）ならびに一般的に公知の教科書および解説
書に記載されている。精製したポリペプチドのＮ−末端アミノ酸配列を、Edman
等の記載するＮ−末端シークエンス法（Archives of Biochemistry 22, 475（19
49））により決定した。タンパク質のシークエンスのための方法および解説は、
例えばSmith：Protein Sequencing Protocols：Methods in Molecular Biology,
Vol. 64およびVol.112（Humana Press, Totowa, NJ, USA, 1996）およびKamp等
：Protein Structure analysis：Preparation, Characterization, and Microse
quencing（Springer Verlag, New York, NY, USA, 1997）に記載されている。
【００４０】 この方法により、酵素グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼが、各分子量約
３０ｋＤａおよび約６０ｋＤａの２個のサブユニットから成ることを示すことが
できる。ＯｐｃＡサブユニットおよびＯｐｃＡタンパク質のＮ−末端アミノ酸配
列を、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１２に示す。ＺｗｆサブユニットおよびＺｗｆタン
パク質のＮ−末端アミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１１に示す。
【００４１】 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.４、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６ま
たはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.９から遺伝子暗号の縮重によって得られるＤＮＡのコ
ード配列はもまた、本発明の構成要素である。同様に、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.４
またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.９あるいはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.４またはＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ.９の一部分とハイブリダイズするＤＮＡ配列も本発明の要素である。
保存されるアミノ酸置換、例えばタンパク質中のグリシンのアラニンへの置換ま
たはアスパラギン酸のグルタミン酸への置換は、当業者らに“センス突然変異”
として良く知られており、タンパク質活性を実質的には基本的に変化させない、
すなわち機能中立である。さらに、タンパク質のＮおよび／またはＣ末端の置換
は実質的な障害を生じさせないばかりか、その機能を安定化できることも知られ
ている。このような情報は、特にBen-Bassat等（Journal of Bacteriology 169:
751〜757（1987））、Ｏ'regan等（Gene, 77:237〜251（1989））、Sahin-Toth
等（Protein Sciences 3：240〜247（1994））、Hochuli等（Bio/Technology 6
：1321〜1325（1988））および公知の遺伝学および分子生物学の教科書中におい
て、専門家により明かにされている。相当の方法でＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.３、Ｓ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ.５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.８またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１０
から得られるアミノ酸配列もまた、本発明の構成要素である。
【００４２】 最後に、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.４またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.９から得られるプ
ライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により製造したＤＮＡ配
列は、本発明の構成要素である。このようなオリゴヌクレオチドは、通常少なく
とも１５個のヌクレオチド長さを有する。
【００４３】 ハイブリダイゼーションによりＤＮＡ配列を同定するための教示を、当業者は
、特にベーリンガー・マンハイム社（Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Ge
rmany, 1993）およびLiebl等（International Journal of Systematic Bacterio
logy (1991) 41: 255-260）の解説書“The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization”から見出すことができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を
用いてＤＮＡ配列を増幅することに関する教示を、当業者は、特にGaitの解説書
：Oligonukleotide synthesis：a practical approach（IRL Press, Oxford, UK
, 1984）およびNewton & Graham：ＰＣＲ（Spektrum Akademischer Verlag, Hei
delberg, Germany, 1994）中に見出すことができる。
【００４４】 発明者は、改良した方法において、ｏｐｃＡ遺伝子および場合によりｚｗｆ遺
伝子をいっしょに過剰発現させた後に、コリネフォルムバクテリアがアミノ酸、
特にＬ−リジンを生産することを見出した。
【００４５】 過剰発現を達成するために、相応する遺伝子のコピー数を増加させるか、ある
いは、構造遺伝子の上流のプロモーターおよび調節領域またはリボソーム結合部
位を変異させてもよい。構造遺伝子の上流に組み込まれた発現カセットは、同様
に作用する。誘導プロモーターを用いて一連のＬ−リジンの発酵生産における発
現を増加させることが可能である。同様に発現は、ｍ−ＲＮＡの寿命を延ばす方
法によって改善される。さらに、酵素活性は酵素タンパク質の分解を防ぐことに
よって増加する。遺伝子または遺伝子構造物は、プラスミド中で異なるコピー数
で存在してよく、または染色体中に組み込まれかつ増幅されていてよい。また、
問題の遺伝子の過剰発現を、培地の組成および培養方法を変更することによって
達成してよい。
【００４６】 これに関連する教示を、当業者は、すなわちMartin等（Bio/Technology 5, 13
7-146 (1987)）、Guerrero等（Gene 138, 35-41 (1994)）、TsuchiyaおよびMori
naga（Bio/Technology 6, 428-430 (1988)）、Eikmanns等（Gene 102, 93-98 (1
991)）、ヨーロッパ特許明細書ＥＰＳ０４７２８６９、米国特許第４６０１８９
３号明細書、SchwarzerおよびPuehler（Bio/Technology 9，84-87 (1991)）、Re
inscheid等（Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)）
、Labarre等（Journal of Basteriology 175, 1001-1007 (1993)）、特許出願
ＷＯ９６／１５２４６、Malumbre等（Gene 134, 15-24 (1993)）、特開平ＪＰ−
Ａ−１０−２２９８９１号公報、JensenおよびHammer（Biotechnology and Bioe
ngineering 58, 191-195 (1998)）、Makrides（Microbiological Reviews 60: 5
12-538 (1996)）および公知の遺伝子学および分子生物学の教科書中に見出すこ
とができる。
【００４７】 実施例において、本発明のｏｐｃＡ遺伝子をプラスミドの助成により過剰発現
させる。
【００４８】 好適なプラスミドはコリネフォルムバクテリア中で複製可能なものである。多
くの公知のプラスミドベクター、例えばｐＺ１（Menkel等, applied and Enviro
nmental Microbiology（1989）64：549〜554）、ｐＥＫＥｘ１（Eikmanns等, Ge
ne 102：93〜98（1991））またはｐＨＳ２−１（Sonnen等, Gene 107：69〜74（
1991））は、潜在プラスミドｐＨＭ１５１９、ｐＢＬ１またはｐＧＡ１を基礎と
する。他のプラスミドベクター、例えばｐＣＧ４（ＵＳ−Ａ ４４８９１６０）
、またはｐＮＧ２（Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 11
9-124 (1990)）、またはｐＡＧ１（ＵＳ−Ａ５１５８８９１）に基づくものを、
同様に使用することができる。
【００４９】 図２に示されるＥ.Ｃｏｌｉ−コリネフォルム グルタミカムシャトルベクタ
ーｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２を例として使用した。ｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２のＳｐ
ｈＩ／ＳａｌＩ切断部位領域へｏｐｃＡ遺伝子およびｚｗｆ遺伝子を組み込むこ
とにより、図３に示されるプラスミドｐＥＣｚｗｆｏｐｃＡが形成された。
【００５０】 他の適したプラスミドベクターは、染色体への組み込みにより遺伝子を増幅さ
せる方法のために補助的に使用するプラスミドベクターであり、例えばReinshei
d等（Applied and Environmental Microbiology 60, 126〜132 (1994) ）により
記載され、これはｈｏｍ−ｔｈｒＢオペロンの重複または増幅のためのものであ
る。この方法では、コリネバクテリウム グルタミクム中ではなくホスト（典型
的にはＥ．Ｃｏｌｉ）中で複製可能なプラスミドベクターにおいて、完全な遺伝
子がクローニングされる。考えられ得るベクターは、例えばｐＳＵＰ３０１（Si
mo等, Bio/Technology 1, 784〜791 (1983) ）、ｐＫ１８ｍｏｂまたはｐＫ１９
ｍｏｂ（Schaefer等, Gene 145, 69〜73 (1994) ）、ｐＧＥＭ−Ｔ（Promega co
rporation, Madison, WI, USA）、ｐＣＲ２.１−ＴＯＰＯ（Shuman (1994). Jou
rnal of Biological Chemisty 269: 32678〜84; US-A 5487993）、ｐＣＲ（Ｒ） Ｂｌｕｎｔ（Invitrogen, Groningen, Netherlands; Bernard et al., Journal
of Molecular Biology, 234: 534〜541 (1993)）、ｐＥＭ１（Schrumpf等,1991,
Journal of Bacteriology 173: 4510〜4516）またはｐＢＧＳ８（spratt等, 19
86, Gene, 41：337〜342）である。増幅されるべき遺伝子を含むプラスミドベク
ターを次いで、所望のコリネバクテリウム グルタミクム株中に接合または形質
転換によって移入する。接合法は、例えばSchaefer等（Applied and Environmen
tal Microbiology 60, 756〜759 (1994)）に記載されている。形質転換法は、例
えばTheirbach等（Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356〜362 (19
88)）、DunicanおよびShivinan(Bio/Technology 7, 1067〜1070 (1989))およびT
auch等（FEMS Microbiological Letters 123, 343〜347 (1994)）に記載されて
いる。“乗り換え”による均質な組み換えの後に、生じる株は本発明の遺伝子の
コピー少なくとも２個を有する。
【００５１】 さらに、アミノ酸、特にＬ−リジン産生のために、ｏｐｃＡ遺伝子に加えて解
糖、補充反応（anaplerosis）、ペントースリン酸回路またはアミノ酸排出に関
与する１つ以上の酵素を場合によりｚｗｆといっしょに増幅または過剰発現させ
るのが有利である。
【００５２】 Ｌ−リジン産生のために、例えば、次の群から選択された一つ以上の遺伝子を
同時に増幅、特に過剰発現させるのが有利である。
【００５３】 ・ジヒドロピコリン酸シンターゼをコードするｄａｐＡ遺伝子（ＥＰ−Ｂ０１９
７３３５）、 ・フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼをコードするｌｙｓＣ遺伝子（ka
linowski等（1990）、Molecular and General Genetics 224：317〜324）、 ・グリセロールアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするｇａｐ遺
伝子（Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076〜6086）、 ・ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするｐｙｃ遺伝子（ＤＥ−Ａ−１９８３
１６０９）、 ・トランスケトラーゼをコードするｔｋｔ遺伝子（European Molecular Biology
Laboratories（EMBL, Heidelberg, Germany）のデータバンクにＡＢ０２３３７
７として寄託される） ・６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードするｇｎｄ遺伝子（ＪＰ−Ａ
−９−２２４６６２） ・リジンの排出をコードするｌｙｓＥ遺伝子（ＤＥ−Ａ−１９５４８２２２） ・ｚｗａ１遺伝子（ＤＥ１９９５９３２８.０；ＤＳＭ１３１１５） ・エノラーゼをコードするｅｎｏ遺伝子（ＤＥ：１９９４１４７８.５） ・トランスアルドラーゼをコードするｔａｌ遺伝子（ＤＳＭ１３２６３）。
【００５４】 さらにアミノ酸、特にＬ−リジン産生のために、ｏｐｃＡ遺伝子および場合に
よりｚｗｆ遺伝子をいっしょに増幅すると共に、以下の遺伝子を同時に減衰させ
てもよい。
【００５５】 ・ホスホエノルピルビン酸カルボキシラーゼをコードするｐｃｋ遺伝子（ＤＥ１
９９５０４０９.１、ＤＳＭ１３０４７）および／または ・グリコース６−リン酸イソメラーゼをコードするｐｇｉ遺伝子（ＵＳ０９／３
９６４７８、ＤＳＭ１２９６９）、 ・ピルビン酸オキシダーゼをコードするｐｏｘＢ遺伝子（ＤＥ１９９５１９７５
.７；ＤＳＭ１３１１４）、または ・ｚｗａ２遺伝子（ＤＥ：１９９５９３２７.２；ＤＳＭ１３１１３）。
【００５６】 アミノ酸、特にＬ−リジンの生産に関し、ｏｐｃＡ遺伝子の過剰発現に加え、
さらに不所望な副反応を排除するのが有利である（Nakayama：“Breeding of Am
ino Acid Producing Micro-organisms”Overproduction of Microbial Products
, Krumphanzl, sikyta, Vanek（編集）, Academic Press, London, UK, 1982）
。
【００５７】 アミノ酸、特にＬ−リジンを生産する目的のために、本発明によって製造された
微生物を連続的または断続的に、回分法（バッチ培養）または半回分法（流加法
）または反復半回分法（反復流加法）を用いて培養してもよい。公知の培養方法
の概略は、Chmielによる教科書（Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bi
overfahrenstechnik （Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991））またはSto
rhasによる教科書(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen（Vieweg Verlag
, Braunschweig/Wiesbaden, 1994））に記載されている。
【００５８】 使用されるべき培地は、特別な株の要求を十分に満たすものでなければならな
い。種々の微生物のための培地はAmerican Society for Bacteriology（Washing
ton D.C., USA 1981）の“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅ
ｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”に記載されている。炭素源として、糖
および炭化水素、例えばグルコース、ショ糖、ラクトース、フルクトース、マル
トース、糖蜜、デンプンおよびセルロース、油および脂肪、例えば大豆油、ヒマ
ワリ油、落花生油およびココナッツ油、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリ
ン酸およびリノール酸、アルコール、例えばグリセロールおよびエタノール、か
つ有機酸、例えば酢酸を使用してよい。前記物質は別々にまたは混合物として使
用されてもよい。窒素源として、窒素含有有機化合物、例えばペプトン、イース
トエキストラクト、肉エキス、麦芽エキス、コーンスチープリカー、大豆ミール
および尿素または無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リ
ン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムを使用してよい。
窒素源は別々にまたは混合物として使用されてもよい。リン源として、リン酸、
リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相当するナトリウム含
有塩を使用してよい。培地は付加的に、増殖に必要な金属塩、例えば硫酸マグネ
シウムまたは硫酸鉄を含んでいなければならない。最後に、増殖に必須な物質、
例えばアミノ酸およびビタミンを前記物質に加えて使用できる。さらに好適な前
駆物質を培地に添加してよい。前記出発物質は単回分として培地に添加されるか
、あるいは培養中に適切な方法で供給されてもよい。
【００５９】 塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアまたは
アンモニア水、あるいは酸性化合物、例えばリン酸または硫酸を、培地のｐＨ調
整のために適切に使用してよい。消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステル
を使用して起泡を制御してよい。プラスミドの安定性を維持するために、選択的
作用を有する好適な物質、例えば抗生物質を培地に添加してよい。好気条件を維
持するために、酸素または酸素含有ガス混合物、例えば空気を培地に導入する。
培養温度は通常２０℃〜４５℃、有利に２５℃〜４０℃である。リジンが最大量
形成されるまで培養を継続する。このことは、通常１０〜１６０時間内で達成さ
れる。
【００６０】 Ｌ−アミノ酸の分析を、Spackma等の記載のようにして、陰イオン交換クロマ
トグラフィーおよび続くニンヒドリン誘導体化により実施してよい（Analytical
Chemistry, 30, (1958), 1190）。
【００６１】 以下の微生物はブタベスト条約に基づき、Deutsche Sammlung fuer Mikroorga
nismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ＝ドイツの微生物および培養細胞寄託所, B
raunschweig, Germany）に寄託されている。
【００６２】 ・コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣｚｗｆｏｐ
ｃＡをＤＳＭ１３２６４として寄託。
【００６３】 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１は新規ｄｅｖＢ遺伝子をも含有する。本発明の方法を
アミノ酸、とくにＬ−リジンの発酵的生産に利用する。
【００６４】 添付の配列： 以下の配列を配列プロトコールの形で添付した： 配列番号 詳細 １ コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２から単 離したＤＮＡ配列 ２ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１由来のＺｗｆタンパク質のアミノ酸配列 ３ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１由来のＯｐｃＡタンパク質のアミノ酸配 列 ４ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１から取得したＡＴＣＣ１３０３２のｏｐ ｃＡ遺伝子のＤＮＡ配列 ５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.４由来のＯｐｃＡタンパク質のアミノ酸配 列 ６ コリネバクテリウム グルタミカム ＡＳ０１９から単離したＤ ＮＡ配列 ７ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６由来のＺｗｆタンパク質のアミノ酸配列 ８ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６由来のＯｐｃＡタンパク質のアミノ酸配 列 ９ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６から取得したＡＳ０１９のｏｐｃＡ遺伝 子のＤＮＡ配列 １０ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.９由来のＯｐｃＡタンパク質のアミノ酸配 列 １１ ＡＴＣＣ１３０３２から単離可能なグルコース６−リン酸デヒド ロゲナーゼのＺｗｆタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列 １２ ＡＴＣＣ１３０３２から単離可能なグルコース６−リン酸デヒド ロゲナーゼのＯｐｃＡタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列。
【００６５】 実施例 以下の実施例により本発明を詳細に説明する。適用する分子生物学技術、例え
ばプラスミドＤＮＡの単離、制限酵素処理、ライゲーション、Escherichia coli
等の標準的な形質転換は（特に記載のないかぎり）Sambrook等の記載による（Mo
lecular cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laborato
ries, USA）。
【００６６】 例１ コリネバクテリウム グルタミカム ＡＳ０１９株の遺伝子ライブラリーの作
製 コリネバクテリウム グルタミカム ＡＳ０１９株のＤＮＡライブラリー（Yo
shihama等、Journal of Bacteriology 162, 591〜597（1985））を、λＺａｐＥ
ｘｐｒｅｓｓＴＭシステム（Short等,（1988）Nucleic Acids Research, 16：75
83〜7600）を使用してO'Donohueの記載（O'Donohue, M. （1997）The Cloning a
nd Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Ge
nes from Corynebacterium glutamicum. Ph. D. Thesis, National University
of Ireland Galway）に従い構築した。λＺａｐＥｘｐｒｅｓｓＴＭキットをStr
atagene社（Stratagene, 11011 North Torrey Pines Rd., La Jolla, Californi
a 92037）より購入し、説明書に従って使用した。ＡＳ０１９−ＤＮＡを制限酵
素Ｓａｕ３Ａで切断し、ＢａｍＨＩ処理しかつ脱リン酸化したλＺａｐＥｘｐｒ
ｅｓｓＴＭの側鎖に連結させた。
【００６７】 例２ ｏｐｃＡおよびｚｗｆ遺伝子のクローニングおよびシークエンス １．ｚｗｆプローブの作製 ｚｗｆ遺伝子を内包する放射線標識したオリゴヌクレオチドを、前記のＡＳ０
１９λＺａｐＥｘｐｒｅｓｓＴＭライブラリーの調査に使用する。オリゴヌクレ
オチドを、ｚｗｆ遺伝子を内包する変性ＰＣＲプライマーを使用して製造する。
ｚｗｆＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のために設計した変性ヌクレオチドプライマーは
以下のとおりである：
【００６８】
【外２】
【００６９】 得られたＰＣＲ産物の推定される大きさは約４８０ｂｐである。
【００７０】 ＰＣＲの至適条件を以下のように決定した： ３５サイクル ９４℃で１分 ６０℃で１分 ７２℃で３０秒 ２.５〜３.５ｍＭ ＭｇＣｌ２ １００〜１５０ｎｇ ＡＳ０１９ ゲノムＤＮＡ。
【００７１】 得られたＰＣＲ産物の塩基配列分析により、生成物がｚｗｆ遺伝子を内包する
ことが証明された。塩基配列分析を一般的なフォワードおよびリバースプライマ
ーおよびPharmacia Biotech社（St. Albans, Herts, UK）のＴ７シークエンシン
グキットを使用して実施した。
【００７２】 ２. クローニング ＡＳ０１９λＺａｐＥｘｐｒｅｓｓＴＭライブラリーのスクリーニングをλＺ
ａｐＥｘｐｒｅｓｓＴＭシステムのプロトコール（Stratagene, 11011 North To
rrey Pines Rd., La Jolla, California 92037）に従って実施した。単離された
クローンについて、次にサザンブロット分析を実施した。ＤＮＡのサザントラン
スファーを、SchleicherおよびSchuellのプロトコールマニュアルの記載に従い
、メンブレンとしてNytranＴＭ（“Nytran Modified Nylon-66 Membrane Filter
s”（March 1987）, SchleicherおよびSchuell, Dassel, Germany）を使用して
実施した。前記したものと同一のプライマーおよびＰＣＲ至適条件を適用して変
性した二本鎖ＤＮＡ断片を、α−３２Ｐ−ｄＣＴＰを用いAmersham Life Scienc
e（amersham Pharmacia Biotech UK Limited, Little Chalfont, Buckinghamshi
re, UK）社製のMultiprimeＴＭＤＮＡラベリングキットを使用して、その説明書
に従って放射線標識した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーショ
ンおよび洗浄条件はSchleicherおよびSchuellのプロトコールマニュアルの記載
のとおりであった。ＡｇＦａ Ｃｕｒｉｘ ＲＰＩＬフィルムを使用し、Sambro
ok等の解説書に概要された方法に従って、オートラジオグラフィーを実施した。
従って、いくつかのｚｗｆクローンが同定された。クローンのひとつからプラス
ミドＤＮＡを単離し、ｐＢＯＢ１０２（図１）と称して、次の分析のために選択
した。
【００７３】 ３. シークエンス Sanger等のサンガージデオキシチェーンターミネーション法（Proceedings of
the National Academy of Sciences USA 74, 5463〜5467（1977））を使用して
、ｐＢＯＢ１０２のクローン化された挿入部の塩基配列を決定した。Pharmacia
Biotech社（st. Albans, Herts, UK）のＴ７シークエンシングキットおよびα− ３５ Ｓ−ｄＣＴＰを使用して方法を実施した。ファルマシアのクローニングおよ
びシークエンシング説明マニュアル（Pharmacia Cloning and sequencing instr
uctions manual、“T7 seauencingTM Kit”,ref/ XY-010-00-19, Pharmacia Bio
tech, 1994）に従い、ＴＢＥバッファー中の６％−ポリアクリルアミド／尿素ゲ
ルで、５０ｍＡの一定の電流をかけてサンプルを３〜８時間電気泳動した。最初
の塩基配列分析は、Pharmacia社製の一般的なフォワードプライマーおよびＭ１
３リバースプライマーを使用して実施された：
【００７４】
【外３】
【００７５】 次いで、得られた全ｏｐｃＡ遺伝子を誘導できる配列から、内部プライマーを
設計した。内部プライマーは以下のとおりであった：
【００７６】
【外４】
【００７７】 得られた塩基配列を次にＤＮＡStrider Programme（Marck（1988）, Nucleic
Acids Research 16：1829〜1836）バージョン１.０でアップルマッキントッシュ
コンピューターを使用して分析した。このプログラムは、制限部位の使用、読み
取り枠分析およびコドン用法決定のような分析を可能にする。得られたＤＮＡ配
列とＥＭＢＬおよびジーンバンクデータベース中のＤＮＡ配列との間の調査をＢ
ＬＡＳＴプログラム（Altschul等（1997）Nucleic Acids Research, 25：3389〜
3402）を使用することにより実施した。ＤＮＡおよびタンパク質の配列をClusta
l VおよびClustal Wプログラム（HigginsおよびSharp, 1988, Gene 73：237〜24
4）を利用して整理した。
【００７８】 このようにして得られた配列をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.６に示す。得られたヌク
レオチド配列の分析により、ｏｐｃＡ遺伝子を表す９５７塩基対の読み取り枠が
明かとなった。これはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.８およびＳＥＱ ＩＤの.１０に示さ
れる３１９のアミノ酸から成るタンパク質をコードしている。５１４個のアミノ
酸から成るＺｗｆ−タンパク質のアミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.７に示
す。
【００７９】 例３ コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２からのゲノムコス
ミド遺伝子ライブラリーの作製 コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ １３０３２に由来する染色体
ＤＮＡを、Tauch等（1995, Plasmid 33：168〜179）の記載に従って単離し、制
限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Descr
iption Sau3AI, Code No. 27-0913-02）で部分的に切断した。ＤＮＡ断片をエビ
のアルカリホスファターゼ（Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, German
y, Product Description SAP, Code no.1758250）で脱リン酸化した。Stratagen
e社製のコスミドベクターＳｕｐｅｒＣｏｓ１（La Jolla, USA, Product Desvri
ption SuperCos1 Cosmid Vector Kit, Code no. 251301）（Wahl等（1987）Proc
eedings of National Academy of Science USA 84：2160〜2164）を制限酵素Ｘ
ｂａＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description XbaI,
Code no.27-0948-02）で切断し、同様にエビのアルカリホスファターゼで脱リ
ン酸化した。コスミドＤＮＡを次に制限酵素ＢａｍＨＩ（Amersharm Pharmacia,
Freiburg, Germany, Product Description BamHI, Code no. 27-0868-04）で切
断した。この方法で処理したコスミドＤＮＡを処理したＡＴＣＣ１３０３２ＤＮ
Ａと混合し、バッチをＴ４ＤＮＡ−ライゲース（Amersham Pharmacia, Freiburg
, Germany, Product Description T4-DNA-Ligase, Code no. 27-0870-04）で処
理した。ライゲーション混合物を次にGigapack II XL Packing Extracts（Strat
agene, La Jolla, USA, Product Description Gigapack II XL Packing Extract
, Code no.200217）を用いてファージ中にパッケージングした。Ｅ.ＣｏｌｉＮ
Ｍ５５４株（Raleigh等1988, Nucleic Acid Research 16：1563〜1575）を感染
させるために、細胞を１０ｍＭのＭｇＳＯ4中に入れ、ファージ懸濁液のアリコ
ートと混合した。コスミドライブラリーの感染および力価測定（titering）をSa
mbrook等の記載（1989, Molecular Cloning：A laboratory Mnual, Cold Spring
Harbor）に従って実施し、この際、細胞をアンピシリン１００μｇ／ｍｌ含有
ＬＢアガー（Lennox, 1995, Virology, １：１９０）上に播いた。３７℃で一晩
インキュベートした後、個々の組み換えクローンを選択した。
【００８０】 例４ ＡＴＣＣ１３０３２のｏｐｃＡおよびｚｗｆ遺伝子の単離およびシークエンス Qiaprep Spin Miniprep Kit（Product No.27106, Qiagen, Hilden, Germany）
を使用し、製造者説明書に従って各コロニーのコスミドＤＮＡを単離し、制限酵
素Ｓａｕ３ＡＩ（Ameersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Descript
ion Sau3AI, Product No. 27-0913-02）で部分的に切断した。ＤＮＡ断片をエビ
のアルカリホスファターゼ（Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, German
y, Product Description SAP, Product No. 1758250）で脱リン酸化した。ゲル
電気泳動による分離の後、１５００〜２０００ｂｐ範囲の大きさのコスミド断片
をQiaExII Gel Extraction Kit（Product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany
）を使用して単離した。シークエンスベクターｐＺｅｒｏ−１はInvitrogen（Gr
oningen, Holland, Product Description Zero Background Cloning Kit, Produ
ct No. K2500-01）制限酵素ＢａｍＨＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg, Germa
ny, Product Description BamHI, Product No. 27-0868-04）で切断された。シ
ークエンスベクターｐＺｅｒｏ−１へのコスミド断片のライゲーションをSambro
ok等の記載（1989, Molecular Cloning：A laboratory Manual, Cold spring Ha
rbor）に従って実施し、この際、ＤＮＡ混合物をＴ４ライゲース（Pharmacia Bi
otech, Freiburg, Germany）で一晩インキュベートした。このライゲーション混
合物を次いでＥ.ＣｏｌｉのＤＨ５αＭＣＲ株（Grant, 1990, Proceeding of th
e National Academy of Sciences U.S.A., 87：4645〜4649）へエレクトロポレ
ーション（Tauch等, 1994, FEMS Microbiol. Letters, 123：343〜7）し、５０
μｇ／ｍｌのゼオシン含有ＬＢアガー（Lennox, 1995, Virology, １：１９０）
上に播いた。組み換えクローンのプラスミド作製をBiorobot 9600（Product no.
900200, Qiagen, Hilden, Germany）を使用して行った。Zimmermann等（1990,
Nucleic Acids Research, 18：1067）の変法によるサンガーのジデオキシチェー
ンストッピング法（1977, Proceedings of the National Academy of Sciences
U.S.A, 74：5463〜5467）で配列を決定した。PE Applied Biosystemsの“RR dRh
odamin Terminator Cycle Sequencing Kit”（Product No. 403044, Weiterstad
t, Germany）を使用した。ゲル電気泳動による分離とシークエンス反応の分析を
“Rotiphoresis NF Acrylamide/Bisacriylamide”ゲル（２９：１）(Product No
. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany）中で、PE Applied Biosystems（Weiters
tadt, Germany）社製の“ABI Prism377”シークエンサーを用いて実施した。
【００８１】 得られた生の配列データをStaden program package（1986, Nucleic Acids Re
search, 14：217〜231）バージョン９７−０を用いて処理した。ｐＺｅｒｏ１誘
導体の個々の塩基配列を組み合わせて連続したコンティグとした。コンピュータ
によるコード範囲分析をＸＮＩＰプログラム（Staden, 1986, Nucleic Acids Re
search, 14：217〜231）で実施した。“National Center for Biotechnology In
formation”（ＮＣＢＩ, Bethesda, MD, USA）の非冗長データバンクと対照して
、更なる分析を“ＢＬＡＳＴサーチプログラム”（Altschul等, 1997, Nucleic
Acids Research, 25：3389〜3402）で実施した。
【００８２】 得られたヌクレオチド配列をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１に示す。ヌクレオチド配
列の分析により、ｏｐｃＡ遺伝子にあたる９５７塩基対のコード領域が明かにな
った。終始コドンを含むｏｐｃＡ遺伝子をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.４に示す。ｏｐ
ｃＡ遺伝子はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.３およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.５の３１９アミ
ノ酸のタンパク質をコードする。
【００８３】 例５ コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２のグルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼの精製およびＮ−末端シークエンス １.ＡＴＣＣ１３０３２株の培養 グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを精製するために、コリネバクテリ
ウム グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２をLabfors fermentation system（Inf
ors AG, Bottmingen, Switzerland）中で３０℃で最小培地上で有気的に増殖さ
せた。前培養物（Bacto （Ｒ） Brain Heart Infusion Medium, 脳心臓浸出物培
地, Difco Laboratories, Detroit, USA）を、３０℃で１５時間インキュベート
し、２.５ｌの最小培地中への接種に利用した。培地は以下の成分（リットルあ
たりの量）を含有した：（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２０ｇ；ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ；Ｋ ２ ＨＰＯ４ １ｇ；ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ ０.２５ｇ；ＣａＣｌ２ １０ｍｇ
；ビオチン ０.２ｍｇ；プロトカテキック酸（protocatechuic acid） ３０ｍ
ｇ；ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ １ｍｇ；ＭｎＳＯ４×Ｈ２Ｏ １ｍｇ；ＺｎＳＯ４ ×７Ｈ２Ｏ ０.１ｍｇ；ＣｕＳＯ４ ０.０２ｍｇ；ＮｉＣｌ２×６Ｈ２Ｏ ０
.００２ｍｇ；ＨＣｌ １.２ｇ；ポリプロピレングリコール ０.２ｇ；ｔｒｉ
ｔｒｉｐｌｅｘＩＩ ７５ｍｇおよびグルコース １００ｇ。発酵の間、水酸化
ナトリウムを連続的に添加してｐＨ−値が常に７.０となるようにした。細胞を
後の指数増殖期に回収した。Beckman（Fullerton, USA）のAvanti J-25遠心機お
よびＪＡ１０ローターを用いて６４００ｇで４℃で１５分遠心した後に、１０ｍ
ＭのＭｇＣｌ2を含有するｐＨ７.５の１００ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ中で洗浄し
、沈殿物を使用するまで−２０℃で貯蔵した。
【００８４】 ２. 酵素精製 細胞の破砕を崩壊系（Disintegrator S, BIOmatic, Rodgau-Hainhausen, Germ
any）中で実施した。細胞を予め、１００ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2、０.７５ｍＭ ＤＴＴおよびいくつかのプロテアーゼインヒビター（
complete ＴＭ, Roche, Mannheim, Germany）から成るｐＨ７.５のバッファー中
に再懸濁した。全懸濁液量に対する細胞の湿量の割合を、０.３に調節した。全
懸濁液体体積１００ｍｌに対して、直径が０.１〜０.２５ｍｍのガラスビーズ（
Fisher scientific, Duesseldorf, Germany）１００ｍｌを添加した後に、５０
００ｒｐｍで１２分間で細胞を破砕した。破砕中の温度の上昇を氷冷により防止
した。ガラスビーズの除去後、Beckmann（Fullerton, USA）のＬ８−７０Ｍ遠心
機およびＴｉ４５ローターを使用し、２３５０００ｇで４０℃で９０分間かけて
超遠心工程を実施した。この上清を、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
精製のための粗抽出物として使用した。全ての精製工程をBeckmann（Fullerton,
USA）のBiosys2000システムを使用して実施した。
【００８５】 粗抽出物をFractogel EMD DEAE-650(S)材料（Merck, Darmstandt）を含有する
ＸＫ５０／３０カラム（Pharmacia, Freiburg, Germany）へ適用した。吸着床の
総体積は５００ｍｌであった。カラムを予め３０ｍＭ ＭｇＣｌ２および０.７
５ｍＭ ＤＴＴを含有するｐＨ７.５の５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌで平衡化し
た。粗抽出物を適用した後に、１４４ｍＭ ＫＣｌを含有する同一のバッファー
でカラムを洗浄した。１４４ｍＭから３２０ｍＭまでの直線勾配をかけたＫＣｌ
により、９５分以内で溶離を実施した。流速は７.４ｍｌ／ｍｉｎであった。活
性分画を貯留し、Varifuge ３.０Ｒ遠心機（Heraeus, Hanau, Germany）を使用
し、centriprep （Ｒ） 30濃縮装置（Amicon, Beverly, USA）中で１５００ｇで
４℃で濃縮した。３０ｍＭ ＭｇＣｌ2および０.７５ｍＭ ＤＴＴを含有するｐ
Ｈ７.５の５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌで希釈することにより、ＫＣｌ濃度を４
０ｍＭに調節した。その後、部分的に精製されたグルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼを、６５ｍｌのRed-sepharose CL6B（Pharmacia, Freiburg, Germany
）で満たしたＸＫ２６／２０カラム（Pharmacia, Freiburg, Germany）へ適用し
た。３０ｍＭ ＭｇＣｌ２および０.７５ｍＭ ＤＴＴを含有するｐＨ７.５の５
０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌでカラムを平衡化した。０〜８００ｍＭの直線的な勾
配をかけたＫＣｌにより、流速０.８７ｍｌ／ｍｉｎで、５９０分以内で溶離を
実施した。
【００８６】 活性のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ分画を貯留した後、ＫＣｌ濃
度を前記と同様の方法で１０ｍＭに希釈した。その後、２’５’−ＡＤＰ−Seph
aroise matrix（Pharmacia, Freiburg, Germany）２０ｍｌで満たしたＸＫ１６
／２０カラム（Pharmacia, Freiburg, Germany）へ溶液を適用した。カラムをRe
d-Sepharose CL6Bカラムと同一のバッファーで平衡化した。０〜２ｍＭの直線的
な勾配をかけたＮＡＤＰにより溶離した。活性のグルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼ分画を貯留し、ゲル濾過カラムへ適用した。
【００８７】 ゲル濾過のために、直径１.６ｃｍでありかつ吸着床体積が１１４ｍｌであるS
uperdex Ｇ２００ｐｇカラム（Parmacia, Freiburg, Germany）を使用した。流
速１ｍｌ／ｍｉｎで、３０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２００ｍＭ ＫＣｌおよび０.７５
ｍＭ ＤＴＴを含有するｐＨ７.５の５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌを用いて溶離
を行った。活性分画を貯留し、centriprep （Ｒ） 30遠心装置（amicon, Beverl
y, USA）中で限外濾過により濃縮した。５０％（ｖ／ｖ）グリセロールを精製し
たグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ溶液に添加した後、これを−２０℃
で貯蔵した。
【００８８】 全精製工程で、グルコース−６−リン酸−デヒドロゲナーゼ活性およびタンパ
ク質濃度を測定した。
【００８９】 グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を測定するためのアッセイ系は
、５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ ｐＨ７.５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ
ＮＡＤＰおよび２００ｍＭ グルタミン酸カリウムを含有した。反応は、４ｍＭ
のグルコース−６−ホスフェートを添加することで開始され、次いでＮＡＤＰＨ
の形成を、３０℃における３４０ｎｍでの吸光度の増加を測定することにより確
認した。タンパク質濃度をクーマシーブリリアントブルー染色（Stoscheck, Met
hods in Enzymology 182, 50〜68（1990））した後に分光光度計で測定した。タ
ンパク質標準として、牛の血清アルブミンを使用した。全ての測定をＵＶ−１６
０ＡPhotometer（Shimadzu, Kyoto, Japan）を使用して実施した。
【００９０】 グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの純度をlaemmli（Laemmli, U.K.,N
ature 227, 680〜685（1970））の方法に従って、変性した不連続なＳＤＳ−ゲ
ル電気泳動により試験した。２’５’−ＡＤＰセファロースリガンドアフィニテ
ィー材料を用いた３回目の精製工程の後に、約６０ｋＤａと３０ｋＤａの分子量
を有する２つの異なるタンパク質を得た。これらの２つのタンパク質はゲル濾過
クロマトグラフィーでは分離できなかった。この生成物の特別な活性を測定した
ところ、タンパク質１ｍｇに対して２１３Ｕであった。
【００９１】 ３. Ｎ−末端シークエンス Procise （Ｒ） Protein Sequencing System（Biosystems, Foster City, US
A）を使用し、Edman（EdmanおよびBegg, European Journal of Biochemistry 1,
81〜91（1967））の方法に従って、精製したグルコール−６−リン酸デヒドロ
ゲナーゼのＮ−末端塩基配列を決定した。６０ｋＤａのタンパク質のＮ−末端配
列は以下のとおりであった：
【００９２】
【外５】
【００９３】 これはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１１にも示される。
【００９４】 ３０ｋＤａのタンパク質のＮ−末端配列は以下のとおりであった：
【００９５】
【外６】
【００９６】 これはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１２にも示される。
【００９７】 例６ ｚｗｆおよびｏｐｃＡ遺伝子のｐＧＥＭ Ｔ−ベクターへのクローニング ＰＣＲを利用してコリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２の
全ｚｗｆおよびｏｐｃＡ遺伝子を含有するＤＮＡ断片ならびにその周辺の上流お
よび下流域を増幅した。ＰＣＲ反応をＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１およびＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ.６から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施した。
ゲノムＤＮＡを、HeeryおよびDunican（Applied and Environmental Microbiolo
gy 59：791〜799（1993））の方法により、コリネバクテリウム グルタミカム
ＡＴＣＣ１３０３２から単離し、テンプレートとして使用した。使用したプラ
イマーは：
【００９８】
【外７】
【００９９】 であった。
【０１００】 ＰＣＲのパラメーターは以下のとおりであった： ３５サイクル ９５℃で３分 ９４℃で１分 ４７℃で１分 ７２℃で４５秒 ２.５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ＤＮＡテンプレート約１５０〜２００ｎｇ。
【０１０１】 Ｅ.ＣｏｌｉＪＭ１０９株（Yanisch-Perron等, Gene 33：103〜119（1985））
をホストとして利用し、得られたＰＣＲ産物を、Promega Corp.から購入した市
販のpGEM-Tベクター（pGEM-T easy Vector System 1, cat. no. A1360, Promega
UK, Southampton）へクローン化した。
【０１０２】 例７ シャトルベクターｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２の製造 Ｅ.Ｃｏｌｉ−コリネバクテリウムグルタミカムシャトルベクターｐＥＣ−Ｔ
１８ｍｏｂ２を従来の技術により構築した。
【０１０３】 ベクターはプラスミドｐＧＡ１の複製領域ｒｅｐを含有し、これは複製エフェ
クターｐｅｒ（ＵＳ−Ａ−５１５８８９１；Nesvera等, Journal of Bacteriolo
gy 179, 1525〜1532（1997））、プラスミドｐＡＧ１（ＵＳ−Ａ−５１５８８９
１；the national Center for Biotechnology Information（NCBI, Bethesda, M
D, USA）に登録番号１２１０００として遺伝子ライブラリーに登録）のテトラサ
イクリン耐性授与ｔｅｔＡ（Ｚ）遺伝子、プラスミドｐＭＢ１（Sutcliffe, Col
d Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77〜90（1979））の
複製領域ｏｒｉＶ、ｌａｃプロモーターおよびマルチクローニング部位（ｍｃｓ
）（Norrnader等, Gene 26, 101〜106（1983））を有するｌａｃＺα遺伝子断片
、およびプラスミドＲＰ４（Simon等,（1983）Bio/Technology 1：784〜791）の
ｍｏｂ領域を含んでいる。
【０１０４】 ベクター構築体でＥ.ＣｏｌｉＤＨ５α株（Hanahan：DNA Cloning, A practic
al approach. vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA）を形質転換し
た。５ｍｇ／ｌのテトラサイクリンを補足したＬＢアガー上に形質転換バッチを
播いて、プラスミドを有する細胞を選択した（Sambrook等：Molecular cloning
：a laboratory manulal 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, N.Y.）。プラスミドDNAをQIAgen社製のQIAprep Spin Miniprep
Kitを用いて形質転換体から単離し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ
で制限し、引き続きアガロースゲル電気泳動（０.８％）を行うことによって確
認した。
【０１０５】 プラスミドをｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２と名付け、図２に示す。これはEscheric
hia coli K-12株ＤＨ５α／ｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２としてDeutsche Sammlung f
uer Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ＝ドイツの微生物および培養
細胞寄託所, Braunschweig, Germany）にＤＳＭ１３２４４として寄託されてい
る。
【０１０６】 例８ コリネバクテリウム グルタミカム中でのグルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼの発現 次いでｚｗｆおよびｏｐｃＡ遺伝子を、ＳｐｈＩ／ＳａｌＩ断片上にこれらの
遺伝子を含有するｐＧＥＭＴ−ベクター（例６参照）から単離し、Ｅ.Ｃｏｌｉ
−コリネバクテリウムグルタミカムシャトルベクターｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２（
例７および図２参照）のｌａｃＺαＳｐｈＩ／ＳａｌＩ部位へクローン化した。
このシャトルベクターは、２個のＳｐｈＩ部位を有している。一つ目はｌａｃＺ
αのマルチクローニング部位中に存在し、二つ目はテトラサイクリン耐性を授与
する遺伝子の中に存在する。それ故、無傷のテトラサイクリン耐性遺伝子を有す
るクローンのみが増殖できるように、テトラサイクリン（Sigma-Aldrich, PO BO
x 2424, Wimborne, Dorset BH21 7YR, UK）（５ｍｇ／ｌ）を選択的圧力として
利用する。この新規構築体をｐＥＣｚｗｆｏｐｃＡと呼称する（図３）。Ｓａｃ
Ｉ（Boehringer Mannheim GmbH, Germany）を用いた制限酵素分析により、ｐＥ
ＣーＴ１８ｍｏｂ２のｌａｃｚα中に存在するｚｗｆ遺伝子およびｏｐｃＡ遺伝
子の位置が明かになり、すなわちｌａｃプロモーターの下流である。コリネバク
テリウム グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２（American Type Culture Collecti
on, Manasas, VA, USA）を該構築体で形質転換し、イソプロピル−チオガラクト
ピラノサイド（ＩＰＴＧ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ガラク
トピラノサイド（ＸＧＡＬ）およびテトラサイクリンをそれぞれ１ｍＭ、０.０
２％および５ｍｇ／ｌで含有するルリアアガー上で、電気的形質転換体（electr
ofransformant）を選択した。アガープレートを３０℃で４８時間インキュベー
トした。迅速なプラスミド作製を、O'GaraおよびDunican（Applied and Environ
mental Microbiology 61：4477〜4479（1995））の記載に従って実施し、Ｓａｃ
Ｉ制限酵素により、所望のクローンの存在を確認した。これらのクローンのひと
つをＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣｚｗｆｏｐｃＡと名付けた。
【０１０７】 例９ 増幅したｏｐｃＡ遺伝子によるアミノ酸プロデューサーの製造 Ｌ−リジン産生コリネバクテリウム グルタミカムＤＳＭ５７１５株はＥＰ−
Ｂ−０４３５１３２に記載され、Ｌ−スレオニン産生ブレビバクテリウム フラ
バムＤＳＭ５３９９株はＥＰ−Ｂ−０３８５９４０に記載される。いずれの株も
ブタベスト条約に従い、ブラウンシュバイク（Germany）に所在するDeutsche Sa
mmlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen（ドイツの微生物および培養細
胞寄託所）に寄託されている。
【０１０８】 ＤＳＭ５７１５およびＤＳＭ５３９９株を、Liebl等のエレクトロポレーショ
ン方法（FEMS Microbiology Letters, 53：299〜303（1989））によりプラスミ
ドｐＥＣｚｗｆｏｐｃＡ（例８）で形質転換した。１８.５ｇ／ｌ 脳−心臓浸
出物ブイヨン、０.５Ｍ ソルビトール、５ｇ／ｌ バクト−トリプトン、２.５
ｇ／ｌ バクト−イーストエキストラクト、５ｇ／ｌ ＮａＣｌおよび１８ｇ／
ｌ バクトアガーを有しかつ５ｍｇ／ｌ テトラサイクリンで補足されたＬＢＨ
ＩＳアガー上で形質転換体を選択した。３３℃で２日間インキュベートした。
【０１０９】 この方法で得られた株をＤＳＭ５７１５／ｐＥＣｚｗｆｏｐｃＡおよびＤＳＭ
５３９９／ｐＥＣｚｗｆｏｐｃＡと呼称した。
【０１１０】 例１０ Ｌ−スレオニンの製造 例９で得られたコリネバクテリウム グルタミカムＤＳＭ５３９９／ｐＥＣｚ
ｗｆｏｐｃＡ株を、スレオニンの生産に好適な栄養培地中で培養し、培養上清中
のスレオニン濃度を測定した。
【０１１１】 このために、株を最初に相当の抗生物質を含有するアガープレート（テトラサ
イクリン（５ｍｇ／ｌ）を有する脳−心臓アガー）上で、３３℃で２４時間イン
キュベートした。このアガープレート培養から出発して、前培養を行った（１０
０ｍｌのコニカルフラスコ中に１０ｍｌの培地）。完全培地ＣｇＩＩＩを前培養
用の培地として使用した。
【０１１２】 培地ＣｇＩＩＩ： ＮａＣｌ ２.５ｇ／ｌ バクト−ペプトン １０ｇ／ｌ バクト−イーストエキストラクト １０ｇ／ｌ グルコース（別にしてオートクレーブ） ２％（ｗ／ｖ） ｐＨを７.４にした。
【０１１３】 テトラサイクリン（５ｍｇ／ｌ）をこれに添加した。振とう装置上で、２４０
ｒｐｍで、３３℃で、１６時間前培養物をインキュベートした。この前培養物か
ら出発して主培養を行い、これにより主培養の初期ＯＤ（６６０ｎｍ）は０.１
であった。主培養には、培地ＭＭを使用した。
【０１１４】 培地ＭＭ： ＣＳＬ（コーンスチープリカー） ５ｇ／ｌ ＭＯＰＳ（モルホリノプロパンスルホン酸） ２０ｇ／ｌ グルコース（別にしてオートクレーブ） ５０ｇ／ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４ ２５ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４ ０.１ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １.０ｇ／ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ ５.０ｍｇ／ｌ ビオチン（濾過滅菌） ０.３ｍｇ／ｌ チアミン・ＨＣｌ（濾過滅菌） ０.２ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシン（濾過滅菌） ０.１ｍｇ／ｌ ＣａＣＯ３ ２５ｇ／ｌ ＣＳＬ、ＭＯＰＳおよび塩溶液をアンモニア水でｐＨ７とし、オートクレーブ
にかけた。滅菌物質およびビタミン溶液を次いで添加し、オートクレーブしたＣ
ａＣＯ３を同様に乾燥状態で添加した。
【０１１５】 １００ｍｌのバッフルを備えたコニカルフラスコ中に１０ｍｌの体積で培養を
実施した。テトラサイクリン（５ｍｇ／ｍｌ）を添加した。大気湿度８０％で、
３３℃で培養した。
【０１１６】 ７２時間後、Biomek 1000（Beckmann Instruments GmbH, Munich）を用いて測
定波長６６０ｎｍでＯＤを測定した。形成されるスレオニンの量を、Eppendorf
BioTronik（Hamburg, Germany）社製のアミノ酸分析装置を使用して、イオン交
換クロマトグラフィーおよびニンヒドリン検出を含むポストカラム誘導体化反応
（post-column derivatisation）により測定した。
【０１１７】 実験結果を表１に示す。
【０１１８】
【表１】
【０１１９】 例１１ Ｌ−リジンの製造 例９で得られたコリネバクテリウム グルタミカムＤＳＭ５７１５／ｐＥＣｚ
ｗｆｏｐｃＡ株を、リジンの産生に好適な栄養培地中で培養し、培養上清のリジ
ン含量を測定した。
【０１２０】 このために、株を最初に相当の抗生物質を含有するアガープレート（テトラサ
イクリン（５ｍｇ／ｌ）を有する脳−心臓アガー）上で、３３℃で２４時間イン
キュベートした。このアガープレート培養から出発して、前培養を行った（１０
０ｍｌのコニカルフラスコ中に１０ｍｌの培地）。完全培地ＣｇＩＩＩを前培養
用の培地として使用した。
【０１２１】 培地ＣｇＩＩＩ： ＮａＣｌ ２.５ｇ／ｌ バクト−ペプトン １０ｇ／ｌ バクト−イーストエキストラクト １０ｇ／ｌ グルコース（別にしてオートクレーブ） ２％（ｗ／ｖ） ｐＨを７.４にした。
【０１２２】 テトラサイクリン（５ｍｇ／ｌ）をこれに添加した。振とう装置上で、２４０
ｒｐｍで、３３℃で、１６時間前培養物をインキュベートした。この前培養物か
ら出発して主培養を行い、これにより主培養の初期ＯＤ（６６０ｎｍ）は０.１
であった。主培養には、培地ＭＭを使用した。
【０１２３】 培地ＭＭ： ＣＳＬ（コーンスチープリカー） ５ｇ／ｌ ＭＯＰＳ（モルホリノプロパンスルホン酸） ２０ｇ／ｌ グルコース（別にしてオートクレーブ） ５８ｇ／ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４ ２５ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４ ０.１ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １.０ｇ／ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ ５.０ｍｇ／ｌ ビオチン（濾過滅菌） ０.３ｍｇ／ｌ チアミン・ＨＣｌ（濾過滅菌） ０.２ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシン（濾過滅菌） ０.１ｍｇ／ｌ ＣａＣＯ３ ２５ｇ／ｌ ＣＳＬ、ＭＯＰＳおよび塩溶液をアンモニア水でｐＨ７とし、オートクレーブ
にかけた。滅菌物質およびビタミン溶液を次いで添加し、オートクレーブしたＣ
ａＣＯ３を同様に乾燥状態で添加した。
【０１２４】 １００ｍｌのバッフルを備えたコニカルフラスコ中に１０ｍｌの体積で培養を
実施した。テトラサイクリン（５ｍｇ／ｍｌ）を添加した。大気湿度８０％で、
３３℃で培養した。
【０１２５】 ７２時間後、Biomek 1000（Beckmann Instruments GmbH, Munich）を用いて測
定波長６６０ｎｍでＯＤを測定した。形成されるリジンの量を、Eppendorf Biot
ronik（Hamburg, Germany）社製のアミノ酸分析装置を使用して、イオン交換ク
ロマトグラフィーおよびニンヒドリン検出を含むポストカラム誘導体化反応（po
st-column derivatisation）により測定した。
【０１２６】 実験結果を表２に示す。
【０１２７】
【表２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 プラスミドｐＢＯＢ１０２の地図である。
【図２】 プラスミドｐＥＣ−Ｔ１８ｍｏｂ２の地図である。
【図３】 プラスミドｐＥＣｚｗｆｏｐｃＡの地図である。
【符号の説明】
図１において： Ｎｅｏ ｒ ネオマイシン／カナマイシン耐性 ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ プラスミドＣｏｌＥ１の複製起点 ＣＭＶ サイトメガロウイルスプロモーター ｌａｃＰ ｌａｃオペロンのプロモーター ｌａｃＺ β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺａ遺伝子断片）の５’−
末端 ＳＶ４０ ３’ｓｐｌｉｃｅ シミアンウイルス４０の３’スプライス部位 ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ シミアンウイルス４０のポリアデニル化部位 ｆ１（-）ｏｒｉ 線状ファージｆ１の複製起点 ＳＶ４０ｏｒｉ シミアンウイルス４０の複製起点 図２および３において： Ｔｅｔ テトラサイクリン耐性遺伝子 ｏｒｉＶ Ｅ.Ｃｏｌｉのプラスミド−コードされた複製起点 ＲＰ４ｍｏｂ プラスミド流動のためのｍｏｂ領域 ｒｅｐ コリネバクテリウム グルタミカム プラスミド ｐＧＡ１由来の
プラスミド−コードされた複製起点 ｐｅｒ ＰＧＡ１由来のコピー数を制御する遺伝子 ｌａｃＺ−ａｌｐｈａ β−ガラクトシダーゼ遺伝子のｌａｃＺα遺伝子断
片（Ｎ−末端） ｌａｃＺａｌｐｈａ’ ｌａｃｚα遺伝子断片の５’−末端 ’ｌａｃＺａｌｐｈａ ｌａｃｚα遺伝子断片の３’−末端 ｚｗｆ ｚｗｆ遺伝子 ｏｐｃＡ ｏｐｃＡ遺伝子 その他の略号： ＡｐａＩ 制限酵素ＡｐａＩの切断部位 ＢａｍＨＩ 制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位 ＣｌａＩ 制限酵素ＣｌａＩの切断部位 ＥｃｏＲＩ 制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位 ＨｉｎｄＩＩＩ 制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの切断部位 ＭｓｔＩＩ 制限酵素ＭｓｔＩＩの切断部位 ＮｈｅＩ 制限酵素ＮｈｅＩの切断部位 ＮｓｉＩ 制限酵素ＮｓｉＩの切断部位 ＳａｃＩ 制限酵素ＳａｃＩの切断部位 ＳａｌＩ 制限酵素ＳａｌＩの切断部位 ＳｐｅＩ 制限酵素ＳｐｅＩの切断部位 ＳｐｈＩ 制限酵素ＳｐｈＩの切断部位 ＳｓｐＩ 制限酵素ＳｓｐＩの切断部位 ＸｂａＩ 制限酵素ＸｂａＩの切断部位
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:15） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＲ，Ｃ Ａ，ＣＮ，ＨＵ，ＩＤ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＰＬ，ＲＵ ，ＳＫ，ＵＡ，ＺＡ (72)発明者 エル キーラン ダニカン アイルランド国 カウンティ ゴールウェ イ ゴールウェイ ブッシー パーク オ ーランズウェル ロード （番地なし) (72)発明者 アシュリング マコーマック アイルランド国 カウンティ ウェストミ ース アスロン モート ロード （番地 なし) (72)発明者 クリオナ ステイプルトン アイルランド国 カウンティ ティッパラ リー ロスクレア レイルウェイ ヴュー 27 (72)発明者 ケヴィン バーク アイルランド国 カウンティ ゴールウェ イ ゴールウェイ ニューキャッスル グ リーンフィールズ ロード ５ (72)発明者 ベルント モーリッツ ドイツ連邦共和国 ボーフム シャットバ ッハシュトラーセ １ (72)発明者 ローター エッゲリング ドイツ連邦共和国 ユーリッヒ エルゼン カンプ ６ (72)発明者 ヘルマン ザーム ドイツ連邦共和国 ユーリッヒ ヴェンデ リヌスシュトラーセ 71 (72)発明者 ベッティーナ メッケル ドイツ連邦共和国 デュッセルドルフ ベ ンローデシュトラーセ 35 (72)発明者 アンケ ヴァイセンボルン ドイツ連邦共和国 テュービンゲン ツィ ラーシュトラーセ １ Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA72 CA04 CA11 DA10 EA04 GA11 4B063 QA01 QQ44 QQ52 QR32 QR55 QS34 4B064 AE25 CA02 CA19 CC24 DA16 4B065 AA24X AA24Y AB01 AC14 BA02 CA17 CA41 CA44

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ａ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.３またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.５ま
    たはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.８またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１０のアミノ酸配列の少
    なくとも１つを含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくと
    も７０％の範囲で同一である、ポリヌクレオチド、 ｂ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.３またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.５のアミノ酸配列あるい
    はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.８またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１０のアミノ酸配列と少な
    くとも７０％の範囲で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
    るポリヌクレオチド、 ｃ）ポリヌクレオチドａ）またはｂ）と相補的なポリヌクレオチド、または ｄ）ポリヌクレオチド配列ａ）、ｂ）またはｃ）の少なくとも１５の連続したヌ
    クレオチドから成るポリヌクレオチド の群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を有する、コリネフ
    ォルムバクテリアから単離されたポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドが、有利にコリネフォルムバクテリア中で
    複製可能な組み換えＤＮＡであり、付加的に、ｔａｌ、ｔｋｔ、ｚｗｆおよびｄ
    ｅｖＢ遺伝子をコードするヌクレオチド配列を少なくとも１つ含有する、請求項
    １記載のポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１記載のポリヌク
    レオチド。
  4. 【請求項４】 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.４またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.９のヌク
    レオチド配列を有する、請求項１記載のポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 （ｉ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.４またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.９
    で示される１つ以上のヌクレオチド配列、 （ｉｉ）遺伝暗号の縮重の範囲内で、配列（ｉ）に相当する、少なくとも１つの
    配列、または （ｉｉｉ）配列（ｉ）または（ｉｉ）と相補的な配列とハイブリダイズする、少
    なくとも１つの配列、および場合により （ｉｖ）（ｉ）の機能中立なセンス突然変異 を含む、複製可能な請求項２記載のＤＮＡ。
  6. 【請求項６】 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.３，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ.５、ＳＥＱ
    ＩＤ Ｎｏ.８およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ.１０のアミノ酸配列の少なくとも１つ
    を含有するポリペプチドをコードする、請求項１記載のポリヌクレオチド。
  7. 【請求項７】 請求項１から５までのいずれか１項記載の複製可能なＤＮＡ
    を導入することにより形質転換させた、特にコリネバクテリウム属のコリネフォ
    ルム微生物。
  8. 【請求項８】 以下の工程、 ａ）ｏｐｃＡ遺伝子に加え、有利に少なくともｚｗｆ遺伝子および場合によりｔ
    ｋｔ遺伝子またはｄｅｖＢ遺伝子の１つ以上の遺伝子が増幅された、所望のＬ−
    アミノ酸を製造するバクテリアの発酵、 ｂ）培地中またはバクテリアの細胞および濃縮したバクテリアの細胞中での所望
    の生成物の濃縮、 ｃ）所望のＬ−アミノ酸の単離 を実施することから成る、Ｌ−アミノ酸の製法。
  9. 【請求項９】 前記の遺伝子に加え、ペントースリン酸回路の１つ以上の別
    の遺伝子を増幅、特に過剰発現させる、請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 増幅を達成するために、遺伝子またはヌクレオチド配列を
    有するプラスミドベクターで微生物を形質転換することにより、該遺伝子または
    該ヌクレオチド配列のコピー数を増加させる、請求項８および９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 アミノ酸、特にリジンを製造するために、ｏｐｃＡ遺伝子
    の他に、以下の群 １１.１ ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードするｄａｐＡ遺伝子 １１.２ フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼをコードするｌｙｓＣ遺
    伝子 １１.３ グリセロールアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするｇ
    ａｐ遺伝子 １１.４ ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするｐｙｃ遺伝子 １１.５ トランスケトラーゼをコードするｔｋｔ遺伝子 １１.６ ６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする、ｇｎｄ遺伝子 １１.７ リジンの排出をコードする、ｌｙｓＥ遺伝子 １１.８ ｚｗａ１遺伝子 １１.９ エノラーゼをコードするｅｎｏ遺伝子 １１.１０ トランスアルドラーゼをコードする、ｔａｌ遺伝子 １１.１１ 特にｚｗｆ遺伝子 から選択された１つ以上の遺伝子を同時に増幅、特に過剰発現させたバクテリア
    を発酵する、請求項８記載の方法。
  12. 【請求項１２】 アミノ酸、特にＬ−リジンを製造するために、以下の群 １２.１ ホスホエノールピルビン酸カルボキキナーゼをコードするｐｃｋ遺伝
    子 １２.２ グルコース６−リン酸イソメラーゼをコードするｐｇｉ遺伝子、 １２.３ ピルビン酸オキシダーゼをコードするｐｏｘＢ遺伝子または １２.４ ｚｗａ２遺伝子 から選択された１つ以上の遺伝子を同時に減衰させたバクテリアを発酵する、請
    求項８記載の方法。
  13. 【請求項１３】 ｏｐｃＡ遺伝子に相当する効果を示す遺伝子のＤＮＡをポ
    リメラーゼ連鎖反応法によって製造するためのプライマーとしての、請求項１記
    載のポリヌクレオチド配列の使用。
  14. 【請求項１４】 ハイブリダイゼーションプローブとしての、請求項１記載
    のポリヌクレオチド配列の使用。
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