KR101937682B1 - L-아미노산을 생산하는 재조합균, 이의 구성 방법 및 l-아미노산 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명에서는 L-아미노산을 생산하는 재조합균, 이의 구성 방법 및 L-아미노산 생산 방법을 제공한다. 본 발명에서 생산하는 L-아미노산의 재조합균은 시작균에 비하여 낮아진 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제 Pgi의 발현과 향상된 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제 Zwf-OpcA의 발현을 가지며, 그 중에서 상기 시작균은 목표 아미노산을 누적시킬 수 있는 균주이다. 본 발명의 재조합균을 발효 배양하면서 중첩적으로 수율을 향상시키는 효과를 관찰하게 되었으며, L-아미노산의 수율을 크게 향상시킨다. 본 발명의 조합 개조 방식은 L-아미노산의 발효 수율을 향상새킬 수 있는 새로운 방법을 제시하였기 때문에, 실제적으로 세균 발효를 통하여 L-아미노산을 생산하는데 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 미생물 발효 분야에 관한 것으로서, 특히 미생물 발효를 통하여 L-아미노산을 생산하는 방법 및 이의 전용 재조합균에 관한 것이다.
미생물 발효법을 통하여 L-아미노산을 생산하는 것은 현재 가장 널리 사용되고 있는 아미노산 생산 방법으로서, 아미노산 생산균의 발효 생산 성능은 발효법이 대규모 산업화 응용을 구현할 수 있을지 여부에 영향을 미치는 주요한 요소이다. 현재 여전히 소수의 아미노산 제품은 발효 성능이 훌륭한 생산 균주가 부족하기 때문에 발효법으로 생산을 구현하지 못하고 있다. 이미 발효법으로 생산을 구현한 아미노산 생산 균주는 생산 원가를 절감하기 위하여 이의 산 수율 수준과 당-산 전환율은 여전히 진일보로 제고되어야 한다. L-히스티딘을 예로 들면, L-히스티딘은 인간과 동물의 제9번째 필수 아미노산으로서, 인체 생장 발육, 산화 방지 및 면역 조절 등 중요한 생리 과정에 참여하고, 중요한 약용 아미노산이며 심장 질환, 빈혈, 위장 궤양 치료의 수액 제제에 이용될 수 있다. 현재 L-히스티딘 생산은 주로 돼지(소) 혈분을 원료로 하는 단백질 가수분해 추출법을 이용하는 바, 단백질 가수분해 추출법은 원료 원가가 높고 이용율이 낮으며, 추출 공정이 복잡하고 환경 오염등 큰 결함을 갖고 있어, L-히스티딘의 생산 원가가 높고 가격이 비싸게 된다. 미생물 발효법으로 L-히스티딘을 생산하는 것은 아직 대규모의 산업화 응용을 구현하지 못하고 있다. L-히스티딘의 생물 합성은 뉴클레오티드 합성과 전구체 물질을 경쟁하고, 대사 조절 제어 기전이 복잡하며 합성 과정 중에 에너지 수요가 높음 등의 특징을 가짐으로써, 이의 공정균의 산 수율과 전환율이 상대적으로 낮게 된다. L-히스티딘 생산 균주의 생산은 주로 다수 회의 전통적인 돌연변이 스크린을 선정하고, 돌연변이 균주의 기초 상에서 유전공학 개조를 진행하는 방법을 이용한다. 돌연변이 스크린을 통하여 취득한 균주는 대량의 부정효과 돌연변이를 누적하고 있기 때문에, 균주 생장이 느리고 환경 저항성이 떨어지며 영양 수요가 높아지는 문제를 가진다. 이러한 결함은 균주의 산업화 응용을 제약하고 있다. 현재 시스템 대사 공정을 통한 L-히스티딘 공정균의 개조 및 구성에 관한 연구는 단지 하나만 보도되어 있다 (Doroshenko, V. G., Lobanov, A. O., Fedorina, E. A., 2013. The directed modification of Escherichia coli MG1655 to obtain histidine-producing mutants. Appl Biochem Microbiol. 49, 130-135.). 해당 연구는 야생형 대장간균의 MG1655를 시작균으로 하여, hisG 유전자 중에 E271K 돌연변이를 도입하여, 히스티딘의 피드백 억제 조절을 약화시키며; 히스티딘 합성 오페론의 전사 감쇠 인자 hisL을 녹아웃시키고, 히스티딘 합성 오페론의 발현을 증가시키며; 아울러 purR 유전자를 녹아웃시키고, 히스티딘 합성 전구체 PRPP의 합성을 증가시켜 L-히스티딘을 생산하는 공정균을 구성하였다. 해당 연구에서는 단지 L-히스티딘 터미널 합성의 개조를 진행하였고, 이의 L-히스티딘의 수율은 단지 4.9 g/L로서, 산업화 응용을 구현하는 것과 비교적 큰 차이를 보이고 있다.
L-히스티딘 생물 합성의 주요한 커런트 캐링 경로는 펜토오스 포스페이트 경로이고, 글루코스를 카본 소스로할 때, 펜토오스 포스페이트 경로를 통하여 L-히스티딘 합성 전구체 포스포리보실 피로포스페이트(PRPP)를 생성하고, PRPP가 동시에 뉴클레오티드 합성 경로와 L-히스티딘 합성 경로로 진입하여, 뉴클레오티드 합성 경로를 통하여 L-히스티딘 합성의 다른 한 전구체 ATP를 생성한다.
그리고, 펜토오스 포스페이트 경로는 또한 여러 가지 아미노산(예를 들면 L-라이신, L-발린, L-트레오닌, L-프롤린 및 L-히드록시프롤린 등) 합성에 필요한 보조 인자 NADPH의 주요한 생성 경로이며, 그 중에서 1 분자의 L-라이신을 합성하려면 4 분자의 NADPH를 소모하여야 하고, 1 분자의 L-트레오닌, L-프롤린 및 L-히드록시 프롤린을 합성하려면 3 분자의 NADPH를 소모하여야 하며, 1 분자의 L-발린을 합성하려면 2 분자의 NADPH를 소모하여야 한다.
불활성 당분해 경로의 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제를 통하여 카본 대사의 흐름을 펜토오스 포스페이트 경로로 가이드할 수 있지만, 균주의 생장과 글루코스 대사 능력이 약화되기 때문에 균주 발효 생산 중의 응용에 불리하다(Marx, A., Hans, S., Mockel, B., Bathe, B., de Graaf, A. A., McCormack, A. C., Stapleton, C., Burke, K., O'Donohue, M., Dunican, L. K., 2003. Metabolic phenotype of phosphoglucose isomerase mutants of Corynebacterium glutamicum. J Biotechnol. 104, 185-197.). 본 발명자의 전 단계의 연구 결과에 의하여 증명된데 의하면, 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제 인코딩 유전자 pgi를 녹아웃시키면, 균주의 생장과 글루코스 대사 능력이 현저하게 낮아지며, 아울러 L-히스티딘 수율도 따라 낮아진다. 그리고, 본 발명자는 또한 단독으로 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제의 발현량을 향상시키는 것은 L-히스티딘 수율의 향상에 큰 영향을 미치지 못함을 발견하였다.
본 발명은 L-아미노산, 특히 펜토오스 포스페이트 경로에 의하여 전구체 물질 또는 보조 인자 NADPH를 제공하여 합성되는 L-아미노산, 예를 들면, L-히스티딘 수율을 향상시킬 수 있는 재조합균, 이의 구성 방법 및 상기 재조합균을 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
이를 위하여, 본 발명의 일 방면에 의하면, L-아미노산을 생산하는 재조합균을 제공하는 바, 상기 재조합균은 시작균에 비하여 낮아진 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제 Pgi의 발현과 향상된 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제 Zwf-OpcA의 발현을 가지며, 그 중에서 상기 시작균은 목표 아미노산을 누적시킬 수 있는 균주이다.
한 실시방식에 의하면, 원시균의 염색체에 대하여 돌연변이 또는 유전공학 개조를 진행하여 상기 시작균을 취득한다. 목표 아미노산을 취득하기 위하여, 상기 시작균은 종래의 목표 아미노산을 누적시킬 수 있는 균주일 수도 있고, 또는 적합한 원시균에 대하여 유전공학 개조를 진행해서 취득한 목표 아미노산을 누적시킬 수 있는 균주일 수도 있다. 높은 수율의 공정균을 취득하기 위하여, 목표 아미노산에 대하여 비교적 높은 수율을 가지는 균주를 시작균으로 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 언급되는 목표 아미노산은 펜토오스 포스페이트 경로에 의하여 전구체 물질 또는 보조 인자 NADPH를 제공하여 합성되는 L-아미노산이다. 바람직하게는, 상기 목표 아미노산은 L-히스티딘이다.
한 실시방식에 의하면, 상기 재조합균은 시작균에 비하여 pgi 유전자 발현을 약화시키고, 아울러 zwf - opcA 유전자의 향상된 발현을 가진다. 구체적으로 말하면, 상기 재조합균의 염색체 상의 pgi 유전자는 이미 불활성화, 바람직하게는 이미 녹아웃되거나, 또는 pgi 유전자의 조절 요소가 이미 낮은 전사 또는 낮은 발현 활성의 조절 요소로 교체되고, 아울러 상기 재조합균 중에는 두 개 또는 더욱 많은 카피의 zwf - opcA 유전자를 가지거나, 또는 tkt - tal - zwf - opcA - devB 오페론의 프로모터가 강한 프로모터로 교체되는 바, 예를 들면 원시균의 P eftu 프로모터로 교체된다.
L-히스티딘을 생산하는 재조합균에 있어서, 이의 시작균은 원시균에 비하여 L-히스티딘 합성 오페론의 hisEG 유전자와 hisDCB 유전자의 향상된 발현을 가질 수 있다. 구체적으로 말하면, 강한 프로모터로 상기 유전자의 프로모터를 교체할 수 있다. 예를 들면, 원시균 염색체 상의 PglyA 프로모터로 원시균의 염색체 상의 hisEG와 hisDCB의 프로모터를 교체한다. 나아가, 바람직하게는 상기 시직균은 원시균에 비하여 또한 PRPP 합성 효소 PrsA의 향상된 발현을 가질 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 시작균 중에는 두 개 또는 더욱 많은 카피의 prsA 유전자를 가지거나, 또는 강한 프로모터로 prsA 유전자의 프로모터를 교체시키는 바, 예를 들면 원시균의 Psod 프로모터로 prsA 유전자의 프로모터를 교체시킬 수 있다.
L-히스티딘을 생산하는 재조합균에 있어서, 하나의 바람직한 실시방식에 의하면, 상기 재조합균은 상기 시작균에 비하여 AICAR 트랜스메칠라제/IMP 환히드라제 PurH의 발현을 증가시킨다. 바람직하게는, 상기 시작균 중에는 두 개 또는 더욱 많은 카피의 purH 유전자를 가지거나, 또는 강한 프로모터로 purH 유전자의 프로모터를 교체시키는 바, 예를 들면 원시균의 Peftu 프로모터로 purH 유전자의 프로모터를 교체시킬 수 있다.
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하나의 더욱 바람직한 실시방식에 의하면, 상기 재조합균은 상기 시작균에 비하여 약화된 아미도포스포리보실 전이효소 PurF의 발현을 가진다. 구체적으로 말하면, 약한 프로모터로 purF 유전자의 프로모터를 교체할 수 있다. 바람직하게는, 상기 재조합균의 염색체 상에서 상기 원시균 중의 P hom 프로모터로 purF 유전자의 프로모터를 교체시킨다.
상기 서로 다른 실시방식 중에서 강한 프로모터의 예시를 보여주기는 하였지만, 강한 프로모터에 대하여 본 명세서에서는 특별한 제한이 없으며, 유전자의 발현을 향상시킬수만 있으면 된다. 본 발명에 이용될 수 있는 강한 프로모터로는 원시균의 P eftu , P sod , P glyA , P pck , P pgk 프로모터 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는, 상기 원시균은 코리네박테리움 속, 다이어리스터 속 또는 브레비박테리움 속으로부터 선택되는 한 가지 세균주이다. 바람직하게는, 상기 코리네박테리움 속의 세균은 Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium pekinense, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium crenatum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium aminogenes, Corynebacterium lilium, Corynebacterium callunae 및 Corynebacterium herculis으로부터 선택되는 한 가지 세균주이다. 바람직하게는, 상기 다이어리스터 속의 세규은 Microbacterium ammoniaphilum으로부터 선택되는 한 가지 세균주이다. 바람직하게는, 상기 브레비박테리움 속의 세균은 Brevibacteriaceae flvum, Brevibacteriaceae lactofermentum 및 Brevibacteriaceae ammoniagenes으로부터 선택되는 한 가지 세균주이다.
한 구체적인 실시방식에 의하면, 상기 원시균은 야생형 Corynebacterium glutamicum ATCC13032이다.
이러한 상황 하에서, L-히스티딘을 생산하는 재조합균에 있어서, 상기 시작균의 염색체 상에는 각각 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 염색체 상의 L-히스티딘 합성 오페론 hisEG와 hisDCB의 프로모터를 교체로 하는 서열 7 중의 5’ 말단 제863-1038번 뉴클레오티드 서열이 보여주는 P glyA 프로모터 및 상기 시작균이 돌연변이를 발현할 수 있는 ATP-포스포리보실 전이효소를 갖고 있다.
상기 돌연변이된 ATP-포스포리보실 전이효소는 서열 6이 보여주는 ATP-포스포리보실 전이효소의 제215번의 아스파라진이 라이신으로 돌연변이되고, 제231번의 류신이 페닐알라닌으로 돌연변이되며, 제235번의 트레오닌이 알라닌으로 돌연변이된 효소이다. 바람직하게는, 상기 시작균의 염색체 상에는 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 염색체 상의 hisG 유전자를 교체로 하는 서열 4 중의 제1007-1852번 뉴클레오티드 서열이 보여주는 hisG fbr 유전자를 가진다.
하나의 바람직한 실시방식에 의하면, 상기 시작균의 염색체 상에는 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 염색체 상의 prsA 유전자의 프로모터를 교체로 하는 서열 11 중의 5' 말단 제656-847번 뉴클레오티드 서열이 보여주는 P sod 프로모터를 가진다.
다른 하나의 바람직한 실시방식에 의하면, 상기 시작균 중에는 두 개 또는 더욱 많은 카피의 prsA 유전자와 hisG fbr 유전자를 가진다. 상기 prsA 유전자는 인코딩 서열 5가 보여주는 PrsA의 유전자에서 선택될 수 있으며; 코드가 상기 PrsA와 비교하여 적어도 60%의 상동성을 가지고, 바람직하게는 적어도 70%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 가지고, 나아가 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 내지는 99%의 상동성을 가지며 또한 PrsA 활성을 가지는 유전자 중의 하나이다. 구체적으로는 서열표 중의 서열 4가 보여주는 제15-992번의 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
본 발명의 재조합균에 있어서, 상기 pgi 유전자는 인코딩 서열표 중의 서열 14가 보여주는 Pgi의 유전자에서 선택될 수 있으며; 코드가 상기 Pgi와 비교하여 적어도 60%의 상동성을 가지고, 바람직하게는 적어도 70%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 가지고, 나아가 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 내지는 99%의 상동성을 가지며 또한 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제 Pgi 활성을 가지는 유전자 중의 하나이다. 구체적으로는 서열 13이 보여주는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
상기 zwf - opcA 유전자는 인코딩 서열표 중의 서열 3이 보여주는 zwf-opcA의 유전자에서 선택될 수 있으며; 코드가 상기 zwf-opcA와 비교하여 적어도 60%의 상동성을 가지고, 바람직하게는 적어도 70%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 가지고, 나아가 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 내지는 99%의 상동성을 가지며 또한 zwf-opcA 활성을 가지는 유전자 중의 하나이다. 구체적으로는 서열 2가 보여주는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
상기 P eftu 프로모터는 서열 12가 보여주는 5’ 말단 제635-834번의 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
상기 purH 유전자는 인코딩 서열표 중의 서열 16이 보여주는 purH의 유전자에서 선택될 수 있으며; 코드가 상기 purH와 비교하여 적어도 60%의 상동성을 가지고, 바람직하게는 적어도 70%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 가지고, 나아가 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 내지는 99%의 상동성을 가지며 또한 purH 활성을 가지는 유전자 중의 하나이고, 상기 purH 유전자는 서열표 중의 서열 15가 보여주는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
상기 P hom 프로모터는 서열 18이 보여주는 5’ 말단 제736-865번의 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
본 발명의 재조합균에 있어서, 어떠한 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 도입하여 해당 유전자의 카피 수량을 증가시킬 수 있고, 또한 직접 어떠한 유전자를 균주 염색체 상의 적합한 위치에 삽입할 수도 있다. 재조합 플라스미드를 구성하는 벡터에 대하여 제한이 없으며, 임의의 적합한 플라스미드일 수 있는 바, 예를 들면 pXMJ19이다.
본 발명의 두번째 방면에 의하면, L-아미노산을 생산하는 재조합균의 구성 방법을 제공한다. 상기 방법에는 하기 단계가 포함되는 바, 즉 시작균 중의 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제 Pgi의 발현을 낮추고, 또한 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제 Zwf-OpcA의 발현을 향상시켜 상기 재조합균을 취득하는 바, 그 중에서 상기 시작균은 목표 아미노산을 누적시킬 수 있는 균주이다.
공지된 방법에 의하여 예를 들면 돌연변이 또는 유전공학 개조 등의 방법을 통하여 시작균을 취득하거나, 또는 기존의 목표 아미노산을 생산할 수 있는 균주를 시작균으로 채용할 수 있다. 바람직하게는 높은 수율의 균주를 사용하는 것이다.
본 발명의 목표 아미노산은 L-히스티딘인 것이 바람직하다.
하나의 실시방식에 의하면, 시작균 중의 Pgi의 발현을 낮추는 것은 하기 A) 또는 B) 방식을 통하여 구현한다.
A) 상기 시작균 염색체 상의 pgi 유전자를 불활성화시킨 것으로서, 상기 불활성화는 녹아웃인 것이 바람직하며;
B) 상기 시작균 중 pgi 유전자의 조절 요소를 낮은 전사 또는 낮은 발현 활성의 조절 요소로 교체한다.
상기 시작균 중 Zwf-OpcA의 발현을 향상시키는 것은 하기 C) 또는 D) 방식을 통하여 구현한다.
C) 상기 시작균 중 zwf - opcA 유전자의 카피 수량을 증가시키며;
D) 상기 시작균 염색체 상 tkt - tal - zwf - opcA - devB 오페론의 프로모터을 강한 프로모터로 교체시키는 바, 예를 들면 상기 원시균 염색체 상의 P eftu 프로모터이다.
L-히스티딘에 있어서, 한 실시방식에 의하면, 상기 시작균을 취득하는 것은 원시균 염색체 상의 L-히스티딘 합성 오페론 hisEG와 hisDCB의 프로모터를 각각 강한 프로모터로 교체하는 것이 포함한다. 예를 들면 원시균 염색체 상의 P glyA 프로모터인 단계를 포함할 수 있다. 나아가, 바람직하게는 상기 시작균을 취득하는 것에는 더욱 상기 시작균 중 PRPP 합성 효소 PrsA의 발현을 향상시키는 단계를 포함할 수 있다. 더욱 바람작하게는, 상기 시작균 중 PrsA의 발현을 향상시키는 것은 하기 E) 또는 F) 방식을 통하여 구현한다.
E) 상기 시작균 중 prsA 유전자의 카피 수량을 증가시키며;
F) 상기 시작균 염색체 상 prsA 유전자의 프로모터을 강한 프로모터로 교체시키는 바, 예를 들면 상기 원시균 염색체 상의 P sod 프로모터이다.
한 바람직한 실시방식에 의하면, L-히스티딘에 있어서, 상기 방법에는 나아가 상기 재조합균 중의 AICAR 트랜스메칠라제/IMP 환히드라제 PurH의 발현을 향상시키는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 재조합균 중의 PurH의 발현을 향상시키는 것은 하기 G) 또는 H) 방식을 통하여 구현할 수 있다.
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G) 상기 시작균 중 purH 유전자의 카피 수량을 증가시키며;
H) 상기 시작균 염색체 상 purH 유전자의 프로모터를 강한 프로모터로 교체시키는 바, 예를 들면 상기 원시균 염색체 상의 P eftu 프로모터이다.
더욱 바람직한 실시방식에 의하면, L-히스티딘에 있어서, 상기 방법에는 나아가 상기 재조합균 중의 아미도포스포리보실 전이효소 PurF를 약화시키는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로 말하면, 약한 프로모터로 purF 유전자의 프로모터를 교체할 수 있다. 바람직하게는, 상기 재조합균 중 PurF의 발현을 약화시키는 것은 상기 시작균 염색체 상의 purF 유전자의 프로모터를 상기 원시균 중 염색체 상의 P hom 프로모터로 교체시키는 것을 통하여 구현한다.
마찬가지로, 강한 프로모터에 대하여 특별한 제한이 없으며, 유전자의 발현을 향상시킬수만 있으면 된다. 예를 들면 원시균의 P eftu , P sod , P glyA , P pck 또는 P pgk 프로모터 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는, 원시균으로 가능한 균주는 코리네박테리움 속, 다이어리스터 속 또는 브레비박테리움 속으로부터 선택되는 한 가지 세균주이다. 바람직하게는, 상기 코리네박테리움 속의 세균은 Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium pekinense, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium crenatum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium aminogenes, Corynebacterium lilium, Corynebacterium callunae 및 Corynebacterium herculis으로부터 선택되는 한 가지 세균주이다. 바람직하게는, 상기 다이어리스터 속의 세균은 Microbacterium ammoniaphilum으로부터 선택되는 한 가지 세균주이다. 바람직하게는, 상기 브레비박테리움 속의 세균은 Brevibacteriaceae flvum, Brevibacteriaceae lactofermentum 및 Brevibacteriaceae ammoniagenes으로부터 선택되는 한 가지 세균주이다. 가장 바람직하게는 Corynebacterium glutamicum 또는 Brevibacteriaceae flvum이다.
한 구체적인 실시방식에 의하면, 원시균은 야생형 Corynebacterium glutamicum ATCC13032이다.
상기 실시방식에 있어서, L-히스티딘을 생산하는 재조합균에 있어서, 상기 시작균은 상기 원시균에 대하여 하기 재조합을 진행하여 취득할 수 있다.
상기 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 염색체 상L-히스티딘 합성 오페론 hisEG와 hisDCB의 프로모터를 각각 서열 7 중의 5’ 말단 제863-1038번 뉴클레오티드(또는 서열 8 중의 5’ 말단 제752-927번 뉴클레오티드)가 보여주는 P glyA 프로모터로 교체하고,
상기 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 이 발현하는 서열 6이 보여주는ATP-포스포리보실 전이효소의 제215번의 아스파라진을 라이신으로 돌연변이시키고, 제231번의 류신을 페닐알라닌으로 돌연변이시키며, 제235번의 트레오닌을 알라닌으로 돌연변이시킨다. 상기 돌연변이된 유전자는 서열 4 중의 제1007-1852번 뉴클레오티드가 보여주는 hisG fbr 유전자이다.
하나의 바람직한 실시방식에 의하면, L-히스티딘 누적 효과가 더욱 좋은 시작균을 취득하기 위하여, 나아가 상기 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 염색체에 대하여 개조를 진행하여, 염색체 상의 prsA 유전자의 프로모터를 서열 11 중의 5’ 말단 제656-847번 뉴클레오티드 서열이 보여주는 P sod 프로모터로 교체시킨다.
다른 한 바람직한 실시방식에 의하면, 상기 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 중의 prsA 유전자의 카피 수량과 상기 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 중의 hisG fbr 유전자의 카피 수량을 증가시켜 L-히스티딘 누적 효과가 더욱 좋은 시작균을 취득할 수 있다.
상기 prsA 유전자는 인코딩 서열 5가 보여주는 PrsA의 유전자에서 선택될 수 있으며; 코드가 상기 PrsA와 비교하여 적어도 60%의 상동성을 가지고, 바람직하게는 적어도 70%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 가지고, 나아가 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 내지는 99%의 상동성을 가지며 또한 PrsA 활성을 가지는 유전자 중의 하나이다. 구체적으로는 서열표 중의 서열 4가 보여주는 제15-992번의 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
상기 pgi 유전자는 인코딩 서열표 중의 서열 14가 보여주는 Pgi의 유전자에서 선택될 수 있으며; 코드가 상기 Pgi와 비교하여 적어도 60%의 상동성을 가지고, 바람직하게는 적어도 70%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 가지고, 나아가 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 내지는 99%의 상동성을 가지며 또한 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제 활성을 가지는 유전자 중의 하나이다. 구체적으로는 서열 13이 보여주는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
상기 zwf - opcA 유전자는 인코딩 서열표 중의 서열 3이 보여주는 zwf-opcA의 유전자에서 선택될 수 있으며; 코드가 상기 zwf-opcA와 비교하여 적어도 60%의 상동성을 가지고, 바람직하게는 적어도 70%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 가지고, 나아가 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 내지는 99%의 상동성을 가지며 또한 zwf-opcA 활성을 가지는 유전자 중의 하나이다. 구체적으로는 서열 2가 보여주는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
상기 P eftu 프로모터는 서열 12가 보여주는 5’ 말단 제635-834번(또는 서열 20이 보여주는 5’ 말단 제634-833번)의 뉴클레오티드 서열이다.
상기 purH 유전자는 인코딩 서열표 중의 서열 16이 보여주는 purH의 유전자에서 선택될 수 있으며; 코드가 상기 purH와 비교하여 적어도 60%의 상동성을 가지고, 바람직하게는 적어도 70%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 가지고, 나아가 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 가지며, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 내지는 99%의 상동성을 가지며 또한 purH 활성을 가지는 유전자 중의 하나이다. 구체적으로는 서열표 중의 서열 15가 보여주는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
상기 P hom 프로모터는 서열 18이 보여주는 5’ 말단 제736-865번의 뉴클레오티드 서열이다.
본 발명의 방법에 있어서, 어느 한 유전자의 카피 수량을 증가시키는 것은 해당 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 구성하고, 이어 재조합 플라스미드를 시작균/원시균 중에 도입하여 구현할 수 있다. 이러한 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 것이기 때문에 상세한 설명을 생략하도록 한다. 재조합 플라스미드를 구성하는 벡터에 대하여 제한이 없으며, 임의의 적합한 플라스미드일 수 있는 바, 예를 들면 pXMJ19이다.
본 발명의 재조합균은 상기 구성 방법을 통하여 취득한 재조합균일 수 있다.
본 발명의 세번째 방면에 의하면, L-아미노산을 생산하는 방법을 제공하는 바, 상기 재조합균을 발효 배양하는 단계가 포함된다. 바람직하게는, 상기 L-아미노산은 L-히스티딘이다.
본 발명에서 제공하는 재조합균을 구성하는 방법에는 하기 단계가 포함되는 바, 즉 시작균 중 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제의 발현을 낮추고, 또한 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제와 PRPP 합성 효소의 발현을 향상시켜 재조합균을 취득하는 것이다.
상기 방법 중에서, 상기 시작균 중 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제의 발현은 낮추는 것은 하기 A) 또는 B) 방식을 통하여 구현한다.
A) 상기 시작균 염색체 상의 pgi 유전자를 불활성화시킨 것으로서, 상기 불활성화는 구체적으로는 녹아웃이며;
B) 상기 시작균 중의 pgi 유전자의 조절 요소를 낮은 전사와 낮은 발현 활성의 조절 요소로 교체하여 구현하며;
상기 시작균 중의글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제와 PRPP 합성 효소의 발현을 향상시키는 것은 하기 C) 또는 D) 방식을 통하여 구현한다.
C) 상기 시작균 중 zwf - opcA 유전자와 prsA 유전자의 카피 수량을 증가시키며;
D) 상기 시작균 염색체 상의 tkt - tal - zwf - opcA - devB 오페론의 프로모터을 P eftu 프로모터로 교체시키며, 또한 상기 염색체 상 prsA 유전자의 프로모터를 P sod 프로모터로 교체한다.
상기 방법에 있어서, 상기 재조합균을 구성하는 방법은 하기 Ⅰ 또는 Ⅱ와 같다.
Ⅰ의 방법으로는 상기 시작균 염색체의 pgi 유전자를 녹아웃시키고, 또한 상기 시작균 중의 zwf - opcA 유전자와 prsA 유전자의 카피 수량을 증가시켜 재조합균을 취득하며;
Ⅱ의 방법으로는 상기 시작균 염색체의 pgi 유전자를 녹아웃시키고, 상기 시작균 염색체 상의 tkt - tal - zwf - opcA - devB 오페론의 프로모터를 P eftu 프로모터로 교체시키며, 또한 상기 염색체 상의 prsA 유전자의 프로모터를 P sod 프로모터로 교체한다.
상기 방법에 있어서,
상기 녹아웃은 녹아웃하고자 하는 유전자 pgi의 업/다운 스트림 상동 암을 포함하는 세그먼트를 상기 시작균에 도입하여 상동 재조합을 진행하는 것이며;
상기 시작균 중의 zwf - opcA 유전자와 prsA 유전자의 카피 수량을 증가시키는 것은 zwf - opcA 유전자와 prsA - hisG fbr 세그먼트를 재조합 벡터를 통하여 상기 시작균으로 도입하는 것이며;
상기 재조합 벡터는 zwf - opcA 유전자와 prsA - hisG fbr 세그먼트를 발현 벡터에 삽입시켜 취득한 재조합 벡터이며; 상기 발현 벡터는 IPTG 유발성 발현 벡터 pXMJ19일 수 있으며;
본 발명의 실시예2에 있어서, 재조합 벡터는 pXMJ19-zwf - opcA - prsA - hisG fbr 로서, zwf - opcA 유전자(서열 2)을 pXMJ19의 Hind III과 Xba I 사이에 삽입하고, 또한 prsA-hisG fbr 세그먼트(서열 4)를 Xba I과 Sma I 사이에 삽입하여 취득한 벡터이다.
상기 시작균 염색체 상의 tkt - tal - zwf - opcA - devB 오페론의 프로모터를 P eftu 프로모터로 교체시키는 것은 P eftu 프로모터가 포함된 세그먼트를 상기 시작균에 도입하여 상동 재조합을 진행하는 것이며;
상기 시작균 염색체 상의 prsA 유전자의 프로모터를 P sod 프로모터로 교체시키는 것은 P sod 프로모터가 포함된 세그먼트를 상기 시작균에 도입하여 상동 재조합을 진행하는 것이다.
상기 방법에 있어서,
상기 녹아웃하고자 하는 유전자 pgi의 업/다운 스트림 상동 암을 포함하는 세그먼트의 뉴클레오티드 서열은 서열표 중의 서열 1이고, 그 중에서 서열 1의 5’ 말단 제1-834번 뉴클레오티드는 녹아웃하고자 하는 유전자 pgi의 업스트림 상동 암이고, 서열 1의 5’ 말단 제2835-1672번 뉴클레오티드는 녹아웃하고자 하는 유전자 pgi의 다운스트림 상동 암이며; 유전자 pgi의 뉴클레오티드 서열은 서열 13이며;
상기 zwf - opcA 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열표 중의 서열 2이며;
상기 prsA - hisG fbr 세그먼트의 뉴클레오티드 서열은 서열표 중의 서열 4이며;
상기 재조합 벡터는 상기 zwf - opcA 유전자와 상기 prsA - hisG fbr 세그먼트를 발현 벡터에 삽입시켜 취득한 벡터이며;
상기 P eftu 프로모터의 뉴클레오티드 서열은 서열표 중의 서열 12의 5’ 말단 제635-834번 뉴클레오티드이며;
상기 P eftu 프로모터의 세그먼트를 포함하는뉴클레오티드 서열은 서열표 중의 서열 12이며;
상기 P sod 프로모터의 세그먼트를 포함하는뉴클레오티드 서열은 서열표 중의 서열 11이다.
상기 방법에 있어서, 상기 시작균은 하기 단계를 포함하는 방법에 따라 제조되는 바, 즉 세균 염색체 상의 L-히스티딘 합성 오페론의 프로모터를 P glyA 프로모터로 교체시키고, 또한 상기 세균 염색체 상의 hisG 유전자를 점 돌연변이시켜 시작균을 취득하며;
상기 L-히스티딘 합성 오페론은 hisEG와 hisDCB이며;
상기 P glyA 프로모터의 뉴클레오티드 서열은 서열표 중 서열 7의 제863-1038번 뉴클레오티드 또는 서열표 중 서열 8의 제752-927번 뉴클레오티드이며;
상기 점 돌연변이는 상기 세균 염색체의 hisG 유전자로 인코딩된 단백질의 제215번의 아스파라진을 라이신으로 돌연변이시키고, 제231번의 류신을 페닐알라닌으로 돌연변이시키며, 제235번의 트레오닌을 알라닌으로 돌연변이시킨 것이다.
상기 방법에 있어서, 상기 세균 염색체 상의 L-히스티딘 합성 오페론의 프로모터를 P glyA 프로모터로 교체시키는 것은 hisEG의 P glyA 프로모터가 포함된 세그먼트와 hisDCB의 P glyA 프로모터가 포함된 세그먼트를 세균 중에 도입하여 상동 재조합을 진행하는 것이며; 그 중에서 hisEG의 P glyA 프로모터가 포함된 세그먼트의 뉴클레오티드 서열은 서열표 중의 서열 7이며; hisDCB의 P glyA 프로모터가 포함된 세그먼트의 뉴클레오티드 서열은 서열표 중의 서열 8이다.
상기 방법에 있어서, 상기 세균 염색체 상의 hisG 유전자를 점 돌연변이시키는 것은 서열 9가 보여주는 뉴클레오티드 서열을 상기 세균 중에 도입하여 상동 재조합을 진행하고, 다시 서열 10이 보여주는 뉴클레오티드 서열을 중간균에 도입시켜 상동 재조합을 진행하기 위한 것이다.
상기 방법에 있어서, 상기 세균은 코리네박테리움 속 세균이고, 상기 코리네박테리움 속 세균은 구체적으로 Corynebacterium glutamicum이다.
상기 방법에 의하여 제조된 재조합균도 본 발명의 보호 범위에 속한다.
상기 재조합균의 L-히스티딘 제조 중의 응용도 본 발명의 보호 범위에 속한다.
본 발명에서는 또한 L-히스티딘을 제조하는 방법을 제공하는 바, 상기 재조합균을 발효 배양하여 L-히스티딘을 취득하는 단계가 포함된다.
본 발명의 상기 불활성화 세균의 pgi 유전자에 있어서, "불활성화"는 상응하게 개조된 객체에 변화가 발생하여 일정한 효과에 달하는 것을 말하는 바, 점 돌연변이, 삽입 불활성화 및/또는 녹아웃이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 이용되는 염색체 유전자 녹아웃, 삽입 불활성화, 녹인, 프로모터 교체와 점 돌연변이의 방법은 자살 벡터 pK18mobsacB가 개조 타켓 유전자의 상동 암을 휴대하고 상동 재조합을 발생하는 것을 통하여 구현한다.
본 발명의 상기 L-히스티딘 공정균에 있어서, 24 시간 발효시킨 L-히스티딘 생산 강도는 0.01~1 g/L/h이고, 발효 종료 시에 L-히스티딘 생산량은 1~60 g/L이며, 일반적으로 발효 수율이 2 g/L 이상에 달할 수 있다.
본 발명의 실험에 의해 증명된데 의하면, 종래의 L-히스티딘 공정균과 L-히스티딘 발효 생산법에 비하여, 본 발명은 하기 장점을 가진다.
(1) 본 발명에서 제공하는 재조합균은 pgi 유전자를 녹아웃시켜 업스트림 당분해 경로를 차단시킴과 아울러, zwf - opcA 유전자를 과도 발현시켜 펜토오스 포스페이트 경로의 대사 능력을 향상시키는 조합 개조 방식을 통하여, 공정균의 생장과 글루코스 소모 능력이 야생형 균주에 비하여 약화되는 것을 보이지 않고 L-아미노산 수율이 크게 향상되었다.
(2) 본 발명에서 제공하는 재조합균은 기본 배양지(플라스크 진탕 발효 실험용)에서 양호하게 생장하며, 영양물질 결핍형이 없어 산업화 제어에 유리하다.
(3) 본 발명에서 제공하는 재조합균의 발효 주기가 짧은 바, 발효 탱크 스케일업 실험에서 약 45-72 시간에 최대 누적량에 도달할 수 있어(허나 현재 보도된 가장 높은 수율의 L-히스티딘 공정균 발효 시간은 120 시간에 달함)(Mizukami, T., Hamu, A., Ikeda, M., Oka, T., Katsumata, R., 1994. Cloning of the ATP phosphoribosyl transferase gene of Corynebacterium glutamicum and application of the gene to l-histidine production. Biosci. Biotechnol. Biochem. 58, 635-638.), 과정 및 원가 제어에 유리하다.
(4) 본 발명은 최초로 pgi 유전자가 결실된 기초 상에서, 아울러 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제의 발현을 향상시키는 조합 개조 방식을 제안하여, pgi 유전자 결실에 의하여 초래되는 균주 생장 및 글로코스 대사의 제한을 해제하고, 최대한으로 중심 카본 대사 유동을 펜토오스 포스페이트 경로로 유도할 수 있으며, 아울러 세균의 비교적 높은 생장 대사와 ATP 수준을 유지할 수 있으며, 아미노산 수율을 크게 향상시킴으로써 실천 상에서 세균 발효 산업화 생산에 이용될 수 있다.
(5) 본 발명에서는 또한 최초로 히스티딘 합성 경로와 뉴클레오티드 합성 경로를 커플링시키는 방안을 제안하여, 히스티딘 합성 부산물 AICAR를 이용하여 히스티딘의 전구체 ATP를 합성하여 L-히스티딘 수율을 크게 향상시킴으로써 실천 상에서 세균 발효 산업화 생산에 이용될 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 유익한 효과라면, L-아미노산의 발효 수율을 향상시킬 수 있는 새로운 방법을 제안 및 증명하고, 또한 상응한 공정균을 구성하였으며, 중첩적으로 수율을 향상시킬 수 있는 효과를 발견하여 실천 상에서 세균 발효를 통하여 L-아미노산을 생산하는데 이용될 수 있어 보급에 유리하다.
아래, 이해를 돕기 위하여 구체적은 실시예를 통하여 본 발명에 대하여 상세한 설명을 진행하도록 한다. 유의할 바로는 이러한 설명은 예시적인 것으로서, 본 발면의 범위를 제한하는 것이 아니다. 본 명세서에 의한 설명에 의하면, 본 발명의 많은 변화, 수정은 당업계의 기술자들에 있어서는 자명한 것이다.
그리고 본 발명에서는 공개 문헌을 인용하였는바, 이러한 문헌은 더욱 명확하게 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 이들의 모든 내용은 모두 본 명세서에 참조되는 바, 이 모든 내용들이 본 명세서에서 중복 기술된 것과 같다.
본 발명에서 생산하는 L-아미노산의 재조합균은 시작균에 비하여 낮아진 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제 Pgi의 발현과 향상된 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제 Zwf-OpcA의 발현을 가지며, 그 중에서 상기 시작균은 목표 아미노산을 누적시킬 수 있는 균주이다. 본 발명의 재조합균을 발효 배양하면서 중첩적으로 수율을 향상시키는 효과를 관찰하게 되었으며, L-아미노산의 수율을 크게 향상시킨다. 본 발명의 조합 개조 방식은 L-아미노산의 발효 수율을 향상새킬 수 있는 새로운 방법을 제시하였기 때문에, 실제적으로 세균 발효를 통하여 L-아미노산을 생산하는데 이용될 수 있다.
하기 도면을 참조하면, 본 발명의 방안 및 유익한 효과를 더욱 잘 이해하는데 도움이 된다.
도 1은 재조합 플라스미드 pXMJ19-prsA - hisG fbr 의 도면.
도 2는 CG161 균주(pgi 유전자가 녹아웃됨) 게놈 DNA의 PCR 검증 전기 이동도.
도 3은 재조합 플라스미드 pXMJ19-zwf - opcA - prsA - hisG fbr 의 도면.
도 4는 L-히스티딘 공정균 CG171 발현 단백질의 SDS-PAGE 도면.
도 5는 L-히스티딘 공정균 CG171 중의 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제 효소 활성 측정도.
도 6은 재조합 플라스미드 pXMJ19-zwf - opcA - prsA - hisG fbr - purH의 도면.
도 7은 CG328 균주가 플라스미드 DNA를 휴대한 PCR 검증 전기 이동도.
도 8은 CG353 균주(purF 유전자가 약화됨) 게놈 DNA의 PCR 검증 전기 이동도.
도 1은 재조합 플라스미드 pXMJ19-prsA - hisG fbr 의 도면.
도 2는 CG161 균주(pgi 유전자가 녹아웃됨) 게놈 DNA의 PCR 검증 전기 이동도.
도 3은 재조합 플라스미드 pXMJ19-zwf - opcA - prsA - hisG fbr 의 도면.
도 4는 L-히스티딘 공정균 CG171 발현 단백질의 SDS-PAGE 도면.
도 5는 L-히스티딘 공정균 CG171 중의 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제 효소 활성 측정도.
도 6은 재조합 플라스미드 pXMJ19-zwf - opcA - prsA - hisG fbr - purH의 도면.
도 7은 CG328 균주가 플라스미드 DNA를 휴대한 PCR 검증 전기 이동도.
도 8은 CG353 균주(purF 유전자가 약화됨) 게놈 DNA의 PCR 검증 전기 이동도.
아래 첨부된 도면과 실시예를 통하여 본 발명의 구체적인 실시방식에 대하여 더욱 상세한 설명을 진행하여 본 발명의 방안 및 여러 가지 방면의 장점을 이해하는 것을 돕도록 한다. 하지만 하기 기술된 구체적인 실시방식과 실시예는 단지 설명을 위한 것이며 본 발명을 제한하는 것이 아니다. 구체적으로 말하면, 하기 기술은 모두 (야생형) Corynebacterium glutamicum을 예로 들어 공정균의 구성 및 L-히스티딘의 생산에 대하여 설명과 실험을 진행하지만, 당업계의 기술자들은 본 발명의 아미노산 대사 경로의 개조 방식이 기타 적합한 균주에 적용되어 L-히스티딘의 수율을 향상시키는 공정균을 구성할 수 있음을 이해하여야 할 것이다.
배경기술 중에서 언급된 바와 같이, pgi 유전자로 인코딩된 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제는 당분해 경로의 핵심 효소이다. L-히스티딘 합성의 전구체 PRPP는 펜토오스 포스페이트 경로를 거쳐 합성된 것이기 때문에, pgi 유전자를 녹아웃시키면 당분해 경로의 대사 유동을 약화시키고, 중심 카본 대사 유동을 펜토오스 포스페이트 경로로 유도하여 L-히스티딘 합성 경로 대사 유동을 향상시킬 수 있다는 것을 추정할 수 있다.
pgi 유전자를 녹아웃시키는 것을 통하여 펜토오스 포스페이트 경로 대사 유동을 향상시키는 개조 방식은 문헌과 특허에 모두 보도된 바 있다(L-라이신, L-발린과 뉴클레오티드 등 생성물 생산. Marx, A., Hans, S., Mockel, B., Bathe, B., de Graaf, A. A., McCormack, A. C., Stapleton, C., Burke, K., O'Donohue, M., Dunican, L. K., 2003. Metabolic phenotype of phosphoglucose isomerase mutants of Corynebacterium glutamicum. J Biotechnol. 104, 185-197; Blombach, B., Schreiner, M. E., Bartek, T., Oldiges, M., Eikmanns, B. J., 2008. Corynebacterium glutamicum tailored for high-yield l-valine production. Appl Microbiol Biotechnol. 79, 471-479;Peifer, S., Barduhn, T., Zimmet, S., Volmer, D., Heinzle, E., Schneider, K., 2012. Metabolic engineering of the purine biosynthetic pathway in Corynebacterium glutamicum results in increased intracellular pool sizes of IMP and hypoxanthine. Microb Cell Fact. 11, 138;US6586214B1;EP1087015A2).
하지만 본 발명인은 실제상에서 pgi 유전자를 녹아웃시키면 당 대사 중간 대사물이 과도하게 누적되어 당대사 압력을 초래하며, 나아가 균체 글로코스 대사와 생장이 늦어짐을 발견하였다. 본 발명인은 또한 pgi 유전자를 녹아웃시킨 후, L-히스티딘을 생산하는 공정균의 L-히스티딘 수율이 증가되지 않을 뿐 아니라 오히려 크게 낮아짐을 발견하였다. 이의 주요한 원인으로는 히스티딘은 펜토오스 포스페이트 경로를 통하여 이의 분자 골격을 합성하는 전구체를 제공하지만, 라이신과 발린은 펜토오스 포스페이트 경로를 통하여 이의 합성 효소의 보조 인자 NADPH를 제공하기 때문이다. 그리고, 히스티딘 합성 과정에 대량의 에너지 벡터 ATP를 소모하기 때문에, pgi 유전자의 발현을 약화시키고 펜토오스 포스페이트 경로 대사 유동을 향상시키는 방식으로 히스티딘의 수율을 향상시키려면, 펜토오스 포스페이트 경로와 당대사 경로 대사 유동의 평형을 유지하여 이의 합성 전구체와 에너지 공급을 확보하여야 한다.
이러한 문제에 대하여, 본 발명에서는 실험을 통하여 zwf-opcA 유전자(해당 유전자는 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제를 인코딩하는 바, 펜토오스 포스페이트 경로의 햄심 속도 제한 효소이다)를 과도 발현시키는 것은 균체의 당 대사 능력을 향상시키고 당 대사 압력을 완화시킬 수 있으며, 균주의 글루코스 대사와 생장 능력을 회복시키고, 아울러 펜토오스 포스페이트 경로와 당대사 경로 대사 유동의 평형시키고, 히스티딘 합성 전구체 PRPP와 ATP공급을 평형시켜, 나아가 L-히스티딘 수율을 향상시키는 것을 발견하였다.
본 발명에 의하면, pgi 유전자를 약화(예를 들면 녹아웃)시킴과 아울러, zwf-opcA 유전자를 과도 발현시키는 개조 방식을 통하여, 이미 prsA 유전자와 L-히스티딘 합성 오페론 유전자 발현을 향상시킨 균주에 대하여 재조합 개조를 진행하여 취득한 균주의 L-히스티딘 수율은 크게 향상되었다.
본 발명의 pgi 유전자를 약화시킴과 아울러, zwf-opcA 유전자를 과도 발현시키는 개조 방식은 NADPH를 증가시킴과 아울러, 펜토오스 포스페이트 경로와 당대사 경로 대사 유동의 평형도 평형시키고, pgi 유전자 약화로 인하여 균체 글로코스 대사와 생장이 늦어지는 문제를 해결함으로써, 마찬가지로 나아가 아미노산의 수율을 향상시킨다.
이 기초 상에서, 본 발명에서는 나아가 L-히스티딘 합성 경로와 뉴클레오티드 합성 경로를 상호 커플링 시키는 방식을 제안하였다. L-히스티딘 합성 과정에 있어서, hisH와 hisF 유전자에 의하여 인코딩된 이미다졸글리세롤포스페이트 합성 효소가 이미다졸글리세롤포스페이트와5-포스포리보실-4-포름아미도-5-아미노이미다졸(AICAR)을 촉매 작용 및 생성하는 바, 그 중에서 이미다졸글리세롤포스페이트가 히스티딘 합성 경로를 따라 최종으로 L-히스티딘을 합성하고, AICAR는 퓨린 합성 경로로 진입하여 최종적으로 퓨린 뉴클레오티드(AMP, ATP 등)를 생성한다. ATP는 히스티딘 합성의 전구 물질 중의 하나이고, 아울러 히스티딘 합성을 위하여 에너지를 제공한다. purH 유전자에 의하여 인코딩되는 이중 기능 효소, AICAR 트랜스메칠라제/IMP 환히드라제는 AICAR 생성되는 IMP의 두 단계 반응에 대하여 촉매 작용을 일으킨다. 본 발명인은 Corynebacterium glutamicum 중의 purH 유전자의 발현을 향상시키는 L-히스티딘 누적에 대하여 큰 촉진 작용을 가지며, 상기 개조 방식과 조합하면 더욱 효과를 향상시킬 수 있음을 발견하였다.
그리고, L-히스티딘 합성 경로와 퓨린 뉴클레오티드 합성 경로는 대사물 AICAR 위치에서 커플링되고, 아울러 두 경로가 전구체 물질 PRPP를 공용한다. 본 발명인은 퓨린 뉴클레오티드의 합성에 대하여 촉매 작용을 하는 제1 반응 단계의 효소(아미도포스포리보실 전이효소)의 인코딩 유전자 purF를 약화시키면, 뉴클레오티드 합성과 히스티딘 합성 경로에 대하여 대사 커플링을 진행할 수 있고, 히스티딘 합성 부산물 AICAR을 이용하여 뉴클레오티드를 합성하면 히스티딘 합성 전구체 물질 PRPP의 공급을 증가시킬 수 있을 뿐 아니라, 히스티딘 합성 경로 대사 유동을 증가시켜 L-히스티딘 누적을 촉진시키는 것을 발견하였다. 상기 유전자 개조는 마찬가지로 더욱 L-히스티딘의 수율을 향상시킬 수 있다.
이로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 히스티딘 합성 관련 경로 중의 다수의 타겟에 대하여 조합 개조를 진행하여 L-히스티딘의 누적을 효과적으로 구현하였다. 그리고, 히스티딘 합성 경로를 개조시킴과 아울러, 히스티딘 합성 경로와 뉴클레오티드 합성 경로를 커플링시켜, 히스티딘 합성과 뉴클레오티드 합성의 커플링 노드 AICAR을 효과적으로 이용하여 퓨린 뉴클레오티드의 경로를 생성하고 합성 전구체 PRPP을 절약함으로써, 히스티딘을 합성하기 위하여 더욱 많은 전구체 물질 PRPP와 ATP를 제공하여, 더욱 L-히스티딘의 누적을 증가시킨다.
정의:
본 명세서에서 언급되는 "시작균(starting bacteria)"(또는 본 명에서 기저균(base bacteria)라고도 함)은 본 발명의 유전자 개조 방식에 이용되는 초기 균주를 말한다. 상기 균주는 천연적으로 존재하는 균주일 수도 있고, 또는 돌연변이 또는 유전공학 개조 등 방식을 통하여 형성된 것일 수도 있다. 어떠한 L-아미노산(예를 들면 L-히스티딘)을 생산하는 공정균을 구성하기 위하여, 상기 시작균은 상기 L-아미노산(예를 들면 L-히스티딘)을 누적시킬 수 있는 균주인 것이 바람직하다.
본 명세서에서 언급되는 "원시균(original bacteria)"은 아무런 유전공학 개조도 거치지 않은 균주를 말하는 바, 자연계에 존재하는 균주일 수도 있고, 또는 인공 돌연변이를 통하여 형성된 균주일 수도 있다.
본 명세서에서 언급되는 "상동성(homology)"은 DNA의 뉴클레오티드 서열 또는 단백질의 아미노산 서열 사이의 유사도를 말하는 바, 아울러 본 명세서에서 말하는 (일정한 수준의) 상동성을 갖는 DNA에 의하여 인코딩된 단백질은 적어도 본 발명의 기능에 사용되는 방면에서 동일하거나 더욱 훌륭한 활성을 가지며, 마찬가지로 (일정한 수준의) 상동을 가지는 단백질은 본 발명의 기능에 사용되는 방면에서 동일하거나 더욱 훌륭한 활성을 가진다. 예를 들면, hisG 유전자와 세 돌연변이를 거친 hisGfbr 유전자는 높은 유사도를 가지며, 그 중에서 전자는 ATP-포스포리보실 전이효소를 인코딩하고, 후자는 히스티딘 피드백 억제 조절이 해제된 ATP-포스포리보실 전이효소를 인코딩하며, 이 두 효소는 전반적으로 보면 기능과 활성이 조금 다르지만, 본 발명의 "히스티딘 합성의 제1 단계 촉매 효소"의 기능 면에서는 양자가 동일하기 때문에, hisG 유전자와 hisG fbr 유전자 및 양자에 의하여 인코딩되는 효소는 각각 본 발명의 의미상의 상동성을 가지는 DNA와 단백질에 속한다. 이들은 모두 본 발명의 보호범위에 속한다 하여야 할 것이다.
본 명세서에서 언급되는 방법 중의 각 단계의 실행 순서는 특별한 설명이 있는 것을 제외하고, 본 명세서에서의 순서에 제한되지 않는 바, 즉 각 단계의 실행 순서는 변화될 수 있고, 두 단계 사이에 수요에 따라 기타 단계를 증가시킬 수 있다.
아래, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명에 대하여 더욱 상세한 설명을 진행하도록 한다. 하기 실시예 중에 이용되는 실험 방법은 특수한 설명이 있는 것을 제외하고는 모두 일반적인 방법이다. 하기 실시예 중에 이용되는 재료, 시제 등은 특수한 설명이 있는 것을 제외하고 모두 상업 경로를 통하여 취득할 수 있다.
특별한 설명이 없는 한, 실시예 중에 이용되는 기술수단은 모두 당업계 기술자들이 숙지하고 있는 일반적인 수단인 바, "분자 클론 실험 지침(제3판)"(과학출판사), "미생물학 실험(제4판)"(고등교육출판사) 및 상응한 기기와 시제의 업체 설명서를 참조할 수 있다. 실시예 중에 이용되는 기기와 시제는 시중의 일반적인 기기와 시제이다. 아래 실시예 중의 정량적 실험은 모두 3번 중복 실험을 진행하고 결과는 평균치를 취한다.
실시예
1 : L-히스티딘 기저
공정균
CG160
의 취득
본 발명의 전단계 연구에 의하여, 본 실시예는 야생형 Corynebacterium glutamicum ATCC13032에 대하여 히스티딘 합성을 향상시키는 개조를 진행하여 본 발명의 상기 다수의 타겟의 개조를 진행하는 기저균을 취득한다. 우선, hisEG와 hisDCB(두 개의 히스티딘 합성 유전자 오페론)의 프로모터를 Corynebacterium glutamicum 내생성의 강한 프로모터 P glyA (서열 7 중의 5’ 말단 제863-1038번 뉴클레오티드 서열이 보여주는 바와 같거나, 또는 서열 8 중의 5’ 말단 제752-927번 뉴클레오티드 서열이 보여주는 바와 같음)로 교체시키고(Zhang, Y., Shang, X., Lai, S., Zhang, G., Liang, Y., Wen, T., 2012. Development and application of an arabinose-inducible expression aystem by facilitating inducer uptake in Corynebacterium glutamicum. Appl Environ Microbiol. 78, 5831-5838.), 아울러 hisE와 hisD 유전자의 리보솜 결합 사이트(RBS)를 Corynebacterium glutamicum 높은 발현 유전자의 보수 RBS 서열(AAAGGAGGA)(서열 7 중의 5’ 말단 제1039-1047번 뉴클레오티드 서열이 보여주거나, 또는 서열 8 중의 5’ 말단 제928-936번 뉴클레오디트 서열이 보여주는 바와 같음)로 교체하여, 이 두 히스티딘 합성 유전자 오페론의 전사와 번역의 약화된 조절을 제거하고, hisE 유전자의 초기 코돈 GTG를 ATG(서열 7 중의 5’ 말단 제1053-1055번 뉴클레오티드 서열이 보여주는 바와 같음)로 교체하여 이의 발현을 향상시킨다. 이어, 히스티딘 합성 경로의 핵심 속도 제한 효소와 ATP-포스포리보실 전이효소(HisG, 서열 6에서 보여주는 바와 같음)의 인코딩 유전자 hisG를 세 아미노산 돌연변이를 포함하는 hisG fbr 유전자(서열 4 중의 5’단 제1007-1852번 뉴클레오티드 서열이 보여주는 바와 같음)로 교체하여, 히스티딘의 해당 효소에 대한 피드백 억제 조절을 제거함으로써 해당 효소의 촉매 활성을 향상시킨다(Zhang, Y., Shang, X., Deng, A., Chai, X., Lai, S., Zhang, G., Wen, T., 2012. Genetic and biochemical characterization of Corynebacterium glutamicum ATP phosphoribosyltransferase and its three mutants resistant to feedback inhibition by histidine. Biochimie. 94, 829-838.).
1.
Corynebacterium
glutamicum
야생형
ATCC13032
중의 L-히스티딘 합성
오
페론 프로모터를 강한 프로모터
P
glyA
로 교체
Genbank 중의 Corynebacterium glutamicum ATCC13032의 hisEG 오페론 및 이의 업/다운 스트림 서열과 P glyA 프로모터에 의하여 각각 프라이머를 디자인한다.
Corynebacterium glutamicum ATCC13032 게놈 DNA를 템플릿으로 하고, P1과 P2를 프라이머로 하여 hisEG 오페론 프로모터 업 스트림 상동 암을 PCR 증폭시키며; P3과 P4를 프라이머로 하여 프로모터 P glyA 를 증폭시키며; P5와 P6을 프라이머로 하여 hisEG 프로모터 다운 스트림 상동 암을 증폭시킨다. 이어 정제된 상기 PCR 생성물을 템플릿으로 하고, P1과 P6을 프라이머로 하여 중첩 확대 PCR 기술(SOE)을 이용하여 증폭을 진행하여 1920 bp의 PCR 생성물 취득하여, 교체할 프로모터 P glyA 및 교체될 프로모터 P hisEG 를 포함하는 업/다운 스트림 상동 암의 세그먼트(서열 7)로 한다.
그 중에서, 서열 7의 5’ 말단 제1-862번 뉴클레오티드는 교체될 프로모터 P hisEG 의 업 스트림 상동 암이고, 서열 7의 5’ 말단 제863-1038번 뉴클레오티드는 프로모터 P glyA 이며, 서열 7의 5’ 말단 제1053-1920번 뉴클레오티드는 교체될 프로모터 P hisEG 의 다운 스트림 상동 암이다.
상기 1920 bp의 PCR 생성물에 대해 Xba I과 BamH I 이중 효소 절단한 후, 마찬가지로 이중 효소 절단을 거친 상동 재조합 벡터 pK18mobsacB(미국의 균주보관기관 ATCC로부터 구입, 상품 번호 87097)와 연결시킨다. 연결 생성물을 화학 전환법을 통하여 대장간균 DH5α로 변형시키고, 카나마이신(50 μg/mL)이 항유된 LB 플레이드 상에서 형질전환체를 스크리닝하고, 형질전환체를 3 세대 서브 배양한 후, P13과 P14를 프라이머로 하여 세균 집락 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 2132 bp의 양성 형질전환체를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하고 또한 플라스미드에 대하여 Xba I와 BamH I 이중 효소 절단을 진행하여 양성 1920 bp를 취득한다.
양성 플라스미드에 대하여 서열 측정을 진행하는 바, 결과적으로 해당 플라스미드는 서열표 중의 서열 7가 보여주는 뉴클레오티드를 벡터 pK18mobsacB 중에 삽입하여 취득한 재조합 플라스미드이며, pK18mobsacB-P glyA ::P hisEG 라 명한다.
동일한 방법을 이용하여 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB - P glyA ::P hisDCB 를 구성하는 바, 구체적으로는 P7과 P8을 프라이머로 hisDCB 오페론 프로모터 업 스트림 상동 암을 증폭시키며; P9와 P10을 프라이머로 하여 프로모터 P glyA 를 증폭시키며; P11과 P12를 프라이머로 하여 hisDCB의 프로모터의 다운 스트림 상동 암을 증폭시킨다. P7과 P12를 프라이머로 하여 중첩 확대 PCR 기술(SOE)을 이용하여 증폭시킨다. 취득한 1694 bp의 PCR 생성물은 교체할 프로모터 P glyA 및 교체될 프로모터 P hisDCB 를 포함하는 업/다운 스트림 상동 암의 긴 세그먼트(서열 8)이고, 그 중에서, 서열 8의 5’ 말단 제1-751번 뉴클레오티드는 교체될 프로모터 P hisDCB 의 업 스트림 상동 암이고, 서열 8의 5’ 말단 제752-927번 뉴클레오티드는 프로모터 P glyA 이며, 서열 8의 5’ 말단 제942-1694번 뉴클레오티드는 교체될 프로모터 P hisDCB 의 다운 스트림 상동 암이다.
상기 1694 bp의 PCR 생성물에 대해 Hind III과 BamH I 이중 효소 절단한 후, 마찬가지로 이중 효소 절단을 거친 상동 재조합 벡터 pK18mobsacB와 연결시킨다. 연결 생성물을 화학 전환법을 통하여 대장간균 DH5α로 변형시키고, 카나마이신(50 μg/mL)이 항유된 LB 플레이드 상에서 형질전환체를 스크리닝하고, 형질전환체를 3 세대 서브 배양한 후, P13과 P14를 프라이머로 하여 콜로니 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 1906 bp의 양성 형질전환체를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하고 또한 플라스미드에 대하여 Hind III과 BamH I 이중 효소 절단을 진행하여 양성 1694 bp를 취득한다. 양성 플라스미드에 대하여 서열 측정을 진행하는 바, 결과적으로 해당 플라스미드는 서열표 중의 서열 5가 보여주는 뉴클레오티드를 벡터 pK18mobsacB 중에 삽입하여 취득한 재조합 플라스미드이며, pK18mobsacB-P glyA ::P hisDCB 라 명한다.
상기 이용되는 프라이머 서열은 하기와 같다.
P1: GCTCTAGAGTATCGGCGTGGAGTTGTC(Xba I)(서열 21)
P2: TAGTGGAGTAGCTTTATTTTGCGACACCTGCC(서열 22)
P3: GTCGCA AAATAAAGCTACTCCACTAGTGTGATCG(서열 23)
P4: GGTTCCTCCTTTGCGTAAGACCTCACTCGC(서열 24)
P5: GAGGTCTTACGCAAAGGAGGAACCGAATGAAGACATTTGA(서열25)
P6: CGCGGATCCCAGGATCTGCTGCTCTGG(BamH I)(서열 26)
P7: CCCAAGCTTCGAGGAAACCGTTGAGGA(Hind III)(서열 27)
P8: TAGTGGAGTAGCTATGGATTTCACCTCTGTGAATG(서열 28)
P9: TCTCCACTTTAGGTAAGCTACTCCACTAGTGTGATCG(서열 29)
P10: CGATCCTCCTTTGCGTAAGACCTCACTCGC(서열 30)
P11: GAGGTCTTACGCAAAGGAGGATCGCCATGTTGAATGTC(서열 31)
P12: CGCGGATCCGGCAGAGGCATCAGCAAG(BamH I)(서열 32)
P13: ATGTGCTGCAAGGCGATTAA(서열 33)
P14: ATGCTTCCGGCTCGTATGT(서열 34)
P15: TTTTATATATGGGTATCGGCGGTCTATGCT(서열 35).
서열 측정이 정확한 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB - P glyA ::P hisEG 를 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 중에 전기적으로 전환한다. 카나마이신 저항성 순방향 스크리닝을 통하여 재조합 플라스미드를 취득하여 염색체 상의 세균 집락에 통합한다. 자당 역방향 스크리닝을 통하여 2회 상동 재조합이 발생한 양성 세균 집락을 취득한다. 양성 세균 집락에 대하여 P15와 P6을 프라이머로 하여 PCR 증폭 검증을 진행하여 재조합균으로서의 948 bp를 취득하며, Corynebacterium glutamicum WT-P glyA ::P hisEG 로 명한다.
서열 측정이 정확한 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB-P glyA ::P hisDCB 를 Corynebacterium glutamicum WT-P glyA ::P hisEG 중에 전기적으로 전환한다. 카나마이신 저항성 순방향 스크리닝을 통하여 재조합 플라스미드를 취득하여 염색체 상의 세균 집락에 통합한다. 자당 역방향 스크리닝을 통하여 2회 상동 재조합이 발생한 양성 세균 집락을 취득한다. 양성 세균 집락에 대하여 P15와 P12를 프라이머로 하여 PCR 증폭 검증을 진행하여 재조합균으로서의 833 bp를 취득하며, Corynebacterium glutamicum CG158(WT-P glyA ::P hisEG -P glyA ::P hisDCB )로 명한다.
재조합균의 게놈 DNA에 대하여 추출 및 서열 측정을 진행하면, 결과적으로 성공적으로 Corynebacterium glutamicum 야생형 ATCC13032 중의 hisEG와 hisDCB의 프로모터를 모두 Corynebacterium glutamicum 내생성의 강한 프로모터 P glyA 로 교체하였고, hisE와 hisD 유전자의 RBS를 Corynebacterium glutamicum 높은 발현 유전자의 보수 RBS 서열(AAAGGAGGA)로 교체하였으며, hisE 유전자의 초기 코돈 GTG을 높은 발현 강도의 ATG로 교체하였고, Corynebacterium glutamicum CG158(WT-P glyA ::P hisEG -P glyA ::P hisDCB ) 구성에 성공하였다.
2.
염색체 상의
유전자
hisG
의 부위 지정 돌연변이로 L-히스티딘 기저
공정
균 CG160 취득
염색체 hisG 유전자의 부위 지정 돌연변이는 두 단계 교체의 방법을 이용하여 동시에 상기 유전자의 3개 부위 지정 돌연변이를 구현하는 바, 우선 서열표 중의 서열 9가 보여주는 클로람페니콜 저항성 유전자 Cmr 및 hisG 유전자 돌연변이 세그먼트 업/다운 스트림 상동 암을 포함하는 긴 세그먼트와 CG158 상동 재조합시켜 재조합균 WT-P glyA ::P hisEG - Cmr::hisG-P glyA ::P hisDCB 를 취득하며; 다시 서열표 중의 서열 10이 보여주는 세 점의 돌연변이를 포함하는 hisG 유전자 말단 264 bp 세그먼트 및 업/다운 스트림 상동 암의 긴 세그먼트와 재조합균 WT-P glyA ::P hisEG - Cmr::hisG-P glyA ::P hisDCB 를 상동 재조합하여 CG160을 취득한다.
구체적으로 하기와 같다.
Corynebacterium glutamicum ATCC13032 게놈 DNA를 템플릿으로 하고, P16과 P17을 프라이머로 하여 hisG 유전자 돌연변이 세그먼트의 업 스트림 상동 암의 PCR 증폭을 진행하고, P18과 P19를 프라이머로 하여 hisG 유전자 돌연변이 세그먼트의 다운링크 스트림 상동 암을 증폭시키며; P20과 P21을 프라이머로 하고, 플라스미드 pXMJ19(Biovector Science Lab,Inc로부터 구매함, 상품 번호 SMD1168H)를 템플릿으로 하여, 클로람페니콜 저항성 유전자 Cmr을 증폭시킨다. 다시 정제된 상기 PCR 생성물을 템플릿으로 하고, P16과 P21을 프라이머로 하여, 중첩 확대 PCR 기술(SOE)을 이용하여 증폭을 진행하여 1689 bp의 클로람페니콜 저항성 유전자 Cmr 및 hisG 유전자 돌연변이 세그먼트 업/다운 스트림 상동 암을 포함하는 긴 세그먼트(서열 9)를 취득한다.
그 중에서, 서열 9의 5’ 말단 제1-420번 뉴클레오티드는 hisG 유전자 돌연변이 세그먼트 업 스트림 상동 암이고, 서열 9의 5’ 말단 제421-1281번 뉴클레오티드는 클로람페니콜 저항성 유전자 Cmr이며, 서열 9의 5’ 말단 제1282-1689번 뉴클레오티드는 hisG 유전자 돌연변이 세그먼트 다운 스트림 상동 암이다.
Corynebacterium glutamicum ATCC13032 게놈 DNA를 템플릿으로 하고, P28과 P29를 프라이머로 하여 C645G(제215번의 아스파라진이 라이신으로 변함) 돌연변이 로커스가 포함된 hisG 유전자 세그먼트를 증폭시키고, P30과 P31을 프라이머로 하여 A693C와 A703G(제231번의 류신이 페닐알라닌으로 변하고, 제235번의 트레오닌이 알라닌으로 변함) 돌연변이 로커스가 포함된 hisG 세그먼트를 증폭시키며, 다시 정제된 상기 PCR 생성물을 템플릿으로 하고, P28과 P31을 프라이머로 하여 중첩 확대 PCR 기술(SOE)을 이용하여 증폭을 진행하여 846 bp의 세 점의 돌연변이를 포함하는 hisG 유전자(서열 4의 5’ 말단 제1007-1852번 뉴클레오티드)를 취득한다. P16과 P22를 프라이머로 하여 hisG 유전자 부위 지정 돌연변이의 업 스트림 상동 암의 PCR 증폭을 진행하고, P25와 P21을 프라이머로 하여 hisG 유전자 부위 지정 돌연변이의 다운 스트림 상동 암을 증폭시키며; P23과 P24를 프라이머로 하고, 상기 취득한 세 점의 돌연변이를 포함하는 hisG 유전자를 템플릿으로 하여, 세 점의 돌연변이를 포함하는 hisG 유전자 말단 264 bp 세그먼트를 증폭시킨다. 다시 정제된 상기 PCR 생성물을 템플릿으로 하고, P16과 P21을 프라이머로 하여, 중첩 확대 PCR 기술(SOE)을 이용하여 증폭을 진행하여 1092 bp의 세 점의 돌연변이를 포함하는 hisG 유전자 말단 264 bp 세그먼트 및 이의 업/다운 스트림 상동 암의 긴 세그먼트(서열 10)를 취득한다.
그 중에서, 서열 10의 5’ 말단 제1-420번 뉴클레오티드는 업 스트림 상동 암이고, 서열 10의 5’ 말단 제421-684번 뉴클레오티드는 세 점 돌연변이의 hisG 유전자 말단 264 bp 세그먼트이며, 서열 10의 5’ 말단 제685-1092번 뉴클레오티드는 다운 스트림 상동 암이다.
정제 회수되는 두 개의 PCR 생성물은 각각 BamH I과 EcoR I 이중 효소 절단을 거친 후, 각각 마찬가지의 이중 효소 절단을 거친 녹아웃 벡터 pK18mobsacB와 연결된다. 연결된 생성물을 화학 전환법을 통하여 대장간균 DH5α로 변형시키고, 카나마이신(50 μg/mL)이 항유된 LB 플레이드 상에서 형질전환체를 스크리닝하고, 형질전환체를 3 세대 서브 배양한 후, P13과 P14를 프라이머로 하여 세균 집락 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 1901 bp와 1304 bp인 각각 두 가지 재조합 플라스미드를 휴대하는 양성 형질전환체를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하고 또한 플라스미드에 대하여 BamH I과 EcoR I 이중 효소 절단을 진행하여 각각 두 가지 재조합 플라스미드인 1689 bp와 1092 bp를 취득한다. 나아가 서열 측정 검증을 거쳐, 재조합 플라스미드 pK18mobsacB-Cmr::hisG와 pK18mobsacB-hisG fbr ::Cmr의 구성에 성공한다.
pK18mobsacB-Cmr::hisG는 클로람페니콜 저항성 유전자 Cmr 및 hisG 유전자 돌연변이 세그먼트 업/다운 스트림 상동 암을 포함하는 긴 세그먼트(서열 9)를 벡터 pK18mobsacB 중에 삽입하여 취득한 재조합 벡터이다.
pK18mobsacB-hisG fbr ::Cmr는 세 점의 돌연변이를 포함하는 hisG 유전자 말단 264 bp 세그먼트 및 이의 업/다운 스트림 상동 암의 긴 세그먼트(서열 10)을 벡트 pK18mobsacB 중에 삽입하여 취득한 재조합 벡터이다.
상기 이용되는 프라이머 서열은 하기와 같다.
P16: CGCGGATCCATCTACGTTGCTGGTGGC(BamH I)(서열 36)
P17: ACGGGCAACAGCTGCTGCTCTGGGGTGAC(서열 37)
P18: CAGAGCAGCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGT(서열 38)
P19: GGTAGTTAAAATTACGCCCCGCCCTGCCACT(서열 39)
P20: GCGGGGCGTAATTTTAACTACCCCCGAAAAT(서열 40)
P21: CCGGAATTCCGAATGAAATCTGGGACG(EcoR I)(서열 41)
P22: CGAAGCAGGATCTGCTGCTCTGGGGTGAC(서열 42)
P23: CAGAGCAGCAGATCCTGCTTCGCCGCATCCA(서열 43)
P24: GGTAGTTAAAACTAGATGCGGGCGATGCG(서열 44)
P25: CCCGCATCTAGTTTTAACTACCCCCGAAAAT(서열 45)
P26: TCCCAAACAAAGGCTCGC(서열 46)
P27: CAGTCGGCGGTTTGCTAA(서열 47)
P28: ATGTTGAAAATCGCTG(서열 48)
P29: TTACTGCAGTGGCAGCGTCCAGGTTGTCGCGGTCGACCTTGTAATCCAGCAT(서열 49)
P30: ACCTGGACGCTGCCACTGCAGTAACCCCAGGCTTCTCCGGCCCAGCGGTATC(서열 50)
P31: CTAGATGCGGGCGATGCGG(서열 51).
서열 측정이 정확한 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB-Cmr::hisG를 Corynebacterium glutamicum CG158 중에 전기적으로 전환하고, 카나마이신 저항성 순방향 스크리닝을 통하여 재조합 플라스미드를 취득하고 염색체 상의 세균 집락에 통합한다. 자당 역방향 스크리닝을 통하여 2회 상동 재조합이 발생한 양성 세균 집락을 취득한다.
P26과 P27을 프라이머로 하여 양성 균에 대하여 PCR 증폭 검증을 진행하여 1872 bp의 재조합균 WT-P glyA ::P hisEG -Cmr::hisG-P glyA ::P hisDCB 를 취득한다.
서열 측정이 정확한 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB-hisG fbr ::Cmr를 상기 구성된 재조합균 WT-P glyA ::P hisEG - Cmr::hisG-P glyA ::P hisDCB 중에 전기적으로 전환하고, 카나마이신 저항성 순방향 스크리닝을 통하여 재조합 플라스미드를 취득하여 염색체 상의 세균 집락에 통합한다. 자당 역방향 스크리닝을 통하여 2회 상동 재조합이 발생한 양성 세균 집락을 취득한다.
P26과 P27을 프라이머로 하여 양성 균에 대하여 PCR 증폭 검증을 진행하여 1275 bp의 재조합균을 취득하고, Corynebacterium glutamicum CG160(WT-P glyA ::P hisEG -hisG fbr -P glyA ::P hisDCB )으로 명한다.
재조합균의 게놈 DNA에 대하여 추출 및 서열 측정을 진행하면, 결과적으로 성공적으로 Corynebacterium glutamicum CG158의 염색체 hisG 유전자의 N215K/L231F/T235A 점 돌연변이에 성공하고, Corynebacterium glutamicum CG160(WT-P glyA ::P hisEG -hisG fbr -P glyA ::P hisDCB ) 구성에 성공하였다.
상기 hisG 유전자의 N215K/L231F/T235A 점 돌연변이는 hisG 유전자에 의하여 인코딩되는 ATP-포스포리보실 전이효소(HisG)의 제215번의 아스파라진을 라이신으로 돌연변이시키고, 제231번의 류신이 페닐알라닌으로 돌연변이시키며, 제235번의 트레오닌이 알라닌으로 돌연변이시키는 것이다.
실시예
2 : 플라스미드를 포함하는 높은 수율의 L-히스티딘의
재조합균
CG171의 구성
본 실시예에 있어서, 실시예1에서 취득한 프라이머리 공정균의 기초 상에서, 나아가 prsA 유전자를 과도 발현시킴과 아울러, hisG fbr 유전자(서열 4의 제1007-1852번 뉴클레오디드 서열)를 과도 발현시킨 후, pgi 유전자(서열 13)를 녹아웃하는 것과 zwf - opcA 유전자(서열 2)를 과도 발현시키는 개조를 조합시켜 높은 수율의 공정균 CG171를 취득한다.
1. L-히스티딘
프라이머리
공정균
CG176
의 구성
prsA 유전자는 PRPP 합성 효소(PrsA, 서열 5가 보여주는 바와 같으며, PRPP는 히스티딘 합성의 전구체 물질)를 인코딩하고, prsA 유전자의 발현을 향상시켜 히스티딘 합성 전구체 PRPP의 합성을 증가시키고, 히스티딘 합성을 위하여 더욱 많은 전구체 물질을 제공한다.
실시예1에서 취득한 기저 공정균 CG160의 기초 상에서, prsA 유전자(서열 4 중의 5’ 말단 제15-992번 뉴클레오티드 서열이 보여주는 바와 같음)를 과도 발현시킴과 아울러, hisG fbr 유전자(서열 4 중의 5’ 말단 제1007-1852번 뉴클레오티드 서열이 보여주는 바와 같음)를 과도 발현시켜 비교적 훌륭한 히스티딘 수율을 가지는 프라이머리 공정균 CG176를 취득하여 본 발명의 방식을 실시하여 더욱 훌륭한 효과를 얻도록 한다. 당업계의 기술자들은 본 발명의 개조 방식이 본 실시예에서 취득하는 프라이머리 공정균에 대하여 재조합 개조를 진행하는 것에 제한되지 않고, 기타 히스티딘 공정균 중에 이용될 수 있음을 이해하여야 할 것이다.
균주 CG160의 게놈 DNA를 템플릿으로 하고, 각각 P32/P33과 P34/P35를 프라이머로 하여 prsA 유전자(992 bp)와 hisG fbr (860 bp)에 대하여 PCR 증폭을 진행한다. 중첩 확대 PCR를 이용하여 두 유전자를 연결시키고, 증폭된 hisG fbr 과 prsA 유전자를 템플릿으로 하며, P32와 P35를 프라이머로 하여 PCR 증폭을 진행하여 1852 bp의 PCR 새성물인 prsA-hisG fbr 세그먼트(서열 4)를 취득한다.
그 중에서, 서열 4의 5’ 말단 제15-992번 뉴클레오티드는 prsA이고, 서열 4의 5’ 말단 제1007-1852번 뉴클레오티드는 hisG fbr (세 점의 돌연변이를 포함하는 hisG 유전자)이다.
상기 PCR 생성물에 대해 Xba I과 Sma I 이중 효소 절단한 후, 마찬가지로 이중 효소 절단을 거친 Corynebacterium glutamicum-대장간균 셔틀 플라스미드 pXMJ19와 연결시킨다. 연결 생성물을 화학 전환법을 통하여 대장간균 DH5α로 변형시키고, 클로람페니콜(20 μg/mL)이 항유된 LB 플레이드 상에서 형질전환체를 스크리닝하고, 형질전환체를 3 세대 서브 배양한 후, P36과 P37을 프라이머로 하여 세균 집락 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 2054 bp의 양성 형질전환체를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하고 또한 플라스미드에 대하여 Xba I과 Sma I 이중 효소 절단을 진행하여 양성 1852 bp를 취득한다.
pXMJ19-prsA-hisG fbr 는 나아가 서열 측정 분석을 거치는 바, 해당 플라스미드는 prsA-hisG fbr 세그먼트(서열 4)를 플라스미드 pXMJ19의 Xba I과 Sma I 효소 사이트 사이에 삽입하여 벡터 pXMJ19-prsA-hisG fbr 를 취득하는 바, 재조합 플라스미드 pWYE 1230(도 1 참조)로 명한다.
플라스미드 pXMJ19-prsA-hisG fbr 을 상기 구성된 기저 공정균 CG160 중으로 전환시키고, P36과 P37을 프라이머로 하며, 세균 집락 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 2054 bp의 양성 형질전환체를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하여 검증하여, 더욱 과도 발현 플라스미드를 성공적으로 공정균 중에 전환시켜 L-히스티딘 공정균 CG176(WT-P glyA ::P hisEG -hisG fbr -P glyA ::P hisDCB /pXMJ19-prsA-hisG fbr )의 구성에 성공하였다.
상기 이용되는 프라이머 서열은 하기와 같다.
P32: GCTCTAGAAAAGGAGGATCCTCATGACTGCTCACTGG(Xba I)(서열 52)
P33: TTGTCCTCCTTTTTAGGCCTCGCCCTCGAA(서열 53)
P34: GGCGAGGCCTAAAAAGGAGGACAATCATGTTGAAAATCGCTG(서열 54)
P35: TCCCCCGGGCTAGATGCGGGCGATGCGG(Sma I)(서열 55)
P36: CAATTAATCATCGGCTCGTA(서열 56)
P37: ACCGCTTCTGCGTTCTGATT(서열 57).
2. L-히스티딘
프라이머리
공정균
CG161
와
CG172
의 취득
pgi 유전자는 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제(Pgi, 서열 14에서 보여주는 바와 같음)를 인코딩한다. 상기 취득한 기저균 160의 기초 상에서, pgi 유전자(서열 13)를 녹아웃시켜 프라이머리 공정균 CG161을 취득하며; CG161의 기초 상에서, prsA 유전자를 과도 발현시킴과 아울러, hisG fbr 유전자를 과도 발현시켜 pgi 유전자를 녹아웃시킨 공정균 CG172를 취득하였다.
프라이머리 공정균 CG161은 L-히스티딘 기저 공정균 CG160 중의 pgi 유전자(서열 13)를 녹아웃시켜 취득한 것으로서, 구체적으로는 하기와 같다.
우선, Genbank 중의 Corynebacterium glutamicum ATCC13032의 pgi 유전자 및 이의 업/다운 스트림 서열에 의하여 각각 프라이머를 디자인한다.
Corynebacterium glutamicum ATCC13032 게놈 DNA을 템플릿으로 하고, P38과 P39를 프라이머로 하여 PCR을 통하여 pgi 유전자 업 스트림 상동 암을 증폭시키며; P40과 P41을 프라이머로 하여 pgi 유전자 다운 스트림 상동 암을 증폭시킨다. 이어 정제된 상기 PCR 생성물을 템플릿으로 하고, P38과 P41을 프라이머로 하여 중첩 확대 PCR 기술(SOE)을 이용하여 증폭을 진행하여 1672 bp의 녹아웃하고자 하는 유전자 pgi의 업/다운 스트림 상동 암을 포함하는 세그먼트(서열 1)를 취득한다.
그 중에서 서열 1의 5’ 말단 제1-834번 뉴클레오티드는 녹아웃하고자 하는 유전자 pgi의 업스트림 상동 암이고, 서열 1의 5’ 말단 제2835-1672번 뉴클레오티드는 녹아웃하고자 하는 유전자 pgi의 다운스트림 상동 암이다.
정제 회수되는 PCR 생성물은 각각 BamH I과 EcoR I 이중 효소 절단을 거친 후, 마찬가지의 이중 효소 절단을 거친 상동 재조합 벡터 pK18mobsacB와 연결된다. 연결 생성물을 화학 전환법을 통하여 대장간균 DH5α로 변형시키고, 카나마이신(50 μg/mL)이 함유된 LB 플레이드 상에서 형질전환체를 스크리닝하고, 형질전환체를 3 세대 서브 배양한 후, P13과 P14를 프라이머로 하여 세균 집락 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 양성 형질전환체로서의 1884 bp를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하고 또한 플라스미드에 대하여 BamH I과 EcoR I 이중 효소 절단을 진행하여 양성인 1672 bp를 취득한다. 나아가 서열 측정 검증을 거쳐 재조합 플라스미드 pK18mobsacB-Δpgi의 구성에 성공하는 바, 이는 녹아웃하고자 하는 유전자 pgi의 업/다운 스트림 상동 암을 포함하는 세그먼트(서열 1)를 벡터 pK18mobsacB의 BamH I과 EcoR I 효소 절단 사이트 사이에 삽입하여 취득한 벡터이다.
상기 이용되는 프라이머 서열은 하기와 같다.
P38: CGCGGATCCGCTCTTTCGGAGTGACCT(BamH I)(서열 58)
P39: TAAGCAAGCGAGAAAACTCCTTTATTGTCG(서열 59)
P40: TAAAGGAGTTTTCTCGCTTGCTTATAGGGTC(서열 60)
P41: CCGGAATTCTCGGGAAGCAGTTAGTGAAA(EcoR I)(서열 61)
P42: TTGACGACGCAAGAGCCA(서열 62)
P43: CACCATTACCGATGAGAAAC(서열 63).
서열 측정이 정확한 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB-Δpgi를 Corynebacterium glutamicum CG160 중에 전기적으로 전환하고, 카나마이신 저항성 순방향 스크리닝을 통하여 재조합 플라스미드를 통합하여 염색체 상의 세균 집락을 취득하며 자당 역방향 스크리닝을 통하여 제2회 상동 재조합이 발생한 세균 집락을 취득한다. P42와 P43을 프라이머로 하여 세균 집락에 대하여 게놈 DNA 추출 및 PCR 증폭 검증을 진행하여 양성인 1759 bp를 취득하고(도 2 참조), CG161(WT-P glyA ::P hisEG -hisG fbr -P glyA ::P hisDCB -Δpgi)로 명한다.
CG161(WT-P glyA ::P hisEG - hisG fbr - P glyA ::P hisDCB -Δpgi)는 나아가 서열 측정 분석을 진행하는 바, 결과적으로 L-히스티딘 기저 공정균 CG160의 염색체 pgi 유전자 녹아웃에 성공하고, CG161 구성에 성공하였다.
공정균 CG172은 플라스미드 pXMJ19-prsA-hisG fbr 을 공정균 CG161에 도입하여 취득한 재조합균(WT-P glyA ::P hisEG - hisG fbr - P glyA ::P hisDCB -Δpgi/pXMJ19-prsA-hisG fbr )이다. 구체적인 조작 방법은 일반적인 방법이기 때문에 여기에서는 설명을 생략하도록 한다.
3. L-히스티딘 높은 수율
공정균
CG171
및 대조로서의
공정균
CG173
의 구성
zwf - opcA 유전자는 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제(Zwf-OpcA, 서열 3에서 보여주는 바와 같으며, 그 중에서 5’ 말단 제1-514번 아미노산이 Zwf 서브 유닛을 구성하고, 제515-833번 아미노산 잔기가 OpcA 서브 유닛을 구성함)를 인코딩한다. pgi 유전자를 녹아웃시키는 것과 zwf - opcA 유전자(서열 2)를 과도 발현시키는 것을 조합하여 개조를 진행하여 높은 수율의인 공정균 CG171를 취득하였다. 대조로서, pgi 유전자를 녹아웃시키지 않았으나, zwf - opcA 유전자를 과도 발현시킨 공정균 CG173을 취득하였다.
Genbank 중의 Corynebacterium glutamicum ATCC13032의 zwf - opcA 유전자 서열에 의하여 프라이머를 디자인하고, Corynebacterium glutamicum ATCC13032의 게놈 DNA를 템플릿으로 하고, P44와 P45를 프라이머로 이용하고 PCR을 통하여 2519 bp의 zwf - opcA 세그먼트(zwf 유전자의 초기 코돈은 GTG로부터 ATG로 교체되어 이의 발현을 향상시킴)(서열 2)를 증폭시킨다. Hind III과 Xba I 이중 효소 절단을 거친 후, 우선 마찬가지로 이중 효소 절단 처리를 거친 발현 플라스미드 pXMJ19와 연결시켜 재조합 플라스미드 pXMJ19-zwf - opcA를 취득하며, pXMJ19-zwf - opcA는 다시 Xba I과 Sma I 이중 효소 절단을 거친 후, 상기 제조된 플라스미드 pXMJ19-prsA - hisG fbr 이 Xba I과 Sma I 이중 효소 절단을 거쳐 취득한 1852 bp의 prsA - hisG fbr 세그먼트와 연결된다.
zwf - opcA 세그먼트에 있어서 그 중의 서열 2의 5’ 말단 제1-1545번 뉴클레오티드는 zwf 유전자이고, 서열 2의 5’ 말단 제1560-2519번 뉴클레오티드는 opcA 유전자이다.
연결 생성물을 화학 전환법을 통하여 대장간균 DH5α로 변형시키고, 클로람페니콜(20 μg/mL)이 함유된 LB 플레이드 상에서 형질전환체를 스크리닝하고, 형질전환체를 3 세대 서브 배양한 후, P36과 P37을 프라이머로 하여 세균 집락 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 4587 bp의 양성 형질전환체를 취득한다. 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하고 또한 플라스미드에 대하여 Xba I/Sma I과 Hind III/Xba I 이중 효소 절단을 진행하여 각각 1852 bp와 2533 bp의 양성을 취득한다.
서열 측정을 통하여 검증을 거쳐 재조합 플라스미드는 pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisG fbr 의 구성에 성공하고, pWYE 1229(도 3 참조)로 명하며, 이는zwf-opcA 유전자(서열 2)을 pXMJ19의 Hind III과 Xba I 사이에 삽입하고, 또한 prsA-hisG fbr 세그먼트(서열 4)를 Xba I과 Sma I 사이에 삽입하여 취득한 벡터이다.
P44: CCCAAGCTTAAAGGAGGACCATCATGAGCACAAACACGACCCCCT(Hind III)(서열 64)
P45: GCTCTAGATTAGACGGTTTCCAGCTTG(Xba I)(서열 65)
재조합 플라스미드 pXMJ19-zwf - opcA - prsA - hisG fbr 을 각각 pgi 결실되지 않은 공정균 CG160와 pgi 결실된 공정균 CG161 중으로 전기 전환한다. P36과 P37을 프라이머로 하고, 세균 집락 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 4587 bp의 양성 형질전환체를 취득하고, 정확하다고 검증된 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출한다.
서열 측정을 진행하고, L-히스티딘 공정균 CG173(WT-P glyA ::P hisEG -hisG fbr -P glyA ::P hisDCB / pXMJ19-zwf - opcA - prsA - hisG fbr )에는 플라스미드 재조합 플라스미드 pXMJ19-zwf - opcA - prsA - hisG fbr 가 포함되고, 이는 재조합 프라스미드 pXMJ19-zwf - opcA - prsA - hisG fbr 를 공정균 CG160에 도입하여 취득한 균이다.
CG171(WT-P glyA ::P hisEG - hisG fbr -P glyA ::P hisDCB -Δpgi/pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisG fbr )에는 플라스미드 재조합 플라스미드 pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisG fbr 가 포함되고, 이는 재조합 프라스미드 pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisG fbr 를 공정균 CG161에 도입하여 취득한 균이다.
나아가 과도 발현 플라스미드 휴대 유전자가 공정균 중에 발현 상황을 검증한다. CG171의 세포 용해액을 제고하여 SDS-PAGE 데스트를 진행하는 바, 결과는 도 4에 도시된 바와 같으며, 여기에서 레인 1과 2는 CG171의 세포 용해액이고, 레인 3은 대조를 위한 것으로서 ATCC13032/pXMJ19(pXMJ19 플라스미드를 ATCC13032 중에 도입하여 취득)의 세포 용해액이며, 과도 발현 플라스미드가 휴대하는 zwf(57.5 kDa), opcA(34.8 kDa) prsA(35.6 kDa)와 hisG fbr (30.2 kDa) 유전자는 공정균 중에서 성공적으로 발현된다.
나아가 공정균 CG171 중의 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제(Zwf-opcA)의 비활성을 측정한다. 측정 반응계는 하기와 같은 바(0.5 mL), 즉 100 mmol/L Tris-HCl (pH 7.8), 200 mmol/L KCl, 1 mmol/L NADP, 10 mmol/L MgCl2, 5 mmol/L 글루코스-6-포스페이트(G6P), 적당량의 세포 용해액이다. 30 ℃에서 5 min 동안 반응시킨다. 340 nm에서의 흡광도의 변화를 측정하는 것을 통하여 생성물 NADPH의 생성량을 반영한다. 효소 활성 단위(U)는 매 분 1 nmol의 환원형 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADPH)를 생성하는 필요한 효소의 량으로 정의된다. 결과는 도5에 도시된 바와 같으며, 야생형 균주에 비하여 플라스미트를 통하여 zwf - opcA를 과도 발현시키는 것을 통하여, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제의 비활성은 34배 향상된다.
실시예
3 : 플라스미드가 포함된 L-히스티딘 높은 수율
공정균
CG319
의 구성
상기 취득한 높은 수율 공정균 CG171의 기초 상에서, 나아가 AICAR 트랜스메칠라제/IMP 환히드라제(PurH, 서열 16이 보여주는 바와 같음)의 purH 유전자를 과도 발현시키기 위하여, 히스티딘 합성 경로가 향상되어 증가되는 부산물 AICAR을 더욱 많이 퓨린 뉴클레오티드 합성 경로로 가이드하여 재조합 플라스미드 pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisG fbr -purH를 구성하고, 또한 프라이머리 균 CG161 중에 도입하여 높은 수율 공정균 CG319를 취득한다.
Genbank 중의 Corynebacterium glutamicum ATCC13032의 purH 유전자 서열에 의하여 프라이머를 디자인하고, ATCC13032 게놈 DNA을 템플릿으로 하고, P46과 P47을 프라이머로 하여 purH 유전자(563 bp)(서열 15)를 PCR 증폭시킨다.
상기 PCR 생성물에 대해 Sma I과 EcoR 이중 효소 절단한 후, 마찬가지로 이중 효소 절단을 거친 Corynebacterium glutamicum-대장간균 셔틀 플라스미드 pXMJ19와 연결시킨다. 연결 생성물을 화학 전환법을 통하여 대장간균 DH5α로 변형시키고, 클로람페니콜(20 μg/mL)이 함유된 LB 플레이드 상에서 형질전환체를 스크리닝하고, 형질전환체를 3 세대 서브 배양한 후, P52와 P53을 프라이머로 하여 세균 집락 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 1779 bp의 양성 형질전환체를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하고 또한 플라스미드에 대하여 Xba I과 Sma I 이중 효소 절단을 진행하여 1577 bp의 양성을 취득하고, 재조합 플라스미드 pXMJ19-purH로 명한다.
재조합 플라스미드 pXMJ19-zwf - opcA - prsA - hisG fbr 을 템플릿으로 하고, 각각 P48/P49와 P50/P51을 프라이머로 하여 zwf-opcA (2519 bp)와 prsA - hisG fbr 세그먼트(1852 bp) PCR 증폭시킨다. 중첩 확대 PCR를 이용하여 두 세그먼트를 연결시켜 4385 bp의 zwf-opcA-prsA-hisG fbr 세그먼트(서열 17)를 취득한다.
그 중에서, 서열 17의 5’ 말단 제15-2533번 뉴클레오티드는 zwf - opcA이고, 서열 17의 5’ 말단 제2534-4385번 뉴클레오티드는 prsA-hisG fbr 이다.
상기 PCR 생성물에 대해 Xba I과 Sma I 이중 효소 절단한 후, 마찬가지로 이중 효소 절단을 거친 재조합 pXMJ19-purH와 연결시킨다. 연결 생성물을 화학 전환법을 통하여 대장간균 DH5α로 변형시키고, 클로람페니콜(20 μg/mL)이 항유된 LB 플레이드 상에서 형질전환체를 스크리닝하고, 형질전환체를 3 세대 서브 배양한 후, P52와 P53을 프라이머로 하여 세균 집락 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 6164 bp의 양성 형질전환체를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하고 또한 플라스미드에 대하여 Xba I과 Sma I 이중 효소 절단을 진행하여 4385 bp의 양성을 취득하고, 재조합 플라스미드 pWYE1507(pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisG fbr -purH)(도 6 참조)로 명한다.
pXMJ19-zwf - opcA - prsA - hisG fbr - purH 나아가 서열 측정 분석을 진행하는 바, 해당 플라스미드는 zwf - opcA - prsA - hisG fbr 세그먼트(서열 17)을 플라스미드 pXMJ19의 Xba I과 Sma I 효소 절단 사이트 사이에 삽입하고, 아울러 purH를 플라스미드 pXMJ19의 Sma I과 EcoR I 효소 절단 사이트 사이에 삽입하여 취득한 벡터이다.
플라스미드 pXMJ19-zwf - opcA - prsA - hisG fbr - purH를 공정균 CG161 중으로 전환시키고, P52와 P53을 프라이머로 하며, 세균 집락 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 6164 bp의 양성 형질전환체를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하여 검증하여, 더욱 과도 발현 플라스미드를 성공적으로 공정균 중에 전환시켜 L-히스티딘 공정균 CG319(WT-P glyA ::P hisEG - hisG fbr - P glyA ::P hisDCB -Δpgi/pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisG fbr -purH)의 구성에 성공하였다.
상기 이용되는 프라이머 서열은 하기와 같다.
P46: TCCCCCGGGAAAGGAGGACCTTCATGAGCGATGATCGTAAG(Sma I)(서열 66)
P47: CCGGAATTCTTAGTGAGCGAAGTGTCGCG(EcoR I)(서열 67)
P48: GCTCTAGAAAAGGAGGACCATCATGAGCACAAACACGACCC(Xba I)(서열 68)
P49: AGTCATGAGGATCCTCCTTTTTAGACGGTTTCCAGCTTG(서열 69)
P50: TCAAGCTGGAAACCGTCTAAAAAGGAGGATCCTCATGACTGCTCACTG(서열 70)
P51: TCCCCCGGGCTAGATGCGGGCGATGCGGATTTC(Sma I)(서열 71)
P52: CAATTAATCATCGGCTCGTA(서열 72)
P53: ACCGCTTCTGCGTTCTGATT(서열 73)
실시예
4 : 플라스미드가 포함된 L-히스티딘 높은 수율
공정균
CG328
의 구성
상기 CG319를 취득한 기초 상에서, 아미도포스포리보실 전이효소(PurF, 서열 19)를 인코딩하는 purF 유전자를 약화시키고, 히스티딘 합성 전구체 물질 PRPP의 히스티딘 합성 경로를 향한 유동을 증가시키기 위하여, 프라이머리 공정균 CG161 중의 purF의 프로모터를 P hom 으로 교체시켜 CG327를 취득하고, 다시 플라스미드 pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisG fbr -purH를 도입하여 높은 수율 공정균 CG328을 취득하였다.
프라이머리 공정균 CG161의 purF 유전자의 프로모터를 P hom 으로 교체시켜 공정균 CG327를 취득하는 것은 구체적으로 하기와 같다.
우선, Genbank 중의 Corynebacterium glutamicum ATCC13032의 purF 유전자 및 이의 업/다운 스트림 서열에 의하여 각각 프라이머를 디자인한다.
Corynebacterium glutamicum ATCC13032 게놈 DNA을 템플릿으로 하고, P54와 P55를 프라이머로 하여 PCR을 통하여 purF 유전자 업 스트림 상동 암을 증폭시키며; P56과 P57를 프라이머로 하여 purF 프로모터를 증폭시킨다. P58과 P59를 프라이머로 하여 purF 유전자 다운 스트림 상동 암을 증폭시킨다. 이어 정제된 상기 PCR 생성물을 템플릿으로 하고, P54와 P59를 프라이머로 하여 중첩 확대 PCR 기술(SOE)을 이용하여 증폭을 진행하여 1654 bp의 P hom 프로모터 및 purF 유전자 프로모터 업/다운 스트림 상동 암을 포함하는 세그먼트(서열 18)를 취득한다.
그 중에서, 서열 18의 5’ 말단 제1-735번 뉴클레오티드는 purF 유전자 업 스트림 상동 암이고, 서열 18의 5’ 말단 제736-865번 뉴클레오티드는 P hom 프로모터이며, 서열 18의 5’ 말단 제866-1654번 뉴클레오티드는 purF 유전자 프로모터의 다운 스트림 상동 암이다.
정제 회수되는 PCR 생성물은 각각 BamH I과 EcoR I 이중 효소 절단을 거친 후, 마찬가지의 이중 효소 절단을 거친 상동 재조합 벡터 pK18mobsacB와 연결된다. 연결 생성물을 화학 전환법을 통하여 대장간균 DH5α로 변형시키고, 카나마이신(50 μg/mL)이 항유된 LB 플레이드 상에서 형질전환체를 스크리닝하고, 형질전환체를 3 세대 서브 배양한 후, P13과 P14를 프라이머로 하여 세균 집락 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 양성 형질전환체로서의 1866 bp를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하고 또한 플라스미드에 대하여 BamH I과 EcoR I 이중 효소 절단을 진행하여 양성 1654 bp를 취득한다. 나아가 서열 측정 검증을 진행하는 바, 재조합 플라스미드 pK18mobsacB-P hom ::P purF 의 구성에 성공하였고, 이는 프로모터 P hom 및 교체하고자 하는 프로모터를 포함하는 업/다운 스트림 상동 암의 세그먼트(서열 18)를 벡터 pK18mobsacB의 BamH I과 EcoR I 효소 절단 사이트 사이에 삽입하여 취득한 벡터이다.
상기 이용되는 프라이머 서열은 하기와 같다.
P54: CGCGGATCCTCCGCAGAAAGCACCTCA(BamH I)(서열 74)
P55: TTTAGTTTTCAACGGCTAAAGTTTGACCACTGG(서열 75)
P56: GTGGTCAAACTTTAGCCGTTGAAAACTAAAAAGC(서열 76)
P57: TCCGGTCCTCCTTTTACTTTGTTTCGGCCACCC(서열 77)
P58: GGCCGAAACAAAGTAAAAGGAGGACCGGAATGACCCAGGTAAACCAC(서열 78)
P59: CCGGAATTCAACCTTTGCGGGTTGTCT(EcoR I)(서열 79)
서열 측정이 정확한 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB-P hom ::P purF 를 Corynebacterium glutamicum CG161 중에 전기적으로 전환하고, 카나마이신 저항성 순방향 스크리닝을 통하여 재조합 플라스미드를 취득하여 염색체 상의 세균 집락에 통합하며, 자당 역방향 스크리닝을 통하여 제2회 상동 재조합이 발생한 세균 집락을 취득한다. P56과 P59를 프라이머로 하여 세균 집락에 대하여 게놈 DNA 추출 및 PCR 증폭 검증을 진행하여 905 bp의 양성을 취득하고, CG327(WT-P glyA ::P hisEG -hisG fbr -P glyA ::P hisDCB -Δpgi::P hom ::P purF )로 명한다.
CG327(WT-P glyA ::P hisEG - hisG fbr - P glyA ::P hisDCB -Δpgi::P hom ::P purF )는 나아가 서열 측정 분석을 진행하는 바, 결과적으로 L-히스티딘 프라이머리 공정균 CG161의 염색체 purF 유전자 프로모터를 P hom 으로 교체하고, CG327 구성에 성공하였다.
공정균 CG328는 플라스미드 pXMJ19-zwf - opcA - prsA - hisG fbr - purH를 공정균 CG327 도입하여 취득한 재조합균(WT-P glyA ::P hisEG - hisG fbr - P glyA ::P hisDCB -Δpgi::P hom ::P purF /pXMJ19-zwf-opcA-prsA-hisG fbr - purH)이다. 구체적인 조작 방법은 상기 공정균 CG319를 제조하는 것이고 일반적인 방법이기 때문에 여기에서는 설명을 생략하도록 한다. CG328 균주가 휴대한 플라스미드에 대하여 PCR 검증을 진행하는 바, P52와 P53을 프라이머로 하여 6164 bp 세그먼트(도 7 참조)를 취득하고, 이 DNA 세그먼트에 대하여 서열 측정을 진행한 결과로는 zwf - opcA - prsA - hisG fbr - purH 세그먼트로서, CG328 균주 구성에 성공하였다.
실시예
5 : 플라스미드가 없는 L-히스티딘 높은 수율
재조합균
CG351
의 구성
플라스미드를 휴대하면 공정균의 대사 부담을 증가시킬 뿐 아니라, 아울러 공정균의 산업화 발효 제어와 발효 제품의 안전성에 불리하다. 그러므로, 본 실시예에 있어서, 플라스미드 휴대 유전자를 염색체 상에서 발현을 향상시고, 플라스미드가 없는 히스티딘 공정균을 구성하여 공정균의 대사 부담을 줄이고 발효 기저물로부터 제품으로의 최대 전환을 구현한다.
본 실시예에 있어서, pgi 유전자를 녹아웃시킨 프라이머리 균 CG161의 기초 상에서 나아가 개조를 진행하는 바, P sod 프로모터로 prsA 유전자의 프로모터를 교체시켜 PRPP 합성 효소(PrsA)의 발현을 향상시킴으로써, CG350을 취득하며; 나아가 P eftu 프로모터로 tkt - tal - zwf - opcA - devB 오페론의 프로모터를 교체시켜 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제(Zwf-OpcA)의 발현을 향상시켜 CG351을 취득한다.
Genbank 중의 Corynebacterium glutamicum ATCC13032의 prsA 유전자 및 이의 업/다운 스트림 서열과 P sod 프로모터에 의하여 각각 프라이머를 디자인한다.
Corynebacterium glutamicum ATCC13032 게놈 DNA를 템플릿으로 하고, P60과 P61을 프라이머로 하여 prsA 프로모터 업 스트림 상동 암을 증폭시키며; P62와 P63을 프라이머로 하여 P sod 프로모터를 증폭시키며; P64와 P65를 프라이머로 하여 prsA 프로모터 다운 스트림 상동 암을 증폭시킨다. 이어 정제된 상기 PCR 생성물을 템플릿으로 하고, P60과 P65를 프라이머로 하여 중첩 확대 PCR 기술(SOE)을 이용하여 증폭을 진행하여 1455 bp의 PCR 생성물 취득하여, 교체할 프로모터 P sod 및 교체될 프로모터 P prsA 를 포함하는 업/다운 스트림 상동 암의 세그먼트(서열 11)로 한다.
그 중에서, 서열 11의 5’ 말단 제1-655번 뉴클레오티드는 교체될 프로모터 P prsA 의 업 스트림 상동 암이고, 서열 11의 5’ 말단 제656-847번 뉴클레오티드는 프로모터 P sod 이며, 서열 11의 5’ 말단 제848-1455번 뉴클레오티드는 교체될 프로모터 P prsA 의 다운 스트림 상동 암이다.
상기 1455 bp의 PCR 생성물에 대해 Hind III과 BamH I 이중 효소 절단한 후, 마찬가지로 이중 효소 절단을 거친 상동 재조합 벡터 pK18mobsacB와 연결시킨다. 연결 생성물을 화학 전환법을 통하여 대장간균 DH5α로 변형시키고, 카나마이신(50 μg/mL)이 항유된 LB 플레이드 상에서 형질전환체를 스크리닝하고, 형질전환체를 3 세대 서브 배양한 후, P13과 P14를 프라이머로 하여 콜로니 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 1667 bp의 양성 형질전환체를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하고 또한 플라스미드에 대하여 Hind III과 BamH I 이중 효소 절단을 진행하여 양성 1455 bp를 취득한다.
양성 플라스미드에 대하여 서열 측정을 진행하는 바, 결과적으로 해당 플라스미드는 서열표 중의 서열 11이 보여주는 뉴클레오티드를 벡터 pK18mobsacB 중에 삽입하여 취득한 재조합 플라스미드이며, pK18mobsacB-P sod ::P prsA 라 명한다.
동일한 방법을 이용하여 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB-P eftu ::P tkt 를 구성하고, tkt - tal - zwf - opcA - devB 오페론의 프로모터를 강한 프로모터 P eftu 로 교체시킨다. 구체적으로 말하면, P66과 P67을 프라이머로 하여 tkt - tal - zwf - opcA - devB 오페론 프로모터 업 스트림 상동 암을 증폭시키며; P68과 P69를 프라이머로 하여 프로모터 P eftu 를 증폭시키며; P70과 P71을 프라이머로 하여 tkt - tal - zwf - opcA - devB 오페론 프로모터 다운 스트림 상동 암을 증폭시킨다. P66과 P71을 프라이머로 하여 중첩 확대 PCR 기술(SOE)을 이용하여 증폭시킨다. 취득한 1512 bp의 PCR 생성물은 교체할 프로모터 P eftu 및 교체될 프로모터 P tkt 를 포함하는 업/다운 스트림 상동 암의 긴 세그먼트(서열 12)이고, 그 중에서, 서열 12의 5’ 말단 제1-634번 뉴클레오티드는 교체될 프로모터 P tkt 의 업 스트림 상동 암이고, 서열 12의 5’ 말단 제635-834번 뉴클레오티드는 프로모터 P eftu 이며, 서열 12의 5’ 말단 제835-1512번 뉴클레오티드는 교체될 프로모터 P tkt 의 다운 스트림 상동 암이다.
상기 1512 bp의 PCR 생성물을 Hind III과 BamH I 이중 효소 절단한 후, 마찬가지로 이중 효소 절단을 거친 상동 재조합 벡터 pK18mobsacB와 연결시킨다. 연결 생성물을 화학 전환법을 통하여 대장간균 DH5α로 변형시키고, 카나마이신(50 μg/mL)이 항유된 LB 플레이드 상에서 형질전환체를 스크리닝하고, 형질전환체를 3 세대 서브 배양한 후, P13과 P14를 프라이머로 하여 콜로니 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 1724 bp의 양성 형질전환체를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하고 또한 플라스미드에 대하여 Hind III과 BamH I 이중 효소 절단을 진행하여 양성 1512 bp를 취득한다. 양성 플라스미드에 대하여 서열 측정을 진행하는 바, 결과적으로 해당 플라스미드는 서열표 중의 서열 12가 보여주는 뉴클레오티드를 벡터 pK18mobsacB 중에 삽입하여 취득한 재조합 플라스미드이며, pK18mobsacB-P eftu ::P tkt 라 명한다.
상기 이용되는 프라이머 서열은 하기와 같다.
P60: CCCAAGCTTTCCAGCAACCACCTGGAT (Hind III)(서열 80)
P61: AATTGGCAGCTATTAGCCTTCCTGGTTGTG(서열 81)
P62: CAGGAAGGCTAATAGCTGCCAATTATTCCG(서열 82)
P63: TTGTCCTCCTTTGGGTAAAAAATCCTTTCG(서열 83)
P64: GATTTTTTACCCAAAGGAGGACAACCATGACTGCTCACTGGAA(서열 84)
P65: CGCGGATCCCGCCATTGGGGCATCGCC(BamH I)(서열 85)
P66: CCCAAGCTTTCAACGATCACTGCCCAG(Hind III)(서열 86)
P67: GGGTAACGGCCAGTGTGTCTTAGAAAATG(서열 87)
P68: CTAAGACACACTGGCCGTTACCCTGCGAA(서열 88)
P69: TTGTCCTCCTTTTGTATGTCCTCCTGGACT(서열 89)
P70: GGAGGACATACAAAAGGAGGACAACCTTGACCACCTTGACGCTG(서열 90)
P71: CGCGGATCCAAGCGATCTCAGTGTTGT(BamH I)(서열 91)
P72: TGTGACCCGCTACCCGATAA(서열 92)
P73: CGTTACCCTGCGAATGTC(서열 93)
서열 측정이 정확한 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB - P sod ::P prsA 를 L-히스티딘 재조합균 CG161 중에 전기적으로 전환하고, 카나마이신 저항성 순방향 스크리닝을 통하여 재조합 플라스미드를 취득하여 염색체 상의 세균 집락에 통합하며, 자당 역방향 스크리닝을 통하여 2회 상동 재조합이 발생한 양성 세균 집락을 취득한다. 양성 세균 집락을 P72와 P65를 프라이머로 하여 PCR 증폭 검증을 진행하여 778 bp의 재조합균 WT-P glyA ::P hisEG - hisG fbr - P glyA ::P hisDCB - P sod :: P prsA -Δpgi를 취득하고, CG350으로 명한다.
서열 측정이 정확한 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB - P eftu ::P tkt 를 Corynebacterium glutamicum CG350 중에 전기적으로 전환하고, 카나마이신 저항성 순방향 스크리닝을 통하여 재조합 플라스미드를 취득하여 염색체 상의 세균 집락에 통합하며, 자당 역방향 스크리닝을 통하여 2회 상동 재조합이 발생한 양성 세균 집락을 취득한다. 양성 세균 집락을 P73과 P71을 프라이머로 하여 PCR 증폭 검증을 진행하여 874 bp의 재조합균 WT-P glyA ::P hisEG -hisG fbr -P glyA ::P hisDCB -P eftu ::P tkt -P sod ::P prsA -Δpgi를 취득하고, Corynebacterium glutamicum CG351로 명한다.
재조합균의 게놈 DNA에 대하여 추출 및 서열 측정을 진행하면, 결과적으로 성공적으로 L-히스티딘 재조합균 CG161 중의 tkt - tal - zwf - opcA - devB 오페론과 prsA 유전자의 프로모터를 각각 Corynebacterium glutamicum 내생성 강한 프로모터 P eftu 와 P sod 로 교체하였고, 플라스미드가 없는 L-히스티딘 재조합균 CG351(WT-P glyA ::P hisEG -hisG fbr -P glyA ::P hisDCB -P eftu ::P tkt -P sod ::P prsA -Δpgi) 구성에 성공하였다.
실시예
6 : 플라스미드가 없는 L-히스티딘 높은 수율
재조합균
CG352
와
G353
의 구성
본 실시예에 있어서, 상기 실시예 5의 기초 상에서, 강한 프로모터 P eftu 로 purH 유전자의 프로모터를 교체시켜 purH가 인코딩한 이중 기능 효소 AICAR 트랜스메칠라제/IMP 환히드라제(PurH, 서열 16)의 발현을 향상시킴으로써, 나아가 CG352를 구성하며; 그 후 P hom 프로모터로 purF 유전자 프로모터를 교체하여 뉴클레오티드 합성 경로 중의 제1 효소, 아미도포스포리보실 전이효소(PurF, 서열 19)를 약화시켜 CG353을 구성한다.
상기 실시예 5에서와 동일한 방법을 이용하여 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB-P eftu ::P purH 를 구성하고, purH 유전자의 프로모터를 강한 프로모터 P eftu 로 교체시킨다. Genbank 중의 Corynebacterium glutamicum ATCC13032의 purH 유전자 업/다운 스트림 서열에 의하여 프라이머를 디자인한다. Corynebacterium glutamicum ATCC13032 게놈 DNA를 템플릿으로 하고, P74과 P75를 프라이머로 하여 증폭시켜 P eftu 프로모터를 취득하고, P76과 P77을 프라이머로 하여 증폭시켜 업 스트림 상동 암을 취득하며, P78과 P79를 프라이머로 하여 증폭시켜 다운 스트림 상동 암을 취득하고, 다시 정제된 상기 PCR 생성물을 템플릿으로 하고, P76과 P79를 프라이머로 하여, 중첩 확대 PCR 기술(SOE)을 이용하여 증폭을 진행하여 1473 bp의 업/다운 스트림 상동 암 및 프로모터 Peftu를 포함하는 세그먼트(서열 20)를 취득한다.
그 중에서, 서열 20의 5’ 말단 제1-633번 뉴클레오티드는 업 스트림 상동 암이고, 서열 20의 5’ 말단 제634-833번 뉴클레오티드는 P eftu 이며, 서열 20의 5’ 말단 제834-1473번 뉴클레오티드는 다운 스트림 상동 암이다.
상기 1473 bp의 PCR 생성물에 대해 Xba I과 Sma I 이중 효소 절단한 후, 마찬가지로 이중 효소 절단을 거친 상동 재조합 벡터 pK18mobsacB와 연결시킨다. 연결 생성물을 화학 전환법을 통하여 대장간균 DH5α로 변형시키고, 카나마이신(50 μg/mL)이 항유된 LB 플레이드 상에서 형질전환체를 스크리닝하고, 형질전환체를 3 세대 서브 배양한 후, P13과 P14를 프라이머로 하여 세균 집락 PCR를 이용하여 형질전환체를 검증하여 1685 bp의 양성 형질전환체를 취득하고, 검증을 거친 형질전환체에 대하여 플라스미드를 추출하고 또한 플라스미드에 대하여 Xba I과 Sma I 이중 효소 절단을 진행하여 양성 1473 bp를 취득한다.
양성 플라스미드에 대하여 서열 측정을 진행하는 바, 결과적으로 해당 플라스미드는 서열표 중의 서열 20이 보여주는 뉴클레오티드를 벡터 pK18mobsacB 중에 삽입하여 취득한 재조합 플라스미드이며, pK18mobsacB- P eftu ::P purH 라 명한다.
P74: CTGGAGAGGCTAATGGCCGTTACCCTGCGAA(서열 94)
P75: ATCATCGCTCATTGTATGTCCTCCTGGACT(서열 95)
P76: GCTCTAGAATGATGGTTCCGAGGCCG(Xba I)(서열 96)
P77: GGGTAACGGCCATTAGCCTCTCCAGTTGAG(서열 97)
P78: GGAGGACATACAATGAGCGATGATCGTAAG(서열 98)
P79: TCCCCCGGGTGGTGCCGATCCAACCTG(Sma I)(서열 99)
서열 측정이 정확한 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB - P eftu ::P purH 를 L-히스티딘 재조합균 공정균 CG351 중에 전기적으로 전환하고, 카나마이신 저항성 순방향 스크리닝을 통하여 재조합 플라스미드를 통합하여 염색체 상의 세균 집락을 취득하며, 자당 역방향 스크리닝을 통하여 2회 상동 재조합이 발생한 양성 세균 집락을 취득한다. 양성 세균 집락에서 게놈 DNA를 추출하고, 추출한 게놈 DAN를 템플릿으로 하고, P74와 P79를 프라이머로 하여 PCR 증폭을 진행하여 840 bp의 양성 클론을 취득하며, 서열 측정 검증에 의하면, 이미 성공적으로 L-히스티딘 재조합균 CG351 중의 purH 유전자의 프로모터를 Corynebacterium glutamicum 내생성 강한 프로모터 P eftu 로 교체시키고, 플라스미드가 없는 L-히스티딘 재조합균 CG352(WT-P glyA ::P hisEG -hisG fbr -P glyA ::P hisDCB -P eftu ::P tkt -P sod ::P prsA -Δpgi-P eftu ::P purH )의 구성에 성공하였다.
실시예 4에서 제조한 서열 측정이 정확한 상동 재조합 플라스미드 pK18mobsacB-P hom ::P purF 를 Corynebacterium glutamicum CG352 중에 전기적으로 전환하고, 카나마이신 저항성 순방향 스크리닝을 통하여 재조합 플라스미드를 취득하여 염색체 상의 세균 집락에 통합하며, 자당 역방향 스크리닝을 통하여 제2회 상동 재조합이 발생한 세균 집락을 취득한다. P56과 P59를 프라이머로 하여, 세균 집락에 대하여 게놈 DNA 추출 및 PCR 증폭 검증을 진행하여 905 bp의 양성을 취득하며(도 8 참조), CG353(WT-WT-P glyA ::P hisEG - hisG fbr - P glyA ::P hisDCB -P eftu ::P tkt -P sod ::P prsA -Δpgi-P eftu ::P purH -P hom ::P purF )로 명한다.
CG353에 대하여 나아가 서열 측정 분석을 진행하는 바, 결과로는 공정균 CG352의 염색체 purF 유전자 포로모터는 P hom 으로 교체되고, CG353의 구성에 성공하였다.
실시예
7 : L-히스티딘
공정균의
L-히스티딘 생산 중의 응용
1. 플라스미드를 포함하는 높은 수율의 L-히스티딘의
재조합균의
발효
1) 플라스미드를 포함하는 높은 수율의 L-히스티딘의 공정균의 진탕 발효
진탕 발효에 이용되는 발효 배지는 구체적으로 하기와 같은 바, 즉 글루코스 40 g/L, (NH4)2SO4 20 g/L, KH2PO4 0.5 g/L, K2HPO4·3H2O 0.5 g/L, MgSO4·7H2O 0.25 g/L, FeSO4·7H2O 0.01 g/L, MnSO4·H2O 0.01 g/L, ZnSO4·7H2O 0.001 g/L, CuSO4 0.0002 g/L, NiCl2·6H2O 0.00002 g/L, 비오틴 0.0002 g/L, pH 7.0-7.2, CaCO3 20 g/L. 글루코스는 단독 멸균을 진행하며, 115 ℃ 하에서 고압 멸균을 15 min 진행한다. MgSO4·7H2O 및 무기염 이온은 단독 멸균을 진행하며, 121 ℃ 하에서 고압 멸균을 20 min 진행한다. 비오틴은 0.22μm 무균 필터링 필름을 이용하여 필터링시켜 세균을 제거한다. 나머지 성분은 121 ℃ 하에서 고압 멸균을 20 min 진행한다.
씨드 배지는 구체적으로 하기와 같은 바, 즉 글루코스 20 g/L, 황산암모늄 5 g/L, K2HPO4·3H2O 1 g/L, MgSO4·7H2O 0.4 g/L, 비오틴 50 μg, 비타민 B1 1 mg, Angel Yeast 분말(FM802) 10 g/L, Angel peptone(FP318) 10 g/L.
(1) 종자액의 취득
상기 실시예 2에서 제조된 공정균 CG176, CG172, CG173과 CG171을 각각 종자 배지에 접종시키는 바, 종자액 배양 조건은 배양 온도 32℃, 쉐이커 회전 속도 220 r/min, 배양 시간 8 h, OD600는 20이다.
(2) 발효
종자액을 체적 백분 함량 3%로 최종 농도가 10 μg/ml인 클로람페니콜이 포함된 발효 배지(500 mL 칸막이 플라스크 용액 투여량은 30 mL)에 접종시키고, 32 ℃, 220 r/min에서 72 h 배양시키며, 6 h 발효 배양시켰을 때 최종 농도가 1 mmol/L인 isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside(IPTG)를 첨가하여 목표 유전자의 유도 발현을 진행한다. 간헐적으로 짙은 암모니아수를 보충 첨가하여 발효액의 pH를 7.0-7.2 사이로 제어하고, 잔당 상황에 의하여 농도가 400 g/L인 글루코스 모액을 보충 첨가하여 발효액의 잔당을 5-10 g/L로 제어한다.
발효 생성물을 수집한 후 12000×g에서 5 min 동안 원심 분리시켜 상청액을 수집한다.
(3) L-히스티딘 함량의 측정
고효율 액상법(2,4-DNFB 프리 컬럼 파생 고효율 액상법)을 이용하는데, 구체적인 방법은 하기와 같은 바, 즉 2 mL의 원심관에 50 μL의 상기 상청액을 취하고, 200 μL NaHCO3 수용액(0.5 mol/L, pH 9.0)과 100 μL 1%의 2,4-DNFB-아세토나이트릴 용액(체적비)을 첨가하고, 60℃의 수욕 중에서 어두운 곳에서 일정한 온도로 60 min 가열시키며, 그 후 25℃까지 냉각시켜 650 μL KH2PO4 수용액(0.01 mol/L, pH 7.2 ± 0.05, NaOH 수용액으로 pH 조절)을 첨가하고, 15 min 방치하고 필터링시킨 후 주입할 수 있는 바, 주입량은 15 μL이다.
사용되는 크로마토그래픽 컬럼은 C18 컬럼(ZORBAX Eclipse XDB-C18, 4.6*150 mm, Agilent, USA); 컬럼 온도: 40℃; 자외선 탐지 파장: 360nm; 유동상 A는 0.04 mol/L KH2PO4 수용액(pH 7.2 ± 0.05, 40 g/L KOH 수용액으로 pH 조절)이고, 유동상 B는 55% 아세토나이트릴 수용액(체적비)이며, 유동상의 유속은 1 mL/min이고 용출 과정은 하기 표 1에 표시된 바와 같다.
시간(min) | 유동상 A(%) | 유동상 B(%) |
0 | 86 | 14 |
2 | 88 | 12 |
4 | 86 | 14 |
10 | 70 | 30 |
20 | 30 | 70 |
21 | 10 | 90 |
24 | 0 | 100 |
야생형 균주 C. glutamicum ATCC13032를 대조로 하여, 발효 과정인 글루코스 소모, OD600 및 최종의 L-히스티딘 수율을 측정한다. 결과는 하기 표 2에 표시된 바와 같다.
표 2는 진탕 발효 실험 중의 L-히스티딘 공정균 CG160, CG176, CG172, CG173과 CG171의 글루코스 소모, 최대 OD600, 비성장 속도 및 L-히스티딘 수율을 보여준다.
균주 | 글루코스 소모량(g) | 최대 OD600 | 비성장 속도(h-1) | L-히스티딘 수율(g/L) |
CG160 | 3.8 | 62.67 | 0.131 | 0.03 |
CG176 | 3.8 | 60.97 | 0.127 | 1.18 |
CG172 | 1.2 | 46.67 | 0.073 | 0.77 |
CG173 | 3.8 | 59.07 | 0.120 | 1.50 |
CG171 | 1.8 | 53.83 | 0.108 | 2.40 |
진탕 발효 실험에 있어서, 72 h 발효시키고, 야생형 균주 C. glutamicum ATCC13032에서는 L-히스티딘의 누적이 검출되지 않았으며, 기저균 CG160의 L-히스티딘 수율은 0.03 g/L이다. 단지 L-히스티딘 터미널 대사 경로 개조를 진행한 기저 공정균 CG176의 L-히스티딘 수율은 1.18 g/L이다. 이 기초 상에서, 단지 pgi 유전자가 결실된 공정균 CG172의 L-히스티딘 수율은 0.77 g/L이며; 단지 zwf - opcA가 과도 발현된 공정균 CG173의 L-히스티딘 수율은 1.50 g/L이다. pgi 유전자가 결실됨과 아울러 zwf - opcA가 과도 발현된 공정균 CG171의 L-히스티딘 수율은 2.40 g/L로서, 단지 pgi 유전자가 결실된 공정균 CG172에 비햐여 수율이 2.1배 향상되고, 단지 zwf - opcA가 과도 발현된 균주 CG173에 비해서는 60% 향상되었으며, 단지 L-히스티딘 터미널 대사 경로 개조를 진행한 균주 CG176에 비해서는 102% 향상되었다.
2) L-히스티딘 공정균 CG171, CG319와 CG328 발효 탱크로 L-히스티딘 발효 생산
씨드 배지는 구체적으로 하기와 같은 바, 즉 글루코스 20 g/L, 황산암모늄 5 g/L, K2HPO4·3H2O 1 g/L, MgSO4·7H2O 0.9 g/L, 비오틴 50 μg, 비타민 B1 1 mg, Angel Yeast 분말(FM802) 2 g/L, Angel peptone(FP318) 2 g/L.
이용된 발효 배지는 구체적으로 하기와 같은 바, 즉 글루코스 20 g/L, 황산암모늄 5 g/L, KH2PO4 0.5 g/L, K2HPO4·3H2O 0.5 g/L, MgSO4·7H2O 0.25 g/L, FeSO4·7H2O 10 mg/L, MnSO4·H2O 10 mg/L, 비타민 B1 0.5 mg/L, Angel Yeast 분말(FM802) 5 g/L.
(1) 종자액의 취득
공정균 CG171, CG319와 CG328를 종자 배지에 접종시키는 바, 종자액 배양 조건은 배양 온도 32℃, 쉐이커 회전 속도 220 r/min, 배양 시간 8 h, OD600는 20이다.
(2) 발효
종자액을 체적 백분 함량 10%으로 최종 농도가 10 μg/ml인 클로람페니콜이 포함된 발효 배지에 접종시킨다.
이용되는 발효 탱크는 7.5 L 발효 탱크(BioFlo115, NBS)로서, 정속도 프로그램가능한 펌포가 내장되어 정속도로 내용물을 보충할 수 있다. 발효 과정에서 연동 펌프를 이용하여 600 g/L의 글루코스를 보충 첨가하여, 발효 시스템 중의 글루코스의 농도를 5~10 g/L로 제어하며, 아울러 10 g/L의 Angel Yeast 분말(FM802)을 드립시킨다. 가열 자켓 및 냉각수를 통하여 발효 온도를 제어하여 32 ℃로 유지하며; 공기를 통과시켜 용존 산소를 제공하고, 회전 속도와 용존 산소 신호를 연속 제어하여 용손 산소를 30%로 유지하며; 짙은 암모니아수를 보충 첨가하여 pH를 조절하여 약 6.9로 유지한다. 발효는 연속 52 h 진행한다. OD600=4~5일 때, IPTG(isopropyl thiogalactopyranoside, 최종 농도는 0.5 mmol/L)를 첨가하여 재조합 플라스미드가 휴대한 유전자의 발현을 유도한다.
발효 생성물을 수집한 후 12000×g에서 5 min 동안 원심 분리시켜 상청액을 수집한다.
(3) L-히스티딘 함량의 측정
상기 1) 중의 (3)의 방법에 따라 상청액 중의 L-히스티딘 함량을 측정하는 바, 결과는 하기 표와 같으며, 공정균 CG171의 L-히스티딘 최고 함량은 10.87 g/L이고, 생산 강도는 0.21 g/L/h이며; 공정균 CG319의 L-히스티딘 최고 함량은 14.15 g/L이고, 생산 강도는 0.30 g/L/h이며; 공정균 CG328의 L-히스티딘 최고 함량은 15.96 g/L이고, 생산 강도는 0.32 g/L/h이다. 결과는 표 3에 표시된 바와 같다.
균주 | 히스티딘 수율(g/L) | 발효 시간(h) |
CG171 | 10.87 | 52 |
CG319 | 14.15 | 47 |
CG328 | 15.96 | 50 |
상기 표에서 알 수 있는 바와 같이, 발효 탱크 실험에서 CG171 균주가 아주 훌륭한 효과를 거두었는 바, 히스티딘 수율은 52 시간 발효시 10.87g/L에 달했다. 나아가 purH를 과도 발현시킨 공정균 CG319 및 나아가 동시에 purH를 과도 발현시키고 purF를 약화시킨 공정균 CG328은 CG171에 비하여, 발효 시간이 더욱 짧은 상황 하에서, 히스티딘 수율이 각각 약 30% 및 50% 향상되었다. 다시 말하면, pgi를 약화시키고 zwf - opcA를 과도 발현시킨 기초 상에서, 히스티딘 합성 경로와 뉴클레오티드 합성 경로를 커플링시켜, 히스티딘 합성 경로의 대사 유동을 증가시키고 나아가 히스티딘의 수율이 크게 향상되도록 하였다.
2. 플라스미드가 없는 L-히스티딘
공정균
CG350
,
CG351
,
CG352
및
CG353
진탕 발효로 L-히스티딘 생산
공정균 CG350, CG351, CG352 및 CG353 종자액의 취득과 진탕 발효 방법은 상기 1에서와 같으나, 다른 점이라면 발효 과정 중에 클로람페니콜와 유도제 IPTG를 첨가할 필요가 없는 것이다. L-히스티딘 함량 측정은 본 실시예의 제1항에서와 같다. 야생형 C. glutamicum ATCC13032를 대조로 한다.
진탕 발효 실험에 있어서, 72 h 발효시키고, 야생형 균주 C. glutamicum ATCC13032에서 L-히스티딘의 누적이 검출되지 않았으며, 단지 pgi 유전자가 결실된 것으로 구성된 공정균 CG350의 L-히스티딘 수율은 0.65 g/L이고, 이 기초 사에서 동시에 zwf - opcA의 발현량을 향상시켜 구성한 공정균 CG351의 L-히스티딘 수율은 1.86 g/L이며, 단지 pgi 유전자가 결실된 공정균 CG350에 비하여 186% 향상되었다. 나아가 purH 유전자 발현을 향상시킨 균주 CG352의 L-히스티딘 수율은 2.23 g/L이고, 더욱 나아가 purF 유전자 발현을 낮춘 균주 CG353의 L-히스티딘 수율은 2.34 g/L이다. 결과는 표 4에 표시된 바와 같다.
균주 | 히스티딘 수율(g/L) |
야생형 | --- |
CG350 | 0.65 |
CG351 | 1.86 |
CG352 | 2.23 |
CG353 | 2.34 |
<110> Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences
<120> RECOMBINANT STRAIN PRODUCING L-AMINO ACIDS, CONSTRUCTING METHOD
THEREFOR AND METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS
<130> IP-2015-0123CN
<150> CN 201410050868.2
<151> 2014-02-14
<160> 99
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1672
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 1
gctctttcgg agtgaccttc tccccagacg gaaccgccga aatcggagcc tccgtcgatg 60
ctgtggacgg gcacatcatc aacgacgccg tcacccaaca cgcgaagaaa aacgacctca 120
cctacggcga agctttcagc gacatccttc ggaacaatat ccaagtcaag gtagtcctca 180
acttgtacac cgccaaagac ctcgccaacg ccccagtgtg ggccagcgga atcggctggt 240
tggatgccaa gactggaaca ttctggtcag agaaagccaa caaagaacaa gacatggatg 300
cggctgccaa aatcagcacc gacaaacacg atcctccacc agcgttgcgt gacgcactca 360
ttggtcgtga tggcacctgc cgattccctg gctgttcagt cccagcgctc aaaacccaag 420
ccgaccaccg catcccctac gaagaaggcg gagaaacttg cctaggcgga atcggctgcc 480
tctgtcaaca ccaccacaac atgaaaaccg acggccgagt cacctacctt ctcgatccct 540
tctccggcat catcgtctgg ctcatgggag acggaacatg ggcagtgtca gaacccaacg 600
ggccgctcaa tcccaaaaat gcgagatggg cgcaaacagt cgcccaacac cgggcacgcc 660
accacaagcg ttgggttaag gaggacgcca agtagccgga tggccacgtc gaaaagcagc 720
ccaataaacg cacctaaatt tgtcgtgttt cccactttga acactcttcg atgcgcttgg 780
ccacaaaagc aagctaacct gaagatgtta tttaacgaca ataaaggagt tttctcgctt 840
gcttataggg tcaggggcgt gaagaatcct cgcctcatag cactggccgc tatcatcctg 900
acctcgttca atctgcgaac agctattact gctttagctc cgctggtttc tgagattcgg 960
gatgatttag gggttagtgc ttctcttatt ggtgtgttgg gcatgatccc gactgctatg 1020
ttcgcggttg ctgcgtttgc gcttccgtcg ttgaagagga agttcactac ttcccaactg 1080
ttgatgtttg ccatgctgtt gactgctgcc ggtcagatta ttcgtgtcgc tggacctgct 1140
tcgctgttga tggtcggtac tgtgttcgcg atgtttgcga tcggagttac caatgtgttg 1200
cttccgattg ctgttaggga gtattttccg cgtcacgtcg gtggaatgtc gacaacttat 1260
ctggtgtcgt tccagattgt tcaggcactt gctccgacgc ttgccgtgcc gatttctcag 1320
tgggctacac atgtggggtt gaccggttgg agggtgtcgc tcggttcgtg ggcgctgctg 1380
gggttggttg cggcgatttc gtggattccg ctgttgagtt tgcagggtgc cagggttgtt 1440
gcggcgccgt cgaaggtttc tcttcctgtg tggaagtctt cggttggtgt ggggctcggg 1500
ttgatgtttg ggtttacttc gtttgcgacg tatatcctca tgggttttat gccgcagatg 1560
gtaggtgatc ctcagctcgg tgcggtgttg ttaggctggt ggtcaatttt gggattgccg 1620
ctgaacattc tgggaccgtg gttggtgacg cgtttcacta actgcttccc ga 1672
<210> 2
<211> 2519
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 2
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ctgtgatccg cgaggtgaca gatgctccca ccgtgccaac cgatgagttt ggtactccac 2280
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<210> 3
<211> 833
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 3
Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp
1 5 10 15
Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val
20 25 30
Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala
35 40 45
Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu
50 55 60
Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr
65 70 75 80
Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn
85 90 95
Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe
100 105 110
Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile
115 120 125
Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile
130 135 140
Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly
145 150 155 160
Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys
165 170 175
Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val
180 185 190
Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu
195 200 205
Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln
210 215 220
Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile
225 230 235 240
Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp
245 250 255
Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu
260 265 270
Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln
275 280 285
Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr
290 295 300
Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln
305 310 315 320
Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro
325 330 335
Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser
340 345 350
Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu
355 360 365
Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His
370 375 380
Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile
385 390 395 400
Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser
405 410 415
Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe
420 425 430
Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg
435 440 445
Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn
450 455 460
Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala
465 470 475 480
Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly
485 490 495
Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg
500 505 510
Arg Pro Met Ile Phe Glu Leu Pro Asp Thr Thr Thr Gln Gln Ile Ser
515 520 525
Lys Thr Leu Thr Arg Leu Arg Glu Ser Gly Thr Gln Val Thr Thr Gly
530 535 540
Arg Val Leu Thr Leu Ile Val Val Thr Asp Ser Glu Ser Asp Val Ala
545 550 555 560
Ala Val Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala Ser Arg Glu His Pro Ser Arg
565 570 575
Val Ile Ile Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala Glu Asn Lys Val Asp
580 585 590
Ala Glu Val Arg Ile Gly Gly Asp Ala Gly Ala Ser Glu Met Ile Ile
595 600 605
Met His Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gln Tyr Val Val Thr
610 615 620
Pro Leu Leu Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu
625 630 635 640
Ser Pro Lys Asn Pro Ser Gln Asp Pro Ile Gly Arg Ile Ala Gln Arg
645 650 655
Arg Ile Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg
660 665 670
Val Glu Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu
675 680 685
Thr Gln Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His Pro Pro His
690 695 700
Ser Glu Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser
705 710 715 720
Val Asp Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Lys Val Pro Val
725 730 735
Ile Arg Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp Glu Phe Gly
740 745 750
Thr Pro Leu Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly
755 760 765
Ser Ile Ile Ile Thr Ile Tyr Asp Ala His Thr Leu Gln Val Glu Met
770 775 780
Pro Glu Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala Ile Gly Arg Arg Ser
785 790 795 800
Glu Ser Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp Pro Asp Leu
805 810 815
Gly Tyr Gln His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr
820 825 830
Val
<210> 4
<211> 1852
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 4
aaaggaggat cctcatgact gctcactgga aacaaaacca aaagaacctc atgctgtttt 60
cgggtcgtgc gcacccagaa ctggcagaag ctgtagctaa agagctcgac gtcaacgtca 120
ccccaatgac ggcacgcgat ttcgccaacg gtgaaatcta cgtccgcttc gaggaatcag 180
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tggaacagct gctgatgatc gacgctttga agcgtggttc cgcaaagcgc atcaccgcga 300
tcctgccgtt ctacccatat gcccgccagg acaagaagca ccgcggccgc gagccaattt 360
ctgctcgcct catcgccgac ctcatgctca ccgctggcgc ggaccgtatc gtgtccgtgg 420
acttgcacac cgatcagatc cagggcttct tcgacggccc agtcgatcac atgcacgcca 480
tgccgatcct caccgatcac atcaaggaaa actacaacct ggacaacatc tgcgtggtct 540
cccctgacgc aggtcgcgtg aaggttgcag agaagtgggc taacaccttg ggcgatgccc 600
caatggcgtt cgtgcacaag acccgctcca ccgaggtagc aaaccaggtt gtcgccaacc 660
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ctgaagaagt catcaccacc gacaccctgc cacagtccac cgagggctgg agcaacctga 900
ccgttttgtc gatcgcaccg ctgctggctc gcaccatcaa cgagatcttc gaaaacggtt 960
ccgtcaccac cctcttcgag ggcgaggcct aaaaaggagg acaatcatgt tgaaaatcgc 1020
tgtcccaaac aaaggctcgc tgtccgagcg cgccatggaa atcctcgccg aagcaggcta 1080
cgcaggccgt ggagattcca aatccctcaa cgtttttgat gaagcaaaca acgttgaatt 1140
cttcttcctt cgccctaaag atatcgccat ctacgttgct ggtggccagc tcgatttggg 1200
tatcaccggc cgcgaccttg ctcgcgattc ccaggctgat gtccacgaag ttctttccct 1260
cggcttcggt tcctccactt tccgttacgc agcaccagct gatgaagagt ggagcatcga 1320
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agcacgtggg ctttccgctg aggtgctccg cctcgacggt gcagtagagg tatccatcaa 1440
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tgctgtacgc gccatggtgc cacgcaggtc agctaacgcc atcatggata agcttgctgg 1800
actcggcgct gaagccatcc tggcttctga aatccgcatc gcccgcatct ag 1852
<210> 5
<211> 325
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 5
Met Thr Ala His Trp Lys Gln Asn Gln Lys Asn Leu Met Leu Phe Ser
1 5 10 15
Gly Arg Ala His Pro Glu Leu Ala Glu Ala Val Ala Lys Glu Leu Asp
20 25 30
Val Asn Val Thr Pro Met Thr Ala Arg Asp Phe Ala Asn Gly Glu Ile
35 40 45
Tyr Val Arg Phe Glu Glu Ser Val Arg Gly Ser Asp Cys Phe Val Leu
50 55 60
Gln Ser His Thr Gln Pro Leu Asn Lys Trp Leu Met Glu Gln Leu Leu
65 70 75 80
Met Ile Asp Ala Leu Lys Arg Gly Ser Ala Lys Arg Ile Thr Ala Ile
85 90 95
Leu Pro Phe Tyr Pro Tyr Ala Arg Gln Asp Lys Lys His Arg Gly Arg
100 105 110
Glu Pro Ile Ser Ala Arg Leu Ile Ala Asp Leu Met Leu Thr Ala Gly
115 120 125
Ala Asp Arg Ile Val Ser Val Asp Leu His Thr Asp Gln Ile Gln Gly
130 135 140
Phe Phe Asp Gly Pro Val Asp His Met His Ala Met Pro Ile Leu Thr
145 150 155 160
Asp His Ile Lys Glu Asn Tyr Asn Leu Asp Asn Ile Cys Val Val Ser
165 170 175
Pro Asp Ala Gly Arg Val Lys Val Ala Glu Lys Trp Ala Asn Thr Leu
180 185 190
Gly Asp Ala Pro Met Ala Phe Val His Lys Thr Arg Ser Thr Glu Val
195 200 205
Ala Asn Gln Val Val Ala Asn Arg Val Val Gly Asp Val Asp Gly Lys
210 215 220
Asp Cys Val Leu Leu Asp Asp Met Ile Asp Thr Gly Gly Thr Ile Ala
225 230 235 240
Gly Ala Val Gly Val Leu Lys Lys Ala Gly Ala Lys Ser Val Val Ile
245 250 255
Ala Cys Thr His Gly Val Phe Ser Asp Pro Ala Arg Glu Arg Leu Ser
260 265 270
Ala Cys Gly Ala Glu Glu Val Ile Thr Thr Asp Thr Leu Pro Gln Ser
275 280 285
Thr Glu Gly Trp Ser Asn Leu Thr Val Leu Ser Ile Ala Pro Leu Leu
290 295 300
Ala Arg Thr Ile Asn Glu Ile Phe Glu Asn Gly Ser Val Thr Thr Leu
305 310 315 320
Phe Glu Gly Glu Ala
325
<210> 6
<211> 281
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 6
Met Leu Lys Ile Ala Val Pro Asn Lys Gly Ser Leu Ser Glu Arg Ala
1 5 10 15
Met Glu Ile Leu Ala Glu Ala Gly Tyr Ala Gly Arg Gly Asp Ser Lys
20 25 30
Ser Leu Asn Val Phe Asp Glu Ala Asn Asn Val Glu Phe Phe Phe Leu
35 40 45
Arg Pro Lys Asp Ile Ala Ile Tyr Val Ala Gly Gly Gln Leu Asp Leu
50 55 60
Gly Ile Thr Gly Arg Asp Leu Ala Arg Asp Ser Gln Ala Asp Val His
65 70 75 80
Glu Val Leu Ser Leu Gly Phe Gly Ser Ser Thr Phe Arg Tyr Ala Ala
85 90 95
Pro Ala Asp Glu Glu Trp Ser Ile Glu Lys Leu Asp Gly Lys Arg Ile
100 105 110
Ala Thr Ser Tyr Pro Asn Leu Val Arg Asp Asp Leu Ala Ala Arg Gly
115 120 125
Leu Ser Ala Glu Val Leu Arg Leu Asp Gly Ala Val Glu Val Ser Ile
130 135 140
Lys Leu Gly Val Ala Asp Ala Ile Ala Asp Val Val Ser Thr Gly Arg
145 150 155 160
Thr Leu Arg Gln Gln Gly Leu Ala Pro Phe Gly Glu Val Leu Cys Thr
165 170 175
Ser Glu Ala Val Ile Val Gly Arg Lys Asp Glu Lys Val Thr Pro Glu
180 185 190
Gln Gln Ile Leu Leu Arg Arg Ile Gln Gly Ile Leu His Ala Gln Asn
195 200 205
Phe Leu Met Leu Asp Tyr Asn Val Asp Arg Asp Asn Leu Asp Ala Ala
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Arg Asp Asn Trp Val Ala Val Arg Ala Met Val Pro Arg Arg Ser Ala
245 250 255
Asn Ala Ile Met Asp Lys Leu Ala Gly Leu Gly Ala Glu Ala Ile Leu
260 265 270
Ala Ser Glu Ile Arg Ile Ala Arg Ile
275 280
<210> 7
<211> 1920
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 7
gtatcggcgt ggagttgtcc gaggaactcc agctgcaccc agagcagtcc acagacgcgt 60
ttgtgctcta ccacccagag gcaaagtact ttaacgtcta acacctttga gagggaaaac 120
tttcccgcac attgcagatc gtgccacttt aactaaggtt gacggcatga ttaaggcgat 180
tttctgggac atggacggca cgatggtgga ctctgagcca cagtggggca ttgctaccta 240
cgagctcagc gaagccatgg gccgccgcct caccccggag ctccgggaac tcaccgtcgg 300
ctcgagcctg ccgcgcacca tgcgcttatg cgcagagcac gcaggcatta cattgagcga 360
cgcggactac gagcgctacc gggctggcat gttcgcccgg gtccatgagc ttttcgacga 420
atccctcgtc ccaaatccag gcgtcaccga actcctgaca gagttgaagg ccctcgagat 480
ccccatgttg gtcaccacca acacagagcg cgatctcgcg acccgttcag tcgcagccgt 540
gggaaatgag ttcttcatcg gttctatcgc tggtgatgaa gtcccaacag caaagccagc 600
ccccgacatg tacctcgaag cagcacgacg tgtgggcttt gacccatcag agtgcctcgt 660
gttcgaagat tcctacaacg gcatgctggg cgctgttact gcaggttgcc gcgtcattgg 720
tctgcaccca gaagaagtcc aagcgccaga aggtgtagtg cctttgcgtt ccctccacgg 780
taaaaactct ttcgaaggtg tcaccgctga gatggtcact gcctggtacc accagatcga 840
gccggcaggt gtcgcaaaat aaagctactc cactagtgtg atcggggtta ttttttcact 900
tcaatgggtg gctaaaagac gtgggcacgt gagtaaactc atgcgcgcga aacgatggga 960
gtgaacccat acttttatat atgggtatcg gcggtctatg cttgtgggcg tacctgtccc 1020
gcgagtgagg tcttacgcaa aggaggaacc gaatgaagac atttgactcg ctgtacgaag 1080
aacttcttaa ccgtgctcag acccgccctg aagggtctgg aaccgtggcc gccttggata 1140
aaggcatcca tcatctaggt aagaaggtca tcgaagaagc cggagaggtc tggattgcag 1200
ccgagtatga gaccgatgaa gagctagccg gagaaatctc ccagctcatt tattggaccc 1260
aggtcatcat ggttgctcgc ggcctgaagc cagaagatat ctacaagaac ctgtaggagt 1320
tttaaagcaa tcatgttgaa aatcgctgtc ccaaacaaag gctcgctgtc cgagcgcgcc 1380
atggaaatcc tcgccgaagc aggctacgca ggccgtggag attccaaatc cctcaacgtt 1440
tttgatgaag caaacaacgt tgaattcttc ttccttcgcc ctaaagatat cgccatctac 1500
gttgctggtg gccagctcga tttgggtatc accggccgcg accttgctcg cgattcccag 1560
gctgatgtcc acgaagttct ttccctcggc ttcggttcct ccactttccg ttacgcagca 1620
ccagctgatg aagagtggag catcgaaaag ctcgacggca agcgcatcgc tacctcttac 1680
cccaaccttg ttcgcgatga cctcgcagca cgtgggcttt ccgctgaggt gctccgcctc 1740
gacggtgcag tagaggtatc catcaagctt ggtgtcgcag atgccatcgc cgatgttgta 1800
tccaccggcc gcacgctgcg tcagcaaggt cttgcacctt tcggcgaggt tctgtgcacc 1860
tctgaggctg tcattgttgg ccgcaaggat gaaaaggtca ccccagagca gcagatcctg 1920
1920
<210> 8
<211> 1694
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 8
cgaggaaacc gttgaggagt tcgtccatgt cgacttcttc aggttcgaag tagtcatcgt 60
ctgtttccca ttcgatttct gagtcatcgt ctaggtagtc gtcttctgca tcctcgtctg 120
ccatgtctga ttcttcccac tctgcgtctt ctagggattc gatgagctct tcaactggag 180
tgggaacgta cagcccccgg attttctcta cgagatctgc ttggtcttgt tcgtcgctga 240
gttcatcggc attgttcgtg tcgtcagggc ttccggtgtc gctgaagtta agttctgaaa 300
aacgctccag aatataggtc acagccatgg cggtggtgtc caaggacagg ttgatgaatt 360
ggcgtagctg ttgggtgctt aacccttcat cgatgcagat ggtcgtgcgg aatttcaatt 420
ccacttcgcc gtcgttgccc agatggacga gggctgttgg cccgatgcgt tcggcattcc 480
attcggtgac agctcgcgcc gcatcgttga tggcaaacat gtccaaatta aggcgcgtgc 540
gaccaaggat ggtgagcatt tgccctgatt cgtggctgaa gtacatcgaa atgcggtgat 600
cttgccacgg cacgatgatg cgatcttctg agctcaaata gtggtagccc aaggaatcaa 660
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cgtttcgatc attcacagag gtgaaatcca tagctactcc actagtgtga tcggggttat 780
tttttcactt caatgggtgg ctaaaagacg tgggcacgtg agtaaactca tgcgcgcgaa 840
acgatgggag tgaacccata cttttatata tgggtatcgg cggtctatgc ttgtgggcgt 900
acctgtcccg cgagtgaggt cttacgcaaa ggaggatcgc catgttgaat gtcactgacc 960
tgcgaggtca aacaccatcc aagagcgaca tccgacgtgc tttgccacgt ggtggcactg 1020
acgtgtggtc tgtgcttccc atagtgcagc ctgttgtaga agatgtccaa aaccgcggcg 1080
ctgaagctgc tttggattac ggcgagaagt tcgaccatat tcgccccgcc tcggtgcggg 1140
tgccagctga ggttattgct gcagcagaaa acaccttaga tccgttggtg cgtgaatcga 1200
ttgaagagtc gattcgtcgc gtccgcaagg ttcacgctga gcaaaagcca tccgagcaca 1260
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cagctcaaga ggctggtgtg aactcccttg tggttgcgtc gcctcctcag gctgagcacg 1440
gtggctggcc tcaccccacc attttggcgg cgtgttccat cttgggtgtt gatgaggtgt 1500
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tcgagcctgt ggatatgatc actggacctg gcaatatctt tgtcaccgct gcgaagcgcc 1620
tggtcagggg agtggtaggt actgattctg aggctggccc tacagaaatc gctgtgcttg 1680
ctgatgcctc tgcc 1694
<210> 9
<211> 1689
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 9
atctacgttg ctggtggcca gctcgatttg ggtatcaccg gccgcgacct tgctcgcgat 60
tcccaggctg atgtccacga agttctttcc ctcggcttcg gttcctccac tttccgttac 120
gcagcaccag ctgatgaaga gtggagcatc gaaaagctcg acggcaagcg catcgctacc 180
tcttacccca accttgttcg cgatgacctc gcagcacgtg ggctttccgc tgaggtgctc 240
cgcctcgacg gtgcagtaga ggtatccatc aagcttggtg tcgcagatgc catcgccgat 300
gttgtatcca ccggccgcac gctgcgtcag caaggtcttg cacctttcgg cgaggttctg 360
tgcacctctg aggctgtcat tgttggccgc aaggatgaaa aggtcacccc agagcagcag 420
ctgttgcccg tctcactggt gaaaagaaaa accaccctgg cgccggggat cagccccgga 480
tgctttggat acggtctatg agctggcagc gtatttgacc gatccggaca cctgggataa 540
tgtgtggatt ttgtcggatc agcttgagta ggacaaatcc gccgagcttc gacgagattt 600
tcaggagcta aggaagctaa aatggagaaa aaaatcactg gatataccac cgttgatata 660
tcccaatggc atcgtaaaga acattttgag gcatttcagt cagttgctca atgtacctat 720
aaccagaccg ttcagctgga tattacggcc tttttaaaga ccgtaaagaa aaataagcac 780
aagttttatc cggcctttat tcacattctt gcccgcctga tgaatgctca tccggagttc 840
cgtatggcaa tgaaagacgg tgagctggtg atatgggata gtgttcaccc ttgttacacc 900
gttttccatg agcaaactga aacgttttca tcgctctgga gtgaatacca cgacgatttc 960
cggcagtttc tacacatata ttcgcaagat gtggcgtgtt acggtgaaaa cctggcctat 1020
ttccctaaag ggtttattga gaatatgttt ttcgtctcag ccaatccctg ggtgagtttc 1080
accagttttg atttaaacgt ggccaatatg gacaacttct tcgcccccgt tttcaccatg 1140
ggcaaatatt atacgcaagg cgacaaggtg ctgatgccgc tggcgattca ggttcatcat 1200
gccgtctgtg atggcttcca tgtcggcaga atgcttaatg aattacaaca gtactgcgat 1260
gagtggcagg gcggggcgta attttaacta cccccgaaaa tgtagtgggt agttccacac 1320
tgcctcttac aagtacgtag gataatccac agcaccattg tgatttcctt caacttgtga 1380
gaggcagtac atgtctaaga cgagcaacaa gtcttcagca gactcaaaga atgacgcaaa 1440
agccgaagac attgtgaacg gcgagaacca aatcgccacg aatgagtcgc agtcttcaga 1500
cagcgctgca gtttcggaac gtgtcgtcga accaaaaacc acggttcaga aaaagttccg 1560
aatcgaatcg gatctgcttg gtgaacttca gatcccatcc cacgcatatt acggggtgca 1620
cacccttcgt gcggtggaca acttccaaat ctcacgaacc accatcaacc acgtcccaga 1680
tttcattcg 1689
<210> 10
<211> 1092
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 10
atctacgttg ctggtggcca gctcgatttg ggtatcaccg gccgcgacct tgctcgcgat 60
tcccaggctg atgtccacga agttctttcc ctcggcttcg gttcctccac tttccgttac 120
gcagcaccag ctgatgaaga gtggagcatc gaaaagctcg acggcaagcg catcgctacc 180
tcttacccca accttgttcg cgatgacctc gcagcacgtg ggctttccgc tgaggtgctc 240
cgcctcgacg gtgcagtaga ggtatccatc aagcttggtg tcgcagatgc catcgccgat 300
gttgtatcca ccggccgcac gctgcgtcag caaggtcttg cacctttcgg cgaggttctg 360
tgcacctctg aggctgtcat tgttggccgc aaggatgaaa aggtcacccc agagcagcag 420
atcctgcttc gccgcatcca gggaattttg cacgcgcaga acttcctcat gctggattac 480
aaggtcgacc gcgacaacct ggacgctgcc actgcagtaa ccccaggctt ctccggccca 540
gcggtatccc cactggcacg cgacaactgg gttgctgtac gcgccatggt gccacgcagg 600
tcagctaacg ccatcatgga taagcttgct ggactcggcg ctgaagccat cctggcttct 660
gaaatccgca tcgcccgcat ctagttttaa ctacccccga aaatgtagtg ggtagttcca 720
cactgcctct tacaagtacg taggataatc cacagcacca ttgtgatttc cttcaacttg 780
tgagaggcag tacatgtcta agacgagcaa caagtcttca gcagactcaa agaatgacgc 840
aaaagccgaa gacattgtga acggcgagaa ccaaatcgcc acgaatgagt cgcagtcttc 900
agacagcgct gcagtttcgg aacgtgtcgt cgaaccaaaa accacggttc agaaaaagtt 960
ccgaatcgaa tcggatctgc ttggtgaact tcagatccca tcccacgcat attacggggt 1020
gcacaccctt cgtgcggtgg acaacttcca aatctcacga accaccatca accacgtccc 1080
agatttcatt cg 1092
<210> 11
<211> 1455
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 11
tccagcaacc acctggatcg atgtggaggt ttctatcggc cgcgacgtga tcatccaccc 60
tggcacccag ctcaagggcg aaactgtcat cggagaccgc gttgaagttg gtccagacac 120
caccttgacc aacatgacca tcggcgacgg cgcatccgta atccgcaccc acggtttcga 180
ctccaccatc ggtgaaaacg ccaccgttgg ccccttcacc tacatccgcc caggaaccac 240
actgggacca gaaggcaagc tcggtggctt cgtagaaacc aagaaggcca caatcggccg 300
tggctccaag gttccacacc tcacctatgt cggcgacgcc accatcggcg aggaatccaa 360
catcggagcc tcctctgtct tcgtgaacta cgacggtgaa aacaagcacc acaccaccat 420
cggcagccac gttcgcactg gttctgacac catgtttatc gctccagtga ccgtgggtga 480
cggagcgtat tccggagccg gtacagtaat taaagacgat gttccgccag gagcccttgc 540
cgtgtccggc ggacgccaac gaaacatcga aggctgggtg caaaagaagc gccctggaac 600
cgctgcagca caagccgcag aagccgccca aaacgtccac aaccaggaag gctaatagct 660
gccaattatt ccgggcttgt gacccgctac ccgataaata ggtcggctga aaaatttcgt 720
tgcaatatca acaaaaaggc ctatcattgg gaggtgtcgc accaagtact tttgcgaagc 780
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 18
tccgcagaaa gcacctcatt cacgatgtgc atggaggaac ggccagtcat cgcaatgcgg 60
gaacgcacct cgaccatgtg gccagaggga atagggcgag tgaagtgaat gtgaccaaca 120
taagcagtga cacagtaggt tccagaccac tgggtagcac aagcataagc agccttatcg 180
atccattcca ggactcggcc accgccaacg ccatggctac cagccatcaa aacgtcagta 240
ggggcagcca tgaaacgaag gacgacttct ggggagcggt gtggattctc acggggattc 300
tcatgcggat tatcagacat atggacactt taacggttcg tactaggctg atgcttcatg 360
aggattgatc cgctggaaac ccggcaagcc gtattggccg tcaaagactg gattgaaggg 420
gagggagacg tcgaaaagcc tggtcgtgcg gcacttgccg ccgcaactcg cctgagcgtc 480
cgactgctcg cgcaagacgc gccgggaaac agcgtggagg tgcgggtacc cccatttgtt 540
gcggtgcaat gcatagaggg gccaaaacat acacgcggca caccacccaa cgtggtggag 600
accgacgcca agacctggtt acgcttagca actgggcaaa ccacatttga tgcagaattt 660
gaaagcggaa aaattagcgc atcaggtacc cgagccaaag agattgcgga ctggttacca 720
gtggtcaaac tttagccgtt gaaaactaaa aagctgggaa ggtgaatcga atttcggggc 780
tttaaagcaa aaatgaacag cttggtctat agtggctagg tacccttttt gttttggaca 840
catgtagggt ggccgaaaca aagtaaaagg aggaccggaa tgacccaggt aaaccacccg 900
tacgatgatc tcaacgaaca ggcaccgcag gaagaatgcg gcgttttcgg cgtttgggcg 960
ccaggtgagg aagtctcgaa acttacctac tttggcctct tcgcacttca gcaccgtggt 1020
caagaagccg cgggcatcgc agtaggcgat ggcgaacaga tcctggtttt caaagatttg 1080
ggcctagtct cccaagtttt cgacgaacca attctggaat ccctccgcgg aaacatcgcc 1140
atcggacaca cccgatacac caccgccggc ggaaacacct gggaaaatgc ccagcctatg 1200
ttccgcatgg caccagatgg caccgatatc gcccttggac acaacggcaa cctgattaat 1260
tacatcgagt tgttggacaa agccaccgaa cttggcctcg tcgatcccgc caagaagcca 1320
tcagataccg atgtgctcac tggactgctc gcaagcggcg tccatgacgg aaataatctc 1380
tttgattccg ccaaggaact cctccccagc gtcaagggag cctactgcct caccttcacc 1440
gacggacaca ccctgtacgc agcgcgtgat ccattcggca tccgcccact gtccatcggc 1500
cgcctcgagc gcggctgggt agtcgcatct gaaaccgcag cgctcgacat cgtaggtgcc 1560
tcgcatgtgc gcgaggtcga accaggcgaa ctgattgcta tcgacgaatc cggcctcaag 1620
tccgcacgat tcgccgagac aacccgcaaa ggtt 1654
<210> 19
<211> 494
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 19
Met Thr Gln Val Asn His Pro Tyr Asp Asp Leu Asn Glu Gln Ala Pro
1 5 10 15
Gln Glu Glu Cys Gly Val Phe Gly Val Trp Ala Pro Gly Glu Glu Val
20 25 30
Ser Lys Leu Thr Tyr Phe Gly Leu Phe Ala Leu Gln His Arg Gly Gln
35 40 45
Glu Ala Ala Gly Ile Ala Val Gly Asp Gly Glu Gln Ile Leu Val Phe
50 55 60
Lys Asp Leu Gly Leu Val Ser Gln Val Phe Asp Glu Pro Ile Leu Glu
65 70 75 80
Ser Leu Arg Gly Asn Ile Ala Ile Gly His Thr Arg Tyr Thr Thr Ala
85 90 95
Gly Gly Asn Thr Trp Glu Asn Ala Gln Pro Met Phe Arg Met Ala Pro
100 105 110
Asp Gly Thr Asp Ile Ala Leu Gly His Asn Gly Asn Leu Ile Asn Tyr
115 120 125
Ile Glu Leu Leu Asp Lys Ala Thr Glu Leu Gly Leu Val Asp Pro Ala
130 135 140
Lys Lys Pro Ser Asp Thr Asp Val Leu Thr Gly Leu Leu Ala Ser Gly
145 150 155 160
Val His Asp Gly Asn Asn Leu Phe Asp Ser Ala Lys Glu Leu Leu Pro
165 170 175
Ser Val Lys Gly Ala Tyr Cys Leu Thr Phe Thr Asp Gly His Thr Leu
180 185 190
Tyr Ala Ala Arg Asp Pro Phe Gly Ile Arg Pro Leu Ser Ile Gly Arg
195 200 205
Leu Glu Arg Gly Trp Val Val Ala Ser Glu Thr Ala Ala Leu Asp Ile
210 215 220
Val Gly Ala Ser His Val Arg Glu Val Glu Pro Gly Glu Leu Ile Ala
225 230 235 240
Ile Asp Glu Ser Gly Leu Lys Ser Ala Arg Phe Ala Glu Thr Thr Arg
245 250 255
Lys Gly Cys Val Phe Glu Tyr Val Tyr Leu Ala Arg Pro Asp Ser Val
260 265 270
Ile Lys Gly Arg Asn Val Asn Glu Ala Arg Leu Glu Ile Gly Arg Lys
275 280 285
Leu Ala Ala Glu Ala Pro Ala Val Gly Asp Leu Val Ile Pro Thr Pro
290 295 300
Glu Ser Gly Thr Pro Ala Ala Val Gly Phe Ala Gln Ala Ser Gly Ile
305 310 315 320
Pro Phe Gly Gln Gly Met Val Lys Asn Ala Tyr Val Gly Arg Thr Phe
325 330 335
Ile Gln Pro Ser Asp Thr Leu Arg Gln Leu Gly Ile Arg Leu Lys Leu
340 345 350
Asn Pro Leu Arg Glu Val Ile Ala Gly Lys Arg Leu Val Val Val Asp
355 360 365
Asp Ser Ile Val Arg Gly Asn Thr Gln Arg Ala Val Ile Arg Met Leu
370 375 380
Arg Glu Ala Gly Ala Ala Glu Val His Val Arg Ile Ala Ser Pro Pro
385 390 395 400
Val Lys Trp Pro Cys Phe Tyr Gly Ile Asp Phe Ala Thr Pro Gly Glu
405 410 415
Leu Ile Ala Asn Ala Val Thr Ser Asp Asn Glu Ala Glu Met Val Glu
420 425 430
Ala Val Arg Ser Ala Ile Gly Ala Asp Thr Leu Gly Tyr Val Ser Ile
435 440 445
Asp Ser Met Val Ala Ala Thr Glu Gln Pro Ala Asn Glu Leu Cys Ile
450 455 460
Ala Cys Phe Asp Gly Lys Tyr Pro Met Gly Leu Pro Gln Gly Asn Ser
465 470 475 480
Asn Ala Asp Leu Val Arg Lys Met Gln Ala Thr Ala Ser Ser
485 490
<210> 20
<211> 1473
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 20
atgatggttc cgaggccgaa gaccgttaac atatctgttg tgaattctga ctctacgacc 60
accattgtcg tgctagcttc cggaacaggc accctccttc agtcactcat tgaagcgcaa 120
ggtacctatt cgatcgtggg cgttgtctct gacgtcgaat gccctgcact ttccagagcc 180
gcagatgcag gtattgatac tgcagttgtt ccgcttggaa aagatcgtgc acagtggaac 240
cacgagcttg cagacgcagt tgcagtaagc gacccagatt tggtggtctc tgcgggattc 300
atgaaaattt tgggcgaagg tttcctctca aggttcccgt cccgcatcat caacacccac 360
ccagctttat tgccttcttt ccctggtgcc cacgcggttc gcgatgcttt ggcatacggt 420
gtgaaagtgt caggttcgac agttcacctt gtcgatgctg gtgtggatac cggcccaatt 480
attgctcaac gagcagtgcc ggtagaagtg aatgatgatg aatccagcct gcatgaaaga 540
atcaagcagg ttgagcgtaa actcattgta gaagtcctga acagcgtgga attttcgcgt 600
cagggtggcg tacaactcaa ctggagaggc taatggccgt taccctgcga atgtccacag 660
ggtagctggt agtttgaaaa tcaacgccgt tgcccttagg attcagtaac tggcacattt 720
tgtaatgcgc tagatctgtg tgctcagtct tccaggctgc ttatcacagt gaaagcaaaa 780
ccaattcgtg gctgcgaaag tcgtagccac cacgaagtcc aggaggacat acaatgagcg 840
atgatcgtaa ggcaattaaa cgcgcactaa ttagcgtgta tgacaagact ggcctggagg 900
atctagccca ggcacttcac cgcgagaacg tggaaattgt ttccaccgga tccactgcgg 960
cgaagattgc tgagcttggt attcctgtta ccccggttga ggagctcacc ggtttccctg 1020
agtgccttga gggccgtgtg aagacactgc accctaaggt tcacgctggc atcttggcgg 1080
acacccgcaa ggaagaccac ctgcgtcagc tcaaggaact tgaggtcgcc ccattccagc 1140
ttgtcgtggt gaacctgtac ccatttgctg agaccgttgc gtccggcgcc gatttcgatg 1200
cttgcgttga gcagatcgac atcggaggcc catccatggt tcgtgctgcg gcaaagaacc 1260
acccatctgt cgctgtggtt gtttcaccga accgctacga ggatgtccag gaagctttga 1320
agaccggtgg attctcccgc gcggagcgca ccaagttggc tgctgaggct ttccgccaca 1380
ccgcaaccta cgatgtcacc gttgcaacct ggatgagcga gcagctggct gccgaagatt 1440
ctgagactga gttcccaggt tggatcggca cca 1473
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 21
gctctagagt atcggcgtgg agttgtc 27
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 22
tagtggagta gctttatttt gcgacacctg cc 32
<210> 23
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 23
gtcgcaaaat aaagctactc cactagtgtg atcg 34
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 24
ggttcctcct ttgcgtaaga cctcactcgc 30
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 25
gaggtcttac gcaaaggagg aaccgaatga agacatttga 40
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 26
cgcggatccc aggatctgct gctctgg 27
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 27
cccaagcttc gaggaaaccg ttgagga 27
<210> 28
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 28
tagtggagta gctatggatt tcacctctgt gaatg 35
<210> 29
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 29
tctccacttt aggtaagcta ctccactagt gtgatcg 37
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 30
cgatcctcct ttgcgtaaga cctcactcgc 30
<210> 31
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 31
gaggtcttac gcaaaggagg atcgccatgt tgaatgtc 38
<210> 32
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 32
cgcggatccg gcagaggcat cagcaag 27
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 33
atgtgctgca aggcgattaa 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 34
tatgcttccg gctcgtatgt 20
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 35
ttttatatat gggtatcggc ggtctatgct 30
<210> 36
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 36
cgcggatcca tctacgttgc tggtggc 27
<210> 37
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 37
acgggcaaca gctgctgctc tggggtgac 29
<210> 38
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 38
cagagcagca gctgttgccc gtctcactgg t 31
<210> 39
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 39
ggtagttaaa attacgcccc gccctgccac t 31
<210> 40
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 40
gcggggcgta attttaacta cccccgaaaa t 31
<210> 41
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 41
ccggaattcc gaatgaaatc tgggacg 27
<210> 42
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 42
cgaagcagga tctgctgctc tggggtgac 29
<210> 43
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 43
cagagcagca gatcctgctt cgccgcatcc a 31
<210> 44
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 44
ggtagttaaa actagatgcg ggcgatgcg 29
<210> 45
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 45
cccgcatcta gttttaacta cccccgaaaa t 31
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 46
tcccaaacaa aggctcgc 18
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 47
cagtcggcgg tttgctaa 18
<210> 48
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 48
atgttgaaaa tcgctg 16
<210> 49
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 49
ttactgcagt ggcagcgtcc aggttgtcgc ggtcgacctt gtaatccagc at 52
<210> 50
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 50
acctggacgc tgccactgca gtaaccccag gcttctccgg cccagcggta tc 52
<210> 51
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 51
ctagatgcgg gcgatgcgg 19
<210> 52
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 52
gctctagaaa aggaggatcc tcatgactgc tcactgg 37
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 53
ttgtcctcct ttttaggcct cgccctcgaa 30
<210> 54
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 54
ggcgaggcct aaaaaggagg acaatcatgt tgaaaatcgc tg 42
<210> 55
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 55
tcccccgggc tagatgcggg cgatgcgg 28
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 56
caattaatca tcggctcgta 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 57
accgcttctg cgttctgatt 20
<210> 58
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 58
cgcggatccg ctctttcgga gtgacct 27
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 59
taagcaagcg agaaaactcc tttattgtcg 30
<210> 60
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 60
taaaggagtt ttctcgcttg cttatagggt c 31
<210> 61
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 61
ccggaattct cgggaagcag ttagtgaaa 29
<210> 62
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 62
ttgacgacgc aagagcca 18
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 63
caccattacc gatgagaaac 20
<210> 64
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 64
cccaagctta aaggaggacc atcatgagca caaacacgac cccct 45
<210> 65
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 65
gctctagatt agacggtttc cagcttg 27
<210> 66
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 66
tcccccggga aaggaggacc ttcatgagcg atgatcgtaa g 41
<210> 67
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 67
ccggaattct tagtgagcga agtgtcgcg 29
<210> 68
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 68
gctctagaaa aggaggacca tcatgagcac aaacacgacc c 41
<210> 69
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 69
agtcatgagg atcctccttt ttagacggtt tccagcttg 39
<210> 70
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 70
tcaagctgga aaccgtctaa aaaggaggat cctcatgact gctcactg 48
<210> 71
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 71
tcccccgggc tagatgcggg cgatgcggat ttc 33
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 72
caattaatca tcggctcgta 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 73
accgcttctg cgttctgatt 20
<210> 74
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 74
cgcggatcct ccgcagaaag cacctca 27
<210> 75
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 75
tttagttttc aacggctaaa gtttgaccac tgg 33
<210> 76
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 76
gtggtcaaac tttagccgtt gaaaactaaa aagc 34
<210> 77
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 77
tccggtcctc cttttacttt gtttcggcca ccc 33
<210> 78
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 78
ggccgaaaca aagtaaaagg aggaccggaa tgacccaggt aaaccac 47
<210> 79
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 79
ccggaattca acctttgcgg gttgtct 27
<210> 80
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 80
cccaagcttt ccagcaacca cctggat 27
<210> 81
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 81
aattggcagc tattagcctt cctggttgtg 30
<210> 82
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 82
caggaaggct aatagctgcc aattattccg 30
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 83
ttgtcctcct ttgggtaaaa aatcctttcg 30
<210> 84
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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gattttttac ccaaaggagg acaaccatga ctgctcactg gaa 43
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Claims (28)
- L-아미노산을 생산하는 재조합균으로서,
상기 재조합균은 시작균에 비하여 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제 pgi 유전자의 낮아진 발현과 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제 zwf-opcA 유전자의 향상된 발현을 가지며,
상기 시작균은 목표 아미노산인 L-히스티딘을 누적시킬 수 있는 균주이며,
상기 재조합균 염색체 상의 pgi 유전자는 녹아웃에 의해 불활성화되거나 상기 pgi 유전자의 조절 요소가 낮은 전사 활성 또는 낮은 발현 활성을 가진 조절 요소로 교체되며,
상기 재조합균은 2개 이상 카피된 zwf-opcA 유전자를 가지거나 상기 시작균 염색체 상의 tkt-tal-zwf-opcA-devB 오페론 프로모터가 강한 프로모터인 원시균의 프로모터 Peftu 로 교체되며,
상기 시작균은 hisEG 유전자와 hisDCB 유전자의 프로모터가 각각 강한 프로모터인 원시균 염색체 상의 프로모터 PglyA 로 교체되어 원시균에 비하여 L-히스티딘 합성 오페론 hisEG 유전자와 hisDCB 유전자의 향상된 발현을 가지며,
상기 시작균의 염색체는 원시균 염색체 상의 L-히스티딘 합성 오페론 hisEG 유전자와 hisDCB 유전자의 프로모터를 각각 교체하는데에 사용되고 서열목록 7의 뉴클레오티드 서열 중 5’ 말단을 기준으로 제863-1038번 뉴클레오티드 서열에 해당하는 프로모터 PglyA 를 가지며,
상기 시작균의 hisE 유전자와 hisD 유전자의 리보솜 결합 사이트(RBS)는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 높은 발현 유전자의 보수 RBS 서열인 AAAGGAGGA로 교체되고 hisE 유전자의 초기 코돈 GTG는 높은 발현 강도의 ATG로 교체되며,
상기 시작균은 돌연변이된 ATP-포스포리보실 전이효소를 발현할 수 있고 상기 돌연변이된 ATP-포스포리보실 전이효소는 서열번호 6이 보여주는 ATP-포스포리보실 전이효소의 서열 중 제215번 아스파라진이 라이신으로 돌연변이되고, 제231번 류신이 페닐알라닌으로 돌연변이되고, 제235번 트레오닌이 알라닌으로 돌연변이된 효소이며,
상기 시작균의 염색체는 원시균 염색체 상의 hisG 유전자를 교체하는데에 사용되고 서열목록 4의 뉴클레오티드 서열 중 5’ 말단을 기준으로 제1007-1852번 뉴클레오티드 서열에 해당하는 hisGfbr 유전자를 가지는 것을 특징으로 하는 재조합균.
- 제1항에 있어서, 상기 시작균은 원시균에 비하여 PRPP 합성 효소 prsA 유전자의 향상된 발현을 가지며,
상기 시작균은 2개 이상 카피된 prsA 유전자를 가지거나 상기 prsA 유전자의 프로모터가 강한 프로모터인 원시균의 프로모터 Psod 로 교체되는 것을 특징으로 하는 재조합균.
- 제2항에 있어서, 상기 재조합균은 시작균에 비하여 향상된 AICAR 트랜스메칠라제/IMP 환히드라제 purH 유전자의 향상된 발현을 가지며,
상기 재조합균은 2개 이상 카피된 purH 유전자를 가지거나 상기 purH 유전자의 프로모터가 강한 프로모터인 원시균의 프로모터 Peftu 로 교체되는 것을 특징으로 하는 재조합균.
- 제3항에 있어서, 상기 재조합균은 시작균에 비하여 아미도포스포리보실 전이효소 purF 유전자의 약화된 발현을 가지며,
상기 purF 유전자의 프로모터가 약한 프로모터인 원시균의 프로모터 Phom 으로 교체되는 것을 특징으로 하는 재조합균.
- 제4항에 있어서, 상기 원시균은 코리네박테리움속 세균, 다이어리스터속 세균 또는 브레비박테리움속 세균으로부터 선택되는 한 가지 균주이고,
상기 코리네박테리움속 세균은 Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium pekinense, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium crenatum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium aminogenes, Corynebacterium lilium, Corynebacterium callunae 및 Corynebacterium herculis으로부터 선택되는 한 가지 균주이고;
상기 다이어리스터속 세균은 Microbacterium ammoniaphilum으로부터 선택되는 한 가지 균주이며;
상기 브레비박테리움속 세균은 Brevibacteriaceae flvum, Brevibacteriaceae lactofermentum 및 Brevibacteriaceae ammoniagenes으로부터 선택되는 한 가지 균주인 것을 특징으로 하는 재조합균.
- 제5항에 있어서, 상기 원시균은 야생형 Corynebacterium glutamicum ATCC13032인 것을 특징으로 하는 재조합균.
- 제6항에 있어서, 상기 시작균의 염색체는 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 염색체 상의 prsA 유전자의 프로모터를 교체하는데에 사용되고 서열목록 11의 뉴클레오티드 서열 중 5’ 말단을 기준으로 제656-847번 뉴클레오티드 서열에 해당하는 프로모터 Psod 를 가지거나;
상기 시작균은 2개 이상 카피된 prsA 유전자와 hisGfbr 유전자를 가지며,
상기 prsA 유전자는 서열목록 4의 뉴클레오티드 서열 중 5’ 말단을 기준으로 제15-992번 뉴클레오티드 서열에 해당하는 것을 특징으로 하는 재조합균.
- 제7항에 있어서, 상기 pgi 유전자는 서열목록 13의 뉴클레오티드 서열에 해당하고,
상기 zwf-opcA 유전자는 서열목록 2의 뉴클레오티드 서열에 해당하고,
상기 프로모터 Peftu 는 서열목록 12의 뉴클레오티드 서열 중 5’ 말단을 기준으로 제635-834번 뉴클레오티드 서열에 해당하고,
상기 purH 유전자는 서열목록 15의 뉴클레오티드 서열에 해당하며,
상기 프로모터 Phom 은 서열목록 18의 뉴클레오티드 서열 중 5’ 말단을 기준으로 제736-865번 뉴클레오티드 서열에 해당하는 것을 특징으로 하는 재조합균.
- L-아미노산을 생산할 수 있는 제1항의 재조합균을 제작하는 방법으로서,
상기 시작균 중의 글루코스-6-포스페이트 아이소메라아제 pgi 유전자의 발현을 낮추고 시작균 중의 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제 zwf-opcA 유전자의 발현을 향상시켜 재조합균을 얻는 단계를 포함하고,
상기 시작균은 목표 아미노산인 L-히스티딘을 누적시킬 수 있는 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 시작균 중의 pgi 유전자의 발현을 낮추는 것은 하기의 A) 또는 B) 방식을 통하여 구현되고 상기 시작균 중의 zwf-opcA 유전자의 발현을 향상시키는 것은 하기의 C) 또는 D) 방식을 통하여 구현되는 것을 특징으로 하는 방법 :
A) 상기 시작균 염색체 상의 pgi 유전자를 녹아웃에 의해 불활성화시킨다.
B) 상기 시작균 중의 pgi 유전자의 조절 요소를 낮은 전사 활성 또는 낮은 발현 활성을 가진 조절 요소로 교체한다.
C) 상기 시작균 중의 zwf-opcA 유전자의 카피 수량을 증가시킨다.
D) 상기 시작균 염색체 상의 tkt-tal-zwf-opcA-devB 오페론 프로모터를 강한 프로모터인 원시균의 염색체 상의 프로모터 Peftu 로 교체시킨다.
- 제9항에 있어서, 상기 시작균을 취득하는 것은 시작균 염색체 상의 L-히스티딘 합성 오페론 hisEG 유전자와 hisDCB 유전자의 프로모터를 각각 강한 프로모터인 원시균 염색체 상의 프로모터 PglyA 로 교체시키는 단계; 및 시작균 중의 PRPP 합성 효소 prsA 유전자의 발현을 향상시키는 단계를 포함하고,
상기 시작균 중의 prsA 유전자의 발현을 향상시키는 것은 하기의 E) 또는 F) 방식을 통하여 구현되는 것을 특징으로 하는 방법 :
E) 상기 시작균 중의 prsA 유전자의 카피 수량을 증가시킨다.
F) 상기 시작균 염색체 상의 prsA 유전자의 프로모터를 강한 프로모터인 원시균 염색체 상의 프로모터 Psod 로 교체시킨다.
- 제11항에 있어서, 상기 재조합균 중의 AICAR 트랜스메칠라제/IMP 환히드라제 purH 유전자의 발현을 향상시키는 단계를 더 포함하고,
상기 재조합균 중의 purH 유전자의 발현을 향상시키는 것은 하기의 G) 또는 H) 방식을 통하여 구현되는 것을 특징으로 하는 방법 :
G) 상기 시작균 중의 purH 유전자의 카피 수량을 증가시킨다.
H) 상기 시작균 염색체 상의 purH 유전자의 프로모터를 강한 프로모터인 원시균 염색체 상의 프로모터 Peftu 로 교체시킨다.
- 제12항에 있어서, 상기 재조합균 중의 아미도포스포리보실 전이효소 purF 유전자의 발현을 약화시키는 단계를 더 포함하고,
상기 재조합균 중의 purF 유전자의 발현을 약화시키는 단계는 상기 시작균 염색체 상의 purF 유전자의 프로모터를 약한 프로모터인 원시균 염색체 상의 프로모터 Phom 으로 교체시키는 것을 통하여 구현되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 시작균을 얻기 위해 사용되는 원시균은 코리네박테리움속 세균, 다이어리스터속 세균 또는 브레비박테리움속 세균으로부터 선택되는 한 가지 균주이고,
상기 코리네박테리움속 세균은 Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium pekinense, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium crenatum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium aminogenes, Corynebacterium lilium, Corynebacterium callunae 및 Corynebacterium herculis으로부터 선택되는 한 가지 균주이고;
상기 다이어리스터속 세균은 Microbacterium ammoniaphilum으로부터 선택되는 한 가지 균주이며;
상기 브레비박테리움속 세균은 Brevibacteriaceae flvum, Brevibacteriaceae lactofermentum 및 Brevibacteriaceae ammoniagenes으로부터 선택되는 한 가지 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 원시균은 야생형 Corynebacterium glutamicum ATCC13032인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 시작균을 얻기 위해 하기 단계들이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법 :
상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 염색체 상의 L-히스티딘 합성 오페론 hisEG 유전자와 hisDCB 유전자의 프로모터를 각각 서열목록 7의 뉴클레오티드 서열 중 5’ 말단을 기준으로 제863-1038번 뉴클레오티드 서열에 해당하는 프로모터 PglyA 로 교체하는 단계; 및
상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 의해 발현되고 서열번호 6이 보여주는 ATP-포스포리보실 전이효소의 제215번 아스파라진을 라이신으로 돌연변이시키고 제231번 류신을 페닐알라닌으로 돌연변이시키고 제235번 트레오닌을 알라닌으로 돌연변이시키는 단계(상기 돌연변이를 수행하기 위해 사용되는 유전자는 서열목록 4의 뉴클레오티드 서열 중 5’ 말단을 기준으로 제1007-1852번 뉴클레오티드 서열에 해당하는 hisGfbr 유전자이다).
- 삭제
- 제16항에 있어서, 상기 시작균을 얻기 위해 하기의 단계들이 더 포함되는 것을 특징으로 하는 방법 :
상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 염색체 상의 prsA 유전자의 프로모터를 서열목록 11의 뉴클레오티드 서열 중 5’ 말단을 기준으로 제656-847번 뉴클레오티드 서열에 해당하는 프로모터 Psod 로 교체하는 단계; 또는
상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 중의 prsA 유전자의 카피 수량을 증가시키고 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 중의 hisGfbr 유전자 카피 수량을 증가시키는 단계(상기 prsA 유전자는 서열목록 4의 뉴클레오티드 서열 중 5’ 말단을 기준으로 제15-992번 뉴클레오티드 서열에 해당한다).
- 제18항에 있어서, 상기 pgi 유전자는 서열목록 13의 뉴클레오티드 서열에 해당하고,
상기 zwf-opcA 유전자는 서열목록 2의 뉴클레오티드 서열에 해당하고,
상기 프로모터 Peftu 는 서열목록 12의 뉴클레오티드 서열 중 5’ 말단을 기준으로 제635-834번 뉴클레오티드 서열에 해당하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 purH 유전자는 서열목록 15의 뉴클레오티드 서열에 해당하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 프로모터 Phom 은 서열목록 18의 뉴클레오티드 서열 중 5’ 말단을 기준으로 제736-865번 뉴클레오티드 서열에 해당하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항의 재조합균을 발효 배양하는 단계를 포함하는 L-아미노산의 생산 방법.
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