CN115960874A - 一种谷氨酸棒杆菌内源GlcNAc6P磷酸酶及提高GlcNAc产量的方法 - Google Patents
一种谷氨酸棒杆菌内源GlcNAc6P磷酸酶及提高GlcNAc产量的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115960874A CN115960874A CN202310111425.9A CN202310111425A CN115960874A CN 115960874 A CN115960874 A CN 115960874A CN 202310111425 A CN202310111425 A CN 202310111425A CN 115960874 A CN115960874 A CN 115960874A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- corynebacterium glutamicum
- glcnac
- glcnac6p
- endogenous
- phosphatase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 title claims abstract description 57
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 56
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 title claims abstract description 46
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 title claims abstract description 46
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 31
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 13
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 claims description 11
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 claims description 11
- 241000759360 Corynebacterium glutamicum S9114 Species 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 claims description 3
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 claims description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 abstract description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 9
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 abstract description 5
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 abstract description 5
- 238000010801 machine learning Methods 0.000 abstract description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 15
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 15
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 4
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 4
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 4
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- SPLIXMVCDRBRKV-BCLLBKCYSA-N (2s)-2-aminopentanedioic acid;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O SPLIXMVCDRBRKV-BCLLBKCYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- DUKURNFHYQXCJG-UHFFFAOYSA-N Lewis A pentasaccharide Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(NC(C)=O)C(OC2C(C(OC3C(OC(O)C(O)C3O)CO)OC(CO)C2O)O)OC1CO DUKURNFHYQXCJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 235000012182 cereal bars Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 150000002301 glucosamine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229960003350 isoniazid Drugs 0.000 description 1
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种谷氨酸棒杆菌内源GlcNAc6P磷酸酶及提高GlcNAc产量的方法,具体涉及采用重组谷氨酸棒杆菌进行发酵生产,该重组谷氨酸棒杆菌过表达了如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列,该蛋白编码GlcNAc6P磷酸酶,能将GlcNAc6P去磷酸化为GlcNAc。本发明通过机器学习的方式鉴定了谷氨酸棒杆菌内源GlcNAc胞内转运蛋白以及内源GlcNAc6P磷酸酶的编码基因,并根据筛选结果对菌株进行改造,显著提高了GlcNAc的产量。
Description
技术领域
本发明涉及一种谷氨酸棒杆菌内源GlcNAc6P磷酸酶及提高GlcNAc产量的方法,属于生物技术领域。
背景技术
N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)是氨基葡萄糖的一种衍生物,也是合成双岐因子和透明质酸的重要前体物质,又称2-(乙酰氨基)-2-脱氧-葡萄糖及N-乙酰葡萄糖胺,是生物体内多种多糖的基本组成单位,在生物体内具有重要的生理功能,现已在食品、医药、化妆品等领域有着广泛应用。谷氨酸棒杆菌是一种革兰氏阳性菌,它作为一种食品级的微生物已经应用于诸多氨基酸的工业化发酵生产中。相比于大肠杆菌来说,谷氨酸棒杆菌具有高安全性,低致病性,高抗逆性,而且受噬菌体污染的概率较低等优点,因而使用谷氨酸棒杆菌工程菌发酵生产GlcNAc更为安全。但目前使用谷氨酸棒杆菌生产GlcNAc的代谢通路还有若干途径未被解析,因此,进一步解析代谢途径对发酵生产GlcNAc来说十分重要。
发明内容
为解决上述问题,本发明通过解析谷氨酸棒杆菌中GlcNAc胞内转运蛋白以及GlcNAc6P磷酸酶,期望进一步提高GlcNAc的产量及转化率。首先根据结构相似性筛选出候选内源胞内转运蛋白和内源磷酸酶,之后分别尝试敲除内源胞内转运蛋白的编码基因或过表达磷酸酶的编码基因,发现过表达其中一种磷酸酶的编码基因,产量得到明显提升。
本发明的第一个目的是提供一种谷氨酸棒杆菌内源GlcNAc6P磷酸酶,其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。该蛋白编码GlcNAc6P磷酸酶,能将GlcNAc6P去磷酸化为GlcNAc。具体地,序列如下:
MIKAIFWDMDGTMVDSEPQWGIATYELSEAMGRRLTPELRELTVGSS
LPRTMRLCAEHAGITLSDTDYERYRAGMFARVHELFDESLVPNPGVTELLT
ELKALEIPMLVTTNTERDLATRSVAAVGNEFFIGSIAGDEVPTAKPAPDMYL
EAARRVGFDPSECLVFEDSYNGMLGAVTAGCRVIGLHPEEVQAPEGVVPLR
SLHGKNSFEGVTAEMVTSWYHQIEPAGVAK。
目前,有人在使用大肠杆菌和枯草芽孢杆菌生产GlcNAc,而大肠杆菌K12(E.coliK-12)以及枯草芽孢杆菌168(Bacillus Subtilis 168)中GlcNAc胞内转运蛋白已经有相关报道,研究人员通过敲除GlcNAc胞内转运蛋白的编码基因,所得到的重组菌株生产GlcNAc的能力有显著提升。而在谷氨酸棒杆菌中上述蛋白还未被鉴定。在发酵生产GlcNAc产品时,是否存在GlcNAc向胞内转运的途径,以及胞内GlcNAc-6P去磷酸化为GlcNAc的途径,还未被揭示。
本发明中,在初步确认无专一性的内源转运蛋白后,首次通过机器学习的方法筛选出具有类似功能的转运蛋白,同时鉴定出两种具有类似功能的GlcNAc6P磷酸酶。之后通过敲除转运蛋白、过表达磷酸酶的方法以期进一步提高产量。最终发现过表达其中一种磷酸酶能够使产量进一步提升,同时进一步完善了谷氨酸棒杆菌发酵生产GlcNAc的代谢途径,具有重要的经济价值和社会意义。
本发明的第二个目的是提供编码上述谷氨酸棒杆菌内源GlcNAc6P磷酸酶的基因。
进一步地,其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第三个目的是提供携带上述基因的重组质粒。
本发明的第四个目的是提供一种重组谷氨酸棒杆菌,所述重组谷氨酸棒杆菌过表达了如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
进一步地,以谷氨酸棒杆菌S9114为出发菌株。
进一步地,以pJYW-4为表达载体。
本发明的第五个目的是提供一种提高N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc产量的方法,包括应用上述重组谷氨酸棒杆菌进行发酵的步骤。
进一步地,将所述重组谷氨酸棒杆菌在种子培养基中活化培养得到种子液,再将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养。
进一步地,发酵温度为25~35℃。
本发明的有益效果:
本发明通过机器学习的方式分析转录组数据,筛选出了一种谷氨酸棒杆菌内源GlcNAc胞内转运蛋白,同时筛选出了两种谷氨酸棒杆菌内源GlcNAc6P磷酸酶,并公布了其编码基因。从而提供了一种提高谷氨酸棒杆菌N-乙酰氨基葡萄糖产量的方法,其浓度在摇瓶中为37.5g/L,50L发酵罐中产量为117.1g/L,葡萄糖转化率为30.7%,均为行业领先水平。本发明筛选出的GlcNAc胞内转运蛋白以及GlcNAc6P磷酸酶编码基因为进一步代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。
附图说明
图1为实验验证谷氨酸棒杆菌S9114中是否存在专一性的GlcNAc胞内转运蛋白;
图2为对照组、敲除胞内转运蛋白、过表达两种磷酸酶发酵生产GlcNAc的产量;
图3为不同菌代谢途径的鉴定情况;灰色方框代表相关蛋白已经解析,白色方框代表未被解析。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述实施例中所涉及的检测方法及相关实验方案:
(一)培养基
种子活化液体培养基(LBB培养基)(g/L):酵母粉5.0,蛋白胨10.0,NaCl 10.0,脑心浸液18.5,250mL挡板三角瓶装液量为25mL。
种子活化固体培养基(LBB固体培养基)(g/L):酵母粉5.0,蛋白胨10.0,NaCl10.0,脑心浸液18.5,营养琼脂粉20.0。
感受态培养基(g/L):脑心浸液18.5,酵母粉5.0,蛋白胨10.0,NaCl 10.0,甘氨酸30.0,异烟肼4.0,添加1mL吐温80(Tween 80),500mL挡板三角瓶装液量为50mL。
电击转化后恢复液体培养基LBHIS(g/L):蛋白胨5.0,酵母膏5.0,NaCl5.0,山梨醇91.0,脑心浸液18.5。
转化子涂布固体培养基(g/L):蛋白胨5.0,酵母膏5.0,NaCl 5.0,山梨醇91.0,脑心浸液18.5,营养琼脂20.0。
种子培养基(g/L):葡萄糖25.0,玉米浆20.0,KH2PO4 1.0,(NH4)2SO4 0.5,脲1.25,调节pH(用1mol/L的氢氧化钾调节)至7.0。
摇瓶发酵培养基(g/L):葡萄糖100.0,玉米浆15.0,KH2PO4 1.0,(NH4)2SO420.0,MgSO4 0.5,CaCO3 20.0,Fe2(SO4)3 0.18。调节pH(用1mol/L的氢氧化钾调节)至7.0。
补料分批发酵初始培养基(g/L):葡萄糖50.0,玉米浆10.0,KH2PO4 1.0,(NH4)2SO420.0,MgSO4 0.5,Fe2(SO4)3,0.18。调节pH(用1mol/L的氢氧化钾调节)至7.0。
谷氨酸棒杆菌培养基所采用的抗生素及相应浓度:卡那霉素25μg/mL,氯霉素10μg/mL。
灭菌条件:葡萄糖配成500g/L的母液,采用115℃灭菌20min,不含葡萄糖的培养基采用121℃灭菌15min。
(二)产物的测定方法
乙酰氨基葡萄糖的测定方法:高效液相色谱(HPLC)检测法:Agilent 1260,RID检测器,HPX-87H柱(Bio-Rad Hercules,CA),流动相:5mM H2SO4,流速0.5mL/min,柱温40℃,进样体积为10μL。
发酵液中葡萄糖浓度采用SBA-40C型葡萄糖-谷氨酸分析仪(山东科学院生物研究所)进行测定。
(三)质粒化学转化大肠杆菌感受态细胞
超底温冰箱保存的大肠杆菌感受态细胞置于冰上融化;加入6μL消化后的PCR产物轻轻混合,冰浴30min。将装有感受态细胞的离心管置于42℃的水浴中热激90s,将离心管转移至冰浴中使细胞冷却2min;加入800μL LB培养基于37℃培养1h;离心去除少量上请,再悬浮菌休,将培养液涂布在含有相应抗生素的LB平板上,37℃倒置培养10-12h,观察菌落,挑取单菌落使用菌落PCR验证阳性克隆,挑取阳性单菌落于含有相应抗性的LB液体培养基中培养过夜后提取质粒并进行测序验证。
(四)谷氨酸棒杆菌电转感受态的制备
(1)谷氨酸棒杆菌S9114接种于LBB培养基(需要在新鲜培养的斜面上进行挑选,否则会影响菌体的生长),置于巡回式摇床(220rpm)上,30℃培养16h,OD600达到0.4。
(2)以10%的接种量将(1)中的菌液转接入感受态培养基中OD600达到0.3,置于巡回式摇床(220rpm)上,30℃培养至OD600达到0.8(培养约3-5h,处于对数生长期即可,一般如果菌浓的持续较低约0.6左右也可以继续后续操作)。需要保证菌体浓度尽量要浓,一般浓缩倍数为100倍(50mL感受态培养基浓缩至0.5mL制备5管感受态细胞)。
(3)菌液冰水浴15min,4000rpm,4℃离心10min,弃去上清。
(4)用30mL预冷的10%甘油充分悬浮菌体,4000rpm,4℃离心10min,弃去上清,重复洗涤重悬四次。
(5)用500μL预冷10%甘油重悬细胞(浓缩100倍),1.5mL无菌离心管分装,每管分装90-100μL。
(6)分装的感受态细胞-80℃保存待用(为保证感受态的转化效率最好现用现做,不能放置超过1周,否则由于感受态细胞裂解细胞内容物释放,在后续电击转化过程中造成电转杯的击穿,同时影响转化效率)。
(五)谷氨酸棒杆菌的电击转化
(1)-80℃保存的谷氨酸棒状杆菌感受态,冰浴中融化。
(2)加入1-5.0μL质粒混匀(DNA总量约为1.0μg),冰浴5-10min。
(3)加入提前预冷的0.1cm电击杯中,1.8KV电压5ms电击2次。
(4)迅速加入预热的恢复用培养基(LBHIS)1.0mL混匀并转移到新的1.5mL无菌离心管中,46℃水浴6min。
(5)将菌体置于巡回式摇床(220rpm)上,30℃后培养2h。
(6)6000rpm,常温离心1min,弃掉少量上清,剩余菌液重悬并涂布到加入对应抗性的转化子涂布固体平板中,于30℃恒温培养箱,培养2-3天。
实施例1以GlcNAc为唯一碳源,验证谷氨酸棒杆菌工程菌能否转运至胞内利用
设置三组平行实验,其中一组为对照。具体培养基配方为(g/L):玉米浆20.0,KH2PO4 1.0,(NH4)2SO4 0.5,尿素1.25,pH 7.0,其中,对照组额外添加葡萄糖20g/L,两组实验组分别额外添加GlcNAc 10g/L,GlcNAc 20g/L代替葡萄糖作为碳源。
挑取活化后的谷氨酸棒杆菌S9114单菌落接种于种子活化液体培养基500ml摇瓶中于30℃,220rpm摇床培养。至菌体OD600达到1.0左右时,准确接种5%菌液于实验培养基中,30℃,220rpm,培养48小时,每隔12h取样,稀释到合适浓度后用分光光度计在600nm下检测菌液吸光度。结果表明(见图1)以GlcNAc为碳源的两组实验组,菌体OD值较接种时几乎无增长。以葡萄糖为碳源的对照组,菌体OD值增高8倍左右,表明谷氨酸棒杆菌S9114不能利用GlcNAc作为碳源。因此,可以初步推断出谷氨酸棒杆菌S9114中无专一性的GlcNAc胞内转运蛋白。
实施例2使用监督学习模型辅助鉴定谷棒内源的GlcNAc胞内转运蛋白和磷酸酶
使用转录组数据用于模型训练,最终筛选出一个与GlcNAc胞内转运蛋白相似度约为30%的谷氨酸棒杆菌内源GlcNAc胞内转运蛋白:Cg1GL001572(核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示,蛋白质序列如SEQ ID NO.4所示),以及两种与磷酸酶相似度约为40%的内源磷酸酶:Cg1GL000210(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,蛋白质序列如SEQ ID NO.5所示)和Cg1GL001719(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,蛋白质序列如SEQ ID NO.6所示)。筛选出的几种蛋白进一步完善了谷氨酸棒杆菌发酵生产GlcNAc的代谢途径。
根据筛选出的三种蛋白对菌株进行改造,摇瓶发酵操作均相同(具体操作见下文),结果见图2,其中:
尝试敲除谷氨酸棒杆菌内源GlcNAc胞内转运蛋白的编码基因Cg1GL001572,菌体OD值无显著变化,但GlcNAc产量略有下降。考虑筛选出的相似度约30%的内源GlcNAc胞内转运蛋白除具有转运GlcNAc的作用外,在代谢过程中还具有其他作用,单纯地敲除会影响其他代谢过程。
尝试使用质粒分别过表达谷氨酸棒杆菌内源GlcNAc6P磷酸酶的编码基因Cg1GL000210和Cg1GL001719。过表达Cg1GL000210基因产量略有下降,但过表达Cg1GL001719基因,实现了GlcNAc产量的进一步提高。同上,考虑鉴定出的谷氨酸棒杆菌内源磷酸酶在代谢过程中还具有其他作用。
实施例3在谷氨酸棒杆菌工程菌中过表达GlcNAc6P磷酸酶基因Cg1GL001719
使用由王小元博士(江南大学)提供的质粒pJYW-4作为表达载体来表达Cg1719(简写Cg1GL001719,下同)。(pJYW-4载体的构建参考2014年公开论文——Hu J,Li Y,Zhang H,et al.Construction of a novel expression system for use in Corynebacteriumglutamicum[J].Plasmid,2014,75.)
以本课题组之前改造过的谷氨酸棒杆菌工程菌S9114为基础,使用pJYW-4-gna1-glms-ramAM质粒为模板(参见文献——Chen Deng,Xueqin Lv,Yanfeng Liu,etal.Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum S9114based on whole-genome sequencing for efficient N-acetylglucosamine synthesis[J].Syntheticand Systems Biotechnology,2019,4(3):120-129.以及文献Chen Deng.Synergisticimprovement of N-acetylglucosamine production by engineering transcriptionfactors and balancing redox cofactors[J].Metabolic Engineering,2021:17.),以pJYW-4-CgF和pJYW-4-CgR为引物PCR获得开环模板质粒。
使用引物Cg1719F和Cg1719R将谷氨酸棒杆菌S9114中内源GlcNAc6P磷酸酶基因扩增下来,基因两段带有20bp左右的同源臂。
PCR条件为:95℃预变性3min;98℃变性1min;58℃退火1min;72℃延伸时间视片段长度而定,反应30个循环;最后72℃延伸l0 min。PCR产物用DNA纯化试剂盒回收,获得带有同源臂的Cg1719基因以及开环的质粒模板。
采用连接试剂盒(购于上海公司赛默飞公司,货号:15224041)连接插入片段和质粒。将载体和插入片段按1:1到1:10的摩尔比混合,加入等量的连接混合溶液,16℃下采用T4连接酶连接1h或过夜。然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑选菌落PCR正确的转化子进行测序验证,得到重组质粒pJYW-4-gna1-glms-ramAM-Cg1719。之后将获得的质粒通过电击转化法转化到实验室之前改造的工程菌谷氨酸棒杆菌S9114中。于-80℃超低温冰箱中保存备用。
工程菌株的摇瓶发酵过程:将储藏在-80℃超低温冰箱的重组谷氨酸棒杆菌工程菌株S9114甘油管中的菌液划线于Kan抗性的LBB固体平板上,于30℃培养48h后挑选单菌落接种于种子培养基中,按起始OD600为1.6的接种量将种子培养液接种至发酵培养基中,30℃下于恒温调温往复式摇床采用220rpm的转速培养培养72h。待72h发酵结束后检测发酵上清液GlcNAc的含量。
50-L罐补料分批发酵过程:补料分批发酵所采用的种子培养基的成分同摇瓶发酵所采用的种子培养基,种子培养在装有100mL种子培养基的1000mL摇瓶中于30℃,220rpm的培养条件下培养16-18h。以保证发酵培养基初始OD600为1.6的体积量将种子发酵液接种到50-L发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)中,初始发酵培养基体积为14.5L。通过加入浓度为29%的氨水将pH值保持在7.0,并将温度控制在30℃。风量和初始转速分别为0.8Nm3/h、25Hz。通过添加850g/L葡萄糖,将葡萄糖浓度保持在10-15g/L范围内,并根据发酵培养基中葡萄糖浓度的变化调整补糖速率。发酵72小时后停止发酵,检测发酵液中GlcNAc含量。
最终过表达GlcNAc6P磷酸酶基因Cg1GL001719,实现了GlcNAc在重组谷氨酸棒杆菌胞外产量的提高。其在500ml摇瓶中产量提高至37.5g/L,在50L发酵罐中产量提高至117.5g/L,转化率提高至30.7%,均为业内领先水平。
引物表
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种谷氨酸棒杆菌内源GlcNAc6P磷酸酶,其特征在于:氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.编码权利要求1所述谷氨酸棒杆菌内源GlcNAc6P磷酸酶的基因。
3.根据权利要求2所述的基因,其特征在于:核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
4.携带权利要求2或3所述基因的重组质粒。
5.一种重组谷氨酸棒杆菌,其特征在于:所述重组谷氨酸棒杆菌过表达了如SEQ IDNO.6所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的重组谷氨酸棒杆菌,其特征在于:以谷氨酸棒杆菌S9114为出发菌株。
7.根据权利要求5所述的重组谷氨酸棒杆菌,其特征在于:以pJYW-4为表达载体。
8.一种提高N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc产量的方法,其特征在于:包括应用权利要求5-7任一项所述的重组谷氨酸棒杆菌进行发酵的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于:将重组谷氨酸棒杆菌在种子培养基中活化培养得到种子液,再将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养。
10.根据权利要求8所述的方法,其特征在于:发酵温度为25~35℃。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310111425.9A CN115960874B (zh) | 2023-02-14 | 2023-02-14 | 一种谷氨酸棒杆菌内源GlcNAc6P磷酸酶及提高GlcNAc产量的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310111425.9A CN115960874B (zh) | 2023-02-14 | 2023-02-14 | 一种谷氨酸棒杆菌内源GlcNAc6P磷酸酶及提高GlcNAc产量的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115960874A true CN115960874A (zh) | 2023-04-14 |
CN115960874B CN115960874B (zh) | 2024-09-20 |
Family
ID=87363614
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310111425.9A Active CN115960874B (zh) | 2023-02-14 | 2023-02-14 | 一种谷氨酸棒杆菌内源GlcNAc6P磷酸酶及提高GlcNAc产量的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115960874B (zh) |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2593287A1 (en) * | 1999-06-25 | 2001-01-04 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in carbon metabolism and energy production |
CN104845923A (zh) * | 2014-02-14 | 2015-08-19 | 中国科学院微生物研究所 | 生产l-组氨酸的方法及其专用重组菌 |
CN106479945A (zh) * | 2015-12-29 | 2017-03-08 | 山东润德生物科技有限公司 | 一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌 |
CN108424870A (zh) * | 2018-04-04 | 2018-08-21 | 江南大学 | 一种生产n-乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒杆菌及其应用 |
CN110195036A (zh) * | 2019-05-23 | 2019-09-03 | 江南大学 | 一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用 |
CN110669708A (zh) * | 2019-07-11 | 2020-01-10 | 北京化工大学 | 合成n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用 |
WO2021128465A1 (zh) * | 2019-12-26 | 2021-07-01 | 江南大学 | 一种促进N-乙酰氨基葡萄糖生产的RamA转录因子突变体及其应用 |
-
2023
- 2023-02-14 CN CN202310111425.9A patent/CN115960874B/zh active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2593287A1 (en) * | 1999-06-25 | 2001-01-04 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding proteins involved in carbon metabolism and energy production |
CN104845923A (zh) * | 2014-02-14 | 2015-08-19 | 中国科学院微生物研究所 | 生产l-组氨酸的方法及其专用重组菌 |
CN106479945A (zh) * | 2015-12-29 | 2017-03-08 | 山东润德生物科技有限公司 | 一种高效合成乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌 |
CN108424870A (zh) * | 2018-04-04 | 2018-08-21 | 江南大学 | 一种生产n-乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒杆菌及其应用 |
CN110195036A (zh) * | 2019-05-23 | 2019-09-03 | 江南大学 | 一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用 |
CN110669708A (zh) * | 2019-07-11 | 2020-01-10 | 北京化工大学 | 合成n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用 |
WO2021128465A1 (zh) * | 2019-12-26 | 2021-07-01 | 江南大学 | 一种促进N-乙酰氨基葡萄糖生产的RamA转录因子突变体及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
CHEN DENG, ET AL.: "Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum S9114based on whole-genome sequencing for efficient N-acetylglucosamine synthesis", SYNTHETIC AND SYSTEMS BIOTECHNOLOGY, vol. 4, no. 3, 6 June 2019 (2019-06-06), pages 120 - 129, XP055824409, DOI: 10.1016/j.synbio.2019.05.002 * |
NCBI: "AGN22266.1", NCBI, 31 January 2014 (2014-01-31) * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN115960874B (zh) | 2024-09-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110195036B (zh) | 一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用 | |
CN114774343B (zh) | 一种生产2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株及应用 | |
WO2018205563A1 (zh) | 一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵生产四氢嘧啶的方法 | |
CN107502585A (zh) | 一株高效合成聚‑γ‑谷氨酸的地衣芽孢杆菌工程菌 | |
CN108531437B (zh) | 一种乙醛酸转氨酶介导的5-氨基乙酰丙酸生物合成途径 | |
CN110669708A (zh) | 合成n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用 | |
US20220106366A1 (en) | Rama transcription factor mutant for promoting production of n-acetylglucosamine and use thereof | |
Soto et al. | High cell-density cultivation in batch mode for plasmid DNA production by a metabolically engineered E. coli strain with minimized overflow metabolism | |
CN112359005B (zh) | 一种酸胁迫能力得到提高的大肠杆菌工程菌及应用 | |
CN104195190B (zh) | 一种利用重组大肠杆菌厌氧生产5‑氨基乙酰丙酸的方法 | |
CN116121161B (zh) | 一种生产麦角硫因的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
CN114874964A (zh) | 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用 | |
CN108456652B (zh) | 一种鞘氨醇单胞菌基因工程菌及其构建方法与应用 | |
CN113186143A (zh) | 一种产四氢嘧啶工程菌株的构建及优化的方法 | |
CN104928226A (zh) | 一株重组谷氨酸棒杆菌及其在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用 | |
CN109536427B (zh) | 一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌 | |
CN108913737B (zh) | 使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法 | |
CN112442471B (zh) | 一种抗酸胁迫能力强的大肠杆菌工程菌及应用 | |
CN112391329B (zh) | 一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌及其应用 | |
CN113549633A (zh) | 一种l-半胱氨酸转运蛋白突变体及其在生产l半胱氨酸中的应用 | |
CN112779203A (zh) | 高产l-半胱氨酸的基因工程菌及其构建与应用 | |
CN115960874B (zh) | 一种谷氨酸棒杆菌内源GlcNAc6P磷酸酶及提高GlcNAc产量的方法 | |
CN111235136A (zh) | 异柠檬酸裂合酶突变体及其在制备芳香族氨基酸中的应用 | |
CN114107158B (zh) | 一种高产高纯度异麦芽酮糖的重组谷氨酸棒杆菌及其应用 | |
CN111172090B (zh) | 一种用离子转运蛋白促进钝齿棒杆菌合成l-精氨酸的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant |