CN110669708A - 合成n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种合成N‑乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用。该基因工程菌为含有氨基葡萄糖合成酶基因glmS和氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1的重组谷氨酸棒状杆菌，且其经过了敲除GlcNAc逆转运途径、分解代谢途径和竞争代谢途径的相关基因的底盘微生物改造；该基因工程菌还含有用于提高胞外GlcNAc浓度的6p‑GlcNAc特异性的磷酸酶基因yqaB，并且该基因工程菌表达氨基葡萄糖合成酶基因glmS、氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1和6p‑GlcNAc特异性的磷酸酶基因yqaB。该基因工程菌安全无毒性，能够利用微生物发酵法高产GlcNAc，且批次稳定，生产成本较低，应用前景广阔。

Description

合成N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用

技术领域

本发明属于基因重组技术领域，涉及一种合成N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用。

背景技术

N-乙酰氨基葡萄糖又称N-乙酰葡糖胺(N-acetyl-D-(+)-glucosamine，GlcNAc)，分子式C₈H₁₅NO₆，分子量221.21，是葡萄糖的2位羟基被乙酰氨基取代后的产物，是一种具有生物活性的功能单糖，是生物体内多种多糖的组成单位，尤其是甲壳类动物的外骨骼含量最高。GlcNAc是合成双歧因子的重要前体，在生物体内具有许多重要生理功能；其具有软骨损伤修复、再生功能；也可改善免疫调节，刺激抗肿瘤免疫应答，具有抗肿瘤和消炎功能；同时，作为新型生化药品，它和氨基葡萄糖(GlcN)是糖胺聚糖结构单元的前体，包括人体内的透明质酸和硫酸软骨素，长期以来一直被用作治疗骨关节炎和保持软骨和关节健康的药物和营养品；其在药品和保健品领域有着广泛的应用。

GlcNAc的生产方法主要有化学法、酶催化法和微生物发酵法。化学法是通过酸水解甲壳素得到乙酰氨糖，但该方法污染大，且产品不适用于海鲜过敏症患者。与化学法相比，酶催化法和微生物发酵法属于环境友好型生产方法，但是酶催化几丁质降解合成乙酰氨糖，受制于底物虾蟹壳预处理困难、关键酶活性低、产物分离纯化困难，导致规模化生产难度较大。微生物发酵法生产GlcNAc是目前最具前景的方法，其在代谢工程技术和合成生物学技术的推动下，发展潜力越来越大，优势日益明显。

目前，利用微生物发酵法生产GlcNAc的主要菌株为大肠杆菌和酵母。早在2005年，MingDe Deng等人利用大肠杆菌，通过代谢工程改造和发酵过程优化，可以产生110g/LGlcNAc，然而由于大肠杆菌在发酵过程中会分泌内毒素，生产的氨基葡萄糖并不能满足食品级需求。近几年来已报道的利用酵母发酵生产GlcNAc，最高产量仅为3g/L，而且发酵周期长达135小时，生产强度较低。

因此，目前存在的问题是需要构建一株合成GlcNAc的无毒性安全菌株，其能够利用微生物发酵法高产GlcNAc，生产成本较低。

发明内容

本发明的目的之一是针对现有技术的存在的缺陷提供一种合成GlcNAc的基因工程菌，该菌株安全无毒性，能够利用微生物发酵法高产GlcNAc，生产成本较低。

本发明的目的之二是提供上述合成GlcNAc的基因工程菌在合成GlcNAc中的应用。

为此，本发明提供了一种合成GlcNAc的基因工程菌。

根据本发明第一方面的实施方式，所述合成GlcNAc的基因工程菌为含有氨基葡萄糖合成酶基因glmS和氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1的重组谷氨酸棒状杆菌。

本发明中，所述氨基葡萄糖合成酶基因glmS包括内源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS和外源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS。

在本发明的一些实施例中，所述外源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS来源于大肠杆菌K12、酿酒酵母S288c、谷氨酸棒状杆菌和枯草芽孢杆菌168中的一种或几种，优选来源于枯草芽孢杆菌168。

在本发明的另一些实施例中，所述氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1来源于秀丽隐杆线虫和/或酿酒酵母S288C，优选来源于秀丽隐杆线虫。

根据本发明第二方面的实施方式，所述合成GlcNAc的基因工程菌为经过底盘微生物改造的合成GlcNAc的基因工程菌。

本发明中，所述底盘微生物改造包括GlcNAc逆转运途径、分解代谢途径的相关基因的敲除，以及竞争代谢途径相关基因的敲除。

在本发明的一些实施例中，所述GlcNAc逆转运途径的相关基因包括胞外GlcNAc转运至胞内的GlcNAc特异性磷酸转移酶基因cgl2642(nagE)。

在本发明的另一些实施例中，所述GlcNAc分解代谢途径的相关基因包括乙酰氨基葡萄糖分解代谢途径的6p-GlcNAc脱乙酰酶基因nagA和6p-GlcN脱氨基酶基因nagB。

在本发明的又一些实施例中，所述竞争代谢途径相关基因包括副产物乳酸合成途径的基因ldh。

根据本发明第三方面的实施方式，所述基因工程菌中还含有用于提高胞外GlcNAc浓度的6p-GlcNAc特异性的磷酸酶基因yqaB。

在本发明的一些实施例中，所述6p-GlcNAc特异性的磷酸酶基因yqaB来源于大肠杆菌K12。

本发明还提供了一种如本发明上述基因工程菌在合成GlcNAc中的应用。

根据本发明，所述应用包括将所述基因工程菌进行发酵培养，制备GlcNAc。

在本发明的一些实施例中，发酵诱导条件为：IPTG诱导剂添加浓度为0.4-2.0mM，进一步优选为0.8-1.2mM；IPTG诱导剂添加时间为发酵2-14小时，优选为2-8小时，进一步优选为2-5小时。

本发明对谷氨酸棒状杆菌从四个方面来进行改造，包括GlcNAc合成途径的构建及强化、GlcNAc合成菌株的底盘微生物改造(包括逆转运途径和分解代谢途径的阻断、副产物途径敲除)、GlcNAc转运途径的打通和GlcNAc合成途径关键酶的筛选，最后构造一株高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌。本发明选用的宿主谷氨酸棒状杆菌是食品级微生物，对人和动物均无致病性，且在同等培养条件下具有更好的生长优势，可比其他菌株积累更高浓度的初级代谢产物GlcNAc。本发明中所构建的重组谷棒菌株是首次确定GlcNAc合成途径关键步骤为最后一步6p-GlcNAc的转运，并在打通GlcNAc转运途径和阻断GlcNAc分解代谢途径后选择最佳氨基葡萄糖合成酶基因glmS和氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1的一株能够高效合成GlcNAc的谷氨酸棒状杆菌，该重组菌株是目前在谷氨酸棒状杆菌中所能产生的最高GlcNAc浓度。最终本发明所构建的重组谷氨酸棒状杆菌的GlcNAc发酵浓度达到17.084g/L，转化率为0.285g/g Glucose(葡萄糖)。

附图说明

下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：

图1为GlcNAc合成途径的构建及强化、副产物乳酸途径敲除、GlcNAc逆转运、分解代谢途径的阻断以及6p-GlcNAc特异性磷酸酶基因yqaB对GlcNAc合成的影响；其中，A菌：pec-cglS-ScA；B菌：pec-cglS-ScAΔnagA/B；C菌：pec-cglS-ScAΔnagA/BΔldh；D菌：pec-cglS-ScAΔnagA/BΔldhΔcgl2642；E菌：pec-cglS-B-ScAΔnagA/BΔldhΔcgl2642。

图2示出表达不同来源的氨基葡萄糖合成酶基因glmS对GlcNAc合成的影响；

图3示出表达不同来源的氨基葡萄糖乙酰基转移酶基因gna1对GlcNAc合成的影响。

图4示出重组菌株的诱导条件IPTG诱导剂添加浓度的优化结果。

图5示出重组菌株的诱导条件IPTG诱导剂添加时间的优化结果。

图6为重组谷氨酸棒状杆菌高效合成GlcNAc的途径示意图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将结合附图和实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

I.术语

本发明所述用语“内源性基因”是指自身基因组内的基因。

本发明所述用语“外源性基因”是通过基因工程技术等途径引入靶细胞中的基因序列。

本发明所述用语“底盘微生物”亦称为“底盘微生物细胞”是指利用微生物细胞作为平台，置入功能化的生物系统，使该细胞能够具备人类需要的功能，用于生物合成。就好比汽车有了底盘才有基础，在这个基础上可以制造各种各样的车体，安装各种功能组件。所以，底盘微生物细胞需要本身的功能精简，但是要具备最基本的自我复制和代谢能力，这样就能成为一个可以不断添加功能的空白平台。

本发明所述用语“基因工程菌”是指将目的基因导入宿主生物体(即宿主细胞或底盘微生物或细菌体)内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌，如谷氨酸棒状杆菌等。基因工程的核心技术是DNA的重组技术，因此，本发明中也将基因工程菌称为为重组微生物。

本发明所述用语“重组”是指利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后再将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。

本发明所述用语“乙酰氨基葡萄糖-6磷酸特异性的磷酸酶”指大肠杆菌K12来源的糖磷酸酶，编码基因为yqaB，帮助使6P-GlcNAc更有效去磷酸化的酶。

本发明所述用语“乙酰氨基葡萄糖消耗途径”指胞外乙酰氨糖的逆转运以及乙酰葡糖胺-6P脱乙酰酶、氨糖-6P脱氢酶所催化的乙酰氨糖分解代谢反应。

本发明中所述“Δ”代表敲除基因的意思。

II.实施方案

现有的利用微生物发酵法生产GlcNAc的技术中，大肠杆菌在发酵过程中会分泌内毒素，生产的氨基葡萄糖并不能满足食品级需求；利用酵母发酵生产GlcNAc，最高产量仅为3g/L，而且发酵周期长达135小时，生产强度较低。鉴于此，本发明人对于利用微生物发酵法生产GlcNAc进行了大量研究，具体研究过程如下：

本发明选择食品安全级(GARS)且不易染菌，基因操作技术成熟的谷氨酸棒状杆菌来生产GlcNAc。GlcNAc的生成速率与菌体生长速率直接相关，是初级代谢产物，因此GlcNAc的发酵类型属于生长耦联型。而谷氨酸棒状杆菌可以很好地利用葡萄糖作为碳源，有着比其他菌株更好的生长优势；具有该特点的谷氨酸棒状杆菌更有利于GlcNAc的合成。

本发明利用谷氨酸棒状杆菌全基因组代谢网络模型和流平衡分析方法计算GlcNAc的理论产率。在没有产物GlcNAc合成所谓限制条件下，首先计算得到最大的生物质生成速率为0.42mmol/Dw h。再限制生物质合成速率，计算GlcNAc的理论得率，最大理论得率随生物质合成速率的增大而降低。当没有生物质合成时，N-GlcNAc对葡萄糖的最大理论产率为67％(mol/mol)和82％(g/g)。由于菌株生长中一定会存在生物质合成，实际上GlcNAc可达到的最高产率约为最大理论得率的70％，即实际上谷棒菌株中GlcNAc可达到的最高产率为0.574g/g。

在发酵过程中，当葡萄糖用尽，GlcNAc也可作为替代碳和氮源，被甘露糖转运蛋白和乙酰氨糖特异性转运蛋白(由cgl2642编码)转运和磷酸化。因此需要敲除GlcNAc逆转运的相关基因，以减少胞外GlcNAc的消耗；接着进一步敲除胞内乙酰氨基葡萄糖的分解代谢基因nagA/B，减少胞内GlcNAc的损耗。

其次，一个高效的化工厂需要合成与转运并重，提供一个完善的物流系统；细胞工厂则和化工厂类似，重组谷氨酸棒状杆菌中GlcNAc的高效生物合成也需要合成和转运的协同改造，以增加产品浓度和转化率。在产GlcNAc的重组谷棒菌株内，GlcNAc合成途径包含五个反应，对乙酰氨糖合成途径的五个反应进行热力学分析，确定GlcNAc合成途径的限速步骤为6P-GlcNAc的去磷酸化。GlcNAc转运途径的打通，是提高GlcNAc产量和产率的关键步骤，也是对重组谷氨酸棒状杆菌高效合成GlcNAc基因工程改造的必须步骤。

先前的报道推测6P-GlcNAc可以通过大肠杆菌周质空间中的磷酸酶去磷酸化为GlcNAc，但谷氨酸棒杆菌为革兰氏阳性菌，缺乏周质空间且原始菌株不产生GlcNAc。因此，需要引入一种负责将6P-GlcNAc转化为GlcNAc的磷酸酶，以改善谷棒中GlcNAc的产生。但在具有表达了氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1的谷棒菌株中可以产生GlcNAc，其又暗示有未知的磷酸酶可以将谷棒中的6p-GlcNAc转化为GlcNAc(少量)，为了改善这种反应，需要引入6p-GlcNAc特异性的磷酸酶。

在打通GlcNAc的转运途径之后，提高关键酶氨基葡萄糖合成酶(编码基因glmS)的酶活成为另一需要解决的问题。glmS表达水平受到glmS转录产物上游核糖开关的调控，6p-GlcN可与glmS转录产物上游的核糖开关序列结合，导致glmS转录产物降解，降低glmS表达水平。不同来源的氨基葡萄糖合成酶(编码基因glmS)对底物Gln和Fru-6-P有不同的亲和力和催化效率，选择最优的氨基葡萄糖合成酶(编码基因glmS)可以更好的积累目标产物。

本发明对谷氨酸棒状杆菌从四个方面来进行改造，包括GlcNAc合成途径的构建及强化、GlcNAc合成菌株的底盘微生物改造和GlcNAc转运途径的打通和GlcNAc合成途径关键酶的筛选，最后构造一株高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌，该菌株安全无毒性，其能够利用微生物发酵法高产GlcNAc，且培养基成分简单，批次稳定，生产成本较低。

因此，本发明第一方面的实施方式所涉及的合成GlcNAc的基因工程菌，为含有氨基葡萄糖合成酶基因glmS和氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1的重组谷氨酸棒状杆菌。所述氨基葡萄糖合成酶基因glmS和氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1用于在重组谷氨酸棒状杆菌中构建和强化GlcNAc合成途径。

本发明中，所述谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的保藏编号为ATCC13032。该菌株为食品级菌株，安全、无毒性。

本领域技术人员应该了解的是，由于谷氨酸棒状杆菌自身含有氨基葡萄糖合成酶基因glmS，因此，本发明中所述合成GlcNAc的基因工程菌中所含的氨基葡萄糖合成酶基因glmS包括内源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS，以及任选的外源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS；所述外源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS来源于大肠杆菌K12、酿酒酵母S288c、谷氨酸棒状杆菌和枯草芽孢杆菌168中的一种或几种，优选来源于枯草芽孢杆菌168。所述外源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS在该基因工程菌中被表达。

例如，在一些优选的例子中，本发明中所述合成GlcNAc的基因工程菌中所含的氨基葡萄糖合成酶基因glmS，由内源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS和来自于枯草芽孢杆菌168的外源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS组成，且所述外源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS在该基因工程菌中被表达。

本发明中，来自于所述谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的保藏编号为ATCC13032的氨基葡萄糖合成酶基因glmS的核苷酸序列如SEQ No.1所示。

本领域技术人员应该了解的是，本发明中上述来源为谷氨酸棒状杆菌的外源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS，是指通过载体导入谷氨酸棒状杆菌靶细胞的是与该谷氨酸棒状杆菌靶细胞自身基因组内的基因序列同源性为100％的基因，例如，核苷酸序列如SEQ No.1所示的来自于所述谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的保藏编号为ATCC13032的氨基葡萄糖合成酶基因glmS。

在本发明的一些具体的实施例中，所述大肠杆菌(Escherichia coli)K12的保藏编号为ATCC 53678。相应地，来自于该菌株的基因glmS的核苷酸序列如SEQ No.4所示。

在本发明的另一些具体的实施例中，所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288c的保藏编号ATCC 9763。相应地，来自于该菌株的基因glmS的核苷酸序列如SEQ No.5所示。

在本发明的又一些具体的实施例中，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的保藏编号为ATCC 6633。相应地，来自于该菌株的基因glmS的核苷酸序列如SEQ No.6所示。

本领域技术人员还应该了解的是，由于谷氨酸棒状杆菌本身不含氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1，因此，本发明中所述合成GlcNAc的基因工程菌中所含的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1属于外源性基因，其来源于秀丽隐杆线虫和/或酿酒酵母S288C，优选来源于秀丽隐杆线虫。所述氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1在该基因工程菌中被表达。

例如，在一些优选的例子中，本发明中所述合成GlcNAc的基因工程菌含有来源于秀丽隐杆线虫的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1，且该氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1在该基因工程菌中被表达。

在本发明的一些具体的实施例中，所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288c的保藏编号ATCC 9763。相应地，来自于该菌株的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1的核苷酸序列如SEQ No.2所示。

在本发明的另一些具体的实施例中，所述秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)的保藏编号为ATCC 77366。相应地，来自于该菌株的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1的核苷酸序列如SEQ No.7所示。

在一些具体优选的例子中，本发明中所述合成GlcNAc的基因工程菌含有内源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS和外源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS，以及氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1(外源性基因)。其中，所述氨基葡萄糖合成酶基因glmS(内源性基因，以及任选的外源性基因)和氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1(外源性基因)用于在重组谷氨酸棒状杆菌中构建和强化GlcNAc合成途径。

进一步地，所述合成GlcNAc的基因工程菌为高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌，外源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS和氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1(外源性基因)在该基因工程菌中被表达。

在一些例子中，例如，可以在重组谷氨酸棒状杆菌中表达外源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS和氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1，用于构建重组质粒的相关引物如表1所示，相应的序列如SEQ No.12-15；30-37所示。

表1构建重组质粒的相关引物(基因glmS和gna1)

本发明第二方面的实施方式所涉及的合成GlcNAc的基因工程菌为经过底盘微生物改造的合成GlcNAc的基因工程菌。

根据本发明的一些实施例，所述底盘微生物改造包括GlcNAc逆转运途径相关基因的敲除。这可以理解为，本发明中的合成GlcNAc的基因工程菌为敲除了磷酸转移酶系统GlcNAc特异性蛋白基因的重组谷氨酸棒状杆菌。

在本发明的一些实施例中，GlcNAc逆转运途径的相关基因包括胞外GlcNAc转运至胞内的GlcNAc特异性磷酸转移酶基因cgl2642。

在本发明的一些具体的实施例中，所述基因cgl2642的核苷酸序列如SEQ No.11所示。

根据本发明的另一些实施例，所述底盘微生物改造包括分解代谢途径的相关基因的敲除。这可以理解为，本发明中的合成GlcNAc的基因工程菌为阻断了GlcNAc分解代谢途径的重组谷氨酸棒状杆菌。

在本发明的一些实施例中，所述GlcNAc分解代谢途径的相关基因包括乙酰氨基葡萄糖分解代谢途径的6p-GlcNAc脱乙酰酶基因nagA和6p-GlcN脱氨基酶基因nagB。

在本发明的一些具体的实施例中，所述基因nagA的核苷酸序列如SEQ No.8所示。

在本发明的一些具体的实施例中，所述基因nagB的核苷酸序列如SEQ No.9所示。

根据本发明的又一些实施例，所述底盘微生物改造还包括竞争代谢途径相关基因的敲除。这可以理解为，本发明中的合成GlcNAc的基因工程菌为阻断副产物乳酸合成途径的重组谷氨酸棒状杆菌。

在本发明的一些实施例中，所述竞争代谢途径相关基因包括副产物乳酸合成途径的基因ldh。

在本发明的一些具体的实施例中，所述基因ldh的核苷酸序列如SEQ No.10所示。

在本发明的一些具体优选的实施例中，所述底盘微生物改造包括GlcNAc逆转运途径、分解代谢途径的相关基因的敲除，以及竞争代谢途径相关基因的敲除；不难理解，本发明中的合成GlcNAc的基因工程菌为敲除了磷酸转移酶系统GlcNAc特异性蛋白基因、阻断了GlcNAc分解代谢途径，以及阻断副产物乳酸合成途径的重组谷氨酸棒状杆菌。

在一些例子中，例如，可以敲除磷酸转移酶系统GlcNAc特异性蛋白基因cgl2642，用于构建敲除质粒的相关引物如表2所示，相应的序列如SEQ No.16-27所示。

表2构建敲除质粒的相关引物(基因nagA/B和cgl2642、ldh)

本发明的第三方面的实施方式所涉及的基因工程菌中还含有用于提高胞外GlcNAc浓度的6p-GlcNAc特异性的磷酸酶基因yqaB。

本领域技术人员应该了解的是，虽然谷氨酸棒状杆菌本身含有与6p-GlcNAc特异性的磷酸酶基因yqaB具有相近功能的内源性基因，但是其本身并不含有6p-GlcNAc特异性的磷酸酶基因yqaB，因此，本发明中所述合成GlcNAc的基因工程菌中所含的6p-GlcNAc特异性的磷酸酶基因yqaB属于外源性基因，其来源于大肠杆菌K12，由此加强6p-GlcNAc的去磷酸化及分泌，促进胞外GlcNAc的积累。所述6p-GlcNAc特异性的磷酸酶基因yqaB在该基因工程菌中被表达，由此进一步加强6p-GlcNAc的去磷酸化及分泌，促进胞外GlcNAc的积累。

在本发明的一些具体的实施例中，所述大肠杆菌(Escherichia coli)K12的保藏编号为ATCC 53678。相应地，所述基因yqaB的核苷酸序列如SEQ No.3所不。

在一些例子中，例如，在重组谷氨酸棒状杆菌中表达提高胞外GlcNAc浓度的6p-GlcNAc特异性的磷酸酶基因yqaB，用于构建重组质粒的相关引物如表1所示，相应的序列如SEQ No.28-29所示。

表3构建重组质粒的相关引物(基因yqaB)

本发明中所述合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌采用以下方法制备：

(1)构建高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌，并打通GlcNAc转运途径：

步骤A，在谷氨酸棒状杆菌中敲除磷酸转移酶系统GlcNAc特异性蛋白基因，阻断GlcNAc分解代谢途径，阻断副产物乳酸合成途径；

所述磷酸转移酶系统GlcNAc特异性蛋白基因是cgl2642，所述GlcNAc分解代谢途径相关基因是6p-GlcNAc脱乙酰酶基因nagA和6p-GlcN脱氨基酶基因nagB，所述副产物乳酸合成途径的关键基因是ldh；

步骤B，向步骤A获得的合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌中导入氨基葡萄糖合成酶glmS和氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1，并在该重组谷氨酸棒状杆菌中表达氨基葡萄糖合成酶glmS和氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1；

所述氨基葡萄糖合成酶glmS来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032；

所述氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1来源于酿酒酵母S288C；

步骤C，在步骤B构建的高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌中导入来源于大肠杆菌K12的6p-GlcNAc特异性的磷酸酶基因yqaB，并表达6p-GlcNAc特异性的磷酸酶基因yqaB；

(2)对高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌中的GlcNAc合成途径进行筛选优化：

步骤M，在谷氨酸棒状杆菌中敲除磷酸转移酶系统GlcNAc特异性蛋白基因，阻断GlcNAc分解代谢途径，阻断副产物乳酸合成途径；

所述磷酸转移酶系统GlcNAc特异性蛋白基因是cgl2642，所述GlcNAc分解代谢途径相关基因是6p-GlcNAc脱乙酰酶基因nagA和6p-GlcN脱氨基酶基因nagB，所述副产物乳酸合成途径的关键基因是ldh；

步骤N，分别向步骤M获得的合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌中导入不同来源的氨基葡萄糖合成酶基因glmS、不同来源的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1以及源于大肠杆菌K12的6p-GlcNAc特异性的磷酸酶基因yqaB，并表达氨基葡萄糖合成酶基因glmS、氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1以及源于大肠杆菌K12的6p-GlcNAc特异性的磷酸酶基因yqaB；

所述氨基葡萄糖合成酶基因glmS来源于大肠杆菌K12、酿酒酵母S288c、谷氨酸棒状杆菌或枯草芽孢杆菌168中的一种或几种；

所述氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1来源于秀丽隐杆线虫和/或酿酒酵母S288C；

对比含有不同来源的氨基葡萄糖合成酶基因glmS和不同来源的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1的高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌的GlcNAc产率，获得最佳高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌。

上述步骤M和N的筛选优化的结果表明：(1)外源导入枯草芽孢杆菌168来源的氨基葡萄糖合成酶基因glmS的基因工程菌合成GlcNAc的效果最好。(2)外源导入秀丽隐杆线虫来源的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1的基因工程菌合成GlcNAc的效果最好。

上述合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌的制备方法中，在步骤A中，敲除磷酸转移酶系统GlcNAc特异性蛋白基因，阻断GlcNAc分解代谢途径，并阻断副产物乳酸合成途径；在步骤B中构建并强化GlcNAc合成途径；在步骤C中，打通GlcNAc转运途径；亦即，通过步骤A、B和C构建高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌，并打通GlcNAc转运途径。在步骤M和N中，对含有不同来源的氨基葡萄糖合成酶基因glmS和不同来源的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1的高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌进行筛选，进一步优化GlcNAc合成途径。通过上述四个方面的改造和优化制备得到的高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌是产GlcNAc最佳的重组谷氨酸棒状杆菌。

这可以理解为，本发明通过反应的吉布斯自由能变确定GLcNAc合成途径的限速步骤，并通过上述方法解除限速步骤的限制，随后选择GlcNAc合成途径最佳来源的氨基葡萄糖合成酶基因glmS和氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1，同时阻断GlcNAc的分解代谢途径和副产物乳酸途径，最终得到高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌。

通过上述方法构建的基因工程菌为含有氨基葡萄糖合成酶基因glmS和氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1的重组谷氨酸棒状杆菌，且其经过了敲除GlcNAc逆转运途径、分解代谢途径和竞争代谢途径的相关基因的底盘微生物改造；该基因工程菌还含有用于提高胞外GlcNAc浓度的6p-GlcNAc特异性的磷酸酶基因yqaB，并且该基因工程菌表达氨基葡萄糖合成酶基因glmS、氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1和6p-GlcNAc特异性的磷酸酶基因yqaB。该重组谷氨酸棒状杆菌高效合成GlcNAc的途径如图6所示。

研究结果表明，该基因工程菌安全无毒性，能够利用微生物发酵法高产GlcNAc，且培养基成分简单(例如，可以使用本领域常规培养基)，批次稳定，生产成本较低。

本发明中谷氨酸棒状杆菌培养专用培养基包括：

1.LBHIS培养基(g/L)：蛋白胨5，添加酵母粉2.5，NaCl 5，脑心浸提液(BHI)18.5，山梨醇91，116℃灭菌20min。对应的固体培养基添加1.8％-2％琼脂。该培养基主要用于谷棒在试管培养，固体平板培养。

2.LBG培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，葡萄糖20，116℃灭菌20min。该培养基主要作为谷棒发酵时用的种子培养基。

3.EPO培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，甘氨酸30，Tween80 10，pH7.0。用于谷棒感受态的制备。

4.LB-suc10％(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，蔗糖(suc)100，琼脂15，pH7.0。用于谷棒基因敲除实验同源重组筛选。

5.发酵培养基(g/L)：葡萄糖65，尿素5，玉米浸粉8，生物素4×10^-4，VB1生物素4×10^-4，K₂HPO₄ 1，KH₂PO₄ 1，29.4mg二水合氯化钙，1.2325g七水硫酸镁，微量元素0.2％。(微量元素配制：称取1g FeSO₄·7H₂O，1gMnSO₄·H₂O，0.1ZnSO₄·7H₂O，0.2gCuSO₄，0.002gNiCl₂·6H₂O，加水定容成100mL，加入100μL浓盐酸(防止二价铁氧化)，过膜灭菌，在发酵培养体系中加千分之二。

本发明所涉及的上述重组谷氨酸棒状杆菌在制备GlcNAc中的应用，可以理解为利用上述重组谷氨酸棒状杆菌制备GlcNAc的方法。

根据本发明，所述应用包括将所述基因工程菌进行发酵培养，制备GlcNAc。

在本发明的一些实施例中，发酵诱导条件为：IPTG诱导剂添加浓度(IPTG诱导剂添加的最终浓度)为0.4-2.0mM，进一步优选为0.8-1.2mM；IPTG诱导剂添加时间为发酵2-14小时，优选为2-8小时，进一步优选为2-5小时。

本发明中的检测方法及仪器：

(1)采用PTC-200型PCR仪(MJ RESEARCH.INC.美国)进行PCR扩增和检测。

(2)采用MicropulserTM型电转仪(BIO-Rad，美国)进行电转化操作。

(3)采用UltiMate3000高效液相色谱仪(HPLC，赛默飞)检测发酵液中的乳酸浓度、GlcNAc浓度。使用BIO-Rad 87H柱子，以0.5mM硫酸为流动相，柱温65℃，流速0.6ml/min，进样体积20μL，检测器为紫外和示差检测器。

(4)使用870型酶标仪(Thermo)通过测定样品的在600nm波长下的吸光值来测量发酵过程中的生物量。

(5)使用SBA-40E葡萄糖测定仪(济南延和生物科技有限公司)检测发酵液中的葡萄糖浓度。

III.实施例

在构建强化高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌，并打通GlcNAc转运途径后，通过以下实施例对高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌中的GlcNAc合成途径进行筛选优化。

实施例1：重组质粒的构建

该实施例中所用到的引物如前文中表1所示。

首先提取得到谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母、大肠杆菌的基因组，以谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母、大肠杆菌的基因组为模板扩增glmS、gna1、yqaB基因，将这3个基因依次与质粒pec-xk99E进行连接，测序得到正确的质粒pec-xk99E-cglglmS、pec-xk99E-gna1和pec-xk99E-cglglmS-gna1、pec-xk99E-cglglmS-gna1-yqaB。

再以大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌的基因组为模板扩增分别来自这些菌的glmS基因。将不同来源的glmS基因分别与质粒pec-xk99E-gna1进行酶切连接，测序得到正确的质粒pec-xk99E-EcglmS-gna1-yqaB、pec-xk99E-ScglmS-gna1-yqaB、pec-xk99E-BsglmS-gna1-yqaB。随后由公司合成基因Cegna1，将此基因与pec-xk99E-BsglmS-yqaB质粒进行酶切连接，测序得到正确的质粒pec-xk99E-BsglmS-Cegna1-yqaB。

实施例2：敲除质粒的构建

该实施例中所用到的引物如前文中表2所示。

以谷氨酸棒状杆菌的基因组为模板，分别扩增敲除基因nagA/B、ldh、cgl2642的上下游同源臂1000bp左右，所得同源臂分别为nagA/B-L、nagA/B-R、ldh-L、ldh-R、cgl2642-L、cgl2642-R。再按照设计好的酶切位点将这些同源臂与质粒PK-JL进行酶切连接，测序得到正确的敲除质粒PK-JL-nagA/B-L-R、PK-JL-ldh-L-R、PK-JL-cgl2642-L-R。随后按照谷棒基因传统敲除方法进行各基因的敲除。

实施例3：谷棒基因敲除传统方法

对于谷氨酸棒状杆菌的基因敲除，一般采用非复制型的自杀质粒引导的定向同源重组技术，利用此种方法敲除掉基因组上的基因后，不会留下任何标记，相较大肠杆菌的Red敲除系统更加简单方便。目前，研究和应用比较广的为pK18mobsacB质粒和pK19mobsacB质粒进行谷氨酸棒状杆菌基因组上的特定基因的敲除。这种敲除方法的敲除原理主要是基于两次同源重组。第一次同源重组是由于质粒pK1 8mobsacB和质粒或者pK19mobsacB上不含有谷氨酸棒状杆菌的复制子。因此，该质粒在谷氨酸棒状杆菌中不能复制，只有通过同源重组的方式将整个质粒整合至谷氨酸棒状杆菌的基因组上，才能随基因组的复制而复制，随后通过质粒上的卡那抗性基因进行第一次重组的筛选。第二次同源重组，是基于第一轮重组后而发生的，最终使得待敲除的基因从基因组上消失。第二次重组的筛选标记为质粒上的sacB基因。

在谷氨酸棒状杆菌的敲除质粒上分别含有以下几个特别重要的元件：用于筛选的标记基因sacB(来自于谷草芽孢杆菌，谷氨酸棒状杆菌中不存在)，卡那霉素抗性基因。但不含有谷氨酸棒状杆菌复制子，因此谷氨酸棒状杆菌的第一次同源重组基于整个质粒整合入谷氨酸棒状杆菌的基因组中。下面是具体敲除方法：

①首先是相应基因敲除质粒的构建，通过PCR扩增待敲除基因的上下游同源臂(每条臂均约为1000bp，不可相差太多)，依次连接至敲除质粒pK-JL上测序正确后待用；

②将上述①中质粒按照上述谷棒电转方法转入谷氨酸棒状杆菌感受态中，并离心全部涂布于含有50mg/L卡那霉素的LBHIS平板上；

③挑取平板上长出的单菌落进行sacB基因的验证，只有既能在卡那抗性平板上生长的菌又能扩增出sacB基因的菌落才是发生了第一次同源重组的菌种；

④挑取符合上述③中的菌接种于30％蔗糖培养基中培养24h(必要时可重复转接2-3代)，待菌液变混浊后划线于含有20％的蔗糖固体培养基上；

⑤挑取④中的平板上的单菌落，进行sacB基因的菌落PCR；

⑥选取⑤中并没有扩增出sacB基因的单菌落，使用验证引物进行二次菌落PCR：因为依据谷氨酸棒状杆菌敲除原理，发生第二次同源重组后，整个敲除质粒会从基因组脱落，从而达到敲除的目的，因此发生二次重组的菌落将不再含有sacB基因；

⑦通过验证引物验证已成功敲除的菌体接种于LBHIS液体培养基中进行培养，并划线于LBHIS平板上进行纯化和再次验证，确定无误后可保菌待用；

最后成功得到三株底盘菌株，分别是ΔnagA/B、ΔnagA/BΔldh、ΔnagA/BΔldhΔcgl2642的三株底盘菌株。

实施例4：重组菌株的构建

(1)感受态细胞的制备

将-80℃保存的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032的甘油菌接种到4mL的LBHIS试管中，过夜培养之后，以一定的接种量接入20mL EPO培养基中，使初始OD600为0.3左右。在30℃摇床培养约2h，当OD600达0.9左右取出用于制备感受态细胞。

将培养好的菌落装入1.5mL离心管，冰浴使菌体冷却到0℃，之后4℃、4500rpm冷冻离心10min收集菌体，用100μL预冷的10％的甘油重悬菌体(三管菌体混一管)，然后4℃、4500rpm冷冻离心10min收集菌体。重复洗涤三次，洗涤完成后用100μL 10％的无菌甘油重悬菌体，用于电转化。

(2)谷氨酸棒状杆菌感受态细胞的电转化

在制备的谷氨酸棒状杆菌感受态细胞中加入4μL构建成功的重组质粒，轻柔的混匀，冰浴5-10min，之后将混合液移入预冷的0.2cm电击杯中，电击条件为：1.8kv，电击5ms，50μF，100Q。电击完毕后立即加入800μL在46℃预热的LBHIS培养基，轻柔的混匀后吸出放入1.5mL离心管中，46℃水浴6min，然后置于30℃复苏3h。复苏完成之后吸取一定量的菌液涂布于对应抗性平板上，30℃培养24-36h，对长出的单菌落进行菌落PCR验证、划线纯化等操作，然后挑取合适的阳性克隆，将其接种到4mL的LBHIS培养基的试管中，过夜培养之后，进行甘油菌的保存，将保存的甘油菌放置在-80℃冰箱中存放。

实施例5：重组菌株的摇瓶发酵验证

吸取-80℃冰箱中存放的重组菌株的甘油菌100μL接种于4mL的LBHIS试管培养基中，30℃、200rpm摇床培养12-14h。之后将种子液按照2％的接种量接种到20mL LBG种子培养基中，同样在30℃、200rpm摇床培养12-14h。待种子培养完成之后，按照5％的接种量将种子液接种到配好的50mL无菌发酵培养基中，在OD600＝2.5左右时，加入终浓度为0.8mMIPTG，对目的基因进行诱导表达，在30℃、200rpm摇床条件下培养48h左右。

实施例6：发酵条件优化

按照实施例5重组菌株发酵验证的实验方法，通过改变诱导条件，进行菌株的培养和产量测定，以筛选最适的发酵诱导条件。IPTG浓度的设定是0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM和1.2mM。IPTG诱导剂添加时间的设定是发酵2、5、8、11、14小时。该部分实验选择目前来说产量最高的菌株pec-BsS-B-CeA作为研究对象。

实施例7：代谢物及产物检测方法

(1)生物量测定

取发酵液用去离子水进行适当稀释之后，用酶标仪测定其在600nm波长下的吸光值，选用96孔板进行吸光值的测定，装液量是200μL。

(2)葡萄糖浓度

用SBA测糖仪检测发酵液中的葡萄糖浓度。

(3)乳酸浓度、GlcNAc浓度测定

用HPLC检测发酵液中的乳酸、GlcNAc浓度。使用BIO-Rad 87H柱子，以0.5mM硫酸为流动相，柱温65℃，流速0.6ml/min，进样体积20μL，检测器为紫外和示差检测器。

根据上述的发酵方法和检测方法对各重组菌株进行发酵验证及产物测定，结果如图1-4所示。

图1为GlcNAc合成途径中关键基因、副产物乳酸途径敲除、GlcNAc分解代谢途径的阻断以及6p-GlcNAc特异性磷酸酶基因yqaB对GlcNAc合成的影响；结果显示：

菌株pec-cglS-ScA的GlcNAc产量可达到375.70mg/L；

菌株pec-cglS-ScAΔnagA/B的GlcNAc产量增长至1.43g/L；

菌株pec-cglS-ScAΔnagA/BΔldh的GlcNAc产量为2.23g/L；

菌株pec-cglS-ScAΔnagA/BΔldhΔcgl2642的GlcNAc产量达到2.46g/L；

菌株pec-cglS-yqaB-ScAΔnagA/BΔldhΔcgl2642的GlcNAc产量则达到了5.28g/L。

图2示出不同来源的氨基葡萄糖合成酶基因glmS对重组谷棒菌株GlcNAc合成的影响；结果显示：

在发酵48小时时，空白对照菌株几乎不产生GlcNAc；

菌株ΔnagA/BΔldhΔcgl2642pec-EcS-B-A的GlcNAc浓度达到7.23g/L；

菌株ΔnagA/BΔldhΔcgl2642pec-cglS-B-A的GlcNAc浓度达到5.24g/L；

菌株ΔnagA/BΔldhΔcgl2642pec-ScS-B-A的GlcNAc浓度达到12.18g/L；

菌株ΔnagA/BΔldhΔcgl2642pec-BsS-B-A的GlcNAc浓度达到16.78g/L。

图3示出不同来源的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1对重组谷棒菌株GlcNAc合成的影响。结果显示：

在发酵48小时时，菌株ΔnagA/BΔldhΔcgl2642pec-BsS-B-A的GlcNAc浓度达到16.78g/L；

菌株ΔnagA/BΔldhΔcgl2642pec-BsS-B-CeA的GlcNAc浓度达到17.08g/L。

图4和图5示出谷棒菌株pec-BsS-B-CeA发酵培养条件的优化结果，其中，图4示出不同IPTG诱导剂添加浓度的优化结果，图5示出诱导剂添加时间的优化结果。

结果显示，诱导剂添加浓度在0.8mM和1.2mM时，GlcNAc浓度较高，两个诱导浓度皆可以更好地促进GlcNAc合成，考虑经济因素，选择IPTG加入浓度为0.8mM。IPTG诱导剂在发酵5小时时(OD为2.5时)添加，GlcNAc浓度最高，可以更好地合成GlcNAc。因此最终确定IPTG诱导剂添加浓度为0.8Mm，IPTG诱导剂添加时间为菌株培养5小时时(OD₆₀₀约为2.5时)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 北京化工大学

<120> 合成N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用

<160> 37

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1872

<212> DNA

<213> （来自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因glmS）

<400> 1

atgtgtggaa ttgttggata tattggccaa gcgggcgact cccgtgatta ctttgctcta 60

gatgtagttg ttgaaggact acgtcgcctg gaataccgcg gatatgactc cgcaggtatt 120

gctattcacg ccaatggtga gattagctac cgaaagaagg ccggaaaggt tgctgcacta 180

gatgcagaaa tcgctaaagc acctcttcca gattctattt tgggaattgg acacacccgt 240

tgggcaactc atggtggccc aaccgatgtc aacgctcacc cccacgttgt ttccaatggc 300

aagcttgccg tagtacacaa cggcatcatc gaaaactttg cggaactgcg ctctgagctt 360

tccgctaagg gctacaactt tgtatccgat accgataccg aagttgctgc ttctttgctt 420

gctgaaattt acaatactca ggcaaacggt gacctcaccc ttgctatgca gctgaccggt 480

cagcgccttg agggtgcttt caccctgcta gctattcatg ctgatcacga tgaccgcatc 540

gttgcagctc gtcgtaactc tcctttggtt atcggcgtcg gcgagggcga gaacttcctc 600

ggatctgacg tttctggctt tattgattac acccgcaagg ctgtagagct ggctaatgac 660

caggttgtta ccatcaccgc tgatgattac gccatcacca actttgatgg atcagaagca 720

gttggcaagc ctttcgacgt ggagtgggac gctgcagctg ctgaaaaggg tggcttcggt 780

tccttcatgg agaaggaaat ccacgatcag ccagcagctg ttcgcgatac cctgatgggc 840

cgtcttgatg aagatggcaa gctcgttctt gatgagctgc gcatcgatga agctattctg 900

cgtagtgtcg acaagatcgt cattgttgct tgtggtactg cagcttatgc aggccaggtt 960

gctcgttacg ccattgagca ctggtgccgc atcccaaccg aggtggagct ggctcacgag 1020

ttccgttacc gcgacccaat cctcaacgag aagacccttg ttgtggcatt gtcccagtcc 1080

ggcgagacca tggataccct catggctgtt cgccacgcac gtgagcaggg tgccaaggtt 1140

gttgctattt gtaacactgt tggatccact cttccacgtg aagcagatgc gtccctgtac 1200

acctacgctg gccctgagat cgctgtggcg tccaccaagg cgttcttggc tcagatcact 1260

gcttcttact tgcttggcct gtacttggct cagctgcgcg gcaacaagtt cgctgatgag 1320

gtttcttcca ttctggacag cctgcgtgag atgcctgaga agattcagca ggtcatcgat 1380

gcagaagagc agatcaagaa gcttggccaa gatatggcag atgctaagtc tgtgctgttc 1440

ctgggccgcc acgttggttt cccagttgcg cttgagggtg cgttgaagct caaggagatc 1500

gcatacctgc acgctgaagg tttcgctgca ggcgagctca agcacggccc aattgctttg 1560

gttgaggaag gccagccgat cttcgttatc gtgccttcac ctcgtggtcg cgattccctg 1620

cactccaagg ttgtctccaa cattcaggag atccgtgcac gtggcgctgt caccatcgtg 1680

attgcagagg aaggcgatga ggctgtcaac gattacgcca acttcatcat ccgcattcct 1740

caggccccaa ccctgatgca gcctctgctg tccaccgtgc ctctgcagat ctttgcgtgc 1800

gctgtggcaa ccgcaaaggg ctacaacgtg gatcagcctc gtaacctggc aaagtctgtc 1860

accgtcgaat aa 1872

<210> 2

<211> 480

<212> DNA

<213> （来自酿酒酵母S288c ATCC9763的基因gna1）

<400> 2

atgagcttac ccgatggatt ttatataagg cgaatggaag agggggattt ggaacaggtc 60

actgagacgc taaaggtttt gaccaccgtg ggcactatta cccccgaatc cttcagcaaa 120

ctcataaaat actggaatga agccacagta tggaatgata acgaagataa aaaaataatg 180

caatataacc ccatggtgat tgtggacaag cgcaccgaga cggttgccgc tacggggaat 240

atcatcatcg aaagaaagat cattcatgaa ctggggctat gtggccacat cgaggacatt 300

gcagtaaact ccaagtatca gggccaaggt ttgggcaagc tcttgattga tcaattggta 360

actatcggct ttgactacgg ttgttataag attattttag attgcgatga gaaaaatgtc 420

aaattctatg aaaaatgtgg gtttagcaac gcaggcgtgg aaatgcaaat tagaaaatag 480

<210> 3

<211> 567

<212> DNA

<213> （来自大肠杆菌K12 ATCC53678的基因yqaB）

<400> 3

atgtacgagc gttatgcagg tttaattttt gatatggatg gcacaatcct ggatacggag 60

cctacgcacc gtaaagcgtg gcgcgaagta ttagggcact acggtcttca gtacgatatt 120

caggcgatga ttgcgcttaa tggatcgccc acctggcgta ttgctcaggc aattattgag 180

ctgaatcagg ccgatctcga cccgcatgcg ttagcgcgtg aaaaaacaga agcagtaaga 240

agtatgctgc tggatagcgt cgaaccgctt cctcttgttg atgtggtgaa aagttggcat 300

ggtcgtcgcc caatggctgt aggaacgggg agtgaaagcg ccatcgctga ggcattgctg 360

gcgcacctgg gattacgcca ttattttgac gccgtcgtcg ctgccgatca cgtcaaacac 420

cataaacccg cgccagacac atttttgttg tgcgcgcagc gtatgggcgt gcaaccgacg 480

cagtgtgtgg tctttgaaga tgccgatttc ggtattcagg cggcccgtgc agcaggcatg 540

gacgccgtgg atgttcgctt gctgtga 567

<210> 4

<211> 1830

<212> DNA

<213> （来自大肠杆菌K12 ATCC53678的基因glmS）

<400> 4

atgtgtggaa ttgttggcgc gatcgcgcaa cgtgatgtag cagaaatcct tcttgaaggt 60

ttacgtcgtc tggaataccg cggatatgac tctgccggtc tggccgttgt tgatgcagaa 120

ggtcatatga cccgcctgcg tcgcctcggt aaagtccaga tgctggcaca ggcagcggaa 180

gaacatcctc tgcatggcgg cactggtatt gctcacactc gctgggcgac ccacggtgaa 240

ccttcagaag tgaatgcgca tccgcatgtt tctgaacaca ttgtggtggt gcataacggc 300

atcatcgaaa accatgaacc gctgcgtgaa gagctaaaag cgcgtggcta taccttcgtt 360

tctgaaaccg acaccgaagt gattgcccat ctggtgaact gggagctgaa acaaggcggg 420

actctgcgtg aggccgttct gcgtgctatc ccgcagctgc gtggtgcgta cggtacagtg 480

atcatggact cccgtcaccc ggataccctg ctggcggcac gttctggtag tccgctggtg 540

attggcctgg ggatgggcga aaactttatc gcttctgacc agctggcgct gttgccggtg 600

acccgtcgct ttatcttcct tgaagagggc gatattgcgg aaatcactcg ccgttcggta 660

aacatcttcg ataaaactgg cgcggaagta aaacgtcagg atatcgaatc caatctgcaa 720

tatgacgcgg gcgataaagg catttaccgt cactacatgc agaaagagat ctacgaacag 780

ccgaacgcga tcaaaaacac ccttaccgga cgcatcagcc acggtcaggt tgatttaagc 840

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tgtggtactt cttataactc cggtatggtt tcccgctact ggtttgaatc gctagcaggt 960

attccgtgcg acgtcgaaat cgcctctgaa ttccgctatc gcaaatctgc cgtgcgtcgt 1020

aacagcctga tgatcacctt gtcacagtct ggcgaaaccg cggataccct ggctggcctg 1080

cgtctgtcga aagagctggg ttaccttggt tcactggcaa tctgtaacgt tccgggttct 1140

tctctggtgc gcgaatccga tctggcgcta atgaccaacg cgggtacaga aatcggcgtg 1200

gcatccacta aagcattcac cactcagtta actgtgctgt tgatgctggt ggcgaagctg 1260

tctcgcctga aaggtctgga tgcctccatt gaacatgaca tcgtgcatgg tctgcaggcg 1320

ctgccgagcc gtattgagca gatgctgtct caggacaaac gcattgaagc gctggcagaa 1380

gatttctctg acaaacatca cgcgctgttc ctgggccgtg gcgatcagta cccaatcgcg 1440

ctggaaggcg cattgaagtt gaaagagatc tcttacattc acgctgaagc ctacgctgct 1500

ggcgaactga aacacggtcc gctggcgcta attgatgccg atatgccggt tattgttgtt 1560

gcaccgaaca acgaattgct ggaaaaactg aaatccaaca ttgaagaagt tcgcgcgcgt 1620

ggcggtcagt tgtatgtctt cgccgatcag gatgcgggtt ttgtaagtag cgataacatg 1680

cacatcatcg agatgccgca tgtggaagag gtgattgcac cgatcttcta caccgttccg 1740

ctgcagctgc tggcttacca tgtcgcgctg atcaaaggca ccgacgttga ccagccgcgt 1800

aacctggcaa aatcggttac ggttgagtaa 1830

<210> 5

<211> 2154

<212> DNA

<213> （来自酿酒酵母S288c ATCC9763的基因glmS）

<400> 5

atgtgtggta tctttggtta ctgcaattat ctagtggaaa gatccagagg agaaattatc 60

gacaccttag tggatggttt acaaagatta gaatatagag gctatgattc caccggtatt 120

gctatcgatg gtgacgaagc tgattctact ttcatctata agcaaatcgg taaagtgagt 180

gctttgaaag aggagattac taagcaaaat ccgaacagag acgttacttt tgtctctcat 240

tgtggtattg cgcatactag atgggctact cacggtcgac cagaacaagt taactgtcac 300

cctcaaagat ctgacccaga agaccaattt gtggtcgttc ataatggtat catcacaaat 360

tttagagaac tgaagactct tttaattaac aaaggttata aattcgaaag tgataccgat 420

accgagtgta ttgctaaact atatttgcat ttatacaata caaatttaca aaatgggcat 480

gacttagatt tccacgaatt aaccaagcta gttcttttag aactagaagg ttcatacggg 540

ttattatgta aatcttgtca ctatcctaat gaggttatcg ccactagaaa agggtcccct 600

ttactgattg gtgtcaaatc tgaaaaaaaa ctaaaagtcg acttcgtgga tgtggaattt 660

cccgaagaaa acgctggtca accggaaatt ccattgaaat ctaacaacaa atcatttggc 720

ttgggcccaa agaaagctcg tgaatttgaa gctggttccc aaaatgccaa tttactacca 780

attgccgcca atgaatttaa cttgagacat tctcaatcca gggctttcct atcagaagat 840

ggatctccaa caccggtgga attttttgtt tcttcggatg cggcatctgt tgttaaacat 900

accaagaagg tgctattttt agaagatgac gatttggctc atatttacga tggtgagtta 960

catattcata gatctagaag agaagtaggc gcatcaatga caaggtccat tcaaacttta 1020

gagatggagt tagctcagat catgaagggc ccttacgacc attttatgca aaaggaaatc 1080

tatgagcaac cagaatctac tttcaatact atgagaggta gaatcgacta tgaaaataat 1140

aaagtgatat tgggtggttt aaaggcatgg ttaccagttg tcagaagagc acggagactg 1200

atcatgatcg catgcggtac ttcttatcat tcatgtttgg ctactcgtgc tatcttcgaa 1260

gaattatcag atatcccagt tagtgtggaa ttagcgtctg actttctgga cagaaaatgc 1320

cctgtcttca gagacgatgt atgcgtgttt gtttcacaaa gtggtgaaac tgcggatacc 1380

atgctggctc taaattattg tttagaaaga ggagccttaa ctgtcggaat tgttaacagt 1440

gttggttctt ctatctctcg tgtcacccac tgtggtgttc atattaacgc tggtcctgaa 1500

attggtgttg cctctacaaa agcttatact tcccagtata ttgccttagt gatgtttgct 1560

ctatcgctgt cagatgaccg tgtatcgaaa atagacagaa gaattgaaat cattcaaggc 1620

ttgaagttaa tcccgggcca aattaagcag gtattaaagc tggaaccaag aataaaaaag 1680

ctctgtgcga ctgaattaaa ggatcaaaaa tctctattgt tattgggtag aggttaccaa 1740

tttgctgctg ctctggaagg tgctttgaag atcaaagaaa tttcttatat gcattctgaa 1800

ggtgttttgg caggtgagtt gaagcacggt gtcttggcct tggtggacga aaacttgcca 1860

atcattgctt ttggtaccag agactctcta ttccctaaag tagtttcctc tattgagcaa 1920

gttactgcaa gaaagggcca tccaattatt atttgtaacg aaaatgatga agtgtgggcg 1980

caaaaatcta aatcaatcga cctgcaaacc ttagaagttc cacaaactgt tgattgttta 2040

caaggtctaa ttaatattat tccattacaa ctaatgtcat attggttggc tgttaataaa 2100

gggattgatg ttgattttcc aagaaacttg gctaaatctg ttaccgtcga ataa 2154

<210> 6

<211> 1803

<212> DNA

<213> （来自枯草芽孢杆菌168 ATCC6633的基因glmS）

<400> 6

atgtgtggaa tcgtaggtta tatcggtcag cttgatgcga aggaaatttt attaaaaggg 60

ttagagaagc ttgagtatcg cggttatgac tctgctggta ttgctgttgc caacgaacag 120

ggaatccatg tgttcaaaga aaaaggacgc attgcagatc ttcgtgaagt tgtggatgcc 180

aatgtagaag cgaaagccgg aattgggcat actcgctggg cgacacacgg cgaaccaagc 240

tatctgaacg ctcacccgca tcaaagcgca ctgggccgct ttacacttgt tcacaacggc 300

gtgatcgaga actatgttca gctgaagcaa gagtatttgc aagatgtaga gctcaaaagt 360

gacaccgata cagaagtagt cgttcaagta atcgagcaat tcgtcaatgg aggacttgag 420

acagaagaag cgttccgcaa aacacttaca ctgttaaaag gctcttatgc aattgcttta 480

ttcgataacg acaacagaga aacgattttt gtagcgaaaa acaaaagccc tctattagta 540

ggtcttggag atacattcaa cgtcgtagca tctgatgcga tggcgatgct tcaagtaacc 600

aacgaatacg tagagctgat ggataaagaa atggttatcg tcactgatga ccaagttgtc 660

atcaaaaacc ttgatggtga cgtgattaca cgtgcgtctt atattgctga gcttgatgcc 720

agtgatatcg aaaaaggcac gtaccctcac tacatgttga aagaaacgga tgagcagcct 780

gttgttatgc gcaaaatcat ccaaacgtat caagatgaaa acggcaagct gtctgtgcct 840

ggcgatatcg ctgccgctgt agcggaagcg gaccgcatct atatcattgg ctgcggaaca 900

agctaccatg caggacttgt cggtaaacaa tatattgaaa tgtgggcaaa cgtgccggtt 960

gaagtgcatg tagcgagtga attctcctac aacatgccgc ttctgtctaa gaaaccgctc 1020

ttcattttcc tttctcaaag cggagaaaca gcagacagcc gcgcggtact cgttcaagtc 1080

aaagcgctcg gacacaaagc cctgacaatc acaaacgtac ctggatcaac gctttctcgt 1140

gaagctgact atacattgct gcttcatgca ggccctgaga tcgctgttgc gtcaacgaaa 1200

gcatacactg cacaaatcgc agttctggcg gttcttgctt ctgtggctgc tgacaaaaat 1260

ggcatcaata tcggatttga cctcgtcaaa gaactcggta tcgctgcaaa cgcaatggaa 1320

gctctatgcg accagaaaga cgaaatggaa atgatcgctc gtgaatacct gactgtatcc 1380

agaaatgctt tcttcatcgg acgcggcctt gactacttcg tatgtgtcga aggcgcactg 1440

aagctgaaag agatttctta catccaggca gaaggttttg ccggcggtga gctaaagcac 1500

ggaacgattg ccttgatcga acaaggaaca ccagtattcg cactggcaac tcaagagcat 1560

gtaaacctaa gcatccgcgg aaacgtcaaa gaagttgctg ctcgcggagc aaacacatgc 1620

atcatctcac tgaaaggcct agacgatgcg gatgacagat tcgtattgcc ggaagtaaac 1680

ccagcgcttg ctccgttggt atctgttgtt ccattgcagc tgatcgctta ctatgctgca 1740

ctgcatcgcg gctgtgatgt ggataaacct cgtaaccttg cgaagagtgt tactgtggag 1800

taa 1803

<210> 7

<211> 498

<212> DNA

<213> （来自秀丽隐杆线虫ATCC77366的基因gna1）

<400> 7

atgtctcaca tttttgatgc gtctgtgtta gctccacaca ttccttcgaa tcttcctgac 60

aattttaaag ttcgtccctt ggcaaaagac gatttctcga aaggatatgt tgatcttctg 120

agtcagttga cttcggtcgg aaatcttgat caggaagcat ttgaaaagcg atttgaggcg 180

atgaggacct cggtccccaa ttatcatata gtcgtcatcg aagattccaa ttctcaaaaa 240

gttgttgcat ctgccagttt ggttgtcgaa atgaagttca ttcacggggc aggaagtcgc 300

ggaagggttg aagatgttgt cgtggatact gaaatgcgtc gtcaaaaatt aggagccgtt 360

cttttgaaga ctcttgtttc tcttggaaag tctctcggag tttacaaaat ttctctcgag 420

tgtgttcctg aacttctccc attctactca caattcgggt tccaggacga ttgcaatttt 480

atgactcagc gcttctaa 498

<210> 8

<211> 1155

<212> DNA

<213> （基因nagA）

<400> 8

gtgcattatc aagaaaatgc aggtcaagca gttaaaaaaa ttgaaggaag aattgttacc 60

ccccacgggg tgattgatgg ctttctccaa ctcgaaaacg gcatcatcac ggaactctct 120

ggagaaccag cacctaaaaa cgcaggattc caccccgaac tccccacgat tgttcccagt 180

tttattgatc ttcataatca cggtggaaac ggtggcgcgt ttcctacggg aacgcaggac 240

caggcgagga atgccgcgca gtatcaccgc gaacatggca cgaccgtgat gttggcaagc 300

atggtttcgg cgccggctga cgcactggca gcgcaggtgg aaaaccttat tcccttgtgt 360

gaagagggcc tgctgtgcgg cattcacctc gagggtcctt tcatcaacgc atgccgttgt 420

ggtgctcaaa acccggattt tatttttccc ggcaacccaa cagatcttgc ccaggtgatc 480

catgcgggaa aaggttggat caaatcgatc acagtagcgc cggaaactga caatcttact 540

gagcttctcg atctctgcgc agcgcaccac atcattgctt ccttcgggca cactgatgca 600

gattttgata ccactaccag cgcaattgcc ttggctaaag agaaaaatgt gacggtcacg 660

gctacgcatt tgttcaatgc gatgcctccg ctgcatcata gggatcccgg cagcgtgggc 720

gctttgcttg ctgcggcacg tgccggggac gcatatgttg agttgatcgc cgacggcgtg 780

catttggccg atggaacggt cgatctagct cgttccaaca acgccttttt catcacggac 840

gccatggaag ccgccggaat gccagacggt gagtacattt tgggcgtttt gaacgtcacc 900

gtcaccgatg gcgtcgcccg tctgcgcgat ggcggcgcca tcgccggggg taccagcaca 960

ctagcgagtc agttcgtgca ccacgtgcgc aggggtatga cgcttatcga cgcgaccctc 1020

cacacctcaa ccgtcgccgc caaaattctc ggacttagcg atcacgaaat cgttaaatcc 1080

aaccctgtaa attttgtggt ctttgactca aacggccagt tacaacaggt ccatttagac 1140

catcaagtaa tttaa 1155

<210> 9

<211> 762

<212> DNA

<213> （基因nagB）

<400> 9

atggacatca tcatctgcaa agacgagcaa gaagtcggca aagcagcggc agccctgatc 60

gcacccttcg caactaaggg cggaaccttg gggcttgcaa ctggatcgtc acctttgagc 120

acctaccaag agctcattcg catgtatgaa gctggggaag tgtcattcaa gaactgcaag 180

gcattcttgt tggatgaata cgtgggatta acgcgcgacg atgaaaacag ctacttcaaa 240

accattcgta aagagttcac tgaccacatc gacatcgttg atgaagaggt ctacagccca 300

gatggtgcaa accctgatcc atacgaagca gctgcagagt atgaggcaaa gatcgctgca 360

gaatccgttg atgttcaaat ccttggcatc ggcggaaacg gccacatcgc tttcaatgag 420

ccatcatctt ctctgtcagg actgacaaag gtccaggcgc tgcaccctaa aactgtggag 480

gacaacgctc gattcttcaa caccatcgaa gaggtcccaa cccacgccct cacccagggt 540

ttgggcactt tgtcccgcgc gcaaaacatc gtgttggtgg caactggtga aggaaaagcc 600

gacgccatcc gcggaactgt ggaaggccca ctgaccgcca tgtgcccagg ttccatcctg 660

cagatgcaca acaatgccac catcatcgtt gatgaagcag cagcatccaa gctggaaaac 720

gctgatcact accgtctcat ggagcaatta aagctgcgct ag 762

<210> 10

<211> 945

<212> DNA

<213> （基因ldh）

<400> 10

atgaaagaaa ccgtcggtaa caagattgtc ctcattggcg caggagatgt tggagttgca 60

tacgcatacg cactgatcaa ccagggcatg gcagatcacc ttgcgatcat cgacatcgat 120

gaaaagaaac tcgaaggcaa cgtcatggac ttaaaccatg gtgttgtgtg ggccgattcc 180

cgcacccgcg tcaccaaggg cacctacgct gactgcgaag acgcagccat ggttgtcatt 240

tgtgccggcg cagcccaaaa gccaggcgag acccgcctcc agctggtgga caaaaacgtc 300

aagattatga aatccatcgt cggcgatgtc atggacagcg gattcgacgg catcttcctc 360

gtggcgtcca acccagtgga tatcctgacc tacgcagtgt ggaaattctc cggcttggaa 420

tggaaccgcg tgatcggctc cggaactgtc ctggactccg ctcgattccg ctacatgctg 480

ggcgaactct acgaagtggc accaagctcc gtccacgcct acatcatcgg cgaacacggc 540

gacactgaac ttccagtcct gtcctccgcg accatcgcag gcgtatcgct tagccgaatg 600

ctggacaaag acccagagct tgagggccgt ctagagaaaa ttttcgaaga cacccgcgac 660

gctgcctatc acattatcga cgccaagggc tccacttcct acggcatcgg catgggtctt 720

gctcgcatca cccgcgcaat cctgcagaac caagacgttg cagtcccagt ctctgcactg 780

ctccacggtg aatacggtga ggaagacatc tacatcggca ccccagctgt ggtgaaccgc 840

cgaggcatcc gccgcgttgt cgaactagaa atcaccgacc acgagatgga acgcttcaag 900

cattccgcaa ataccctgcg cgaaattcag aagcagttct tctaa 945

<210> 11

<211> 1986

<212> DNA

<213> （基因cgl2642）

<400> 11

atggaccata aggacctcgc gcaacgcatc ctgcgcgaca ttggcggcga agacaacatt 60

gtcgccgccg cacactgtgc aacgcgttta cgcctcgtgc tcaaagacac caaggatgtg 120

gatcgccaaa gtctggatga tgatccagat ctgaaaggca cgtttgaaac gggtggtatg 180

ttccagatca tcgtcgggcc aggcgatgtg gatcatgttt tcaaagaact cgatgacgca 240

acctccaaag acatcgctgt gtccacagag cagctcaaag atgttgtggc taacaacgcc 300

aactggttca gccgtgctgt gaaggtattg gcggacattt tcgtcccgct gattccaatc 360

ttggttggtg gcggtctgct catggctatc aacaatgtgt tggttgcgca ggatctgttc 420

ggtccgcaat cactggtgga gatgttccct cagatcagcg gtgttgctga gatgatcaac 480

ctcatggcat ctgcgccgtt cgcgttcttg ccagtgttgg ttggtttcac cgcaaccaag 540

cgtttcggcg gcaatgagtt cctgggcgcc ggtattggta tggcgatggt gttcccgagc 600

ttggtgaacg gctacgacgt ggccgccacc atggctgcgg gcgaaatgcc aatgtggtcc 660

ctgtttggtt tagatgttgc ccaagccggt taccagggca ccgtgcttcc tgtgctggtg 720

gtttcttgga ttctggcaac gatcgagaag ttcctgcaca agcgactcaa gggcactgca 780

gacttcctga tcactccagt gctgacgttg ctgctcaccg gattccttac attcatcgcc 840

attggcccag caatgcgctg ggtgggcgat gtgctggcac acggtctaca gggactttat 900

gatttcggtg gtccagtcgg cggtctgctc ttcggtctgg tctactcacc aatcgtcatc 960

actggtctgc accagtcctt cccgccaatt gagctggagc tgtttaacca gggtggatcc 1020

ttcatcttcg caacggcatc tatggctaat atcgcccagg gtgcggcatg tttggcagtg 1080

ttcttcctgg cgaagagtga aaagctcaag ggccttgcag gtgcttcagg tgtctccgct 1140

gttcttggta ttacggagcc tgcgatcttc ggtgtgaacc ttcgcctgcg ctggccgttc 1200

ttcatcggta tcggtaccgc agctatcggt ggcgctttga ttgcactctt taatatcaag 1260

gcagttgcgt tgggcgctgc aggtttcttg ggtgttgttt ctattgatgc tccagatatg 1320

gtcatgttct tggtgtgtgc agttgttacc ttcttcatcg cattcggcgc agcgattgct 1380

tatggccttt acttggttcg ccgcaacggc agcattgatc cagatgcaac cgctgctcca 1440

gtgcctgcag gaacgaccaa agccgaagca gaagcacccg cagaattttc aaacgattcc 1500

accatcatcc aggcaccttt gaccggtgaa gctattgcac tgagcagcgt cagcgatgcc 1560

atgtttgcca gcggaaagct tggctcgggc gttgccatcg tcccaaccaa ggggcagtta 1620

gtttctccgg tgagtggaaa gattgtggtg gcattcccat ctggccatgc tttcgcagtt 1680

cgcaccaagg ctgaggatgg ttccaatgtg gatatcttga tgcacattgg tttcgacaca 1740

gtaaacctca acggcacgca ctttaacccg ctgaagaagc agggcgatga agtcaaagca 1800

ggggagctgc tgtgtgaatt cgatattgat gccattaagg ctgcaggtta tgaggtaacc 1860

acgccgattg ttgtttcgaa ttacaagaaa accggacctg taaacactta cggtttgggc 1920

gaaattgaag cgggagccaa cctgctcaac gtcgcaaaga aagaagcggt gccagcaaca 1980

ccataa 1986

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> （引物cglglmS-EcoRI-F）

<400> 12

ccggaattca aggaggatat acatgcgcat gtg 33

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> （引物cglglmS-kpnI-R）

<400> 13

cggggtacct tattcgacgg tgacagactt tgc 33

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> （引物ScgnaI-BamHI-F）

<400> 14

cgcggatcca aggaggatat acatatgagc ttaccc 36

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> （引物ScgnaI-XbaI-R）

<400> 15

gctctagact attttctaat ttgcatttcc acgcctgc 38

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> （引物nagA/B-L-BamHI-F）

<400> 16

cgcggatcca atgacaccag c 21

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> （引物nagA/B-L-XbaI-R）

<400> 17

gctctagagt cagtttccgg cgc 23

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> （引物nagA/B-R-XbaI-F）

<400> 18

ctagtctaga ggaggacaac gctcg 25

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> （引物nagA/B-R-SalI–R）

<400> 19

cgatgtcgac cccacatgta gc 22

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> （引物ldh-L-EcoRI-F）

<400> 20

ccgcaattca ccgtgatgat gtcatc 26

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> （引物ldh-L-XbaI-R）

<400> 21

gctctagaac ctgatttccc taaccgg 27

<210> 22

<211> 32

<212> DNA

<213> （引物ldh-R-XbaI-F）

<400> 22

gctctagaat caggtgacac aaactcacag cg 32

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> （引物ldh-R-HindⅢ-R）

<400> 23

cccaagcttc ttgtggaagg gtgcag 26

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> （引物cgl2642-L-BamHI-F）

<400> 24

cgggatcctg caatatcctc atccatcgca 30

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> （引物cgl2642-L-XbaI-R）

<400> 25

gctctagagt tgaaaccttg agtgttcgca 30

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> （引物cgl2642-R-XbaI-F）

<400> 26

gctctagaga atttctcctt aaccgggaag 30

<210> 27

<211> 29

<212> DNA

<213> （引物cgl2642-R-SalI-R）

<400> 27

acgcgtcgac gccgttcgcc taaaaatcc 29

<210> 28

<211> 42

<212> DNA

<213> （引物yqaB-HindⅢ-F）

<400> 28

cccaagctta aggaggatat acatgtacga gcgttatgca gg 42

<210> 29

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物yqaB-pstI-R）

<400> 29

aactgcagtc acagcaagcg aacatcca 28

<210> 30

<211> 40

<212> DNA

<213> （引物Bsglms-kpnI-F）

<400> 30

cggggtacca aggaggatat acatgtgtgg aatcgtaggt 40

<210> 31

<211> 33

<212> DNA

<213> （引物Bsglms-kpnI-R）

<400> 31

cggggtacct tactccacag taacactctt cgc 33

<210> 32

<211> 40

<212> DNA

<213> （引物Ecglms-SacI-F）

<400> 32

cgagctcaag gaggatatac atgtgtggaa ttgttggcgc 40

<210> 33

<211> 33

<212> DNA

<213> （引物Ecglms-kpnI-R）

<400> 33

cggggtacct tactcaaccg taaccgattt tgc 33

<210> 34

<211> 45

<212> DNA

<213> （引物ScglmS-EcoRI-F）

<400> 34

cggaattcaa ggaggatata catgtgtggt atctttggtt actgc 45

<210> 35

<211> 32

<212> DNA

<213> （引物ScglmS-SacI-R）

<400> 35

cgagctctta ttcgacggta acagatttag cc 32

<210> 36

<211> 45

<212> DNA

<213> （引物Cegna1-BamHI-F）

<400> 36

cgggatccaa ggaggatata catgtctcac atttttgatg cgtct 45

<210> 37

<211> 34

<212> DNA

<213> （引物Cegna1-XbaI-R）

<400> 37

gctctagatt agaagcgctg agtcataaaa ttgc 34

Claims (10)

1.一种合成N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，其为含有氨基葡萄糖合成酶基因glmS和氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1的重组谷氨酸棒状杆菌。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述氨基葡萄糖合成酶基因glmS包括内源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS，以及任选的外源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS。

3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述外源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS来源于大肠杆菌K12、酿酒酵母S288c、谷氨酸棒状杆菌和枯草芽孢杆菌168中的一种或几种，优选来源于枯草芽孢杆菌168；和/或，所述氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1来源于秀丽隐杆线虫和/或酿酒酵母S288C，优选来源于秀丽隐杆线虫。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述合成N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌为经过底盘微生物改造的合成N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述底盘微生物改造包括GlcNAc逆转运途径、分解代谢途径的相关基因的敲除，以及竞争代谢途径相关基因的敲除。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述GlcNAc逆转运途径的相关基因包括胞外GlcNAc转运至胞内的GlcNAc特异性磷酸转移酶基因cgl2642；和/或，所述GlcNAc分解代谢途径的相关基因包括乙酰氨基葡萄糖分解代谢途径的6p-GlcNAc脱乙酰酶基因nagA和6p-GlcN脱氨基酶基因nagB；和/或，所述竞争代谢途径相关基因包括副产物乳酸合成途径的基因ldh。

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中还含有用于提高胞外GlcNAc浓度的6p-GlcNAc特异性的磷酸酶基因yqaB。

8.根据权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述6p-GlcNAc特异性的磷酸酶基因yqaB来源于大肠杆菌K12。

9.根据权利要求1-8中任意一项所述的基因工程菌在合成N-乙酰氨基葡萄糖中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将所述基因工程菌进行发酵培养，制备N-乙酰氨基葡萄糖；优选地，发酵诱导条件为：IPTG诱导剂添加浓度为0.4-2.0mM，进一步优选为0.8-1.2mM；和/或，IPTG诱导剂添加时间为发酵2-14小时，优选为2-8小时，进一步优选为2-5小时。

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