CN113444676B - 一种改造大肠杆菌利用棕榈粕发酵的工程菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改造大肠杆菌利用棕榈粕发酵的工程菌株及其应用，属于生物工程技术领域。本发明重组表达的β‑1,4外切甘露糖苷酶能够有效的将甘露聚糖分解成甘露寡糖，从而本发明改造的工程菌株得以在以甘露聚糖为底物的棕榈粕培养基中实现高效的生长速率；同时本大肠杆菌工程菌株的透明质酸产量可达57mg/L。本发明为大肠杆菌以棕榈粕为碳源发酵的利用奠定了一定的基础，而透明质酸的生产也适合于工业化应用。

Description

一种改造大肠杆菌利用棕榈粕发酵的工程菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种改造大肠杆菌利用棕榈粕发酵的工程菌株及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

棕榈粕是棕榈油工业的农业副产物，盛产于东南亚地区，年产量约992万吨。棕榈仁饼是近年来棕榈油工业的主要废弃物之一，是棕榈仁经压榨和榨油后的45种主要废弃物。棕榈粕含有大量的碳水化合物，其中棕榈仁粕的81％的碳水化合物以非淀粉多糖形式存在，而非淀粉多糖又主要以不溶性的非纤维素多糖为主，不溶性非纤维素多糖中含有甘露糖和葡萄糖(Knudsen，1997)，甘露聚糖是其主要成分之一，约占干重的40％。根据马来西亚棕榈油委员会(mpob)提供的统计数据446，2015年马来西亚47个棕榈油工业生产了2519990吨棕榈粕副产物(PKC)，棕榈粕含有相对较高的碳水化合物，而其碳水化合物主要由大量的甘露聚糖组成，甘露聚糖也是棕榈粕中重要的半纤维素，主要存在于以线性D甘露聚糖骨架连接而成，因此是生物精炼系统和工业生化过程的潜在的优质原料。甘露聚糖是高度分支的多聚体，以α-1,6-甘露糖为骨架链，大部分甚至全部的残基具有α-1，2或α-1，3连接的含有2～5个甘露糖残基的侧链。甘露聚糖酶，即β-甘露聚糖酶能催化甘露聚糖水解为低聚糖或单糖，是一种重要的半纤维素酶，也是甘露聚糖降解过程的关键酶。甘露聚糖酶属于糖苷水解酶家族5、26和113，它通过随机的断裂甘露聚糖链来水解甘露聚糖的主链，从而释放不同数量的甘露寡糖以及单糖。

考虑到棕榈粕具有丰富的甘露聚糖，且价格低廉，目前的研究主要利用棕榈粕提取多种种甘露聚糖。通过优化物理和生物酶催化协同反应的操作工艺，分离提取到较高纯度的可用于微生物发酵的寡糖，然后将其应用于菌体发酵法生产其他发酵产品的工艺中。

发明内容

[技术问题]

提供一种以棕榈粕为碳源发酵生产的基因工程菌。

[技术方案]

为了能实现对棕榈粕中甘露聚糖的直接利用，本技术将一个性能优异的嗜热β-1,4外切甘露糖苷酶TFMS导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行分泌表达，从而构建一个可以直接利用棕榈粕作为碳源的的底盘工程菌株，此菌株通过直接分泌胞外的β-1,4外切甘露糖苷酶水解释放棕榈粕中的甘露聚糖，得到多种寡糖甚至单糖，直接供细胞利用，这为棕榈仁饼生产甘露寡糖以及促进细胞生长和生物合成奠定了技术基础。

本发明提供了一种基因工程菌，可以利用棕榈粕这种农业副产物为碳源进行发酵。

在一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为出发菌株，基因组的malZ位点上整合有由编码甘露糖苷酶的基因TFMS，信号肽，组成型T7启动子和核糖体结合位点序列组成的操纵子；所述组成型T7启动子和核糖体结合位点序列在信号肽的上游，所述信号肽在基因TFMS的上游。

在一种实施方式中，所述信号肽包含ompA、Dsba或pelB。

在一种实施方式中，所述ompA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示、Dsba的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示或pelB的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在一种实施方式中，所述组成型T7启动子和核糖体结合位点序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在一种实施方式中，所述编码甘露糖苷酶的基因TFMS的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括但不限于大肠杆菌BL21(DE3)。

在一种实施方式中，所述基因工程菌还含有利用低分子寡糖合成代谢产物的代谢途径的基因的表达载体。

在一种实施方式中，所述利用低分子寡糖合成代谢产物的代谢途径的基因包括但不限于以低分子寡糖为底物的酶的基因。

在一种实施方式中，所述利用低分子寡糖合成代谢产物的代谢途径的基因包括但不限于编码透明质酸合酶的基因hasA。

在一种实施方式中，所述表达载体包括但不限于pET21a。

在一种实施方式中，基因hasA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供上述基因工程菌在利用棕榈粕发酵生产中的应用。

有益效果：

(1)本发明在将嗜热菌Thermobifida fusca来源的甘露糖苷酶编码基因TFMS重组大肠杆菌进行分泌表达，实现了甘露糖苷酶的高效活性胞外表达，可以对棕榈粕中难降解的甘露聚糖进行高效水解和产生低分子量寡糖，有利于细胞对其高效摄取和利用。

(2)本发明利用大肠杆菌以棕榈粕为碳源发酵生产透明质酸。此外，本发明过程中改造的底盘菌株在棕榈粕培养基中具有较强的生长能力，可以用于构建其他大宗生物制品合成的平台宿主，提高对棕榈粕废弃物的再利用价值。

附图说明

图1TFMS整合BL21菌株基因组DNA操作示意图；

图2：三个信号肽TFMS胞外酶活图(相对％)；

图3：不同信号肽底盘菌株在棕榈粕培养基中对其生长速度的影响；

图4：重组菌株利用棕榈粕产生透明质酸。

具体实施方式

下述实施例当中涉及的pET21a质粒和大肠杆菌E.coli BL21(DE3)均购自Stratagene,La Jolla,CA,USA。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，氨苄浓度为100μg/mL。

LB固体培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，氨苄浓度为100μg/mL，琼脂15g/L。

棕榈粕培养基：棕榈粕30g/L，酵母粉5g/L，硫酸镁2g/L，氯化钠10g/L，氨苄浓度为100μg/mL。

魔芋甘露聚糖培养基：魔芋粉5g/L，酵母粉1g/L，硫酸镁2g/L，磷酸二氢钾2g/L，氨苄浓度为100μg/mL。

甘露糖苷酶酶活测定：

酶活定义：在37℃下，每1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量定义为一个单位酶活(U)。

酶活测定：甘露糖苷酶可以将甘露聚糖分解为甘露寡糖，甘露寡糖具有还原性，可以与DNS试剂在碱性条件下发生一定的化学反应，生成在煮沸条件下呈棕红色的3-amin-5-nitrosalicylic acid，可以用分光光度计测量生成的还原糖量，它的颜色的深浅程度与还原糖含量有关。

下述实施例中涉及的试剂如下：

咔唑溶液：0.125g咔唑溶于100mL乙醇。

四硼酸钠溶液：0.954g四硼酸钠溶于100mL浓硫酸。

实施例1：TFMS的分泌表达优化

(1)重组菌株构建

以嗜热菌Thermobifida fusca中TFMS基因序列为模板，根据密码子的兼并性对密码子进行优化合成大小为1362bp的TFMS基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)。为了实现嗜热甘露糖苷酶TFMS的高效胞外分泌能力，如图1所示，将大肠杆菌三个常用的信号肽ompA、Dsba和pelB分别融合到TFMS的上游端。同时在信号肽的上游添加了组成型T7启动子和核糖体结合位点的序列构建获得操作子。整合位点选择大肠杆菌BL21(DE3)基因组上非必需的麦芽糊精葡萄糖苷酶编码基因malz。设计用于同源重组的malZ上下游同源臂序列片段，上游同源臂位于T7启动子/RBS序列的上游，下游同源臂在TFMS基因的下游，上游同源臂的序列如SEQ ID NO.7所示，下游同源臂的序列如SEQ ID NO.8所示。将上游同源臂、T7启动子/RBS、信号肽/TFMS、下游同源臂进行基因人工合成获得一个完成操纵子片段，并用于下一步基因组整合。

将操纵子利用crispr-cas系统整合至大肠杆菌BL21(DE3)基因组位点上，含有crispr-cas操作质粒的菌株BL21(DE3)制备为感受态细胞，随后分别加入10uL的上述三种基因合成的操纵子片段，混合均匀后进行电转化，获得的转化子进行涂布培养和筛选，长出的克隆进一步进行PCR检测和DNA测序，确定操纵子成功整合进入malz位点。最终获得了三个重组菌株，分别命名为BL21-OT(ompA-TFMS)，BL21-DT(Dsba-TFMS)和BL21-PT(pelB-TFMS)。

(2)TFMS酶的表达

为了评估信号肽对TFMS分泌效率的影响，将步骤(1)构建的三个菌株分别接种LB培养基，在37℃，200rpm进行发酵培养48h。离心收集发酵液上清，并对发酵液上清中的TFMS活性进行测定，结果如图2所示，菌株BL21-DT(Dsba-TFMS)分泌的TFMS活性最高，其次为菌株BL21-OT(ompA-TFMS)，仅为前者的48％，而最低的为菌株BL21-PT(pelB-TFMS)，约为BL21-DT菌株的17％。

实施例2：底盘菌株的生长性能评估

为了进一步评价TFMS分泌表达效率对细胞利用底物棕榈粕生长的影响，将实施例1获得的三个菌株分别接种至棕榈粕作为唯一碳源的培养基，进行培养具体步骤如下：将BL21-OT，BL21-DT和BL21-PT单菌落分别接种于5mL的LB液体培养基的试管中，并将试管置于37℃，200rpm条件下振荡培养12-14h，得到种子液；将100μL种子液转接于含有100mL新鲜棕榈粕培养基的摇瓶中，将摇瓶放置于37℃、200rpm条件下振荡培养；培养至24h和48h的时候分别在无菌条件下各收集2mL发酵液。对24h取得的发酵液稀释10⁴～10⁶后涂板，对48h取得的发酵液取稀释倍数10⁵～10⁶后涂板，将平板放置于37℃培养24h后，对平板上的菌落进行计数统计，采用菌落单位数来评估细胞的生长效率。

结果如图3所示，信号肽Dsba对TFMS的分泌效果最好，重组菌株BL21-DT的生长效率最高，因此优选Dsba信号肽用于TFMS的分泌表达。

实施例3：利用棕榈粕的大肠杆菌工程菌株用于产HA

(1)菌株的构建

构建含有透明质酸HA合成途径相关基因的质粒并转化大肠杆菌，完善透明质酸HA在大肠杆菌中的合成途径。将人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的hasA基因片段连接至经NdeI酶和XhoI酶双酶切的pET21a载体，获得表达载体pET21a-hasA。将表达载体pET21a-hasA转化至实施例1获得的大肠杆菌BL21-DT，得到重组菌株BL21-DT/pET21a-hasA。

(2)发酵生产透明质酸

将步骤(1)构建的工程菌株BL21-DT/pET21a-hasA用于棕榈粕发酵，棕榈粕作为唯一碳源的培养基，进行培养具体步骤如下：将BL21-DT/pET21a-hasA单菌落接种于5mL的LB液体培养基的试管中，并将试管置于37℃，200rpm条件下振荡培养12-14h，得到种子液；将100μL种子液转接于含有100mL新鲜棕榈粕培养基的摇瓶中，将摇瓶放置于37℃、200rpm条件下振荡培养；培养至细胞OD600达到约0.6，添加IPTG至终浓度为0.1mM诱导hasA基因的表达。诱导培养后于12、24、48小时后取样10mL发酵液。

将取得的发酵液进行醇沉处理。先离心去除沉淀，然后加入2倍体积的乙醇静止10min，离心去除上清；加2ml纯净水溶解沉淀，再次离心保留上清，加两倍体积的乙醇静止10min，重复上述操作三次，最后一次用1mL纯净水溶解沉淀。将四硼酸钠溶液分装于试管中，每个试管5mL，然后放置于4℃冰浴中；将得到的醇沉样品进行HA的显色反应。取1mL得到的醇沉样品加到装有四硼酸钠溶液的试管中，先轻微摇晃再充分混匀(在冰浴中进行)；将试管置于沸水中煮沸10min后，放入冷水中冷却至室温，加咔唑溶液0.2mL混匀，再在沸水中煮沸15min，冷却至室温，利用紫外分光光度计530nm处测定吸光值通过标准曲线得出以HA的浓度，最后确定发酵48h，HA产量达到57mg/L(图4)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江农林大学

<120> 一种改造大肠杆菌利用棕榈粕发酵的工程菌株及其应用

<130> BAA210728A

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1253

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgagaacat taaaaaacct cataactgtt gtggccttta gtattttttg ggtactgttg 60

atttacgtca atgtttatct ctttggtgct aaaggaagct tgtcaattta tggctttttg 120

ctgatagctt acctattagt caaaatgtcc ttatcctttt tttacaagcc atttaaggga 180

agggctgggc aatataaggt tgcagccatt attccctctt ataacgaaga tgctgagtca 240

ttgctagaga ccttaaaaag tgttcagcag caaacctatc ccctagcaga aatttatgtt 300

gttgacgatg gaagtgctga tgagacaggt attaagcgca ttgaagacta tgtgcgtgac 360

actggtgacc tatcaagcaa tgtcattgtt caccggtcag aaaaaaatca aggaaagcgt 420

catgcacagg cctgggcctt tgaaagatca gacgctgatg tctttttgac cgttgactca 480

gatacttata tctaccctga tgctttagag gagttgttaa aaacctttaa tgacccaact 540

gtttttgctg cgacgggtca ccttaatgtc agaaatagac aaaccaatct cttaacacgc 600

ttgacagata ttcgctatga taatgctttt ggcgttgaac gagctgccca atccgttaca 660

ggtaatattc tcgtttgctc aggcccgctt agcgtttaca gacgcgaggt ggttgttcct 720

aacatagata gatacatcaa ccagaccttc ctgggtattc ctgtaagtat cggtgatgac 780

aggtgcttga ccaactatgc aactgattta ggaaagactg tttatcaatc cactgctaaa 840

tgtattacag atgttcctga caagatgtct acttacttga agcagcaaaa ccgctggaac 900

aagtccttct ttagagagtc cattatttct gttaagaaaa tcatgaacaa tccttttgta 960

gccctatgga ccatacttga ggtgtctatg tttatgatgc ttgtttattc tgtggtggat 1020

ttctttgtag gcaatgtcag agaatttgat tggctcaggg ttttggcctt tctggtgatt 1080

atcttcattg ttgctctttg tcgtaatatt cactatatgc ttaagcaccc gctgtccttc 1140

ttgttatctc cgttttatgg ggtactgcat ttgtttgtcc tacagccctt gaaattgtat 1200

tctcttttta ctattagaaa tgctgactgg ggaacacgta aaaaattatt ata 1253

<210> 2

<211> 1362

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgcgtaagc gtctggcggt ggctgcggcg accgttctgg cgctgctggc gagcgtgttt 60

gcgctgaccc agccggcgaa cgcggcgacc ggtctgcacg ttaaaaacgg ccgtctgtac 120

gaggcgaacg gtcaagagtt catcattcgt ggcgtgagcc acccgcacaa ctggtatccg 180

cagcacaccc aagcgtttgc ggacatcaag agccacggtg cgaacaccgt gcgtgtggtt 240

ctgagcaacg gtgttcgttg gagcaagaac ggcccgagcg acgtggcgaa cgttatcagc 300

ctgtgcaaac agaaccgtct gatttgcatg ctggaagtgc acgataccac cggttacggc 360

gaacagagcg gtgcgagcac cctggaccaa gcggttgatt attggatcga gctgaaaagc 420

gtgctgcaag gcgaggaaga ttacgttctg atcaacattg gtaacgaacc gtatggcaac 480

gacagcgcga ccgttgcgcg ttgggcgagc gataccagcg cggcgattca acgtctgcgt 540

gcggcgggtt tcgagcacac cctggtggtt gacgcgccga actggggtca ggattggacc 600

aacaccatgc gtaacaacgc ggaccaagtg tacgcgagcg atccgaccgg taacaccgtg 660

tttagcatcc acatgtacgg cgtttatagc caggcgagca ccattgcgag ctatctggag 720

cacttcgtta acgcgggtct gccgctgatc attggcgagt ttggccacga ccacagcgat 780

ggcaacccgg acgaagatac catcatggcg gaggcggaac gtctgaagct gggttacatt 840

ggctggagct ggagcggtaa cggtggcggt gtggaatacc tggacatggt ttataacttc 900

gacggtgata acctgagccc gtggggcgag cgtatctttt atggtccgaa cggcattgcg 960

agcaccgcga aagaagcgac catctttggc ggtagccagc cgggtccgac cgaggaaccg 1020

accgaagagc cgaccgagga gccgaccccg accccgccgc cggcggaggg tgactgcacc 1080

gcgacctacg cgaccattgg cagctggggc ggtggctttc aaggtgaagt gaccgttacc 1140

gctggtgata gcgcgattag cagctggcag gtgagctgga ccttcccggg tggccaaagc 1200

gttgcgcacg gttggaacgc gagctttagc ggcaccagca ccgtgaccgc gagcaacctg 1260

agctacaacg gtcaactggg tgcgggtcaa agcgcgacct tcggctttat tggtagcggt 1320

gatgcgccga gcagcctgac cctgagctgc accgcgcgtt aa 1362

<210> 3

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag 60

gcc 63

<210> 4

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgttaagat ccatgaaaaa gatttggctg gcgctggctg gtttagtttt agcgtttagc 60

gcatcggcg 69

<210> 5

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60

atggcc 66

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcgaaattaa tacgactcac tataggaaga aggagatata 40

Claims (7)

1.一种基因工程菌，其特征在于，能够以棕榈粕为碳源生产寡糖；所述基因工程菌以大肠杆菌为出发菌株，在基因组的malZ位点上整合有由编码甘露糖苷酶的基因TFMS，信号肽，组成型T7启动子和核糖体结合位点序列组成的操纵子；所述组成型T7启动子和核糖体结合位点序列在信号肽的上游，所述信号肽在基因TFMS的上游；

信号肽包含ompA、Dsba或pelB；所述ompA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示、Dsba的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示或pelB的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述编码甘露糖苷酶的基因TFMS的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

3.如权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，还含有利用低分子寡糖合成代谢产物的代谢途径的基因的表达载体。

4.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述表达载体为pET21a。

5.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述利用低分子寡糖合成代谢产物的代谢途径的基因为编码透明质酸合酶的基因hasA。

6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，基因hasA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

7.权利要求1~6任一所述基因工程菌在利用棕榈粕发酵生产中的应用。

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