CN102124119A

CN102124119A - 使用具有降低的异柠檬酸脱氢酶活性的微生物生产精细化学药品的方法

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Publication number: CN102124119A
Application number: CN2009801156796A
Authority: CN
Inventors: A·赫罗尔德; H·施罗德; W·K·郑; C·克洛普罗格; O·策尔德尔; S·黑夫纳; U·里希特; J·贝克尔; C·维特曼
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2008-04-30
Filing date: 2009-04-28
Publication date: 2011-07-13
Also published as: KR20130038944A; KR101498753B1; JP2011518571A; KR20110015422A; EP2283142A1; WO2009133114A1; JP5395893B2; BRPI0911770A2

Abstract

本发明涉及利用具有降低的异柠檬酸脱氢酶活性的微生物来生产精细化学药品的方法。所述精细化学药品可以是氨基酸、用于聚合物合成的单体、糖、脂类、油类、脂肪酸或维生素，且优选是天冬氨酸家族的氨基酸，特别是甲硫氨酸或赖氨酸，或所述氨基酸的衍生物，特别是尸胺。另外，本发明涉及重组微生物，所述重组微生物与初始微生物相比具有降低的异柠檬酸脱氢酶活性，以及这些微生物在例如天冬氨酸家族氨基酸及其衍生物等精细化学药品生产中的用途。

Description

使用具有降低的异柠檬酸脱氢酶活性的微生物生产精细化学药品的方法

本发明涉及利用具有降低的异柠檬酸脱氢酶活性的微生物来生产精细化学药品的方法。所述精细化学药品可以是氨基酸、用于聚合物合成的单体、糖、脂类、油类、脂肪酸或维生素，且优选是天冬氨酸家族的氨基酸，特别是甲硫氨酸或赖氨酸，或所述氨基酸的衍生物，特别是尸胺。

另外，本发明涉及重组微生物，所述重组微生物与原始微生物相比具有降低的异柠檬酸脱氢酶活性，以及涉及这些微生物在例如天冬氨酸家族氨基酸及其衍生物等精细化学药品生产中的用途。

发明背景

精细化学药品，例如包括如乳酸等有机酸，如二氨基戊烷(尸胺)等有机胺，标准(proteogenic)或非标准氨基酸，碳水化合物，芳香化合物，如吡啶二羧酸(dipicolinate)的芳香杂环化合物、维生素和辅因子，饱和与不饱和脂肪酸，通常在制药、农业、化妆品以及食品和饲料工业中需要并使用，但也作为单体用于聚合物合成。它们通常通过化学过程进行生产，但也有越来越多的精细化学药品通过发酵过程进行生产。

关于例如氨基酸甲硫氨酸，目前世界年产量达约500,000吨。标准的工业生产方法不是发酵，而是多步骤的化学过程。甲硫氨酸是禽畜饲料中的第一限制性氨基酸，并因此主要用作饲料添加剂。现有技术中已发表了多种尝试，通过发酵(例如使用大肠杆菌等微生物)来生产甲硫氨酸。

如谷氨酸、赖氨酸和苏氨酸等其他氨基酸，是通过例如发酵方法来生产的。对于这些目的，已经证明如谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)等特定微生物特别合适。通过发酵进行氨基酸生产有特殊的优势，即只生产L-氨基酸，并且避免使用如溶剂等通常用于化学合成的造成环境问题的化学品。

关于如吡啶二羧酸、尸胺或β-赖氨酸等精细化学药品，所述化合物应用于多种领域，并且通常通过非发酵的方法生产。

二吡啶羧酸(CAS号499-83-2)，也称为吡啶-2，6-二羧酸或DPA，应用于不同的技术领域，例如用作聚酯或聚酰胺型共聚物合成中的单体，吡啶合成的前体，过氧化物和过酸(例如叔丁基过氧化物、二甲基-环己酮过氧化物、过氧乙酸和过氧单硫酸(peroxy-monosulphuric acid))的稳定剂，金属表面抛光液的成分，由于存在痕量金属离子容易变质(螯合效应sequestrating effect)的有机材料的稳定剂，环氧树脂稳定剂，以及摄影用溶液或乳剂的稳定剂(防止钙盐沉淀)。

众所周知，DPA是在细菌的内生孢子中生物合成的。催化从二氢吡啶二羧酸(dihydrodipicolinate)生物合成DPA的酶是吡啶二羧酸合成酶。所述酶已从枯草芽孢杆菌中分离出来并进一步表征。它由spoVP操纵子(BG10781，BG10782)编码。

在1950年代，在链霉菌属产生的几种强碱性肽抗生素中鉴定出L-β-赖氨酸。水解时产生L-β-赖氨酸的抗生素包括紫霉素、黄链霉菌素A、链丝菌素、玫瑰丝菌素和土霉素(Stadtman，Adv.Enzymol.Relat.Areas Molec.Biol.38：413(1973))。β-赖氨酸也是诺卡尔菌属真菌产生的抗生素(如菌霉素)的组分，并且β-赖氨酸可用于制备其他生物学上有活性的化合物。然而，β-赖氨酸的化学合成既费时，需要昂贵的起始材料，又通常得到外消旋混合物。

1，5-二氨基戊烷是目前通过L-赖氨酸的化学过程(脱羧)生产的相对昂贵的特制化学品。通过发酵生产的二氨基戊烷在市场上还未能得到。

当今精细化学药品的发酵生产通常在如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、毕赤式酵母(Pichia pastoris)、黑曲霉(Aspergillus niger)、枯草芽孢杆菌、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)或氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)等微生物中进行。特别地，已知谷氨酸棒杆菌具有产生大量氨基酸(如L-谷氨酸和L-赖氨酸)的能力(Kinoshita，S.(1985)Glutamic acidbacteria；页115-142，于：A.L.Demain and N.A.Solomon(编)，Biology of industrial microorganisms，Bejamin/Cummings Publishing Co.，London)。

现有技术的一些尝试，在如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌等微生物中生产如氨基酸、脂类、维生素或碳水化合物等精细化学药品，是设法通过例如增强各精细化学药品生物合成途径有关基因的表达，来达到该目的的。如果，例如已知氨基酸(如甲硫氨酸或赖氨酸)的生物合成途径中某个步骤是限制速率的，各自酶的过度表达可能容许得到产生更多催化反应产物的微生物，并且因此将最终导致相应氨基酸的产量提高。相似地，例如在想得到的氨基酸生物合成途径中，如果已知由于向不期望的中间产物合成传递大量代谢能，而不期望发生某个酶促步骤，可以考虑下调相关酶活性的表达，以便只利于最终导致所需氨基酸合成的那些代谢反应。

例如在WO 02/10209、WO 2006/008097和WO 2005/059093中，描述了通过甲硫氨酸或赖氨酸的生物合成中相关基因的表达上调和/或下调，来增加例如甲硫氨酸或赖氨酸的产量的尝试。

例如在WO 2007/113127、WO 2007/101867和EP 08151031.5中，描述了通过如尸胺、吡啶二羧酸或β-赖氨酸等精细化学药品生物前体的生物合成中相关基因表达的上调和/或下调，来增加所述化合物的产量的尝试。

异柠檬酸脱氢酶(ICD，有时也称IDH，EC 1.1.1.42，SEQ ID NO：3)是参与如谷氨酸棒杆菌的柠檬酸循环(TCA)的酶。它催化循环中的第三步：异柠檬酸的氧化脱羧，产生α酮戊二酸和CO₂。

Eikmanns等人鉴定、克隆并表征了谷氨酸棒杆菌中编码ICD的基因(Eikmanns，B.等人，J.Bacteriol.(1995)177：774-782)。通过在谷氨酸棒杆菌中敲除来使编码ICD的染色体icd基因失活，会导致谷氨酸营养缺陷(Eikmanns，B.等人，J.Bacteriol.(1995)177：774-782)。

谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中的ICD过度表达并不提高谷氨酸产量(Eikmanns，B.等人，J.Bacteriol.(1995)177：774-782)。然而，在DE 10210967中已有报道，大肠杆菌中ICD的过度表达导致苏氨酸产量增加。在谷氨酸棒杆菌中的icd和编码谷氨酸脱氢酶的基因进行共表达，则报道了与之矛盾的结果：Eikmanns没有记录任何效果，JP63214189和JP2520895报道了谷氨酸产量提高。

尽管考虑到已报道的增加精细化学药品(如天冬氨酸家族氨基酸、其生化前体及其衍生物)产量的尝试，仍然需要备选生产方法。

发明目标及概要

本发明的目标之一是提供使用具有至今未知特性的如谷氨酸棒杆菌等工业上重要的微生物，来生产精细化学药品的备选的发酵方法，以及所述方法中使用的微生物。

如从本发明后续描述中逐渐明显所示，本发明如独立的权利要求所述解决这些和其他目标。从属的权利要求涉及优选的实施方案。

在一个实施方案中，本发明涉及使用具有降低的异柠檬酸脱氢酶活性的细胞来生产精细化学药品的方法。目前未知所述酶的下调会否导致特定生化产物的产量提高，特别是天冬氨酸下游产物的产量提高。

根据本发明的方法生产的精细化学药品优选通过从天冬氨酸到甲硫氨酸和/或赖氨酸的生物合成途径的中间体来进行合成。精细化学药品优选天然存在的氨基酸，例如赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸，或其含氮衍生物，例如β-赖氨酸、吡啶二羧酸和1，5-二氨基戊烷。

生产方法中使用的细胞可以是原核生物的、低等真核生物的、分离的植物细胞、酵母细胞、分离的昆虫细胞或分离的哺乳动物细胞，特别是细胞培养系统中的细胞。在本发明背景下，术语“微生物”用于所述种类的细胞。

在本发明中表现出降低的ICD活性的优选的微生物种类是ICD表达降低的棒杆菌，并特别优选ICD表达降低的谷氨酸棒杆菌。

具有降低的ICD活性，并优选包含导致在宿主细胞中ICD所述表达降低的经修饰的核苷酸序列的重组微生物，也是本发明的一部分。这样的微生物可以是谷氨酸棒杆菌。

本发明也涉及前述重组微生物用于生产精细化学药品的用途，特别是通过从天冬氨酸到甲硫氨酸和/或赖氨酸的生物合成途径的中间体进行生产的用途。特别地，它可用于如赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸等天然存在氨基酸的生产。它也可以特别用于如β-赖氨酸、吡啶二羧酸和1，5-二氨基戊烷等含氮精细化学药品的生产。

特别地，提供了本发明的以下实施方案：

生产精细化学药品的方法，其利用与相应原始微生物相比，具有部分或完全降低的异柠檬酸脱氢酶(ICD)活性的微生物；

与相应原始微生物相比，具有部分或完全降低的异柠檬酸脱氢酶(ICD)活性的重组微生物，条件是ICD表达的降低并不是由于经修饰的编码ICD的核苷酸序列(icd序列)代替微生物的天然icd序列进行表达，该表达中所述经修饰的icd编码序列源自未修饰的icd序列，以致未修饰核苷酸序列的至少一个密码子在经修饰的icd序列中被比较不频繁使用的密码子(依据宿主细胞密码子使用)所替换；

根据实施方案(2)用于生产精细化学药品的微生物的用途；和

从根据实施方案(1)的方法得到的精细化学药品制备如聚合物等化学药品和化学终产物的方法，其包括根据实施方案(1)的方法生产所述精细化学药品，作为一个步骤。

附图说明

图1：从赖氨酸生物合成中分支的酶促反应中，发酵制备β-赖氨酸、吡啶二羧酸和1，5-二氨基戊烷。所示的酶与发酵中使用的微生物通常是异源的。

序列表，自由文本

定义

这里使用以下缩写、术语和定义：

IDH，异柠檬酸脱氢酶；ICD，异柠檬酸脱氢酶；缩写“ICD”和“IDH”同义用于异柠檬酸脱氢酶；WT，野生型；PPP，磷酸戊糖途径；DAP，二氨基戊烷；DPA，二吡啶羧酸。

在本发明背景下使用时，除非上下文另有说明，“一个”的单数形式也包括相应的复数。因此术语“微生物”可包括多于一种微生物，即一类微生物的2、3、4、5种等。

与数值或参数范围一起出现的术语“约”，表示本领域技术人员会理解的仍可保证所讨论特征技术效应的精确度区间。该术语通常表明从所示数值偏差+/-10％，优选偏差+/-5％。

除非另有说明，本发明背景下提及的化合物或氨基酸可以有任意的立体化学，包括不同立体异构体的混合物。优选地，氨基酸、其前体和衍生物有L-构型。特别优选的构型在适当处说明。

除非另有说明，通过根据本发明的方法得到的酸可以是游离酸形式、所述酸的部分或完全的盐形式，或者酸及其盐的混合物形式。反之亦然，通过根据本发明的方法得到的胺类，可以是游离胺形式、所述胺的部分或完全的盐形式，或者胺及其盐的混合物形式。

对于本发明目的，术语“宿主细胞”指的是为了生产例如多肽或精细化学药品进行核苷酸序列表达通常使用的任意分离细胞。特别地，术语“宿主细胞”涉及原核生物、低等真核生物、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞培养系统。

术语“微生物”涉及原核生物、低等真核生物、分离的植物细胞、酵母细胞、分离的昆虫细胞或分离的哺乳动物细胞，特别是细胞培养系统中的特定细胞。适合实施本发明的微生物包含如裂殖酵母、酿酒酵母和毕赤氏酵母等酵母菌。哺乳动物细胞培养系统可以选自例如NIH T3细胞、CHO细胞、COS细胞、293细胞、Jurkat细胞和HeLa细胞。在本发明的背景下，优选微生物是原核生物或酵母细胞。本发明背景下优选的微生物在以下“发明详述”部分进行说明。特别优选棒杆菌属。

“天然”是“野生型”和“天然存在”的同义词。除非另有说明，“野生型”微生物是所指微生物通常天然存在的形式。通常野生型微生物是非重组微生物。

“原始”是“起始”(starting)的同义词。“起始”核苷酸序列或酶活性是其进行修饰(例如通过突变或插入抑制子)的出发点。任意“起始”序列、酶或微生物都缺乏它的“最终”或“修饰”形式具有的显著特征，所述特征在具体文字中进行说明(例如降低的ICD活性)。本发明背景下的术语“起始”包含术语“天然”的意思，并且在优选的方面与“天然”同义。

任意野生型或突变体(非重组或重组突变体)微生物可以通过非重组(例如加入特定酶抑制物)或重组的方法进行进一步修饰，得到与原始微生物至少有一种物理或化学性质不同的微生物，并且在本发明的特定方面是其ICD活性不同。在本发明背景下，起始、未修饰的微生物指定“原始微生物”或“起始(微生物)菌株”。与具有给定ICD表达水平的起始菌株相比，微生物ICD活性的任何降低，是通过在可比较条件下两种微生物ICD活性的比较来决定的。

通常，依据本发明的微生物是通过向不携带基因变化的原始微生物引入所述基因变化而得到的。

微生物菌株的“衍生物”是源自其亲本菌株，通过例如经典诱变和选择，或通过定向诱变得到的菌株。例如，菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032lysC^fbr(WO 2005/059093)是源自ATCC13032和LU11424的赖氨酸生产菌株。

对于本发明目的，术语“核苷酸序列”或“核酸序列”涉及编码如肽类、蛋白质等多肽的任意核酸分子。这些核酸分子可以由DNA、RNA或其类似物构成。然而，优选由DNA组成的核酸分子。

本发明背景下的“重组”意思是“由基因工程制备或者是基因工程的结果”。因此，“重组微生物”包含至少一种“重组核酸”或“重组蛋白”。优选重组微生物包含表达载体或克隆载体，或其经过基因改造，而在宿主细胞的内源基因组中含有克隆的核酸序列。

“异源”是通过相关细胞或生物体的基因工程向细胞或生物体引入任意核酸或多肽/蛋白质，并不论其起源生物。因此，在本发明背景下，从微生物中分离，引入同种的另一微生物的DNA，对于后者、经过基因修饰的微生物来说是异源DNA，即使在本领域中对这种基因工程修饰有时使用术语“同源”。然而，在本发明背景下优选术语“异源”表示非同源核酸或多肽/蛋白质。“异源蛋白质/核酸”与“重组蛋白质/核酸”同义。

术语“表达”、“表达中”、“已表达”和“表达”是指宿主生物中基因产物(例如途径中基因的生物合成酶)的表达。表达可通过用作起始生物的微生物的基因改变来进行。在一些实施方案中，可对微生物进行基因改变(例如，经过基因工程)，以相对于起始微生物产生的水平或未经改变的可比较微生物中产生的水平更高的水平，表达基因产物。基因改变包括并不限于改变或修饰与特定基因表达相关的调节序列或位点(例如通过添加强启动子、诱导型启动子或多个启动子，或者通过去除调节序列令表达成为组成型的)，修饰特定基因的染色体位置，改变如核糖体结合位点或转录终止子等特定基因附近的核酸序列，增加特定基因的拷贝数量，修饰参与特定基因转录和/或特定基因产物翻译的蛋白质(例如调节蛋白质、抑制子、增强子、转录激活因子及类似蛋白质)，或使用本领域中常规的对特定基因表达解除调节的其他任意常规方法(包括并不限于例如使用反义核酸分子以阻断阻遏蛋白质的表达)。

“保守的氨基酸变换”意思是起始氨基酸序列的一个或多个氨基酸，被具有相似化学性质的氨基酸替换，例如Val被Ala替换。与起始多肽序列相比，优选替换氨基酸的比例占起始氨基酸序列全部氨基酸的0到30％，更优选0到15％，最优选0到5％。

优选保守氨基酸变换在下列一个氨基酸组的成员之间进行：

-酸性氨基酸(天门冬氨酸和谷氨酸)；

-碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；

-疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸)；

-亲水氨基酸(丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸)；

-具有脂肪族侧链的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)；

-具有脂肪-羟基侧链的氨基酸(丝氨酸、苏氨酸)；

-具有含酰胺侧链的氨基酸(天冬酰胺、谷氨酰胺)；

-具有芳香侧链的氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)；

-具有碱性侧链的氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；

-具有含硫侧链的氨基酸(半胱氨酸、甲硫氨酸)。

特别优选的保守氨基酸变换如下：

天然残基替换残基

Ala Ser

Arg LyS

Asn Gln；His

Asp Glu

Cys Ser

Gln Asn

Glu Asp

Gly Pro

His Asn；Gln

Ile Leu；Val

Leu Ile；Val

Lys Arg；Gln；Glu

Met Leu；Ile

Phe Met；Leu；Tyr

Ser Thr

Thr Ser

Trp Tyr

Tyr Trp；Phe

Val Ile；Leu

术语“分离的”意思是“从其起源生物中分离或纯化”。更特别地，多细胞生物的分离细胞是从其起源生物中分离或已纯化。这包括了生化纯化的和重组产生的细胞。

如此处所用，氢基酸的“前体”或“生化前体”是在本发明的微生物中导致氨基酸形成的生化途径里在所述氨基酸前面(“上游”)的化合物，特别是在所述生化途径的最后几步中形成的化合物。在本发明的背景下，赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或异亮氨酸即除天冬氨酸以外的天冬氨酸家族任意氨基酸的“前体”，是在野生型生物体内天冬氨酸转变为各氨基酸的生化过程中形成的任意中间体。

如此处所用，术语“衍生物”(除了其在语境“微生物衍生物”中的用途，见上)意思是任意化学化合物，其可衍生自(i)天冬氨酸家族的氨基酸或(ii)通过酶促或非酶促转化的在天冬氨酸下游的生化途径中的它们的生化前体，优选酶促转化。优选地，转化得到以下至少一种：

(i)去除一个或两个羧基；

(ii)去除一个氨基；

(iii)一个氨基移位；和/或

(iv)脱氢。

特别优选的转化和衍生物在以下的“发明详述”部分进行描述。

“中间体”或“中间产物”应理解为在化学或生化过程中暂时或持续形成的化合物，其浓度不需要在分析上直接可测。所述中间体可以通过其他化学或生化反应从所述生化过程中去除，特别是通过后续的酶促转化去除，其定义如下详述部分。所述后续酶促转化优选在微生物中进行，所述微生物根据本发明具有部分或完全降低的ICD活性。在根据这一优选方面的方法中，微生物包含至少一种异源的酶，所述酶催化的反应步骤是内源中间体向方法最终产物的后续转化。

氨基酸的“天冬氨酸家族”包括天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和异亮氨酸，特别是所述氨基酸的L-对映体。在狭义上，它包括赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和异亮氨酸。

“碳产量”是每消耗一个碳量(发酵中所用碳源，通常是糖)形成的(产物)碳量，即产物对原料的碳比例。

本发明背景下的“ICD活性”意思是ICD的任意酶活性，特别是ICD发挥的任意催化效应。特别地，“ICD活性”的意思是异柠檬酸向α酮戊二酸的转化。ICD活性可表达为单位每毫克酶(比活性)，或者每分钟每个酶分子转化的底物分子数。

发明详述

本发明涉及通过具有降低的ICD活性的微生物，将氨基酸及其前体生化转化为精细化学药品。

ICD活性提供了细胞中产生氨基酸所需的一些NADPH/NADH。因此，在本发明的概念以前，降低细胞中ICD活性以放大其氨基酸生产，特别是天冬氨酸家族氨基酸及其前体的生产，并不是显而易见的。

令人惊讶的是，现在发现微生物中ICD活性的降低，将导致所述微生物中天冬氨酸家族氨基酸生产的水平提高，天冬氨酸下游生化途径中其前体水平提高，以及所述氨基酸特定衍生物和前体的水平提高。衍生物是通过内源或异源酶合成的，优选通过异源酶，特别是通过图1中列出的异源酶，通过转化天冬氨酸家族的氨基酸或其天然前体之一得到。这些产物有一些，作为精细化学药品是令人有相当兴趣的，特别是氨基酸甲硫氨酸和赖氨酸及衍生物尸胺(1，5-二氨基戊烷)，β-赖氨酸和吡啶二羧酸。例如，它们可作为以下物质使用：

1，5-二氨基戊烷：聚酰胺单体、聚氨基甲酸酯单体、哌啶前体

β-赖氨酸：己内酰胺前体、聚酰胺单体

吡啶二羧酸：聚酯单体、聚酰胺单体、稳定剂

在本发明优选的方面，根据实施方案(1)的生产方法是发酵法。然而，也考虑了化学化合物的其他生物技术生产方法，包括在植物和非人动物中进行体内生产。

根据实施方案(1)的精细化学药品发酵生产法，可包含至少一种(优选重组)微生物的培养，所述微生物具有降低的ICD活性，以致通过乙醛酸分路的碳流得到增加。

在实施方案(1)另一优选的方面，生产方法中所用的微生物是重组微生物。尽管也考虑了化学化合物生物技术生产的其他方法，包括在植物和非人动物的体内生产，选择的生物优选重组微生物。

在本发明的任意实施方案中，实施方案所用微生物中的异柠檬酸脱氢酶活性部分或完全降低。

根据本发明，具有降低的ICD活性的微生物，在与同种、遗传背景相同的原始微生物比较时，部分或完全丧失了其原始的ICD活性。优选地，微生物中丧失了原始ICD活性的至少1％、至少2％、至少4％、至少6％、至少8％、至少10％，更优选丧失活性的至少20％、至少40％、至少60％、至少80％、至少90％、至少95％或全部。活性降低的程度，通过在可比较条件下，与原始微生物内源ICD活性的活性水平相比较来决定。

应当理解，并不总是期望尽可能降低更多ICD活性。在特定情况下，以上所示任意水平和中间体水平的不完全降低，例如降低25％、40％、50％等，可以是期望并足够的了。

优选ICD活性的不完全丧失，因为这样保持了TCA，并允许微生物进一步生产谷氨酸和从α-酮戊二酸合成的其他生物分子。

在ICD活性的完全或接近完全(如90％或更多)丧失表征了微生物的实施方案中，微生物的培养基，特别是根据实施方案(1)用于生产的培养基，可以补充一种或多种由于ICD活性被抑制而使微生物缺乏的重要化合物。特别地，可补充谷氨酸到培养基中，因为它是不昂贵、容易获得的化合物。

在具有多于一个编码ICD基因和/或多于一种ICD的生物中，ICD活性的降低可以是不同种ICD中全部、几种或只有一种活性的降低。由于以上说明的ICD不完全丧失部分的理由，优选少于全部种类ICD的特异降低。

本发明所需的ICD活性降低可以是根据实施方案(1)方法中所用微生物的内源性状，例如来自自发突变的性状，也可以是来自本领域已知的抑制部分或全部酶活性(特别是体内酶活性)的任意方法。酶活性的降低可以在酶合成和酶反应的任意阶段，在遗传、转录、翻译或反应水平上发生。

优选ICD活性水平的降低是基因工程的结果。为了降低宿主细胞中一种或多种内源ICD基因的表达量，并因而降低icd靶基因被抑制的宿主细胞中ICD的量和/或活性，可以应用本领域中任意已知方法。为了下调例如大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌等微生物中或其他如毕赤式酵母和黑曲霉等其他宿主细胞中的基因表达，可利用例如基因敲除法、反义技术、RNAi技术等多种技术。可以删除相应基因的原始拷贝，和/或用显示降低活性，特别是降低比活性的突变来进行取代，或者从弱启动子进行表达。或者可以替换icd基因的起始密码子、icd基因的启动子，通过随机或定向诱变引入突变，破坏或敲除icd基因。另外，可以向mRNA中引入去稳定元件，或引入导致RNA核糖体结合位点(RBS)退化的遗传修饰。最后，可以向反应混合物添加特定的ICD抑制物。

在实施方案(1)的第一优选方面，ICD的降低是由于ICD表达的部分或完全降低。“降低微生物中至少一种ICD的表达”是指，与具有给定ICD表达水平的原始微生物相比，微生物中表达的任意降低。当然，这假定了比较发生在可比较的宿主细胞种类中、可比较的遗传背景情况下等等。优选地，表达降低的达成如上所列，或如下所述。

在本发明的一个特殊方面，微生物损失其原始ICD活性是由于ICD表达降低，优选降低约5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或100％，其表达降低程度通过与原始微生物中多肽表达水平进行比较而决定。表达降低的程度，是通过在可比较条件下，与原始微生物中从起始icd核苷酸序列表达的内源ICD表达水平进行比较而决定的。

在具有多于一个ICD编码基因和/或多于一种ICD的生物中，ICD表达的降低可能涉及一种、数种或全部icd基因。由于以上说明的ICD不完全丧失的上文的理由，优选少于全部icd基因表达的特异降低。

在一个优选的方面，“表达的降低”意思是以下情况，如果将编码多肽的内源核苷酸序列替换为编码基本上同样氨基酸序列和/或功能的已修饰的核苷酸序列，修饰的细胞中会表达的编码多肽数量降低。

这一下调模式的特殊方面是icd基因的敲除(比较实施例4)。它可以通过所研究微生物适合的任意已知敲除方法来达成。敲除方法和使用所得敲除突变体进行精细化学药品生产的特别优选的方法在实施例4中进行描述。

icd的敲除可导致ICD活性的全部或接近全部丧失。因此，为了避免缺乏的症状和保持微生物存活，对于敲除突变体，需要向培养基添加缺乏的如谷氨酸等ICD依赖的产物。

在另一优选的方面，“表达的降低”意思是通过反义技术或RNA干涉(在可应用处，如在真核细胞培养中)干涉基因表达来下调表达。这些技术可以影响icd mRNA水平和/或icd翻译效率。

在另一优选的方面，“表达的降低”意思是缺失或破坏icd基因，并组合引入“弱的”icd基因，即基因编码的ICD酶活性比起始ICD活性低，或通过在弱的表达位点整合icd位点，导致细胞内ICD活性降低。这可以通过在基因转录不那么好的染色体位点整合icd基因来完成，或者通过引入突变或异源的icd基因，所述icd基因具有低比活性或转录效率低、翻译效率低或在细胞内不那么稳定。这一突变icd基因的引入可使用复制质粒或整合到基因组中来进行。

在另一优选的方面，“表达的降低”意思是，降低的ICD活性是通过降低来自染色体编码的icd基因的转录而降低mRNA水平的结果，优选通过原始启动子的突变，或将原始ICD启动子用所述启动子的弱化版本进行替换，或用较弱的异源启动子进行替换。实施这一方面并用所得突变体进行精细化学药品生产的特别优选的方法在实施例6中进行描述。

在另一优选的方面，“表达的降低”意思是ICD活性的降低是RBS突变的结果，导致核糖体结合到翻译起始点的减少，并因此减少了icd mRNA的翻译。突变可以是简单的核苷酸改变和/或也影响RBS与起始密码子的间距。为达成这些突变，可建立含有一系列突变RBS的突变库。例如可通过筛选较低的ICD活性来选择合适的RBS。原始RBS随后可被选择的RBS替换。实施这一方面并用所得突变体进行精细化学药品生产的特别优选的方法在实施例6中进行描述。

在另一优选的方面，“表达的降低”是通过降低mRNA稳定性(例如改变二级结构)以降低mRNA水平来达成的。

在另一优选的方面，“表达的降低”是通过icd调节子，例如转录调节子来达成的。

在另一优选的方面，下调ICD表达的特殊方法是PCT/EP2007/061151中描述的密码子使用法，其在此引入作为参考，涉及微生物中，特别是棒杆菌和大肠杆菌中ICD活性下调的密码子使用方法应用。PCT/EP2007/061151描述了在宿主细胞中减少至少一种多肽量的方法，该方法包含在所述宿主细胞中表达已修饰的核苷酸序列，而不是编码具有基本相同氨基酸序列和/或功能的多肽的非修饰核苷酸序列的步骤，其中所述修饰的核苷酸序列源自非修饰的核苷酸序列，使得非修饰核苷酸序列的至少一个密码子在已修饰核苷酸序列中由不那么频繁使用(根据宿主细胞密码子使用)的密码子替换。

在为了减少ICD量，已修饰核苷酸序列将在棒杆菌，特别优选谷氨酸棒杆菌中进行表达的情况下，至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个，优选至少1％、至少2％、至少4％、至少6％、至少8％、至少10％，更优选至少20％、至少40％、至少60％、至少80％，甚至优选至少90％或至少95％，并且最优选所有的非修饰核苷酸序列密码子，可在已修饰核苷酸序列中，被对于相应氨基酸较不频繁使用的密码子替换。在更优选的实施方案中，前面提到数目的将被替换的密码子，是指频繁、非常频繁、极端频繁或最频繁使用的密码子。在另一个特别优选的实施方案中，以上数目的密码子被最不频繁使用的密码子所替换。在所有这些情况下，参考密码子使用将基于棒杆菌属并优选谷氨酸棒杆菌的密码子使用，并优选基于棒杆菌属并优选谷氨酸棒杆菌的丰富蛋白质密码子使用。详细介绍也见PCT/EP2007/061151。

本发明一个特别优选的方面涉及方法，该方法中微生物中异柠檬酸脱氢酶表达的降低，是通过如PCT/EP2007/061151所描述的改变密码子使用来达成的。微生物可以是棒杆菌，优选是谷氨酸棒杆菌。这些方法可用于改善氨基酸合成，特别是甲硫氨酸和/或赖氨酸，及其衍生物和所述氨基酸的前体衍生物，如1，5-二氨基戊烷、β-赖氨酸和吡啶二羧酸的合成。因此，在本发明的一个优选的方面，由于应用PCT/EP2007/061151描述的密码子使用方法而具有降低的ICD活性的微生物，是根据实施方案(1)的方法进行实施所选择的微生物。特别优选由于替换了其起始密码子(例如ATG)而具有降低的ICD活性的微生物，特别是起始密码子ATG被替换成GTG的微生物。PCT/EP2007/061151特别描述了通过在一个实施方案中用GTG替换起始密码子，和通过在天然ICD的32和33位置将甘氨酸和异亮氨酸密码子从GGC ATT改为GGGATA(比较SEQ ID NO：3与SEQ ID No：4到7)，使谷氨酸棒杆菌细胞中的ICD减少。PCT/EP2007/061151的这两个实施方案是在实施方案(1)生产方法的一个方面为降低ICD活性选择的方法，并且它们在根据本发明实施方案(1)的方法中的用途因此特别引入作为参考。它们的制备和用途在实施例1和3中进行展示。所述实施例中描述的微生物为本发明的优选实施方案，特别是菌株ICD ATG→GTG。

在另一方面，在本发明另外的特别优选的方面，由于应用PCT/EP2007/061151中描述的密码子使用方法而具有降低的ICD活性的微生物，被排除在根据实施方案(1)的方法选择的微生物之外。根据所述方面，实施方案(1)的方法是本发明的实施方案，其附带条件是ICD表达的降低并不是由于已修饰的ICD编码核苷酸序列(icd序列)的表达代替了微生物天然icd序列的表达，其中所述已修饰的icd编码序列源自非修饰的icd序列，这样非修饰核苷酸序列的至少一个密码子在已修饰的icd序列中被不那么频繁使用(根据宿主细胞密码子使用)的密码子替换。换句话说，实施方案(1)的方法是本发明的实施方案，其附带条件是ICD表达的降低并不是由于如PCT/EP2007/061151中描述的修饰密码子使用，并且没有使用PCT/EP2007/061151中描述的微生物。更优选地，实施方案(1)的方法是本发明的实施方案，其附带条件是当精细化学药品选自赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸时，ICD表达的降低并不是由于已修饰的ICD编码核苷酸序列(icd序列)代替微生物的天然icd序列进行表达，其中所述已修饰的icd编码序列源自非修饰的icd序列，这样在已修饰的icd序列中，非修饰的核苷酸序列至少一个密码子被不那么频繁使用的密码子(根据微生物的密码子使用)替换。

所述附带条件并不适用于使用微生物进行的精细化学药品生产，所述微生物的ICD表达降低，是由于PCT/EP2007/061151中描述的已修饰密码子使用，并且该微生物还包含异源酶，该异源酶催化微生物的内源生物合成中间体或最终产物转化为精细化学药品合成的非天然目标化合物(见下)。优选地，所述异源酶选自催化精细化学药品生物合成中的一个或多个步骤的酶，其中精细化学药品特别是可通过酶转化从赖氨酸或其在天冬氨酸下游的生化前体衍生所得到的。更优选地，它是催化脱羧、脱氨基、氨基交换、氨基沿有机分子移位、氧化和/或环化反应的酶。更优选地，它选自吡啶二羧酸合成酶、赖氨酸脱羧酶和赖氨酸2，3-氨基变位酶。特别优选的是包含异源吡啶二羧酸合成酶、赖氨酸脱羧酶或赖氨酸2，3-氨基变位酶的微生物。换句话说，在这一特别优选的实施方案中，微生物可具有降低的ICD活性，是由于如PCT/EP2007/061151中描述的已修饰密码子使用，并且甚至可以是PCT/EP2007/061151中描述的微生物，但另外包含异源吡啶二羧酸合成酶、赖氨酸脱羧酶或赖氨酸2，3-氨基变位酶。

根据本发明实施方案(1)的精细化学药品的制备可用微生物进行，如果精细化学药品不是列于PCT/EP2007/061151中的任一种精细化学药品的话，则所述微生物的ICD活性降低是由于如PCT/EP2007/061151中描述的密码子使用。因此，既然天冬氨酸下游的生化途径中氨基酸的生化前体(例如氨基酸赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和异亮氨酸的前体，如2，3-二氢吡啶二羧酸、二氨基庚二酸、高丝氨酸、高半胱氨酸和2，3-二羟基-3-甲基戊酸)和所述氨基酸的天然或非天然衍生物或生化前体在PCT/EP2007/061151中并未列为其所述的微生物产物，则选自所述前体和衍生物的化合物是根据实施方案(1)的方法优选的产物。甚至更优选的是衍生物，优选非天然衍生物的制备，其为所述氨基酸或前体，特别是赖氨酸或天冬氨酸下游的赖氨酸天然前体之一(例如2，3-二氢吡啶二羧酸)的衍生物的制备。特别优选的是以下化合物的制备：1，5-二氨基戊烷(尸胺)、β一赖氨酸和吡啶二羧酸。

在实施方案(1)的第二优选的方面，ICD活性的降低是由于酶的部分或完全抑制。抑制可以是任意已知可逆或不可逆ICD抑制剂结合到ICD的结果。这样的抑制剂为本领域公知，例如草乙酸、2-酮戊二酸和柠檬酸(已知为谷氨酸棒杆菌中ICD的弱抑制剂)，或草乙酸加乙醛酸，其已知为强抑制剂(Eikmanns等人(1995)上述引文)。所述抑制剂可以添加到发酵培养基中，或可由外界刺激诱导细胞内它的合成。

在实施方案(1)和(2)的几个优选的方面中，降低的ICD活性是对宿主细胞(优选微生物，特别是棒杆菌)进行基因工程的结果，而不是ICD表达降低的结果。

特别地，在第三优选的方面，缺失icd基因的原始拷贝，并将其替换为突变形式，所述突变形式编码的ICD与原始ICD相比具有较少的ICD活性，或编码的ICD活性较少的异源icd基因，导致本发明微生物ICD活性的降低。实施这一方面并使用所得突变体生产精细化学药品的特别优选的方法，在实施例5中进行描述。

在第四优选的方面，根据本发明，在微生物中实现了两种或多种以上提及特性的组合，导致ICD活性降低。

依据本发明实施方案(1)的优选方法，包含降低微生物中，优选棒杆菌并更优选谷氨酸棒杆菌中的ICD活性的步骤，其中应用了以上原理。

在ICD活性降低的微生物中，天冬氨酸家族成员的生物合成增加，及其通过天冬氨酸的生物转化形成的前体的生物合成增加，可能是由于ICD抑制的结果，造成通过PPP和乙醛酸分路的碳流增加。前者导致为氨基酸生产提供了充足的还原等价物，例如NAD(P)H，后者为天冬氨酸家族生物合成提供了需要的碳前体。因此，在本发明的一个优选的方面，在实施方案(1)中使用的微生物或根据实施方案(2)的微生物中，通过

(i)乙醛酸分路和/或

(ii)磷酸戊糖途径(PPP)

的碳流与野生型微生物相比是增加的。优选地，通过乙醛酸分路的碳流乙醛酸循环。任意的所述增加可以是ICD活性降低的结果、微生物基因工程的结果、微生物天然性状的结果，或任意这些因素的组合。通过乙醛酸分路的增加的碳流，优选是ICD活性降低和/或微生物基因工程的结果。通过PPP的增加的碳流优选是微生物基因工程的结果，更优选是PPP酶表达水平积极上调的结果，例如通过使用如Psod(WO 2005/059144)等强启动子。

如上所示，本发明关于微生物和微生物在精细化学药品生产中的用途。然而，也考虑了除了根据实施方案(1)生产方法中的微生物之外的其他微生物的用途，以及取代根据实施方案(2)的微生物的其他微生物的用途。对于本发明的目的，术语“生物”是指通常用于精细化学药品生产的核苷酸序列表达的任意非人生物，特别是如上定义的微生物、包括藻类和苔藓的植物、酵母和非人动物。特别适宜精细化学药品生产的微生物以外的生物是植物和植物的各部分。这样的植物可以是单子叶或双子叶的，例如单子叶或双子叶农作物、食用植物或饲料植物。单子叶织物的实例是属于燕麦属(燕麦)、小麦属(小麦)、黑麦属(黑麦)、大麦属(大麦)、稻属(稻)、黍属、狼尾草属、狗尾草属、蜀黍属(小米)、玉蜀黍属(玉蜀黍)及类似植物。

双子叶农作物包含特别是棉、如豆类等豆科植物，以及特别是紫花苜蓿、大豆、油菜、西红柿、甜菜、土豆、观赏植物和树。另外的农作物还包含水果(特别是苹果、梨、樱桃、葡萄、柑橘、凤梨和香蕉)、油棕、茶树、可可树和咖啡树、烟草、剑麻，以及，考虑到药用植物，萝芙木和洋地黄。特别优选的是谷物小麦、黑麦、燕麦、大麦、稻、玉米和小米、甜菜、油菜、大豆、西红柿、土豆和烟草。其他农作物可从US 6,137,030中取得。

本领域技术人员会意识到，对例如微生物、植物和植物细胞、动物和动物细胞等不同的生物和细胞，细胞中icd基因和ICD蛋白的数量和种类方面将有不同。即使在同一生物内，不同菌株可以显示出蛋白质水平上多少有异源的表达谱。

在生物与实施本发明所用的微生物不同时，可应用非发酵的生产方法。

本发明中根据实施方案(1)、(2)、(3)和(4)，可以使用如上定义的任意微生物。优选地，微生物是原核生物。为实施本发明特别优选的是选自棒杆菌属和短杆菌属(Brevibacterium)的微生物，优选棒杆菌属，特别关注谷氨酸棒杆菌，埃希氏菌属，特别关注大肠杆菌，芽孢杆菌属，特别是枯草芽孢杆菌，链霉菌属和曲霉菌属。

1.本发明优选的实施方案涉及微生物的用途，所述微生物选自棒状杆菌，例如棒杆菌属的细菌。特别优选的是以下的种：谷氨酸棒杆菌、醋谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、嗜醋酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、美棒杆菌(Corynebacterium callunae)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)和Corynebacterium effiziens。本发明其他优选的实施方案涉及短杆菌属的使用，且特别是以下种：黄色短杆菌、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)和Brevibacterium divarecatum。

在本发明优选的实施方案中，微生物可选自谷氨酸棒杆菌ATCC13032、醋谷棒杆菌ATCC15806，嗜醋酸棒杆菌ATCC13870，热产氨棒杆菌FERMBP-1539，栖糖蜜棒杆菌ATCC17965，Corynebacterium effiziens DSM44547，Corynebacterium effiziens DSM 44549，黄色短杆菌ATCC14067，乳酸发酵短杆菌ATCC13869，Brevibacterium divarecatum ATCC 14020，谷氨酸棒杆菌KFCC10065和谷氨酸棒杆菌ATCC21608，及其通过例如经典突变和选择或通过定向突变得到的菌株。

谷氨酸棒杆菌的其他优选菌株可选自ATCC13058，ATCC13059，ATCC13060，ATCC21492，ATCC21513，ATCC21526，ATCC21543，ATCC13287，ATCC21851，ATCC21253，ATCC21514，ATCC21516，ATCC21299，ATCC21300，ATCC39684，ATCC21488，ATCC21649，ATCC21650，ATCC19223，ATCC13869，ATCC21157，ATCC21158，ATCC21159，ATCC21355，ATCC31808，ATCC21674，ATCC21562，ATCC21563，ATCC21564，ATCC21565，ATCC21566，ATCC21567，ATCC21568，ATCC21569，ATCC21570，ATCC21571，ATCC21572，ATCC21573，ATCC21579，ATCC19049，ATCC19050，ATCC19051，ATCC19052，ATCC19053，ATCC19054，ATCC19055，ATCC19056，ATCC19057，ATCC19058，ATCC19059，ATCC19060，ATCC19185，ATCC13286，ATCC21515，ATCC21527，ATCC21544，ATCC21492，NRRL B8183，NRRL W8182，B12NRRLB12416，NRRLB12417，NRRLB12418和NRRLB11476。

缩写KFCC表示韩国培养物保藏联盟(Korean Federation of Culture Collection)，ATCC表示美国典型培养物保藏中心(American-Type Strain Culture Collection)，且缩写DSM表示德国微生物保藏中心。缩写NRRL表示美国北方农业研究所培养物保藏中心。

对实施本发明，特别优选已经有能力生产例如L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸和/或L-苏氨酸等精细化学药品的谷氨酸棒杆菌菌株。这样的菌株是例如谷氨酸棒杆菌ATCC13032，并且特别是其衍生物。也优选使用已知产生赖氨酸的菌株ATCC 13286，ATCC 13287，ATCC 21086，ATCC 21127，ATCC 21128，ATCC 21129，ATCC 21253，ATCC 21299，ATCC 21300，ATCC21474，ATCC 21475，ATCC 21488，ATCC 21492，ATCC 21513，ATCC 21514，ATCC 21515，ATCC 21516，ATCC 21517，ATCC 21518，ATCC 21528，ATCC21543，ATCC 21544，ATCC 21649，ATCC 21650，ATCC 21792，ATCC 21793，ATCC 21798，ATCC 21799，ATCC 21800，ATCC 21801，ATCC 700239，ATCC21529，ATCC 21527，ATCC 31269和ATCC 21526。特别优选的是已经有能力产生例如L-赖氨酸、L-甲硫氨酸和/或L-苏氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株。因此特别优选源自具有反馈抗性天冬氨酸激酶及其衍生物的谷氨酸棒杆菌菌株。这一优选包括源自具有反馈抗性天冬氨酸激酶的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的菌株，以及特别关注菌株LU11424，ATCC130321ysC^fbr和ATCC13286。

在本发明背景下，具有反馈抗性天冬氨酸激酶的谷氨酸棒杆菌LU11424，ATCC13032lysC^fbr，ATCC13032或ATCC13286及其衍生物是特别优选的微生物。最优选的是LU11424，ATCC13032lysC^fbr或ATCC13286及其衍生物，特别优选LU11424。

可以用不同的谷氨酸棒杆菌菌株来替换icd的内源拷贝。然而，优选使用谷氨酸棒杆菌赖氨酸生产菌株，例如ATCC13032 lysC^fbr，LU11424或其他ATCC13032或ATCC13286的衍生物。

ATCC13032lysC^fbr可从ATCC13032开始生产。为了生成这样的赖氨酸生产菌株，在谷氨酸棒杆菌ATCC13032中进行了野生型基因LysC的等位交换。为了这一目的，向LysC基因引入了核苷酸交换，以致所得的蛋白质在311位置携带异亮氨酸而不是苏氨酸。这一菌株的详细构建在专利申请WO2005/059093中进行了描述。LysC基因的登记号是P26512。

可如实施例1所述生产LU11424。它是ATCC13032lysC^fbr的衍生物。LU11424中的ICD活性降低，是优选通过对作为异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列起始密码子的ATG进行替换，优选将ATG替换为GTG。本发明背景下特别优选实施例1中描述的icd起始密码子被替换的菌株(例如菌株ICDATG →GTG)。然而，也考虑具有列于实施例1中的一个或多个修饰的LU11424，并具有降低的ICD活性的ATCC13032的任意衍生物作为实施本发明的优选菌株。

应当理解，为了适合本发明，以上所列所有微生物将显示部分或完全降低的ICD活性。本发明背景下优选的微生物是重组微生物，该微生物ICD活性降低是基因工程的结果，例如实施例1中描述的菌株ICD ATG→GTG。

本发明的实施方案(1)涉及以上提及的具有降低的ICD活性的微生物用于生产精细化学药品的用途。

术语“精细化学药品”为本领域技术人员公知，并且表示可用于制药工业、农业生产以及化妆品、食品和饲料工业不同部分的化合物。术语“精细化学药品”也包括用于合成聚合物的单体。

精细化学药品可以是最终产物或需要进一步合成步骤的中间体。

在本发明背景下，术语“精细化学药品”的复数与“精细化学药品”的单数同义，即只有一种化合物。精细化学药品的生产，即只有一种目标化合物，优选通过本发明的方法和微生物来进行。

精细化学药品定义为所有有机分子，其含有至少两个碳原子，并另具有至少一个非碳和氢原子的杂原子。优选术语“精细化学药品”涉及有机分子，该有机分子包含至少两个碳原子，并另具有至少一个官能团，例如羟基、氨基、硫醇基、羰基、羧基、甲氧基、醚基、酯基、氨基、磷酸酯基、硫醚基或硫酯基团。

因此精细化学药品优选包含有机酸，例如乳酸、琥珀酸、酒石酸、衣康酸等。精细化学药品还包含氨基酸、嘌呤和嘧啶碱基、核苷酸、脂类、例如花生四烯酸等饱和和不饱和脂肪酸，例如丙二醇和丁二醇等二醇的醇类，例如透明质酸和海藻糖等糖，例如香草醛、维生素和辅因子等芳香化合物。优选海藻糖和以下部分描述的精细化学药品。

为了本发明的目的特别优选的精细化学药品，是选自有机酸、氨基酸、有机胺和在芳香环上包含一或两个氮原子的芳香杂环化合物的生物合成产物。

更优选地，本发明背景下术语“精细化学药品”是关于包含至少三个芳香或脂肪碳原子，并另具有至少一个羧基或氨基基团，甚至更优选具有

(I)

其中

R1是-COOH或H，且R2和R3相互独立地为NH₂或H；

并且其中优选以下组合：

R1＝COOH，R2＝NH₂，R3＝H；R1＝H，R2＝NH₂，R3＝H；R1＝COOH，

如上概括，根据实施方案(1)的方法特别适合生产选自以下的化合物：

天冬氨酸家族氨基酸，特别是赖氨酸，

这些氨基酸在天冬氨酸生化途径下游的生化前体，以及

所述氨基酸的天然或非天然衍生物或生化前体。

优选生产非天然衍生物，特别是非天然酶促衍生物，以及氨基酸。这之中，优选生产赖氨酸的非天然衍生物，或生产其前体之一的非天然衍生物，即天冬氨酸向赖氨酸的生物转化中的中间体。

根据本发明的方法特别优选的最终产物选自赖氨酸，甲硫氨酸，苏氨酸，异亮氨酸，1，5-二氨基戊烷，β-赖氨酸和吡啶二羧酸。更优选地，最终产物选自优选最终产物包含的衍生物(iii)，即选自1，5-二氨基戊烷，β-赖氨酸和吡啶二羧酸。最优选生产1，5-二氨基戊烷(尸胺)。

如上概括，优选在实施方案(1)的方法中，生产选自天冬氨酸家族氨基酸的化合物及其生化前体，作为中间体或最终产物。

在一个方面，选自天冬氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，异亮氨酸和苏氨酸的氨基酸是根据实施方案(1)的方法的最终产物，其中优选赖氨酸，甲硫氨酸，异亮氨酸和苏氨酸，特别优选赖氨酸作为最终产物。特别优选L-对映体。

在第二个方面，选自赖氨酸，甲硫氨酸，异亮氨酸和苏氨酸的氨基酸的生化前体是根据实施方案(1)的方法的最终产物，其中所述生化前体在各氨基酸的生物合成中处于天冬氨酸的下游。

在第三个方面，在根据实施方案(1)的方法中，所述氨基酸或氨基酸前体是中间产物，并且随后酶促或非酶促转化为其衍生物，优选转化为有机胺，有机酸或氨基酸。优选地，最终产物是所述中间产物的非天然衍生物。特别优选中间产物随后转化为赖氨酸或其在天冬氨酸下游的生化前体之一。对于所述前体，特别优选二氢吡啶二羧酸。

在所述的第三个方面，术语“衍生物”意思是任意化学化合物，所述化学化合物可从(i)天冬氨酸家族氨基酸或(ii)它们在天冬氨酸下游的生化途径中的生化前体通过酶促或非酶促转化而衍生得到，优选酶促转化。优选地，转化得到以下至少一项：

(i)去除一或两个羧基；

(ii)去除一个氨基；

(iii)一个氨基移位；和/或

(iv)脱氢

在所述的第三个方面，所述的后续转化优选酶促转化，或至少包含一个酶促步骤。催化所述转化的酶可以是对具有降低的ICD活性的微生物内源的，或者异源的。优选它是异源的。

随后的转化优选在包含实施方案(1)中所定义微生物的反应混合物中发生。催化可以是通过添加到反应混合物中的分离的酶，通过除了具有降低ICD活性的微生物以外的微生物，或者通过具有降低ICD活性的微生物本身进行。优选催化是通过具有降低的ICD活性的微生物本身进行。

因此，根据实施方案(1)方法的优选的方面包含后续的酶促转化，所述酶促转化如上定义，发生在具有部分或完全降低的ICD活性的微生物中。在根据这一优选方面的方法中，优选微生物包含至少一种异源的酶，所述酶在后续的内源中间体向方法的最终产物的转化中催化反应步骤。

所述的在具有降低ICD活性的微生物中的异源酶，可以是有能力将内源生物合成中间体或微生物的最终产物转化为精细化学药品合成的目标化合物的任意的酶。优选地，它选自对精细化学药品合成或生物合成中一个或多个步骤进行催化的酶，特别是从赖氨酸或从它在天冬氨酸下游的生化前体通过酶促转化得到的精细化学药品。更优选地，它是催化脱羧、脱氨基、氨基交换、氨基沿有机分子移位、氧化和/或环化反应的酶。更优选地，它选自吡啶二羧酸合成酶、赖氨酸脱羧酶和赖氨酸2，3-氨基变位酶。特别优选的是包含异源吡啶二羧酸合成酶、赖氨酸脱羧酶或赖氨酸2，3-氨基变位酶的微生物。

因此，在根据实施方案(1)的方法的特别优选的方面，微生物如前面部分定义，包含至少一种异源的酶。特别优选的是使用为了制备选自吡啶二羧酸、1，5-二氨基戊烷和β-赖氨酸的产物之一而进行最优化的微生物，如下：

吡啶二羧酸：具有异源吡啶二羧酸合成酶的微生物；

1，5-二氨基戊烷：具有异源赖氨酸脱羧酶的微生物；

β-赖氨酸：具有异源赖氨酸2，3-氨基变位酶的微生物。

对于根据实施方案(1)方法的各优选最终产物，可以使用这样的微生物，该微生物不仅具有降低的ICD活性，并且也特别适应生产期望的最终产物。这种适应可以是由于酶活性的抑制或减少，已知这种抑制和减少对不想要的副产物的合成有作用。降低形成生物合成途径一部分的酶的数量或活性，可以通过例如关闭副产物的生产和通过将代谢流引向优选的方向，容许前面提及的精细化学药品的合成得到增加。

另一方面，这一适应可以是由于酶的活性增加或这样的代谢途径，均已知为会促进化学生产。优选微生物的所述适应包括酶的活性和/或表达的增加，所述酶催化通向期望最终产物的一个或多个转化步骤，特别地，该酶催化天冬氨酸下游的转化步骤，更特别地，该酶催化天冬氨酸向赖氨酸转化的转化步骤，或者异源酶催化内源生物合成中间体或微生物的最终产物向精细化学药品合成的非天然目标化合物进行转化。更优选的是所述适应是由于基因工程，该基因工程导致在微生物中存在至少一种异源酶，该酶促进目标精细化学药品的生产，或对所述生产是必需的，因为野生型微生物不能合成目标化合物。

因此在根据实施方案(1)的方法的方面，其中生产方法(1)的目标化合物是1，5-二氨基戊烷(尸胺)，对于实施所述方法特别优选的微生物，不仅具有降低的ICD活性，也另外包含了赖氨酸脱羧酶。所述脱羧酶优选是异源(重组)赖氨酸脱羧酶。微生物有能力产生赖氨酸，并将其转化为尸胺。

更优选地，赖氨酸脱羧酶是异源的赖氨酸脱羧酶，如WO 2007/113127中所述。赖氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.18)催化L-赖氨酸脱羧成为尸胺。来自大肠杆菌的具有赖氨酸脱羧酶活性的酶，是cadA(SEQ ID NO：10)基因的产物(SEQ ID NO：11；Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，Entry b4131)，以及1dcC(SEQ ID NO：12)基因的产物(SEQ ID NO：13；Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，Entry JW0181)。

可通过使用多核苷酸探针筛选cDNA或基因组库，得到编码大肠杆菌赖氨酸脱羧酶的DNA分子，所述多核苷酸探针具有的核苷酸序列是从SEQ IDNO：11或13的氨基酸序列进行反向翻译得到的。

可选地，可以通过使用互为引物的长寡核苷酸或PCR来合成DNA分子，得到大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因。例如，见Ausubel等人，(eds.)，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，页8.2.8至8.2.13(1990)，Wosnick等人，Gene 60：115(1987)；Ausubel等人(编)，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，3版，页8-8至8-9，John Wiley & Sons，Inc.(1995)；另外的与DNA合成相关的引文在WO 2007/113127中提供，此处引入作为参考。

也可以使用大肠杆菌赖氨酸脱羧酶的变体，所述赖氨酸脱羧酶与亲本酶相比，含有保守的氨基酸变换，如上定义。也见WO 2007/113127。

可通过将核苷酸替换成SEQ ID NO：10或12所述的核苷酸，来引入大肠杆菌赖氨酸脱羧酶的保守氨基酸变换。可通过例如寡核苷酸定向突变、接头分区诱变、使用聚合酶链反应的突变或类似的突变，得到这样的″保守氨基酸″变体。Ausubel等人，supra，在8.0.3-8.5.9页；Ausubel等人(eds.)，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，第3版，8-10到8-22页(John Wiley & Sons，Inc.1995)。通常也见McPherson(编)，DIRECTED MUTAGENESIS：A PRACTICAL APPROACH，IRL Press(1991)。可使用标准酶活性测试方法，例如WO 2007/113127中所述的测试方法，来测定这样的变体将L-赖氨酸向尸胺转化的能力。

本发明背景下优选的赖氨酸脱羧酶是来自大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶，及其与相应“原始”基因产物有高达80％、优选高达90％及最优选95％或98％的序列同一性(基于氨基酸序列)的、仍然具有赖氨酸脱羧酶生物活性的同源体。可以容易地通过用本领域已知方法引入核苷酸替换、缺失或插入，来构建这些同源体基因。大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶(SEQ ID NO：11和NO：13)也可以通过应用谷氨酸棒杆菌的密码子使用，被重新翻译为DNA。这些赖氨酸脱羧酶多核苷酸序列对在棒杆菌属，特别是谷氨酸棒杆菌中进行赖氨酸脱羧酶表达有用处。

对于1，5-二氨基戊烷的生产甚至更加特别优选的微生物，不仅具有降低的ICD活性并包含赖氨酸脱羧酶，也包含至少一种额外的进行上调或下调的基因，所述基因编码在赖氨酸生物合成中起关键作用的酶，如WO2007/113127中所述。对尸胺的生产最优选的是在WO 2007/113127中特别描述的，并额外具有实施本发明所需的降低的ICD活性的微生物。在特别优选的方面，二氨基乙酰基转移酶基因被下调，即基因被完全灭活或基因活性降低。二氨基乙酰基转移酶的序列在WO 2007/113127中进行了描述。

在根据实施方案(1)的方法中，其中目标化合物是β-赖氨酸的方面，为实施所述方法特别优选的微生物不仅具有降低的ICD活性，还额外包含赖氨酸-2，3-氨基变位酶。所述氨基变位酶优选是异源(重组)的赖氨酸-2，3-氨基变位酶。微生物有产生赖氨酸并将其转化为β-赖氨酸的能力。

更优选地，赖氨酸-2，3-氨基变位酶是异源的赖氨酸-2，3-氨基变位酶，如WO 2007/101867中所述。赖氨酸-2，3-氨基变位酶催化L-赖氨酸向β-赖氨酸的可逆异构化。从近端梭菌菌株SB4中分离的酶是明显相同亚基的六聚蛋白质，其分子量从扩散与沉降系数测定，为285,000(Chirpich et al.，J.Biol.Chem.245：1778(1970)；Aberhart等人，J.Am.Chem.Soc.105：5461(1983)；Chang等人，Biochemistry 35：11081(1996))。梭菌酶含有铁硫簇、钴和锌，以及吡哆醛5′-磷酸盐，并且它由S-腺苷蛋氨酸活化。与典型的腺苷酰钴胺素依赖的氨基变位酶不同，梭菌酶不含有或需要任何种类的维生素B12辅酶。梭菌赖氨酸-2，3-氨基变位酶的核苷酸和预测的氨基酸序列(SEQ ID NO：14和16)在US 6,248,874B1中公开。

编码梭菌赖氨酸-2，3-氨基变位酶的DNA分子，可通过使用多核苷酸探针筛选cDNA或基因组库得到，所述多核苷酸探针具有从SEQ ID NO：16反向翻译得到的核苷酸序列，或者具有基于SEQ ID NO：14的核苷酸序列。例如，可通过从近端梭菌菌株SB4(ATCC No.29748)中得到基因组DNA来制备合适的库，并根据标准方法建立库。如见Ausubel等人(编)，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，第三版，2-1到2-13以及5-1到5-6页(John Wiley & Sons，Inc.1995)。

可选地，可通过使用互为引物的长寡核苷酸或PCR合成DNA分子来得到赖氨酸-2，3-氨基变位酶基因。如见Ausubel等人(编)，CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，8.2.8到8.2.13页(1990)，Wosnick等人，Gene 60：115(1987)；Ausubel等人(编)，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，第3版，8-8到8-9页，John Wiley & Sons，Inc.(1995)，并且另外的与DNA合成有关的引文在WO 2007/113127和WO2007/101867中提供，在此处引入作为参考。

也可以使用与亲本酶相比如上定义含有保守氨基酸变换的赖氨酸-2，3-氨基变位酶基因的变体。也见WO 2007/101867。

可通过将核苷酸替换成SEQ ID NO：14中所述核苷酸，来引入赖氨酸-2，3-氨基变位酶基因中的保守氨基酸变换。例如可通过寡核苷酸定向突变、接头分区诱变、使用聚合酶链反应的突变及类似突变，来得到这样的″保守氨基酸″变体。Ausubel等人，同上，8.0.3-8.5.9页；Ausubel等(编)，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，第3版，8-10到8-22页(John Wiley & Sons，Inc.1995)。通常也见McPherson(编)，DIRECTED MUTAGENESIS：A PRACTICAL APPROACH，IRL Press(1991)。可以使用标准的酶活性测试方法，例如WO 2007/101867中描述的测试方法，来测定这样的变体将L-赖氨酸转化为β-赖氨酸的能力。

与来自近端梭菌不同的其他来源的赖氨酸-2，3-氨基变位酶，如来自枯草芽孢杆菌或大肠杆菌的酶，在US 6,248,874B1中已公开。这一美国专利与赖氨酸-2，3-氨基变位酶的分离、SEQ ID NO和表达相关的部分在此引入作为参考。

优选用于本发明的赖氨酸-2，3-氨基变位酶，是来自近端梭菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌，及其具有与相应天然氨基酸序列高达80％，优选90％，最优选95％和98％序列同一性(基于氨基酸序列)的同源体，且仍具有赖氨酸-2，3-氨基变位酶生物活性的赖氨酸-2，3-氨基变位酶。可以用本领域已知的方法容易地通过引入核苷酸替换、缺失或插入来构建这些同源体。

另一种优选的赖氨酸-2，3-氨基变位酶是来自近端梭菌(US 6,248,874B1的SEQ ID NO：2)的赖氨酸-2，3-氨基变位酶，其通过应用谷氨酸棒杆菌(SEQ ID NO：15)的密码子使用重新翻译为DNA。这一赖氨酸-2，3-氨基变位酶的序列对于在棒杆菌属，特别是谷氨酸棒杆菌中进行赖氨酸-2，3-氨基变位酶表达有用处。

对于β-赖氨酸生产甚至更加特别优选的微生物不仅具有降低的ICD活性和包含赖氨酸-2，3-氨基变位酶，也包含至少一种上调或下调的基因，所述基因编码如WO 2007/101867所述在赖氨酸生物合成中起关键作用的酶。对于β-赖氨酸生产，最优选在WO 2007/101867中特别描述的，另外具有实施本发明所需的降低ICD活性的微生物。

在根据实施方案(1)的方法，其中目标化合物是吡啶二羧酸的方面，为实施所述方法特别优选的微生物不仅具有降低的ICD活性，也另外包含吡啶二羧酸合成酶。所述吡啶二羧酸合成酶优选是异源(重组)的吡啶二羧酸合成酶。微生物具有产生2，3-二氢吡啶二羧酸并将其转化为吡啶二羧酸的能力。

最优选地，吡啶二羧酸合成酶是如EP 08151031.5所述的异源吡啶二羧酸合成酶。

遵循根据本发明实施方案(1)的方法的DPA发酵生产，包含培养至少一种具有降低ICD活性的重组微生物，所述微生物有能力用二氢吡啶二羧酸，特别是L-2，3-二氢吡啶二羧酸作为中间产物，通过二氨基庚二酸(DAP)途径生产赖氨酸，并且该微生物另外具有表达异源吡啶二羧酸合成酶的能力，以致二氢吡啶二羧酸，特别是L-2，3-二氢吡啶二羧酸转化成DPA。

特别地，所述亲本微生物是产赖氨酸的细菌，优选棒状杆菌。特别地，所述亲本微生物是棒杆菌属的细菌，例如谷氨酸棒杆菌。

所述异源吡啶二羧酸合成酶是原核或真核来源的。例如，所述异源吡啶二羧酸合成酶可以源自芽孢杆菌属的细菌，特别是来自枯草芽孢杆菌。所述芽孢杆菌酶由α和β亚基组成，如EP 08151031.5中所述。在本发明的进一步的实施方案中，异源吡啶二羧酸合成酶包含至少一个α亚基，该亚基具有根据EP 08151031.5的SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或者具有与该序列有至少80％序列同一性，例如具有至少85，90，92，95，96，97，98或99％的序列同一性的序列，；并且至少一个β亚基，其具有根据EP08151031.5的SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或者与该序列有至少80％序列同一性，例如具有至少85，90，92，95，96，97，98或99％的序列同一性的序列。

具有吡啶二羧酸合成酶活性的酶可由核酸序列编码，所述核酸序列适应了所述的具有产赖氨酸能力的亲本微生物的密码子使用。

例如，具有吡啶二羧酸合成酶活性的酶可以由包含以下序列的核酸序列进行编码：

a)根据SEQ ID NO：17(EP 08151031.5的SEQ ID NO：1)的spoVF基因序列，或

b)合成spoVF基因序列，其包含的编码序列主要来自根据EP08151031.5的SEQ ID NO：4中的193残基到1691残基；或

c)编码吡啶二羧酸合成酶，或其如上定义的α和/或β亚基的任意核苷酸序列。

可使用多核苷酸探针进行cDNA或基因组库筛选来得到编码吡啶二羧酸合成酶的DNA分子，所述多核苷酸探针具有的核苷酸序列是从SEQ IDNO：19或20的氨基酸序列反向翻译得到的，或者所用多核苷酸探针具有基于SEQ ID NO：17的核苷酸序列。可选地，可使用互为引物的长寡核苷酸或PCR进行DNA合成，来得到吡啶二羧酸合成酶基因。例如，见Ausubel等人(编)，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，8.2.8到8.2.13页(1990)，Wosnick等人，Gene 60：115(1987)；Ausubel等人(编)，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，第3版，8-8到8-9页，John Wiley &Sons，Inc.(1995)；并且另外的与DNA合成相关的引文在WO 2007/113127和WO 2007/101867中提供，在此引入作为参考。

也可以使用吡啶二羧酸合成酶的变体，所述变体含有与亲本酶相比的保守氨基酸变换，如上定义。也见EP 08151031.5。

可通过将核苷酸替换成SEQ ID NO：17中所述的核苷酸，来引入吡啶二羧酸合成酶中的保守氨基酸变换。例如可通过寡核苷酸定向突变、接头分区诱变、使用聚合酶链反应的突变及类似突变，来得到这样的″保守氨基酸″变体。Ausubel等人，同上，8.0.3-8.5.9页；Ausubel等人(编)，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BI0LOGY，第3版，8-10到8-22页(John Wiley& Sons，Inc.1995)。通常也见McPherson(编)，DIRECTED MUTAGENESIS：A PRACTICAL APPROACH，IRL Press(1991)。可以使用标准的酶活性测试方法来测定这样的变体将2，3-二氢吡啶二羧酸转化为DPA的能力。

另一优选的吡啶二羧酸合成酶是来自枯草芽孢杆菌的吡啶二羧酸合成酶，通过应用谷氨酸棒杆菌(SEQ ID NO：18)的密码子使用将该酶反向翻译成DNA。这一吡啶二羧酸合成酶多核苷酸序列对于在棒杆菌属微生物，特别是谷氨酸棒杆菌中进行吡啶二羧酸合成酶表达有用处。

对吡啶二羧酸生产甚至更加特别优选的微生物，不仅具有降低的ICD活性并包含吡啶二羧酸合成酶，还同时包含至少一种另外的上调或下调基因，所述基因编码的酶在如EP 08151031.5所述的赖氨酸生物合成中起关键作用。特别地，微生物中下调了二氢吡啶二羧酸下游的一个或多个酶，特别地优选转化二氢吡啶二羧酸的酶本身，因为在这些微生物中减少了自二氢吡啶二羧酸开始进入天然赖氨酸生物合成的碳损失，因此提高了吡啶二羧酸的碳产率。对吡啶二羧酸生产，最优选EP 08151031.5中特别描述的，另外具有实施本发明所需的降低的ICD活性的微生物。

根据本发明生产的吡啶二羧酸可用作聚酯或聚酰胺型共聚物合成的单体；吡啶合成的前体；过氧化物和过酸(例如叔丁基过氧化物、二甲基-环己酮过氧化物、过氧乙酸和过氧单硫酸)的稳定剂；金属表面抛光溶液的成分；由于存在痕量金属离子容易变质(螯合效应)的有机材料的稳定剂；环氧树脂稳定剂；以及摄影用溶液或乳剂的稳定剂(特别是防止钙盐沉淀)。

根据本发明生产的1，5-二氨基戊烷可用作聚酰胺或聚氨基甲酸酯合成中的单体，或用作哌啶合成的前体。

根据本发明生产的β-赖氨酸可用于合成己内酰胺，或用作聚酰胺合成的单体。

在本发明方法(1)和微生物(2)的优选实施方案中，除了ICD活性以外，还修饰了微生物的内源生物合成途径中一种或多种其他酶活性，导致目标化合物的碳产率增加。优选地，上调或下调了催化天冬氨酸向赖氨酸、甲硫氨酸或异亮氨酸进行生化转化的一种或多种酶。

优选地，上调或下调了棒杆菌酶，且特别是谷氨酸棒杆菌酶的活性。

优选地，所述修饰是通过编码所述酶的核苷酸序列的修饰来达成的。

在第一优选的方面，即在其中应修饰赖氨酸生物合成的情况下，也就是说，在根据实施方案(1)的方法其中，赖氨酸、其衍生物或前体之一作为中间体或最终产物得到生产，所述已修饰酶和/或核苷酸序列可选自编码以下基因产物的序列，这些基因产物被优选上调或优选下调。优选上调(即与野生型微生物相比它们的活性应当增加)的基因产物选自以下：

天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶，二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸脱羧酶，赖氨酸输出蛋白，丙酮酸羧化酶，磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶，葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶，6-磷酸-葡萄糖酸内酯酶，6-磷酸葡萄糖酸酯脱氢酶，核糖-5-磷酸-异构酶，核糖-磷酸表异构酶，转酮醇酶，转醛醇酶，葡糖磷酸异构酶，转录调节子LuxR，转录调节子LysR1，转录调节子LysR2，苹果酸-醌-氧化还原酶，苹果酸脱氢酶，果糖-1，6-二磷酸酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸甘油醛脱氢酶，磷酸甘油酸酯激酶，磷酸甘油酸酯变位酶烯醇化酶，丙酮酸激酶，精氨酰-tRNA-合成酶，0pcA蛋白，1-果糖磷酸激酶，6-果糖磷酸激酶，生物素连接酶，异柠檬酸裂合酶，苹果酸合酶，四氢吡啶二羧酸-丁二酰酶，丁二酰-氨基酮庚二酸-氨基转移酶，丁二酰-二氨基庚二酸-去丁二酰酶，二氨基庚二酸表异构酶，天冬氨酸转氨酶和苹果酸酶，PTS糖摄取系统的组分，accBC(乙酰辅酶A羧化酶)，accDA(乙酰辅酶A羧化酶)，aceA(异柠檬酸酶)，acp(酰基载体蛋白质)，asp(天冬氨酸酶)，atr61(ABC转运蛋白)，ccsB(细胞色素c合成蛋白)，cdsA(磷脂酸胞苷酰转移酶)，citA(2组分系统的感受蛋白激酶)，cls(心磷脂合成酶)，cma(环丙烷-分枝菌酸合成酶)，cobW(钴胺合成相关蛋白质)，cstA(碳饥饿蛋白A)，ctaD(细胞色素aa3氧化酶UE1)，ctaE(细胞色素aa3氧化酶UE3)，ctaF，4(细胞色素aa3氧化酶的亚基)，cysD(硫酸-腺苷三磷酸钴胺素腺苷转移酶)，cysE(丝氨酸-乙酰基转移酶，cysH，cysK(半胱氨酸合酶)，cysN(硫酸-腺苷三磷酸钴胺素腺苷转移酶)，cysQ(转运蛋白)，dctA(C4二羧化物转运蛋白质)，dep67(钴胺合成相关蛋白质)，dps(DNA保护蛋白质)，dtsR(丙酰辅酶A羧化酶)，fad15(酰基辅酶A合酶)，ftsX(细胞分裂蛋白质)，glbO(HB样蛋白质)，glk(葡萄糖激酶)，gpmB(磷酸甘油酸酯激酶II)，hemD hemB(尿卟啉原-II-合酶，δ-氨基酮戊酸脱水酶)，lldd2(乳酸脱氢酶)，metY(O-乙酰高丝氨酸-硫化氢解酶)，msiK(糖输入蛋白质)，ndkA(二磷酸核苷激酶)，nuoU(NADH-脱氢酶U亚基)，nuoV(NADH脱氢酶V亚基)，nuoW(NADH-脱氢酶W亚基)，oxyR(转录调节子)，pgsA2(CDP-二酰甘油-p-3-磷脂酰转移酶)，pknB(蛋白激酶B)，pknD(蛋白激酶D)，plsC(1-酰基-SN-甘油-3-P-酰基转移酶)，poxB gnd(丙酮酸氧化酶，6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶)，ppgK(多磷酸葡糖激酶)ppsA(PEP合酶)，qcrA(铁硫蛋白Fe-S-蛋白)，qcrA(铁硫蛋白Fe-S-蛋白)，qcrB(细胞色素B)，qcrB(细胞色素B)，qcrC(细胞色素C)，rodA(细胞分裂蛋白)，rpe(磷酸核酮糖异构酶)，rpi(磷酸戊糖异构酶)，sahH(腺苷高半胱氨酸酶)，sigC(σ因子C)，sigD(转录因子活化剂σD)，sigE(σ因子E)，sigh(σ因子H)，sigM(σ因子M)，sod(超氧化物歧化酶)，thyA(胸苷酸合酶)，truB(tRNA假尿苷55合酶)和zwa1(PS1-蛋白).

这其中，优选上调以下：天冬氨酸激酶，天冬氨酸半醛脱氢酶，二氢吡啶二羧酸合成酶，二氢吡啶二羧酸还原酶，二氨基庚二酸脱氢酶，二氨基庚二酸脱羧酶，赖氨酸输出蛋白，丙酮酸羧化酶，磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，6-磷酸-葡萄糖酸内酯酶，6-磷酸葡萄糖酸酯脱氢酶，核糖-5-磷酸异构酶，磷酸核糖表异构酶，转酮醇酶，转醛醇酶，异柠檬酸裂合酶，苹果酸合酶，四氢吡啶二羧酸-丁二酰酶，丁二酰-氨基酮庚二酸-氨基转移酶，丁二酰-二氨基庚二酸去丁二酰酶和二氨基庚二酸表异构酶。

在第一优选的方面，优选进行下调(与野生型微生物相比它们的活性应当降低)的基因产物选自以下：

磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，丙酮酸氧化酶，高丝氨酸激酶，高丝氨酸脱氢酶，苏氨酸输出蛋白，苏氨酸外流(threonine-efflux)，天冬酰胺酶，天冬氨酸脱羧酶，苏氨酸合酶，柠檬酸合酶，顺乌头酸酶，异柠檬酸脱氢酶，α-酮戊二酸脱氢酶，丁二酰辅酶A合酶，琥珀酸脱氢酶，延胡索酸酶，苹果酸-醌氧化还原酶，苹果酸脱氢酶，丙酮酸激酶，苹果酸酶苏氨酸脱氢酶，高丝氨酸-O-乙酰基转移酶，O-乙酰高丝氨酸-硫化氢解酶，alr(丙氨酸外消旋酶)，atr43(ABC转运蛋白)，ccpA1(分解代谢物控制蛋白a)，ccpA2(分解代谢物控制蛋白)，chrA(双组分反应调节子)，chrS(组氨酸激酶)，citB(转录调节子)，citE(柠檬酸裂解酶E)，citE(柠檬酸裂解酶E)，clpC(蛋白酶)，csp1，ctaF(细胞色素aa3氧化酶的第4亚基)，dctA(C4-双羧基转运蛋白)，dctQ sodit(C4-双羧基转运蛋白)，dead(DNA/RNA解链酶)，def(肽脱甲酰基酶)，dep33(多抗药性蛋白B)，dep34(外流蛋白)，fda(二磷酸果糖醛缩酶)，gorA(谷胱甘肽还原酶)，gpi/pgi(葡萄糖-6-P-异构酶)，hisC2(组氨醇磷酸氨基转移酶)，hom(高丝氨酸脱氢酶)，lipA(脂肪酸合酶)，lipB(脂蛋白连接酶B)，lrp(亮氨酸反应调节子)，luxR(转录调节子)，luxS(感觉传导蛋白激酶)，lysR1(转录调节子)，lysR2(转录调节子，lysR3(转录调节子)，mdhA(苹果酸脱氢酶)，menE(O-丁二酰苯甲酸辅酶A连接酶)，mikE17(转录因子)，mqo(苹果酸醌氧化还原酶)，mtrA mtrB(感受蛋白cpxA，感受的调解组分)，nadA(喹啉酸合酶A)，nadC(烟酰酸核苷酸焦磷酸酶)，otsA(海藻糖-6-P-合酶)，otsB，trey，treZ(海藻糖磷酸酶，麦芽寡糖基海藻糖合酶，麦芽寡糖基海藻糖水解酶，pepC(氨肽酶I)，pepCK(PEP-羧激酶)，pfKApfkB(1和6-磷酸果糖激酶)，poxB(丙酮酸氧化酶)，poxB gnd(丙酮酸氧化酶，6-磷酸葡萄糖脱氢酶)，pstC2(膜结合磷酸转移蛋白)，rplK(PS1-蛋白)，sucC sucD(丁二酰辅酶A合成酶)，sugA(糖转运蛋白)，tmk(胸苷酸激酶)，zwa2，metK metZ，glyA(丝氨酸羟甲基转移酶)，sdhC sdhAsdhB(琥珀酸DH)，smtB(转录调节子)，cgl1(转录调节子)，hspR(转录调节子)，cgl2(转录调节子)，cebR(转录调节子)，cgl3(转录调节子)，gatR(转录调节子)，glcR(转录调节子)，tcmR(转录调节子)，smtB2(转录调节子)，dtxR(转录调节子)，degA(转录调节子)，galR(转录调节子)，tipA2(转录调节子)，malI(转录调节子)，cgl4(转录调节子)，arsR(转录调节子)，merR(转录调节子)，hrcA(转录调节子)，glpR2(转录调节子)，lexA(转录调节子)，ccpA3(转录调节子)，degA2(转录调节子)，甲基丙二酰辅酶A变位酶。

这其中，优选下调以下：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，丙酮酸氧化酶，高丝氨酸激酶，高丝氨酸脱氢酶，丁二酰辅酶A合酶，苹果酸-醌氧化还原酶和甲基丙二酰辅酶A变位酶。

在生产的赖氨酸衍生物是二氨基戊烷的情况下，优先下调二胺乙酰基转移酶的基因，即基因完全失活或基因活性降低。二胺乙酰基转移酶的序列在WO 2007/113127中进行描述。

在第二优选的方面，即在其中应修饰甲硫氨酸生物合成的情况下，也就是说，在根据实施方案(1)的方法中，甲硫氨酸、其衍生物或前体之一作为中间体或最终产物得到生产，被优选地下调的已修饰酶和/或核苷酸序列可选自编码以下基因产物的序列：高丝氨酸激酶、苏氨酸脱水酶、苏氨酸合酶、内消旋二氨基庚二酸D-脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸-羧激酶、丙酮酸氧化酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶和二氨基庚二酸脱羧酶。优选的，所述酶是下调的。其中，优选的下调以下基因：高丝氨酸激酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶。

在该第二优选的方面，优选上调的基因产物选自以下：胱硫醚合酶、胱硫醚裂解酶、高丝氨酸-O-乙酰转移酶、O-乙酰高丝氨酸-硫化氢解酶、高丝氨酸脱氢酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛-脱氢酶、3磷酸甘油醛脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸丙糖异构酶、转醛醇酶、转酮醇酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、生物素连接酶、蛋白OpcA、1-磷酸果糖激酶、6-磷酸果糖激酶、果糖-1，6-二磷酸酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、天冬氨酸转氨酶、辅酶B12依赖性甲硫氨酸合酶、辅酶B12非依赖性甲硫氨酸合酶和苹果酸酶。

在第三优选的方面，即在其中应修饰苏氨酸生物合成的情况下，也就是说，在根据实施方案(1)的方法中，苏氨酸、其衍生物或前体之一作为中间体或最终产物得到生产，被优选地下调的已修饰酶和/或核苷酸序列可选自编码以下基因产物的序列：高丝氨酸-O-乙酰转移酶、丝氨酸-羟甲基转移酶、O-乙酰高丝氨酸-硫化氢解酶、内消旋二氨基庚二酸D-脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸-羧激酶、丙酮酸氧化酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、天冬酰胺酶、天冬氨酸脱羧酶、溶素-输出子(exporter)、乙酰乳酸合酶、乙酮醇酸还原异构酶、支链氨基转移酶、辅酶B12依赖性甲硫氨酸合酶、辅酶B12非依赖性甲硫氨酸合酶、二羟酸脱水酶和二氨基吡啶(diaminopicolinate)脱羧酶。优选的，所述酶是下调的。

在该第三优选的方面，优选上调的基因产物选自以下：苏氨酸脱水酶、苏氨酸合酶、高丝氨酸脱氢酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛-脱氢酶、3磷酸甘油醛脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸丙糖异构酶、转醛醇酶、转酮醇酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、生物素连接酶、蛋白OpcA、1-磷酸果糖激酶、6-磷酸果糖激酶、果糖-1，6-二磷酸酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、天冬氨酸转氨酶和苹果酸酶。优选的，所述酶是上调的。

实施方案(1)还可以包括回收靶化合物(精细化学药品)的步骤。术语“回收”包括从培养基中提取、收获、分离或纯化化合物。可以根据本领域已知的任何常规的分离或纯化方法实施化合物的回收，包括但不限于：用常规树脂(例如，阴离子或阳离子交换树脂、非离子吸附树脂等)处理、用常规吸附剂(例如，活性炭、硅酸、硅胶、纤维素、矾土等)处理、改变pH、溶剂抽提(例如，用常规溶剂如醇类、乙酸乙酯、己烷等)、蒸馏、透析、过滤、浓缩、结晶、重结晶、pH调整、冻干等。例如，可以通过首先移出微生物来从培养基中回收靶化合物。然后将剩余的培养基通过或经过阳离子交换树脂去除不需要的阳离子，通过或经过阴离子交换树脂去除不需要的无机阴离子和有机酸。

本发明的实施方案(2)涉及重组微生物。所述微生物可以是上文详细列举的任何微生物，具有在所述章节提示的相同偏好。在特定的方面，是谷氨酸棒杆菌，优选的是具有反馈抗性天冬氨酸激酶的谷氨酸棒杆菌ATCC13032衍生物，特别是ATCC130321ysC^fbr或ATCC13286，或所述菌株的衍生物如LU11424(参见实施例1)。LU11424是特别优选的。

根据实施方案(2)的微生物可以具有用于根据实施方案(1)的生产方法的微生物的任何上述特征，只要它满足实施方案(2)中包括的附带规则，从而排除了在PCT/EP2007/061151中已经公开的特定微生物。由于使用PCT/EP2007/061151描述的密码子使用方法，而具有降低的ICD活性的微生物，当PCT/EP2007/061151中已经公开了所述微生物时，它是从根据实施方案(2)的微生物中排除的。该附带条件没有排除这样的微生物，所述微生物中ICD表达的降低不是由于修饰的ICD编码核苷酸序列替代微生物的天然icd序列的表达产生的，其中所述修饰的icd编码序列源自未修饰的icd序列，使得未修饰的核苷酸序列的至少一个密码子在修饰的icd序列中被根据宿主细胞的密码子使用规则较不频繁使用的密码子取代。换言之，本发明的实施方案(2)不排除这样的微生物，所述微生物中ICD表达的降低不是由于如PCT/EP2007/061151中描述的修饰的密码子使用规则，也不是PCT/EP2007/061151中描述的微生物。

该附带条件没有进一步排除这样的微生物，所述微生物的ICD表达是由于如PCT/EP2007/061151中描述的修饰的密码子使用规则而降低的，且所述微生物还包括催化微生物的内源生物合成中间物或终产物转化成精细化学药品合成的非天然靶化合物的异源的酶(参见上文)。优选的，所述异源的酶选自这样的酶，所述酶催化精细化学药品的合成或生物合成中的一个或多个步骤，特别是通过酶促转化可源自赖氨酸或其在天冬氨酸下游的生物化学前体所得到的精细化学药品。更优选的，它是催化脱羧基、脱氨基、转氨、氨基沿有机分子的移位、氧化和/或环化反应的酶。更优选的，它选自：吡啶二羧酸合酶、赖氨酸脱羧酶和赖氨酸-2，3-氨基变位酶。特别优选的是包含异源吡啶二羧酸合酶、赖氨酸脱羧酶和赖氨酸-2，3-氨基变位酶的微生物。换言之，在该特别优选的实施方案中，微生物可以具有由于如PCT/EP2007/061151中描述的修饰密码子使用规则而降低的ICD活性，甚至可以是PCT/EP2007/061151中描述的微生物，但还额外的包括异源的吡啶二羧酸合酶、赖氨酸脱羧酶或赖氨酸-2，3-氨基变位酶。

所述根据实施方案(2)的微生物特别适合实施根据实施方案(1)的方法。其优选的包括在棒杆菌中，优选的在谷氨酸棒杆菌中，导致较低ICD表达的载体和/或核苷酸序列。在优选的方面，所述较低的ICD表达是由于取代作为异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列的起始密码子的ATG，优选的用GTG取代ATG。

根据实施方案(2)的特别优选的微生物是LU11424，它的部分或完全降低的异柠檬酸脱氢酶活性是由于取代作为异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列的起始密码子的ATG，优选的用GTG取代ATG。

特别的是，实施方案(2)的重组微生物还包括这样的异源酶，所述酶能够将天冬氨酸族的氨基酸或其生物化学前体之一转化为如上在实施方案(1)的内容中详细描述的进一步的精细化学药品。所述酶优选的能够将赖氨酸或其天冬氨酸下游的生物化学前体之一转化为进一步的精细化学药品。

在所述特定的方面，异源的酶优选的选自赖氨酸脱羧酶、赖氨酸-2，3-氨基变位酶和吡啶二羧酸合成酶。

微生物(2)的用途(3)涵盖了如实施方案(1)所述的方法。

在实施方案(4)中，本发明提供了生产从根据实施方案(1)的方法制备的精细化合物产生的产物的方法。制备

(i)聚酰胺、聚氨基甲酸酯或哌啶，其中1，5-二氨基戊烷是中间产物；

(ii)己内酰胺或聚酰胺、其中β-赖氨酸是中间产物；或

(iii)聚酯或聚酰胺或稳定剂，其中吡啶二羧酸是中间产物的方法，并包括这样的步骤，所述步骤中的中间产物是由实施方案(1)的方法制备的，这样的方法是实施方案(4)的优选的方面。

在实施方案(4)的特定方面，方法是生产聚酰胺(例如，

)的方法，并包括根据实施方案(1)的尸胺的生产和所述尸胺与二羧酸的反应。尸胺以已知的方式与二-、三-或多元羧酸反应，获得聚酰胺。优选的，尸胺与含有4-10碳的二羧酸反应，例如琥珀酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸等。二羧酸优选的是游离的酸。

在实施方案(4)的其它特定方面，方法是生产β-氨基-ε-己内酰胺、ε-己内酰胺或ε-氨基己酸的方法，并包括根据实施方案(1)的β-赖氨酸的生产。在所述β-赖氨酸的转化的一个方面，本发明提供了生产β-氨基-ε-己内酰胺的方法，包括根据实施方案(1)的β-赖氨酸的生产作为方法的一个步骤。β-赖氨酸然后经历分子内环化，获得β-氨基-ε-己内酰胺。该环化反应可以在分离和/或纯化β-赖氨酸之前直接实施，或使用分离的β-赖氨酸实施。

在所述β-赖氨酸的转化的第二个方面，本发明提供了生产ε-己内酰胺的方法，包括根据实施方案(1)的β-赖氨酸的生产作为方法的一个步骤。如上所述，β-赖氨酸再经历分子内环化，获得β-氨基-ε-己内酰胺，其可以被选择性脱氨基化从而获得ε-己内酰胺。该脱氨基方法是本领域已知的。

在所述β-赖氨酸的转化的第三个方面，本发明提供了生产氨基己酸的方法，包括根据实施方案(1)的β-赖氨酸的生产作为方法的一个步骤，然后通过脱氨基化去除β-赖氨酸的β-氨基官能基。获得的ε-氢基己酸可以转化为ε-己内酰胺，或者在不环化为内酰胺的条件下，通过已知的聚合技术直接转化为聚酰胺。ε-氨基己酸是生产聚酰胺，特别是PA6非常重要的单体。

在实施方案(4)的其它特定方面，方法是生产聚酯或聚酰胺(例如，

)共聚物的方法，并包括根据实施方案(1)的吡啶二羧酸的生产、所述吡啶二羧酸的分离和随后所述吡啶二羧酸与至少一种其它多价的共聚单体的多聚化作用，所述共聚用单体选自多元醇和多胺。吡啶二羧酸以已知的方式与二-、三-或多胺反应获得聚酰胺，或者与二-、三-或多元醇反应获得聚酯。优选的，吡啶二羧酸与含有4-10碳的多胺或多元醇反应。

本领域技术人员熟知如何用修饰的核苷酸序列取代例如编码特定多肽的基因或内源性核苷酸序列。这可以通过电穿孔、化学转化、接合或其它合适的转化方法，引入合适的构建体(不含复制起点的质粒、不含复制起点的线性DNA片段)来实现。然后通过例如使用可选择标志物的同源重组，保证只鉴别携带修饰的核苷酸序列替代了内源的天然存在序列的细胞。其它方法包括内源染色体基因座的基因破坏，和从例如质粒表达修饰的序列。其它方法包括例如转座。下文给出了关于可以使用的载体和宿主细胞的其它信息。

一般而言，本领域技术人员熟知设计构建体，例如驱使多肽在微生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中表达的载体。本领域技术人员还熟悉微生物如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的培养条件，以及用于从上述微生物收获和纯化精细化学药品的步骤，所述化学物例如氨基酸，特别是赖氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸。下文将进一步详细论述一些这类方面。

本领域技术人员还熟知使原始未修饰的核苷酸序列变为修饰的核苷酸序列的技术，所述修饰的核苷酸序列编码具有相同氨基酸的多肽，但具有不同的核酸序列。这可以通过例如基于诱变技术的聚合酶链式反应、普遍已知的克隆步骤、化学合成等来实现。在多篇出版物中描述了重组DNA技术和分子生物学的标准技术，例如Sambrook等人，(2001)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press；或Ausubel等人(编著)，Current protocols in molecular biology(John Wiley & Sons，Inc.2007)；Ausubel等人，Current Protocols in Protein Science，(John Wiley & Sons，Inc.2002)；Ausubel等人(编著)，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，第3版，(John Wiley &Sons，Inc.1995)。特别用于谷氨酸棒杆菌的方法描述在Eggeling和Bott(编著)，Handbook of Corynebacterium(Taylor and Francis Group，2005)。下文和“实施例”章节中论述了一些这类方法。

在下文中，详细描述和论述了可以如何在微生物例如大肠杆菌，特别是谷氨酸棒杆菌中实施遗传操作。

载体和宿主细胞

如本文中使用的，术语“载体”指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。

一种类型的载体是“质粒”，指可以将额外的DNA片段连接到其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，可以将额外的DNA片段连接到病毒基因组中。

一些载体能够在引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体，和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，一些载体能够指导与其有效连接的基因的表达。

本文称此类载体为“表达载体”。

一般而言，用于重组DNA技术的表达载体通常是以质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以可互换的使用，因为质粒是载体的最普遍使用形式。然而，发明意在包括发挥等价的功能的其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷的逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

适合制备发明的重组微生物的重组表达载体可以包括如上文定义的异源核酸，其形式适合各核酸在宿主细胞中的表达，意指重组表达载体包括一种或多种基于用于表达的宿主细胞而选择的调控序列，所述调控序列与待表达的核酸序列有效的连接。

在重组表达载体中，“有效的连接”意在表示目标核苷酸序列与调控序列以允许核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中，或者当载体引入宿主细胞中时，在宿主细胞中)的方式连接。术语“调控序列”意在包括启动子、抑制子结合位点、激活子结合位点、增强子和其他表达控制元件(例如，终止子、多聚腺苷酸化信号或mRNA次级结构的其它元件)。此类调控序列描述在例如Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)。调控序列包括指导核苷酸序列在多种类型的宿主细胞中组成型表达的序列，和指导核苷酸序列仅在特定宿主细胞中表达的序列。优选的调控序列是例如启动子，如cos-、tac-、trp-、tet-、trp-、tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、lacIq-、T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、SP6-、arny、SP02、e-Pp-ore PL、SOD、EFTu、EFTs、GroEL、MetZ(最后五个来自谷氨酸棒杆菌)，优选的在细菌中使用。其它的调控序列是例如来自酵母和真菌的启动子，例如ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH，来自植物的启动子，例如CaMV/35S、SSU、OCS、1ib4、usp、STLS1、B33、nos或泛素-或菜豆蛋白-启动子。还可以使用人工启动子。本领域普通技术人员可以理解，表达载体的设计可依赖于这样的因素，即待转化的宿主细胞的选择、所需要蛋白质的表达水平等。可以将表达载体引入宿主细胞，从而生产蛋白质或肽，包括融合蛋白或肽。

任何适合驱动修饰的核苷酸序列在宿主细胞中表达的载体，优选的在棒杆菌，特别优选的在谷氨酸棒杆菌中，都可用于降低这些宿主细胞中ICD的量。此类载体可以是例如在棒状杆菌细菌中可自主复制的质粒载体。实例是pZ1(Menkel等人，(1989)，Applied and Environmental Microbiology64：549-554)、pEKEx1(Eikmanns等人，(1991)，Gene 102：93-98)、pHS2-1(Sonnen等人，(1991)，Gene 107：69-74)。这类载体是基于隐性质粒pHM1519、pBL1 oder pGA1。其它合适的载体是pClik5MCS(WO 2005/059093)，或基于pCG4(US-A 4,489,160)或pNG2(Serwold-Davis等人，(1990)，FEMSMicrobiology Letters 66：119-124)或pAG1(US-A 5,158,891)的载体。其它适合载体的例子可见Handbook of Corynebacterium，Chapter 23(Eggeling和Bott编，ISBN 0-8493-1821-1，2005)。

重组表达载体可以设计用于在原核或真核细胞中表达特定的核苷酸序列。例如，核苷酸序列可以在细菌细胞例如谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母和其它真菌细胞(参见Romanos，M.A.等人，(1992)，Yeast 8：423-488；van den Hondel，C.A.M.J.J.等人，(1991)in：More Gene Manipulations in Fungi，J.W.Bennet &L.L.Lasure编著，第396-428页，Academic Press：San Diego；和vanden Hondel，C.A.M.J.J.& Punt，P.J.(1991)in：Applied Molecular Genetics of Fungi，Peberdy，J.F.等人编著，第1-28页，Cambridge University Press：Cambridge)、藻类和多细胞植物细胞(参见Schmidt，R.和Willmitzer，L.(1988)Plant Cell Rep.：583-586)中表达。在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中进一步讨论了合适的宿主细胞。可选的，可以使用例如T7启动子调控序列和T7聚合酶在体外转录和翻译重组表达载体。

通常使用含组合型或诱导型启动子的载体进行蛋白质在原核细胞的表达，所述启动子指导融合或非融合蛋白的表达。

融合载体向其中编码的蛋白质添加了多个氨基酸，通常在重组蛋白质的氨基端，但可在C端或融合在蛋白质中的合适区域内。此类融合载体通常满足四种目的：1)增加重组蛋白质的表达；2)增加重组蛋白质的溶解性；3)通过作为亲和纯化中的配基发挥作用，帮助重组蛋白质的纯化；和4)为蛋白质的后续检测提供“标签”。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组蛋白质的连接处引入蛋白水解切割位点，使得纯化融合蛋白后重组蛋白能够从融合部分中分离。此类酶及其同种识别(cognate recognition)序列，包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。

典型的融合表达载体包括pGRX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其分别融合了谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A。

合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amann等人，(1988)Gene 69：301-315)、pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、egtll、pBdC1和pET 11d(Studier等人，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89；和Pouwels等人编著，(1985)Cloning Vectors.Elsevier：New York，ISBN 0 444 904018)。从pTrc载体表达靶基因依赖于宿主RNA聚合酶从杂合trp-lac融合启动子的转录。靶基因从pET 11d载体的表达依赖于由共表达的病毒RNA聚合酶(T7gnl)介导的从T7gnlO-lac融合启动子的转录。该病毒聚合酶是由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供的，来自固有(resident)的X原噬菌体，其带有在lacUV5启动子的转录控制下的T7gnl基因。对于转化其它种类的细菌，可以选择合适的载体。例如，质粒pIJ101、pIJ364、pIJ702和pIJ361已知可用于转化链霉菌，而质粒pUB110、pC194或pBD214适合转化芽孢杆菌。一些在将遗传信息转移到棒杆菌中的质粒包括pHM1519、pBL1、pSA77或pAJ667(Pouwels等人编著，(1985)Cloning Vectors.Elsevier：New York ISBN 0 444 904018)。

合适的谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌穿梭载体的实例是，例如pClik5aMCS(WO 2005/059093)或可见于Eikmanns等人，((1991)Gene 102：93-8)。

用于操纵棒杆菌的合适载体的实例可见于棒杆菌手册(由Eggeling和Bott，ISBN 0-8493-1821-1，2005编著)中。可以发现大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体的名单(表23.1)、大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体的名单(表23.2)、可用于将DNA整合到谷氨酸棒杆菌染色体中的载体的名单(表23.3)、用于整合到谷氨酸棒杆菌染色体中的表达载体的名单(表23.4)，以及位点特异性的整合到谷氨酸棒杆菌染色体中的载体的名单(表23.6)。

在另一个实施方案中，表达载体是酵母表达载体。用于在酿酒酵母中表达的载体的实例包括pYepSecl(Baldari等人，(1987)Embo J.6：229-234)、2i、pAG-1、Yep6、Yepl3、pEMBLYe23、pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等人，(1987)Gene 54：113-123)和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。载体和用于构建适合用于其它真菌(例如，丝状真菌)的载体的方法包括在van den Hondel，C.A.M.J.J.& Punt，P.J.(1991)in：Applied Molecular Genetics of Fungi；J.F.Peberdy等人编著，第1-28页，Cambridge University Press：Cambridge；和Pouwels等人编著，(1985)Cloning Vectors.Elsevier：New York(ISBN 0 444 904018)中描述的。

出于本发明的目的，有效的连接理解为启动子(包括核糖体结合位点(RBS))、编码序列、终止子和任选的其它调控元件的顺序排列，其排列方式使每种调控元件都可以完成它的功能，根据目的表达编码序列。

在另一个实施方案中，异源核苷酸序列可以在单细胞植物细胞(例如藻类)中表达，或者在来自更高等的植物(例如，种子植物如农作物)的植物细胞中表达。植物表达载体的实例包括在Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.和Masterson，R.(1992)Plant Mol.Biol.20：1195-1197；和Bevan，M.W.(1984)Nucl.Acid.Res.12：8711-8721中描述的，并包括pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004和pDH51(Pouwels等人编著，(1985)Cloning Vectors.Elsevier：New York ISBN 0 444 904018)。

关于其它用于原核和真核细胞的合适的表达系统参见Sambrook，J.等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第3版，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，2003的第16和17章。

在另一个实施方案中，重组表达载体能够指导核酸优选的在特定细胞类型中表达，例如在植物细胞中(例如，使用组织特异性调控元件表达核酸)。组织特异性调控元件是本领域已知的。

发明的另一方面涉及引入了重组表达载体或核酸的生物体或宿主细胞。获得的细胞或生物体分别是重组细胞或生物体。可以理解，此类术语不仅指特定的对象细胞，当所述后代包含重组核酸时也指此类细胞的后代或潜在的后代。由于突变或环境影响，在继承的世代中可以发生一些修饰作用，因此，实际上此类后代可以与亲代细胞不同，但只要所述后代仍然表达或能够表达重组蛋白，则仍包括在本文使用的术语的范围内。

通过常规的转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。如本文中使用的，术语“转化”和“转染”、“接合”和“转导”意在指多种本领域已认知的、用于将外源核酸(例如，线性DNA或RNA(如，线性化的载体或没有载体的基因构建体)，或载体形式的核酸(如，质粒、噬粒、噬菌粒、转座子或其他DNA))导入宿主细胞中的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂转染、自然竞争、接合化学-介导的转移或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适的方法可见于Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第3版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2003)和其它实验手册中。

为了鉴别和选择这些整合子，通常将编码可选择标志物的基因(例如，对抗生素的抗性)与目的基因一起导入宿主细胞中。优选的可选择标志物包括产生药物抗性的，例如G418、潮霉素、卡那霉素、四环素、青霉素和氨甲蝶呤。编码可选择标志物的核酸可以与编码上述修饰的核苷酸序列的核酸位于同一载体上而导入宿主细胞中，或者可以位于分离的载体上而导入。通过药物选择(例如，已整合了可选择标志物基因的细胞可以存活，而其它细胞死亡)可以鉴别用导入的核酸稳定转染的细胞。

当使用没有复制起点和两种不同的标志物基因的质粒时(例如，pClikint sacB)，可能产生不含标志物的菌株，其有部分插入物插入到基因组中。这是通过两次连续的同源重组事件来实现的(也参见Becker等人，APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，71(12)，第8587-8596页；Eggeling and Bott(eds)Handbook of Corynebacterium(Taylor and Francis Group，2005))。质粒pClik int sacB的序列可见于WO2005/059093的SEQ ID NO：24；其中质粒被称为pCIS。

在另一个实施方案中，可以生产含选定系统的重组微生物，所述系统允许调控所导入基因的表达。例如，将载体上包含的核苷酸序列置于lac操纵子的控制下，仅在存在IPTG的条件下允许基因表达。此类调控系统是本领域普遍已知的。

大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的生长培养基和培养条件

在一个实施方案中，方法包括在合适的培养基中培养微生物进行精细化学药品的生产。在另一个实施方案中，方法还包括从培养基或宿主细胞中分离精细化学药品。

本领域技术人员熟知普通微生物的培养，例如谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。因此，下文将给出关于大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌培养的常规教导。其它信息可以从培养大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的标准教科书中查找。

大肠杆菌菌株常规的分别生长在MB和LB培养基中(Follettie等人，(1993)J.Bacteriol.175：4096-4103)。用于大肠杆菌的基础培养基是M9，修饰培养基是MCGC(Yoshihama等人，(1985)J.Bacteriol.162：591-597)。可以添加葡萄糖至终浓度为1％。可以添加以下量的抗体(毫克/毫升)：青霉素，50；卡那霉素，25；萘啶酸，25。可以添加以下量的氨基酸、维生素和其它添加物：甲硫氨酸，9.3mM；精氨酸，9.3mM；组氨酸，9.3mM；硫胺素，0.05mM。大肠杆菌细胞分别常规在37℃下生长。

遗传修饰的棒杆菌通常生长在合成的或天然的生长培养基中。用于棒杆菌的、多种不同的生长培养基都是普遍已知的，并可以方便的获得(Liebl等人，(1989)Appl.Microbiol.Biotechnol.，32：205-210；von der Osten等人，(1998)Biotechnology Letters，11：11-16；专利DE 4,120,867；Liebl(1992)″The Genus Corynebacterium”，in：The Procaryotes，第II卷，Balows，A.等人编著，Springer-Verlag)。指导还可见于棒杆菌手册(由Eggeling和Bott，ISBN 0-8493-1821-1，2005编辑)。

这些培养基包括一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和微量元素。优选的碳源是糖类，例如单糖、二糖或多糖。例如，葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘油、棉籽糖、淀粉或纤维素，都作为非常好的碳源发挥作用。

还可能通过络合物向培养基提供糖，例如糖浆(molasses)或来自糖精炼的其它副产物。提供不同碳源的混合物也可以是有利的。其它可能的碳源是醇类和有机酸，例如甲醇、乙醇、乙酸或乳酸。氮源通常是有机或无机氮化合物，或者含有这些化合物的材料。示例性氮源包括氨气或铵盐，例如NH₄Cl或(NH₄)₂SO₄、NH₄OH、硝酸盐、尿素、氨基酸或复杂氮源，如玉米浆(corn steep liquor)、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉膏及其他。

使用不同的硫源可以过量生产甲硫氨酸。可以使用硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐和更还原的硫源如H₂S和硫化物，以及衍生物。也可以使用有机硫源，如甲硫醇、硫基乙醇酸盐/酯、硫氰酸盐和硫脲，含硫氨基酸如半胱氨酸和其它含硫化合物，来实现有效的甲硫氨酸生产。还可以使用甲酸盐作为类似其它C1源的添加物，如甲醇或甲醛。

培养基中可包含的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯盐、磷酸盐或硫酸盐。可以向培养基中添加螯合物，保持金属离子在溶液中。特别有效的螯合物包括二羟基苯酚，如儿茶酚或原儿茶酸，或有机酸，如柠檬酸。培养基还典型地含有其它生长因子，例如维生素或生长促进剂，其实例包括生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸和吡哆醇。生长因子和盐通常源自复杂的培养基组分，例如酵母提取物、糖浆、玉米浆等。培养基化合物的实际组成强烈依赖于即时的实验，并根据每种特定的情况分别决定。关于培养基优化的信息可获得自教科书“Applied Microbiol.Physiology，A Practical Approach”(编著P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL Press(1997)第53-73页，ISBN 0 19 9635773)。还可以从商业供应商挑选生长培养基，如standard 1(Merck)或BHI(谷心浸液，DIFCO)或其他。

在本发明内容中的优选培养基的实例描述在下文实施例章节中。

所有的培养基组分都应该灭菌，通过加热(在1.5bar和121℃，20min)或通过无菌过滤。化合物可以是一起灭菌的，或者如果需要，分别灭菌。

所有的培养基组分可以在生长开始时就存在，或者可以任选的持续或分批添加。每次实验的培养条件是分别定义的。

温度依赖于所使用的微生物，通常应该是在15℃和45℃之间的范围。温度可以保持恒定，或者可以在实验过程中改变。培养基的pH可以在5-8.5的范围内，优选的约7.0，可以通过向培养基中添加缓冲液来维持。用于该目的的示例性缓冲液是磷酸钾缓冲液。可以替代性的或同时的使用合成的缓冲液例如MOPS、HEPES、ACES和其它。还可以通过在生长过程中加入NaOH或NH₄OH来维持恒定的培养pH。如果使用了复杂的培养基组分，如酵母提取物，则可以减少额外缓冲液的需要，因为许多复杂化合物都具有高的缓冲能力。如果使用发酵罐培养微生物，则也可以使用氨气控制pH。

孵育时间通常在数小时至数天的范围内。选择上述时间的目的是允许培养基中积累最大量的产物。可以在不同的容器中进行公开的生长实验，例如微滴度板、玻璃试管、玻璃瓶，或不同大小的玻璃或金属的发酵罐。为了筛选大量的克隆，应该在微滴度板、玻璃试管或摇瓶中培养微生物，使用或不用挡板。优选的使用100ml摇瓶，装填10％(体积)的所需生长培养基。摇瓶应该在转动摇床(振幅25mm)上使用100-300rpm的速度振荡。通过维持湿润的空气，可以消除蒸发损失；可选的，应该实施对蒸发损失的数学校正。

优选培养条件的实例描述在下文实施例章节中。

如果测试遗传修饰的克隆，则还可以测试未修饰的对照克隆(例如，亲本菌株)或含有基础质粒而不含插入物的对照克隆。使用生长在琼脂平板上的细胞接种培养基至OD600为0.5-1.5，所述培养基例如CM平板(10g/l葡萄糖、2.5g/l NaCl、2g/l尿素、10g/l蛋白胨、5g/l酵母提取物、5g/l肉膏、22g/l NaCl、2g/l尿素、10g/l蛋白胨、5g/l酵母提取物、5g/l肉膏、22g/l琼脂，pH 6.8，含2M NaOH)，在30℃孵育。

通过引入来自CM平板的谷氨酸棒杆菌细胞的盐水悬浮液，或者通过添加该细菌的液体预培养物，实现接种培养基。

氨基酸或其中间产物的定量

可以通过本领域技术人员已知的任何教科书方法实施对氨基酸或其中间产物的定量。在下文中，通过甲硫氨酸的定量来示范所述定量。定量的其它示例显示在实施例章节中。后者在本发明内容中是优选的。使用保护柱(guard cartridge)和Synergi 4μm柱(MAX-RP

150*4.6mm)(Phenomenex，Aschaffenburg，Germany)，通过HPLC(Agilent 1100，Agilent，Waldbronn，Germany)进行分析。在注射前，使用邻苯二醛(OPA)和巯基乙醇作为还原剂(2-MCE)将分析物衍生化。此外，用碘乙酸阻断巯基。在1ml/min的流速下进行分离，使用40mM NaH₂PO₄(洗提液A，pH＝7.8，用NaOH调节)作为极性相，甲醇水混合物(100/1)作为非极性相(洗提液B)。使用下列梯度：开始0％B；39分钟39％B；70分钟64％B；100％B 3.5分钟；2分钟0％B平衡。如下所述在室温下自动进行衍生化。开始，将0.5μl在N-二(羟乙基)甘氨酸中的0.5％2-MCE(0.5M，pH8.5)与0.5μl细胞提取物混合。然后，添加1.5μl在N-二(羟乙基)甘氨酸中的50mg/ml的碘乙酸(0.5M，pH8.5)，然后添加2.5μl N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液(0.5M，pH8.5)。通过添加0.5μl溶解在1/45/54v/v/v的2-MCE/MeOH/N-二(羟乙基)甘氨酸(0.5M，pH8.5)中的10mg/ml的OPA试剂进行衍生化。最后，用32μl H₂0稀释混合物。在每一步上述移液步骤之间，都有1分钟的等待时间。然后，将37.5μl的总体积注射到柱上。如果在样品制备的过程中(例如，在等待时间中)和之后周期性的清洁自动上样针头，则可以显著改善分析结果。通过荧光检测仪(340nm激发光，发射光450nm，Agilent，Waldbronn，Germany)实施检测。为了定量，使用α-氨基丁酸(ABA)作为内标准。

谷氨酸棒杆菌的重组规程

在下文中，将描述如何使用特定的重组规程构建具有增加的精细化学药品生产效率的谷氨酸棒杆菌菌株。

如本文中使用的，“campbell转入”(Campbell in)指原始宿主细胞的转化体，其中完整的环状双链DNA分子(例如，基于pClik int sacB的质粒)已经通过单次同源重组事件(交叉转入(cross-in)事件)整合到染色体中，有效的导致所述环状DNA分子的线性化形态插入到染色体的第一DNA序列中，所述序列与所述环状DNA分子的第一DNA序列同源。“已campbell转入”指线性化的DNA序列已经整合到“campbell转入”转化体的染色体中。“campbell转入”含有第一同源DNA序列的复制，每一拷贝都包含并围绕着一拷贝的同源重组交换位点。该名称来自Alan Campbell教授，他第一个提出了该类型重组的假设。

如本文中使用的，“campbell转出”(campbell out)指源于“campbell转入”转化体的细胞，其中，在“campbell转入”DNA的线性化插入的DNA中含有的第二DNA序列，已经与染色体起源的第二DNA序列(与所述线性化的插入物的第二DNA序列同源)发生了第二次同源重组事件(交叉转出(cross-out)事件)，所述第二次重组事件导致一部分已整合的DNA序列的缺失(丢弃)，但重要的是，还导致一部分(可以少至一个碱基)已整合的campbell转入DNA保留在染色体上，使得与原始的宿主细胞相比，“campbell转出”细胞的染色体含有一处或多处故意的改变(例如，单碱基取代、多碱基取代、异源基因或DNA序列的插入、额外的一或多拷贝的同源基因或修饰的同源基因的插入，或者包含多于一个上文列举的上述实例的DNA序列的插入)。

“campbell转出”细胞或菌株通常但不必须是通过针对基因的逆向选择而获得的，所述基因包含在一部分“campbell转入”DNA序列中(需要被丢弃的部分)，例如，枯草芽孢杆菌sacB基因，当其在生长在存在约5％-10％蔗糖的细胞中表达时是致死的。使用或不用逆向选择，都可以使用任何可筛选的表型，通过筛选理想的细胞而获得或鉴别出理想的“campbell转出”细胞，所述表型例如但不限于集落形态学、集落颜色、存在或缺少抗生素抗性、通过聚合酶链式反应存在或缺少给定的DNA序列、存在或缺少营养缺陷型、存在或缺少酶、集落核酸杂交、抗体筛选等。术语“campbell转入”和“campbell转出”还可以作为动词以各种时态使用，指上述的方法或过程。

可以理解，导致“campbell转入”或“campbell转出”的同源重组事件可以在同源DNA序列中的一系列DNA碱基上发生，并且由于在该范围的至少一部分中同源序列是彼此相同的，因此提出不能准确的指出交换事件在哪里发生。换言之，不能精确的指出哪些序列源自插入的DNA，而哪些源自染色体DNA。此外，第一同源DNA序列和第二同源DNA序列通常是由部分非同源的区域分开的，该非同源区域才是仍然位于“campbell转出”细胞的染色体上的。

实际上，在谷氨酸棒杆菌中，典型的第一和第二同源DNA序列的长度是至少约200个碱基对，且长度可以多达数千碱基对，然而，使用较短或较长的序列也可以进行该步骤。例如，第一和第二同源序列的长度范围可以从约500至2000个碱基，通过安排第一和第二同源序列为几乎相同的长度，可以有利于从“campbell转入”获得“campbell转出”，优选长度差异小于200个碱基对，最优选的使两链中较短链为较长链碱基对长度的至少70％。“campbell转入和转出的方法”描述在WO 2007/012078以及Eggeling和Bott(编著)Handbook of Corynebacterium(Taylor and Francis Group，2005)，第23章中。

用于谷氨酸棒杆菌的优选的重组规程描述在实施例章节中。

本发明通过参考下列实施例进行了更详细的描述。应该理解，这些实施例仅用于示例的目的，而不视为限制本发明。

实施例

在下列实施例中，使用了重组DNA技术和分子生物学的标准技术，并描述在多种出版物中，例如Sambrook等人，(2001)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press；或Ausubel等人，(2007)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols in Protein Science，2002年版，Wiley Interscience。除非另外说明，所有的细胞、试剂、装置和试剂盒都根据生产商的说明使用。

PCT/EP2007/061151关于通过密码子使用规则降低ICD，及其对甲硫氨酸生产的影响的实施例，通过引用整合到本文中。

实施例1：降低异柠檬酸脱氢酶(icd)的表达及其对赖氨酸和海藻糖生产的影响

1.1构建具有降低的ICD活性的谷氨酸棒杆菌菌株

为了降低异柠檬酸脱氢酶(Genbank登录号X71489)的活性，进行了密码子使用的改变。用GTG取代原始的起始密码子ATG。在谷氨酸棒杆菌icd基因的唯一一份染色体拷贝上进行操作。后续的ICD活性测量直接允许读出其影响。

表1-ICD中密码子交换概括

ICD ATG-GTG的序列描述在PCT/EP2007/061151的图2a)中。为了将该图标引入到icd编码区的染色体拷贝中，构建了这样的质粒，其通过2次连续的同源重组事件，允许不含标志物的操作。

为此目的，将ICD ATG-GTG的序列克隆到载体pClik int sacB(Becker等人，(2005)，Applied and Environmental Microbiology，71(12)，第8587-8596页)中，成为含有下列元件的质粒：

卡那霉素抗性基因

SacB-基因，可用作阳性选择标志物，因为携带该基因的细胞不能在含蔗糖的培养基上生长

大肠杆菌的复制起点

多克隆位点(MCS)

该质粒允许序列整合到谷氨酸棒杆菌的基因组座位上。

构建质粒pClik int sacB ICD ATG-GTG

通过PCR，使用ATCC 13032的基因组DNA作为模板，扩增插入物。使用下列寡核苷酸，通过融合PCR实现编码区的修饰。表格显示了使用的引物以及模板DNA：

表2-用于克隆idh构建体的引物的概括

Old 441 GAGTACCTCGAGCGAAGACCTCGCAGATTCCG

(PCT/EP2007/061151的SEQ ID No.6)

Old 442 CATGAGACGCGTGGAATCTGCAGACCACTCGC(PCT/EP2007/061151的SEQ ID No.7)

Old 443 GAGACTCGTGGCTAAGATCATCTG(PCT/EP2007/061151的SEQ ID No.8)

Old 444 CAGATGATCTTAGCCACGAGTCTC(PCT/EP2007/061151的SEQ ID No.9)

纯化融合PCR的产物，用XhoI和MluI消化，再次纯化并连接到pClikint sacB中，后者已经用相同的限制性酶线性化。通过测序验证插入物的完整性。

PCT/EP2007/061151的图2显示了优化序列ICD ATG→GTG的编码序列(PCT/EP2007/061151的SEQ ID NO：2；本序列表的SEQ ID NO：4)。

获得的质粒称为pClik int sacB ICD ATG-GTG。

构建含修饰的ICD表达水平的菌株

然后使用质粒pClik int sacB ICD ATG-GTG，用含修饰的起始密码子的编码区取代icd基因的天然编码区。使用的菌株是LU11424。

两次连续的重组事件，分别位于上游区域和下游区域，是改变编码区必需的。用优化基因取代内源性基因的方法大体上描述在Becker等人(见上文)的出版物中。最重要的步骤是：

-通过电穿孔将质粒导入菌株。步骤是例如描述在DE 10046870中，只要公开了将质粒导入菌株，则通过引用整合在本文中。

-选择在第一次同源重组事件后基因组中已经成功整合了质粒的克隆。通过在含卡那霉素的琼脂平板上生长实现所述选择。

除了所述选择步骤外，可以通过集落PCR检测成功的重组。

-用于验证基因组中存在质粒的引物是：BK1776(AACGGCAGGTATATGTGATG)(PCT/EP2007/061151的SEQ ID No.12)和OLD 450(CGAGTAGGTCGCGAGCAG)(PCT/EP2007/061151的SEQ ID No.13)。阳性克隆产生约600bp的条带。

-通过在不含卡那霉素的培养基中孵育阳性克隆产生第二次重组事件。

-通过在含蔗糖的培养基上生长，鉴别通过第二次重组事件成功去除载体骨架的克隆。只有已缺失包含SacB基因的载体骨架的克隆可以存活。

-然后，通过对跨越了相关区域的PCR产物的测序和确定ICD活性，鉴别2次重组事件已导致成功取代天然的idh-编码区的克隆。使用各克隆的基因组DNA作为模板，和引物OLD 441和OLD 442，产生PCR产物。纯化PCR产物，并用Old 471(GAATCCAACCCACGTTCAGGC)(PCT/EP2007/061151的SEQ IDNo：14)测序。

可以使用不同的谷氨酸棒杆菌菌株来取代icd的内源拷贝。然而，优选的使用谷氨酸棒杆菌赖氨酸生产菌株，例如LU11424或ATCC13032的其它衍生物，ATCC12032lysC^fbr或ATCC13286。LU11424是特别优选的。

通过遗传工程的一些连续步骤，从ATCC13032构建了LU11424。

LU11424含有下列修饰：

·突变的lysC基因(编码天冬氨酸激酶)，获得反馈抗性的酶。为此目的，向lysc基因引入核苷酸改变，使获得的蛋白质在311位携带异亮氨酸而非苏氨酸。此类菌株的详细构建描述在WO 2005/059093中。LysC基因的登录号是P26512。

·破坏的pepCK基因(编码磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolcarboxykinase))。PepCK的登录号是AB115091。

·复制的ddh基因(编码二氨基庚二酸脱氢酶)。ddh的登录号是Y00151。

·增强的dapB基因(编码二氢吡啶二羧酸还原酶)，由Psod表达单位控制。dapB的登录号是X67737。

·复制的argSlysA操纵子(编码精氨酰-tRNA合成酶和二氨基庚二酸脱羧酶)。arg SlysA操纵子的登录号是X54740。

·由Psod表达单位控制的增强的LysC基因。

·突变的hom基因(编码高丝氨酸脱氢酶)，导致在59位氨基酸携带丙氨酸而非缬氨酸的蛋白质。Hom的登录号是Y00546。

·增强且突变的pycA基因(编码丙酮酸羧化酶)，由表达单位Psod控制，并含有点突变，导致在458位氨基酸携带丝氨酸而非脯氨酸的蛋白质。pycA的登录号是AF038548。

·突变的zwf基因(编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶)，导致在243位氨基酸携带苏氨酸而非丙氨酸的蛋白质。Zwf的登录号是BA000036.3，nt.1667860-1669404。

表达单位Psod(包含核糖体结合位点的启动子)描述在WO2005/059144中。Psod序列是(5，至3，)：

tagctgccaattattccgggcttgtgacccgctacccgataaataggtcggctgaaaaatttcgttgcaatatcaacaaaaaggcctatcattgggaggt

使用相似的对策引入上述修饰，用于操作icd基因(即，通过上述“Campbell转入/Campbell转出”方法)。用于操作的质粒都基于pClik intsacB(见上文)或pK19mobsacB(SEQ ID NO：21)。

通过将icd起始密码子由ATG变为GTG，而降低其中ICD活性的赖氨酸生产菌株LU11424被称为ICD ATG-GTG(同义词ICD ATG→GTG)。

1.2对ICD活性、赖氨酸生产和海藻糖生产的影响

在2个独立的测试系列中验证了操作icd基因的影响。在第一个系列中，确定了ICD活性和赖氨酸生产。第二个测试系列还含有确定海藻糖生产。

1.2.1第一测试系列：ICD活性和赖氨酸生产

对ICD活性的影响

通过与初始菌株LU11424相比，确定菌株ICD ATG-GTG的ICD酶活性，来验证icd基因的成功操作。为了确定异柠檬酸脱氢酶的活性，从过夜培养物中制备不含细胞的提取物。细胞生长在含37g/L BHI(Bacto^TM谷心浸液)的复杂培养基中，用来自琼脂平板的单细胞接种。通过离心(13.000×g，5min，Centrifuge 5415R，Eppendorf，Hamburg，Germany)收获细胞，用反应缓冲液(100mM Tris-HCl，pH7.8)洗涤，并用玻璃珠在ribolyser(Schwingmühle，Retsch，Haan，Germany)中破坏细胞。通过离心(13.000×g，15min，Centrifuge 5415R，Eppendorf，Hamburg，Germany)去除细胞碎片，使用不含细胞的提取物来确定蛋白质含量和酶活性。通过Bradford方法测量蛋白质浓度，使用来自Bio-Rad的Bradford试剂(Quick Start^TM Bradford Due Reagent，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，United States)。根据340nm的吸光值增加，来确定酶活性。在1ml含100mM Tris/HCl、10mM MgCl₂、0.5mM NADP、1mM异柠檬酸和50μl细胞粗提液的pH7.8总体积中，进行反应。分别在不含异柠檬酸或细胞提取物的条件下进行阴性对照。以mU/mg蛋白质给出酶的比活(在30℃下，1U＝1μmol/min)。

表3-ICD活性

数据显示菌株ICD ATG→GTG中的ICD活性显著低于初始菌株LU11424。

对赖氨酸生产的影响

为了分析较低的ICD活性对赖氨酸生产的影响，将产生的菌株与亲本菌株比较。

生长菌株的条件如下：

培养基：在含有5g L^-1葡萄糖、5g L^-1酵母提取物、10g L^-1胰蛋白胨和5g L^-1 NaCl的复杂培养基中生长第一预培养物。通过添加18g L^-1琼脂制备琼脂平板。在含有55mM葡萄糖的基础培养基中实施第二预培养和主培养。基础培养基还含有每升：0.055g CaCl₂·2H₂O、0.2g MgSO₄·7H₂O、1g NaCl、25g K₂HPO₄、7.7g KH₂PO₄、15g(NH₄)₂SO₄、0.5mg生物素、1mg Ca-泛酸、1mg硫胺素·HCl、20mg FeSO₄、30mg 3，4-二羟基苯甲酸和10ml的100×微量元素溶液。微量元素溶液含有每升：200mg FeCl₃.6H₂O、200mg MnSO₄.H₂O、50mg ZnSO₄.7H₂O、20mg CuCl₂.2H₂O、20mg NaB₄O₇.10H₂O和10mg(NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O，并调节至pH 1。

培养：使用来自琼脂平板的单菌落接种第一预培养物，在500mL三角瓶(baffled flask)中的50mL复杂培养基中孵育8h。然后，通过离心(8,800×g，2min，4℃)收获细胞，用无菌0.9％NaCl洗涤，用作第二预培养物的接种物(在250mL三角瓶中的25mL基础培养基)。在500mL三角瓶中的50mL培养基中实施主培养，并用来自第二预培养物的指数生长的细胞接种。在转动摇床(振荡直径5cm，Multitron，Infors AG，Bottmingen，Switzerland)上，在30℃和230rpm下进行所有的培养实验。在培养时间内，pH在7.1±0.2的范围内。在18小时后，从指数生长的培养物中采样分析细胞浓度、底物消耗和产物形成。

通过在660nm光密度的测量(分光光度计，Libra S11，Biochrom，Cambridge，UK)来确定细胞浓度。如果需要，在分析天平(CP255D，Sartorius，

Germany)上稀释样品，获得在0.05和0.3之间的吸光值。

用来自Boehringer Mannheim的葡萄糖试剂盒确定葡萄糖浓度。使用赖氨酸校准曲线，用光学酶促测试确定赖氨酸浓度。在含有0.9ml 100mMTris-HCl(pH8.0)、1mg ABTS、80mU赖氨酸氧化酶、400mU过氧化物酶的1ml体积中实施反应，通过添加100μl培养上清启动反应。在6分钟后，测量436nm的吸光值。如果需要，稀释培养上清获得落入校准曲线范围内的吸光值。

表4：赖氨酸产率结果

易见具有较低ICD活性的菌株具有较高的赖氨酸产率(比初始菌株高大于1.3倍)。

1.2.2第二测试系列：ICD活性、赖氨酸和海藻糖的生产

通过确定赖氨酸生产，以及通过与初始菌株LU11424相比，确定菌株ICD ATG-GTG的ICD酶活性，来验证icd基因的成功操作。此外，还测量了海藻糖的生产。

培养基组成：用于琼脂平板和第一预培养的复杂培养基，含有10g L^-1蛋白胨、5g L^-1牛肉膏、5g L^-1酵母提取物、2.5g L^-1NaC l、10g L^-1葡萄糖和2g L^-1尿素，分别含有或不含18g L^-1琼脂。在含有以下成分的基础培养基中实施第二预培养和主培养：A)500mL盐溶液(1g NaCl、55mg MgSO₄·7H₂O和200mg CaCl₂)；B)100mL底物溶液(分别是100gL^-1葡萄糖或果糖)；C)100mL缓冲液(2M磷酸钾，pH7.8)；D)100mL溶液B(150g L^-1(NH₄)₂SO₄，pH 7.0)；E)20mL维生素溶液(25mg L^-1生物素、50mg L^-1硫胺素·HCl和50mg L^-1泛酸)；F)10mL FeSO₄溶液(2g L^-1FeSO₄，pH1.0)；G)10mL 100x微量元素(Vallino，J.J.和G.Stephanopoulos，repr inted from Biotechnol Bioeng 41：633-646(1993)in Biotechnol Bioeng 67：872-85(1993))；和H)1mL DHB溶液(30mg mL^-13，4-二羟基苯甲酸溶于0.3M NaOH中)，用milliQ纯水调节至1L。通过高压蒸气灭菌(A-D)或通过过滤(E-H)将溶液分别灭菌。不同的培养基化合物在使用前室温下新鲜组合。

培养和生长条件：将来自储存在-80℃的甘油储存物(10％甘油，50mgL^-1乳糖)的细胞涂布在琼脂平板上，在30℃孵育48h。第一预培养物在25mL复杂培养基(250ml三角摇瓶)中30℃生长10h，并在转动摇床(Multitron，Infors AG，Bottmingen，Switzerland)上230rpm。离心后(3min，7000×g，Biofuge stratos，Heraeus，Hanau，Germany)，用无菌0.9％NaCl洗涤，用作第二预培养物的接种物(在500mL三角摇瓶中50mL)。在指数生长中期，收获细胞，如上述洗涤，用作主培养的接种物。使用含200mL培养基的2L三角摇瓶一式三份的实施。在培养过程中，培养的pH维持在7.1±0.1的范围内，并保证提供充足的氧气。

底物和产物分析

在1∶10稀释的培养上清中确定葡萄糖、赖氨酸和其他产物的浓度。用生物化学分析仪(YSI 2700 Select，Kreienbaum，Langenfeld，Germany)定量葡萄糖。在45℃下，通过LaChrome HPLC系统在Aminex HPX-87H柱(300×7.8；Bio-Rad，Hercules，California)上确定有机酸和海藻糖的浓度，所述系统包括自动上样仪L-2200、泵L-2130、UV检测仪L-2400、RI检测仪L-24900和柱式加热炉L-2350(Hitachi，VWR，Darmstadt，Germany)，使用10mM H₂SO₄作为移动相，流速为0.5ml/min，通过210nm的折射指数(糖)或UV吸光值(有机酸)来检测。定量氨基酸的规程包括如前述(J.O.等人，Anal Biochem 340：171-3(2005))用邻苯二醛(OPA)进行柱前衍生，并在C18柱分离(Gemini5u，Phenomenex，Aschaffenburg，Germany)。为了减少测量时间，改变梯度谱，并以4％min^-1添加洗脱液B。在光度计中660nm处确定细胞浓度(Libra S11，Biochrome，Cambridge，UK)，或重量分析细胞干重(CDM)(CP225D，Sartorius，

Germany)。对于后者，通过离心(10min，9800×g，Biofuge stratos，Heraeus，Hanau，Germany)从15mL培养基中收获细胞，用水洗涤3次，然后在80℃干燥3天。在OD₆₆₀(Libra S11，Biochrome，Cambridge，UK)和CDM之间的相关因子确定为1OD＝0.258(g CDM)L^-1。

细胞裂解

如上述用50mL的主培养体积(500mL三角摇瓶)生长细胞。通过离心(5min，9800×g，4℃，Biofuge stratos，Heraeus，Hanau，Germany)收获指数生长期的细胞，用裂解缓冲液(100mM TrisHCl，pH7.8)洗涤，然后重悬在10ml相同的缓冲液中。以750μl的量将细胞悬浮液等分在含玻璃珠的2ml Eppendorf管中。在ribolyzer(MM301，Retsch，Haan，Germany)中30Hz(2×5min；期间间隔5分钟)实施裂解。通过在13000×g离心10分钟(Centrifuge 5415R，Eppendorf，Hamburg，Germany)获得细胞粗提物，用于确定酶活性和蛋白质含量。后者通过Bradford(Anal Biochem 72：248-54(1976))的方法定量，使用来自BioRad(Quick Start Bradford Dye，BioRad，Hercules，USA)的试剂溶液。

异柠檬酸脱氢酶活性

ICD的体外活性分析是基于Chen等人(Chen，R.和H.Yang，Arch Biochem Biophys 383：238-45(2000))的规程。在pH 7.8和30℃下，在1.5ml聚苯乙烯比色皿中，以1ml体积进行反应。测定混合物含有100mMTris/HCl(pH7.8)、10mM MgCl₂、1mM异柠檬酸、0.5mM NADP和25μl细胞粗提液。在线监控(Specord 40，Analytik Jena，Jena，Germany)由于NADPH形成而导致的340nm吸光值的改变。分别用不含异柠檬酸或不含细胞提取物的进行阴性对照。表5中给出了在谷氨酸棒杆菌LU11424和ICD ATG→GTG的细胞粗提物中ICD的比活，所述菌株是生长在含葡萄糖作为碳源的基础培养基中的。在30℃下，1U＝1μmol/min；NADPH的摩尔消光系数＝6.22L mmol^-1 cm^-1。

表5：ICD活性结果

赖氨酸和海藻糖生产

表6中提供了赖氨酸生产型谷氨酸棒杆菌LU11424和ICD ATG→GTG利用葡萄糖的生产特征。表6中给出的产率是生物量产率(Y_X/S)、赖氨酸产率(Y_Lys/S)和海藻糖产率(Y_Tre/S)，都是基于每消耗的葡萄糖(S)，且代表来自三个平行培养实验的均值和相应偏差。当用产物形成对于底物消耗作图时，线性最佳拟合的斜率确定为产率。

表6：赖氨酸和海藻糖生产率的结果

易见具有较低ICD活性的菌株具有较高的赖氨酸和海藻糖产率(比初始菌株高大于1.3倍)。

实施例2：构建用于甲硫氨酸生产的菌株和对甲硫氨酸生产力的影响

在PCT/EP2007/061151描述的其它实验中，如上述，将在起始密码子(与实施例1.1相比)中携带上述ATG-GTG突变的异柠檬酸脱氢酶克隆到pClik中，获得pClik int sacB ICD(ATG-GTG)(PCT/EP2007/061151的SEQ ID NO：15，本序列表的SEQ ID NO：5显示了载体插入物)。然后，通过将pClik int sacB ICD(ATG-GTG)(PCT/EP2007/061151的SEQ IDNO：15)campbell转入和campbell转出菌株OM469的基因组，构建菌株M2620。菌株OM469描述在WO 2007/012078中。

如WO 2007/020295所述生长菌株。在30℃孵育48h后，分析样品的糖消耗。发现菌株已用尽所有提交的糖，意味着所有的菌株都已使用了等量的碳源。如上文和WO 2007/020295所述，通过HPLC确定合成的甲硫氨酸。

表7-甲硫氨酸生产

菌株	甲硫氨酸(mM)
		OM 469	10,2

M2620

23,7

从表7的数据可见，ICD基因具有改变的起始密码子，从而具有改变的ICD活性的菌株M2620，具有较高的甲硫氨酸产率。由于48h后用尽了所有的碳源，因此也可以直接明了，该菌株中用于生产甲硫氨酸的碳产率(形成的产物的量/糖消耗)较高。

实施例3：具有降低的ICD表达水平的菌株在二氨基戊烷生产中的用途

构建具有修饰的ICD表达水平的菌株

使用质粒pClik int sacB ICD ATG→GTG(参见实施例1.1，同义词：pClik int sacB ICD(ATG-GTG)、pClik int sacB ICD ATG-GTG、载体插入物参见SEQ ID NO：5)构建与宿主菌株相比具有修饰的ICD表达水平的二氨基戊烷生产菌株。

使用的亲本菌株是源自谷氨酸棒杆菌野生型菌株ATCC 13032的1，5-二氨基戊烷(1，5-DAP)生产菌，通过在天冬氨酸激酶基因(NCgl 0247)中整合点突变T311I，然后通过添加强启动子Psod来扩大基因剂量、复制二氨基庚二酸脱氢酶基因(NCgl 2528)、破坏磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因(NGgl 2765)和染色体整合大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，登录号JW0181)。通过实施普遍已知的重组DNA技术方法，来实施对ATCC 13032的所述各种修饰。用于建立1，5-DAP生产菌亲代菌株的质粒序列显示在SEQ ID NO：21-24中。SEQ ID NO：21可用于删除pepCK基因(δpepCK)。SEQ ID NO：22可用于复制ddh基因(2x ddh)。SEQ ID NO：23可用于通过在ask基因上游插入Psod启动子来扩大ask基因剂量(Psodk ask)。SEQ ID NO：24可用于通过将大肠杆菌ldcC整合到谷氨酸棒杆菌赖氨酸生产菌的bioD区域中，构建二氨基戊烷生产菌株。

然后，通过实施例1在“构建具有修饰的ICD表达水平的菌株”中关于赖氨酸生产菌的描述的方法，可以将pClick int sacB ICD ATG→GTG或任何其它其整合可以导致宿主细胞ICD活性降低的质粒导入亲本菌株中。

为了分析密码子使用修正对IDH ATG-GTG的影响，将优化的菌株与亲本菌株的1，5-DAP生产力进行比较，如实施例1在“确定ICD活性”中关于赖氨酸生产菌的描述。

对1，5-DAP生产力的影响

为了分析修饰的ICD表达对1，5-DAP生产力的影响，将优化的菌株与亲本菌株的1，5-DAP生产力进行比较。

出于该目的，菌株在30℃下生长在CM-平板(10％蔗糖、10g/l葡萄糖、2.5g/l NaCl、2g/l尿素、10g/l Bacto蛋白胨、10g/l酵母提取物、22g/l琼脂)上2天。然后，从平板上刮下细胞，并重悬生理盐水中。对于主培养，将10ml生产培养基(40g/l蔗糖、60g/l糖浆(根据100％糖含量计算)、50g/l(NH₄)₂SO₄、50g/l KH₂PO₄、0.4g/l MgSO₄·7H₂O、2mg/lFeSO₄·7H₂O、2mg/l MnSO₄·H₂O、0.3mg/l硫胺素·HCl、1mg/l生物素)和0.5g高压蒸汽灭菌的CaCO₃在100ml Erlenmeyer瓶中与细胞悬浮液一起孵育，直到OD₆₆₀为1.5。细胞然后在Infors AJ118型摇床(Infors，Bottmingen，Switzerland)上，在220rpm生长72小时。

然后，确定分泌到培养基中的1，5-DAP的浓度。在Agilent 1100系列LC系统HPLC上使用HPLC完成。使用邻苯二醛进行柱前衍生化，允许定量形成的1，5-DAP。可以在Gemini C18柱(Phenomenex)上进行混合物的分离。洗脱液A是40mM NaH₂PO₄.H₂O，pH7.8，洗脱液B是：乙腈∶甲醇∶H₂O＝45∶45∶10。通过荧光检测仪进行检测。

由于具有较低ICD活性的菌株具有较高的赖氨酸生产力，因此，具有较低ICD活性的菌株将具有较高的1，5-DAP生产力可视为是合理的。

实施例4：icd的敲除

为了删除icd编码区，在pClik int sacB中插入删除盒，所述删除盒含有icd编码序列上游约300-600个连续的核苷酸，与icd编码序列下游约300-600个连续的核苷酸直接融合。获得的质粒被称为pClik int sacBδicd(SEQ ID NO：8)。

然后，通过标准方法将质粒转化到谷氨酸棒杆菌中，例如电穿孔。用于转化的方法可见于例如Thierbach等人(Applied Microbiology and Biotechnology 29：356-362(1988))；Dunican和Shivnan(Biotechnology 7：1067-1070(1989))；Tauch等人(FEMS Microbiological Letters 123，343-347(1994))和DE 10046870中。

删除完整的编码序列需要2次连续的重组事件，分别发生在上游和下游区域。使用质粒pClik int sacB用删除盒取代内源基因的方法大体描述在Becker等人(见上文)的出版物中。最重要的步骤是：

-选择在第一次同源重组事件后基因组中已经成功整合了质粒的克隆。通过在含卡那霉素的琼脂平板上生长实现所述选择。除了所述选择步骤外，可以通过菌落PCR检测成功的重组。

-然后，用PCR-特异性引物或通过Southern印迹，鉴别2次重组事件已导致缺失天然的idh-编码区的克隆。

合适的引物是(5’-3’)：

ICD上游：GAACAGATCACAGAATCCAACC

ICD下游：TGGCGATGCACAATTCCTTG

已经去除了ICD完整编码区的菌株应该获得约440碱基对(更准确的：442bp)的PCR产物，而具有野生型icd基因的亲本菌株应该表现出约2600碱基对的条带。

还可以通过Southern印迹或测量ICD活性进一步验证成功的删除。

所获得的含有icd编码区完整缺失的菌株被称为δicd。

由于该菌株可以缺少ICD活性，从而不能合成谷氨酸，因此让该菌株在富养培养基或者提供了谷氨酸的基础培养基上是有效的。

关于如何删除谷氨酸棒杆菌的基因的更详细的方法还描述在Eggeling和Bott(编著)“Handbook of Corynebacterium”(Taylor and Francis Group，2005)第23.8章中。

可以如上文和WO 2007/101867、WO 2007/113127中所述，监控icd缺失对赖氨酸、甲硫氨酸、β-赖氨酸、二氨基戊烷、吡啶二羧酸的生产力的影响。

一般而言，对于生产任何目的精细化学药品，都可以使用WO2005/059139中描述的用于赖氨酸生产的相同培养基和条件。菌株在30℃下在CM琼脂预培养过夜。将培养的细胞收获到含有1.5ml的0.9％NaCl的微管中，涡流振荡后，通过在610nm的吸光值确定细胞密度。对于主培养，将悬浮的细胞接种到10ml生产培养基(在WO 2005/059139中称为培养基I)中，直到初始OD为1.5，所述培养基包含在含有0.5g CaCO₃的高压蒸汽灭菌的100ml Erlenmeyer瓶中。在旋转摇床(Infors AJ118，Bottmingen，Switzerland)上，30℃下用200rpm实施主培养48-78小时。对于细胞生长测量，将0.1ml培养基与0.9ml 1N HCl混合，消除CaCO₃，在适当稀释后测量610nm的吸光值。通过HPLC方法(Agilent 1100SeriesLC system)测量产物和剩余糖的浓度，包括葡萄糖、果糖和蔗糖。

实施例5：用含较低比活的变体取代天然的icd编码区

关于用具有较低ICD活性的变体序列取代原始icd序列的一种可能的策略，下面描述其更实验性的细节。

1.产生和选择具有较低活性的icd变体

在第一步，将icd编码序列克隆到复制载体中，所述载体含有在宿主细胞中发挥功能的所有调控序列，例如启动子、RBS和终止子序列，所述宿主细胞可以是谷氨酸棒杆菌。理想的，使用可以在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中复制的穿梭载体。此类穿梭载体的实例是pClik5aMCS(WO2005/059093)。更合适的穿梭载体可见于Eikmanns等人(Gene(1991)102：93-8)或者“棒杆菌手册”(由Eggeling和Bott，ISBN 0-8493-1821-1，2005编辑)中。其中可见大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体的名单(表23.1)和大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体的名单(表23.2)。后者是优选的，因其已经含有驱动克隆基因表达的合适启动子。

分子生物学的标准方法，例如克隆，包括PCR扩增、用限制性酶切消化、连接、转化都是技术人员已知的，并可见于标准的常规书籍，例如Ausubel等人(编著)Current protocols in molecular biology.(John Wiley & Sons，Inc.2007)；Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；和Ausubel等人(编著)SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，第3版(John Wiley & Sons，Inc.1995)。

通过定点突变产生了一组icd编码序列的突变变体。突变的技术可见于Glick和Pasternak MOLECULAR BIOTECHNOLOGY.PRINCIPLES AND APPLICATIONS OF RECOMBINANT DNA；第2版(American Sicienty for Microbiology，1998)，第8章：Directed Mutagenensis and Protein Engineering；和Ausubel等人(编著)Current protocols in molecular biology.(John Wiley & Sons，Inc.2007)第8章。

通常在大肠杆菌中产生所获得的编码icd变体文库的质粒组合。

然后，可以通过标准方法将文库转化到谷氨酸棒杆菌中，例如电穿孔。用于转化的方法可见于例如Thierbach等人(Applied Microbiology and Biotechnology 29：356-362(1988))；Dunican和Shivnan(Biotechnology7：1067-1070(1989))；Tauch等人(FEMS Microbiological Letters 123：343-347(1994))或Eggeling和Bott(编著)“棒杆菌手册”(Handbook of Corynebacterium)(Taylor and Francis Group，2005)ISBN0-8493-1821-1。

然后，应该测试所获得的克隆的ICD活性。从细胞粗提物中测量ICD酶活性的方法描述在实施例1中。

作为对照，平行的确定克隆到与icd变体文库相同的质粒中的野生型icd基因。

基于上述结果，可以选择具有与野生型icd基因相比较低活性的ICD变体。

获得较低ICD活性的变体可以具有较低的比活(例如，每种蛋白质分子是较低活性的)、较低效的转录或翻译的、或者较不稳定的。

2.用具有较低ICD活性的变体取代野生型icd基因

为了用具有较低ICD活性的变体取代野生型icd编码区，可以使用2步法对策。在第一步中，从基因组中完全删除野生型icd基因的编码区。有文献描述具有破坏的icd的细胞是可存活的(Eikmanns等人(1995)JBacteriol(1995)177(3)：774-782)。

a)删除野生型icd

实施例4中描述了删除icd的方法。获得的菌株被称为δicd。

b)插入突变体icd序列

在第二步骤中，将变体icd编码序列插入到δicd菌株中。为此，将变体icd序列克隆到合适的整合质粒中，例如pClik int sacB(参见上文)，侧翼是约300-600个上游和下游核苷酸，与实施例4的删除构建体使用的相同。

一旦该含有突变icd的质粒转化到谷氨酸棒杆菌中，可以通过如上述相似的对策鉴别在两步连续的同源重组步骤后，icd基因座中已插入了突变icd编码区的克隆。可以使用对突变ICD编码区特异的PCR引物来区别δicd菌株和阳性克隆。

已经用突变ICD编码区成功取代了野生型icd编码区的克隆在下文中可以称为“icd(mut)”。

3.确定ICD活性

应该将菌株“icd(mut)”的ICD活性与含有野生型icd基因的亲本菌株进行比较。其方法描述在实施例1中。

4.对精细化学药品生产的影响的分析

可以在通过发酵生产不同化学物的菌株中进行突变icd对野生型icd的上述取代。

合适的菌株包括经改造生产下列化学物的谷氨酸棒杆菌(可用作生产菌株的菌株的参考在括号中)：

-赖氨酸(例如LU11424、ATCC 13032 lysC(fbr)；ATCC13287、21300、21513，描述在例如Eggeling和Bott(编著)“Handbook of Corynebacterium”(Taylor and Francis Group，2005)第20章)

-甲硫氨酸(描述在例如WO 2007/012078、WO 2007/020295)

-二氨基戊烷(WO 2007/113127。实施例3)

-β-赖氨酸(WO 2007/101867)

-吡啶二羧酸(EP 08151031.5)

-苏氨酸(Colon等人，(1995)Appl Environ Microbiol61：71-78；Eikmanns等人，(1991)Appl Micorbiol Biotechnol34：617-622；Ishida等人，(1994)Biosci Biotechnol Biochem 57：1755-1756；Kase等人，(1974)Agric Biol Chem38：993-1000)

-异亮氨酸(Morbach等人，(1996)Appl Environ Microbiol62：4345-4351；Ishida等人，(1993)Biosci Biotechnol Biochem57：1755-1756)

赖氨酸、甲硫氨酸和二氨基戊烷的培养和检测描述在其它实施例中。一般而言，对于任何目的精细化学药品，都可以使用如WO 2005/059139所述用于赖氨酸生产的相同培养基和条件。菌株在30℃下在CM琼脂预培养过夜。将培养的细胞收获到含有1.5ml的0.9％NaCl的微管中，涡流振荡后，通过在610nm的吸光值确定细胞密度。对于主培养，将悬浮的细胞接种到10ml生产培养基(在WO 2005/059139中称为培养基I)中，直到初始OD为1.5，所述培养基包含在含有0.5g CaCO₃的高压蒸汽灭菌的100ml Erlenmeyer瓶中。在旋转摇床(Infors AJ118，Bottmingen，Switzerland)上，30℃下用200rpm实施主培养48-78小时。对于细胞生长测量，将0.1ml培养基与0.9ml 1N HCl混合，消除CaC0₃，在适当稀释后测量610nm的吸光值。通过HPLC方法(Agilent 1100 Series LC system)测量产物和剩余糖的浓度，包括葡萄糖、果糖和蔗糖。

预期目的产物的积累在ICD活性已降低的菌株中较高。

实施例6：通过改变上游序列降低icd转录/翻译

a)鉴别合适的上游序列(启动RBS)

首先，必须鉴别比天然icd启动子弱的上游序列。新的上游序列可以源自棒杆菌或其它生物体。已经鉴别了一些在细菌、更特别的在棒杆菌中发挥作用的启动子(包括RBS)。此类启动子的实例描述在：DE-A-44 40 118；Reinscheid等人，Microbiology 145：503(1999)；Patek等人，Microbiology 142：1297(1996)；WO 02/40679；DE-A-10359594；DE-A-10359 595；DE-A-103 59 660和DE-A-10 2004 035 065。

此外，也可以使用其它比天然icd启动子弱的上游区取代icd启动子。

可以使用报告基因系统测量上游区域的强度，例如在Patek等人，(1996)Promoters from corynebacterium glutamicum：cloning，molecular analysis and search for a consensus motif.Microbiology142：1297-1309中描述的。

可选的，可以在天然上游序列中引入突变，然后分析它的转录活性。优选的，使用icd起始密码子的83nt的上游序列，因为在该区域中没有其它基因的编码区。下文显示了上游区域的序列(粗体字)。

关于如何突变DNA序列(包括启动子序列)的方法是本领域普遍已知的，也描述在例如Bernard R.Glick，Jack J.Pasternak：Molecular Biotechnology：Principles and Applications of Recombinant DNA，第2版，1998.ISBN 1-55581-136-1；第8章；Directed Mutagenesis and Protein engineering。然后可以选择合适的启动子。

应该使用具有较低转录或翻译活性的上游区来取代驱动ICD表达的原始启动子。技术上，可以通过两次连续的同源重组事件完成取代，通过与前述实施例中描述的取代icd编码区的相同的方法。

获得的菌株可以具有较低的ICD活性。可以如实施例5所述分析对生产力的影响。

包括500nt上游和下游区域的ICD基因的序列(SEQ ID NO：2)

推测的启动子区域(上游区域)：粗体字

粗体，没有下划线：(部分的)位于icd上游的基因的3’编码区

粗体，下划线：没有任何编码区的83nt

编码区：斜体

下游区域：普通

Claims

1.生产精细化学药品的方法，使用与相应的初始微生物相比，具有部分或完全降低的异柠檬酸脱氢酶活性的微生物。

2.权利要求1的方法，其中具有部分或完全降低的异柠檬酸脱氢酶活性的微生物是重组微生物。

3.权利要求1或2的方法，其中异柠檬酸脱氢酶活性降低是由于异柠檬酸脱氢酶表达的部分或完全降低。

4.权利要求3的方法，其中异柠檬酸脱氢酶活性的部分或完全降低是由于作为异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列的起始密码子的ATG被取代，优选的用GTG取代ATG。

5.根据权利要求1-4的任一项的方法，其中微生物是谷氨酸棒杆菌，优选的谷氨酸棒杆菌ATCC13032、ATCC130321ysC^fbr或ATCC13286，或任一上述菌株的衍生物，优选LU11424。

6.根据权利要求5的方法，其中微生物是LU11424，它的部分或完全降低的异柠檬酸脱氢酶活性是由于作为异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列的起始密码子的ATG被取代，优选的用GTG取代ATG。

7.根据权利要求1-6的任一项的方法，其中作为中间产物或终产物生产的是选自天冬氨酸家族的氨基酸及其生物化学前体的化合物。

8.权利要求7的方法，其中所述化合物是中间产物，然后酶促或非酶促转化为有机胺、有机酸或氨基酸。

9.权利要求8的方法，其中所述中间产物是赖氨酸、或其在天冬氨酸下游的生物化学前体之一，其中终产物优选的是所述中间产物的非天然衍生物。

10.权利要求7-9的任一项的方法，其中微生物包括至少一种异源的酶，所述酶催化在中间产物向终产物的后续转化中的反应步骤。

11.权利要求10的方法，其中异源的酶选自催化精细化学药品生物合成中一步或多步的酶，优选的是从赖氨酸或其天冬氨酸下游的生物化学前体合成的精细化学药品。

12.权利要求11的方法，其中异源的酶选自赖氨酸脱羧酶、赖氨酸-2，3-氨基变位酶和吡啶二羧酸合成酶。

13.根据权利要求1-12的任一项的方法，其中所述精细化学药品选自

(i)天冬氨酸家族的氨基酸；

(ii)其在天冬氨酸下游的生物化学通路中的生物化学前体；

(iii)所述氨基酸(i)和前体(ii)的衍生物。

14.权利要求13的方法，其中所述精细化学药品选自赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、二氨基戊烷、β-赖氨酸和吡啶二羧酸。

15.根据权利要求1-14的任一项的方法，附加条件是当精细化学药品选自赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸时，异柠檬酸脱氢酶表达的降低不是由于修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列的表达取代了微生物的天然的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列，其中，所述修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列源自未修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列，使得根据微生物的密码子使用，在修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列中，未修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列的至少一个密码子被较不频繁使用的密码子取代。

16.权利要求14或15的方法，其中精细化学药品是选自1，5-二氨基戊烷、β-赖氨酸和吡啶二羧酸的化合物。

17.权利要求16的方法，其中生产1，5-二氨基戊烷。

18.权利要求17的方法，其中重组微生物包括异源的赖氨酸脱羧酶。

19.权利要求17或18的方法，其中重组微生物中的二氨基乙酰转移酶下调或者失活。

20.权利要求16的方法，其中生产β-赖氨酸。

21.权利要求20的方法，其中重组微生物包括异源的赖氨酸-2，3-氨基变位酶。

22.权利要求16的方法，其中生产吡啶二羧酸。

23.权利要求22的方法，其中重组微生物包括异源的吡啶二羧酸合成酶。

24.根据权利要求1-6的任一项的方法，其中海藻糖作为中间产物或终产物生产。

25.与相应的初始微生物相比，具有部分或完全降低的异柠檬酸脱氢酶活性的重组微生物，附有条件是异柠檬酸脱氢酶表达的降低不是由于修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列的表达取代了微生物的天然的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列，其中，所述修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列源自未修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列，使得根据宿主细胞的密码子使用，在修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列中，未修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列的至少一个密码子被较不频繁使用的密码子取代。

26.权利要求25的重组微生物，其中微生物是谷氨酸棒杆菌，优选的谷氨酸棒杆菌ATCC13032、ATCC130321ysC^fbr或ATCC13286，或任一上述菌株的衍生物，优选LU11424。

27.权利要求26的重组微生物，其中LU11424的部分或完全降低的异柠檬酸脱氢酶活性是由于作为异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列的起始密码子的ATG被取代，优选的用GTG取代ATG。

28.根据权利要求25-27的任一项的重组微生物，其还包括异源的酶，所述酶能够将天冬氨酸家族的氨基酸或其生物化学前体之一转化为其它精细化学药品，优选的能够将赖氨酸或其在天冬氨酸下游的生物化学前体转化为其它精细化学药品。

29.根据权利要求25-28的任一项的重组微生物，其中异源的酶选自赖氨酸脱羧酶、赖氨酸-2，3-氨基变位酶和吡啶二羧酸合成酶。

30.权利要求29的重组微生物，其中异源的酶是亮氨酸脱羧酶，其中重组微生物中的二氨基乙酰转移酶是下调的或失活的，且能够将赖氨酸转化为1，5-二氨基戊烷。

31.根据权利要求25-30的任一项的重组微生物，其适合用于根据权利要求1-24的任一项的方法。

32.根据权利要求25-31的任一项的微生物在生产精细化学药品中的用途，优选的精细化学药品如权利要求7-9、13、14、16、17、20和22的任一项定义。

33.制备以下物质的方法：

(ii)己内酰胺或聚酰胺、其中β-赖氨酸是中间产物；或

(iii)聚酯或聚酰胺或稳定剂，其中吡啶二羧酸是中间产物；

其中包括这样的步骤，其中所述中间产物是由权利要求1-23的任一项定义的方法制备的。

34.根据权利要求33的方法，其为生产聚酰胺的方法，包括根据权利要求1-19的任一项的1，5-二氨基戊烷的生产，以及所述1，5-二氨基戊烷与二羧酸的反应。

35.根据权利要求33的方法，其为生产β-氨基-ε-己内酰胺、ε-己内酰胺或ε-氨基己酸的方法，包括根据权利要求1-16、20和21的任一项的β-赖氨酸的生产。

36.根据权利要求33的方法，其为生产聚酯或聚酰胺共聚物的方法，包括根据权利要求1-16、22和23的任一项的吡啶二羧酸的生产，分离所述吡啶二羧酸，和随后所述吡啶二羧酸与至少一种选自多元醇和多胺的其它多价共聚单体的聚合。