CN1922329A - 使用重组棒状细菌发酵制备l－氨基酸的方法 - Google Patents

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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
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Abstract

本发明涉及一种发酵制备L－氨基酸、特别是L－甲硫氨酸的方法，其中发酵产生希望的L－氨基酸的重组微生物，优选地发酵棒状细菌，所述微生物从周围介质中很少或者不吸收甲硫氨酸，其中选自metD2甲硫氨酸摄取系统的yaeC、abc和yaeE基因中的一或多个基因被弱化、特别是被失活或在较低水平表达，本发明还涉及这些重组微生物。

Description

使用重组棒状细菌发酵制备L-氨基酸的方法
本发明涉及一种使用重组微生物、优选棒状细菌发酵制备L-氨基酸、特别是L-甲硫氨酸的方法，所述微生物从周围介质中很少或者不吸收甲硫氨酸。根据本发明，这个目的通过弱化、尤其是失活由基因yaeC、abc和yaeE编码的Met2甲硫氨酸摄取系统而实现。
技术领域
发现一些化学化合物、特别是L-氨基酸、维生素、核苷及核苷酸及D-氨基酸用于人用医药及制药工业，用于化妆品业、食品业及动物营养。
许多这些化合物是通过发酵微生物、优选棒状细菌菌株制备，特别是从谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)中制备的。
由于L-氨基酸的极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵的技术特征，如搅拌和供氧，或培养基的组分如发酵期间的糖浓度，或生产加工方法，例如通过离子交换层析或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变、选择及突变体选择等方法。以此方式可获得抗代谢物例如赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸或者甲硫氨酸类似物α-甲基-甲硫氨酸、乙硫氨酸、正亮氨酸、N-乙酰基正亮氨酸、S-三氟甲基高半胱氨酸、2-氨基-5-heprenoit acid、硒代甲硫氨酸、甲硫氨酸sulfoxamine、methoxine、1-氨基环戊烷羧酸抗性的菌株，或者对于调节重要性代谢物是营养缺陷的并产生L-氨基酸的菌株。
一段时间以来，重组DNA技术也已经用于生产氨基酸的谷氨酸棒杆菌菌株的改良，其中扩增特定的氨基酸生物合成基因并研究对L-氨基酸的生产的作用而进行。
发明目的
本发明人提供了用微生物、优选棒状细菌发酵制备L-氨基酸、特别是L-甲硫氨酸的改良方法的新基础。
发明描述
当下文提及L-氨基酸或氨基酸时，是指选自如下的一或多种蛋白质氨基酸，包括其盐：L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-脯氨酸。特别优选L-甲硫氨酸。
蛋白质氨基酸是指在天然蛋白质中出现的氨基酸，即在微生物、植物、动物和人体蛋白质中出现的氨基酸。它们作为蛋白质的结构实体(entities)，通过肽键彼此连接。
下文提及的L-甲硫氨酸或者甲硫氨酸也指其盐，例如甲硫氨酸盐酸盐或者甲硫氨酸硫酸盐。
从发酵介质中摄取甲硫氨酸对于甲硫氨酸的生产非常有意义，因为分泌产物的可能再吸收会降低生产速度。本发明中例如针对谷氨酸棒杆菌而描述的被弱化的基因yaeE、abc和yaeC编码一起形成MetD2甲硫氨酸摄取系统的ATP结合蛋白ABC和通透酶YaeE，及编码周质结合蛋白(periplasmatic binding protein)Yaec。
对于MetD2甲硫氨酸摄取系统的编码基因yaeC、abc和yaeE的一或多个的弱化、特别是失活，与这些基因未弱化或失活的起始微生物相比改良了相应棒状细菌中L-甲硫氨酸的生产。
本发明的目的是提供一种使用重组微生物、优选棒状细菌发酵制备L-氨基酸的方法，所述微生物特别已经生产L-氨基酸，其与起始微生物相比从周围介质中较少地吸收甲硫氨酸或者不吸收甲硫氨酸，其中编码MetD2甲硫氨酸摄取系统的yaeC、abc和yaeC编码核苷酸序列中的一或多个被弱化或者特别是被失活或者以较低水平表达。
本发明的另一个目的是发酵制备L-氨基酸的方法，其中进行如下步骤：
(a)在培养基中发酵生产L-氨基酸的重组微生物、优选棒状细菌，其与起始微生物相比从周围介质中较少地或者不吸收甲硫氨酸，且其中编码MetD2甲硫氨酸摄取系统的yaeE、abc和yaeC编码基因中的至少一个被弱化，特别是被失活或者较低水平表达；
(b)富集培养基或者细菌细胞中的L-氨基酸；
(c)分离希望的L-氨基酸，其中任选地，发酵肉汤的成分和/或生物量部分(＞0-100％)或者全部保留在终产物中。
应用的微生物、优选棒状细菌在弱化或者失活从周围介质中摄取甲硫氨酸之前已经生产L-氨基酸、尤其是L-甲硫氨酸，甲硫氨酸摄取的弱化或者失活例如通过弱化或者失活yaeE、abc和yaeC基因中的一或多个而实现。
发现通过弱化或者失活MetD2甲硫氨酸摄取系统的yaeE、abc和yaeC编码基因中的一或多个而实现从周围介质中较少地或不吸收甲硫氨酸的微生物、优选棒状细菌增强了L-氨基酸、特别是L-甲硫氨酸的生产。
所述谷氨酸棒杆菌基因的核苷酸序列对于最近的技术领域是已知的，可以引用不同的专利申请和国立医学图书馆(National Libraryof Medicine，Bethesda，MD，USA)的国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI)的数据库中可获得。
yaeC-基因：
名称：周质结合蛋白YaeC
功能：MetD2甲硫氨酸摄取系统的一部分
参考文献：EP1108790的序列7061和709
登记号：AX127145和AX120793
abc-基因：
名称：ATP结合蛋白ABC
功能：MetD2摄取系统的一部分
参考文献：EP1108790的序列7061、708、7060和707；WO0100805的序列363；WO0100844的序列509登记号：AX127145、AX120792、AX127144、AX120791、AX066781、AX065383
yaeE-基因：
名称：通透酶YaeE
功能：MetD2甲硫氨酸摄取系统的一部分
参考文献：EP0100805的序列7060、7061和706；WO0100805的序列365
登记号：AX127144、AX127145、AX120790、AX066783
根据本发明可以使用本文所述的编码yaeC、abc和yaeE基因的序列。另外，可以使用所述基因的等位基因，等位基因是通过遗传密码的简并性质或者通过中性功能“有义突变”而产生的。
优选的实施方案可见于权利要求书中。
文中术语“弱化”是指降低或失活微生物中由相应的DNA编码的一或多种酶系统或者蛋白质的胞内活性，例如使用弱启动子或编码具有较低活性的相应酶的基因或等位基因或者使相应的基因或酶或蛋白质失活，及如果需要任选组合这些措施。
通过弱化步骤，与野生型蛋白质或者起始微生物中蛋白质的活性或浓度相比，相应蛋白质的活性或浓度通常降低了的0-75％、0-50％、0-25％、0-10％或者0-5％。
术语“较低”指的是与MetD2甲硫氨酸摄取系统未被弱化或失活的起始微生物相比，重组微生物的摄取能力具有相同的百分比。
蛋白质浓度的降低可以通过一维和二维常用蛋白质分离技术及随后使用适当的评价软件经光学鉴别凝胶中蛋白质浓度而检测。制备棒状细菌的蛋白质凝胶及鉴别该蛋白质的方法由Hermann等(Electrophoresis，22：1712-23(2001))描述。蛋白质浓度的分析也可以通过与要验证的蛋白质的特异性抗体进行Western印迹杂交(Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd Ed.ColdSpring Harbor Laboratory Press，NY，(1989))，随后用适当的软件光学解释以确定浓度(Lohaus and Meyer(1998)Biospektrum 5：32-39；Lottspeich，Angewandte Chemie 111：2630-2647(1999))。DNA结合蛋白的活性可以使用DNA条带迁移分析(也称作凝胶滞留分析)测定，如教科书Bioanalytik(Lottspeich/Zorbas，Spektrum AkademischerVerlag GmbH，Heidelberg，Germany，1998)所述，并由Wilson等(J.Bacteriol.183：2151-2155(2001))所应用。DNA结合蛋白对其它基因表达的作用可以使用Reportergen-Assays的不同方法(Sambrook et al.，Molecular Cloning；a Laboratory Manual.2nd Ed.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)证实。
本发明的微生物可以从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素，或者从甘油和乙醇中生产氨基酸。所述微生物是棒状细菌，尤其是棒杆菌属(corynebacterium)。对于棒杆菌属，提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。
合适的棒杆菌属菌株尤其是谷氨酸棒杆菌，尤其是野生型菌株。
谷氨酸棒杆菌ATCC13032
醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC15806
嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067
乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869，和叉开短杆菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC14020。
或者，例如生产L-甲硫氨酸的菌株：
谷氨酸棒杆菌ATCC21608
具有ATCC名称的菌株可以得自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，VA，USA)。
具有FERM名称的菌株可以得自National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology(AIST Tsukuba Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba Ibaraki，Japan)。所提及的菌株Corynebacteriumthermoaminogene(FERM BP-1539)在美国专利5,250,434中描述。
为实现弱化，可以降低或失活基因的表达或者酶蛋白的催化性质。如果需要，可组合这两种措施。
基因表达可通过合适的培养控制或通过遗传修饰(突变)基因表达的信号结构而降低。基因表达的信号结构是例如阻抑物基因、激活物基因、操纵基因、启动子、弱化子、核糖体结合位点、起始密码子和终止子。本领域技术人员可以在如下文献中发现这种信息：专利申请WO 96/15246，论文Boyd和Murphy(Journal ofBacteriology 170：5949-5952(1988)，Vosuil和Chambliss(NucleicAcids Research 26：3584-3590(1998)，Patek et al(Microbiology 142：1297-309(1996)和Journal of Biotechnology 104：311-323(2003))及已知的遗传学和分子生物学教科书，例如Knippers“MoleculareGenetik”(Molecular Genetics)，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)，或者Winnacker(“Gene und Klone”(Genesand Clones)，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany(1990))的教科书。
希望的基因表达调节的例子是要弱化的基因被克隆在通过加入一定剂量的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)可诱导的诱导型启动子例如trc启动子或者tac启动子的控制下。为此，载体例如大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pXK99E是合适的(WO0226787，根据布达佩斯条约于2001年7月31日提交，作为DH5alpha/pXK99E以保藏号DSM14440保藏在德国微生物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，Germany)，或者是pVWEx2(Wendisch，theJülich Research Center的Ph.D论文，Jül-3397，ISSN 0994-2952，Jülich，Germany(1997))，其使得克隆的基因可以在谷氨酸棒杆菌中IPTG-依赖性表达。
这种方法例如包括在专利WO0226787中，通过将载体pXK99EdeaD整合进谷氨酸棒杆菌的基因组中而调节deaD基因的表达，或者如Simic等(Applied and Environmental Microbiology 68：3321-3327(2002))所述通过将载体pK18mobglyA整合进谷氨酸棒杆菌中调节glyA基因的表达。
特异性降低基因表达的另一种方法是反义技术，其中短的寡脱氧核苷酸或载体用于在靶细胞中合成较长的反义RNA。
所述反义RNA可以结合特异的mRNA的互补节段(segment)，并降低其稳定性或者阻断其阻断易位体能力的能力。本领域技术人员可以在Srivastava et al.(Applied EnvironmentalMicrobiology，Oct 2000；66(10)：4366-4371)中发现关于这方面的实例。
本领域已知导致催化性质改变或降低的突变。提及的例子见Qiu和Goodman(Journal of Biological Chemistry 272：8611-8617(1997))，Sugimoto et al(Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61：1760-1762(1997))的工作及M_ckel(Ph.D论文，Berichte desForschungszentrums Jülich(Jülich Research Center Reports)，Jül-2906，ISSN09442952，Jülich，Germany(1994)所述。概括描述可见于已知的遗传学和分子生物学教科书，例如Hagemann(“AllgemeineGenetik”(General Genetics)，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart(1986)的教科书。
可能的突变是转换、颠换、插入和缺失。根据氨基酸置换对酶活性的作用，称作“错义突变”或“无义突变”。
在基因中插入或缺失至少一个碱基对导致移码突变，这样导致错误的氨基酸形成或者翻译过早中断。缺失多个密码子典型导致酶活性的完全破坏。
关于产生这种突变的指导为本领域所已知，可见于已知的遗传学和分子生物学教科书，例如Knippers(″Molekulare Genetik[Molecular Genetics]″，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1995)；或Winnacker(″Gene und Klone[Genes andClones]″(Genes and Clones)，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany，1990)或者Hagemann(″Allgemeine Genetik[General Genetics]″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)。
突变谷氨酸棒杆菌的基因的常用方法是Schwarzer and Pühler(Bio/Technology 9，84-87(1991)所述的“基因破坏”和“基因置换”方法。
在基因破坏方法中，例如将感兴趣基因的编码区的主要部分(central portion)克隆进质粒载体中，所述质粒载体在一种宿主(典型为大肠杆菌)中可以复制，但在谷氨酸棒杆菌中不能复制。值得考虑的载体是例如pSUP301(Simon et al.，Bio/Technology 1，784-791(1983))、pK18 mob、pK19mob、pk18mobsacB或者pK19mobsacB(Sch_fer et al.，Gene 145，69-73(1994))、pGEM-T(Promega Corporation，Madison，WI，USA，pCR2.1-TOPO(Invitrogen，Groningen，Netherlands)；Shuman(1994)，Journal of BiologicalChemistry 269：32678-84，U.S.Patent 5,487,993，pCR_Blunt(Invitrogen，Groningen，Netherlands)；Bernard et al.，Journal of Molecular Biology，234：534-541(1993)或者pEMl(Schrumpf et al.，1991，Journal ofBacteriology 173 4510-4516)。随后，将含有基因编码区的主要区域的质粒载体通过接合或转化进谷氨酸棒杆菌的希望菌株中。所述接合方法例如Sch_fer等(Journal of Bacteriology 172：1663-1666(1990)和Applied and Environmental Microbiology 60：756-759(1994)所述。
转化方法例如在Thierbach等(Applied Microbiology andBiotechnology 29，356-362(1988)，Duncan and Shivnan(Bio/Technology 7，1067-1070(1989))和Tauch等(FEMSMicrobiolgical Letters 123，343-347(1994))中描述。在通过“交换”事件同源重组后，所述被研究基因的编码区被载体序列中断，获得两个不完整的等位基因，每个等位基因缺少3’或者5’末端。Fitzpatrick等(Applied Microbiology and Biotechnology 42，575-580(1994)使用这个方法使得谷氨酸棒杆菌的recA基因失活。
本发明另外提供了含有至少yaeD、abc或者yaeE基因之一的编码区主要部分的至少15个、优选25个连续核苷酸的载体。
在“基因置换”方法中，在体外在感兴趣基因中产生了例如缺失、插入或者碱基置换的突变。另一方面将制备的等位基因在谷氨酸棒杆菌的非复制型载体中克隆，随后通过转化或者接合进希望的谷氨酸棒杆菌宿主中。在靶基因或者指定序列中通过首先产生整合的“交换”事件及适当的导致切除的“交换”事件的同源重组之后，可以获得(entrapment)突变体或者等位基因。这种方法在Scharzer and Pühler Bio/Technology 9：84-87(1991)中描述，并且例如由Peters-Windisch等(Microbiology 144，915-927(1998)使用，以通过缺失而使得谷氨酸棒杆菌的pyc基因失活，或者由Wehmeier等(Microbiology 144：1853-1862(1998)使用，在谷氨酸棒杆菌rel基因中插入缺失。
Kirchner和Tauch(Journal of Biotechnology 104：287-299(2003))提供了关于谷氨酸棒杆菌的不同遗传方法的综述。
在这种方式中，可以在选自yaeC、abc和yaeE组中的一或多个基因中进行缺失、插入或者碱基置换。
另外，除了根据本发明通过弱化选自yaeC、abc和yaE组中的一或多个基因而降低从周围介质中输入甲硫氨酸之外，强化或弱化各自的生物合成途径、糖酵解、添补代谢、柠檬酸循环、氨基酸输出的戊糖磷酸循环的一或多种酶及如果需要调节蛋白、尤其是失活或者降低其表达对于生产L-氨基酸是有益的。
文中术语“强化”描述了微生物中由相应DNA编码的一或多种酶或蛋白质的胞内活性或者浓度的增加，例如基因的拷贝数或者基因数增加，使用强启动子或者编码具有较高活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因，及如果需要则组合这些措施。
通过强化、尤其是过表达措施，相应蛋白质的活性或浓度相对于野生型蛋白质或者起始微生物中蛋白质的活性或浓度通常增加至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或者500％，最大增加1000％或者2000％。
通常优选使用内源基因。
“内源基因”或者“内源核苷酸序列”是指所述种群中存在的基因或者核苷酸序列的类型。
因此，例如对于L-甲硫氨酸的制备，除了根据本发明通过弱化选自yaeC、abc和yaeE组中的一或多个基因而降低从周围介质中输入甲硫氨酸之外，选自生产甲硫氨酸的基因或等位基因组中的一或多个基因可以被强化、尤其是过表达。“生产甲硫氨酸的基因或等位基因”应理解为其强化/过表达可以使得甲硫氨酸生产改良的、优选内源的开放读框、基因或等位基因。
如下读框、基因或等位基因可用于此目的：accBC，accDA，aecD，cstA，cysD，cysE，cysH，cysK，cysN，cysQ，dps，eno，fda，gap，gap2，gdh，gnd，glyA，hom，homFBR，lysC，lyscFBR，metA，metB，metE，metH，metY，msiK，opcA，oxyR，ppc，ppcFBR，pgk，pknA，pknB，pknD，pknG，ppsA，ptsH，ptsI，ptsM，pyc，pyc P458S，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tal，thyA，tkt，tpi，zwal，zwf和zwf A213T。这些基因概括示于表1。
表1：甲硫氨酸生产中的基因和等位基因
  名称   编码的酶或蛋白质的名称   参考文献   登记号
  accBC   Acyl-CoA羧化酶(Acyl-CoACarboxylase)EC 6.3.4.14(酰基-CoA羧化酶)   J_ger et al.Archives ofMicrobiology(1996)166：76-82EP1108790；WO0100805   U35023AX123524AX066441
  accDA   乙酰-CoA羧化酶(Acetyl-CoACarboxylase)EC 6.4.1.2(乙酰-CoA羧化酶)   EP1055725EP1108790WO0100805 AX121013AX066443
  aecD   胱硫醚beta-裂合酶(Cystathionin beta-Lyase)EC 4.4.1.8(胱硫醚β-裂合酶)   Rossol et al.，Journal ofBacteriology 174：2968-2977(1992)   M89931
  cstA   碳饥饿蛋白A(CarbonStarvation Protein A)(碳饥饿蛋白A)   EP1108790WO0100804   AX120811AX066109
  cysD   Sulfat-腺苷酰转移酶(Sulfat-Adenylyltransferase)Untereinheit IIEC 2.7.7.4(硫酸腺苷酰转移酶小链)   EP1108790   AX123177
  cysE   Serin乙酰转移酶(Serinacetyltransferase)EC 2.3.1.30(丝氨酸乙酰转移酶)   EP1108790WO0100843   AX122902AX063961
  cysH   3′-磷酸腺苷硫酸还原酶(3′-PhosphoadenylsulfatReduktase)EC 1.8.99.4(3′-磷酸腺苷5′-磷酰硫酸还原酶)   EP1108790WO0100842   AX123178AX066001
  cysK   半胱氨酸-合酶(Cystein-Synthase)EC 4.2.99.8(半胱氨酸合酶)   EP1108790WO0100843   AX122901AX063963
  cysN   硫酸-腺苷酰转移酶(Sulfat-Adenylyltransferase)Untereinheit IEC 2.7.7.4(硫酸腺苷酰转移酶)   EP1108790   AX123176AX127152
  cysQ   转运蛋白CysQ(Transportprotein CysQ)(转运蛋白cysQ)   EP1108790WO0100805   AX127145AX066423
  dps   DNA-保护蛋白(DNA-Protection Protein)(在蛋白质饥饿期间的保护作用)   EP1108790   AX127153
  eno   烯醇化酶(Enolase)EC 4.2.1.11(烯醇化酶)   EP1108790WO0100844EP1090998Hermann et al.，Electrophoresis19：3217-3221(1998)   AX127146AX064945AX136862
  fda   果糖二磷酸醛缩酶(FruktoseBisphosphat Aldolase)EC 4.1.2.13   van der Osten et al.，Molecular Microbiology3：1625-1637(1989)   X17313
  (果糖二磷酸醛缩酶)
  gap   甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase)EC 1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)  EP1108790WO0100844Eikmanns et al.，Journalof Bacteriology 174：6076-6086(1992)   AX127148AX064941X59403
  gap2   甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyd-3-Phosphate Dehydrogenase)EC 1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶2)  EP1108790WO0100844   AX127146AX064939
  gdh   谷氨酸脱氢酶(GlutamatDehydrogenase)EC 1.4.1.4(谷氨酸脱氢酶)  EP1108790WO0100844Boermann et al.，Molecular Microbiology6：317-326(1992)   AX127150AX063811X59404X72855
  glyA   甘氨酸/丝氨酸羟甲基转移酶(Glycine/SerinHydroxymethyltransferase)EC 2.1.2.1(甘氨酸/丝氨酸羟甲基转移酶)  EP1108790   AX127146AX121194
  gnd   6-磷酸葡糖酸脱氢酶(6-PhosphogluconatDehydrogenase)EC 1.1.1.44(6-磷酸葡糖酸脱氢酶)  EP1108790WO0100844   AX127147AX121689AX065125
  hom   高丝氨酸脱氢酶(HomoserinDehydrogenase)EC 1.1.1.3(高丝氨酸脱氢酶)  Peoples et al.，MolecularMicrobiology 2：63-72(1988)   Y00546
  homFBR   反馈抗性(fbr)高丝氨酸脱氢酶(Homoserin Dehydrogenasefeedback resistent)EC 1.1.1.3(fbr高丝氨酸脱氢酶)  Reinscheid et al.，Journal of Bacteriology173：3228-30(1991)
  lysC   天冬氨酸激酶(Aspartatkinase)EC 2.7.2.4(天冬氨酸激酶)  EP1108790WO0100844Kalinowski et al.，Molecular Microbiology5：1197-204(1991)   AX120365AX063743X57226
  lysCFBR   反馈抗性天冬氨酸激酶(fbr)(Aspartatkinase feedbackresistent)EC 2.7.2.4(fbr天冬氨酸激酶)  见表2
  metA   高丝氨酸乙酰转移酶  Park et al.，Molecular   AF052652
  (HomoserinAcetyltransferase)EC 2.3.1.31(高丝氨酸乙酰转移酶)   Cells 8：286-94(1998)
  metB   胱硫醚γ-裂合酶(Cystahioninγ-Lyase)EC 4.4.1.1(胱硫醚γ-合酶)   Hwang et al.，MolecularCells 9：300-308(1999)   AF126953
  metE   高半胱氨酸-甲基转移酶(Homocystein-Methyltransferase)EC 2.1.1.14(高半胱氨酸甲基转移酶)   EP1108790   AX127146AX121345
  metH   高半胱氨酸-甲基转移酶(Homocystein-Methyltransferase)(Vitamin B12 abh_ngig)EC 2.1.1.14(高半胱氨酸甲基转移酶)   EP1108790   AX127148AX121747
  metY   乙酰高丝氨酸Sulfhydrolase(AcetylhomoserinSulfhydrolase)(乙酰高丝氨酸Sulfhydrolase)   EP1108790   AX120810AX127145
  msiK   Zuckerimporter(多糖输入蛋白)   EP1108790   AX120892
  opcA   葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶(Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase)(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶亚基)   WO0104325   AX076272
  oxyR   转录调节物(Transcriptionsregulator)(转录调节物)   EP1108790   AX122198AX127149
  ppcFBR   反馈抗性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PhosphoenolpyruvatCarboxylase feedbackresistent)EC 4.1.1.31(反馈抗性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)   EP0723011WO0100852
  ppc   磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PhosphoenolpyruvatCarboxylase)EC 4.1.1.31(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)   EP1108790O′Reagan et al.，Gene77(2)：237-251(1989)   AX127148AX123554M25819
  pgk   磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerat Kinase)EC 2.7.2.3(磷酸甘油酸激酶)   EP1108790WO0100844Eikmanns，Journal ofBacteriology 174：6076-6086(1992)   AX121838AX127148AX064943X59403
  pknA   蛋白激酶A(Protein kinaseA)(蛋白激酶A)   EP1108790   AX120131AX120085
  pknB   蛋白激酶B(Protein kinaseB)(蛋白激酶B)   EP1108790   AX120130AX120085
  pknD   蛋白激酶D(Protein kinaseD)(蛋白激酶D)   EP1108790   AX127150AX122469AX122468
  pknG   蛋白激酶G(Protein kinaseG)(蛋白激酶G)   EP1108790   AX127152AX123109
  ppsA   磷酸烯醇丙酮酸-合酶(Phosphoenolpyruvat-Synthase)EC 2.7.9.2(磷酸烯醇丙酮酸合酶)   EP1108790   AX127144AX120700AX122469
  ptsH   磷酸转移酶系统蛋白H(PhosphotransferaseSystem Protein H)EC 2.7.1.69(磷酸转移酶系统成分H)   EP1108790WO0100844   AX122210AX127149AX069154
  ptsI   磷酸转移酶系统酶I(PhosphotransferaseSystem Enzym I)EC 2.7.3.9(磷酸转移酶系统酶I)   EP1108790   AX122206AX127149
  ptsM   葡萄糖特异性磷酸转移酶系统酶II(Glukose spezifischesPhosphotransferaseSystem Enzym II)EC 2.7.1.69(葡萄糖-磷酸转移酶系统酶II)   Lee et al.，FEMSMicrobiology Letters119(1-2)：137-145(1994)   L18874
  pyc   丙酮酸-羧化酶(Pyrvat-Carboxylase)EC 6.4.1.1(丙酮酸羧化酶)   WO9918228Peters-Wendisch et al.，Microbiology 144：915-927(1998)   A97276Y09548
  pycP458S   丙酮酸-羧化酶EC 6.4.1.1(丙酮酸羧化酶)氨基酸置换P458S   EP1108790
  sigC   Sigma因子C(SigmafaktorC)EC 2.7.7.6(胞质外功能替代sigma因子C)   EP1108790   AX120368AX120085
  sigD   RNA聚合酶Sigma因子D(RNAPolymerase SigmafaktorD)EC 2.7.7.6(RNA聚合酶sigma因子)   EP1108790   AX120753AX127144
  sigE   Sigma因子E(SigmafaktorE)EC 2.7.7.6(胞质外功能替代sigma因子E)   EP1108790   AX127146AX121325
  sigH   Sigma因子H(SigmafaktorH)EC 2.7.7.6(sigma因子SigH)   EP1108790   AX127145AX120939
  sigM   Sigma因子M(SigmafaktorM)EC 2.7.7.6(sigma因子SigM)   EP1108790   AX123500AX127153
  tal   转醛酶(Transaldolase)EC 2.2.1.2(转醛酶)   WO0104325   AX076272
  thyA   胸苷酸合酶(ThymidylatSynthase)EC 2.1.1.45(胸苷酸合酶)   EP1108790   AX121026AX127145
  tkt   转羟乙醛酶(Transketolase)EC 2.2.1.1(转羟乙醛酶)   Ikeda et al.，NCBI   AB023377
  tpi   丙糖磷酸异构酶(Triose-phosphat Isomerase)EC 5.3.1.1(丙糖磷酸异构酶)   Eikmanns，Journal ofBacteriology 174：6076-6086(1992)   X59403
  zwal   细胞生长因子1(Zellwachstumsfaktor 1)(生长因子1)   EP1111062   AX133781
  zwf   葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Glukose-6-phosphat-l-Dehydrogenase)EC 1.1.1.49(葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶)   EP1108790WO0104325   AX127148AX121827AX076272
  zwfA213T   葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶(Glukose-6-phosphat-1-Dehydrogenase)   EP1108790
  EC 1.1.1.49(葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶)氨基酸置换A213T
另外，除了通过弱化选自yaeC、abc和yaeE组的一或多个基因而降低从周围介质中输入甲硫氨酸之外，同时弱化选自对于生长或者生产甲硫氨酸非必需的基因或等位基因组的一或多个基因、尤其是使其失活或者降低其表达对于L-甲硫氨酸的生产可能是有益的。
为此可以选择如下开放读框：brnQ，ccpA1，ccpA2，citA，citB，citE，ddh，gluA，gluB，gluC，gluD，luxR，luxS，lysR1，lysR2，lysR3，menE，metD，metK，pck，pgi，poxB和zwa2。这些基因概括示于表2。
表2：对于甲硫氨酸生产非必需的基因和等位基因
  基因名称   编码的酶或蛋白质的名称  参考文献   登记号
  brnQ   Carrier-Protein verzweigtkettigerAminos_uren(支链氨基酸转运系统载体蛋白)  Tauch et al.，Archivesof Microbiology 169(4)：303-12(1998)WO0100805EP1108790   M89931AX066841AX127150
  ccpA1   分解代谢物控制蛋白(Katabolit-Kontroll-Protein)(分解代谢物控制蛋白A1)  WO0100844EP1108790   AX065267AX127147
  ccpA2   分解代谢物控制蛋白(分解代谢物控制蛋白A2)  WO0100844EP1108790   AX065267AX121594
  citA   传感蛋白激酶CitA(Sensor-Kinase CitA)(传感蛋白激酶CitA)  EP1108790   AX120161
  citB   转录调节物CitB(转录调节物CitB)  EP1108790   AX120163
  cite   柠檬酸-裂合酶(Citrat-Lyase)EC 4.1.3.6(柠檬酸裂合酶)  WO0100844EP1108790   AX065421AX127146
  Ddh   二氨基庚二酸-脱氢酶(Diaminopimelat-Dehydrogenase)EC 1.4.1.16(二氨基庚二酸脱氢酶)  Ishino et al.，NucleicAcids Research 15：3917(1987)EP1108790   S07384AX127152
  gluA   谷氨酸转运ATP-结合蛋白(Glutamat-Transport ATP-  Kronemeyer et al.，Journal of Bacteriology   X81191
  bindendes Protein)(谷氨酸转运ATP-结合蛋白)  177(5)：1152-8(1995)
  gluB   谷氨酸结合蛋白(Glutamat-bindendes Protein)(谷氨酸结合蛋白)  Kronemeyer et al.，Journal of Bacteriology177(5)：1152-8(1995)   X81191
  gluC   谷氨酸转运通透酶(Glutamat-Transport Permease)(谷氨酶转运系统通透酶)  Kronemeyer et al.，Journal of Bacteriology177(5)：1152-8(1995)   X81191
  gluD   谷氨酸转运通透酶(谷氨酸转运系统通透酶)  Kronemeyer et al.，Journal of Bacteriology177(5)：1152-8(1995)   X81191
  luxR   转录调节物LuxR(TranskriptionsregulatorLuxR)(转录调节物LuxR)  WO0100842EP1108790   AX065953AX123320
  luxS   组氨酸激酶LuxS(Histidin-Kinase LuxS)(组氨酸激酶LuxS)  EP1108790   AX123323AX127153
  lysR1   转录调节物LysR1(TranskriptionsregulatorLysRl)(转录调节物LysR1)  EP1108790   AX064673AX127144
  lysR2   转录调节物LysR2(转录调节物LysR2)  EP1108790   AX123312
  lysR3   转录调节物LysR3(转录调节物LysR3)  WO0100842EP1108790   AX065957AX127150
  menE   O-琥珀酰苯甲酸-CoA-连接酶(O-Succinylbenzoes_ure-CoA-Ligase)EC 6.2.1.26(O-琥珀酰苯甲酸-CoA连接酶)  WO0100843EP1108790   AX064599AX064193AX127144
  metD   转录调节物MetD(转录调节物MetD)  EP1108790   AX123327AX127153
  metK   甲硫氨酸-腺苷-转移酶(Methionin-Adenosyl-Trans ferase)EC 2.5.1.6(S-腺苷甲硫氨酸合成酶)  WO0100843EP1108790   AX063959AX127148
  pck   磷酸烯醇丙酮酸-羧激酶(Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase)(磷酸烯醇丙酮酸羧激酶)  WO0100844   AJ269506AX065053
  pgi   葡萄糖-6-磷酸-异构酶(Glucose-6-Phosphat-Isomerase)  EP1087015EP1108790   AX136015AX127146
  EC 5.3.1.9(葡萄糖-6-磷酸异构酶)
  poxB   丙酮酸-氧化酶(Pyruvat-Oxidase)EC 1.2.3.3(丙酮酸氧化酶)   WO0100844EP1096013   AX064959AX137665
  zwa2   细胞生长因子2(Zellwachstumsfaktor 2)(生长因子2)   EP1106693EP1108790   AX113822AX127146
最后，除了通过例如弱化选自yaeC、abc和yaeE组的一或多个基因而降低从周围介质中输入甲硫氨酸之外，消除非所需的副反应对于氨基酸、尤其是L-甲硫氨酸的生产可以是有益的(Nakayama：“Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms”in：Overproduction of Microbial Products，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(eds.)Academic Press，London，UK，1982)。
根据本发明制备的微生物是本发明的另一个目的，其可通过连续培养或者通过分批法或者补料分批法或者重复补料分批法不连续培养，以生产L-氨基酸。已知的培养方法见Chmiel(Bioprozesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik)，(Bioprocess Technology 1.Introduction to Bioprocess Technology)(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart(1991)或者Lehrbuch von Storhas，Bioreactoren und Periphere Einrichtungen(Storhas的教科书，(Bioreactors and Ancillary Equipment)(Viewweg Publishers，Braunschweig/Wiesbaden(1994))的教科书所描述。
所用培养基必须以适当方式符合适当菌株的需求。关于不同微生物的培养基的阐述见于美国细菌学会(American Society forBacteriology)的“Manual of Methods for General Bacteriology”(Washington D.C.，USA，1981)。
可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如大豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸。这些物质可单独或混合使用。
可使用的氮源包括含氮有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽汁，玉米浆，大豆粉和尿素，或无机化物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。
可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可加入生长必需物质如氨基酸和维生素。此外，可将适当前体加入培养基中。所述添加物质可以单批形式加入培养物或在培养期间以适当方式补料。
为了控制培养物的pH，可以适当方式应用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸。为控制泡沫产生，可以使用抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯。为维持质粒的稳定性，可以向培养基中加入选择性作用物质例如抗生素。为维持有氧条件，可以向培养物中充入氧气或含氧混合气，例如空气。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃-40℃。持续培养直至希望的产物形成最大量。此目的通常在10～160小时范围内达到。
使用本发明的方法，细菌或者发酵方法中关于产物浓度(每单位体积的产物)、产物产量(每一利用的碳源形成的产物)、产物形成(每单位体积时间形成的产物)或者其它方法参数及其组合的发酵方法的结果可以改良至少0.5％、至少1％或者至少2％。
本领域已知确定L-氨基酸的方法。可通过如Spackmann等(Analytical Chemistry，30，(1958)，1185-1190)所述的阴离子交换层析及随后的茚三酮衍生化，或者可以进行Lindroth等(AnalyticalChemistry(1979)51：1167-1174)所述的反相HPLC来进行分析。本领域技术人员在Ashman等(in Tschesche(Hrsg)，Modern Methods inProtein Chemistry，155-172，de Gruyter，Berlin 1985)中也可发现关于这方面的信息。
本发明的方法是通过发酵生产L-甲硫氨酸。
如果需要，终产物中L-甲硫氨酸的浓度可以通过加入L-甲硫氨酸至希望的水平。

Claims (12)

1、一种通过发酵重组微生物、优选棒状细菌制备L-氨基酸的方法，其特征在于所应用的细菌与初始微生物相比从周围介质中较少或者不摄取甲硫氨酸，所述微生物中编码MetD2甲硫氨酸吸收系统的yaeC、abc和yaeE基因中的一或多个被弱化、失活或者以较低水平表达。
2、权利要求书1的方法，特征在于制备的是L-甲硫氨酸。
3、权利要求书1的发酵制备L-氨基酸、特别是L-甲硫氨酸的方法，其中进行如下步骤：
(a)发酵产生希望的L-氨基酸的微生物、优选棒状细菌，所述微生物与初始微生物相比从周围介质中较少或不吸收甲硫氨酸，其中使得编码MetD2甲硫氨酸吸收系统的yaeC、abc和yaeE组中的一或多个基因被弱化、特别是被失活或者以较低水平表达；
(b)富集培养基或者细菌细胞中希望的产物；及
(c)分离希望的L-氨基酸，其中任选地发酵肉汤的成分和/或生物量的全部或者部分(＞0至100)保留在终产物中。
4、权利要求1或3的方法，其特征在于应用其中L-甲硫氨酸生物合成途径的其它基因被额外强化的细菌。
5、权利要求1或3的方法，其特征在于应用其中降低L-甲硫氨酸形成的代谢途径至少被部分失活的细菌。
6、权利要求1或3的方法，其特征在于降低编码从周围介质中摄取甲硫氨酸的成分的多核苷酸的表达，所述多核苷酸例如选自编码甲硫氨酸摄取系统的yaeC、abc和yaeE组中的一或多个基因。
7、权利要求1或3的方法，其特征在于降低yaeC、abc和yaeE多核苷酸编码的多肽(酶蛋白)的调节和/或催化性质。
8、权利要求1或3的方法，其特征在于为了制备L-氨基酸、尤其是L-甲硫氨酸，微生物、优选发酵的棒状细菌中选自如下表1所示组的一或多个基因同时被强化、尤其是过表达：  名称   编码的酶或蛋白质的名称  accBC   酰基-CoA羧化酶EC 6.3.4.14(酰基-CoA羧化酶)  accDA   乙酰基-CoA羧化酶EC 6.4.1.2(乙酰基-CoA羧化酶)  aecD   胱硫醚β-裂合酶EC 4.4.1.8(胱硫醚β-裂合酶)  cstA   碳饥饿蛋白A(碳饥饿蛋白A)  cysD   硫酸腺苷酰转移酶Untereinheit IIEC 2.7.7.4(硫酸腺苷酰转移酶小链)  cysE   丝氨酸乙酰转移酶EC 2.3.1.30(丝氨酸乙酰转移酶)  cysH   3′-磷酸腺苷硫酸还原酶(3′-Phosphoadenylsulfat Reduktase)EC 1.8.99.4(3′-磷酸腺苷5′-磷酰硫酸还原酶)  cysK   半胱氨酸-合酶EC 4.2.99.8(半胱氨酸合酶)  cysN   硫酸-腺苷酰转移酶Untereinheit IEC 2.7.7.4(硫酸腺苷酰转移酶)  cysQ   转运蛋白CysQ(转运蛋白cysQ)  dps   DNA-保护蛋白(在蛋白质饥饿期间的保护作用)  eno   烯醇化酶EC 4.2.1.11(烯醇化酶)  fda   果糖二磷酸醛缩酶EC 4.1.2.13
  (果糖二磷酸醛缩酶)  gap   甘油醛-3-磷酸脱氢酶EC 1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)  gap2   甘油醛-3-磷酸脱氢酶EC 1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶2)  gdh   谷氨酸脱氢酶EC 1.4.1.4(谷氨酸脱氢酶)  glyA   甘氨酸/丝氨酸羟甲基转移酶EC 2.1.2.1(甘氨酸/丝氨酸羟甲基转移酶)  gnd   6-磷酸葡糖酸脱氢酶EC 1.1.1.44(6-磷酸葡糖酸脱氢酶)  hom   高丝氨酸脱氢酶EC 1.1.1.3(高丝氨酸脱氢酶)  homFBR   反馈抗性(fbr)高丝氨酸脱氢酶EC 1.1.1.3(高丝氨酸脱氢酶fbr)  lysC   天冬氨酸激酶(Aspartatkinase)EC 2.7.2.4(天冬氨酸激酶)  lysCFBR   反馈抗性(fbr)天冬氨酸激酶EC 2.7.2.4(天冬氨酸激酶fbr)  metA   高丝氨酸乙酰转移酶EC 2.3.1.31(高丝氨酸乙酰转移酶)  metB   胱硫醚γ-裂合酶EC 4.4.1.1(胱硫醚γ-合酶)  metE   高半胱氨酸-甲基转移酶EC 2.1.1.14(高半胱氨酸甲基转移酶)  metH   高半胱氨酸-甲基转移酶(维生素B12abh_ngig)EC 2.1.1.14(高半胱氨酸甲基转移酶)  metY   乙酰高丝氨酸Sulfhydrolase(乙酰高丝氨酸Sulfhydrolase)  msiK   Zuckerimporter(多糖输入蛋白)
  opcA   葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的亚基)   oxyR   转录调节物(转录调节物)   ppcFBR   反馈抗性磷酸烯醇内酮酸羧化酶EC 4.1.1.31(反馈抗性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)   ppc   磷酸烯醇丙酮酸羧化酶EC 4.1.1.31(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)   pgk   磷酸甘油酸激酶EC 2.7.2.3(磷酸甘油酸激酶)   pknA   蛋白激酶A(蛋白激酶A)   pknB   蛋白激酶B(蛋白激酶B)   pknD   蛋白激酶D(蛋白激酶D)   pknG   蛋白激酶G(蛋白激酶G)   ppsA   磷酸烯醇丙酮酸-合酶EC 2.7.9.2(磷酸烯醇丙酮酸合酶)   ptsH   磷酸转移酶系统蛋白HEC 2.7.1.69(磷酸转移酶系统成分H)   ptsI   磷酸转移酶系统酶IEC 2.7.3.9(磷酸转移酶系统酶I)   ptsM   葡萄糖特异性磷酸转移酶系统酶IIEC 2.7.1.69(葡萄糖磷酸转移酶系统酶II)   pyc   丙酮酸-羧化酶EC 6.4.1.1(丙酮酸羧化酶)   pycP458S   丙酮酸-羧化酶EC 6.4.1.1(丙酮酸羧化酶)氨基酸置换P458S   sigC   Sigma因子CEC 2.7.7.6(细胞质外功能替代物sigma因子C)   sigD   RNA聚合酶Sigma因子DEC 2.7.7.6
  (RNA聚合酶sigma因子)   sigE   Sigma因子EEC 2.7.7.6(细胞质外功能替代物sigma因子E)   sigH   Sigma因子HEC 2.7.7.6(sigma因子SigH)   sigM   Sigma因子MEC 2.7.7.6(sigma因子SigM)   tal   转醛醇酶EC 2.2.1.2(转醛醇酶)   thyA   胸苷酸合酶EC 2.1.1.45(胸苷酸合酶)   tkt   转羟乙醛酶EC 2.2.1.1(转羟乙醛酶)   tpi   磷酸丙糖异构酶EC 5.3.1.1(磷酸丙糖异构酶)   zwa1   细胞生长因子1(生长因子1)   zwf   葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶EC 1.1.1.49(葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶)   ZwfA213T   葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶EC 1.1.1.49(葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶)氨基酸置换A213T
9、权利要求1或3的方法，其特征在于为了制备L-氨基酸、特别是L-甲硫氨酸，发酵微生物、优选棒状微生物，其中选自下表2中所示组的一或多个基因的表达被弱化、尤其被失活或降低：   基因名称   编码的酶或蛋白质的名称   brnQ   Carrier-ProteinverzweigtkettigerAminos_uren(支链氨基酸转运系统载体蛋白)   ccpA1   分解代谢物控制蛋白
  (分解代谢物控制蛋白A1)   ccpA2   分解代谢物控制蛋白(分解代谢物控制蛋白A2)   citA   传感蛋白激酶CitA(传感蛋白激酶CitA)   citB   转录调节物CitB(转录调节物CitB)   citE   柠檬酸-裂合酶EC 4.1.3.6(柠檬酸裂合酶)   ddh   二氨基庚二酸-脱氢酶EC 1.4.1.16(二氨基庚二酸脱氢酶)   gluA   谷氨酸转运ATP-结合蛋白(谷氨酸转运ATP-结合蛋白)   gluB   谷氨酸结合蛋白(谷氨酸结合蛋白)   gluC   谷氨酸转运通透酶(谷氨酸转运系统通透酶)   gluD   谷氨酸转运通透酶(谷氨酸转运系统通透酶)   luxR   转录调节物LuxR(转录调节物LuxR)   luxS   组氨酸激酶LuxS(组氨酸激酶LuxS)   lysR1   转录调节物LysR1(转录调节物LysR1)   lysR2   转录调节物LysR2(转录调节物LysR2)   lysR3   转录调节物LysR3(转录调节物LysR3)   menE   O-Succinylbenzoes_ure-CoA-连接酶EC 6.2.1.26(O-琥珀酰苯甲酸-CoA连接酶)   metD   转录调节物MetD(转录调节物MetD)   metK   甲硫氨酸-腺苷-转移酶EC 2.5.1.6(S-腺苷甲硫氨酸合成酶)   pck   磷酸烯醇丙酮酸-羧激酶(磷酸烯醇丙酮酸羧激酶)   pgi   葡萄糖-6-磷酸-异构酶EC 5.3.1.9(葡萄糖-6-磷酸异构酶)
  poxB   丙酮酸-氧化酶EC 1.2.3.3(丙酮酸氧化酶)   zwa2   细胞生长因子2(生长因子2)
10、权利要求1-9任一项的方法，其特征在于应用谷氨酸棒杆菌类型的微生物。
11、重组的微生物、优选棒状细菌，其中选自编码从周围介质中摄取甲硫氨酸的、编码MetD2甲硫氨酸摄取系统的yaeC、abc和yaeE组中的一或多个基因被弱化、尤其被失活或者以比MetD2甲硫氨酸摄取系统未被弱化或失活的起始微生物低的水平表达。
12、载体，其含有具有至少15个确定序列的核苷酸的片段，所述片段含有yaeC、abc和yaeE基因中至少一个的一或多个序列，且所述载体不能复制进谷氨酸棒杆菌中。
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