CN105431539B

CN105431539B - 新的有机酸通路

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Publication number: CN105431539B
Application number: CN201480038491.7A
Authority: CN
Inventors: 皮特·扬·彭特; 李安; 马丁努斯·彼德勒斯·玛丽亚·卡斯佩尔斯
Original assignee: Lesaffre et Cie SA
Current assignee: Lesaffre et Cie SA
Priority date: 2013-05-02
Filing date: 2014-05-02
Publication date: 2021-05-25
Anticipated expiration: 2034-05-02
Also published as: WO2014178717A1; US20160068873A1; CN105431539A; MX2015015274A; US20180273986A1; US9885066B2; EP2992105A1; CA2911170A1; BR112015027609A2

Abstract

本发明涉及细胞质柠檬酸合成酶在微生物或藻类的线粒体外异源性生产柠檬酸盐的应用，其中所述蛋白选自黑曲霉(A.niger)An08g10920、An01g09940、An09g03570或这些基因的直系同源物。通过将编码上述蛋白的核酸引入到合适的宿主细胞中，来实现上述生产。上述蛋白优选是黑曲霉(A.niger)An08g10920、An01g09940、An09g03570或其直系同源物，更具体地，其中上述直系同源物选自下组：图9所列出的蛋白，以及与An08g10920、An01g09940或An09g03570具有70％、更优选75％、更优选80％、更优选85％、更优选90％、更优选95％、更优选98％、更优选99％的百分比同一性的蛋白。

Description

新的有机酸通路

技术领域

本发明涉及微生物生产的领域，更具体涉及有机酸，诸如柠檬酸及其衍生物，诸如草酰乙酸、衣康酸(衣康酸盐)和甲基丙烯酸的生产，更具体涉及上述物质在微生物中的生产。

背景技术

在活的生物体中，最基础且最普遍的代谢途径之一是柠檬酸循环或以发现者的姓名命名的克雷伯氏(Krebs)循环。在真核生物中，这一过程发生在线粒体中并且主要注入从细胞质转运到线粒体内的丙酮酸盐和乙酰辅酶A(CoA)。通过主动转运机制，通常通过三羧酸转运蛋白，可将Krebs循环的一些组分或其衍生物转运回细胞质中。这主要意味着，依赖于或起始于有机酸，诸如柠檬酸(柠檬酸盐)、苹果酸(苹果酸盐)、草酰乙酸(草酰乙酸盐)的细胞质代谢通路，极大地依赖于并且通常受限于Krebs循环内的活性和三羧酸转运蛋白的可利用性。

迄今为止，还没有阐明线粒体外产生柠檬酸的具体代谢途径。然而，细胞质中的柠檬酸可利用性对于产生这种酸自身是极其有用的，甚至更重要的是，对于柠檬酸的衍生物和代谢物的产生也是极其有用的。柠檬酸是很多代谢途径的起始点。一个重要的代谢途径是衣康酸的产生。

已经对微生物细胞中的衣康酸的产生和代谢进行了几十年的广泛研究(Calam,C.T.et al.,1939,Thom.J.Biochem.,33:1488-1495；Bentley,R.and Thiessen,C.P.,1956,J.Biol.Chem.226:673-720；Cooper,R.A.and Kornberg,H.L.,1964,Biochem.J.,91:82-91；Bonnarme,P.et al.,1995,J.Bacteriol.117:3573-3578；Dwiarti,L.et al.,2002,J.Biosci.Bioeng.1:29-33)，但是还没有明确建立衣康酸的代谢通路(Wilke,Th.andVorlop,K.-D.,2001,Appl.Microbiol.Biotechnol.56:289-295；Bonnarme,P.et al.,1995,J.Bacteriol.177:3573-3578)。这一方面的两个并发性因素是，衣康酸的生物合成途径被认为即发生在细胞质中也发生在线粒体中(Jaklitsch,W.M.et al.,1991,J.Gen.Microbiol.Appl.6:51-61)，而且已发现乌头酸酶(使柠檬酸与顺乌头酸互变的酶)和代谢通路中的其他酶以很多亚型的形式存在于微生物细胞中。

在图1中，给出了目前所设想的衣康酸生物合成的一般线路图，其中，清楚示出在细胞质和线粒体中都存在生物合成途径，并且在两个区室之间存在假定的连接。这一线路图的几个点上，存在试图改善目前在微生物中所进行的衣康酸商业生产的可能性。

使用在WO 2009/014437、WO 2009/104958和WO 2009/110796中描述的技术，实现了在曲霉属真菌(Aspergillus)(另外，还有其他微生物)中从柠檬酸盐产生衣康酸。

但是，与衣康酸盐类似，柠檬酸盐也可用作生产苹果酸盐、琥珀酸盐、谷氨酸盐和甲基丙烯酸的起始点。

另外，柠檬酸还可引起赖氨酸的代谢途径，并且自此产生青霉素和类似的化合物。或者，柠檬酸可引起脂肪酸的合成，由此成为生物柴油生产的原料。而且，柠檬酸的代谢物，特别是乙酰-CoA，形成朝向脂肪酸、聚酮化合物的生物合成途径，和朝向萜类化合物及其他化合物的甲羟戊酸通路的基础。

但是，仍然需要一种能产生或过量产生柠檬酸的酶。

发明内容

现在，本发明人阐明了一种基因，该基因编码存在于真核生物体的线粒体外(并且可能在细胞质中)并且起作用的，能催化从草酰乙酸盐至柠檬酸的反应的酶，所以被称为柠檬酸合成酶。

因此，本发明包括具有细胞质柠檬酸合成酶活性的蛋白在微生物或藻类的细胞质中异源性生产柠檬酸盐的应用，优选其中，所述微生物是真菌或酵母或植物或藻类细胞，更优选，当所述微生物选自下组：曲霉属(Aspergillus spp.)，更具体是黑曲霉(A.niger)、构巢曲菌(A.nidulans)、土曲霉(A.terreus)、棒曲菌(A.clavatus)、米曲霉(A.oryzae)或黄曲霉(A.flavus)；链孢霉属(Neurospora spp.)，更具体是粗糙链孢霉(N.crassa)或白色链孢霉(N.tetrasperma)；核盘霉(Sclerotina)；赤霉菌(Gibberella)；盾壳霉菌(Coniothyrium)；皮斯特霉(Psiticum)；稻瘟病菌(Magnaporthe)；柄孢壳菌(Podospora)；毛壳菌(Chaetomium)；暗球腔菌(Phaeosphaeria)；孢盘菌(Botryotinia)；新萨托菌(Neosartorya)；核腔菌(Pyrenophora)；黍(Panicum)；褐潮藻(Aureococcus)；青霉菌(Penicillium)；木霉菌(Trichoderma)；粪壳菌(Sordaria)；炭疽菌(Colleotrichum)；轮枝孢菌(Verticillium)；节丛孢菌(Arthrobotrys)；丛赤壳菌(Nectria)；小球腔菌(Leptosphaeria)；镰刀菌(Fusarium)；小丛壳菌(Glomerella)；地丝霉(Geomyces)；毁丝霉(Myceliophthora)；毕赤酵母(Pichia)；酵母属(Saccharomyces spp.)，诸如巴斯德酵母(S.pastorianus)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、布拉氏酵母(S.boulardii)、卡尔酵母(S.carlsbergensis)、非酿酒酵母(S.kudriavzevii)和奇异酵母(S.paradoxus)；接合酵母(Zygosaccharomyces)；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces spp.)；解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；红曲霉属(Monascusspp.)(诸如红色红曲霉(M.rubber)、紫红曲霉(M.purpureus)、丛毛红曲霉(M.pilosus)、透明红曲霉(M.vitreus)和软毛红曲菌(M.pubigerus))；青霉菌属(Penicillium spp.)(诸如桔青霉(P.citrinum)、黄青霉(P.chrysogenum))；汉逊酵母属(Hansenula spp.)；戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)；菌寄生属(Hypomyces spp.)；导塔菌属(Dotatomyces spp.)(诸如发网菌(D.stemonitis))；东方伊萨酵母(Issatchenkoorientalis)；茎点霉属(Phoma spp.)；正青霉属(Eupenicillium spp.)；裸子囊菌属(Gymnoascus spp.)；拉巴毕赤酵母(Pichia labacensis)；异常毕赤酵母(Pichiaanomala)；异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)；卡氏念珠菌(Candidacariosilognicola)；拟青霉(Paecilomyces virioti)；短柄帚霉(Scopulariopsisbrevicaulis)；酒香酵母属(Brettanomyces spp.)，诸如普鲁氏酒香酵母(B.bruxellensis)、异酒香酵母(B.anomalus)、班图酒香酵母(B.custersianus)、纳氏酒香酵母(B.naardenensis)和南斯酒香酵母(Brettanomyces nanus)；布鲁塞尔德克酵母(Dekkera bruxellensis)；阿诺马德克酵母(Dekkera anoma)和木霉属(Trichodermaspp.)(诸如绿色木霉(T.viride))。

优选，在所述应用中，上述蛋白来源于黑曲霉(A.niger)。还优选，当上述蛋白是黑曲霉(A.niger)An08g10920或其直系同源物时，更特别地是，其中所述直系同源物选自下组：CAK45764.1/An08g10920,XP001393195.2/ANI1_1474074、EHA18674.1/Aspni5_176409、NP_001142237.1、GAA88109.1/AKAW_06223、EIT75413.1/Ao3042_08560、XP_001827205.1/AOR_1_298024、AO090010000170、XP_002384448.1/AFLA_117410、AFL2G_11427、XP_002148678.1/PMAA_091390、Aspfo1_0085419、Acar5010_212258、Acar5010_171837、Aspbr1_0068777、Asptu1_0164827，以及与An08g10920具有70％、更优选75％、更优选80％、更优选85％、更优选90％、更优选95％、更优选98％、更优选99％的百分比同一性的蛋白。

本发明的另一部分是一种用于转化微生物的载体，该载体包括编码如上定义的蛋白的核酸序列。本发明的又一部分是一种经上述载体转化的转基因生物体，或包括如上定义的异源柠檬酸合成酶的转基因生物体。

本发明还包括一种生产柠檬酸的方法，该方法包括使编码如上定义的柠檬酸合成酶的基因过表达。

在进一步优选的实施方式中，本发明包括一种生产衣康酸的方法，该方法包括：在适当的宿主细胞中，使编码如上定义的柠檬酸合成酶的基因过表达，并且使编码酶顺乌头酸脱羧酶(CAD)的基因过表达。

在本发明又一优选的实施方式中，本发明还包括一种生产柠檬酸的衍生物的方法，该方法包括：在适当的宿主细胞中，使编码如在权利要求1、2或3中任一项限定的柠檬酸合成酶的基因过表达，并且使编码能将柠檬酸转化成所述柠檬酸的衍生物的酶的一种或多种基因过表达。优选地，在上述方法中，所述一种或多种基因选自下组，所述组包括：An08g10860(脂肪酸合成酶β亚基)、An08g10870(2-甲基柠檬酸脱水酶，prpD)；An08g10880(GAL4；GAL4-样Zn2Cys6双核)、An08g10930(3-氧酰基-[酰基-载体-蛋白]合成酶)；An08g10970(MFS多药转运蛋白)；An08g10980(转录因子乙酸盐调节DNA结合蛋白facB)、An01g09950、An09g06220、An15g01780、An02g14730(细胞质prpD家族)’、An05g02230和An08g10530(细胞质顺乌头酸酶)、An02g12430、(非线粒体异柠檬酸脱氢酶)An04g06210(高柠檬酸合成酶)、An11g00510和An11g00530(柠檬酸裂解酶)。进一步优选地，在上述方法中，所述适当的宿主细胞是微生物或藻类，更优选是真菌或酵母或植物或藻类细胞，优选选自下组：曲霉属，更具体是黑曲霉(A.niger)、构巢曲菌(A.nidulans)、土曲霉(A.terreus)、棒曲菌(A.clavatus)、米曲霉(A.oryzae)或黄曲霉(A.flavus)，链孢霉(Neurospora spp.)，更具体是粗糙链孢霉(N.crassa)或白色链孢霉(N.tetrasperma)；核盘霉(Sclerotina)；赤霉菌(Gibberella)；盾壳霉(Coniothyrium)；皮斯特霉(Psiticum)；稻瘟病菌(Magnaporthe)；柄孢壳菌(Podospora)；毛壳菌(Chaetomium)；暗球腔菌(Phaeosphaeria)；孢盘菌(Botryotinia)；新萨托菌(Neosartorya)；核腔菌(Pyrenophora)；黍(Panicum)；褐潮藻(Aureococcus)；青霉菌(Penicillium)；木霉菌(Trichoderma)；粪壳菌(Sordaria)；炭疽菌(Colleotrichum)；轮枝孢菌(Verticillium)；节丛孢菌(Arthrobotrys)；丛赤壳(Nectria)；小球腔菌(Leptosphaeria)；镰刀菌(Fusarium)；小丛壳菌(Glomerella)；地丝霉(Geomyces)；毁丝霉(Myceliophthora)；毕赤酵母(Pichia)；酵母属(Saccharomycesspp.)，诸如巴斯德酵母(S.pastorianus)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、布拉氏酵母(S.boulardii)、卡尔酵母(S.carlsbergensis)、非酿酒酵母(S.kudriavzevii)和奇异酵母(S.paradoxus)；接合酵母(Zygosaccharomyces)；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)；克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces spp.)；解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；红曲霉属(Monascus spp.)(诸如红色红曲霉(M.rubber)、紫红曲霉(M.purpureus)、丛毛红曲霉(M.pilosus)、透明红曲霉(M.vitreus)和软毛红曲菌(M.pubigerus))；青霉菌属(Penicillium spp.)(诸如桔青霉(P.citrinum)、黄青霉(P.chrysogenum))；汉逊酵母属(Hansenula spp.)；戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)；菌寄生属(Hypomyces spp.)；导塔菌属(Dotatomyces spp.)(诸如发网菌(D.stemonitis))；东方伊萨酵母(Issatchenko orientalis)；茎点霉属(Phoma spp.)；正青霉属(Eupenicilliumspp.)；裸子囊菌属(Gymnoascus spp.)；拉巴毕赤酵母(Pichia labacensis)；异常毕赤酵母(Pichia anomala)；异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)；卡氏念珠菌(Candida cariosilognicola)；拟青霉(Paecilomyces virioti)；短柄帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)；酒香酵母属(Brettanomyces spp.)，诸如普鲁氏酒香酵母(B.bruxellensis)、异酒香酵母(B.anomalus)、班图酒香酵母(B.custersianus)、纳氏酒香酵母(B.naardenensis)和南斯酒香酵母(Brettanomyces nanus)；布鲁塞尔德克酵母(Dekkera bruxellensis)；阿诺马德克酵母(Dekkera anoma)和木霉属(Trichodermaspp.)(诸如绿色木霉(T.viride))；最优选，其中所述微生物选自由黑曲霉(Aspergillusniger)、酸曲霉(A.acidus)、塔宾曲霉(A.tubigensis)、米曲霉(A.oryzae)、白曲霉(A.kawachii)、黄曲霉(A.flavus)、酸曲霉(A.acidus)、碳黑曲霉(A.carbonarius)、巴西曲霉(A.brasiliensis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、马尔尼菲蓝状菌(Talaromycesmarneffei)、玉蜀黍(Zea mays)、异常毕赤酵母(Pichia anomala)和布鲁塞尔德克酵母(Dekkera bruxellensis)组成的组。

本发明还包括一种生产柠檬酸的衍生物的方法，优选其中所述衍生物是衣康酸，该方法包括：使编码如权利要求1、2或3中任一项限定的柠檬酸合成酶的基因，和编码参与衣康酸盐或其任意前体的产生或转运的蛋白的基因过表达；优选其中，所述基因选自顺乌头酸脱羧酶(CAD)、ATEG_09969.1、ATEG_09970.1和ATEG_09972.1的组。

在进一步优选的实施方式中，本发明包括如上定义的方法，其中，在厌氧条件下培养所述宿主细胞。或者，本发明包括如上定义的方法，其中，在作为N-源的硝酸盐的存在下，在厌氧条件下培养所述宿主细胞。

附图说明

图1：土曲霉(A.terreus)中衣康酸的假设生物合成途径。1、柠檬酸合成酶；2、乌头酸酶；3、顺乌头酸脱羧酶(衣康酸盐-形成)；4、顺乌头酸脱羧酶(柠康酸盐-形成)；5、柠康酸盐异构酶；6、线粒体二羧酸-三羧酸反向转运蛋白；7、线粒体三羧酸转运蛋白；8、二羧酸转运蛋白；9、2-甲基柠檬酸脱水酶。

图2：赖氨酸生物合成通路的示意图。

图3：五个曲霉(Aspergillus)物种的CitB基因簇的分析(以粉色示出citB基因)。从上至下，分别为黄曲霉(A.flavus)NRRL 3357、米曲霉(A.oryzae)RIB40/ATCC 42149、黑曲霉(A.niger)CBS 51388、黑曲霉(A.niger)ATCC 1015、酸曲霉(A.acidus)、炭黑曲霉(A.carbonarius)ITEM 5010。“黑色曲霉”，黑曲霉(A.niger)、酸曲霉(A.acidus)和炭黑曲霉(A.carbonarius)在citB基因周围的基因示出类似的成簇，而在米曲霉(A.oryzae)和黄曲霉(A.flavus)中的基因组区域仅含有citB(An08g10920)直系同源物以及An08g10880和An08g10930的直系同源物。对于土曲霉(A.terreus)(未示出)根本没有发现对应的基因簇。

图4：甲羟戊酸通路。

图5：曲霉(Aspergillus)表达载体pABgpd-I的核苷酸序列。

图6：黑曲霉(A.niger)CitB#99的葡萄糖消耗和有机酸的产生。

图7：黑曲霉(A.niger)CAD+MTT+MFS的葡萄糖消耗和有机酸的产生

图8：黑曲霉(A.niger)AB1.13CitB#99在甘油上的生长和衣康酸的产生。

图9：直系同源的citB柠檬酸合成酶样蛋白的氨基酸序列。

图10：A、曲霉(Aspergillus)柠檬酸合成酶样蛋白的同源树；B、黑曲霉(Aspergillus niger)、白曲霉(A.kawachii)、赤曲霉(A.ruber)的柠檬酸合成酶样蛋白的同源树。

具体实施方式

在本文中，“真菌”被定义为真核微生物，并且包括真菌亚门的所有物种(Alexopoulos,C.J.,1962,In:Introductory Mycology,John Wiley&Sons,Inc.,NewYork)。因此，术语真菌包括丝状真菌和酵母。在本文中，“丝状真菌”在此被定义为包括真菌亚门所有丝状形态的真核微生物。这些真菌的特征是由几丁质、纤维素和其他复合多糖构成的营养菌丝体。在本发明中使用的丝状真菌在形态、生理和基因方面与酵母是不同的。丝状真菌的营养生长是菌丝延长，而且大多数丝状真菌的碳代谢作用必须是需氧的。在本文中，“酵母”被定义为真核微生物，并且包括主要以单细胞形式生长的真菌亚门的所有物种。酵母可通过单细胞菌体出芽进行生长，或者可通过生物体分裂进行生长。

当提及蛋白或核酸分子时，术语“真菌的”指其氨基酸或核苷酸序列分别天然存在于真菌中的蛋白或核酸。

本发明的核心在于，发现了从草酰乙酸产生柠檬酸的新的替代的并行通路。最令人惊奇的是，所述柠檬酸的产生发生在线粒体外，可能发生在细胞质中。相应地，该途径即使在线粒体柠檬酸循环无活性的条件下也是有活性的，这意味着可在厌氧或低氧条件下，在没有活性TCA循环的情况下产生柠檬酸。此外，已显示出在静止期表达酶，这意味着可在没有产生生物体的任何生物质生长的情况下，实现柠檬酸的过表达。此外，之前的研究(Rafledge C.,2000,FEMS Microbiol.Lett.189(2):317-319；Ruijter G.et al.,2000,FEMS Microbiol.Lett.184(1):35-40；Murray,S.and Hynes,M.2010,Eukaryotic Cell 9(4):656-666)示出，对中央代谢(柠檬酸合成酶)进行的合理操作没有成功改进产物流，这与本发明获得的结果相反。

为了方便参考，在本说明书中将该酶称为柠檬酸合成酶B或citB-酶，或仅称为citB。

初始分离的citB基因来源于黑曲霉(Aspergillus niger)。但是，本发明还包括来源其他微生物的同源蛋白(也被称为直系同源物)，及编码这些同源蛋白的核苷酸序列。对于本领域技术人员来说清楚的是，基于编码黑曲霉(A.niger)的CitB酶的核苷酸序列，通过在对比中使用最小缺口大小，基于序列相似性和对比分析在NCBI GenBank中搜索数据库，可以很容易发现来自其他微生物物种的直系同源物。在表1a中示出这些直系同源物的列表。

表1a、在NCBI GenBank数据库发现的citB直系同源物和在曲霉物种(AspGD数据库，布罗得研究所(Broad institute))中的直系同源基因的列表。图9给出了这些基因的序列。

本发明的另一部分是上述序列经保守改变的变体或其多态变体的核苷酸序列。本领域技术人员会认识到，遗传密码的简并性使得多条多核苷酸能编码相同的氨基酸。可使用这样的“沉默变化”，例如来选择性杂交和检测本发明的核苷酸序列的等位基因变体。此外，本发明提供了分离的核苷酸序列，该分离的核苷酸序列包括上述核苷酸序列的一种或多种多态(等位基因)变体。本发明的又一部分是仍然编码具有与CitB酶的功能相同的生物功能的蛋白的多核苷酸，该多核苷酸是使用在严格条件下与上述核苷酸序列内的座位选择性杂交的引物对，从核苷酸库中扩增出来的产物。核苷酸中的引物长度选自由至少15至50组成的整数的组。本领域技术人员应认识到，可利用加长的引物序列来增加与靶序列结合(即退火)的特异性。在这一方面，严格条件意味着在温度为60℃至65℃之间，在含0.1％SDS的0.3强度的柠檬酸缓冲盐中进行反应，然后在相同温度下，使用含0.1％SDS的0.3强度的柠檬酸缓冲盐进行洗涤。

因此，本发明的另一部分是如下的多核苷酸，该多核苷酸与上述核苷酸序列的一种或多种在选择性杂交条件下进行选择性杂交，并且编码具有与本发明中公开的CitB酶的功能类似的生物功能的氨基酸序列。“与……CitB酶的功能类似的生物功能”指将草酰乙酸盐转化成柠檬酸盐的能力，并且是在线粒体外，在细胞质中进行这种转化。

指示杂交潜力的另一方式是序列同一性。从这个意义上来说，本发明还提供了与上述序列具有65％至95％同一性百分比的核苷酸序列。因此，例如，同一性百分比可以至少是65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。使用BLASTN计算机程序(是公开的，例如通过国家生物技术信息中心 (National Center for Biotechnological Information)，可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/因特网上获得)，使用字长(W)11、期望值(E)10、一对匹配残基的奖励分数5(M)、错配的惩罚分数-4(N)和截止点100的默认设置，来计算核苷酸序列的序列同一性。

类似的，可基于所述核苷酸序列编码的酶的氨基酸序列，来计算同源性。对于氨基酸，可通过BLASTP计算机程序(也可通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/获得)，来计算序列同一性。在氨基酸水平上，将同源物或直系同源物定义为具有与CitB酶类似的生物功能，并且与图3所示的黑曲霉(A.niger)CitB酶的氨基酸具有至少50％、优选至少55％、优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、更优选至少95％的序列同一性的氨基酸序列。

本发明进一步包括酶以及编码该酶的核苷酸序列，该酶具有功能性柠檬酸合成酶活性，但缺乏正常使它们在线粒体中表达或有功能的信号序列。本发明进一步包括的并且在根据本发明的citB定义内的是，其中信号序列被替换成黑曲霉(A.niger)citB酶(An08g10920)的信号序列的线粒体柠檬酸合成酶。如在实施例中所示，具有注释An01g09940和An09g03570的酶也缺乏线粒体信号蛋白部分。因此，设想这些蛋白以及这些蛋白的直系同源物也会具有与根据本发明的citB酶相同的限定。在下面的表1B中列出的这些酶及其直系同源物也示于图9中。

所有这些蛋白，和所限定的直系同源物和同源物都被认为涵盖在本文所使用的术语“citB蛋白”或“citB酶”中。

进一步预计，基因在实际上不产生或几乎不产生线粒体外柠檬酸的异源生物体内的过表达，能为这样的生物体提供在线粒体外并且优选在细胞质中表达柠檬酸的功能通路。优选在丝状真菌、酵母和/或细菌中完成这样的过表达，其中丝状真菌、酵母和/或细菌诸如，但并不限于：曲霉属(Aspergillus sp.)，诸如真菌土曲霉(A.terreus)、解乌头酸曲霉(A.itaconicus)、米曲霉(A.oryzae)和黑曲霉(A.niger)，玉米黑粉菌(Ustilago zeae)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)、黑粉菌属(Ustilago sp.)、假丝酵母属(Candida sp.)、被孢霉属(Mortierella sp.)、亚罗酵母属(Yarrowia sp.)、根霉属(Rgizopus sp.)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、红酵母属(Rhodotorula sp.)和担子菌(PseudozymaAntarctica)，细菌大肠杆菌(E.coli)和酵母酵母属(Saccharomyces sp)，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)，毕赤酵母属(Pichia sp)，例如毕赤氏巴斯德酵母(P.pastoris)或异常毕赤酵母(P.anomala)。植物细胞和藻类细胞和细胞培养物也可用作宿主。特别优选的是可在宿主生物体中得到丰富的底物草酰乙酸盐的异源性生物体。本发明中也能使用可厌氧生长、同时使用NO₃作为氮源的宿主，诸如酵母异常毕赤酵母(P.anomala)和布鲁塞尔德克酵母(Dekkera bruxellensis)。在这样的情况中，接受体硝酸盐可产生还原化合物，与氧在需氧发酵中产生还原化合物相同。类似地还有曲霉属真菌，诸如土曲霉(A.terreus)使用异化性硝酸盐还原作用可在非常低的氧水平下生长(Stief,P.,Fuchs-Ocklenburg,S.,Kamp,A.,Manohar,C.-S.,Houbraken,J.,Boekhout,T.,De Beer,D.,Stoeck,T.Dissimilatorynitrate reduction by Aspergillus terreus isolated from the seasonal oxygenminimum zone in the Arabian Sea(2014)BMC Microbiology,14(1),art.no.35)，从而能在这些条件下产生如本发明所述的有机酸。

进一步优选以下宿主生物体，仅次于异源性citB酶，该宿主生物体进一步含有其他特异性代谢柠檬酸的酶。非常适于此的通路之一是形成衣康酸的通路，其中，通过酶乌头酸酶或酶(2-甲基)柠檬酸脱水酶，从柠檬酸形成顺乌头酸，这些酶被认为在细胞质中有功能(参见图1)。可通过酶CAD实现衣康酸的产生，其中酶CAD提供顺乌头酸脱羧酶活性，从而将顺乌头酸转化成衣康酸。在WO 2009/014437中，描述了产生衣康酸的有利方法、其中使用的酶及其顺序和/或进行这一代谢通路的宿主。在本发明涉及产生衣康酸的方面，可通过调整调节蛋白的活性，对本发明进行进一步优化，该调节蛋白包括如可在还包括ATEG_09970的基因簇上发现的锌指和真菌特异性转录因子结构域，其中将该调节蛋白表示为ATEG_09969.1。进一步地，如在WO 2009/104958和WO 2009/11079中所描述的，编码转运衣康酸的主要促进超家族转运蛋白(MFST)基因序列(下面称为“衣康酸转运蛋白”)的核酸序列的过表达，增强了如本文所述的衣康酸盐的产生/转运。在这些参考文件中也可找到这些酶的序列。所述核酸优选包括土曲霉(Aspergillus terreus)的ATEG_09972.1序列，或与ATEG_09972.1的序列具有超过约70％、优选超过约80％、优选超过约90％序列同一性的核酸。甚至可通过将如在WO 2009/014437中所述的CAD基因的过表达，与二/三羧酸转运蛋白的过表达组合起来，来进一步优化这一过程，其中二/三羧酸转运蛋白能将顺乌头酸、柠檬酸盐或异柠檬酸盐从线粒体转运到细胞质中，优选由ATEG_09970.1的核酸序列编码的基因。该转运蛋白的过表达会增加细胞质中的顺乌头酸，顺乌头酸可进一步被转化成衣康酸(还参见WO 2009/104958)。相应地，异源性citB基因和选自二/三羧酸转运蛋白的组的基因的组合不仅有利于产生衣康酸盐，而且如上所述，还可提高其他柠檬酸盐衍生物的表达。

当然，理想情况是，可以将citB与上面限定的增强衣康酸产生的基因中一种或多种，优选与所有这些基因的组合进行应用，以协力促进衣康酸和/或其衍生物的产生和转运。

可使用本领域已知的为细胞提供重组核酸的方法，获得重组的宿主细胞。这些方法包括使用合适的质粒(也被称为载体)，对宿主细胞进行转化、接合(transconjugation)、转染或电穿孔，该合适的质粒包括与驱动表达的启动子序列可操作地连接的感兴趣的核酸构建体。优选使用如下面进一步限定的核酸构建体转化本发明的宿主细胞，并且本发明的宿主细胞可包括一个核酸构建体，但优选包括多个拷贝的核酸构建体。上述核酸构建体可维持游离状态，因此包括用于自主复制的序列，诸如ARS序列。合适的游离体核酸构建体可例如基于酵母2μ或pKD1(Fleer et al.,1991,Biotechnology 9:968-975)质粒。但是，上述核酸构建体优选以一个或多个拷贝的形式整合在宿主细胞的基因组中。所述构建体可通过非常规重组随机整合在宿主细胞的基因组中，但优选通过如在真菌分子遗传学领域公知的同源重组整合到宿主细胞的基因组中(例如参见WO 90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574和US 6,265,186)。

可通过本领域公知的方法，使用本发明的核酸构建体转化宿主细胞，以及对如上所述的本发明的真菌宿主细胞进行其他基因改造。这些方法例如根据标准指南是已知的，诸如Sambrook和Russel(2001)的“分子克隆：实验指南(第三版)(Molecular Cloning:ALaboratory Manual(3rd edition))，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，或F.Ausubel等人编辑的“最新分子生物学实验方法(Current protocols in molecular biology)”，绿色出版和威利国际科学(Green Publishing and Wiley Interscience)，纽约(New York)(1987)。真菌宿主细胞的转化和基因改造的方法可由例如EP-A-0635574、WO 98/46772、WO 99/60102和WO 00/37671获知。

另一方面，本发明涉及一种核酸构建体，该核酸构建体包括如上限定的编码CitB酶或其同源物或直系同源物的核苷酸序列，并且用于转化如上限定的宿主细胞。在该核酸构建体中，编码CitB蛋白的核苷酸序列优选与在如下限定的宿主细胞中控制和启动核苷酸序列转录的启动子可操作地连接。所述启动子优选能使CitB酶在宿主细胞中进行充分表达。在本发明的核酸构建体中有用的启动子包括天然提供CitB基因表达的启动子。此外，可使用组成型天然启动子和诱导型天然启动子，以及经基因工程改造的启动子。适于在本发明的宿主中驱动CitB基因表达的启动子包括例如：GAL7、GAL10或GAL 1、CYC1、HIS3、PGL、PH05、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI和A0X1。其他合适的启动子包括PDC、GPD1、PGK1、TEF、TDH、来自糖酵解基因(例如来自甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因)的启动子、编码核糖体蛋白的基因启动子、醇脱氢酶启动子(ADH1、ADH4等)、来自编码淀粉酶或纤维素酶(葡糖淀粉酶、TAKA-淀粉酶和纤维二糖水解酶)的基因的启动子。其他启动子，组成型启动子和诱导型启动子以及增强子或上游激活序列对于本领域技术人员来说是已知的。如果需要，可对本发明的核酸构建体中使用的启动子进行改造，以影响它们的控制特征。优选地，在CitB基因表达的核酸构建体中所使用的启动子，对于CitB蛋白在其中表达的宿主细胞来说是同源的。

在核酸构建体中，编码CitB酶的核酸序列的3’端优选可操作地连接转录终止子序列。优选，终止子序列在选择的宿主细胞中是可操作的。在任意情况中，终止子的选择都不是决定性的；例如，它可以来自任意真菌基因，来自非真菌的真核生物基因的终止子有时也可能起作用。转录终止序列进一步优选包括多聚腺苷酸化信号。

可选地，核酸构建体中可存在选择性标记物。如本文所使用的，术语“标记物”指编码能对含有该标记物的宿主细胞进行选择或筛选的性状或表型的基因。在真菌转化中，多种选择性标记物可供使用。合适的标记物包括：参与氨基酸或核苷酸代谢的营养缺陷型标记物基因，例如编码鸟氨酸转氨甲酰酶(argB)、乳清酸核苷-5'-脱羧酶(pyrG，URA3)或谷氨酰胺-胺基转移酶、吲哚甘油磷酸合成酶、磷酸核糖基邻氨基苯甲酸异构酶(trpC)的基因；或者，参与碳或氮代谢的营养缺陷型标记物基因，例如niaD或facA；以及，抗生素抗性标记物，诸如提供针对腐草霉素、博来霉素或新霉素(G418)的抗性的基因。优选，使用双向选择标记物，可同时进行阳性遗传选择和阴性遗传选择。这样的双向标记物的实例是pyrG(URA3)、facA和amdS的基因。由于它们的双向性，可从经转化的丝状真菌中去除这些标记物，同时使引入的重组DNA分子留在适当位置，以获得不含选择性标记物的真菌。EP-A-0635574中公开了这种MARKER GENE FREE^TM转化技术的要素，该文件通过引用并入本文中。在这些选择性标记物中，最优选使用显性且双向选择性标记物，诸如乙酰胺酶基因，如构巢曲菌(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)和黄青霉(P.chrysogenum)的amdS基因。除了它们的双向性之外，这些标记物还提供了以下优点：它们是显性选择性标记物，而显性选择性标记物的使用不需要突变体(营养缺陷型)菌株，而可直接在野生型菌株中使用。

可在本发明的核酸构建体中存在的其他可选元件包括，但并不限于，一种或多种前导序列、增强子、整合因子和/或报告基因、内含子序列、着丝粒、端粒和/或基质附着(MAR)的序列。本发明的核酸构建体可进一步包括用于自主复制的序列，诸如ARS序列。合适的游离体核酸构建体可例如基于酵母2μ或pKD1(Fleer et al.,1991,Biotechnology 9:968-975)质粒。或者，核酸构建体可包括用于整合的序列，优选通过同源重组进行整合的序列(参见例如WO98/46772)。因此，这样的序列可以是与宿主细胞基因组中的整合靶位点同源的序列。可以自身已知的方式提供本发明的核酸构建体，通常涉及诸如限制和连接核酸/核酸序列的技术，对此可参考标准手册，诸如Sambrook和Russel(2001)“分子克隆：实验指南(第三版)(Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd edition))，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)，或F.Ausubel等人编辑的“最新分子生物学实验方法(Currentprotocols in molecular biology)”，绿色出版和威利国际科学(Green Publishing andWiley Interscience)，纽约(New York)(1987)。

在又一方面上，本发明涉及发酵过程，在该发酵过程中，本发明的经转化的宿主细胞用于产生柠檬酸以及衍生自柠檬酸进一步代谢途径的产物。这样的发酵过程可以是需要发酵过程，但是因为酶位于线粒体外，可有利地利用限氧或厌氧的发酵过程。这样能使用许多仍然产生柠檬酸的可能的环境或条件。具体地，具有无活性TCA循环的环境，一般被认为与柠檬酸生产不相容。具体地，多种酵母种能通过发酵进行厌氧生长。为了维持合适的辅因子平衡，特别地，优选能使用NO₃的酵母菌株，例如布鲁塞尔德克酵母(Dekkerabruxellensis)和异常毕赤酵母(Pichia anomola)。发酵过程可以是深层发酵过程或者是固态发酵过程。

在固态发酵过程(有时被称为半固态发酵)中，经转化的宿主细胞在固体培养基上进行发酵，该固体培养基在不存在任何自由流动的物质的情况下，为真菌提供固定点。固体培养基中的水的含量可以是水的任意含量。例如，固体培养基可以是几乎干燥的，或者它可以是泥浆状的。本领域技术人员知道，术语“固态发酵”与“半固态发酵”是可以互换的。此前已经描述了各种各样的固态发酵装置(参见综述Larroche et al.,"SpecialTransformation Processes Using Fungal Spores and Immobilized Cells",Adv.Biochem.Eng.Biotech.,(1997),Vol55,pp.179；Roussos et al.,"Zymotis:A largeScale Solid State Fermenter",Applied Biochemistry and Biotechnology,(1993),Vol.42,pp.37-52；Smits et al.,"Solid-State Fermentation-A Mini Review,1998),Agro-Food-Industry Hi-Tech,March/April,pp.29-36)。这些装置落入两种类别，静态系统和搅拌系统(agitated system)的类别。在静态系统中，固体培养基在整个发酵过程中都是静止的。用于固态发酵的静态系统的实例包括烧瓶、皮氏培养皿、托盘、固床柱和烤箱。搅拌系统提供了在发酵过程中混合固体培养基的装置。搅拌系统的一个实例是转鼓(Larroche et al.,上述)。另一方面，在深层发酵过程中，通常在本领域公知的搅拌釜式发酵罐中，经转化的真菌宿主细胞在淹没在液体培养基中的同时进行发酵，但是也有其他类型的发酵罐，例如也可使用气举式发酵罐(参见例如US 6,746,862)。

在本发明中，优选是以分批或补料分批的方式进行的深层发酵过程。这意味着，持续注入含碳源和/或其他相关营养物的补料，以提高柠檬酸的产量。可例如以恒定速率进行，或在特定底物的浓度或发酵参数跌至某设定点以下时进行补料的注入。

还有一些发酵过程，在这些发酵过程中，真菌在所谓的生物膜工艺中生长在液相中的固体支撑物上。在这些条件下将存在氧限制，这意味着在这种情况下的代谢至少是部分厌氧的。生物膜已使用在水处理设施中很长一段时间了，其中将生物膜称为粘泥(slime)、衬垫(mat)或污泥(sludge)，但是迄今为止还没有看到有其他实际应用。这样，大部分可用的信息是关于细菌的，最近几年是关于酵母生物膜的。丝状真菌天然适于在表面上生长，而且在这些条件下，丝状真菌示出与在深层培养中不同的特殊的生理学行为。因此，根据上述概念，认为丝状真菌可能是形成生物膜的生物体。大部分附着的真菌的不同的生理学行为理论上对应于酶的较高产生和分泌，并且也对应于深层培养物中不存在的形态分化(Akao,T.et al.,Curr.Genet.41:275-281,2002；Biesebeke,R.et al.,FEMS YeastRes.2:245-248,2002)。在工业上，两种培养系统利用了这种形式的生长的优点：SSF和细胞固定化(Gutierrez-Correa,M.and Villena,G.,Rev.peru.Boil.10(2):113–124,2003)。一旦在宿主细胞中产生了柠檬酸，该柠檬酸就可用作进一步代谢过程的底物。这些代谢过程之一是衣康酸的产生。对此，必须经由酶乌头酸酶和CAD(顺乌头酸脱羧酶)，进行柠檬酸经由顺乌头酸至衣康酸的转化。在WO2009/014437、WO 2009/104958和WO 2009/110796中，描述了额外提高从顺乌头酸产生衣康酸的这种转化和进一步的方法。

仅紧接着至衣康酸的通路，柠檬酸也可用作其他代谢途径的起始点。商业上最感兴趣的途径之一是甲基丙烯酸的产生。可通过衣康酸的脱羧基作用直接产生甲基丙烯酸，但也可以通过其他代谢途径产生甲基丙烯酸(参见Carlsson,M.et al.,Ind.Eng.Chem.Res.33:1989-1996,1994)。柠檬酸也是脂肪酸和甘油三酸酯的生物合成中基础组成构件之一。脂肪酸形成能量的重要储存分子，该能量可随后使用，例如在脂肪酸已经用作生物柴油来源时使用。脂肪酸用作生物燃料的确切性质基本不相关性，因为所有类型的植物脂肪酸可用于该用途。当然，脂肪酸也可用作例如食物添加剂。这在必需脂肪酸(如亚油酸和α-亚麻酸)用于产生其他化合物，如生物可降解的塑料的情况中是特别重要的。

此外，柠檬酸可用作赖氨酸生物合成(经由高柠檬酸和高顺乌头酸)的起始点。图2给出了可用于将柠檬酸盐转化成赖氨酸的化学反应和通路的概观。

氨基乙二酸的生物合成的生产也需要这一通路，其中氨基乙二酸是青霉素和其他抗生素化合物的中间体。赖氨酸反过来可用作产生己内酰胺(参见US 2009/005532)的起始点，并且从那里开始来产生塑料(诸如尼龙-6，聚酰胺)。

进一步，柠檬酸盐可用作甲羟戊酸通路的前体(参见图4)。这样能产生萜类化合物。最后，柠檬酸盐(和乙酰CoA)可起到聚酮通路的前体的作用，这与脂肪酸的生物合成相似。沿着这样的途径所产生的聚酮类抗生素、抗真菌剂、细胞抑制剂、抗胆甾醇血药、抗寄生物剂、抗球虫剂、动物促生长剂和天然杀虫剂是商业上重要的化合物。

进一步发现，在存在citB基因的簇中，含有与柠檬酸盐参与其中的通路相关的其他基因。在存在于特定黑曲霉(A.niger)菌株中的citB(An08g10920)簇中，可发现以下基因：An08g10860(脂肪酸合成酶)、An08g10870(2-甲基柠檬酸脱水酶(prpD))、An08g10880(GAL4；GAL4-样Zn2Cys6双核)、An08g10930(3-氧化酰基-[酰基-载体-蛋白]合成酶，脂肪酸合成酶)、An08g10970(MFS多药转运蛋白)、An08g10980(转录因子乙酸盐调节DNA结合蛋白facB)。与citB的表达差不多，认为这些基因中的任一种的(过)表达对于增加细胞内柠檬酸盐的产生和夺取(usurpation)是特别有利的。

实施例

实施例1、在产生衣康酸的菌株中对酶的分析

下面表2中给出了在黑曲霉(Aspergillus niger)和酿酒酵母(S.cerevisiae)中属于酶分类柠檬酸合成酶、乌头酸酶和顺乌头酸酶脱羧酶的蛋白/基因的概述。对于黑曲霉(A.niger)中的所有成员，在WT菌株和产生衣康酸的菌株(如在WO 2009/014437中所述，通过携带来自土曲霉(A.terreus)的顺乌头酸脱羧酶的额外基因拷贝，进行CAD的转基因)中的RNA测序结果，给出表达分析的结果。这示出，在产生衣康酸的菌株中，高度诱导了An08g10920(暂时称为citB，编码柠檬酸合成酶，没有预测的线粒体定位)。这一基因在酿酒酵母(S.cerevisiae)中没有同源物。仅在密切相关的黑色曲霉(Aspergilli)中存在同源物(参见下面的基因组挖掘citB基因簇)。另外，来自黑曲霉(A.niger)的预测的细胞质顺乌头酸酶脱羧酶(prpD)基因之一，与citB聚集的An08g10870被高度诱导。而且，关系更远的典型的细胞质乌头酸酶An08g10530在CAD菌株中被诱导。

如常见的代谢通路所预测的，在酿酒酵母(S.cerevisiae)中，三种柠檬酸合成酶蛋白和单一的prpD基因都是线粒体的，同时两种顺乌头酸酶都是细胞质的。

表2、黑曲霉(A.niger)中的柠檬酸合成酶、乌头酸酶和顺乌头酸脱羧酶(prpD)的基因。粗体为在表达CAD菌株中诱导的基因。BG＝处于本底水平的表达值，因此比值的计算(R，表示为2LogR)是不相关的

从上表可以看出，两种黑曲霉(A.niger)蛋白明显定位在线粒体中(An09g09980和An15g01920)，两种黑曲霉(A.niger)基因定位在线粒体外(An01g09940和An08g10920)，一种蛋白的定位是未确定的(An09g03570)。

在同源树(参见图10)中，显示出基因同源性，也能区分出线粒体的柠檬酸合成酶与非线粒体的柠檬酸合成酶。

实施例2、与野生型菌株相比，黑曲霉(A.niger)CAD转化株的RNA序列分析

RNAseq是新的转录组学平台，能对mRNA进行直接测序。这意味着，不需要阵列，并且测量所有表达的RNA(非编码，非注释)。在下述发酵培养基中的摇瓶培养物在33℃生长46小时，从其中收获生物质样品。使用Trizol(Invitrogen)，从生物质样品中分离总RNA。将总RNA送至BaseClear(荷兰)。在进行随机mRNA测序之前，经由寡dT珠(Illumina TruSeq RNAsamp.prep)进行mRNA纯化，然后使用随机引物进行第一链的cDNA合成。进行连接物连接，添加120bp，然后进行～270bp凝胶分离(cDNA插入～150bp)。随后进行双末端(paired-end)测序，以得到Illumina HiSeq数据(28-29M读数/样品)。进行数据分析，以获得RNA-Seq比对的输出文件(*.clc、*,sam)和RNA-Seq表达表(*.csv、*.clc、*.xlsx)。将样品标准化的表达值表示为RKPM/样品(＝读数每千碱基外显子模型每百万映射的读数(Reads per Kilobaseof exon model per Million mapped reads)(Mortazavi et.al 2008))。对由限定RPKM值(Excel)(S<1被限定为S＝1)的“基底(Floor)”组成的TNO，进行数据分析。在引入“Floor”之后，在Excel(R＝Sx/Sref；2logR比率)中计算CAD转化株和野生型的表达值的差值。下面的表2中，提供了在紧挨柠檬酸合成酶基因周围的基因(可能属于假定柠檬酸合成酶/prpD基因簇)的RNAseq数据(计数和2logR比率)。AB1.13数据指WT黑曲霉(A.niger)宿主菌株，而AB1.13CAD指产生衣康酸的菌株(CAD)，该产生衣康酸的菌株(CAD)携带来自如在WO 2009/014437中所述的土曲霉(A.terreus)的顺乌头酸脱羧酶的额外的基因拷贝。黄色表示，示出类似表达谱的基因，因此表明这些基因是同一基因簇的一部分。注意到，低于100-200的RNAseq值代表非常低的表达。在相关的基因/基因簇中，仅citB簇(An08g10860-An08g1011030，在灰色背景中，为粗体且为斜体)在AB1.13CAD菌株中示出显著诱导的表达(表3)。其他含有柠檬酸合成酶、乌头酸酶和顺乌头酸脱羧酶基因(高亮的)的基因区域没有示出诱导(表3)。

表3、RNAseq分析

实施例3、从发酵样品和摇瓶样品中分离RNA

在不同的发酵条件下(参见表4)培养黑曲霉(A.niger)菌株。在New BrunswickScientific Bioflow 3000发酵罐中，进行5升受控的分批发酵。

除非另有说明，都使用下面的条件：

温度37℃

pH起始3.5设定点2.3

DO设定点第1天：75％

第2、3、4天：50％

随后几天：25％

预培养：在500ml折流爱伦美氏(Erlenmeyer)烧瓶中，100ml如在发酵培养基(10⁷孢子/ml)中使用的相同培养基，过夜，37℃，150rpm。

pH对照：4M KOH(碱)，1.5M H₃PO₄(酸)

止泡剂：Struktol(Schill&Seilacher)

发酵培养基的组成：

每升：2.36g NH₄SO₄，0.11g KH₂PO₄，2.08g MgSO₄*7H₂O，0.13g CaCl₂*2H₂O，0.074NaCl，0.2mg CuSO₄*5H₂O，5.5mg Fe(III)SO₄*7H₂O，0.7mg MnCl₂*4H₂O和1.3mg ZnSO₄*7H₂O和100g葡萄糖作为碳源。

所有培养基都制备在去矿物质的水中。

表4、黑曲霉(A.niger)菌株的发酵条件

对于摇瓶培养，使用上述的发酵培养基。培养物在33℃生长46小时，从中收获生物质样品。

使用Invitrogen的Trizol，从生物质样品中分离RNA。将等量的RNA(8微克)上样在RNA凝胶上，并且在GE Healthcare的Hybond N+膜上进行印迹。

实施例4、Northern分析

从RNAseq数据示出，与TNO-WT菌株相比，在TNO-CAD菌株中的在包括citB基因的基因簇中的几个基因被上调。

为了证实RNAseq结果并且分析不同的菌株和不同的发酵调节，进行了Northern分析。

设计引物，以通过PCR扩增上述基因簇(citB、MFS、citR和prpD，参见表5)的四个上调基因，以及其他感兴趣基因(gpdA、citA、CAD)的基因片段。使用PCR DIG ProbeSynthesis Kit(PCR DIG探针合成试剂盒)(Roche)，对基因片段进行标记。使用DIG-HighPrime DNA Labeling and Detection Starter Kit II(DIG-高引物DNA标记和检测起始子试剂盒II)(Roche)，进行杂交。

表5、用于Northern分析的引物

o5886-CitA正向	TGTTGTCGCCGTAGCCGAGC
		o5887-CitA反向	AGCTCCTCCCCAAGGCTCCC
o5888-CitB正向	GCGACGCGGTCCACCTCAAA
		o5889-CitB反向	GCACAGGACTGCCCAACCCC
o5890-An08g10880正向	GCTTCGCGGCCCATACTGCT
		o5891-An08g10880反向	TGAAGCTGCCAACACCCCGC
o5892-An08g10870正向	GATGGACGGCCACCCACTGC
		o5893-An08g10870反向	TGCGCTCCCTTCAGCAGCAC
o5894-An08g10970正向	GCAAAGGGTGCCAGGCCGAT
		o5895-An08g10970反向	CTGGGTGCTGGTCATCGCGG
cadA正向	GGTCTTAGCCGAGCAAGGC
		cadA反向	GCGACACTCATCTGCCCTG
gpdA正向	ATCGAGACCTACGAGGAGGG
		gpdA反向	CCGGGAGTTCCTGCGAAGG

对发酵样品的Northern分析的结果示于下面的表6中。

表6、Northern分析的结果

从Northern分析总结出，基因簇的基因表达示出低表达水平，或没有检测到表达，或低于检测极限。

实施例5、定量RT-PCR

Northern分析显示非常低的表达水平，最有可能低于方法的检测极限。因此，使用Superscript III platinum One Step Quantitative RT-PCR(Superscript III铂金一步定量RT-PCR)试剂盒(Life Technologies)分析citB基因的表达(参见表6)，进行定量RT-PCR。使用软件Primer Express 2.0(Applied Biosystems)，设计citB基因的引物-探针组合。为了将citB的表达水平与高表达的基因进行对比，还设计了gpdA的引物。对于citB和gpdA数据的标准化，还使用18S的引物进行了定量RT-PCR。在7500Fast Real time PCR系统(Applied Biosystems)上进行定量PCR。在这种方法中，分析从发酵实验的生物质分离出的总RNA(用于Northern分析中)。另外，分析了用于RNAseq实验的总RNA，并且分析了从新的摇瓶培养实验中生长的黑曲霉(A.niger)菌株分离的总RNA。在标准化的RT-qPCR结果可以看出，citB基因在特定条件下被诱导。对用于RNAseq的样品，RT-qPCR证实了RNAseq的结果。

实施例6、对citB基因簇的基因组挖掘

在表7中，给出了对citB基因簇进行基因组挖掘工作的结果。

序列获自NCBI。使用具有BLOSUM62矩阵和BLASTX的默认设置的BLASTX，进行比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi)。

表7、来自CitB基因组簇的基因的Blast结果

由此看来，可认为如在NP_001142237.1、GAA88109.1、XP_002384448.1、XP_001827205.1和XP_002148678.1中所示的基因是黑曲霉(Aspergillus niger)柠檬酸合成酶的直系同源物。

使用AspGD网站(布罗德研究所(Broad Institute))(http://aspgd.broadinstitute.org/cgi-bin/asp2_v3/shared/show_protein_cluster.cgi？site＝asp2_v8)上的搜索工具Sybil，来自多个基因组的直系同源物簇示于图3中。

进一步使用柠檬酸合成酶基因(An08g10920)，来搜索其他曲霉(Aspergillus)基因组中的直系同源物簇。在图3中可以看出，“黑色曲霉”黑曲霉(A.niger)(2个基因组)、酸曲霉(A.acidus)、塔宾曲霉(A.tubigensis)和巴西曲霉(A.brasiliensis)在citB基因周围的基因的类似的成簇，而在米曲霉(A.oryzae)和黄曲霉(A.flavus)中的基因组区域仅含有citB(An08g10920)的直系同源物以及An08g10880和An08g10930的直系同源物。对于土曲霉(A.terreus)，根本没有发现对应的基因簇。

实施例7A、黑曲霉(Aspergillus niger)中的A.niger citB基因的过表达

为了在黑曲霉(A.niger)中建立citB基因的过表达，生成由PCR生成的基因拷贝。为此，生成如下所示的两套引物。基于黑曲霉(A.niger)基因组DNA的PCR扩增得到PCR片段的分离，从该分离的PCR片段中，可分离出citB基因完整的编码区域作为BsmBI-NcoI片段。

citB基因组seq的翻译(1-1874)

通用密码子

概观(Overview)引物

citB-F1-6 ATCACTATGCCCGACATCGC 50.6℃

citB-F3-ATG+BsmBI CGTCTCCCATGCCCGACATCGCATCCAAC 63.3℃

citB-R1+1631 TGAGAGCGAAACTGCCTA 54.1℃

citB-R1+NcoI CCATGGTGAGAGCGAAACTGCCTA 54.1℃

citB-F3-ATG+BsmBI；29-mer；63.3℃

5'-CGTCTCCCATGCCCGACATCGCATCCAAC-3'引物

|||||||||||||||||||||

3'- TACGGGCTGTAGCGTAGGTTG-5'(21)链-

citB-F1-6；20-mer；50.6℃

5'-ATCACTATGCCCGACATCGC-3'引物

||||||||||||||

3'- TACGGGCTGTAGCG-5'(14)链-

citB-R1+NcoI；24-mer；54.1℃

5'-CCATGGTGAGAGCGAAACTGCCTA-3'引物

| | ||||||||||||||||||

3'-GTGGCTACTCTCGCTTTGACGGAT-5'(1614)链+

citB-R1+1631；18-mer；54.1℃

5'-TGAGAGCGAAACTGCCTA-3'引物

||||||||||||||||||

3'-ACTCTCGCTTTGACGGAT-5'(1614)链+

将得到的BsmBI-NcoI片段克隆到曲霉(Aspergillus)表达载体pABgpd-I(图5)的NcoI位点中。在该载体的衍生物中，还克隆了曲霉(Aspergillus)营养缺陷型选择标记物pyrG。

随后，使用citB过表达载体，对产生衣康酸的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株(Li,A.et al.,Appl.Microbial.Biotechnol.1-11,2013；Li,A.et al.FungalGenet.Biol.48:602-611,2011)进行转化。通过单一菌落纯化及对它们的PyrG+表型进行复验，纯化出PyrG+转化株。随后，将几株PyrG+转化株培养在摇瓶中，并且使用定量RT-PCR，分析摇瓶培养物中诱导的citB表达盒的表达。此外，进行Southern分析，以证实在转化株中存在表达盒的完整拷贝。

以分批发酵的方式，培养具有最大拷贝数和/或最高citB表达水平的转化株。之后，通过HPLC分析培养基样品中，由黑曲霉(A.niger)转化株产生的衣康酸的量。除此之外，还分析了其他有机酸(如柠檬酸和草酸)，因为这些有机酸与黑曲霉(Aspergillus niger)中假定的衣康酸盐产生通路相关。

培养条件

为了进行黑曲霉(A.niger)转化株的筛选和选择，使用了我们之前开发的筛选测定法(Li et al.2012)。在接种之后，所有平板都经氧渗透性膜(Sealing film sterile,breathable M20193,Dispolab the Netherlands)直接密封，放置在塑料气囊中，并且培养在33℃、850rpm培养箱(Microtron,Infos-ht)中60h。在培养结束时，收获培养基，用于进行HPLC分析。

对于摇瓶和受控的分批发酵，使用在我们之前的研究(Li et al.2012)中所述的具有以下组成的生产培养基(M12)(每升)：100g葡萄糖、2.36g(NH₄)₂SO₄、0.11g KH₂PO₄、0.5gMgSO₄·7H₂0、0.6mg FeSO₄·7H₂O、2.5mg CuSO₄·5H₂O、0.6mg ZnSO₄·7H₂O、0.074g NaCl和0.13g CaCl₂·2H₂O。将该培养基制备在去矿物质水中。生产培养基M12+Cu额外添加了2.5mgCuSO₄·5H₂O(0.01mM)。对于受控发酵，通过以10⁶孢子/毫升接种在两个500mL折流爱伦美氏烧瓶中的2×100-mL生产培养基中，来制备预培养物。在33℃且以125rpm摇动64h之后，预培养物用于进行发酵罐的接种。在33℃下，在5-L Benchtop发酵罐(BioFlo3000,NewBrunswick Scientific Co.,Inc.)中进行发酵。使基础pH体系起始于3.5，随后通过添加4MKOH(碱)被调节为2.3。在发酵过程的所有培养中，都使用Struktol作为止泡剂(Schill&Seilacher)。以0.25vvm[(vol.液体)^-1min^-1]的恒定流速，向生物反应器鼓入空气。在33℃，氧在培养基中的溶解度约为225μMol。将纯的空气注入(air sparging)校准为100％D.O.，而将纯的氮注入校准为0％D.O.。在基础D.O.体系中，从发酵起始将D.O.设置在100％。一旦因为菌丝体的生长而使D.O.水平降落至25％以下时，就自动增加搅拌器的搅拌，以使D.O.维持在25％。为了研究氧可利用性对衣康酸产生的影响，在整个发酵过程中，将菌株N201CAD的D.O固定在10％、15％、20％和25％，而将菌株HBD 2.5的D.O固定在5、10和20％。通过改变注入气体中空气/氮的混合物，来获得不同百分比的D.O.。

分析培养的转化株中，微板培养物中的柠檬酸和衍生物的存在。基于这些培养物，选择出几株衣康酸产生水平增加的转化株，以用于进一步的研究。

基于在微板筛选中获得的结果，将选择的转化株生长在如Li et al.,2012,2013所述的摇瓶培养物中，并且分析衣康酸的生产率和产量。

	衣康酸	衣康酸
			菌株	生产率(mg/L/hr)	产量(mg/g葡萄糖)摇瓶培养
培养
			CAD	7.8
CAD+citB#49	8.8
			CAD+citB#53	11.4
CAD+citB#71	10.4
			CAD+citB#84A	8.7
CAD MFS/MTT#48	17.9
			CAD MFS/MTT#49	31.2
CAD MFS/MTT#63	26.7
			受控发酵
CAD	8.9	30
			CAD	11.2
CAD+citB#53	15.4	42
			CAD MFS/MTT#8	20.9
CAD MFS/MTT#63	50.2

如所示，将citB基因引入到已经表达cadA的黑曲霉(A.niger)菌株中，导致了高分泌的衣康酸的生产率和产量。

将在WO 2009/104958和WO 2009/110796中所述的两种之前鉴定出的有机酸转运蛋白(MTT/MFS)引入到单一宿主菌株中，也导致提高的衣康酸的生产率。

实施例7B、在表达衣康酸基因簇的所有三种基因的宿主菌株中，黑曲霉(A.niger)citB的过表达

菌株构建

如在上面的实施例7A中的表中所示，在已经同时表达土曲霉(A.terreus)cadA、mfsA和mttA基因(在WO 2009/014437、WO 2009/104958和WO 2009/110796中已经描述了这些基因和菌株)的菌株(菌株CADMFSMTT#63或#49)中，使用用于对转化株进行选择的腐草霉素抗性标记物的共转化，引入黑曲霉(A.niger)citB表达载体。从得到的转化体中，选择出菌株CitB#99，用于进一步的分析。

发酵条件

在5升分批发酵罐(BioFlo 3000,New Brunswick Scientific Co.,Inc.)中，进行受控的分批培养。如之前Li et al.,2012所公开的，生产培养基由以下成分组成(每升)：100g葡萄糖、2.36g(NH₄)₂SO₄、0.11g KH₂PO₄、0.5g MgSO₄·7H₂O、0.6g FeSO₄·7H₂O、2.5mgCuSO₄·5H₂O、0.6mg ZnSO₄·7H₂O、0.074g NaCl和0.13g CaCl₂·2H₂O。将该培养基制备在去矿物质水中。将接种物制备为在500mL折流爱伦美氏烧瓶中的100-mL生产培养基中的1.0×10⁶孢子/mL。然后，将接种物在33℃孵育72小时，同时以125rpm进行摇动。在整个发酵过程中，使温度保持稳定在33℃。发酵起始于pH 3.5，之后通过添加4M KOH，被保持稳定在2.3。以1.25vvm[(vol.液体)^-1min^-1]恒定流速，向生物反应器鼓入空气。通过将纯空气注入生物反应器中，将系统校准为100％D.O.，而将纯氮注入校准为0％D.O.。在发酵的整个过程中，将D.O.保持为20％，这是通过在注入气体中应用空气和氮的各种混合物来实现的。使用Struktol(Schill&Seilacher)作为止泡剂。使用0.22μM过滤器(Applikon Biotechnology,USA)，每6小时自动取样一次。

HPLC分析

通过高效液相层析仪(HPLC)分析经过滤器除菌的发酵样品，以量化代谢物并且评定有机酸的产生。将样品上样到装备有Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad)的WATERS e2695分离模块上，，5mM H₂SO₄作为洗脱液。同时通过折光率检测器(WATERS 2414)和双波长检测器(WATERS UV/Vis 2489)，检测代谢物。使用Empower Pro作为处理数据的软件(Empower2软件，版权2005-2008,Waters Corporation,米尔福德(Milford),马萨诸塞州(Massachusetts),USA)。

结果

为了将CitB#99菌株的有机酸产生能力与AB1.13CAD+MTT+MFS菌株进行对比，进行受控的分批发酵。两种菌株的葡萄糖消耗和有机酸生产能力示于图6(CitB#99)和图7(AB1.13CAD+MTT+MFS)中。如在图6和图7中可以看出，CitB#99产生更多的衣康酸(较高的产量)并且具有较高的生产率。CitB#99生产高达25克/升的衣康酸，并且出乎意料地，没有产生柠檬酸。这示出，在我们的转化菌株中，柠檬酸至衣康酸的转化是非常有效的。进一步地，衣康酸得到改进的生产率是主要的进步；在发酵5天之后实现最大的产量，而AB1.13CAD+MTT+MFS菌株需要7天来实现约12克/升的最大产量。

实施例7C、在未加工的第二代原料的上的衣康酸生产

摇瓶培养物

在摇瓶中进行培养，以评定CitB#99菌株是否能生长在第二代原料，例如甘油上。对于本实验，从生物柴油生产厂中获取未加工的废弃甘油。在生物柴油的工艺中，作为废弃产物，产生含有甘油作为主要碳源的废弃产物。在500mL具有100mL体积的折流Erlenmeyer摇瓶中进行实验。通过将来自公司的10mL未加工的甘油添加到90mL去矿物质水中，来制备培养基。通过在500mL折流Erlenmeyer摇瓶中，在100mL生产培养基中以1.0×10⁶孢子/mL进行接种，并且在33℃且以125rpm摇动生长过夜，来制备预培养物。来自该预培养物的2mL用作接种体。

结果

为了评定CitB#99菌株是否能生长在第二代原料上，使用甘油作为C源进行了摇瓶培养(图8)。烧瓶在33℃孵育216小时。在图8中，可以看出在96小时之后开始出现甘油消耗，同时产生衣康酸。孵育最早的96小时似乎对生物体适应环境是必需的。这种现象可能部分是由以下事实引起：预培养物生长在生产培养基上，其中生产培养基具有葡萄糖作为C源，而不是甘油。衣康酸的生产水平可高达约1.5克/升，这表明该菌株在生长在第二代原料(诸如未加工的甘油)上时可产生衣康酸。对于进一步的目的，可将CitB#99菌株培养在受控的分批发酵中，以实现最佳的衣康酸生产。

实施例8、黑曲霉(A.niger)的citB基因和土曲霉(A.terreus)的cadA基因在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的过表达

为了在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中过表达黑曲霉(A.niger)的citB和土曲霉(A.terreus)的cadA，在Geneart(Life technologies Europe,布雷斯维克(Bleiswijk),荷兰)合成含有两个表达盒的表达载体。将编码黑曲霉(A.niger)citB蛋白的酵母(Saccharomyces)密码子优化基因插入到酵母(Saccharomyces)的gpd启动子和CYC1终止子之间。将编码土曲霉(A.terreus)CAD蛋白的酵母(Saccharomyces)密码子优化基因插入到酵母(Saccharomyces)的tef启动子和ADH1终止子之间。在两个表达盒之间，以反义方式放置了URA3标记物。完整的片段包围有URA3侧翼区域，以用于在酿酒酵母(Saccaromycescerevisiae)的URA3座位处进行整合。

5’URA3侧翼-GPD启动子-citB基因(对酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)优化的密码子)-CYC1终止子–URA3标记物-TEF启动子-CAD基因(对酿酒酵母(Saccaromycescerevisiae)优化的密码子)-ADH1终止子–3’URA3侧翼

使用BamHI-SstI，从合成的载体中分离出citB表达片段，并且克隆到经BamHI和SstI消化的pFL61酵母表达载体(ATCC77215；http://www.lgcstandards-atcc.org/ Products/All/77215.aspx；Minet M,et al.Complementation of Saccharomycescerevisiae auxotrophic mutants by Arabidopsis thaliana cDNA.Plant J.2:417-422,1992.)中。使用Acc65I-EcoRI分离出cadA表达片段，并且克隆到pFL61酵母表达载体中。使用在(Transformation of commercial baker’s yeast strains byelectroporation.,Gysler et al.,Biotechnology Techniques Vol 4No 4285-290(1990))中所述的电穿孔方案，将得到的citB和cadA表达载体转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株CEN.PK113-5D中。通过单一菌落纯化，纯化酵母转化株，并且使用PCR分析表达载体的存在。

随后，在需氧和厌氧条件下，以微量滴定板培养方式培养携带citB或cadA基因拷贝的转化株，并且使用HPLC分析有机酸的产生。在cadA表达菌株中，在厌氧和需氧条件下，在培养基中都检测到衣康酸的产生。

Claims

1.具有细胞质柠檬酸合成酶活性的蛋白在微生物或细胞的线粒体外异源性生产柠檬酸盐的应用，其中，所述蛋白选自NCBI登录号为CAK45764.1、XP_001389414.2、GAA91575.1、XP_001260993.1、XP_001481680.1、CBF79704.1、XP_002556968.1、XP_001275815.1、XP_002482831.1、XP_002485362.1、XP_001216503.1、EKV06554.1、EFQ27732.1、XP_002148678.1、EMR66249.1、EOD45286.1或EMR70107.1的蛋白。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述蛋白来源于黑曲霉A. niger。

3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述微生物是真菌或藻类，且所述细胞是植物或藻类细胞。

4.根据权利要求3所述的应用，所述真菌是酵母。

5.根据权利要求3所述的应用，其中，所述微生物选自下组：曲霉属Aspergillus spp.；链孢霉属Neurospora spp.；核盘霉Sclerotina；赤霉菌Gibberella；盾壳霉Coniothyrium；皮斯特霉Psiticum；稻瘟病菌Magnaporthe；柄孢壳菌Podospora；毛壳菌Chaetomium；暗球腔菌Phaeosphaeria；孢盘菌Botryotinia；新萨托菌Neosartorya；核腔菌Pyrenophora；黍Panicum；褐潮藻Aureococcus；青霉菌Penicillium；木霉菌Trichoderma；粪壳菌Sordaria；炭疽菌Colleotrichum；轮枝孢菌Verticillium；节丛孢菌Arthrobotrys；丛赤壳菌Nectria；小球腔菌Leptosphaeria；镰刀菌Fusarium；小丛壳菌Glomerella；地丝霉Geomyces；毁丝霉Myceliophthora；毕赤酵母Pichia；酵母属Saccharomyces spp.；接合酵母Zygosaccharomyces；粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe；克鲁维酵母菌属Kluyveromyces spp.；解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica；红曲霉属Monascus spp.；青霉菌属Penicillium spp.；汉逊酵母属Hansenula spp.；戴尔凯氏有孢圆酵母Torulasporadelbrueckii；菌寄生属Hypomyces spp.；导塔菌属Dotatomyces spp.；东方伊萨酵母Issatchenko orientalis；茎点霉属Phoma spp.；正青霉属Eupenicillium spp.；裸子囊菌属Gymnoascus spp.；拉巴毕赤酵母Pichia labacensis；异常毕赤酵母Pichia anomala；异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus；卡氏念珠菌Candida cariosilognicola；拟青霉Paecilomyces virioti；短柄帚霉Scopulariopsis brevicaulis；酒香酵母属Brettanomyces spp.；布鲁塞尔德克酵母Dekkera bruxellensis；阿诺马德克酵母Dekkeraanoma和木霉属Trichoderma spp.。

6. 根据权利要求5所述的应用，其中，所述曲霉属Aspergillus spp.选自黑曲霉A.niger、构巢曲菌A. nidulans、土曲霉A. terreus、棒曲菌A. clavatus、米曲霉A. oryzae或黄曲霉A. flavus。

7.根据权利要求5所述的应用，其中，所述链孢霉属Neurospora spp.选自粗糙链孢霉N. crassa或白色链孢霉N. tetrasperma。

8.根据权利要求5所述的应用，其中，所述酵母属Saccharomyces spp.选自巴斯德酵母S. pastorianus、酿酒酵母S. cerevisiae、布拉氏酵母S. boulardii、卡尔酵母S.carlsbergensis、非酿酒酵母S. kudriavzevii和奇异酵母S. paradoxus。

9.根据权利要求5所述的应用，其中，所述红曲霉属Monascus spp. 选自红色红曲霉M.rubber、紫红曲霉M. purpureus、丛毛红曲霉M. pilosus、透明红曲霉M. vitreus和软毛红曲菌M. pubigerus。

10.根据权利要求5所述的应用，其中，所述青霉菌属Penicillium spp.选自桔青霉P.citrinum、黄青霉P. chrysogenum。

11.根据权利要求5所述的应用，其中，所述导塔菌属Dotatomyces spp.是导塔发网菌D. stemonitis。

12.根据权利要求5所述的应用，其中，所述酒香酵母属Brettanomyces spp.选自普鲁氏酒香酵母B. bruxellensis、异酒香酵母B. anomalus、班图酒香酵母B. custersianus、纳氏酒香酵母B. naardenensis和南斯酒香酵母Brettanomyces nanus。

13.根据权利要求5所述的应用，其中，所述木霉属Trichoderma spp.是绿色木霉T.viride。

14.一种用于转化微生物的载体，包括编码如权利要求1至13中任一项限定的蛋白的核酸序列。

15.一种转基因生物体，所述转基因生物体经根据权利要求14所述的载体转化，或包括如在权利要求1至13中任一项限定的异源性柠檬酸合成酶，其中，所述转基因生物体是丝状真菌、酵母或细菌。

16.一种生产柠檬酸的方法，包括：在适当的宿主细胞中，使编码如在权利要求1至13中任一项限定的柠檬酸合成酶的基因过表达。

17.一种生产衣康酸的方法，包括：在适当的宿主细胞中，使编码如在权利要求1至13中任一项限定的柠檬酸合成酶的基因过表达，并且使编码酶顺乌头酸脱羧酶（CAD）的基因过表达。

18.一种生产柠檬酸的代谢物的方法，包括：在适当的宿主细胞中，使编码权利要求1至13中任一项限定的柠檬酸合成酶的基因过表达，并且使编码能将柠檬酸转化成所述柠檬酸的代谢物的酶的一种或多种基因过表达。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述一种或多种基因选自下组，所述组包括：An08g10860、An08g10870、An08g10880、An08g10930；An08g10970；An08g10980、An01g09950、An09g06220、An15g01780、An02g14730、An05g02230和An08g10530、An02g12430、An04g06210、An11g00510和An11g00530。

20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中，所述适当的宿主细胞是微生物或藻类。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述适当的宿主细胞是真菌或藻类，且所述细胞是植物或藻类细胞。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述适当的宿主细胞选自下组：曲霉属Aspergillus spp.；链孢霉属Neurospora spp.；核盘霉Sclerotina；赤霉菌Gibberella；盾壳霉Coniothyrium；皮斯特霉Psiticum；稻瘟病菌Magnaporthe；柄孢壳菌Podospora；毛壳菌Chaetomium；暗球腔菌Phaeosphaeria；孢盘菌Botryotinia；新萨托菌Neosartorya；核腔菌Pyrenophora；黍Panicum；褐潮藻Aureococcus；青霉菌Penicillium；木霉菌Trichoderma；粪壳菌Sordaria；炭疽菌Colleotrichum；轮枝孢菌Verticillium；节丛孢菌Arthrobotrys；丛赤壳菌Nectria；小球腔菌Leptosphaeria；镰刀菌Fusarium；小丛壳菌Glomerella；地丝霉Geomyces；毁丝霉Myceliophthora；毕赤酵母Pichia；酵母属Saccharomyces spp.；接合酵母Zygosaccharomyces；粟酒裂殖酵母Schizosaccharomycespombe；克鲁维酵母菌属Kluyveromyces spp.；解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica；红曲霉属Monascus spp.；青霉菌属Penicillium spp.；汉逊酵母属Hansenula spp.；戴尔凯氏有孢圆酵母Torulaspora delbrueckii；菌寄生属Hypomyces spp.；导塔菌属Dotatomycesspp.；东方伊萨酵母Issatchenko orientalis；茎点霉属Phoma spp.；正青霉属Eupenicillium spp.；裸子囊菌属Gymnoascus spp.；拉巴毕赤酵母Pichia labacensis；异常毕赤酵母Pichia anomala；异常威克汉姆酵母Wickerhamomyces anomalus；卡氏念珠菌Candida cariosilognicola；拟青霉Paecilomyces virioti；短柄帚霉Scopulariopsisbrevicaulis；酒香酵母属Brettanomyces spp.；布鲁塞尔德克酵母Dekkerabruxellensis；阿诺马德克酵母Dekkera anoma和木霉属Trichoderma spp.。

23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述曲霉属Aspergillus spp.选自黑曲霉A.niger、构巢曲菌A. nidulans、土曲霉A. terreus、棒曲菌A. clavatus、米曲霉A. oryzae或黄曲霉A. flavus。

24.根据权利要求22所述的方法，其中，所述链孢霉属Neurospora spp.选自粗糙链孢霉N. crassa或白色链孢霉N. tetrasperma。

25.根据权利要求22所述的方法，其中，所述酵母属Saccharomyces spp.选自巴斯德酵母S. pastorianus、酿酒酵母S. cerevisiae、布拉氏酵母S. boulardii、卡尔酵母S.carlsbergensis、非酿酒酵母S. kudriavzevii和奇异酵母S. paradoxus。

26.根据权利要求22所述的方法，其中，所述红曲霉属Monascus spp.选自红色红曲霉M. rubber、紫红曲霉M. purpureus、丛毛红曲霉M. pilosus、透明红曲霉M. vitreus和软毛红曲菌M. pubigerus。

27. 根据权利要求22所述的方法，其中，所述青霉菌属Penicillium spp.选自桔青霉P. citrinum、黄青霉P. chrysogenum。

28.根据权利要求22所述的方法，其中，所述导塔菌属Dotatomyces spp.是导塔发网菌D. stemonitis。

29.根据权利要求22所述的方法，其中，所述酒香酵母属Brettanomyces spp.选自普鲁氏酒香酵母B. bruxellensis、异酒香酵母B. anomalus、班图酒香酵母B. custersianus、纳氏酒香酵母B. naardenensis和南斯酒香酵母Brettanomyces nanus。

30.根据权利要求22所述的方法，其中，所述木霉属Trichoderma spp.是绿色木霉T.viride。

31.根据权利要求20所述的方法，其中，所述微生物选自由黑曲霉Aspergillus niger、酸曲霉A. acidus、塔宾曲霉A.tubigensis、米曲霉A. oryzae、白曲霉A. kawachii、黄曲霉A. flavus、酸曲霉A. acidus、碳黑曲霉A. carbonarius、巴西曲霉A. brasiliensis、酿酒酵母S.cerevisiae、马尔尼菲蓝状菌Talaromyces marneffei、玉蜀黍Zea mays、异常毕赤酵母Pichia anomala和布鲁塞尔德克酵母Dekkera bruxellensis组成的组。

32.根据权利要求17所述的方法，其中，所述编码酶顺乌头酸脱羧酶（CAD）的基因选自ATEG_09969.1、ATEG_09970.1和ATEG_09972.1。

33.根据权利要求16至19、21至31中任一项所述的方法，其中，在厌氧条件下培养所述宿主细胞。

34.根据权利要求16至19、21至31中任一项所述的方法，其中，在作为N-源的硝酸盐的存在下，在厌氧条件下培养所述宿主细胞。