KR20080069678A

KR20080069678A - 재조합 효모에서 말산 생산

Info

Publication number: KR20080069678A
Application number: KR1020087013974A
Authority: KR
Inventors: 아론 아드리안 윈크렐르; 아브라함 프레데릭 데 훌스테르; 요하네스 피에테르 반 디즈켄; 자코버스 토마스 프론크
Original assignee: 테이트 앤 라일 인그리디언츠 아메리카스, 인코포레이티드
Priority date: 2005-11-21
Filing date: 2006-11-01
Publication date: 2008-07-28
Also published as: BRPI0620551A2; AU2006317058A1; CA2630333A1; WO2007061590A1; CN101365782A; JP2009516526A; US20080090273A1; EP1954799A1; WO2007061590A8

Abstract

재조합 효모가 기술되는데, 여기서 상기 효모는 피루브산 탈카르복시화효소 효소(pyruvate decarboxylase, PDC) 활성 네거티브(PDC-네거티브)이고, 피루브산 카르복시화효소(pyruvate carboxylase, PYC)(여기서, PYC는 시토졸에서 활성을 나타낸다); 말산 탈수소효소 효소(MDH)(여기서, MDH는 시토졸에서 활성을 나타내고 글루코오스의 존재 하에 비활성화되지 않는다)를 인코딩하는 코딩 영역; 및 말산 수송 단백질(MAE)을 인코딩하는 코딩 영역으로 기능적으로 형질전환된다. 또한, 탄소 공급원과 이산화탄소 공급원을 포함하는 배지에서 이런 효모를 배양하고 상기 배지로부터 말산을 분리함으로써 말산을 생산하는 방법이 기술된다.

재조합 효모

Description

재조합 효모에서 말산 생산{MALIC ACID PRODUCTION IN RECOMBINANT YEAST}

전반적으로, 본 발명은 미생물의 산업적 용도에 관계한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 효모에 의한 말산 또는 숙신산의 생산에 관계한다.

산업적 공정을 수행함에 있어 효모와 같은 미생물의 이용은 수천년 동안 유익하게 이용되어 왔고 수십년간 기술적 탐구의 과제이었다. 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae)와 같은 효모는 유기산(organic acid)을 비롯한 여러 상이한 소형 분자를 생산하는데 이용되고 있다.

하지만, 효모, 특히, 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae)로부터 생산하기 어려운 한 가지 유기산은 말산이다. 말산, C₄H₆O₅는 많은 신맛 식품, 예를 들면, 청색 사과와 와인에 시큼한 맛(tart taste)을 부여하는 디카르복시산 유기산(dicarboxylic organic acid)이다. 말산은 다양한 식품에서 이용되는 시큼함(tartness)의 공급원으로서 식품 가공 업계(food processing industry)에 이용된다. 이 시점에서, 효모에 의한 말산의 높은 수율 생산은 확인되지 않고 있다.

본 발명의 요약

한 구체예에서, 본 발명은 재조합 효모에 관계하는데, 상기 효모는 피루브산 탈카르복시화효소 효소(pyruvate decarboxylase, PDC) 활성 네거티브(PDC-네거티브)이고, 피루브산 카르복시화효소(pyruvate carboxylase, PYC)(여기서, PYC는 시토졸에서 활성을 나타낸다) 또는 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate, PEP) 카르복시화효소(여기서, PEP 카르복시화효소는 말산염(malate), 아스파르트산염(aspartate), 옥살로아세트산염(oxaloacetate)에 의한 저해에 무감하다)를 인코딩하는 코딩 영역; 말산 탈수소효소 효소(MDH)(여기서, MDH는 시토졸에서 활성을 나타내고 글루코오스의 존재 하에 비활성화되지 않는다)를 인코딩하는 코딩 영역; 및 말산 수송 단백질(MAE)을 인코딩하는 코딩 영역으로 기능적으로 형질전환된다.

다른 구체예에서, 본 발명은 말산 또는 숙신산을 생산하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: 탄소 공급원과 이산화탄소 공급원을 포함하는 배지에서 재조합 효모를 배양하는 단계, 여기서 상기 효모는 피루브산 탈카르복시화효소 효소(pyruvate decarboxylase, PDC) 활성 네거티브(PDC-네거티브)이고, 피루브산 카르복시화효소(pyruvate carboxylase, PYC)(여기서, PYC는 시토졸에서 활성을 나타낸다) 또는 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate, PEP) 카르복시화효소(여기서, PEP 카르복시화효소는 말산염(malate), 아스파르트산염(aspartate), 옥살로아세트산염(oxaloacetate)에 의한 저해에 무감하다)를 인코딩하는 코딩 영역; 말산 탈수소효소 효소(MDH)(여기서, MDH는 시토졸에서 활성을 나타내고 글루코오스의 존재 하에 비활성화되지 않는다)를 인코딩하는 코딩 영역; 및 말산 수송 단백질(MAE)을 인코딩하는 코딩 영역으로 기능적으로 형질전환된다; 상기 배지로부터 말산 또는 숙신을 분리하는 단계.

아래의 도면은 본 발명의 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 측면을 더욱 예시하기 위하여 포함된다. 본 발명은 본 명세서에 제시된 특정 구체예의 상세한 설명과의 조합으로 이들 도면 중에서 하나이상을 참조하면 더욱 명백하게 이해될 수 있다.

도 1에서는 실시예 1에 기술된 바와 같이, 배양 시간(culture time)의 함수로서 글루코오스와 피루브산염 농도를 도시한다.

도 2에서는 실시예 1에 기술된 바와 같이, 배양 시간의 함수로서 말산염, 글리세롤, 숙신산염 농도를 도시한다.

도 3은 실시예 1에 기술된 바와 같이, 플라스미드 p426GPDMDH3의 지도이다.

도 4는 실시예 1에 기술된 바와 같이, 플라스미드 pRS2의 지도이다.

도 5는 실시예 1에 기술된 바와 같이, 플라스미드 pRS2△MDH3의 지도이다.

도 6은 실시예 1에 기술된 바와 같이, 플라스미드 YEplac112 SpMAE1의 지도이다.

도 7에서는 배치 A, 실시예 2에서 출발 생물체량(start biomass), 글루코오스의 소비, 피루브산염의 생산을 도시한다.

도 8에서는 배치 A, 실시예 2에서 말산염, 글리세롤, 숙신산염의 생산을 도시한다.

도 9에서는 배치 B, 실시예 2에서 출발 생물체량, 글루코오스의 소비, 피루브산염의 생산을 도시한다.

도 10에서는 배치 B, 실시예 2에서 말산염, 글리세롤, 숙신산염의 생산을 도시한다.

도 11에서는 배치 C, 실시예 2에서 출발 생물체량, 글루코오스의 소비, 피루브산염의 생산을 도시한다.

도 12에서는 배치 C, 실시예 2에서 말산염, 글리세롤, 숙신산염의 생산을 도시한다.

산업적 공정에 이용되는 당분야에 공지된 임의의 효모는 본 발명으로부터 이익을 얻는 당업자에 의한 통상적인 실험의 문제로써 본 발명에 이용될 수 있다. 형질전환되는 효모는 임의의 공지된 속과 종의 효모로부터 선택될 수 있다. 효모는 N. J. W. Kreger-van Rij, "The Yeasts," Vol. 1 of Biology of Yeasts, Ch. 2, A. H. Rose and J. S. Harrison, Eds. Academic Press, London, 1987. 한 구체예에서, 효모 속은 특히, 사카로마이세스(Saccharomyces), 지고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 데바로마이세스(Debaromyces), 나드소니아(Nadsonia), 리포마이세스(Lipomyces), 토룰롭시스(Torulopsis), 클로에케라(Kloeckera), 피치아(Pichia), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 트리고놉시스(Trigonopsis), 브레타노마이세스(Brettanomyces), 크립토코커스(Cryptococcus), 트리코스포론(Trichosporon), 오레오바시디움(Aureobasidium), 리포마이세스(Lipomyces), 파피아(Phaffia), 로도토룰라(Rhodotorula), 야로이야(Yarrowia), 또는 슈바니오마이세스(Schwanniomyces)일 수 있다. 다른 구체예에서, 효모는 사카로마이세스(Saccharomyces), 지고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 또는 피치아(Pichia) 종일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 효모는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다. 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)는 산업적 공정에 통상적으로 이용되는 효모이지만 본 발명은 이에 국한되지 않는다.

"재조합" 효모는 효모 내에서 자연적으로 발생하지 않는 핵산 서열 또는 내인성 핵산 서열의 부가적인 사본을 보유하는 효모인데, 여기서 상기 핵산 서열은 인위적으로 효모 또는 이의 조상 세포 내로 도입된다. 재조합 DNA 기술은 예로써, Sambrook et al., Molecular Genetics: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press에 널리 공지되어 있는데, 상기 문헌에서는 당분야에 널리 공지되어 있고 본 명세서에 논의된 다양한 기술과 관련된 추가적인 정보를 제공한다. 이러한 구체예에서, 상동성 및/또는 이질성 유전자의 코딩 영역은 상기 유전자를 보유하는 생물체로부터 분리된다. 이러한 생물체는 세균(bacterium), 원핵세포생물(prokaryote), 진핵세포생물(eukaryote), 미생물(microorganism), 진균류(fungus), 식물, 또는 동물일 수 있다.

이러한 코딩 영역을 포함하는 유전 물질은 임의의 공지된 기술에 의해 생물체의 세포로부터 추출될 수 있다. 이후, 코딩 영역은 임의의 적절한 기술에 의해 분리될 수 있다. 한 가지 공지된 기술에서, 이러한 코딩 영역은 첫째, 게놈 DNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리를 준비하고, 둘째, 예로써 코딩 영역과 최소한 부분적으로 상동하거나 상동할 것으로 생각되는 선택된 표지된 뉴클레오티드 프로브로 상기 라이브러리를 탐색함으로써 게놈 DNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리 내에서 코딩 영역을 확인하고, 코딩 영역의 발현이 이러한 코딩 영역을 포함하는 라이브러리 미생물(library microorganism)에 탐지가능한 표현형을 부여하는 지를 결정하고, 또는 PCR로 원하는 서열을 증폭함으로써 분리된다. 이러한 코딩 영역을 분리하기 위한 다른 공지된 기술 역시 이용될 수 있다.

본 명세서에서, "PDC-네거티브"는 van Maris, AJ.A., M.Ah. Luttik, A.A. Winkler, J.P. van Dijken, and J.T. Pronk. 2003에서 기술된 기존의 방법을 이용하는 경우에 0.005 마이크로몰(micromol)/min ㎎ 단백질^-1이하의 피루브산 탈카르복시화효소 활성을 보유하는 효모를 기술하는데 이용된다. 이런 효모는 본 명세서에서, "PDC 활성 없음"으로 지칭된다. 트레오닌 알돌라아제(threonine aldolase)의 과다생산은 글루코오스-배양된 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에서 피루브산 탈카르복시화효소의 생합성 역할을 우회한다(Appl. Environ. Microbiol. 69:2094-2099). 이런 효모는 본 명세서에서, "PDC 활성 없음"으로 지칭된다.

PDC-네거티브인 효모는 임의의 적절한 기술에 의해 분리되거나 가공될 수 있다. 유전적으로 다양한 효모의 대규모 출발 집단은 PDC-네거티브인 자연 변이체를 포함할 수 있다. 출발 집단은 돌연변이유발(mutagenesis) 또는 키모스탯-기초된 선별(chemostat-based selection)에 종속될 수 있다. 전형적인 PDC-파지티브 효모 균주는 (A) 효모 균주 내에서 발현될 수 있는 최소한 하나의 PDC 구조 유전자; (B) 효모 균주 내에서 발현될 수 있는 최소한 하나의 PDC 조절 유전자; (C) PDC 구조 유전자의 프로모터; (D) PDC 조절 유전자의 프로모터를 포함한다. PDC-네거티브 효모에서, (A)-(D) 중에서 하나이상이 (i) 돌연변이되거나, (ii) 교란되거나, 또는 (iii) 결실될 수 있다. (A)-(D) 중에서 하나이상의 돌연변이, 교란 또는 결실은 특정 구체예에서, 피루브산 탈카르복시화효소 활성의 부재에 기여할 수 있다.

한 구체예에서, PDC-네거티브 효모는 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주 TAM("탐지가능한 피루브산 탈카르복시화효소 활성이 없고, C₂ 탄소 공급원 독립성이고, 글루코오스 내성인 MATa pdcl(-6,-2)::loxP pdc5(-6,-2)::loxP pdc6(-6,-2)::loxP ura3-52" ura-효모)이다.

피루브산 카르복시화효소(PYC)는 피루브산염의 옥살로아세트산염으로의 전환을 촉매할 수 있는 임의의 효소(EC 6.4.1.1)일 수 있는데, 여기서 PYC는 시토졸에서 활성을 나타낸다. 효소는 본 출원의 제출 시점에 기존 문헌에서 피루브산 카르복시화효소로서 PYC의 정의에 포함되는 것으로 확인될 필요는 없다. 임의의 공급 생물체로부터 PYC가 이용될 수 있고, 이러한 PYC는 야생형이거나 야생형으로부터 변형될 수 있다. PYC는 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) 피루브산 카르복시화효소일 수 있다. 한 구체예에서, PYC는 SEQ ID NO: 1에 제공된 아미노산 서열에 최소한 75% 동일성을 보유한다. 한 구체예에서, PYC는 SEQ ID NO:1에 제공된 아미노산 서열에 최소한 80% 동일성을 보유한다. 한 구체예에서, PYC는 SEQ ID NO:1에 제공된 아미노산 서열에 최소한 85% 동일성을 보유한다. 한 구체예에서, PYC는 SEQ ID NO:1에 제공된 아미노산 서열에 최소한 90% 동일성을 보유한다. 한 구체예에서, PYC는 SEQ ID NO:1에 제공된 아미노산 서열에 최소한 95% 동일성을 보유한다. 다른 구체예에서, PYC는 SEQ ID NO:1에 제공된 아미노산 서열에 최소한 96% 동일성을 보유한다. 부가적인 구체예에서, PYC는 SEQ ID NO:1에 제공된 아미노산 서열에 최소한 97% 동일성을 보유한다. 또 다른 구체예에서, PYC는 SEQ ID NO:1에 제공된 아미노산 서열에 최소한 98% 동일성을 보유한다. 또 다른 구체예에서, PYC는 SEQ ID NO:1에 제공된 아미노산 서열에 최소한 99% 동일성을 보유한다. 또 다른 구체예에서, PYC는 SEQ ID NO:1에 제공된 아미노산 서열을 보유한다.

동일성은 ClustalW 프로그램과 이의 디폴트 수치(default value), 다시 말하면, DNA Gap Open Penalty = 15.0, DNA Gap Extension Penalty = 6.66, DNA Matrix = 동일성, Protein Gap Open Penalty = 10.0, Protein Gap Extension Penalty = 0.2, Protein matrix = Gonnet를 이용하여 수행된 서열 정렬(sequence alignment)에 의해 결정될 수 있다. 동일성은 ClustalW 설명서에 기술된 절차에 따라 산정될 수 있다: "쌍별 스코어는 정렬되는 서열의 각 쌍에 대하여 산정된다. 이들 스코어는 결과표에 표시된다. 쌍별 스코어는 비교되는 잔기(residue)의 총수(갭 위치는 제외된다)로 나눗셈된 최적 정렬(best alignment)에서 동일성의 총수로서 산정된다. 이들 스코어 둘 모두 초기에 동일성 스코어 비율로서 산정되고, 100으로 나눗셈하고 1.0으로부터 뺄셈함으로써 거리(distance)로 전환되어 부위(site)당 차이의 총수를 제공한다. 이들 최초 거리에서 복수 치환(multiple substitution)을 교정하지 않는다. 쌍별 스코어가 선택된 매트릭스와 갭에 무관하게 산정되기 때문에, 이는 특정 쌍의 서열에 대하여 항상 동일한 수치가 될 것이다."

코딩 영역은 생물체의 세포로부터 정제된 동일한 단백질의 서열과 실질적으로 동일한 단백질 서열을 인코딩하면 상기 생물체로부터 유래되는 것으로 간주된다.

한 구체예에서, 효모는 PYC의 대안으로 또는 PYC에 추가하여, 포스포에놀피루브산(PEP) 카르복시화효소를 인코딩하는 코딩 영역으로 형질전환될 수 있다(EC 4.1.1.38). PEP 카르복시화효소는 포스포에놀피루브산의 옥살로아세트산염으로의 전환을 촉매할 수 있는 임의의 효소일 수 있다. 효소는 본 출원의 제출 시점에 기존 문헌에서 PEP 카르복시화효소로서 PEP 카르복시화효소의 정의에 포함되는 것으로 확인될 필요는 없다. 임의의 공급 생물체로부터 PEP 카르복시화효소가 이용될 수 있는데, 이러한 PEP 카르복시화효소는 야생형이거나 야생형으로부터 변형될 수 있다. PEP 카르복시화효소는 말산염, 아스파르트산염, 옥살로아세트산염에 의한 저해에 무감하여야 한다. 대장균(E. coli) PEP 카르복시화효소는 말산염에 의해 저해되는 것으로 관찰되었다.

말산 탈수소효소 효소(MDH)는 옥살로아세트산염의 말산염으로의 전환을 촉진할 수 있는 임의의 효소(EC 1.1.1.37)일 수 있는데, 여기서 MDH는 시토졸에서 활성을 나타내고 글루코오스의 존재 하에 비활성화되지 않는다("말산염"과 "말산"은 하나의 특정한 이온 화학종(ionic species)으로 명시되는 경우를 제외하고 동의어로서 이용된다). 효소는 본 출원의 제출 시점에 기존 문헌에서 말산 탈수소효소로서 MDH의 정의에 포함되는 것으로 확인될 필요는 없다. "시토졸에서 활성"은 시토졸 내에 존재하는 상기 효소의 촉매 활성 형태(catalytically-active form)를 의미한다. "글루코오스의 존재 하에 비활성화되지 않는"은 상기 효소의 촉매 활성(catalytic activity)이 글루코오스가 부재할 때와 비교하여 글루코오스에 노출될 때 감소되지 않는다는 것을 의미한다. 임의의 공급 생물체로부터 MDH가 이용될 수 있는데, 이러한 MDH는 야생형이거나 야생형으로부터 변형될 수 있다. 한 구체예에서, MDH는 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) MDH1 또는 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) MDH3일 수 있다. 야생형 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) MDH2는 시토졸에서 활성을 나타내지만 글루코오스의 존재 하에 비활성화된다. 한 구체예에서, MDH는 시토졸에서 활성을 나타내고 글루코오스의 존재 하에 비활성화되지 않도록 변형된(유전 조작(genetic engineering), 번역후 수식(posttranslational modification), 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 기술에 의해) 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) MDH2일 수 있다. 한 구체예에서, MDH는 MDH를 효모의 시토졸로 표적할 수 있는 신호전달 서열을 보유하거나, 또는 MDH를 시토졸 이외의 효모의 세포내 영역(intracellular region)으로 표적할 수 있는 신호전다 서열이 부재한다. 한 구체예에서, MDH는 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) MDH3△SKL일 수 있는데, 여기서 MDH를 인코딩하는 코딩 영역은 MDH3을 페록시솜(peroxisome)으로 전형적으로 표적시키는, 야생형 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) MDH3의 카르복시-말단 SKL 잔기가 결실되도록 변형된다. 한 구체예에서, MDH는 SEQ ID NO:2에 제공된 아미노산 서열에 최소한 75% 동일성을 보유한다. 한 구체예에서, MDH는 SEQ ID NO:2에 제공된 아미노산 서열에 최소한 80% 동일성을 보유한다. 한 구체예에서, MDH는 SEQ ID NO:2에 제공된 아미노산 서열에 최소한 85% 동일성을 보유한다. 한 구체예에서, MDH는 SEQ ID NO:2에 제공된 아미노산 서열에 최소한 90% 동일성을 보유한다. 한 구체예에서, MDH는 SEQ ID NO:2에 제공된 아미노산 서열에 최소한 95% 동일성을 보유한다. 다른 구체예에서, MDH는 SEQ ID NO:2에 제공된 아미노산 서열에 최소한 96% 동일성을 보유한다. 부가적인 구체예에서, MDH는 SEQ ID NO:2에 제공된 아미노산 서열에 최소한 97% 동일성을 보유한다. 또 다른 구체예에서, MDH는 SEQ ID NO:2에 제공된 아미노산 서열에 최소한 98% 동일성을 보유한다. 또 다른 구체예에서, MDH는 SEQ ID NO:2에 제공된 아미노산 서열에 최소한 99% 동일성을 보유한다. 또 다른 구체예에서, MDH는 SEQ ID NO:2에 제공된 아미노산 서열을 보유한다.

말산 수송 단백질(MAE)은 세포막을 통하여 세포외 공간으로 효모의 시토졸로부터 말산염을 수송할 수 있는 임의의 단백질일 수 있다. 단백질은 본 출원의 제출 시점에 기존 문헌에서 말산 수송 단백질로서 MAE의 정의에 포함되는 것으로 확인될 필요는 없다. 임의의 공급 생물체로부터 MAE가 이용될 수 있는데, 이러한 MAE는 야생형이거나 야생형으로부터 변형될 수 있다. MAE는 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) SpMAE1일 수 있다. 한 구체예에서, MAE는 SEQ ID NO:3에 제공된 아미노산 서열에 최소한 75% 동일성을 보유한다. 한 구체예에서, MAE는 SEQ ID NO:3에 제공된 아미노산 서열에 최소한 80% 동일성을 보유한다. 한 구체예에서, MAE는 SEQ ID NO:3에 제공된 아미노산 서열에 최소한 85% 동일성을 보유한다. 한 구체예에서, MAE는 SEQ ID NO:3에 제공된 아미노산 서열에 최소한 90% 동일성을 보유한다. 한 구체예에서, MAE는 SEQ ID NO:3에 제공된 아미노산 서열에 최소한 95% 동일성을 보유한다. 다른 구체예에서, MAE는 SEQ ID NO:3에 제공된 아미노산 서열에 최소한 96% 동일성을 보유한다. 부가적인 구체예에서, MAE는 SEQ ID NO:3에 제공된 아미노산 서열에 최소한 97% 동일성을 보유한다. 또 다른 구체예에서, MAE는 SEQ ID NO:3에 제공된 아미노산 서열에 최소한 98% 동일성을 보유한다. 또 다른 구체예에서, MAE는 SEQ ID NO:3에 제공된 아미노산 서열에 최소한 99% 동일성을 보유한다. 또 다른 구체예에서, MAE는 SEQ ID NO:3에 제공된 아미노산 서열을 보유한다.

적절하게는, 원하는 효소를 인코딩하는 코딩 영역은 이러한 효소가 효모 내에서 생산되고 실질적으로 기능하도록 하는 방식으로 효모 내로 통합된다. 이런 효모는 본 명세서에서, "기능적으로 형질전환되는" 것으로 지칭된다.

이러한 효소 또는 단백질을 인코딩하는 코딩 영역이 생물체의 핵산으로부터 추출되거나 화학적 수단으로 합성되면, 이는 효모 내로의 형질전환(transformation)과 효모 내에서 발현을 위하여 준비될 수 있다. 최소한, 이는 코딩 영역의 벡터 내로의 삽입 및 벡터 상에서 발견되고 효모 내에서 활성을 나타내는 프로모터에 작동가능 연결(operable linkage)을 수반한다. 임의의 벡터(통합성(integrative), 염색체(chromosomal) 또는 에피솜(episomal))가 이용될 수 있다.

표적 숙주 내에서 활성을 나타내는 임의의 프로모터(상동성 또는 이질성; 구조성(constitutive), 유도성(inducible) 또는 억제성(repressible))가 이용될 수 있다. 이런 삽입은 원하는 위치에서 벡터를 "개방"하기 위한 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease)의 이용을 수반할 수 있는데, 상기 위치에서 프로모터에 작동가능한 연결이 가능하고, 이후 상기 위치 내로 코딩 영역이 결찰된다. 원하는 경우에, 벡터 내로 삽입에 앞서, 코딩 영역은 표적 생물체 내에 이용을 위하여 제조될 수 있다. 이는 표적 생물체의 코돈 이용(codon use)에 더욱 완전하게 일치하도록 코딩 영역 내에 이용되는 코돈을 변화시키거나; 코딩 영역의 전사 또는 번역, 또는 상기 코딩 영역의 mRNA 전사체의 안정성을 손상시킬 수 있는 코딩 영역 내에 서열을 변화시키거나; 또는, 당분야에 공지된 다른 가능한 제조물 중에서, 신호전달 펩티드(signaling peptide)를 인코딩하는 부분(단백질을 특정 위치(가령, 세포 기관(organelle), 세포 또는 세포 기관의 막, 또는 세포외 분비( extracellular secretion))로 지향시키는 코딩 영역에 의해 인코딩된 단백질의 영역)을 추가하거나 제거하는 과정을 수반할 수 있다.

코딩 영역이 변형되는 지에 상관없이, 코딩 영역이 벡터 내로 삽입되면, 이는 효모에서 활성을 나타내는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 알려져 있는 바와 같이, 프로모터는 인근 코딩 영역의 전사를 관리할 수 있는 DNA 서열이다. 앞서 기술된 바와 같이, 프로모터는 구조성, 유도성 또는 억제성일 수 있다. 구조성 프로모터는 인근 코딩 영역의 전사를 지속적으로 관리한다. 유도성 프로모터는 배지에 적절한 유도 분자(inducer molecule)의 추가에 의해 유도될 수 있는데, 이러한 유도 분자는 프로모터의 실체에 의해 결정될 것이다. 억제성 프로모터는 배지에 적절한 억제 분자(repressor molecule)의 추가에 의해 억제될 수 있는데, 이러한 억제 분자는 프로모터의 실체에 의해 결정될 것이다. 한 구체예에서, 프로모터는 구조성이다. 가령, 다른 구체예에서, 구조성 프로모터는 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) 삼탄당인산 이소메라아제(triosephosphate isomerase, TPI) 프로모터이다. 다른 구체예에서, 프로모터는 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) 글리세르알데히드-3-인산 탈수소화효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, isozyme 3) THD3 프로모터일 수 있다.

원하는 경우에, 종결 영역(terminator region)이 이용될 수 있다. 전형적인 종결 영역은 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) CYC1이다.

프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 영역을 포함하는 벡터는 효모에 이용하기 적합한 것으로 당분야에 공지된 다른 것들 중에서 플라스미드, 코스미드(cosmid), 또는 효모 인공 염색체(artificial chromosome)일 수 있다. 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 영역 이외에, 벡터는 다른 유전 요소(genetic element) 역시 포함할 수 있다. 가령, 벡터가 효모 게놈 내로 통합될 것으로 기대되지 않으면, 벡터는 복제 기점(origin of replication)을 포함할 수 있는데, 이러한 복제 기점은 벡터가 상기 벡터를 포함하는 효모의 자손 세포(progeny cell)로 전달될 수 있도록 한다. 효모 게놈 내로 벡터의 통합이 바람직하면, 벡터는 효모 게놈 내에서 관찰되는 서열에 상동한 서열을 포함할 수 있고, 또한 통합을 용이하게 할 수 있는 코딩 영역을 포함할 수 있다. 어떤 효모 세포가 형질전환되는 지를 결정하기 위하여, 벡터는 형질전환되지 않은 효모로부터 형질전환된 효모를 구별짓는 표현형, 예를 들면, 형질전환되지 않은 효모에 치명적인 항생제를 포함하는 배지에서 생존, 또는 형질전환되지 않은 효모가 물질대사하지 못하는 배지 성분의 산물로의 물질대사를 효모에 부여하는 선택가능 마커 또는 선별가능 마커를 포함할 수 있다. 이에 더하여, 벡터는 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 벡터 내에서 전형적으로 발견되는 다른 요소와 같은 다른 유전 요소를 포함할 수도 있다.

코딩 영역이 프로모터에 작동가능하게 연결된 벡터가 제조된 이후, 효모는 벡터로 형질전환될 수 있다(즉, 벡터가 효모 집단의 최소한 하나의 세포 내로 삽입될 수 있다). 효모 형질전환을 위한 기술은 널리 확립되어 있는데, 여기에는 특히, 전기천공(electroporation), 미세입자 충격(microprojectile bombardment), LiAc/ssDNA/PEG 방법이 포함된다. 형질전환된 효모 세포는 이후, 벡터 상에서 선별가능 또는 선택가능 마커의 이용으로 탐지될 수 있다. "형질전환된 효모"는 본질적으로, 앞서 정의된 "재조합 효모"와 동일한 의미를 갖는다. 형질전환된 효모는 형질전환 기술에 의해 벡터를 수용한 효모, 또는 이런 효모의 자손일 수 있다.

PYC, MDH, MAE와 관련하여, 본 발명으로부터 이익을 얻는 당업자는 유전자 코드(genetic code)의 축퇴성(redundancy)에 비추어, 특정 PYC 서열, MDH 서열, 또는 MAE 서열을 인코딩하는 다수의 잠재적 코딩 영역이 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 전형적인 PYC 코딩 영역은 SEQ ID NO:4로 제공된다; 전형적인 MDH 코딩 영역은 SEQ ID NO:5로서 제공된다; 전형적인 MAE 코딩 영역은 SEQ ID NO:6으로서 제공된다. 원하는 단백질 서열을 인코딩하는 임의의 코딩 영역은 통상적인 실험의 문제로써 이용될 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 특정 코돈("편향된 코돈(biased codon)")은 효모 내에서 다른 축퇴성 코돈보다 더욱 큰 상응하는 tRNA 도구를 보유하고, 따라서 효모 내에서 더욱 신속한 단백질 번역을 가능하게 한다.

또한, 당업자가 인지하는 바와 같이, 당분야에 공지된 다양한 조절 서열, 특히, 프로모터와 인핸서(enhancer)가 기능적으로 형질전환되는 효모의 제조와 이용에서 통상적인 실험의 문제로써 이용될 수 있다.

본 발명은 식물, 효모, 또는 다른 생물체에서 말산 중간물질 또는 말산의 생산을 위하여 공지된 경로의 효소에 한정되지 않는다.

다른 구체예에서, 본 발명은 말산 또는 숙신산을 생산하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: 탄소 공급원과 이산화탄소 공급원을 포함하는 배지에서 재조합 효모를 배양하는 단계, 여기서 상기 효모는 피루브산 탈카르복시화효소 효소(pyruvate decarboxylase, PDC) 활성 네거티브(PDC-네거티브)이고, 피루브산 카르복시화효소(pyruvate carboxylase, PYC)(여기서, PYC는 시토졸에서 활성을 나타낸다)를 인코딩하는 코딩 영역; 말산 탈수소효소 효소(MDH)(여기서, MDH는 시토졸에서 활성을 나타내고 글루코오스의 존재 하에 비활성화되지 않는다)를 인코딩하는 코딩 영역; 및 말산 수송 단백질(MAE)을 인코딩하는 코딩 영역으로 기능적으로 형질전환된다; 상기 배지로부터 말산 또는 숙신을 분리하는 단계.

효모 및 이의 코딩 영역은 앞서 기술된 바와 동일할 수 있다.

재조합 효모를 획득한 이후, 효모는 배지 내에 배양될 수 있다. 효모가 배양될 수 있는 배지는 이런 목적에 적합한 당분야에 공지된 임의의 배지일 수 있다. 배양 기술과 배지는 당분야에 널리 공지되어 있다. 한 구체예에서, 배양은 적절한 용기 내에서 수성 발효(aqueous fermentation)에 의해 수행될 수 있다. 효모 발효를 위한 전형적인 용기의 실례는 교반 플라스크(shake flask) 또는 생물반응기(bioreactor)이다.

배지는 특히, 글루코오스, 수크로오스, 프럭토오스, 락토오스, 갈락토오스, 또는 식물성 물질(vegetable matter)의 가수분해물(hydrolysate)과 같은 탄소 공급원을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 배지는 유기 또는 무기 분자로서 질소 공급원 역시 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 배지는 특히, 아미노산; 퓨린; 피리미딘; 옥수수 침지수(corn steep liquor); 효모 추출물; 단백질 가수분해물; 수용성 비타민, 예를 들면, B 복합 비타민; 또는 무기염, 예를 들면, Ca, Mg, Na, K, Fe, Ni, Co, Cu, Mn, Mo, 또는 Zn의 염화물, 염산염, 인산염, 포스페이트, 또는 황산염과 같은 성분 역시 포함할 수 있다. 효모 배양 또는 발효에 유용한 것으로 당업자에게 공지된 다른 성분 역시 포함될 수 있다. 배지는 완충될 수도 있지만 반드시 그럴 필요는 없다.

이산화탄소 공급원은 가스성 이산화탄소(이는 배지 위에 헤드스페이스(headspace)에 도입되거나, 또는 배지를 통하여 살포될 수 있다) 또는 탄산염(가령, 탄산칼슘(calcium carbonate))일 수 있다.

발효 과정 동안, 탄소 공급원은 효모에 의해 내재화되고 다수의 단계를 통하여 말산으로 전환된다. MAE의 발현은 이렇게 생산된 말산이 효모에 의해 배지 내로 분비될 수 있도록 한다. 전형적으로, 일정량의 탄소 공급원은 숙신산으로 전환되고, 일정량의 숙신산은 효모에 의해 배지 내로 분비된다.

전형적인 배지는 50 g/ℓ CaCO₃과 1 g/ℓ 요소를 포함하는 미네랄 배지이다.

배지 내에서 원하는 농도의 말산 또는 숙신산이 생산될 만큼 충분한 시간 동안 배양이 진행된 이후, 말산 또는 숙신산은 분리될 수 있다. 본 명세서에서, "분리된"은 유기산을 지칭하고, 효모 또는 배지의 최소한 하나의 다른 성분(다른 유기산 또는 상기 범주에 포함되지 않는 화합물)으로부터 유기산의 분리에 의해 더욱 높은 순도 상태로 되는 것을 의미한다. 한 구체예에서, 분리된 유기산은 최소한 95% 순수하다, 예를 들면, 최소한 99% 순수하다.

배지 내에 축적된 말산을 분리하기 위하여, 이러한 분리는 특히, 이온 교환 수지, 활성화된 탄소, 마이크로여과(microfiltration), 한외여과(ultrafiltration), 나노여과(nanofiltration), 액체-상 추출(liquid-liquid extraction), 결정화(crystallization), 또는 크로마토그래피(chromatography)의 이용과 같은 공지된 기술로 배지로부터 말산을 정제하는 단계를 포함할 수 있다.

숙신산의 분리는 동일한 방식으로 수행될 수 있다.

50 g/ℓ CaCO₃과 1 g/ℓ 요소를 포함하는 미네랄 배지 내에서 본 발명의 재조합 효모의 배양은 배지 내에서 최소한 1 g/ℓ의 말산(산으로서) 수준을 유도할 수 있다. 한 구체예에서, 이러한 배양은 배지 내에서 최소한 10 g/ℓ의 말산(산으로서) 수준을 유도할 수 있다. 다른 구체예에서, 이러한 배양은 배지 내에서 최소한 30 g/ℓ의 말산(산으로서) 수준을 유도할 수 있다.

효모가 배양 단계 동안 배지 내에 말산을 축적하면, 가급적, 말산의 농도는 안정화되거나 증가된다.

아래의 정의는 당업자가 본 발명의 상세한 설명을 이해하는데 도움을 주고자 제공된다.

"배경 수준을 초과하는 말산의 축적"은 본 명세서에서 기술된 절차를 이용한 결정에서 탐지불가능 수준을 초과하는 말산의 축적을 지칭한다.

"증폭"은 원하는 임의의 수단으로, 핵산 분자의 사본수를 증가시키거나, 또는 효소의 활성을 증가시키는 것을 지칭한다.

"코돈"은 특정 아미노산을 명기하는 3개의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.

"DNA 리가아제"는 이중-가닥 DNA의 두 조각을 공유 연결하는 효소를 지칭한다.

"전기천공"은 호스트 세포를 투과하여 이들 세포가 염색체외(extra-chromosomal) DNA를 흡수하도록 하는 짧은 고전압 DC 전하를 이용하는, 외래 DNA를 세포 내로 도입하는 방법을 지칭한다.

"엔도뉴클레아제"는 내부 위치에서 이중 가닥 DNA를 가수분해하는 효소를 지칭한다.

"발현"은 상응하는 mRNA를 산출하기 위한 유전자의 전사(transcription) 및 상응하는 유전자 산물, 다시 말하면, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 산출하기 위한 상기 mRNA의 번역을 지칭한다.

"기능적으로 연결된" 또는 "작동가능하게 연결된"은 코딩이나 구조 서열의 전사가 프로모터 또는 프로모터 영역에 의해 관리되는 방향과 거리에 존재하는 프로모터 또는 프로모터 영역 및 코딩이나 구조 서열을 지칭한다.

"유전자"는 염색체 DNA, 플라스미드 DNA, cDNA, 합성 DNA, 또는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 RNA 분자를 인코딩하는 다른 DNA, 또는 발현의 조절에 관여하는 코딩 서열에 접하는 영역을 지칭한다.

"게놈"은 호스트 세포 내에서 염색체와 플라스미드를 모두 포괄한다. 이런 이유로, 호스트 세포 내로 도입된 본 발명의 인코딩 DNA는 염색체에 통합되거나, 또는 플라스미드에 위치한다.

"이질성 DNA"는 수용자 세포(recipient cell)의 공급원과 상이한 공급원으로부터 DNA를 지칭한다.

"상동성 DNA"는 수용자 세포의 공급원과 동일한 공급원으로부터 DNA를 지칭한다.

"혼성화"는 염기 쌍(base pairing)을 통하여 상보성 가닥(complementary strand)과 결합하는 핵산 가닥의 능력을 지칭한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 내에서 상보성 서열이 서로 결합할 때 발생한다.

"배지"는 효모 또는 재조합 효모의 성장을 위하여 필요한 임의의 성분 및 아스코르브산(ascorbic acid)의 생산을 위한 하나이상의 전구체(precursor)를 포함하는, 효모의 화학적 환경을 지칭한다. 효모의 성장을 위한 성분 및 아스코르브산의 생산을 위한 전구체는 동일하거나 동일하지 않을 수 있다.

"개방해독틀(open reading frame, ORF)"은 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 인코딩하는 DNA 또는 RNA 영역을 지칭한다.

"플라스미드"는 DNA의 원형, 염색체외, 복제가능 조각을 지칭한다.

"중합효소 연쇄 반응(PCR)"은 하나의 핵산 서열의 복수 사본을 산출하는 효소 기술을 지칭한다. DNA 서열의 사본은 2개의 증폭기(amplimer) 사이에 DNA 중합효소를 왕복함으로써 제조된다. 이러한 증폭 방법의 기초는 증폭기를 변성하고 재-어닐링하며, 이후 측면에 접하는 증폭기 사이에 위치하는 영역 내에서 신장(extension)으로 새로운 DNA 가닥을 합성하는 온도 변화의 복수 주기이다.

"프로모터" 또는 "프로모터 영역"은 정확한 부위에서 전사의 출발을 위하여 필요한 RNA 중합효소 및/또는 다른 인자를 위한 인식 부위(recognition site)를 제공하여 메신저 RNA(mRNA)의 생산을 제어함으로써 코딩 서열의 발현을 제어하는, 통상적으로 상기 코딩 영역의 상류(5')에서 발견되는 DNA 서열을 지칭한다.

"재조합 세포" 또는 "형질전환된 세포"는 세포 내에서 자연적으로 발생하지 않는 핵산 서열 또는 내인성 핵산 서열의 부가적인 사본을 보유하는 세포인데, 여기서 상기 핵산 서열은 인위적으로 세포 또는 이의 조상 내로 도입된다.

"재조합 벡터" 또는 "재조합 DNA 또는 RNA 구조체"는 임의의 공급원으로부터 유래되고, 게놈 통합(genomic integration) 또는 자발적 복제(autonomous replication)가 가능하며, 하나이상의 서열이 기능적으로 작동가능 방식으로 연결된 핵산 분자를 포함하는 임의의 작인(agent), 예를 들면, 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 자기 복제 서열, 파지, 또는 선형이나 원형 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이런 재조합 구조체 또는 벡터는 DNA 서열이 기능적 mRNA로 전사되고, 상기 mRNA가 번역되거나 번역되지 않고, 이후 발현되도록 하는 방식으로, 5' 조절 서열 또는 프로모터 영역 및 선택된 유전자 산물에 대한 DNA 서열을 세포 내로 도입할 수 있다.

"제한 효소"는 이중 가닥 DNA 내에서 뉴클레오티드의 특정 서열을 인식하고 양쪽 가닥을 절단하는 효소를 지칭한다; 일명, 제한 엔도뉴클레아제. 절단은 전형적으로, 제한 부위 내에서 또는 인접한 부위에서 발생한다.

"선택가능 마커"는 발현되면 해당하는 핵산 서열을 보유하는 세포의 확인을 용이하게 하는 표현형을 공여하는 핵산 서열을 지칭한다. 선택가능 마커에는 독성 물질(가령, 암피실린(ampicillin), 카나마이신(kanamycin))에 대한 내성(resistance)을 공여하거나, 또는 영양 결핍(가령, 우라실(uracil), 히스티딘(histidine), 루이신(leucine))을 보충하는 것들이 포함된다.

"선별가능 마커"는 발현되면 가시적으로 구별되는 특징(가령, 색깔 변화, 형광)을 부여하는 핵산 서열을 지칭한다.

"전사"는 DNA 주형으로부터 RNA 사본을 생산하는 과정을 지칭한다.

"형질전환"은 외인성(exogenous) 핵산 서열(가령, 벡터, 플라스미드, 또는 재조합 핵산 분자)을 세포 내로 도입하는 과정을 지칭하는데, 여기서 상기 외인성 핵산은 염색체 내로 통합되거나 자가 복제할 수 있다. 형질전환된 세포, 또는 이런 세포의 후손은 "형질전환"되거나 또는 "재조합"된다. 이러한 외인성 핵산이 원하는 단백질을 인코딩하는 코딩 영역을 포함하고, 원하는 단백질이 형질전환된 효모 내에서 생산되고 실질적으로 기능하면, 이런 형질전환된 효모는 "기능적으로 형질전환된다."

"번역"은 메신저 RNA로부터 단백질의 생산을 지칭한다.

"수율"은 100으로 곱해진 소비된 탄소 공급원의 양(몰 또는 중량/부피)으로 나눗셈된 생산된 말산의 양(몰 또는 중량/부피)을 지칭한다.

효소의 "단위(unit)"는 효소 활성(enzymatic activity)을 지칭하고, 분당 전체 세포 단백질 ㎎당 전환되는 기질의 양(micromole)을 지시한다.

"벡터"는 핵산 서열을 호스트 세포 내로 운반하는 DNA 또는 RNA 분자(가령, 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지, 효모 인공 염색체, 또는 바이러스)를 지칭한다. 벡터 또는 이의 일부는 호스트 세포의 게놈 내로 삽입될 수 있다.

아래의 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 예시하기 위하여 포함된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 아래의 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 발명자에 의해 본 발명의 실시에서 충분히 기능하는 것으로 확인된 기술을 대표하고, 따라서, 이의 실시를 위한 바람직한 양식을 구성하는 것으로 간주될 수 있다. 하지만, 당업자는 본 명세서에 비추어, 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않으면서 본 명세서에 개시된 특정 구체예에서 다양한 변화가 달성될 수 있음을 인지할 것이다.

실시예 1

피루브산 카르복시화효소(PYC), 말산 탈수소효소(MDH), 말산염 수송 단백질(MAE)을 인코딩하는 유전자로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주 TAM(MATa pdcl(-6,-2)::loxP pdc5(-6,-2)::loxP pdc6(-6,-2)::loxP ura3-52(PDC-네거티브))로 시작하여 2가지 효모 균주를 작제하였다.

TAM 균주가 하나의 영양요구성 마커(auxotrophic marker)만을 보유하기 때문에, 영양요구성 마커를 갖는 하나이상의 플라스미드를 도입할 수 있도록 하기 위하여 TRP1 좌위를 파괴하고, RWB961(MATapdcl(-6,-2)::loxP pdc5 (-6,-2):;loxP pdc6(-6,-2)::loxP mutx uraS-52 trpl::Kanlox)을 산출하였다.

이용된 MDH와 PYC 유전자는 플라스미드 p426GPDMDH3(사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) THD3 프로모터와 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) CYC1 종결인자 사이에 MDH3△SKL 유전자를 보유하고 URA3 마커를 갖는 2μ 플라스미드, 도 3) 및 pRS2(사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) PYC2 유전자를 보유하고 URA3 마커를 갖는 2μ 플라스미드, 도 4) 내로 미리 클론되었다.

쉬조사카로마이세스 폼베(S. pombe) MAE를 보유하는 P_TDH3-SpMAE1 카세트는 YEplacl12(2μ, TRP1)와 YIplac204(통합, TRP1)로 재클론하여 YEplacl12SpMAE1(도 6)과 YIplac204SpMAE1(도시되지 않음)을 산출하였다.

PYC와 MDH 벡터를 제조하였다: pRS2MDH3△SKL(2μ, URA3, PYC2, MDH3△SKL)(도 5).

RWB961은 pRS2MDH3△SKL과 YEplac112SpMAE1(균주 1) 또는 pRS2MDH3△SKL과 YIplac204SpMAE1(균주 2)로 형질전환시켰다. 균주 1과 균주 2 둘 모두 PYC2와 MDH3△SKL을 과다발현하지만 MAE1에 대한 상이한 발현 수준을 보였는데, 발현 수준은 YEplac112SpMAE1(2μ-기초된)의 경우 세포당 대략 10-40개 및 YIplac204SpMAE1(통합된)의 경우 세포당 대략 1-2개의 플라스미드 사본수(copy number)에 비례하였다.

균주 1과 균주 2의 분리후, 0.04 g/ℓ 또는 0.4 g/ℓ의 각 균주는 100 ㎖ 미네랄 배지, 50 g/ℓ CaCO₃, 1 g/ℓ 요소를 포함하는 500 ㎖ 교반 플라스크에 도입하였다. 플라스크는 각 실험의 지속 동안 200 rpm에서 교반하였다. 각 배양 배지의 샘플은 다양한 시점에서 분리하고, 글루코오스, 피루브산염, 글리세롤, 숙신산염, 말산염의 농도를 결정하였다. 대략 90-160 hr후 대략 250 mM의 세포외 말산염 농도가 관찰되었다. 결과는 도 1-2에 도시된다.

이들 결과는 효모 물질대사 경로(metabolic pathway)에 아래와 같은 변형이 재조합 효모에 의한 높은 수준의 세포외 말산염 축적을 가능하게 한다는 것을 지시한다:

1. 피루브산염 유동을 피루브산 카르복시화효소 방향으로 지향시킨다(PDC 활성을 감소시킴으로써).

2. PYC를 과다발현함으로써 피루브산 카르복시화효소를 통한 유동을 증가시킨다.

3. PYC에 의해 형성된 옥살로아세트산염을 포획하는 높은 말산 탈수소효소 활성을 시토졸 내에 도입한다.

4. 말산염의 이출(export)을 용이하게 하기 위하여 이질성 말산 전달체를 도입한다.

도 2 역시 대략 50 mM의 세포외 숙신산염 농도가 앞서 기술된 말산염 생산과 동시에 산출될 수 있음을 도시한다.

실시예 2

발효조 시스템 내에서 말산염 생산에 대한 이산화탄소의 효과는 실시예 1에 기술된 바와 같이, PYC2, 시토졸 MDH3, 사카로마이세스 폼베(S. pombe) MAE1 전달체를 과다발현하는 TAM 균주(YEplac112SpMAE1)를 이용하여 조사하였다. 3가지 발효조 실험을 수행하였다:

A: 완전 호기성 조건 하에 배치 배양.

B: 완전 호기성 조건 하에, 70%/20%/10%의 N₂/O₂/CO₂의 혼합물과 함께 배치 배양.

C: 완전 호기성 조건 하에, 65%/20%/15%의 N₂/O₂/CO₂의 혼합물과 함께 배치 배양.

프로토콜

배지

미네랄 배지는 1 ℓ의 탈염수(demineralized water)당 100 g 글루코오스, 3 g KH₂PO₄, 0.5 g MgSO₂.7H₂O 및 Verduyn et al (Yeast 8: 501-517, 1992)에 따른 1 ㎖ 미량 원소 용액을 포함하였다. 110℃에서 20분간 배지의 가열 멸균(heat sterilization) 이후, Verduyn et al (Yeast 8: 501-517, 1992)에 따른 1 ㎖ 필터 멸균된 비타민 및 1 g 요소를 포함하는 용액을 1 ℓ당 추가하였다. 1 ℓ당 0.2 ㎖ 거품억제제(antifoam)(BDH)를 또한 추가하였다. CaCO₃은 추가하지 않았다.

발효조 배양

발효조 배양은 1 ℓ의 작업 용적(working volume)을 갖는 생물반응기(Applikon Dependable Instruments, Schiedam, The Netherlands)에서 수행하였다. pH는 2 M 수산화칼륨(potassium hydroxide)을 이용한 적정(titration)으로 pH 5.0에서 자동적으로 제어하였다. 3O℃에 유지된 온도는 Pt100-센서로 측정하고 가열 핑거(heating finger)를 통하여 물을 순환시킴으로써 제어하였다. 교반기 속도(stirrer speed)는 2개의 rushton 임펠러(impeller)를 이용하여 800 rpm에서 일정하게 유지시켰다. 호기성 조건의 경우에, 대기압(atmospheric pressure)에서 60% 초과의 공기 포화도(air saturation)로 용존-산소 농도(dissolved-oxygen concentration)를 유지하기 위하여 Brooks 5876 질량 유량계(mass-flow controller)(Brooks BV, Veenendaal, The Netherlands)이용하여 0.5 ℓ.min^-1의 기류(air flow)를 유지하였다.

배치 B와 C에서, 우수한 산소포화(oxygenation)를 유지하면서 10% 또는 15%의 증가된 이산화탄소 농도는 가압된 공기 79% N₂ + 21% O₂ 및 79% CO₂ + 21% O₂를 포함하는 가스 혼합물(Hoekloos, Schiedam, the Netherlands)을 혼합함으로써 달성되었다. Brooks 질량 유량계를 통하여 공급된 10% 또는 15% CO₂의 원하는 비율은 가압된 공기로, 0.5 ℓ/min의 고정된 전체 유속까지 보충하였다.

pH, DOT 및 KOH/H₂SO₄ 공급량(feed)은 온-라인 데이터 획득 & 제어 시스템(MFCS/Win, Sartorius BBI Systems)을 이용하여 연속적으로 모니터하였다.

오프-가스(off-gas) 분석

발효조 배양의 폐기 가스(exhaust gas)는 응축기(condenser)(2℃) 내에서 냉각하고 Perma Pure 건조기(타입 PD-625-12P)로 건조시켰다. 산소와 이산화탄소 농도는 Rosemount NGA 2000 가스 분석기로 결정하였다. 폐기 가스 유속은 Saga 디지털 유량계(Ion Science, Cambridge)로 측정하였다. 이산화탄소 생산과 산소 소비의 특정 비율(specific rate)은 van Urk et al (1988, Yeast 8: 501-517)에 기술된 바와 같이 산정하였다.

샘플 준비

생물체량(biomass), 기질과 산물 분석을 위한 샘플은 얼음 위에 집합시켰다. 발효 배양액(fermentation broth)의 샘플과 세포 없는 샘플(10분간 10.000 x g에서 원심분리로 제조됨)은 후기 분석을 위하여 -2O℃에서 보관하였다.

대사물질의 결정

HPLC-결정

당, 유기산과 폴리올의 결정은 Waters 2487 UV 검출기와 Waters 2410 굴절률 검출기(refractive index detector)에 결합된 HPX-87H Aminex 이온 배제 칼럼(300 X 7.8 ㎜, BioRad)(6O℃, 0.6 ㎖/min 5 mM H₂SO₄)이 구비된 Waters HPLC 2690 시스템을 이용하여 동시에 수행하였다.

효소 대사물질 결정

HPLC 치수를 검증하고 및/또는 분리 오류(separation error)를 배제하기 위하여, L-말산을 효소 키트(Boehringer-Mannheim, Catalog No. 0 139 068)로 결정하였다

건조 중량(dry weight)의 결정

배양액 내에서 효모의 건조 중량은 0.45 ㎛ 필터(Gelman Sciences) 상에서 5 ㎖의 배양액을 여과함으로써 결정하였다. 필요하면, 샘플은 5 내지 10 g.ℓ^-1의 최종 농도로 희석하였다. 필터는 사용에 앞서 그들의 건조 중량을 결정하기 위하여, 사용 이전에 최소한 24 시간동안 8O℃ 배양기 내에 유지시켰다. 샘플 내에서 효모 세포는 필터 상에 유지되고 10 ㎖의 탈염수로 세척되었다. 이후, 세포가 존속하는 필터는 20분간 50% 용량(capacity)에서 전자레인지(Amana Raderrange, 1500 Watt) 내에서 건조시켰다. 세포가 존속하는 건조된 필터는 2분간 냉각후 칭량하였다. 건 조 중량은 세포가 존속하는 필터의 중량으로부터 필터의 중량을 뺄셈함으로써 산정하였다.

흡광도(optical density)(OD ₆₆₀ )의 결정

효모 배양액의 흡광도는 4 ㎖ 큐벳(cuvet) 내에서 분광광도계(spectrophotometer): Novaspec II(Amersham Pharmasia Biotech, Buckinghamshire, UK)로 660 nm에서 결정하였다. 필요하면, 샘플은 희석하여 0.1 내지 0.3의 흡광도를 산출하였다.

배치 A: 완전 호기된 21% O₂(+ 79% N₂)

도 7과 8에서는 시간의 흐름에서 대사물질 형성을 도시한다. 균주당 하나의 대표적인 배치 실험의 결과가 도시된다. 반복 실험(replicate experiment)은 본질적으로 동일한 결과를 산출하였다. 도 7에서는 출발 생물체량(직사각형), 글루코오스의 소비(삼각형), 피루브산염의 생산(별표)을 도시한다. 도 8에서는 말산염(사각형), 글리세롤(위쪽 반원), 숙신산염(팔각형)의 생산을 도시한다. 도 8에 도시된 바와 같이, 효모는 24 hr후 대략 25 mM 말산염 및 48 hr후 대략 20 mM 숙신산염을 생산하였다.

배치 B: 10% CO₂ + 21% O₂(+ 69% N₂)

도 9와 10에서는 시간의 흐름에서 대사물질 형성을 도시한다. 도 9에서는 출발 생물체량(직사각형), 글루코오스의 소비(삼각형), 피루브산염의 생산(별표)을 도시한다. 도 10에서는 말산염(사각형), 글리세롤(위쪽 반원), 숙신산염(팔각형)의 생산을 도시한다. 도 10에 도시된 바와 같이, 효모는 24 hr후 대략 100 mM 말산염, 96 hr후 대략 150 mM 말산염, 96 hr후 대략 60 mM 숙신산염을 생산하였다.

배치 C: 15% CO₂ + 21% O₂(+ 64% N₂)

도 11과 12에서는 시간의 흐름에서 대사물질 형성을 도시한다. 도 11에서는 출발 생물체량(직사각형), 글루코오스의 소비(삼각형), 피루브산염의 생산(별표)을 도시한다. 도 12에서는 말산염(사각형), 글리세롤(위쪽 반원), 숙신산염(팔각형)의 생산을 도시한다. 도 12에 도시된 바와 같이, 효모는 24 hr후 대략 45 mM 말산염, 96 hr후 대략 100 mM 말산염, 96 hr후 대략 60 mM 숙신산염을 생산하였다.

본 발명에서 개시되고 청구된 모든 조성물과 방법은 본 명세서에 비추어 과도한 실험 없이 달성될 수 있다. 본 발명의 조성물과 방법이 바람직한 구체예의 관점에서 기술되긴 했지만, 본 발명의 개념, 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않는 변이가 본 명세서에 기술된 조성물 및 방법과 이런 방법의 단계에 적용될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 더욱 구체적으로, 동일하거나 유사한 결과를 달성하는 화학적으로 및 생리학적으로 관련된 특정 작용제(agent)가 본 명세서에 기술된 작용제를 대체할 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이와 같은 모든 유사한 대체물과 변형은 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 개념, 기술적 사상과 범위 내에 속하는 것으로 간주된다.

SEQUENCE LISTING <110> Winkler, Aaron A. de Hulster, Erik van Dijken, Johannes Pieter Pronk, Jacobus T. <120> MALIC ACID PRODUCTION IN RECOMBINANT YEAST <130> 2027.709000, 2007090 <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1180 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Met Ser Ser Ser Lys Lys Leu Ala Gly Leu Arg Asp Asn Phe Ser Leu 1 5 10 15 Leu Gly Glu Lys Asn Lys Ile Leu Val Ala Asn Arg Gly Glu Ile Pro 20 25 30 Ile Arg Ile Phe Arg Ser Ala His Glu Leu Ser Met Arg Thr Ile Ala 35 40 45 Ile Tyr Ser His Glu Asp Arg Leu Ser Met His Arg Leu Lys Ala Asp 50 55 60 Glu Ala Tyr Val Ile Gly Glu Glu Gly Gln Tyr Thr Pro Val Gly Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Ala Met Asp Glu Ile Ile Glu Ile Ala Lys Lys His Lys Val 85 90 95 Asp Phe Ile His Pro Gly Tyr Gly Phe Leu Ser Glu Asn Ser Glu Phe 100 105 110 Ala Asp Lys Val Val Lys Ala Gly Ile Thr Trp Ile Gly Pro Pro Ala 115 120 125 Glu Val Ile Asp Ser Val Gly Asp Lys Val Ser Ala Arg His Leu Ala 130 135 140 Ala Arg Ala Asn Val Pro Thr Val Pro Gly Thr Pro Gly Pro Ile Glu 145 150 155 160 Thr Val Gln Glu Ala Leu Asp Phe Val Asn Glu Tyr Gly Tyr Pro Val 165 170 175 Ile Ile Lys Ala Ala Phe Gly Gly Gly Gly Arg Gly Met Arg Val Val 180 185 190 Arg Glu Gly Asp Asp Val Ala Asp Ala Phe Gln Arg Ala Thr Ser Glu 195 200 205 Ala Arg Thr Ala Phe Gly Asn Gly Thr Cys Phe Val Glu Arg Phe Leu 210 215 220 Asp Lys Pro Lys His Ile Glu Val Gln Leu Leu Ala Asp Asn His Gly 225 230 235 240 Asn Val Val His Leu Phe Glu Arg Asp Cys Ser Val Gln Arg Arg His 245 250 255 Gln Lys Val Val Glu Val Ala Pro Ala Lys Thr Leu Pro Arg Glu Val 260 265 270 Arg Asp Ala Ile Leu Thr Asp Ala Val Lys Leu Ala Lys Val Cys Gly 275 280 285 Tyr Arg Asn Ala Gly Thr Ala Glu Phe Leu Val Asp Asn Gln Asn Arg 290 295 300 His Tyr Phe Ile Glu Ile Asn Pro Arg Ile Gln Val Glu His Thr Ile 305 310 315 320 Thr Glu Glu Ile Thr Gly Ile Asp Ile Val Ser Ala Gln Ile Gln Ile 325 330 335 Ala Ala Gly Ala Thr Leu Thr Gln Leu Gly Leu Leu Gln Asp Lys Ile 340 345 350 Thr Thr Arg Gly Phe Ser Ile Gln Cys Arg Ile Thr 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Leu Ala Gly 770 775 780 Ala Asp Val Val Asp Val Ala Ile Asn Ser Met Ser Gly Leu Thr Ser 785 790 795 800 Gln Pro Ser Ile Asn Ala Leu Leu Ala Ser Leu Glu Gly Asn Ile Asp 805 810 815 Thr Gly Ile Asn Val Glu His Val Arg Glu Leu Asp Ala Tyr Trp Ala 820 825 830 Glu Met Arg Leu Leu Tyr Ser Cys Phe Glu Ala Asp Leu Lys Gly Pro 835 840 845 Asp Pro Glu Val Tyr Gln His Glu Ile Pro Gly Gly Gln Leu Thr Asn 850 855 860 Leu Leu Phe Gln Ala Gln Gln Leu Gly Leu Gly Glu Gln Trp Ala Glu 865 870 875 880 Thr Lys Arg Ala Tyr Arg Glu Ala Asn Tyr Leu Leu Gly Asp Ile Val 885 890 895 Lys Val Thr Pro Thr Ser Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Gln Phe Met 900 905 910 Val Ser Asn Lys Leu Thr Ser Asp Asp Ile Arg Arg Leu Ala Asn Ser 915 920 925 Leu Asp Phe Pro Asp Ser Val Met Asp Phe Phe Glu Gly Leu Ile Gly 930 935 940 Gln Pro Tyr Gly Gly Phe Pro Glu Pro Leu Arg Ser Asp Val Leu Arg 945 950 955 960 Asn Lys Arg Arg Lys Leu Thr Cys Arg Pro Gly Leu Glu Leu Glu Pro 965 970 975 Phe Asp Leu Glu Lys Ile Arg Glu Asp Leu Gln Asn Arg 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ttacttgatt acatacataa acaagcccct cttttcttcc aaactcttgt 180 agcttactat ctgtggcccg tcatttgagt ttgatttttt tgccaattac tatattgcaa 240 aataaaggac agttactagg agagaaaata agggacatag agaacaaaat aaaatatgag 300 cagtagcaag aaattggccg gtcttaggga caatttcagt ttgctcggcg aaaagaataa 360 gatcttggtc gccaatagag gtgaaattcc gattagaatt tttagatctg ctcatgagct 420 gtctatgaga accatcgcca tatactccca tgaggaccgt ctttcaatgc acaggttgaa 480 ggcggacgaa gcgtatgtta tcggggagga gggccagtat acacctgtgg gtgcttactt 540 ggcaatggac gagatcatcg aaattgcaaa gaagcataag gtggatttca tccatccagg 600 ttatgggttc ttgtctgaaa attcggaatt tgccgacaaa gtagtgaagg ccggtatcac 660 ttggatcggc cctccagctg aagttattga ctctgtgggt gacaaagtct ctgccagaca 720 cttggcagca agagctaacg ttcctaccgt tcccggtact ccaggaccta tcgaaactgt 780 gcaagaggca cttgacttcg ttaatgaata cggctacccg gtgatcatta aggccgcctt 840 tggtggtggt ggtagaggta tgagagtcgt tagagaaggt gacgacgtgg cagatgcctt 900 tcaacgtgct acctccgaag cccgtactgc cttcggtaat ggtacctgct ttgtggaaag 960 attcttggac aagccaaagc atattgaagt tcaattgttg gctgataacc acggaaacgt 1020 ggttcatctt ttcgaaagag actgttctgt gcaaagaaga caccaaaaag ttgtcgaagt 1080 cgctccagca aagactttgc cccgtgaagt tcgtgacgct attttgacag atgctgttaa 1140 attagctaag gtatgtggtt acagaaacgc aggtaccgcc gaattcttgg ttgacaacca 1200 aaacagacac tatttcattg aaattaatcc aagaattcaa gtggagcata ccatcactga 1260 agaaatcacc ggtattgaca ttgtttctgc ccaaatccag attgccgcag gtgccacttt 1320 gactcaacta ggtctattac aggataaaat caccacccgt gggttttcca tccaatgtcg 1380 tattaccact gaagatccct ctaagaattt ccaaccggat accggtcgcc tggaggtcta 1440 tcgttctgcc ggtggtaatg gtgtgagatt ggacggtggt aacgcttatg caggtgctac 1500 tatctcgcct cactacgact caatgctggt caaatgttca tgctctggtt ctacttatga 1560 aatcgtccgt aggaagatga ttcgtgccct gatcgaattc agaatcagag gtgttaagac 1620 caacattccc ttcctattga ctcttttgac caatccagtt tttattgagg gtacatactg 1680 gacgactttt attgacgaca ccccacaact gttccaaatg gtatcgtcac aaaacagagc 1740 gcaaaaactg ttacactatt tggcagactt ggcagttaac ggttcttcta ttaagggtca 1800 aattggcttg ccaaaactaa 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atgtagctat caattcaatg tcgggcttaa cttcccaacc 2700 atcaattaat gcactgttgg cttcattaga aggtaacatt gatactggga ttaacgttga 2760 gcatgttcgt gaattagatg catactgggc cgaaatgaga ctgttgtatt cttgtttcga 2820 ggccgacttg aagggaccag atccagaagt ttaccaacat gaaatcccag gtggtcaatt 2880 gactaacttg ttattccaag ctcaacaact gggtcttggt gaacaatggg ctgaaactaa 2940 aagagcttac agagaagcca attacctact gggagatatt gttaaagtta ccccaacttc 3000 taaggttgtc ggtgatttag ctcaattcat ggtttctaac aaactgactt ccgacgatat 3060 tagacgttta gctaattctt tggactttcc tgactctgtt atggactttt ttgaaggttt 3120 aattggtcaa ccatacggtg ggttcccaga accattaaga tctgatgtat tgagaaacaa 3180 gagaagaaag ttgacgtgcc gtccaggttt agaattagaa ccatttgatc tcgaaaaaat 3240 tagagaagac ttgcagaaca gattcggtga tattgatgaa tgcgatgttg cttcttacaa 3300 tatgtatcca agggtctatg aagatttcca aaagatcaga gaaacatacg gtgatttatc 3360 agttctacca accaaaaatt tcctagcacc agcagaacct gatgaagaaa tcgaagtcac 3420 catcgaacaa ggtaagactt tgattatcaa attgcaagct gttggtgact taaataagaa 3480 aactgggcaa agagaagtgt 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tgaaaaaggc aagagtttca 1020 tcctagactc ttgagtcgac agct 1044 <210> 6 <211> 1336 <212> DNA <213> Schizosaccharomyces pombe <400> 6 gctctagaca tgggtgaact caaggaaatc ttgaaacaga ggtatcatga gttgcttgac 60 tggaatgtca aagcccctca tgtccctctc agtcaacgac tgaagcattt tacatggtct 120 tggtttgcat gtactatggc aactggtggt gttggtttga ttattggttc tttccccttt 180 cgattttatg gtcttaatac aattggcaaa attgtttata ttcttcaaat ctttttgttt 240 tctctctttg gatcatgcat gctttttcgc tttattaaat atccttcaac tatcaaggat 300 tcctggaacc atcatttgga aaagcttttc attgctactt gtcttctttc aatatccacg 360 ttcatcgaca tgcttgccat atacgcctat cctgataccg gcgagtggat ggtgtgggtc 420 attcgaatcc tttattacat ttacgttgca gtatccttta tatactgcgt aatggctttt 480 tttacaattt tcaacaacca tgtatatacc attgaaaccg catctcctgc ttggattctt 540 cctattttcc ctcctatgat ttgtggtgtc attgctggcg ccgtcaattc tacacaaccc 600 gctcatcaat taaaaaatat ggttatcttt ggtatcctct ttcaaggact tggtttttgg 660 gtttatcttt tactgtttgc cgtcaatgtc ttacggtttt ttactgtagg cctggcaaaa 720 ccccaagatc gacctggtat gtttatgttt gtcggtccac cagctttctc aggtttggcc 780 ttaattaata ttgcgcgtgg tgctatgggc agtcgccctt atatttttgt tggcgccaac 840 tcatccgagt atcttggttt tgtttctacc tttatggcta tttttatttg gggtcttgct 900 gcttggtgtt actgtctcgc catggttagc tttttagcgg gctttttcac tcgagcccct 960 ctcaagtttg cttgtggatg gtttgcattc attttcccca acgtgggttt tgttaattgt 1020 accattgaga taggtaaaat gatagattcc aaagctttcc aaatgtttgg acatatcatt 1080 ggggtcattc tttgtattca gtggatcctc ctaatgtatt taatggtccg tgcgtttctc 1140 gtcaatgatc tttgctatcc tggcaaagac gaagatgccc atcctccacc aaaaccaaat 1200 acaggtgtcc ttaaccctac cttcccacct gaaaaagcac ctgcatcttt ggaaaaagtc 1260 gatacacatg tcacatctac tggtggtgaa tcggatcctc ctagtagtga acatgaaagc 1320 gtttaagtcg acgcgt 1336 14

Claims

재조합 효모에 있어서, 상기 효모는 피루브산 탈카르복시화효소 효소(pyruvate decarboxylase, PDC) 활성 네거티브(PDC-네거티브)이고, 피루브산 카르복시화효소(pyruvate carboxylase, PYC)(여기서, PYC는 시토졸에서 활성을 나타낸다) 또는 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate, PEP) 카르복시화효소(여기서, PEP 카르복시화효소는 말산염(malate), 아스파르트산염(aspartate), 옥살로아세트산염(oxaloacetate)에 의한 저해에 무감하다)를 인코딩하는 코딩 영역; 말산 탈수소효소 효소(MDH)(여기서, MDH는 시토졸에서 활성을 나타내고 글루코오스의 존재 하에 비활성화되지 않는다)를 인코딩하는 코딩 영역; 및 말산 수송 단백질(MAE)을 인코딩하는 코딩 영역으로 기능적으로 형질전환되는 것을 특징으로 하는 재조합 효모.
청구항 1에 있어서, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 종인 것을 특징으로 하는 재조합 효소.
청구항 2에 있어서, 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주 TAM인 것을 특징으로 하는 재조합 효소.
청구항 1에 있어서, PYC는 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) 피루 브산 카르복시화효소이고, MDH는 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) MDH1 또는 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) MDH3이고, MAE는 분열 효모(Schizosaccharomyces pombe) SpMAE1인 것을 특징으로 하는 재조합 효소.
청구항 4에 있어서, MDH는 야생형 MDH를 인코딩하는 코딩 영역과 비교하여, MDH를 인코딩하는 코딩 영역의 변형에 의해 효모의 시토졸로 표적되는 것을 특징으로 하는 재조합 효소.
청구항 1에 있어서, PYC는 SEQ ID NO: 1에 최소한 75% 동일성을 보유하고, MDH는 SEQ ID NO:2에 최소한 75% 동일성을 보유하고, MAE는 SEQ ID NO:3에 최소한 75% 동일성을 보유하는 것을 특징으로 하는 재조합 효소.
청구항 6에 있어서, PYC는 SEQ ID NO: 1에 최소한 95% 동일성을 보유하고, MDH는 SEQ ID NO:2에 최소한 95% 동일성을 보유하고, MAE는 SEQ ID NO:3에 최소한 95% 동일성을 보유하는 것을 특징으로 하는 재조합 효소.
청구항 6에 있어서, PYC는 SEQ ID NO:1에 도시된 서열을 보유하고, MDH는 SEQ ID NO:2에 도시된 서열을 보유하고, MAE는 SEQ ID NO:3에 도시된 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 재조합 효소.
말산을 생산하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 생산 방법:

탄소 공급원과 이산화탄소 공급원을 포함하는 배지에서 재조합 효모를 배양하는 단계, 여기서 상기 효모는 피루브산 탈카르복시화효소 효소(pyruvate decarboxylase, PDC) 활성 네거티브(PDC-네거티브)이고, 피루브산 카르복시화효소(pyruvate carboxylase, PYC)(여기서, PYC는 시토졸에서 활성을 나타낸다) 또는 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate, PEP) 카르복시화효소(여기서, PEP 카르복시화효소는 말산염(malate), 아스파르트산염(aspartate), 옥살로아세트산염(oxaloacetate)에 의한 저해에 무감하다)를 인코딩하는 코딩 영역; 말산 탈수소효소 효소(MDH)(여기서, MDH는 시토졸에서 활성을 나타내고 글루코오스의 존재 하에 비활성화되지 않는다)를 인코딩하는 코딩 영역; 및 말산 수송 단백질(MAE)을 인코딩하는 코딩 영역으로 기능적으로 형질전환된다;

상기 배지로부터 말산을 분리하는 단계.
청구항 9에 있어서, 탄소 공급원은 글루코오스인 것을 특징으로 하는 생산 방법.
청구항 9에 있어서, 효모는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 종인 것을 특징으로 하는 생산 방법.
청구항 11에 있어서, 효모는 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주 TAM인 것을 특징으로 하는 생산 방법.
청구항 9에 있어서, 효모는 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) 피루브산 카르복시화효소를 인코딩하는 코딩 영역, 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) MDH1 또는 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) MDH3을 인코딩하는 코딩 영역 및 분열 효모(Schizosaccharomyces pombe) SpMAE1을 인코딩하는 코딩 영역으로 기능적으로 형질전환되는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
청구항 13에 있어서, MDH는 효모의 시토졸로 표적되는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
청구항 9에 있어서, 효모는 SEQ ID NO: 1에 최소한 75% 동일성을 보유하는 PYC를 인코딩하는 코딩 영역, SEQ ID NO:2에 최소한 75% 동일성을 보유하는 MDH를 인코딩하는 코딩 영역 및 SEQ ID NO:3에 최소한 75% 동일성을 보유하는 MAE를 인코딩하는 코딩 영역으로 기능적으로 형질전환되는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
청구항 9에 있어서, 효모는 SEQ ID NO: 1에 최소한 95% 동일성을 보유하는 PYC를 인코딩하는 코딩 영역, SEQ ID NO:2에 최소한 95% 동일성을 보유하는 MDH를 인코딩하는 코딩 영역 및 SEQ ID NO:3에 최소한 95% 동일성을 보유하는 MAE를 인코 딩하는 코딩 영역으로 기능적으로 형질전환되는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
청구항 16에 있어서, PYC는 SEQ ID NO:1에 도시된 서열을 보유하고, MDH는 SEQ ID NO:2에 도시된 서열을 보유하고, MAE는 SEQ ID NO:3에 도시된 서열을 보유하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
청구항 9에 있어서, 배지로부터 숙신산을 분리하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 생산 방법.