KR20130038944A - 이소시트레이트 데히드로게나제 활성이 감소된 미생물을 사용한 정밀 화학물질의 생산 방법 - Google Patents

이소시트레이트 데히드로게나제 활성이 감소된 미생물을 사용한 정밀 화학물질의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 정밀 화학물질의 생산을 위해 이소시트레이트 데히드로게나제 활성이 감소된 미생물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 그러한 정밀 화학물질은 아미노산, 중합체 합성을 위한 단량체, 당, 지질, 오일, 지방산 또는 비타민일 수 있고, 바람직하게는 아스파르테이트 패밀리의 아미노산, 특히 메티오닌 또는 라이신, 또는 상기 아미노산의 유도체, 특히 카다베린이다. 또한, 본 발명은 초기 미생물에 비해 이소시트레이트 데히드로게나제 활성이 감소된 재조합 미생물 및 정밀 화학물질, 예를 들어 아스파르테이트 패밀리 아미노산 및 그의 유도체를 생산하는데 있어서 그러한 미생물의 용도에 관한 것이다.

Description

이소시트레이트 데히드로게나제 활성이 감소된 미생물을 사용한 정밀 화학물질의 생산 방법{PRODUCTION PROCESS FOR FINE CHEMICALS USING MICROORGANISMS WITH REDUCED ISOCITRATE DEHYDROGENASE ACTIVITY}
본 발명은 정밀 화학물질의 생산을 위해 이소시트레이트 데히드로게나제 활성이 감소된 미생물을 이용하는 방법에 관한 것이다. 상기 정밀 화학물질은 아미노산, 중합체 합성을 위한 단량체, 당, 지질, 오일, 지방산 또는 비타민일 수 있고, 바람직하게는 아스파르테이트 패밀리의 아미노산, 특히 메티오닌 또는 라이신, 또는 상기 아미노산의 유도체, 특히 카다베린이다.
또한, 본 발명은 초기 미생물에 비해 이소시트레이트 데히드로게나제 활성이 감소된 재조합 미생물 및 정밀 화학물질, 예를 들어 아스파르테이트 패밀리 아미노산 및 그의 유도체의 생산시에 상기 미생물의 용도에 관한 것이다.
예를 들어 유기산, 예를 들어 락트산, 유기 아민, 예를 들어 디아미노펜탄 (카다베린), 단백질원성 (proteogenic) 또는 비-단백질원성 아미노산, 탄수화물, 방향족 화합물, 헤테로방향족 화합물, 예를 들어 디피콜리네이트, 비타민 및 보조인자, 포화 및 불포화 지방산을 포함하는 정밀 화학물질은 제약, 농업, 화장품 및 식품 및 사료 산업에서 일반적으로 사용되고 필요하며, 중합체 합성을 위한 단량체로서도 사용된다. 이들은 일반적으로 화학 공정에 의해 생산되지만, 점점 많은 수의 정밀 화학물질이 발효 공정에 의해서도 생산되고 있다.
예를 들어 아미노산 메티오닌의 경우, 현재 전세계적인 1년 생산량은 약 500,000톤이다. 표준 산업 생산 공정은 발효 공정이 아니라 다단계 화학 공정이다. 메티오닌은 가금류 사료 내의 제1 제한 (first limiting) 아미노산이고, 이 때문에 주로 사료 보충물로서 적용된다. 예를 들어 미생물, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli)를 사용한 발효에 의해 메티오닌을 생산하기 위한 다양한 시도가 선행 기술 문헌에 발표되었다.
다른 아미노산, 예를 들어 글루타메이트, 라이신, 및 트레오닌은 예를 들어 발효 방법에 의해 생산된다. 이를 위해, 특정 미생물, 예를 들어 씨. 글루타미쿰 (C. glutamicum)이 특히 적합한 것으로 증명되었다. 발효에 의한 아미노산의 생산은 L-아미노산만 생산되고, 일반적으로 화학적 합성에 사용되는 용매와 같은 환경 문제를 야기하는 화학물질의 사용이 방지된다는 특정 잇점을 갖는다.
디피콜리네이트, 카다베린 또는 β-라이신과 같은 정밀 화학물질의 경우, 상기 화합물은 다양한 분야에서 사용되고, 일반적으로 비-발효 방법에 의해 생산된다.
피리딘-2,6-디카르복실산 또는 DPA로도 알려진 디피콜린산 (CAS 넘버 499-83-2)은 상이한 기술분야에서, 예를 들어 폴리에스테르 또는 폴리아미드 유형의 공중합체의 합성에서의 단량체, 피리딘 합성의 전구체, 퍼옥시드 및 과산, 예를 들어 t-부틸 퍼옥시드, 디메틸-시클로헥사논 퍼옥시드, 퍼옥시아세트산 및 퍼옥시-일황산의 안정화제, 금속 표면 연마 용액의 성분, 미량의 금속 이온의 존재에 의해 열화되기 쉬운 유기 물질의 안정화제 (격리 효과 (sequestrating effect)), 에폭시 수지의 안정화제, 및 사진용 용액 또는 에멀젼의 안정화제 (칼슘염의 침전 억제)로서 사용된다. DPA가 세균의 내생포자에서 생합성되는 것이 공지되어 있다. 디히드로디피콜리네이트로부터 DPA의 생합성을 촉매하는 효소는 디피콜리네이트 합성효소 (synthetase)이다. 상기 효소는 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis)로부터 단리되었고, 추가로 특성화되었다. 이는 spoVF 오페론 (BG10781, BG10782)에 의해 코딩되었다.
1950년대에, L-β-라이신은 스트렙토마이세스 (Streptomyces)에 의해 생산되는 일부 강염기성 펩티드 항생제에서 확인되었다. 가수분해시에 L-β-라이신을 생성하는 항생제는 비오마이신, 스트렙톨린 A, 스트렙토트리신, 로세오트리신 및 게오마이신을 포함한다 (Stadtman, Adv. Enzymol. Relat. Areas Molec. Biol. 38:413 (1973)). 또한, β-라이신은 또한 진균 노카르디아 (Nocardia)에 의해 생산되는 항생제, 예를 들어 미코마이신의 성분이고, β-라이신은 다른 생물학상 활성 화합물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, β-라이신의 화학적 합성은 시간이 많이 소요되고, 고가의 출발 물질을 필요로 하고, 일반적으로 라세미 혼합물을 생성시킨다.
1,5-디아미노펜탄은 L-라이신의 화학 공정 (탈카르복실화)에 의해 현재 생산되는 비교적 고가의 특수 화학물질이다. 발효에 의해 생산되는 디아미노펜탄은 아직 시장에서 입수할 수 없다.
정밀 화학물질의 발효 산물은 현재 일반적으로 미생물, 예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) (씨. 글루타미쿰), 에스체리키아 콜라이 (Escherichia coli) (이. 콜라이), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) (에스. 세레비지애), 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) (에스. 폼베), 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (피. 파스토리스), 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger), 바실러스 섭틸리스, 아슈비아 고시피이 (Ashbya gossypii) 또는 글루코노박터 옥시단스 (Gluconobacter oxydans)에서 생산된다. 특히 코리네박테리움 글루타미쿰은 아미노산, 예를 들어, L-글루타메이트 및 L-라이신을 다량 생산하는 그의 능력이 알려져 있다 (Kinoshita, S. (1985) Glutamic acid bacteria; p. 115-142 in: A.L. Demain and N.A. Solomon (ed.), Biology of industrial microorganisms, Bejamin/Cummings Publishing Co., London).
미생물, 예를 들어 이. 콜라이 및 씨. 글루타미쿰에서 정밀 화학물질, 예를 들어 아미노산, 지질, 비타민 또는 탄수화물을 생산하기 위한 선행 기술의 일부 시도는 예를 들어 각각의 정밀 화학물질의 생합성 경로에 관련되는 유전자의 발현을 증가시킴으로써 상기 목적을 달성하기 위해 시도하였다. 예를 들어, 아미노산, 예를 들어 메티오닌 또는 라이신의 생합성 경로의 특정 단계가 속도 제한 단계로 알려진 경우에, 각각의 효소의 과다발현에 의해 촉매되는 반응의 보다 많은 생성물을 생산하는 미생물을 얻을 수 있고, 따라서 최종적으로 각각의 아미노산의 생산을 향상시킬 것이다. 유사하게, 예를 들어 요구되는 아미노산의 생합성 경로의 특정 효소 단계가 많은 대사 에너지를 요구되지 않는 부산물의 형성으로 돌리기 때문에 바람직하지 않은 것으로 알려진 경우에는, 관심있는 아미노산의 형성을 최종적으로 유도하는 대사 반응에만 유리하도록 각각의 효소 활성의 발현을 하향조절하는 것이 고려될 수 있다.
메티오닌 또는 라이신의 생합성에 관련되는 유전자의 발현의 상향조절 및/또는 하향조절에 의해, 예를 들어 메티오닌 또는 라이신의 생산을 증가시키는 시도는 예를 들어 WO 02/10209, WO 2006/008097 및 WO 2005/059093에 기재되어 있다.
화합물의 생물학적 전구체의 생합성에 관련되는 유전자의 발현의 상향조절 및/또는 하향조절에 의해, 예를 들어 카다베린, 디피콜리네이트 또는 β-라이신과 같은 정밀 화학물질의 생산을 증가시키는 시도는 예를 들어 WO 2007/113127, WO 2007/101867 및 EP 08151031.5에 기재되어 있다.
이소시트레이트 데히드로게나제 (ICD, 때때로 IDH로도 불림, EC 1.1.1.42, 서열 3)는 예를 들어 씨. 글루타미쿰의 시트르산 사이클 (TCA)에 참여하는 효소이다. 이는 사이클의 제3 단계, 즉 알파-케토글루타레이트 및 CO2를 생산하는 이소시트레이트의 산화에 의한 탈카르복실화를 촉매한다.
씨. 글루타미쿰에서 ICD를 코딩하는 유전자가 확인되어 클로닝되고, 특성화되었다 (Eikmanns, B. et al., J. Bacteriol. (1995) 177:774-782). 씨. 글루타미쿰에서 낙아웃 (knockout)에 의한, ICD를 코딩하는 염색체 icd 유전자의 불활성화는 글루타메이트 영양요구성을 초래한다 (Eikmanns, B. et al., J. Bacteriol. (1995) 177:774-782).
씨. 글루타미쿰 및 이. 콜라이에서 ICD의 과다발현은 글루타메이트 생산을 향상시키지 않았다 (Eikmanns, B. et al., J. Bacteriol. (1995) 177:774-782). 그러나, 이. 콜라이에서 ICD의 과다발현은 트레오닌 생산을 증가시킨다고 DE 10210967에서 보고되었다. 씨. 글루타미쿰에서 글루타메이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자를 사용한 icd의 동시발현에 대해 모순되는 결과가 보고되었고: 에익만스 (Eikmanns)는 어떠한 효과도 제시하지 않았지만, 개선된 글루타메이트 수율이 JP63214189 및 JP2520895에서 보고되었다.
아스파르테이트 패밀리의 아미노산, 그의 생화학적 전구체 및 유도체와 같은 정밀 화학물질의 생산을 증가시키기 위해 보고된 시도를 고려한 경우에도, 대체 생산 방법에 대한 필요성이 계속 존재한다.
<본 발명의 목적 및 개요>
대체 발효 방법 및 산업상 중요한 미생물, 예를 들어 지금까지 특성이 알려지지 않은 씨. 글루타미쿰을 사용하여 정밀 화학물질을 생산하기 위해 상기 방법에 사용하기 위한 미생물의 제공이 본 발명의 한 목적이다.
본 발명에 대한 하기 설명으로부터 분명해지는 바와 같은 본 발명의 상기 및 다른 목적은 독립항에서 설명되는 바와 같은 본 발명에 의해 해결된다. 종속항은 바람직한 실시태양에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명은 이소시트레이트 데히드로게나제 활성이 감소된 세포를 사용하여 정밀 화학물질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 효소의 하향조절은 특정 생화학적 생성물, 특히 아스파르테이트 하류의 생성물의 수율을 개선하는 것으로 지금까지 알려지지 않은 것이다.
본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 정밀 화학물질은 바람직하게는 아스파르테이트로부터 메티오닌 및/또는 라이신을 생산하는 생합성 경로의 중간체를 통해 합성된다. 정밀 화학물질은 바람직하게는 천연 생성 아미노산, 예를 들어 라이신, 트레오닌, 이소류신 또는 메티오닌, 또는 그의 질소 함유 유도체, 예를 들어 β-라이신, 디피콜리네이트 및 1,5-디아미노펜탄이다.
생산 방법에 사용되는 세포는 원핵생물, 하등 진핵생물, 단리된 식물 세포, 효모 세포, 단리된 곤충 세포 또는 단리된 포유동물 세포, 특히 세포 배양 시스템 내의 세포일 수 있다. 본 발명의 측면에서, 용어 "미생물"은 상기 종류의 세포에 대해 사용된다.
본 발명의 수행을 위해 ICD 활성이 감소된 바람직한 종류의 미생물은 ICD 발현이 감소된 코리네박테리움, 특히 바람직하게는 ICD 발현이 감소된 씨. 글루타미쿰이다.
ICD 활성이 감소되고, 바람직하게는 숙주 세포에서 상기 ICD의 발현을 감소시키는 변형된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 미생물도 본 발명의 일부를 형성한다. 상기 미생물은 씨. 글루타미쿰일 수 있다.
또한, 본 발명은 특히 아스파르테이트로부터 메티오닌 및/또는 라이신을 생산하는 생합성 경로의 중간체를 통해 정밀 화학물질을 생산하기 위한 상기한 재조합 미생물의 용도에 관한 것이다. 이것은 특히 천연 생성 아미노산, 예를 들어 라이신, 트레오닌, 이소류신 또는 메티오닌의 생산을 위해 사용될 수 있다. 또한, 이것은 특히 질소 함유 정밀 화학물질, 예를 들어 β-라이신, 디피콜리네이트 및 1,5-디아미노펜탄의 생산을 위해 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 다음과 같은 실시태양이 제공된다:
(1) 대응하는 초기 미생물에 비해 이소시트레이트 데히드로게나제 (ICD) 활성이 부분적으로 또는 완전히 감소된 미생물을 이용하여 정밀 화학물질을 생산하는 방법;
(2) 대응하는 초기 미생물에 비해 이소시트레이트 데히드로게나제 (ICD) 활성이 부분적으로 또는 완전히 감소되고, 여기서 ICD 발현의 감소가 미생물의 천연 icd 서열 대신에 변형된 ICD 코딩 뉴클레오티드 서열 (icd 서열)의 발현에 의한 것이 아니고, 상기 변형된 icd 코딩 서열은 비-변형된 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 코돈이 변형된 icd 서열에서 숙주 세포의 코돈 사용 빈도 (codon usage)에 따라 사용 빈도가 더 적은 코돈으로 교체되도록 비-변형된 icd 서열로부터 유도되는 것인 재조합 미생물;
(3) 정밀 화학물질을 생산하기 위한 실시태양 (2)에 따른 미생물의 용도; 및
(4) 실시태양 (1)에 따른 방법에 의한 정밀 화학물질의 생산을 1단계로서 포함하는, 실시태양 (1)에 따른 방법에 의해 생산된 정밀 화학물질로부터 화학물질 및 최종 화학물질 생성물, 예를 들어 중합체의 제조 방법.
도 1: 라이신 생합성에서 분기되는 효소 반응에서 베타-라이신, 디피콜리네이트 및 1,5-디아미노펜탄의 발효 제조. 나타낸 효소는 일반적으로 발효에 사용되는 미생물에 대해 이종성이다.
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정의
다음 약어, 용어 및 정의가 본원에서 사용된다:
IDH, 이소시트레이트 데히드로게나제; ICD, 이소시트레이트 데히드로게나제; 약어 "ICD" 및 IDH"는 이소시트레이트 데히드로게나제에 대한 동의어로 사용됨; WT, 야생형; PPP, 펜토스 포스페이트 경로; DAP, 디아미노펜탄; DPA, 디피콜린산.
본 발명의 문맥에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 ("a" 및 "an")는 문맥상 이와 다른 의미로 분명하게 언급되지 않으면 각각의 복수형을 또한 포함한다. 따라서, 용어 "미생물"은 하나 초과의 미생물, 즉 그 종류의 2, 3, 4, 5개 등의 미생물을 포함할 수 있다.
수치값 또는 파라미터 범위의 문맥에서 용어 "약"은 해당 특징의 기술적인 효과를 계속 보장하는 것으로 당업자가 이해할 수 있는 정확도의 차이를 나타낸다. 용어 "일반적으로는" 나타낸 수치값으로부터 +/-10％, 바람직하게는 +/-5％의 편차를 나타낸다.
달리 나타내지 않으면, 본 발명의 문맥에서 언급된 화합물 또는 아미노산은 상이한 입체이성질체의 혼합물을 포함하는 임의의 입체화학을 가질 수 있다. 바람직하게는, 아미노산, 그의 전구체 및 유도체는 L-입체형태를 갖는다. 적절한 경우, 구체적으로 바람직한 입체형태가 표시된다.
달리 나타내지 않으면, 본 발명에 따른 방법에 의해 얻는 산은 유리 산, 상기 산의 부분적인 또는 완전한 염의 형태 또는 산과 그의 염의 혼합물의 형태일 수 있다. 반대로, 본 발명에 따른 방법에 의해 얻은 아민은 유리 아민, 상기 아민의 부분적인 또는 완전한 염의 형태 또는 아민과 그의 염의 혼합물의 형태일 수 있다.
본 발명의 목적을 위한 용어 "숙주 세포"는 예를 들어 폴리펩티드 또는 정밀 화학물질의 생산을 위한 뉴클레오티드 서열의 발현을 위해 통상 사용되는 임의의 단리된 세포를 의미한다. 특히, 용어 "숙주 세포"는 원핵생물, 하등 진핵생물, 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포 배양 시스템에 관한 것이다.
용어 "미생물"은 원핵생물, 하등 진핵생물, 단리된 식물 세포, 효모 세포, 단리된 곤충 세포 또는 단리된 포유동물 세포, 특히 세포 배양 시스템 내의 세포에 관한 것이다. 본 발명의 수행에 적합한 미생물은 효모, 예를 들어 에스. 폼베 또는 에스. 세레비지애 및 피치아 파스토리스를 포함한다. 포유동물 세포 배양 시스템은 예를 들어 NIH T3 세포, CHO 세포, COS 세포, 293 세포, 주르카트 (Jurkat) 세포 및 HeLa 세포를 포함하는 군 중에서 선택될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 미생물은 바람직하게는 원핵생물 또는 효모 세포이다. 본 발명의 문맥에서 바람직한 미생물은 하기 "상세한 설명" 섹션에서 제시된다. 코리네박테리아가 특히 바람직하다.
"천연"은 "야생형" 및 "천연 생성"의 동의어이다. "야생형" 미생물은 달리 나타내지 않으면, 나타낸 미생물의 통상적인 천연 생성 형태이다. 일반적으로, 야생형 미생물은 비-재조합 미생물이다.
"초기"는 "출발"의 동의어이다. "초기" 뉴클레오티드 서열 또는 효소 활성은 예를 들어 돌연변이 또는 억제제의 첨가에 의한 그의 변형을 위한 출발점이다. 임의의 "초기" 서열, 효소 또는 미생물에는, 그의 "최종" 또는 "변형된" 대응물에 존재하고 특정 문맥에서 제시되는 구별되는 특징 (예를 들어, 감소된 ICD 활성)이 결여된다. 용어 "초기"는 본 발명의 문맥에서 용어 "천연"의 의미를 포함하고, 바람직한 측면에서 "천연"의 동의어이다.
임의의 야생형 또는 돌연변이체 (비-재조합 또는 재조합 돌연변이체) 미생물은 적어도 하나의 물리적 또는 화학적 특성, 및 본 발명의 한 특정 측면에서 그의 ICD 활성에서 초기 미생물과 상이한 미생물을 생성시키는 비-재조합 방법 (예를 들어 특이적인 효소 억제제의 첨가) 또는 재조합 방법에 의해 추가로 변형될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 초기 비-변형된 미생물은 "초기 미생물" 또는 "초기 (미생물) 균주"로 지정된다. 제시된 ICD 발현 수준을 갖는 초기 균주에 비해 미생물의 ICD 활성의 임의의 감소는 비교가능한 조건 하에 두 미생물 내의 ICD 활성의 비교에 의해 결정된다.
일반적으로, 본 발명에 따른 미생물은 상기 유전자 변경을 보유하지 않는 초기 미생물에 유전자 변경을 도입함으로써 얻는다.
미생물 균주의 "유도체"는 예를 들어 전통적인 돌연변이 유발 및 선택에 의해 또는 지정 돌연변이 유발에 의해 그의 모 균주로부터 유도된 균주이다. 예를 들어, 균주 씨. 글루타미쿰 ATCC13032lysCfbr (WO 2005/059093)는 ATCC13032, 및 LU11424로부터 유도된 라이신 생산 균주이다.
본 발명의 목적을 위해 용어 "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 서열"은 폴리펩티드, 예를 들어 펩티드, 단백질 등을 코딩하는 임의의 핵산 분자에 관한 것이다. 상기 핵산 분자는 DNA, RNA 또는 그의 유사체로 이루어질 수 있다. 그러나, DNA로 이루어진 핵산 분자가 바람직하다.
본 발명의 문맥에서 "재조합"은 "유전공학에 의해 제조되거나 유전공학의 결과"를 의미한다. 따라서, "재조합 미생물"은 적어도 하나의 "재조합 핵산" 또는 "재조합 단백질"을 포함한다. 재조합 미생물은 바람직하게는 발현 벡터 또는 클로닝 벡터를 포함하거나, 또는 숙주 세포의 내인성 게놈 내에 클로닝된 핵산 서열(들)을 함유하도록 유전공학에 의해 조작된다.
"이종성"은 세포 또는 유기체에 대해, 그가 기원하는 유기체와 상관없이, 유전공학에 의해 상기 세포 또는 유기체 내로 도입된 임의의 핵산 또는 폴리펩티드/단백질이다. 따라서, 미생물로부터 단리되어 동일한 종의 다른 미생물 내로 도입된 DNA는 본 발명의 문맥에서 유전적으로 변형된 상기 미생물에 대해 이종성 DNA이지만, 용어 "상동성"이 때때로 당업계에서 상기 종류의 유전공학에 의해 조작된 변형에 대해 사용된다. 그러나, 용어 "이종성"은 바람직하게는 본 발명의 문맥에서 비-상동성 핵산 또는 폴리펩티드/단백질을 언급하는 것이다. "이종성 단백질/핵산"은 "재조합 단백질/핵산"의 동의어이다.
용어 "발현하다", "발현하는", "발현된" 및 "발현"은 숙주 유기체에서 유전자 생성물 (예를 들어, 경로의 유전자의 생합성 효소)의 발현을 나타낸다. 발현은 출발 유기체로서 사용되는 미생물의 유전자 변경에 의해 실시될 수 있다. 일부 실시태양에서, 미생물은 출발 미생물 또는 변경되지 않은 비교가능한 미생물에 의해 생산된 수준에 비해 증가된 수준으로 유전자 생성물을 발현하도록 유전적으로 변경 (예를 들어, 유전공학에 의해 조작)될 수 있다. 유전자 변경은 특정 유전자의 발현과 관련된 조절 서열 또는 부위의 변경 또는 변형 (예를 들어, 강력한 프로모터, 유도가능 프로모터 또는 다수의 프로모터의 부가 또는 발현이 구성적이 되도록 조절 서열의 제거에 의해), 특정 유전자의 염색체 위치의 변형, 특정 유전자, 예를 들어 리보좀 결합 부위 또는 전사 종결인자에 인접한 핵산 서열의 변형, 특정 유전자의 카피 수의 증가, 특정 유전자의 전사 및/또는 특정 유전자 생성물의 번역에 관련되는 단백질 (예를 들어, 조절 단백질, 서프레서, 인핸서, 전사 활성인자 등)의 변형, 또는 당업계의 통상적인 기술을 사용한 특정 유전자의 발현을 탈조절하기 위한 임의의 다른 통상적인 수단 (예를 들어, 리프레서 단백질의 발현을 차단하기 위한 안티센스 핵산 분자의 사용을 포함하고 이로 제한되지 않음)을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"보존적 아미노산 교환"은 초기 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산이 화학적 특성이 유사한 아미노산으로 치환되는, 예를 들어 Val이 Ala으로 치환되는 것을 의미한다. 초기 폴리펩티드 서열에 비교할 때 치환된 아미노산의 비율은 바람직하게는 초기 아미노산 서열의 총 아미노산의 0 내지 30％, 보다 바람직하게는 0 내지 15％, 가장 바람직하게는 0 내지 5％이다.
보존적 아미노산 교환은 바람직하게는 다음 아미노산 군 중의 하나의 멤버 사이에서 이루어진다:
- 산성 아미노산 (아스파르트산 및 글루탐산);
- 염기성 아미노산 (라이신, 아르기닌, 히스티딘);
- 소수성 아미노산 (류신, 이소류신, 메티오닌, 발린, 알라닌);
- 친수성 아미노산 (세린, 글라이신, 알라닌, 트레오닌);
- 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 (글라이신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신);
- 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 아미노산 (세린, 트레오닌);
- 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산 (아스파라긴, 글루타민);
- 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (페닐알라닌, 티로신, 트립토판);
- 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (라이신, 아르기닌, 히스티딘);
- 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산 (시스테인, 메티오닌).
구체적으로 바람직한 보존적 아미노산 교환은 다음과 같다:
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용어 "단리된"은 그의 기원 유기체로부터 분리 또는 정제된"을 의미한다. 보다 구체적으로, 다세포 유기체의 단리된 세포는 그의 기원 유기체로부터 분리 또는 정제된 것이다. 이것은 생화학적으로 정제된 및 재조합 방식으로 생산된 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 아미노산의 "전구체" 또는 "생화학적 전구체"는 본 발명의 미생물에서 상기 아미노산의 형성을 유도하는 생화학적 경로 내의 아미노산에 선행하는 ("상류") 화합물, 특히 상기 생화학적 경로의 마지막 몇 단계에서 형성되는 화합물이다. 본 발명의 문맥에서, 라이신, 메티오닌, 트레오닌 또는 이소류신의, 즉 아스파르테이트 이외의 아스파르테이트 패밀리의 임의의 아미노산의 "전구체"는 생체 내에서 야생형 유기체에서 아스파르테이트의 각각의 아미노산으로의 생화학적 전환 동안 형성되는 임의의 중간체이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유도체" ("미생물의 유도체"의 문맥에서의 그의 용도를 제외함, 상기 참조)는 (i) 아스파르테이트 패밀리의 아미노산 또는 (ii) 효소에 의한 또는 비-효소에 의한 전환 (효소에 의한 전환이 바람직함)에 의한 아스파르테이트 하류의 생화학적 경로 내의 그의 생화학적 전구체로부터 유도가능한 임의의 화학적 화합물을 의미한다. 바람직하게는, 전환은 다음 중 적어도 하나를 유발한다:
(i) 하나 또는 두 개의 카르복실기의 제거;
(ii) 하나의 아미노기의 제거;
(iii) 하나의 아미노기의 전환; 및/또는
(iv) 탈수소화.
특히 바람직한 전환 및 유도체는 하기 "상세한 설명" 섹션에서 설명된다.
"중간체" 또는 "중간 생성물"은 반드시 분석에 의해 직접적으로 검출가능한 농도는 아니지만, 화학적 또는 생화학적 과정 동안 일시적으로 또는 지속적으로 형성되는 화합물로서 이해된다. 상기 중간체는 제2 화학적 또는 생화학적 반응에 의해, 특히 하기 상세한 설명 섹션에서 규정되는 바와 같은 후속적인 효소에 의한 전환에 의해 상기 생화학적 과정으로부터 제거될 수 있다. 상기 후속적인 효소에 의한 전환은 바람직하게는 본 발명에 따라 ICD 활성이 부분적으로 또는 완전히 감소된 미생물에서 일어난다. 상기 바람직한 측면에 따른 방법에서, 미생물은 방법의 내인성 중간체의 최종 생성물로의 후속적인 전환에서 반응 단계를 촉매하는 적어도 하나의 이종성 효소를 포함한다.
아미노산의 "아스파르테이트 패밀리"는 아스파르테이트, 아스파라긴, 라이신, 메티오닌, 트레오닌 및 이소류신, 특히 상기 아미노산의 L-에난티오머를 포함한다. 보다 좁은 의미에서, 이는 라이신, 메티오닌, 트레오닌 및 이소류신을 포함한다.
"탄소 수율"은 소비되는 탄소 (발효에 사용되는 탄소 공급원, 대체로 당)의 양당 발견되는 (생성물의) 탄소의 양, 즉 생성물 대 공급원의 탄소 비율이다.
본 발명의 문맥에서, "ICD 활성"은 ICD의 임의의 효소 활성, 특히 ICD에 의해 발생하는 임의의 촉매 효과를 의미한다. 구체적으로, 이소시트레이트의 알파-케토글루타레이트로의 전환은 "ICD 활성"을 의미한다. ICD 활성은 효소 1 밀리그램당 단위 (비활성 (specific activity)) 또는 효소 분자당 1분당 전환된 기질의 분자로서 표현될 수 있다.
<발명의 상세한 설명>
본 발명은 ICD 활성이 감소된 미생물에 의한, 아미노산 및 그의 전구체의 정밀 화학물질로의 생화학적 전환에 관한 것이다
ICD의 활성은 세포에서 아미노산 생산에 필요한 일부의 NADPH/NADH를 제공한다. 따라서, 그의 아미노산 생산, 특히 아스파르테이트 패밀리의 아미노산 및 그의 전구체의 생산을 증폭시키도록 세포 내의 ICD 활성을 감소시키는 본 발명의 개념은 이전에 자명하지 않은 것으로 보인다.
놀랍게도, 미생물 내의 ICD 활성 감소는 미생물 내에서 아스파르테이트 패밀리의, 아스파르테이트 하류의 생화학적 경로 내의 그의 전구체의 및 상기 아미노산 및 전구체의 특정 유도체의 아미노산의 생산 수준을 증가시킴이 본 발명에서 밝혀졌다. 유도체는 아스파르테이트 패밀리의 아미노산 또는 그의 천연 전구체의 하나를 전환시킴으로써 내인성 또는 이종성 효소, 바람직하게는 이종성 효소, 특히 도 1에 제시된 이종성 효소에 의해 합성된다. 상기 생성물 중의 일부는 정밀 화학물질, 특히 아미노산 메티오닌 및 라이신 및 유도체 카다베린 (1,5-디아미노펜탄), β-라이신 및 디피콜리네이트로서 특히 주목할 수 있다. 예를 들어, 이들은 다음과 같이 사용될 수 있다:
1,5-디아미노펜탄: 폴리아미드 단량체, 폴리우레탄 단량체, 피페리딘 전구체
베타-라이신: 카프로락탐 전구체, 폴리아미드 단량체
디피콜리네이트: 폴리에스테르 단량체, 폴리아미드 단량체, 안정화제.
본 발명의 바람직한 측면에서, 실시태양 (1)에 따른 생산 방법은 발효 방법이다. 그러나, 식물 및 비-인간 동물에서의 생체내 생산을 포함하는 화학적 화합물의 다른 생물공학적 생산 방법도 고려된다.
실시태양 (1)에 따른 정밀 화학물질의 발효 생산 방법은 글리옥실레이트 션트 (shunt)를 통한 탄소 유동 (flux)이 증가하도록 ICD 활성이 감소된 적어도 하나의 - 바람직하게는 재조합 - 미생물의 배양을 포함할 수 있다.
실시태양 (1)의 다른 바람직한 측면에서, 생산 방법에 사용되는 미생물은 재조합 미생물이다. 식물 및 비-인간 동물에서의 생체내 생산을 포함하는 화학적 화합물의 다른 생물공학적 생산 방법이 고려될 경우, 선택되는 유기체는 바람직하게는 재조합 유기체이다.
본 발명의 임의의 실시태양에서, 실시태양에 사용되는 미생물 내의 이소시트레이트 데히드로게나제 활성은 부분적으로 또는 완전히 감소된다.
본 발명에 따른 ICD 활성이 감소된 미생물은 동일한 종 및 유전적 배경의 초기 미생물에 비해 그의 초기 ICD 활성을 부분적으로 또는 완전히 상실한 것이다. 바람직하게는, ICD의 대략 적어도 1％, 적어도 2％, 적어도 4％, 적어도 6％, 적어도 8％, 적어도 10％, 보다 바람직하게는 적어도 20％, 적어도 40％, 적어도 60％, 적어도 80％, 적어도 90％, 적어도 95％ 또는 모든 초기 활성이 미생물에서 상실된다. 활성의 감소 정도는 비교가능한 조건 하에 초기 미생물 내의 내인성 ICD 활성의 수준에 비교하여 결정된다.
ICD 활성을 가능한 한 많이 감소시키는 것이 항상 바람직하지는 않다는 것이 이해된다. 특정 경우에, 상기 나타낸 임의의 수준에 비해 불완전한 감소이지만, 중간 수준, 예를 들어, 25％, 40％, 50％ 등의 감소도 충분하고 바람직할 수 있다.
ICD 활성의 불완전한 상실이 바람직하고, 이것은 TCA를 유지하고 미생물이 글루타메이트 및 알파-케토글루타레이트로부터 합성되는 다른 생체 분자를 추가로 생산할 수 있도록 하기 때문이다.
미생물이 ICD 활성의 완전한 또는 거의 완전한 (즉, 90％ 이상) 상실을 특징으로 하는 실시태양에서, 미생물의 배양 배지, 특히 실시태양 (1)에 따른 생산에 사용되는 배지에는 ICD 활성의 억제에 의해 미생물에 결여되는 하나 이상의 필수적인 화합물이 보충될 수 있다. 특히, 글루타메이트는 저렴하고 쉽게 입수가능한 화합물이기 때문에 배지에 보충될 수 있다.
하나 초과의 ICD 코딩 유전자 및/또는 하나 초과의 종류의 ICD를 갖는 유기체에서, ICD 활성 감소는 상이한 종류의 ICD의 전부, 일부 또는 단지 하나의 활성의 감소일 수 있다. ICD의 불완전한 상실과 관련하여 상기 나타낸 이유 때문에, 모든 종류보다는 그보다 적은 종류의 ICD의 특이적인 감소가 바람직하다.
본 발명에 필요한 ICD 활성의 감소는 실시태양 (1)에 따른 방법에 사용되는 미생물의 내인성 특징, 예를 들어 자연 돌연변이에 의한 특징이거나, 또는 효소 활성, 특히 생체내 효소 활성을 부분적으로 또는 완전히 억제 또는 제한하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 발생하는 것일 수 있다. 효소 활성의 감소는 효소 합성 및 효소 반응의 임의의 단계에서, 유전자, 전사, 번역 또는 반응 수준에서 발생할 수 있다.
ICD 활성의 감소는 바람직하게는 유전공학 처리에 의한 것이다. 숙주 세포에서 하나 이상의 내인성 ICD 유전자(들)의 발현량을 감소시켜, icd 표적 유전자가 억제되는 숙주 세포 내에서 ICD의 양 및/또는 활성을 감소시기 위해서, 당업계에 공지된 임의의 방법을 적용할 수 있다. 미생물, 예를 들어 이. 콜라이 또는 씨. 글루타미쿰 또는 다른 숙주 세포, 예를 들어 피. 파스토리스 및 에이. 니게르 내의 유전자의 발현을 하향조절하기 위해, 다수의 기술, 예를 들어 유전자 낙아웃 방법, 안티센스 기술, RNAi 기술 등을 이용할 수 있다. 각각의 유전자의 초기 카피를 제거하고/하거나 이를 감소된 활성, 특히 감소된 비활성을 보이는 돌연변이체 버젼으로 교체하거나, 또는 약한 프로모터로부터 발현시킬 수 있다. 또는, icd 유전자의 출발 코돈, icd 유전자의 프로모터를 교환하거나, 무작위 또는 표적 돌연변이 유발에 의해 돌연변이를 도입하거나, icd 유전자를 붕괴 또는 낙아웃시킬 수 있다. 또한, 탈안정화 요소를 mRNA 내로 도입하거나 또는 RNA의 리보좀 결합 부위 (RBS)의 기능을 저하시키는 유전자 변형을 도입할 수 있다. 마지막으로, 특이적인 ICD 억제제를 반응 혼합물에 첨가할 수 있다.
실시태양 (1)의 바람직한 제1 측면에서, ICD 활성은 ICD 발현의 부분적인 또는 완전한 감소에 의해 감소된다. "미생물 내의 적어도 하나의 ICD의 발현 감소"는 제시된 ICD 발현 수준을 갖는 초기 미생물에 비해 미생물 내의 임의의 발현 감소를 의미한다. 물론, 이것은 비교가능한 숙주 세포 종류, 비교가능한 유전자 배경 상황 등에 대해 이루어짐을 가정한다. 바람직하게는, 발현의 감소는 상기 나열되거나 다음에 설명되는 바와 같이 달성된다.
본 발명의 특정 측면에서, 미생물은 ICD 발현의 감소, 바람직하게는 적어도 약 5％, 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 100％ 감소에 의해 그의 초기 ICD 활성을 상실한 것이고, 발현의 감소도는 초기 미생물에서의 폴리펩티드의 발현 수준에 비교하여 결정된다. 발현의 감소도는 비교가능한 조건 하에 초기 미생물 내에서 초기 icd 뉴클레오티드 서열로부터 발현된 내인성 ICD의 발현 수준에 비교하여 결정된다.
하나 초과의 ICD 코딩 유전자 및/또는 하나 초과의 종류의 ICD를 보유하는 유기체에서, ICD 발현의 감소는 하나의, 몇몇의 또는 모든 icd 유전자에 관련될 수 있다. ICD의 불완전한 상실과 관련하여 상기 나타낸 이유 때문에, 모든 종류보다는 그보다 적은 종류의 icd 유전자의 특이적인 발현의 감소가 바람직하다.
한 바람직한 측면에서, "발현의 감소"는 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 뉴클레오티드 서열을 실질적으로 동일한 아미노산 서열 및/또는 기능의 폴리펩티드를 코딩하는 변형된 뉴클레오티드 서열로 교체하면, 감소된 양의 코딩되는 폴리펩티드가 변형된 세포 내에서 발현되는 상황을 의미한다.
상기 하향조절 방식의 한 측면은 icd 유전자의 낙아웃이다 (실시예 4 참조). 이는 해당 미생물에 적합한 임의의 공지의 낙아웃 프로토콜에 의해 달성할 수 있다. 낙아웃 및 생성되는 낙아웃 돌연변이체를 사용한 정밀 화학물질의 생산을 위한 특히 바람직한 방법이 실시예 4에 설명되어 있다.
icd의 낙아웃은 ICD 활성의 완전한 또는 거의 완전한 상실을 초래한다. 따라서, 결핍 증상을 방지하고 미생물의 생존을 유지하기 위해서, 배양 배지를 결핍 ICD-의존 생성물, 예를 들어 글루타메이트로 보충하는 것이 낙아웃 돌연변이체에 필요할 수 있다.
다른 바람직한 측면에서, "발현의 감소"는 유전자 발현을 간섭하는 안티센스 기술 또는 RNA 간섭 (적용가능한 경우, 예를 들어 진핵 세포 배양에서)에 의한 발현의 하향조절을 의미한다. 상기 기술은 icd mRNA 수준 및/또는 icd 번역 효율에 영향을 줄 수 있다.
또다른 바람직한 측면에서, "발현의 감소"는 "약한" icd 유전자, 즉 그의 효소 활성이 초기 ICD 활성보다 낮은 ICD를 코딩하는 유전자의 도입과 조합되거나, 또는 약하게 발현되는 부위에 icd 부위를 통합하여 세포 내에서 보다 낮은 ICD 활성의 유발에 의한 icd 유전자의 결실 또는 파괴를 의미한다. 이는 icd 유전자를 그로부터 유전자가 보다 낮은 수준으로 전사되는 염색체 로커스에 통합시키거나 또는 비활성이 보다 낮거나 덜 효율적으로 전사되거나, 덜 효율적으로 번역되거나, 세포 내에서 덜 안정한 돌연변이체 또는 이종성 icd 유전자를 도입함으로써 이루어질 수 있다. 상기 돌연변이체 icd 유전자의 도입은 복제 플라스미드를 사용함으로써 또는 게놈 내로의 통합에 의해 수행될 수 있다.
또다른 바람직한 측면에서, "발현의 감소"는 감소된 ICD 활성이, 염색체에서 코딩되는 icd 유전자로부터 전사를 저하시킴으로써, 바람직하게는 초기 프로모터의 돌연변이 또는 초기 ICD 프로모터의 약화된 버젼 또는 보다 약한 이종성 프로모터에 의한 상기 프로모터의 교체에 의해 mRNA 수준이 저하된 결과임을 의미한다. 상기 측면을 수행하고 생성되는 돌연변이체를 사용하여 정밀 화학물질을 생산하기 위한 특히 바람직한 방법이 실시예 6에 설명되어 있다.
또다른 바람직한 측면에서, "발현의 감소"는 감소된 ICD 활성이, 리보좀의 번역 개시 부위에 대한 결합을 감소시켜 icd mRNA의 번역을 감소시키는 RBS 돌연변이의 결과임을 의미한다. 돌연변이는 단일 뉴클레오티드 변화일 수 있고/있거나 출발 코돈에 대한 RBS의 공간적 배치에 영향을 줄 수도 있다. 이들 돌연변이를 달성하기 위해, 돌연변이된 RBS의 세트를 함유하는 돌연변이체 라이브러리를 생성할 수 있다. 적합한 RBS는 예를 들어 보다 낮은 ICD 활성에 대해 선택함으로써 선택될 수 있다. 이어서, 초기 RBS를 선택된 RBS로 교체할 수 있다. 상기 측면을 수행하고 생성되는 돌연변이체를 사용하여 정밀 화학물질을 생산하기 위한 특히 바람직한 방법이 실시예 6에 설명되어 있다.
또다른 바람직한 측면에서, "발현의 감소"는 예를 들어 2차 구조를 변경하여 mRNA의 안정성을 감소시킴으로써 mRNA 수준을 저하시켜 달성된다.
또다른 바람직한 측면에서, "발현의 감소"는 icd 조절제, 예를 들어 전사 조절제에 의해 달성된다.
또다른 바람직한 측면에서 ICD 발현을 하향조절하기 위한 특이적인 방법은 미생물, 특히 코리네박테리움 및 이. 콜라이에서 ICD 활성을 하향조절하기 위한 코돈 사용 빈도 방법의 적용에 관한 한 본원에 참조로 포함되는 PCT/EP2007/061151에 설명된 코돈 사용 빈도 방법이다. PCT/EP2007/061151에는 숙주 세포에서 적어도 하나의 폴리펩티드의 양을 감소시키는 방법이 기재되어 있고, 이 방법은 실질적으로 동일한 아미노산 서열 및/또는 기능의 폴리펩티드를 코딩하는 비-변형된 뉴클레오티드 서열 대신에 상기 숙주 세포 변형된 뉴클레오티드 서열을 상기 숙주 세포에서 발현하는 단계를 포함하고, 상기 변형된 뉴클레오티드 서열은 비-변형된 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 코돈이, 변형된 뉴클레오티드 서열에서 숙주 세포의 코돈 사용 빈도에 따라 사용 빈도가 더 적은 코돈으로 교체되도록 비-변형된 뉴클레오티드 서열로부터 유도된다.
ICD의 양을 감소시키기 위해 코리네박테리움, 특히 바람직하게는 씨. 글루타미쿰에서 발현될 변형된 뉴클레오티드 서열의 경우에, 비-변형된 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 바람직하게는 적어도 1％, 적어도 2％, 적어도 4％, 적어도 6％, 적어도 8％, 적어도 10％, 보다 바람직하게는 적어도 20％, 적어도 40％, 적어도 60％, 적어도 80％, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90％ 또는 적어도 95％, 가장 바람직하게는 모든 코돈이 변형된 뉴클레오티드 서열에서 각각의 아미노산에 대해 사용 빈도가 더 적은 코돈으로 교체될 수 있다. 훨씬 더 바람직한 실시태양에서, 교체되는 상기한 수의 코돈은 빈번한, 매우 빈번한, 극히 빈번한 또는 가장 빈번한 코돈을 나타낸다. 특히 바람직한 다른 실시태양에서, 상기 수의 코돈은 사용 빈도가 가장 낮은 코돈으로 교체된다. 상기 모든 경우에, 기준 코돈 사용 빈도는 코리네박테리움, 바람직하게는 씨. 글루타미쿰의 코돈 사용 빈도, 바람직하게는 코리네박테리움, 바람직하게는 씨. 글루타미쿰의 풍부 단백질의 코돈 사용 빈도를 기초로 할 것이다. 상세한 설명에 대해서는 PCT/EP2007/061151을 참조한다.
본 발명의 특히 바람직한 측면은 미생물에서 이소시트레이트 데히드로게나제의 발현 감소가 PCT/EP2007/061151에 설명된 코돈 사용 빈도를 적용함으로써 달성되는 방법에 관한 것이다. 미생물은 코리네박테리움일 수 있고, 여기서 씨. 글루타미쿰이 바람직하다. 이들 방법은 아미노산, 특히 메티오닌 및/또는 라이신 및 그의 유도체 및 상기 아미노산의 전구체의 유도체, 예를 들어 1,5-디아미노펜탄, β-라이신 및 디피콜리네이트의 합성을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, PCT/EP2007/061151에 설명된 코돈 사용 빈도 방법의 적용에 의해 ICD 활성이 감소된 미생물은 본 발명의 한 바람직한 측면에서 실시태양 (1)에 따른 방법의 수행을 위해 선택되는 미생물이다. 그의 출발 코돈, 예를 들어 ATG의 교체에 의해 ICD 활성이 감소된 미생물, 특히 출발 코돈 ATG가 GTG로 교체된 미생물이 특히 바람직하다. PCT/EP2007/061151에는 특히 한 실시태양에서 출발 코돈의 GTG로의 교체에 의한 및 천연 ICD의 위치 32 및 33에서 GGC ATT로부터 GGG ATA로의 글라이신 및 이소류신 코돈의 변경 (서열 3 대 서열 4 내지 7 비교)에 의한 씨. 글루타미쿰 세포에서의 ICD 감소가 기재되어 있다. PCT/EP2007/061151의 상기 두 개의 실시태양은 실시태양 (1)의 생산 방법의 한 측면에서 ICD 활성의 감소를 위해 선택되는 방법이고, 따라서 본 발명의 실시태양 (1)에 따른 방법에서의 그의 용도가 본원에 구체적으로 참고로 포함된다. 그의 제조 및 용도는 실시예 1 및 3에 예시되어 있다. 상기 예에서 설명된 미생물은 본 발명의 바람직한 실시태양, 특히 균주 ICD ATG → GTG이다.
다른 한편으로, 본 발명의 특히 바람직한 상이한 측면에서, PCT/EP2007/061151에 설명된 코돈 사용 빈도 방법의 적용에 의해 ICD 활성이 감소된 미생물은 실시태양 (1)에 따른 방법에서 선택되는 미생물로부터 배제된다. 상기 측면에 따르면, 실시태양 (1)의 방법은 ICD 발현의 감소가 미생물의 천연 icd 서열 대신에 변형된 ICD 코딩 뉴클레오티드 서열 (icd 서열)의 발현에 의한 것이 아니고, 상기 변형된 icd 코딩 서열은 비-변형된 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 코돈이 변형된 icd 서열에서 숙주 세포의 코돈 사용 빈도에 따라 사용 빈도가 더 적은 코돈으로 교체되도록 비-변형된 icd 서열로부터 유도되는 것인 본 발명의 실시태양이다. 즉, 실시태양 (1)의 방법은 ICD 발현의 감소가 PCT/EP2007/061151에 설명된 변형된 코돈 사용 빈도에 의한 것이 아니고, PCT/EP2007/061151에 설명된 미생물이 사용되지 않는 것인 본 발명의 실시태양이다. 보다 바람직하게는, 실시태양 (1)의 방법은 정밀 화학물질이 라이신, 트레오닌 및 메티오닌으로 이루어지는 군 중에서 선택될 때, ICD 발현의 감소가 미생물의 천연 icd 서열 대신에 변형된 ICD 코딩 뉴클레오티드 서열 (icd 서열)의 발현에 의한 것이 아니고, 상기 변형된 icd 코딩 서열은 비-변형된 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 코돈이 변형된 icd 서열에서 미생물의 코돈 사용 빈도에 따라 사용 빈도가 더 적은 코돈으로 교체되도록 비-변형된 icd 서열로부터 유도되는 것인 본 발명의 실시태양이다.
상기 조건은 그의 ICD 발현이 PCT/EP2007/061151에 설명된 바와 같은 변형된 코돈 사용 빈도에 의해 감소되고 미생물의 내인성 생합성 중간체 또는 최종 생성물의 정밀 화학물질 합성의 비-천연 표적 화합물로의 전환을 촉매하는 이종성 효소를 추가로 포함하는 미생물을 사용한 정밀 화학물질의 생산에는 적용되지 않는다 (아래 참조). 바람직하게는, 상기 이종성 효소는 정밀 화학물질, 특히 효소에 의한 전환을 통해 아스파르테이트 하류의 라이신 또는 그의 생화학적 전구체로부터 유도가능한 정밀 화학물질의 합성 또는 생합성에서 하나 이상의 단계를 촉매하는 효소로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 효소는 탈카르복실화, 탈아미노화, 아미노 전이 반응 (transamination), 유기 분자를 따른 아미노기의 전환, 산화 및/또는 고리화 반응을 촉매하는 효소이다. 훨씬 더 바람직하게는, 효소는 디피콜리네이트 합성효소, 라이신 데카르복실라제 및 라이신 2,3-아미노뮤타제로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 이종성 디피콜리네이트 합성효소, 라이신 데카르복실라제 또는 라이신 2,3-아미노뮤타제를 포함하는 미생물이 특히 바람직하다. 즉, 특히 바람직한 상기 실시태양에서, 미생물은 PCT/EP2007/061151에 설명된 바와 같이 변형된 코돈 사용 빈도에 의해 감소된 ICD 활성을 가질 수 있고, 심지어 PCT/EP2007/061151에 설명된 미생물일 수 있지만, 추가로 이종성 디피콜리네이트 합성효소, 라이신 데카르복실라제 또는 라이신 2,3-아미노뮤타제를 포함한다.
본 발명의 실시태양 (1)에 따른 정밀 화학물질의 제조는 정밀 화학물질이 PCT/EP2007/061151에 나열된 정밀 화학물질이 아닐 경우 PCT/EP2007/061151에 설명된 바와 같은 코돈 사용 빈도에 의해 그의 ICD 활성이 감소된 미생물을 사용하여 수행할 수 있다. 따라서, 아스파르테이트 하류의 생화학적 경로 내의 아미노산의 생화학적 전구체 (예를 들어 아미노산 라이신, 메티오닌, 트레오닌 및 이소류신의 전구체, 예를 들어 2,3-디히드로디피콜리네이트, 디아미노피멜레이트, 호모세린, 호모시스테인 및 2,3-디히드록시-3-메틸발레레이트), 및 상기 아미노산 또는 생화학적 전구체의 천연 또는 비-천연 유도체는 PCT/EP2007/061151에 설명된 미생물의 생성물로서 나열되지 않은 것이기 때문에, 상기 전구체 및 유도체의 군 중에서 선택되는 화합물이 실시태양 (1)에 따른 방법의 바람직한 생성물이다. 상기 아미노산 또는 전구체, 특히 아스파르테이트 하류의 라이신 또는 그의 천연 전구체 중의 하나 (예를 들어 2,3-디히드로디피콜리네이트)의 유도체, 바람직하게는 비-천연 유도체의 제조가 훨씬 더 바람직하다. 1,5-디아미노펜탄 (카다베린), β-라이신 및 디피콜리네이트로 이루어지는 군 중에서 선택되는 화합물의 제조가 특히 바람직하다.
실시태양 (1)의 바람직한 제2 측면에서, ICD 활성은 효소의 부분적인 또는 완전한 억제에 의해 감소된다. 억제는 임의의 공지의 가역적인 또는 비가역적인 ICD 억제제의 ICD에 대한 결합의 결과일 수 있다. 그러한 억제제는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 옥살로아세테이트, 2-옥소글루타레이트 및 시트레이트는 씨. 글루타미쿰에서 ICD의 약한 억제제로서 알려져 있고, 옥살로아세테이트 + 글리옥실레이트는 강한 억제제로서 알려져 있다 (Eikmanns et al (1995) loc. cit.). 상기 억제제는 발효 배지 내에 첨가될 수 있거나, 또는 세포 내에서 그의 합성이 외부 자극에 의해 유도될 수 있다.
실시태양 (1) 및 (2)의 바람직한 몇몇 측면에서, 감소된 ICD 활성은 유전공학 처리된 숙주 세포 (바람직하게는 미생물, 특히 코리네박테리움)에 의한 것이고, 감소된 ICD 발현에 의한 것이 아니다.
특히, 바람직한 제3 측면에서, icd 유전자의 초기 카피를 결실시키고 이를 감소된 ICD 활성을 보이는 ICD를 코딩하는 돌연변이체 버젼으로 또는 초기 ICD보다 ICD 활성이 더 작은 ICD를 코딩하는 이종성 icd 유전자로 치환하면, 본 발명의 미생물의 ICD 활성이 감소한다. 상기 측면을 수행하고 생성되는 돌연변이체를 사용하여 정밀 화학물질을 생산하기 위한 특히 바람직한 방법이 실시예 5에 설명되어 있다.
제4의 바람직한 측면에서, ICD 활성 감소를 야기하는 2 이상의 상기한 특징의 조합이 본 발명에 따른 미생물에서 실현된다.
본 발명의 실시태양 (1)에 따른 바람직한 방법은 상기 원칙이 사용되는, 미생물, 바람직하게는 코리네박테리아, 보다 바람직하게는 씨. 글루타미쿰에서 ICD 활성을 감소시키는 단계를 포함한다.
아스파르테이트 패밀리의 멤버 및 ICD 활성이 감소된 미생물에서 아스파르테이트의 생체내 변환에 의해 형성되는 그들의 전구체의 생합성의 증가는 ICD 억제의 결과로서 PPP 및 글리옥실레이트 션트를 통한 증가된 탄소 유동에 의한 것일 수 있다. 전자는 아미노산 생산을 위한 충분한 환원 당량, 즉 NAD(P)H를 공급하고, 후자는 아스파르테이트 패밀리의 아미노산의 생합성을 위해 필요한 탄소 전구체를 제공한다. 따라서, 본 발명의 한 바람직한 측면에서, 실시태양 (1)에 사용된 미생물 또는 실시태양 (2)에 따른 미생물에서, (i) 글리옥실레이트 션트 및/또는 (ii) 펜토스 포스페이트 경로 (PPP)를 통한 탄소 유동은 야생형 미생물에 비해 증가한다. 바람직하게는, 글리옥실레이트 션트를 통한 탄소 유동이 증가한다. 임의의 상기 증가는 ICD 활성 감소, 유전공학 처리된 미생물, 미생물의 천연 특징, 또는 상기 인자의 임의의 조합에 의한 것일 수 있다. 글리옥실레이트 션트를 통한 증가된 탄소 유동은 바람직하게는 ICD 활성 감소 및/또는 유전공학 처리된 미생물에 의한 것이다. PPP를 통한 증가된 탄소 유동은 바람직하게는 유전공학 처리된 미생물, 보다 바람직하게는 예를 들어 Psod와 같은 강력한 프로모터의 사용에 의한 PPP 효소 발현 수준의 능동적인 상향조절에 의한 것이다 (WO 2005/059144).
상기한 바와 같이, 본 발명은 미생물 및 정밀 화학물질 생산에서 미생물의 용도에 관한 것이다. 그러나, 실시태양 (1)에 따른 생산 방법에서의 미생물 이외에 및 실시태양 (2)에 따른 미생물 대신에 다른 유기체의 사용도 고려된다. 본 발명의 목적을 위한 용어 "유기체"는 상기 규정된 특정 미생물, 조류 및 이끼를 포함하는 식물, 효모, 및 비-인간 동물에서 정밀 화학물질의 생산을 위한 뉴클레오티드 서열의 발현에 통상적으로 사용되는 임의의 비-인간 유기체를 의미한다. 정밀 화학물질 생산에 특히 적합한 미생물 이외의 유기체는 식물 및 식물의 일부이다. 상기 식물은 단자엽 또는 쌍자엽 식물, 예를 들어 단자엽 또는 쌍자엽 작물, 먹이 식물 또는 사료 작물일 수 있다. 단자엽 식물의 예는 아베나 (avena) (귀리), 트리티쿰 (triticum) (밀), 세케일 (secale) (호밀), 호르데움 (hordeum) (보리), 오리자 (oryza) (쌀), 파니쿰 (panicum), 페니세툼 (pennisetum), 강아지풀 (setaria), 수수 (sorghum) (기장), 제아 (zea) (옥수수) 등의 속에 속하는 식물이다.
쌍자엽 작물은 특히 목화, 콩과, 예를 들어 콩 및 특히 알팔파, 대두, 평지씨, 토마토, 사탕무, 감자, 관상용 식물 및 나무를 포함한다. 추가의 작물은 과실 (특히 사과, 배, 체리, 포도, 감귤, 파인애플 및 바나나), 기름 야자나무, 차 덤불, 카카오 나무 및 커피 나무, 담배, 사이잘 및 약용 식물로서 인도사목 (rauwolfia) 및 디기탈리스를 포함할 수 있다. 특히 바람직한 것은 곡물 밀, 호밀, 귀리, 보리, 벼, 옥수수 및 기장, 사탕무, 평지씨, 대두, 토마토, 감자 및 담배이다. 추가의 작물은 US 6,137,030에서 볼 수 있다.
당업자는 상이한 유기체 및 세포, 예를 들어 미생물, 식물 및 식물 세포, 동물 및 동물 세포 등이 세포 내의 icd 유전자 및 ICD 단백질의 수 및 종류에 있어 상이할 것임을 잘 알고 있다. 동일한 유기체 내에서도, 상이한 균주는 단백질 수준에 대해 다소 불균일한 발현 프로필을 보일 수 있다.
미생물과 상이한 유기체가 본 발명의 수행시에 사용되는 경우, 비-발효 생산 방법이 적용될 수 있다.
실시태양 (1), (2), (3) 및 (4)에 따른 본 발명에서, 상기 규정된 바와 같은 임의의 미생물이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 미생물은 원핵생물이다. 본 발명의 수행을 위해 특히 바람직한 미생물은 코리네박테리움 및 브레비박테리움 (Brevibacterium)의 속, 바람직하게는 코리네박테리움, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰, 에스체리키아 속, 특히 에스체리키아 콜라이, 바실러스 속, 특히 바실러스 섭틸리스, 스트렙토마이세스 속 및 아스페르길루스 속으로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 실시태양은 코리네형 (coryneform) 세균, 예를 들어 코리네박테리움 속의 세균으로부터 선택되는 미생물의 사용에 관한 것이다. 특히 바람직한 것은 종 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 (C. acetoglutamicum), 코리네박테리움 아세토아시도필룸 (C. acetoacidophilum), 코리네박테리움 칼루나에 (C. callunae), 코리네박테리움 암모니아게네스 (C. ammoniagenes), 코리네박테리움 테르모아미노게네스 (C. thermoaminogenes), 코리네박테리움 멜라세콜라 및 코리네박테리움 에피지엔스 (C. effiziens)이다. 본 발명의 다른 바람직한 실시태양은 브레비박테리아, 특히 종 브레비박테리움 플라붐 (B. flavum), 브레비박테리움 락토페르멘툼 (B. lactofermentum) 및 브레비박테리움 디바레카툼 (B. divarecatum)의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 씨. 아세토글루타미쿰 ATCC15806, 씨. 아세토아시도필룸 ATCC13870, 코리네박테리움 테르모아미노게네스 FERMBP-1539, 코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC17965, 코리네박테리움 에피지엔스 DSM 44547, 코리네박테리움 에피지엔스 DSM 44549, 브레비박테리움 플라붐 ATCC14067, 브레비박테리움 락토포르멘툼 ATCC13869, 브레비박테리움 디바레카툼 ATCC 14020, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10065 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21608 및 예를 들어 전통적인 돌연변이 유발 및 선택 또는 지정 돌연변이 유발에 의해 그로부터 유도되는 균주로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다.
씨. 글루타미쿰의 다른 바람직한 균주는 ATCC13058, ATCC13059, ATCC13060, ATCC21492, ATCC21513, ATCC21526, ATCC21543, ATCC13287, ATCC21851, ATCC21253, ATCC21514, ATCC21516, ATCC21299, ATCC21300, ATCC39684, ATCC21488, ATCC21649, ATCC21650, ATCC19223, ATCC13869, ATCC21157, ATCC21158, ATCC21159, ATCC21355, ATCC31808, ATCC21674, ATCC21562, ATCC21563, ATCC21564, ATCC21565, ATCC21566, ATCC21567, ATCC21568, ATCC21569, ATCC21570, ATCC21571, ATCC21572, ATCC21573, ATCC21579, ATCC19049, ATCC19050, ATCC19051, ATCC19052, ATCC19053, ATCC19054, ATCC19055, ATCC19056, ATCC19057, ATCC19058, ATCC19059, ATCC19060, ATCC19185, ATCC13286, ATCC21515, ATCC21527, ATCC21544, ATCC21492, NRRLB8183, NRRL W8182, B12NRRLB12416, NRRLB12417, NRRLB12418 및 NRRLB11476으로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다.
약어 KFCC는 한국 종균 협회 (Korean Federation of Culture Collection)이고, ATCC는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American-Type Strain Culture Collection)이고, 약어 DSM은 도이체 잠룸 본 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)이다. 약어 NRRL은 ARS 컬쳐스 컬렉션 노던 리져널 리써치 래버러토리 (ARS cultures collection Northern Regional Research Laboratory, 미국 일리노이주 피오레아)이다.
L-라이신, L-메티오닌, L-이소류신 및/또는 L-트레오닌과 같은 정밀 화학물질을 이미 생산할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰의 균주가 본 발명의 수행을 위해 특히 바람직하다. 그러한 균주는 예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 및 특히 그의 유도체이다. 라이신을 생산하는 것으로 알려져 있는 균주 ATCC13286, ATCC 13287, ATCC 21086, ATCC 21127, ATCC 21128, ATCC 21129, ATCC 21253, ATCC 21299, ATCC 21300, ATCC 21474, ATCC 21475, ATCC 21488, ATCC 21492, ATCC 21513, ATCC 21514, ATCC 21515, ATCC 21516, ATCC 21517, ATCC 21518, ATCC 21528, ATCC 21543, ATCC 21544, ATCC 21649, ATCC 21650, ATCC 21792, ATCC 21793, ATCC 21798, ATCC 21799, ATCC 21800, ATCC 21801, ATCC 700239, ATCC 21529, ATCC 21527, ATCC 31269 및 ATCC 21526도 바람직하게 사용될 수 있다. L-라이신, L-메티오닌 및/또는 L-트레오닌과 같은 정밀 화학물질을 이미 생산할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주가 특히 바람직하다. 따라서, 피드백-내성 (feedback-resistant) 아스파르토키나제 및 그의 유도체가 존재하는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유도된 균주가 특히 바람직하다. 이와 같은 바람직한 균주는 피드백-내성 아스파르토키나제가 존재하는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 유도된 균주를 포함하고, 특히 균주 LU11424, ATCC13032lysCfbr 및 ATCC13286에 관련된다. 피드백-내성 아스파르토키나제가 존재하는 씨. 글루타미쿰, LU11424, ATCC13032lysCfbr, ATCC13032 또는 ATCC13286 및 그의 유도체가 본 발명의 측면에서 특히 바람직한 미생물이다. LU11424, ATCC13032lysCfbr 또는 ATCC13286 및 그의 유도체가 가장 바람직하고, LU11424가 특히 바람직하다.
icd의 내인성 카피를 교체하기 위해 상이한 씨. 글루타미쿰 균주를 사용할 수 있다. 그러나, 예를 들어 ATCC12032lysCfbr, LU11424, 또는 ATCC13032 또는 ATCC13286의 다른 유도체와 같은 씨. 글루타미쿰 라이신 생산 균주를 사용하는 것이 바람직하다.
ATCC13032lysCfbr은 ATCC13032로부터 출발하여 생산할 수 있다. 그러한 라이신 생산 균주를 생성하기 위해, lysC 야생형 유전자의 대립유전자 교환을 씨. 글루타미쿰 ATCC13032에서 수행한다. 이를 위해, 생성되는 단백질이 위치 311에서 트레오닌 대신 이소류신을 보유하도록 뉴클레오티드 교환을 lysC 유전자 내로 도입시킨다. 상기 균주의 제작에 관한 상세한 내용은 특허 출원 WO 2005/059093에 설명되어 있다. lysC 유전자의 기탁 번호는 P26512이다.
LU11424는 실시예 1에 설명된 바와 같이 생산할 수 있다. 이는 ATCC13032lysCfbr의 유도체이다. LU11424 내의 ICD 활성은 바람직하게는 이소시트레이트 데히드로게나제 코딩 뉴클레오티드 서열의 출발 코돈으로서 ATG의 교체, 바람직하게는 ATG의 GTG로의 교체에 의해 감소된다. icd 출발 코돈이 변경된 실시예 1에 설명된 균주가 본 발명의 측면에서 특히 바람직하다 (즉, 균주 ICD ATG→GTG). 그러나, LU11424에 대해 실시예 1에서 나열된 하나 이상의 변형을 갖고 감소된 ICD 활성을 갖는 임의의 ATCC13032 유도체도 본 발명의 수행을 위해 바람직한 균주로 간주된다.
본 발명에 적합하기 위해, 상기 나열된 모든 미생물은 부분적으로 또는 완전히 감소된 ICD 활성을 보일 것으로 이해된다. 본 발명의 문맥에서 바람직한 미생물은 그의 ICD 활성 감소가 유전공학 처리에 의한 것인 재조합 미생물, 예를 들어 실시예 1에 설명된 균주 ICD ATG → GTG이다.
본 발명의 실시태양 (1)은 정밀 화학물질을 생산하기 위한, ICD 활성이 감소된 상기한 미생물의 용도에 관한 것이다.
용어 "정밀 화학물질"은 당업자에게 잘 공지되어 있고, 제약 산업, 농업 및 화장품, 식품 및 사료 산업의 상이한 부분에서 사용될 수 있는 화합물을 나타낸다. 용어 "정밀 화학물질"은 중합체 합성을 위한 단량체도 포함한다.
정밀 화학물질은 추가의 합성 단계를 위해 필요한 최종 생성물 또는 중간체일 수 있다.
본 발명의 측면에서, 용어 "정밀 화학물질들"은 "정밀 화학물질", 즉 단지 하나의 종류의 화합물의 동의어이다. 본 발명의 방법 및 미생물에 의한 정밀 화학물질, 즉 단지 하나의 종류의 표적 화합물의 생산이 바람직하다.
정밀 화학물질은 적어도 2개의 탄소 원자, 및 추가로 탄소 또는 수소 원자가 아닌 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 모든 유기 분자로서 정의된다. 바람직하게는, 용어 "정밀 화학물질"은 적어도 2개의 탄소 원자 및 추가로 적어도 하나의 관능기, 예를 들어 히드록시-, 아미노-, 티올-, 카르보닐-, 카르복시-, 메톡시-, 에테르-, 에스테르-, 아미도-, 포스포에스테르-, 티오에테르- 또는 티오에스테르기를 포함하는 유기 분자를 나타낸다.
정밀 화학물질은 따라서 바람직하게는 유기산, 예를 들어 락트산, 숙신산, 타르타르산, 이타콘산 등을 포함한다. 정밀 화학물질은 아미노산, 퓨린 및 피리미딘 염기, 뉴클레오티드, 지질, 포화 및 불포화 지방산, 예를 들어 아라키돈산, 알콜, 예를 들어 디올, 예를 들어 프로판디올 및 부탄디올, 탄수화물, 예를 들어 히알루론산 및 트레할로스, 방향족 화합물, 예를 들어 바닐린, 비타민 및 보조인자 등을 추가로 포함한다. 트레할로스 및 다음 섹션에서 설명되는 정밀 화학물질이 바람직하다.
본 발명의 목적을 위한 특히 바람직한 군의 정밀 화학물질은 유기산, 아미노산, 유기 아민, 및 방향족 고리 내에 1 또는 2개의 질소를 포함하는 헤테로방향족 화합물로 이루어지는 군 중에서 선택되는 생합성 생성물이다.
보다 바람직하게는, 용어 "정밀 화학물질"은 본 발명의 문맥에서 적어도 3개의 방향족 또는 지방족 탄소 원자 및 추가로 적어도 하나의 카르복시기 또는 아미노기, 훨씬 더 바람직하게는 1 또는 2개의 카르복시기 및/또는 아미노기를 포함하는 분자에 관련된다. 구체적으로, 본 발명의 방법 및/또는 미생물에 의해 생산된 정밀 화학물질은 하기 화학식 I 또는 II의 화합물 또는 그의 염이다:
<화학식 I>
Figure pat00003
상기 식에서,
R1은 -COOH 또는 H이고, R2 및 R3은 서로 독립적으로 NH2 또는 H이고; 여기서 다음 조합이 바람직하다:
R1 = COOH, R2 = NH2, R3 = H; R1 = H, R2 = NH2, R3 = H; R1 = COOH, R2 = H, R3 = NH2.
<화학식 II>
Figure pat00004
상기 개관한 바와 같이, 실시태양 (1)에 따른 방법은
(i) 아스파르테이트 패밀리의 아미노산, 특히 라이신,
(ii) 아스파르테이트 하류의 생화학적 경로 내의 그들의 생화학적 전구체, 및 (iii) 상기 아미노산 또는 생화학적 전구체의 천연 또는 비-천연 유도체
로 이루어지는 군 중에서 선택되는 화합물을 생산하기 위해 특히 적합하다. 비-천연 유도체, 특히 비-천연 효소에 의한 유도체, 및 아미노산의 생산이 바람직하다. 이 중에서, 라이신의 비-천연 유도체 또는 그의 전구체 중의 하나의 비-천연 유도체, 즉 아스파르테이트의 라이신으로의 생물전환에서의 중간체의 생산이 바람직하다.
본 발명에 따른 방법의 특히 바람직한 최종 생성물은 라이신, 메티오닌, 트레오닌, 이소류신, 1,5-디아미노펜탄, β-라이신 및 디피콜리네이트로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 보다 바람직하게는, 최종 생성물은 바람직한 최종 생성물의 군에 포함되는 유도체 (iii) 중에서, 즉 1,5-디아미노펜탄, β-라이신 및 디피콜리네이트로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 1,5-디아미노펜탄 (카다베린)의 생산이 가장 바람직하다.
상기 개관된 바와 같이, 실시태양 (1)의 방법에서 아스파르테이트 패밀리의 아미노산 및 그의 생화학적 전구체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 화합물이 중간체 또는 최종 생성물로서 생산되는 것이 바람직하다. 한 측면에서, 아스파르테이트, 라이신, 메티오닌, 이소류신 및 트레오닌으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산이 실시태양 (1)에 따른 방법의 최종 생성물이고, 여기서 라이신, 메티오닌, 이소류신 및 트레오닌, 특히 라이신이 최종 생성물로서 바람직하다. L-에난티오머가 특히 바람직하다. 제2 측면에서, 각각의 아미노산의 생합성에서 아스파르테이트의 하류에 위치하는 라이신, 메티오닌, 이소류신 및 트레오닌으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산의 생화학적 전구체가 실시태양 (1)에 따른 방법의 최종 생성물이다.
제3 측면에서, 상기 아미노산 또는 아미노산 전구체는 중간 생성물이고, 후속적으로 실시태양 (1)에 따른 방법에서 효소에 의해 또는 비-효소에 의한 방식으로 그의 유도체, 바람직하게는 유기 아민, 유기산, 또는 아미노산으로 전환된다. 바람직하게는, 최종 생성물은 상기 중간 생성물의 비-천연 유도체이다. 후속적으로 전환되는, 특히 바람직한 중간 생성물은 아스파르테이트 하류의 라이신 또는 그의 생화학적 전구체 중의 하나이다. 상기 전구체 중에서, 디히드로디피콜리네이트가 특히 바람직하다.
상기 제3 측면에서, 용어 "유도체"는 (i) 아스파르테이트 패밀리의 아미노산 또는 (ii) 효소에 의한 또는 비-효소에 의한 전환 (효소에 의한 전환이 바람직함)에 의한 아스파르테이트 하류의 생화학적 경로 내의 그의 생화학적 전구체로부터 유도가능한 임의의 화학적 화합물을 의미한다. 바람직하게는, 전환은 다음 중 적어도 하나를 유발한다:
(i) 하나 또는 두 개의 카르복실기의 제거;
(ii) 하나의 아미노기의 제거;
(iii) 하나의 아미노기의 전환; 및/또는
(iv) 탈수소화.
상기 제3 측면에서, 상기 후속적인 전환은 바람직하게는 효소에 의한 전환이거나, 또는 적어도 하나의 효소에 의한 단계를 포함한다. 상기 전환을 촉매하는 효소는 ICD 활성이 감소된 미생물에 내인성이거나 이종성일 수 있다. 효소는 바람직하게는 이종성이다.
후속 전환은 바람직하게는 실시태양 (1)에서 규정된 미생물을 포함하는 반응 혼합물에서 발생한다. 이는 반응 혼합물에 첨가된 단리된 효소에 의해, ICD 활성이 감소된 미생물 이외의 제2 미생물에 의해, 또는 ICD 활성이 감소된 미생물 자체에 의해 촉매될 수 있다. 이는 바람직하게는 ICD 활성이 감소된 미생물 자체에 의해 촉매된다.
따라서, 실시태양 (1)에 따른 방법의 바람직한 측면은 ICD 활성이 부분적으로 또는 완전히 감소된 미생물에서 발생하는, 상기 규정된 바와 같은 후속적인 효소에 의한 전환을 포함한다. 상기 바람직한 측면에 따른 방법에서, 미생물은 바람직하게는 내인성 중간체의 방법의 최종 생성물로의 후속적인 전환에서 반응 단계를 촉매하는 적어도 하나의 이종성 효소를 포함한다.
ICD 활성이 감소된 미생물 내의 상기 이종성 효소는 미생물의 내인성 생합성 중간체 또는 최종 생성물을 정밀 화학물질 합성의 표적 화합물로 전환할 수 있는 임의의 효소일 수 있다. 바람직하게는, 상기 이종성 효소는 정밀 화학물질, 특히 효소에 의한 전환을 통해 아스파르테이트 하류의 라이신 또는 그의 생화학적 전구체로부터 유도가능한 정밀 화학물질의 합성 또는 생합성에서 하나 이상의 단계를 촉매하는 효소로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 효소는 탈카르복실화, 탈아미노화, 아미노 전이 반응, 유기 분자를 따른 아미노기의 전환, 산화 및/또는 고리화 반응을 촉매하는 효소이다. 훨씬 더 바람직하게는, 효소는 디피콜리네이트 합성효소, 라이신 데카르복실라제 및 라이신 2,3-아미노뮤타제로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 이종성 디피콜리네이트 합성효소, 라이신 데카르복실라제 또는 라이신 2,3-아미노뮤타제를 포함하는 미생물이 특히 바람직하다.
따라서, 실시태양 (1)에 따른 방법의 특히 바람직한 측면에서, 미생물은 이전 섹션에서 규정된 바와 같은 적어도 하나의 이종성 효소를 포함한다. 디피콜리네이트, 1,5-디아미노펜탄 및 β-라이신으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 생성물 중의 하나의 제조를 위해 최적화된, 다음과 같은 미생물의 사용이 특히 바람직하다:
디피콜리네이트: 이종성 디피콜리네이트 합성효소가 존재하는 미생물;
1,5-디아미노펜탄: 이종성 라이신 데카르복실라제가 존재하는 미생물;
β-라이신: 이종성 라이신 2,3-아미노뮤타제가 존재하는 미생물.
실시태양 (1)에 따른 방법의 각각의 바람직한 최종 생성물에 대해, 감소된 ICD 활성을 가질 뿐만 아니라, 요구되는 최종 생성물의 생산을 위해 특이적으로 적응시킨 미생물이 사용될 수 있다. 이러한 적응은 원치 않는 부산물/부수물의 합성을 담당하는 것으로 알려진 효소 활성의 억제 또는 감소에 의한 것일 수 있다. 생합성 경로의 일부를 형성하는 효소의 양 또는 활성의 저하는 예를 들어 부산물의 생산을 차단하고 대사 흐름을 바람직한 방향으로 돌림으로써 상기한 정밀 화학물질의 합성을 증가시킬 수 있다.
다른 한편으로, 상기 적응은 효소의 증가된 활성 또는 정밀 화학물질 생산을 향상시키는 것으로 알려진 대사 경로에 의한 것일 수 있다. 미생물의 상기 적응은 요구되는 최종 생성물에 이르는 하나 이상의 전환 단계를 촉매하는 효소, 특히 아스파르테이트 하류의 전환 단계를 촉매하는 효소, 보다 특히 아스파르테이트의 라이신으로의 전환에서 전환 단계를 촉매하는 효소 또는 미생물의 내인성 생합성 중간체 또는 최종 생성물의 정밀 화학물질 합성의 비-천연 표적 화합물로의 전환을 촉매하는 이종성 효소의 활성 및/또는 발현의 증가를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 적응은 야생형 미생물이 표적 화합물을 합성할 수 없기 때문에, 표적 정밀 화학물질의 생산을 향상시키거나 또는 심지어 상기 생산에 필수적인 적어도 하나의 이종성 효소가 미생물 내에 존재하는 것에 의한 것이 바람직하다.
따라서, 생산 방법 (1)의 표적 화합물이 1,5-디아미노펜탄 (카다베린)인 실시태양 (1)에 따른 방법의 측면에서, 상기 방법의 수행에 특히 바람직한 미생물은 감소된 ICD 활성을 가질 뿐만 아니라, 라이신 데카르복실라제도 또한 포함한다. 상기 데카르복실라제는 바람직하게는 이종성 (재조합) 라이신 데카르복실라제이다. 미생물은 라이신을 생산하고 이를 카다베린으로 전환하는 능력을 갖는다.
보다 바람직하게는, 라이신 데카르복실라제는 WO 2007/113127에 설명된 바와 같이 이종성 라이신 데카르복실라제이다. 라이신 데카르복실라제 (EC 4.1.1.18)는 L-라이신의 카다베린으로의 탈카르복실화를 촉매한다. 라이신 데카르복실라제 활성을 갖는 이. 콜라이로부터의 효소는 cadA (서열 10) 유전자 생성물 (서열 11; Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Entry b4131) 및 ldcC (서열 12) 유전자 생성물 (서열 13; Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Entry JW0181)이다.
이. 콜라이 라이신 데카르복실라제를 코딩하는 DNA 분자는 서열 11 또는 13의 아미노산 서열로부터 역-번역된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 프로브로 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다.
별법으로, 이. 콜라이 라이신 데카르복실라제 유전자는 긴 올리고뉴클레오티드의 수동 프라이밍 (priming) 또는 PCR을 사용하여 DNA 분자를 합성함으로써 얻을 수 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Ausubel et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, pages 8.2.8 to 8.2.13 (1990)], [Wosnick et al., Gene 60:115 (1987)]; [Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, pages 8-8 to 8-9, John Wiley & Sons, Inc. (1995)]; 및 DNA 합성과 관련하여 WO 2007/113127에서 제시되는 추가의 인용문헌을 참조한다.
또한, 모 효소에 비해 상기 규정된 바와 같은 보존적 아미노산 변화를 보유하는 이. 콜라이 라이신 데카르복실라제의 변이체도 사용될 수 있다. 또한, WO 2007/113127을 참조한다.
이. 콜라이 라이신 데카르복실라제 내의 보존적 아미노산 변화는 서열 10 또는 12에 제시된 뉴클레오티드 대신에 뉴클레오티드를 치환함으로써 도입될 수 있다. 상기 "보존적 아미노산" 변이체는 예를 들어 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이 유발, 링커-스캐닝 돌연변이 유발, 중합효소 연쇄 반응을 사용한 돌연변이 유발 등에 의해 얻을 수 있다 ([Ausubel et al., 상기 문헌, at pages 8.0.3-8.5.9]; [Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, pages 8-10 to 8-22 (John Wiley & Sons, Inc. 1995]). 또한, 일반적으로, 문헌 [McPherson (ed.), DIRECTED MUTAGENESIS: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1991)]을 참조한다. 상기 변이체가 L-라이신을 카다베린으로 전환하는 능력은 표준 효소 활성 분석, 예를 들어 WO 2007/113127에 설명된 분석을 사용하여 결정할 수 있다.
본 발명의 문맥에서 바람직한 라이신 데카르복실라제는 이. 콜라이로부터의 라이신 데카르복실라제 및 대응하는 "원래의" 유전자 생성물과 80％ 이하, 바람직하게는 90％, 가장 바람직하게는 95％ 또는 98％의 서열 동일성 (아미노산 서열 기준)을 갖고 라이신 데카르복실라제의 생물학적 활성을 계속 갖는 그의 상동체이다. 이들 상동성 유전자는 당업계에 공지된 방법에 의해 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 삽입을 도입함으로써 쉽게 제작할 수 있다. 또한, 이. 콜라이의 라이신 데카르복실라제 (서열 11 및 13)는 코리네박테리움 글루타미쿰의 코돈 사용 빈도를 적용함으로써 DNA로 재번역될 수 있다. 상기 라이신 데카르복실라제 폴리뉴클레오티드 서열은 코리네박테리움 속의 미생물, 특히 씨. 글루타미쿰에서 라이신 데카르복실라제의 발현에 유용하다.
1,5-디아미노펜탄의 생산을 위한 특히 훨씬 더 바람직한 미생물은 감소된 ICD 활성을 갖고 라이신 데카르복실라제를 포함할 뿐만 아니라, WO 2007/113127에 설명된 바와 같이 라이신 생합성에서 중요한 역할을 수행하는 효소를 코딩하는 적어도 하나의 추가의 상향조절 또는 하향조절된 유전자를 포함한다. WO 2007/113127에 구체적으로 설명되고 본 발명의 수행에 필요한 감소된 ICD 활성을 추가로 갖는 미생물이 카다베린의 생산에 가장 바람직하다. 특히 바람직한 측면에서, 유전자 디아민 아세틸트랜스퍼라제는 하향조절된다. 즉, 유전자는 완전히 불활성화되거나 또는 유전자 활성이 감소된다. 디아민 아세틸트랜스퍼라제의 서열은 WO 2007/113127에 설명되어 있다.
표적 화합물이 β-라이신인 실시태양 (1)에 따른 방법의 측면에서, 상기 방법을 수행하기 위해 특히 바람직한 미생물은 감소된 ICD 활성을 가질 뿐만 아니라, 또한 라이신-2,3-아미노뮤타제를 포함한다. 상기 아미노뮤타제는 바람직하게는 이종성 (재조합) 라이신-2,3-아미노뮤타제이다. 미생물은 라이신을 생산하고 이를 β-라이신으로 전환하는 능력을 갖는다.
보다 바람직하게는, 라이신-2,3-아미노뮤타제는 WO 2007/101867에 설명된 바와 같은 이종성 라이신-2,3-아미노뮤타제이다. 라이신 2,3-아미노뮤타제는 L-라이신의 β-라이신으로의 가역적인 이성체화를 촉매한다. 클로스트리듐 서브테르미날레 균주 SB4로부터 단리된 효소는 확산 및 침강 계수로 결정된 분자량이 285,000인, 외관상 동일한 서브유닛의 육량체 단백질이다 ([Chirpich et al., J. Biol. Chem. 245:1778 (1970)]; [Aberhart et al., J. Am. Chem. Soc. 105:5461 (1983)]; [Chang et al., Biochemistry 35:11081 (1996)]). 클로스트리듐 효소는 철-황 클러스터, 코발트 및 아연, 및 피리독살 5'-포스페이트를 함유하고, S-아데노실메티오닌에 의해 활성화된다. 전형적인 아데노실코발라민-의존성 아미노뮤타제와 달리, 클로스트리듐 효소는 비타민 B12 조효소의 임의의 종을 함유하거나 필요로 하지 않는다. 클로스트리듐 라이신 2,3-아미노뮤타제의 뉴클레오티드 및 예측된 아미노산 서열 (서열 14 및 16)은 US 6,248,874 B1에 개시되어 있다.
클로스트리듐 라이신 2,3-아미노뮤타제를 코딩하는 DNA 분자는 서열 16의 아미노산 서열로부터 역-번역된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 프로브 또는 서열 14를 기초로 한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 프로브로 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 예를 들어, 적합한 라이브러리는 클로스트리듐 서브테르미날레 균주 SB4 (ATCC No. 29748)로부터 게놈 DNA를 얻고, 표준 방법에 따라 라이브러리를 제작함으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, pages 2-1 to 2-13 and 5-1 to 5-6 (John Wiley & Sons, Inc. 1995)]을 참조한다.
별법으로, 라이신 2,3-아미노뮤타제 유전자는 긴 올리고뉴클레오티드의 수동 프라이밍 또는 PCR을 사용하여 DNA 분자를 합성함으로써 얻을 수 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Ausubel et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, pages 8.2.8 to 8.2.13 (1990)], [Wosnick et al., Gene 60:115 (1987)]; [Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, pages 8-8 to 8-9, John Wiley & Sons, Inc. (1995)]; 및 DNA 합성과 관련하여 WO 2007/113127 및 WO 2007/101867에서 제시되는 추가의 인용문헌을 참조한다.
또한, 모 효소에 비해 상기 규정된 바와 같은 보존적 아미노산 변화를 보유하는 라이신 2,3-아미노뮤타제의 변이체도 사용될 수 있다. 또한, WO 2007/101867을 참조한다.
라이신 2,3-아미노뮤타제 내의 보존적 아미노산 변화는 서열 14에 제시된 뉴클레오티드 대신에 뉴클레오티드를 치환함으로써 도입될 수 있다. 상기 "보존적 아미노산" 변이체는 예를 들어 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이 유발, 링커-스캐닝 돌연변이 유발, 중합효소 연쇄 반응을 사용한 돌연변이 유발 등에 의해 얻을 수 있다 ([Ausubel et al., 상기 문헌, at pages 8.0.3-8.5.9]; [Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, pages 8-10 to 8-22 (John Wiley & Sons, Inc. 1995]). 또한, 일반적으로, 문헌 [McPherson (ed.), DIRECTED MUTAGENESIS: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1991)]을 참조한다. 상기 변이체가 L-라이신을 β-라이신으로 전환하는 능력은 표준 효소 활성 분석, 예를 들어 WO 2007/101867에 설명된 분석을 사용하여 결정할 수 있다.
클로스트리듐 서브테르미날레 이외의 다른 공급원, 예를 들어 바실러스 섭틸리스 또는 에스체리키아 콜라이로부터의 라이신-2,3-아미노뮤타제가 US 6,248,874 B1에 개시되어 있다. 상기 미국 특허의 라이신-2,3-아미노뮤타제의 단리, 서열 번호 및 발현에 대한 부분이 본원에 참조로 명백하게 포함된다.
본 발명에 사용하기에 바람직한 라이신-2,3-아미노뮤타제는 클로스트리듐 서브테르미날레, 바실러스 섭틸리스 및 에스체리키아 콜라이로부터의 라이신-2,3-아미노뮤타제 및 대응하는 천연 아미노산 서열과 80％ 이하, 바람직하게는 90％, 가장 바람직하게는 95％ 및 98％의 서열 동일성 (아미노산 서열 기준)을 갖고 라이신-2,3-아미노뮤타제의 생물학적 활성을 계속 갖는 그의 상동체이다. 이들 상동체는 당업계에 공지된 방법에 의해 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 삽입을 도입함으로써 쉽게 제작할 수 있다.
다른 바람직한 라이신-2,3-아미노뮤타제는 코리네박테리움 글루타미쿰의 코돈 사용 빈도를 적용함으로써 DNA로 재변역된 클로스트리듐 서브테르미날레 (US 6,248,874 B1의 서열 2)로부터의 라이신-2,3-아미노뮤타제이다 (서열 15). 상기 라이신-2,3-아미노뮤타제 폴리뉴클레오티드 서열은 코리네박테리움 속, 특히 씨. 글루타미쿰의 미생물에서 라이신-2,3-아미노뮤타제의 발현에 유용하다.
β-라이신의 생산을 위한 특히 훨씬 더 바람직한 미생물은 감소된 ICD 활성을 갖고 라이신-2,3-아미노뮤타제를 포함할 뿐만 아니라, WO 2007/101867에 설명된 바와 같이 라이신 생합성에서 중요한 역할을 수행하는 효소를 코딩하는 적어도 하나의 추가의 상향조절 또는 하향조절된 유전자를 포함한다. WO 2007/101867에 구체적으로 설명되고 본 발명의 수행에 필요한 감소된 ICD 활성을 추가로 갖는 미생물이 β-라이신의 생산에 가장 바람직하다.
표적 화합물이 디피콜리네이트인 실시태양 (1)에 따른 방법의 측면에서, 상기 방법의 수행을 위해 특히 바람직한 미생물은 감소된 ICD 활성을 가질 뿐만 아니라, 또한 디피콜리네이트 합성효소를 포함한다. 상기 디피콜리네이트 합성효소는 바람직하게는 이종성 (재조합) 디피콜리네이트 합성효소이다. 미생물은 2,3-디히드로피콜리네이트를 생산하고 이를 디피콜리네이트로 전환하는 능력을 갖는다.
보다 바람직하게는, 디피콜리네이트 합성효소는 EP 08151031.5에 설명된 바와 같은 이종성 디피콜리네이트 합성효소이다.
본원의 실시태양 (1)에 따른 방법을 따른 DPA의 발효 생산은 디히드로디피콜리네이트, 특히 L-2,3-디히드로디피콜리네이트가 중간 생성물인 디아미노피멜레이트 (DAP) 경로를 통해 라이신을 생산하는 능력을 갖고, 추가로 디히드로디피콜리네이트, 특히 L-2,3-디히드로디피콜리네이트가 DPA로 전환되도록 이종성 디피콜리네이트 합성효소를 발현하는 능력을 갖는, 적어도 하나의 재조합 ICD 활성이 감소된 미생물의 배양을 포함한다. 특히, 상기 모 미생물은 라이신 생산 세균, 바람직하게는 코리네형 세균이다. 특히, 상기 모 미생물은 코리네박테리움 속의 세균, 예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰이다.
상기 이종성 디피콜리네이트 합성효소는 원핵생물 또는 진핵생물 기원의 것이다. 예를 들어, 상기 이종성 디피콜리네이트 합성효소는 바실러스 속의 세균, 특히 바실러스 섭틸리스로부터 기원할 수 있다. 상기 바실러스 효소는 EP 08151031.5에 설명된 바와 같이 알파 및 베타 서브유닛으로 이루어진다. 본 발명의 방법의 추가의 실시태양에서, 이종성 디피콜리네이트 합성효소는 EP 08151031.5의 서열 2에 따른 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 80％의 동일성, 예를 들어 적어도 85, 90, 92, 95, 96, 97, 98 또는 99％의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 적어도 하나의 알파 서브유닛; 및 EP 08151031.5의 서열 3에 따른 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 80％의 동일성, 예를 들어 적어도 85, 90, 92, 95, 96, 97, 98 또는 99％의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 적어도 하나의 베타 서브유닛을 포함한다.
디피콜리네이트 합성효소 활성을 갖는 효소는 라이신을 생산하는 능력을 갖는 상기 모 미생물의 코돈 사용 빈도에 적응된 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 예를 들어, 디피콜리네이트 합성효소 활성을 갖는 효소는
a) 서열 17 (EP 08151031.5의 서열 1)에 따른 spoVF 유전자 서열, 또는
b) 본질적으로 EP 08151031.5의 서열 4에 따른 잔기 193 내지 잔기 1691의 코딩 서열을 포함하는 합성 spoVF 유전자 서열; 또는
c) 상기 규정된 바와 같은 디피콜리네이트 합성효소 또는 그의 알파 및/또는 베타 서브유닛을 코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열
을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
디피콜리네이트 합성효소를 코딩하는 DNA 분자는 서열 19 또는 20의 아미노산 서열로부터 역-번역된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 프로브 또는 서열 17에 기반한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 프로브로 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 별법으로, 디피콜리네이트 합성효소 유전자는 긴 올리고뉴클레오티드의 수동 프라이밍 또는 PCR을 사용하여 DNA 분자를 합성함으로써 얻을 수 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Ausubel et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, pages 8.2.8 to 8.2.13 (1990)], [Wosnick et al., Gene 60:115 (1987)]; [Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, pages 8-8 to 8-9, John Wiley & Sons, Inc. (1995)]; 및 DNA 합성과 관련하여 WO 2007/113127 및 WO 2007/101867에서 제시되는 추가의 인용문헌을 참조한다.
모 효소에 비해 상기 규정된 바와 같은 보존적 아미노산 변화를 함유하는 디피콜리네이트 합성효소의 변이체가 또한 사용될 수 있다. 또한, EP 08151031.5를 참조한다.
디피콜리네이트 합성효소 내의 보존적 아미노산 변화는 서열 17에 제시된 뉴클레오티드 대신에 뉴클레오티드를 치환함으로써 도입될 수 있다. 상기 "보존적 아미노산" 변이체는 예를 들어 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이 유발, 링커-스캐닝 돌연변이 유발, 중합효소 연쇄 반응을 사용한 돌연변이 유발 등에 의해 얻을 수 있다 ([Ausubel et al., 상기 문헌, at pages 8.0.3-8.5.9]; [Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, pages 8-10 to 8-22 (John Wiley & Sons, Inc. 1995]). 또한, 일반적으로, 문헌 [McPherson (ed.), DIRECTED MUTAGENESIS: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1991)]을 참조한다. 상기 변이체가 2,3-디히드로디피콜리네이트를 DPA로 전환시키는 능력은 표준 효소 활성 분석을 이용하여 결정할 수 있다.
다른 바람직한 디피콜리네이트 합성효소는 코리네박테리움 글루타미쿰의 코돈 사용 빈도를 적용함으로써 DNA로 재번역되는 비. 섭틸리스로부터의 디피콜리네이트 합성효소이다 (서열 18). 상기 디피콜리네이트 합성효소 폴리뉴클레오티드 서열은 코리네박테리움 속의 미생물, 특히 씨. 글루타미쿰 내에서 디피콜리네이트 합성효소의 발현을 위해 유용하다.
디피콜리네이트의 생산을 위한 특히 훨씬 더 바람직한 미생물은 감소된 ICD 활성을 갖고 디피콜리네이트 합성효소를 포함할 뿐만 아니라, 또한 EP 08151031.5에 설명된 바와 같이 라이신 생합성에서 중요한 역할을 하는 효소를 코딩하는 적어도 하나의 추가의 상향조절 또는 하향조절된 유전자를 포함한다. 특히, 디히드로디피콜리네이트 하류의 하나 이상의 효소, 특히 디히드로디피콜리네이트 자체를 전환하는 효소가 하향조절된 미생물이 바람직하고, 그 이유는 이들 미생물에서 디히드로디피콜리네이트로부터 출발하는 천연 라이신 생합성에서 탄소 손실이 감소되어 디피콜리네이트의 탄소 수율을 향상시키기 때문이다. EP 08151031.5에 구체적으로 설명되고 추가로 본 발명의 수행에 필요한 감소된 ICD 활성을 갖는 미생물이 디피콜리네이트의 생산에 가장 바람직하다.
본 발명에 따라 생산되는 디피콜리네이트는 폴리에스테르 또는 폴리아미드 유형의 공중합체의 합성에서의 단량체, 피리딘 합성의 전구체, 퍼옥시드 및 과산, 예를 들어 t-부틸 퍼옥시드, 디메틸-시클로헥사논 퍼옥시드, 퍼옥시아세트산 및 퍼옥시-일황산의 안정화제, 금속 표면 연마 용액의 성분, 미량의 금속 이온의 존재에 의해 열화되기 쉬운 유기 물질의 안정화제 (격리 효과), 에폭시 수지의 안정화제, 및 사진용 용액 또는 에멀젼의 안정화제 (특히, 칼슘염의 침전 억제에 의한)로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 생산되는 1,5-디아미노펜탄은 폴리아미드 또는 폴리우레탄의 합성에서 단량체로서; 또는 피페리딘 합성을 위한 전구체로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 생산된 베타-라이신은 카프로락탐의 합성을 위해 또는 폴리아미드의 합성에서 단량체로서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법 (1) 및 미생물 (2)의 바람직한 실시태양에서, 미생물의 내인성 생합성 경로에서 ICD 활성 외에 하나 이상의 추가의 효소 활성이 변형되어, 표적 화합물에 대한 탄소 수율을 증가시킨다. 바람직하게는, 아스파르테이트의 라이신, 메티오닌 또는 이소류신으로의 생화학적 형질전환을 촉매하는 하나 이상의 효소가 상향조절 또는 하향조절된다.
바람직하게는, 코리네박테리움 효소 및 특히 씨. 글루타미쿰 효소의 활성이 상향조절 또는 하향조절된다.
바람직하게는, 상기 변형은 상기 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 변형에 의해 달성된다.
바람직한 제1 측면에서, 즉, 라이신 생합성이 변형될 경우에, 즉 라이신, 그의 유도체 또는 전구체 중의 하나가 실시태양 (1)에 따른 방법에서 중간체 또는 최종 생성물로서 생산되는 경우에, 상기 변형된 효소 및/또는 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 상향조절되거나 바람직하게는 하향조절되는 다음 유전자 생성물을 코딩하는 서열로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 상향조절되는 (즉, 그 활성이 야생형 미생물에 비해 증가되어야 함) 유전자 생성물은 다음 군 중에서 선택된다: 아스파르테이트 키나제, 아스파르테이트-세미알데히드-데히드로게나제, 디히드로디피콜리네이트-합성효소, 디히드로디피콜리네이트-리덕타제, 디아미노피멜레이트-데히드로게나제, 디아미노피멜레이트-데카르복실라제, 라이신-방출인자 (exporter), 피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 (PEP) 카르복실라제, 글루코스-6-포스페이트-데히드로게나제, 6-포스포-글루코놀락토나제, 6-포스포글루코네이트-데히드로게나제, 리보스-5-포스페이트-이소머라제, 리보스-포스페이트 에피머라제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 글루코스포스페이트-이소머라제, 전사 조절제 LuxR, 전사 조절제 LysR1, 전사 조절제 LysR2, 말레이트-퀴논-옥시도리덕타제, 말레이트 데히드로게나제, 프럭토스-1,6-비스포스파타제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 글리세르알데히드-포스페이트 데히드로게나제, 포스포글리세레이트 키나제, 포스포글리세레이트 뮤타제 에놀라제, 피루베이트 키나제, 아르기닐-t-RNA-합성효소, 단백질 OpcA, 1-포스포프럭토키나제, 6-포스포프럭토키나제, 비오틴-리가제, 이소시트레이트 리아제, 말레이트 합성효소, 테트라히드로피콜리네이트-숙시닐라제, 숙시닐-아미노케토피멜레이트-아미노트랜스퍼라제, 숙시닐-디아미노피멜레이트-데숙시닐라제, 디아미노피멜레이트-에피머라제, 아스파르테이트-트랜스아미나제 및 말레이트-효소, PTS 당 흡수 시스템의 성분, accBC (아세틸 CoA 카르복실라제), accDA (아세틸 CoA 카르복실라제), aceA (이소시트레이트-리아제), acp (아실 담체 단백질), asp (아스파르타제), atr61 (ABC 수송체), ccsB (시토크롬 c 합성 단백질), cdsA (포스파티데이트-시티딜일트랜스퍼라제), citA (2-성분 시스템의 센서 키나제), cls (카르디올리핀 합성효소), cma (시클로프로판-미올산 합성효소), cobW (코발라민 합성-관련 단백질), cstA (탄소 결핍 (starvation) 단백질 A), ctaD (시토크롬 aa3 옥시다제 UE1), ctaE (시토크롬 aa3 옥시다제 UE3), ctaF,4 (시토크롬 aa3 옥시다제의 서브유닛), cysD (술페이트-아데노실트랜스퍼라제), cysE (세린-아세틸트랜스퍼라제, cysH, cysK (시스테인 합성효소), cysN (술페이트-아데노실트랜스퍼라제), cysQ (수송 단백질), dctA (C4 디카르복실레이트 수송 단백질), dep67 (코발라민 합성-관련 단백질), dps (DNA 보호 단백질), dtsR (프로피오닐-CoA 카르복실라제), fad15 (아실-CoA-합성효소), ftsX (세포 분열 단백질), glbO (HB-유사 단백질), glk (글루코키나제), gpmB (포스포글리세레이트 키나제 II), hemD hemB (유로포르피리노겐-II-합성효소, 델타-아미노레불린산 데히드라타제), lldd2 (락테이트 데히드로게나제), metY (O-아세틸호모세린-술프히드릴라제), msiK (당 도입 단백질), ndkA (뉴클레오시드 디포스페이트 키나제), nuoU (NADH-데히드로게나제 서브유닛 U), nuoV (NADH-데히드로게나제 서브유닛 V), nuoW (NADH-데히드로게나제 서브유닛 W), oxyR (전사 조절제), pgsA2 (CDP-디아실글리세롤-3-P-3-포스파티딜트랜스퍼라제), pknB (단백질 키나제 B), pknD (단백질 키나제 D), plsC (1-아실-SN-글리세롤-3-P-아실트랜스퍼라제), poxB gnd (피루베이트 옥시다제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제), ppgK (폴리포스페이트 글루코키나제), ppsA (PEP 합성효소), qcrA (Rieske Fe-S-단백질), qcrA (Rieske Fe-S-단백질), qcrB (시토크롬 B), qcrB (시토크롬 B), qcrC (시토크롬 C), rodA (세포 분열 단백질), rpe (리불로스 포스페이트 이소머라제), rpi (포스포펜토스 이소머라제), sahH (아데노실 호모시스테이나제), sigC (시그마 인자 C), sigD (전사인자 시그마 D의 활성인자), sigE (시그마 인자 E), sigh (시그마 인자 H), sigM (시그마 인자 M), sod (수퍼옥시드디스뮤타제), thyA (티미딜레이트 합성효소), truB (tRNA 슈도우리딘 55 합성효소) 및 zwa1 (PS1-단백질).
이 중에서, 다음이 상향조절을 위해 바람직하다: 아스파르테이트 키나제, 아스파르테이트-세미알데히드-데히드로게나제, 디히드로디피콜리네이트-합성효소, 디히드로디피콜리네이트-리덕타제, 디아미노피멜레이트-데히드로게나제, 디아미노피멜레이트-데카르복실라제, 라이신-방출인자, 피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 (PEP) 카르복실라제, 글루코스-6-포스페이트-데히드로게나제, 6-포스포-글루코놀락토나제, 6-포스포글루코네이트-데히드로게나제, 리보스-5-포스페이트-이소머라제, 리보스-포스페이트 에피머라제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 이소시트레이트 리아제, 말레이트 합성효소, 테트라히드로피콜리네이트-숙시닐라제, 숙시닐-아미노케토피멜레이트-아미노트랜스퍼라제, 숙시닐-디아미노피멜레이트-데숙시닐라제 및 디아미노피멜레이트-에피머라제.
상기 바람직한 제1 측면에서, 바람직하게는 하향조절되는 유전자 생성물 (즉, 그들의 활성이 야생형 미생물에 비해 감소되어야 함)은 다음 군 중에서 선택된다: 포스포에놀피루베이트-카르복시키나제, 피루베이트-옥시다제, 호모세린-키나제, 호모세린-데히드로게나제, 트레오닌-방출인자, 트레오닌-유출인자, 아스파라기나제, 아스파르테이트-데카르복실라제, 트레오닌-합성효소, 시트레이트 합성효소, 아코니타제, 이소시트레이트-데히드로게나제, 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제, 숙시닐-CoA-합성효소, 숙시네이트-데히드로게나제, 푸마라제, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제, 말레이트 데히드로게나제, 피루베이트 키나제, 말산 효소 트레오닌-데히드라타제, 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제, O-아세틸호모세린-술프히드릴라제, alr (알라닌 라세마제), atr43 (ABC 수송체), ccpA1 (이화산물 제어 단백질 a), ccpA2 (이화산물 제어 단백질), chrA (2 성분 반응 조절제), chrS (히스티딘 키나제), citB (전사 조절제), citE (시트레이트 리아제 E), citE (시트레이트 리아제 E), clpC (프로테아제), csp1, ctaF (시토크롬 aa3 옥시다제의 4 서브유닛), dctA (C4-디카르복실레이트 수송 단백질), dctQ sodit (C4-디카르복실레이트 수송 단백질), dead (DNA/RNA 헬리카제), def (펩티드 데포르밀라제), dep33 (다제 약물 내성 단백질 B), dep34 (유출 단백질), fda (프럭토스 비스포스페이트 알돌라제), gorA (글루타티온 리덕타제), gpi/pgi (글루코스-6-P-이소머라제), hisC2 (히스티디놀 포스페이트 아미노트랜스퍼라제), hom (호모세린 데히드로게나제), lipA (리포에이트 합성효소), lipB (지단백질-리가제 B), lrp (류신 반응 조절제), luxR (전사 조절제), luxS (감각 도입 단백질 키나제), lysR1 (전사 조절제), lysR2 (전사 조절제), lysR3 (전사 조절제), mdhA (말레이트 데히드로게나제), menE (O-숙시닐벤조산 CoA 리가제), mikE17 (전사 인자), mqo (말레이트-퀴논 옥시도리덕타제), mtrA mtrB (센서 단백질 cpxA, 감각 조절 성분), nadA (퀴놀리네이트 합성효소 A), nadC (니코티네이트 뉴클레오티드 피로포스파제), otsA (트레할로스-6-P-합성효소), otsB, treY, treZ (트레할로스 포스파타제, 말토올리고실-트레할로스 합성효소, 말토올리고실-트레할로스 트레할로히드롤라제), pepC (아미노펩티다제 I), pepCK (PEP-카르복시키나제), pfKA pfkB (1 및 6-포스포프럭토키나제), poxB (피루베이트 옥시다제), poxB gnd (피루베이트 옥시다제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제), pstC2 (막 결합형 포스페이트 수송 단백질), rp1K (PS1-단백질), sucC sucD (숙시닐 CoA 합성효소), sugA (당 수송 단백질), tmk (티미딜레이트 키나제), zwa2, metK metZ, glyA (세린히드록시메틸트랜스퍼라제), sdhC sdhA sdhB (숙시네이트 DH), smtB (전사 조절제), cgl1 (전사 조절제), hspR (전사 조절제), cgl2 (전사 조절제), cebR (전사 조절제), cgl3 (전사 조절제), gatR (전사 조절제), glcR (전사 조절제), tcmR (전사 조절제), smtB2 (전사 조절제), dtxR (전사 조절제), degA (전사 조절제), galR (전사 조절제), tipA2 (전사 조절제), malI (전사 조절제), cgl4 (전사 조절제), arsR (전사 조절제), merR (전사 조절제), hrcA (전사 조절제), glpR2 (전사 조절제), lexA (전사 조절제), ccpA3 (전사 조절제), degA2 (전사 조절제), 메틸말로닐-CoA-뮤타제.
이 중에서, 다음은 하향조절을 위해 바람직하다: 포스포에놀피루베이트-카르복시키나제, 피루베이트-옥시다제, 호모세린-키나제, 호모세린-데히드로게나제, 숙시닐-CoA-합성효소, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제 및 메틸말로닐-CoA- 뮤타제.
생산된 라이신 유도체가 디아미노펜탄인 경우에, 디아민 아세틸트랜스퍼라제의 유전자는 우선적으로 하향조절된다. 즉, 유전자는 완전히 불활성화되거나 유전자 활성이 감소된다. 디아민 아세틸트랜스퍼라제의 서열은 WO 2007/113127에 설명되어 있다.
바람직한 제2 측면에서, 즉, 메티오닌 생합성이 변형될 경우에, 즉 메티오닌, 그의 유도체 또는 전구체 중의 하나가 실시태양 (1)에 따른 방법에서 중간체 또는 최종 생성물로서 생산되는 경우에, 바람직하게는 하향조절되는 변형된 효소 및/또는 뉴클레오티드 서열은 호모세린-키나제, 트레오닌-데히드라타제, 트레오닌-합성효소, 메조-디아미노피멜레이트 D-데히드로게나제, 포스포에놀피루베이트-카르복시키나제, 피루베이트-옥시다제, 디히드로디피콜리네이트-합성효소, 디히드로디피콜리네이트-리덕타제, 및 디아미노피콜리네이트-데카르복실라제를 코딩하는 서열로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 효소는 하향조절된다. 이 중에서, 다음이 하향조절을 위해 바람직하다: 호모세린-키나제, 포스포에놀피루베이트-카르복시키나제 및 디히드로디피콜리네이트-합성효소.
상기 바람직한 제2 측면에서, 바람직하게는 상향조절되는 유전자 생성물은 다음 군 중에서 선택된다: 시스타티오닌 합성효소, 시스타티오닌 리아제, 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제, O-아세틸호모세린-술프히드릴라제, 호모세린-데히드로게나제, 아스파르테이트-키나제, 아스파르테이트-세미알데히드-데히드로게나제, 글리세린알데히드-3-포스페이트-데히드로게나제, 3-포스포글리세레이트-키나제, 피루베이트-카르복실라제, 트리오스포스페이트-이소머라제, 트랜스알돌라제, 트랜스케톨라제, 글루코스-6-포스페이트-데히드로게나제, 비오틴-리가제, 단백질 OpcA, 1-포스포프럭토-키나제, 6-포스포프럭토-키나제, 프럭토스-1,6-비스포스파타제, 6-포스포글루코네이트-데히드로게나제, 호모세린-데히드로게나제, 포스포글리세레이트-뮤타제, 피루베이트-키나제, 아스파르테이트-트랜스아미나제, 조효소 B12-의존성 메티오닌-합성효소, 조효소 B12-비의존성 메티오닌-합성효소 및 말레이트-효소.
바람직한 제3 측면에서, 즉, 트레오닌 생합성이 변형될 경우에, 즉 트레오닌, 그의 유도체 또는 전구체 중의 하나가 실시태양 (1)에 따른 방법에서 중간체 또는 최종 생성물로서 생산되는 경우에, 바람직하게는 하향조절되는 변형된 효소 및/또는 뉴클레오티드 서열은 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제, 세린-히드록시메틸트랜스퍼라제, O-아세틸호모세린-술프히드릴라제, 메조-디아미노피멜레이트 D-데히드로게나제, 포스포에놀피루베이트-카르복시키나제, 피루베이트-옥시다제, 디히드로디피콜리네이트-합성효소, 디히드로디피콜리네이트-리덕타제, 아스파라기나제, 아스파르테이트-데카르복실라제, 라이신-방출인자, 아세토락테이트-합성효소, 케톨-산-리덕토이소머라제, 분지쇄 아미노트랜스퍼라제, 조효소 B12-의존성 메티오닌-합성효소, 조효소 B12-비의존성 메티오닌-합성효소, 디히드록시산 데히드라타제 및 디아미노피콜리네이트-데카르복실라제를 코딩하는 서열로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 효소는 하향조절된다.
상기 바람직한 제3 측면에서, 바람직하게는 상향조절된 유전자 생성물은 다음 군 중에서 선택된다: 트레오닌-데히드라타제, 트레오닌 합성효소, 호모세린-데히드로게나제, 아스파르테이트-키나제, 아스파르테이트-세미알데히드-데히드로게나제, 글리세린알데히드-3-포스페이트-데히드로게나제, 3-포스포글리세레이트-키나제, 피루베이트-카르복실라제, 트리오스포스페이트-이소머라제, 트랜스알돌라제, 트랜스케톨라제, 글루코스-6-포스페이트-데히드로게나제, 비오틴-리가제, 단백질 OpcA, 1-포스포프럭토-키나제, 6-포스포프럭토-키나제, 프럭토스-1,6-비스포스파타제, 6-포스포글루코네이트-데히드로게나제, 포스포글리세레이트-뮤타제, 피루베이트-키나제, 아스파르테이트-트랜스아미나제 및 말레이트-효소. 바람직하게는, 상기 효소는 상향조절된다.
실시태양 (1)은 표적 화합물 (정밀 화학물질)을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 용어 "회수하는"은 배양 배지로부터 화합물의 추출, 수거, 단리 또는 정제를 포함한다. 화합물의 회수는 통상적인 수지 (예를 들어, 음이온 또는 양이온 교환 수지, 비-이온 흡착 수지 등)를 사용한 처리, 통상적인 흡수재 (예를 들어, 활성탄, 규산, 실리카겔, 셀룰로스, 알루미나 등)를 사용한 처리, pH이 변경, 용매 추출 (예를 들어, 통상적인 용매, 예를 들어 알콜, 에틸 아세테이트, 헥산 등의 사용), 증류, 투석, 여과, 농축, 결정화, 재결정화, pH 조정, 동결건조 등을 포함하고 이로 제한되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 통상적인 단리 또는 정제 방법에 따라 수행할 수 있다. 예를 들어, 표적 화합물을 먼저 미생물을 제거함으로써 배양 배지로부터 회수할 수 있다. 이어서, 남아있는 브로쓰 (broth)는 원치 않는 양이온을 제거하기 위해 양이온 교환 수지를 통과하거나 양이온 교환 수지를 가로지른 후, 원치 않는 무기 음이온 및 유기산을 제거하기 위해 음이온 교환 수지를 통과하거나 음이온 교환 수지를 가로지르게 된다.
본 발명의 실시태양 (2)는 재조합 미생물에 관한 것이다. 상기 미생물은 상기 섹션에서 나타낸 바와 동일한 선호도로 상기에서 상세히 나열된 임의의 미생물일 수 있다. 특정 측면에서, 이는 씨. 글루타미쿰이고, 바람직하게는 피드백-내성 아스파르토키나제를 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC13032 유도체이고, 특히 ATCC13032lysCfbr 또는 ATCC13286, 또는 LU11424와 같은 상기 균주의 유도체이다 (실시예 1 참조). LU11424가 특히 바람직하다.
실시태양 (2)에 따른 미생물은 PCT/EP2007/061151에 이미 개시된 특정 미생물을 배제하기 위해 실시태양 (2) 내에 포함된 조건 기준을 충족시킨다면, 실시태양 (1)에 따른 생산 방법에 사용된 미생물에 대해 상기 설명된 임의의 특징을 가질 수 있다. PCT/EP2007/061151에 설명된 코돈 사용 빈도 방법의 적용에 의해 ICD 활성이 감소된 미생물은 상기 미생물이 PCT/EP2007/061151에 개시된 경우 실시태양 (2)에 따른 미생물로부터 배제된다. 상기 조건은, ICD 발현의 감소가 미생물의 천연 icd 서열 대신에 변형된 ICD 코딩 뉴클레오티드 서열 (icd 서열)의 발현에 의한 것이 아니고, 상기 변형된 icd 코딩 서열은 비-변형된 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 코돈이 변형된 icd 서열에서 숙주 세포의 코돈 사용 빈도에 따라 사용 빈도가 더 적은 코돈으로 교체되도록 비-변형된 icd 서열로부터 유도되는 것인 미생물을 배제하지 않는다. 즉, ICD 발현의 감소가 PCT/EP2007/061151에 설명된 변형된 코돈 사용 빈도에 의한 것이 아니고, PCT/EP2007/061151에 설명된 미생물이 아닌 미생물은 본 발명의 실시태양 (2)로부터 배제되지 않는다.
상기 조건은 그의 ICD 발현이 PCT/EP2007/061151에 설명된 바와 같은 변형된 코돈 사용 빈도에 의해 감소되고 미생물의 내인성 생합성 중간체 또는 최종 생성물의 정밀 화학물질 합성의 비-천연 표적 화합물로의 전환을 촉매하는 이종성 효소를 추가로 포함하는 미생물을 또한 배제하지 않는다 (상기 참조). 바람직하게는, 상기 이종성 효소는 정밀 화학물질, 특히 효소에 의한 전환을 통해 아스파르테이트 하류의 라이신 또는 그의 생화학적 전구체로부터 유도가능한 정밀 화학물질의 합성 또는 생합성에서 하나 이상의 단계를 촉매하는 효소로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 효소는 탈카르복실화, 탈아미노화, 아미노 전이 반응, 유기 분자를 따른 아미노기의 전환, 산화 및/또는 고리화 반응을 촉매하는 효소이다. 훨씬 더 바람직하게는, 효소는 디피콜리네이트 합성효소, 라이신 데카르복실라제 및 라이신 2,3-아미노뮤타제로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 이종성 디피콜리네이트 합성효소, 라이신 데카르복실라제 또는 라이신 2,3-아미노뮤타제를 포함하는 미생물이 특히 바람직하다. 즉, 특히 바람직한 상기 실시태양에서, 미생물은 PCT/EP2007/061151에 설명된 바와 같이 변형된 코돈 사용 빈도에 의해 감소된 ICD 활성을 가질 수 있고, 심지어 PCT/EP2007/061151에 설명된 미생물일 수 있지만, 추가로 이종성 디피콜리네이트 합성효소, 라이신 데카르복실라제 또는 라이신 2,3-아미노뮤타제를 포함한다.
실시태양 (2)에 따른 상기 미생물은 실시태양 (1)에 따른 방법의 수행에 특히 적합하다. 이는 바람직하게는 코리네박테리움 및 바람직하게는 씨. 글루타미쿰 내에서 ICD 발현을 보다 낮게 하는 벡터 및/또는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직한 측면에서, 상기 보다 낮은 ICD 발현은 이소시트레이트 데히드로게나제 코딩 뉴클레오티드 서열의 출발 코돈으로서 ATG의 교체, 바람직하게는 ATG의 GTG로의 교체에 의해 발생한다.
특히 바람직한 실시태양 (2)에 따른 미생물은 그의 부분적으로 또는 완전히 감소된 이소시트레이트 데히드로게나제 활성이 이소시트레이트 데히드로게나제 코딩 뉴클레오티드 서열의 출발 코돈으로서 ATG의 교체, 바람직하게는 ATG의 GTG로의 교체에 의해 발생하는 LU11424이다.
특히, 실시태양 (2)의 재조합 미생물은 실시태양 (1)의 문맥에서 상세하게 상기 설명된 바와 같이 아스파르테이트 패밀리의 아미노산 또는 그의 생화학적 전구체 중의 하나를 추가의 정밀 화학물질로 전환시킬 수 있는 이종성 효소를 추가로 포함한다. 상기 효소는 바람직하게는 아스파르테이트 하류의 라이신 또는 그의 생화학적 전구체 중의 하나를 추가의 정밀 화학물질로 전환시킬 수 있다.
상기 특정 측면에서, 이종성 효소는 바람직하게는 라이신 데카르복실라제, 라이신-2,3-아미노뮤타제 및 디피콜리네이트 합성효소로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
미생물 (2)의 용도 (3)은 실시태양 (1)에 설명된 방법에서의 용도를 포함한다.
실시태양 (4)에서, 본 발명은 실시태양 (1)에 따른 방법에 의해 제조된 정밀 화학물질로부터 제조된 생성물의 생산 방법을 제공한다. 중간 생성물이 실시태양 (1)에 대해 상기 규정된 바와 같은 방법에 의해 제조되는 단계를 포함하는,
(i) 폴리아미드, 폴리우레탄 또는 피페리딘 (1,5-디아미노펜탄이 중간 생성물임);
(ii) 카프로락탐 또는 폴리아미드 (β-라이신이 중간 생성물임); 또는
(iii) 폴리에스테르 또는 폴리아미드 또는 안정화제, (디피콜리네이트가 중간 생성물임)
의 제조 방법이 실시태양 (4)의 바람직한 측면이다.
실시태양 (4)의 특정 측면에서, 방법은 폴리아미드 (예를 들어 나이론?)의 생산 방법이고, 실시태양 (1)에 따른 카다베린의 생산 및 상기 카다베린과 디카르복실산의 반응을 포함한다. 카다베린은 공지의 방식으로 디-, 트리- 또는 폴리카르복실산과 반응하여 폴리아미드를 생성시킨다. 바람직하게는, 카다베린은 4 내지 10개의 탄소를 함유하는 디카르복실산, 예를 들어 숙신산, 글루타르산, 아디프산, 피멜산, 수베르산, 아젤라산, 세박산 등과 반응한다. 디카르복실산은 바람직하게는 유리 산이다.
실시태양 (4)의 추가의 특정 측면에서, 방법은 β-아미노-ε-카프로락탐, ε-카프로락탐, 또는 ε-아미노카프로산의 생산 방법이고, 실시태양 (1)에 따른 β-라이신의 생산을 포함한다. β-라이신의 상기 전환의 한 측면에서, 본 발명은 실시태양 (1)에 따른 β-라이신의 생산 방법을 한 단계로서 포함하는 β-아미노-ε-카프로락탐의 생산 방법을 제공한다. β-라이신은 후속적으로 분자내 고리화를 거쳐 β-아미노-ε-카프로락탐을 생성시킨다. 상기 고리화 반응은 β-라이신의 단리 및/또는 정제 전에 직접 또는 단리된 β-라이신을 사용하여 수행할 수 있다.
β-라이신의 상기 전환의 제2 측면에서, 본 발명은 실시태양 (1)에 따른 β-라이신의 생산 방법을 한 단계로서 포함하는 ε-카프로락탐의 생산 방법을 제공한다. 상기 설명된 바와 같이, β-라이신은 추가로 분자내 고리화를 β-아미노-ε-카프로락탐을 생성시키고, 이는 선택적으로 탈아미노화되어 ε-카프로락탐을 얻을 수 있다. 상기 탈아미노화 과정은 당업계에 공지되어 있다.
β-라이신의 상기 전환의 제3 측면에서, 본 발명은 한 단계로서 실시태양 (1)에 따른 β-라이신의 생산 방법 및 β-라이신의 β-아미노 관능기의 탈아미노화에 의한 후속적인 제거를 포함하는 아미노카프로산의 생산 방법을 제공한다. 생성되는 ε-아미노카프로산은 ε-카프로락탐으로 또는 공지의 중합 기술에 의해 직접 - 락탐으로의 고리화 단계 없이 - 폴리아미드로 전환될 수 있다. ε- 카프로락탐은 폴리아미드, 특히 PA6의 생산에 매우 중요한 단량체이다.
실시태양 (4)의 추가의 특정 측면에서, 방법은 폴리에스테르 또는 폴리아미드 (예를 들어 나이론?) 공중합체의 생산 방법이고, 실시태양 (1)에 따른 디피콜리네이트의 생산, 상기 디피콜리네이트의 단리, 및 상기 디피콜리네이트와 폴리올 및 폴리아민 중에서 선택되는 적어도 하나의 추가의 다가 공단량체와의 후속적인 중합을 포함한다. 디피콜리네이트는 공지의 방식으로 디-, 트리- 또는 폴리아민과 반응하여 폴리아미드를 얻거나, 또는 디-, 트리- 또는 폴리올과 반응하여 폴리에스테르를 얻는다. 바람직하게는, 디피콜리네이트는 4 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 폴리아민 또는 폴리올과 반응한다.
당업자는 예를 들어 특정 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 또는 내인성 뉴클레오티드 서열을 변형된 뉴클레오티드 서열로 교체하는 방법을 잘 알고 있다. 이는 예를 들어 전기천공, 화학적 형질전환, 접합 또는 다른 적합한 형질전환 방법에 의해 적합한 구성체 (복제 기점 미함유 플라스미드, 복제 기점 미함유 선형 DNA 단편)의 도입에 의해 달성할 수 있다. 이어서, 예를 들어 내인성 천연 생성 서열 대신 변형된 뉴클레오티드 서열을 보유하는 세포만 확인되는 것을 보장하는 선택가능 마커 (marker)를 사용하여 상동성 재조합을 수행한다. 다른 방법은 내인성 염색체 로커스의 유전자 파괴 및 예를 들어 플라스미드로부터 변형된 서열의 발현을 포함한다. 또 다른 방법은 예를 들어 전위 (transposition)를 포함한다. 사용될 수 있는 벡터 및 숙주 세포에 대한 추가의 정보를 아래에 제공할 것이다.
일반적으로, 당업자는 이. 콜라이 및 씨. 글루타미쿰과 같은 미생물 내에서 폴리펩티드의 발현을 유도하기 위한 벡터와 같은 구성체의 설계를 잘 알고 있다. 당업자는 또한 씨. 글루타미쿰 및 이. 콜라이와 같은 미생물의 배양 조건, 및 상기한 미생물로부터 정밀 화학물질, 예를 들어 아미노산, 특히 라이신, 메티오닌 및 트레오닌을 수거하고 정제하기 위한 절차를 잘 숙지하고 있다. 이들 측면 중 일부를 아래에서 추가로 상세하게 설명할 것이다.
당업자는 또한 원래의 비-변형된 뉴클레오티드 서열을 동일한 아미노산의 폴리펩티드를 코딩하지만 상이한 핵산 서열을 갖는 변형된 뉴클레오티드 서열로 변화시키는 기술도 잘 알고 있다. 이는 예를 들어 중합효소 연쇄 반응 기반 돌연변이 유발 기술에 의해, 일반적으로 공지된 클로닝 절차에 의해, 화학적 합성 등에 의해 달성할 수 있다. 재조합 DNA 기술 및 분자 생물학의 표준 기술은 다양한 출판물, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press] 또는 [Ausubel et al. (eds) Current protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc. 2007)], [Ausubel et al., Current Protocols in Protein Science, (John Wiley & Sons, Inc. 2002)], [Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition (John Wiley & Sons, Inc. 1995)]에 설명되어 있다. 씨. 글루타미쿰에 대한 구체적인 방법은 문헌 [Eggeling and Bott (eds.) Handbook of Corynebacterium (Taylor and Francis Group, 2005)]에 설명되어 있다. 이들 절차 중 일부를 아래에서 및 "실시예" 섹션에서 설명한다.
다음에서, 이. 콜라이 및 특히 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 미생물 내에서 유전자 조작을 수행할 수 있는 방법을 상세하게 설명하거나 제시할 것이다.
벡터 및 숙주 세포
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 그가 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 나타낸다.
벡터의 하나의 종류는 "플라스미드"이고, 이는 추가의 DNA 세그먼트가 라이게이팅될 수 있는 환상 이중 가닥 DNA 루프를 나타낸다. 벡터의 다른 종류는 바이러스 벡터이고, 여기서 추가의 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈 내로 라이게이팅될 수 있다.
특정 벡터는 그가 도입되는 숙주 세포 내에서 자동 복제할 수 있다 (예를 들어, 세균 복제 기점 및 에피솜 포유동물 벡터를 갖는 세균 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입 시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 그들이 작동가능하게 연결되는 유전자의 발현을 지시할 수 있다.
상기 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 언급된다.
일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, 플라스미드는 가장 일반적으로 사용되는 형태의 벡터이므로, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 하는 그러한 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)를 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명의 재조합 미생물의 제조에 적합한 재조합 발현 벡터는 상기 규정된 바와 같은 이종성 핵산을 숙주 세포 내에서 각각의 핵산의 발현을 위해 적합한 형태로 포함할 수 있고, 이는 재조합 발현 벡터가 발현을 위해 사용할 숙주 세포에 기초하여 선택된 하나 이상의 조절 서열 (이는 발현시킬 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다)을 포함함을 의미한다.
재조합 발현 벡터 내에서, "작동가능하게 연결된"은 관심있는 뉴클레오티드 서열이 (예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템 내에서 또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입될 경우 숙주 세포 내에서) 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 조절 서열(들)에 연결되는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 용어 "조절 서열"은 프로모터, 리프레서 결합 부위, 활성인자 결합 부위, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소 (예를 들어, 종결인자, 폴리아데닐화 신호, 또는 mRNA 2차 구조의 다른 요소)를 포함하는 것으로 의도된다. 상기 조절 서열은 예를 들어 문헌 [Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 설명되어 있다. 조절 서열은 많은 종류의 숙주 세포 내에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 지시하는 것 및 특정 숙주 세포 내에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 것을 포함한다. 바람직한 조절 서열은 예를 들어 프로모터, 예를 들어 cos-, tac-, trp-, tet-, trp-, tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, arny, SP02, e-Pp- ore PL, SOD, EFTu, EFTs, GroEL, MetZ (마지막 5개는 씨. 글루타미쿰으로부터 유도됨)이고, 바람직하게는 세균에서 사용된다. 추가의 조절 서열은 예를 들어 효모 및 진균으로부터의 프로모터, 예를 들어 ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, 식물로부터의 프로모터, 예를 들어 CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos 또는 유비퀴틴- 또는 파세올린-프로모터이다. 인공 프로모터를 사용하는 것도 가능하다. 당업자는 발현 벡터의 설계가 형질전환시킬 숙주 세포의 선택, 요구되는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되어 융합 단백질 또는 펩티드를 포함하는 단백질 또는 펩티드를 생산할 수 있다.
숙주 세포, 바람직하게는 코리네박테리움, 특히 바람직하게는 씨. 글루타미쿰 내에서 변형된 뉴클레오티드 서열의 발현 유도에 적합한 임의의 벡터는 이들 숙주 세포 내의 ICD의 양을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 벡터는 예를 들어 코리네형 세균에서 자동 복제가능한 플라스미드 벡터일 수 있다. 그 예는 pZ1 (Menkel et al. (1989), Applied and Environmental Microbiology 64:549-554), pEKEx1 (Eikmanns et al. (1991), Gene 102:93-98), pHS2-1 (Sonnen et al. (1991), Gene 107:69-74)이다. 이들 벡터는 잠재 (cryptic) 플라스미드 pHM1519, pBL1 또는 pGA1에 기초한 것이다. 다른 적합한 벡터는 pClik5MCS (WO 2005/059093), 또는 pCG4 (US-A 4,489,160) 또는 pNG2 (Serwold-Davis et al. (1990), FEMS Microbiology Letters 66:119-124) 또는 pAG1 (US-A 5,158,891)에 기초한 벡터이다. 다른 적합한 벡터에 대한 예는 문헌 [Handbook of Corynebacterium, Chapter 23 (edited by Eggeling and Bott, ISBN 0-8493-1821-1, 2005)]에서 찾을 수 있다.
재조합 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포 내에서 특이적 뉴클레오티드 서열의 발현을 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 세균 세포, 예를 들어 씨. 글루타미쿰 및 이. 콜라이, 곤충 세포 (바큘로바이러스 발현 벡터를 사용함), 효모 및 다른 진균 세포 ([Romanos, M.A. et al. (1992), Yeast 8:423-488]; [van den Hondel, C. A. M. J. J. et al. (1991) in: More Gene Manipulations in Fungi, J. W. Bennet & L .L. Lasure, eds., p. 396-428, Academic Press: San Diego]; 및 [van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge] 참조), 조류 및 다세포 식물 세포 ([Schmidt, R. and Willmitzer, L. (1988) Plant Cell Rep.:583-586] 참조) 내에서 발현될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 문헌 [Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 추가로 논의되어 있다. 별법으로, 재조합 발현 벡터는 예를 들어 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 중합효소를 사용하여 시험관 내에서 전사되고 번역될 수 있다.
원핵생물 내에서 단백질의 발현은 가장 종종 융합 또는 비-융합 단백질의 발현을 지시하는 구성적 또는 유도가능 프로모터를 함유하는 벡터를 사용하여 수행된다.
융합 벡터는 많은 아미노산을 코딩되는 단백질에, 대체로 재조합 단백질의 아미노 말단, 및 C-말단에 부가하거나 또는 단백질의 적합한 구역 내에 융합시킨다. 그러한 융합 벡터는 일반적으로 다음과 같은 4개의 목적을 위한 것이다: 1) 재조합 단백질의 발현 증가; 2) 재조합 단백질의 가용성 증가; 3) 친화도 정제에서 리간드로서 작용함으로써 재조합 단백질의 정제 보조; 및 4) 추후 단백질 검출을 위한 "태그"의 제공. 종종, 융합 발현 벡터에서, 융합 단백질의 정제 후에 융합 모이어티 (moiety)로부터 재조합 단백질의 분리가 가능하도록 융합 모이어티와 재조합 단백질의 연결부에 단백분해 절단 부위가 도입된다. 그러한 효소, 및 그의 동족 (cognate) 인식 서열은 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나제를 포함한다.
전형적인 융합 발현 벡터는 pGEX (파마시아 바이오테크 인크 (Pharmacia Biotech Inc); [Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40]), pMAL (뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs, 미국 뉴저지주 베벌리)) 및 pRIT5 (파마시아 (Pharmacia, 미국 뉴저지주 피츠카타웨이))을 포함하고, 각각 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST), 말토스 E 결합 단백질, 또는 단백질 A를 융합시킨다.
적합한 유도가능 비-융합 이. 콜라이 발현 벡터의 예는 pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315), pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, egtll, pBdC1, 및 pET lld ([Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89]; 및 [Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York, ISBN 0 444 904018])를 포함한다. pTrc 벡터로부터 표적 유전자 발현은 하이브리드 trp-lac 융합 프로모터로부터 숙주 RNA 중합효소의 전사에 의존한다. pET lld 벡터로부터 표적 유전자 발현은 동시발현된 바이러스 RNA 중합효소 (T7gnl)에 의해 매개되는 T7 gnlO-lac 융합 프로모터로부터의 전사에 의존한다. 상기 바이러스 중합효소는 lacUV 5 프로모터의 전사 제어 하에 T7gnl 유전자를 보유하는 정주 (resident) X 프로파지로부터 숙주 균주 BL21 (DE3) 또는 HMS 174 (DE3)에 의해 공급된다. 다른 종류의 세균의 형질전환을 위해, 적절한 벡터를 선택될 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 pIJ101, pIJ364, pIJ702 및 pIJ361은 스트렙토마이세스를 형질전환시키는데 유용한 것으로 알려져 있고, 플라스미드 pUB110, pC194 또는 pBD214는 바실러스 종의 형질전환에 적합하다. 코리네박테리움 내로의 유전 정보의 전달에 유용한 몇몇 플라스미드는 pHM1519, pBL1, pSA77 또는 pAJ667을 포함한다 (Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York ISBN 0 444 904018).
적합한 씨. 글루타미쿰 및 이. 콜라이 셔틀 (shuttle) 벡터의 예는 예를 들어 pClik5aMCS (WO 2005/059093)이거나; 문헌 [Eikmanns et al. (1991) Gene 102:93-8]에서 찾을 수 있다.
코리네박테리아를 조작하기 위해 적합한 벡터에 대한 예는 문헌 [Handbook of Corynebacterium (edited by Eggeling and Bott, ISBN 0-8493-1821-1, 2005)]에서 찾을 수 있다. 이. 콜라이 - 씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터의 목록 (표 23.1), 이. 콜라이 - 씨. 글루타미쿰 셔틀 발현 벡터의 목록 (표 23.2), 씨. 글루타미쿰 염색체 내로 DNA의 통합을 위해 사용될 수 있는 벡터의 목록 (표 23.3), 씨. 글루타미쿰 염색체 내로 통합을 위한 발현 벡터의 목록 (표 23.4), 및 씨. 글루타미쿰 염색체 내로 부위-특이적 통합을 위한 벡터의 목록 (표 23.6)을 찾을 수 있다.
또다른 실시태양에서, 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 에스. 세레비지애 내에서 발현을 위한 벡터의 예는 pYepSec1 (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6:229-234), 2i, pAG-1, Yep6, Yep13, PEMBLYe23, pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), 및 pYES2 (인비트로겐 코퍼레이션 (Invitrogen Corporation, 미국 캘리포니아주 샌디에고))를 포함한다. 다른 진균, 예를 들어 사상 진균에서 사용하기 적절한 벡터 및 벡터의 제작 방법은 문헌 [van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P.J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy et al., eds., p. 1-28], [Cambridge University Press: Cambridge, and Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York (ISBN 0 444 904018)]에 상세히 설명된 것을 포함한다.
본 발명의 목적에서, 작동가능한 연결은 각각의 조절 요소가 코딩 서열을 발현시킬 때 그의 결정에 따라 그의 기능을 충족시킬 수 있는 방식으로, 프로모터 (리보좀 결합 부위 (RBS)를 포함하는), 코딩 서열, 종결인자 및 임의로 추가의 조절 요소의 순차적인 정렬로 이해된다
또다른 실시태양에서, 이종성 뉴클레오티드 서열은 단세포 식물 세포 (예를 들어, 조류)에서 또는 고등 식물 (예를 들어, 종자식물, 예를 들어 작물)로부터의 식물 세포에서 발현될 수 있다. 식물 발현 벡터의 예는 문헌 [Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) Plant Mol. Biol. 20:1195-1197]; 및 [Bevan, M.W. (1984) Nucl. Acid. Res. 12:8711-8721]에 상세히 설명된 것을 포함하고, pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004, 및 pDH51을 포함한다 (Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York ISBN 0 444 904018).
원핵 및 진핵 세포 모두에 대한 다른 적합한 발현계에 대해서는 문헌 [chapters 16 and 17 of Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003]을 참조한다.
또다른 실시태양에서, 재조합 발현 벡터는 특정 세포 종류에서, 예를 들어 식물 세포 내에서 핵산의 발현을 우세하게 지시할 수 있다 (예를 들어, 조직-특이적 조절 요소가 핵산을 발현시키기 위해 사용된다). 조직-특이적 조절 요소는 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 다른 측면은 그 내부에 재조합 발현 벡터 또는 핵산이 도입된 유기체 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 생성되는 세포 또는 유기체는 각각 재조합 세포 또는 유기체이다. 상기 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라, 자손이 재조합 핵산을 포함하는 경우에 그러한 세포의 자손 또는 잠재적인 자손을 나타내는 것으로 이해된다. 돌연변이 또는 환경의 영향으로 인해 다음 세대에서 특정 변형이 일어날 수 있으므로, 그러한 자손은 사실상 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 자손이 여전히 재조합 단백질을 발현하거나 발현할 수 있는 한, 본원에서 사용되는 용어의 범위 내에 여전히 포함된다.
벡터 DNA는 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기술을 통해 원핵 또는 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형질전환" 및 "형질감염", "접합" 및 "형질도입"은 외래 핵산 (예를 들어, 선형 DNA 또는 RNA (예를 들어, 선형화 벡터 또는 벡터가 없는 유전자 구성체 단독) 또는 벡터 형태의 핵산 (예를 들어, 플라스미드, 파지, 파스미드, 파지미드, 트랜스포존 또는 다른 DNA))를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 다양한 당업계에서 인정되는 기술, 예를 들어 인산칼슘 또는 염화칼슘 동시-침전, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 리포펙션 (lipofection), 자연적 형질전환 적격 (natural competence), 접합 화학물질-매개 전달, 또는 전기천공을 나타내는 것으로 의도된다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키기 위한 적합한 방법은 문헌 [Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003)], 및 다른 실험 매뉴얼에서 찾을 수 있다.
이들 통합체 (integrant)를 확인하고 선택하기 위해, 선택가능 마커 (예를 들어, 항생제에 대한 내성)를 코딩하는 유전자를 일반적으로 관심있는 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입한다. 바람직한 선택가능 마커는 G418, 히그로마이신, 카나마이신, 테트라사이클린, 암피실린 및 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여하는 것을 포함한다. 선택가능 마커를 코딩하는 핵산은 상기 언급된 변형된 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 것과 동일한 벡터 상에서 숙주 세포 내로 도입될 수 있거나 또는 별개의 벡터 상에서 도입될 수 있다. 도입된 핵산으로 안정하게 형질감염된 세포는 약물 선택에 의해 확인할 수 있다 (예를 들어, 선택가능 마커 유전자가 통합된 세포는 생존할 것인 반면, 다른 세포는 죽는다).
복제 기점 및 2개의 상이한 마커 유전자가 존재하지 않는 플라스미드가 사용될 때 (예를 들어, pClik int sacB), 삽입체의 일부가 게놈 내로 삽입된 마커-미함유 균주를 생성하는 것도 가능하다. 이는 2회의 연속적인 상동성 재조합 사건에 의해 달성된다 (또한, 문헌 [Becker et al., APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 71 (12), p. 8587-8596]; [Eggeling and Bott (eds) Handbook of Corynebacterium (Taylor and Francis Group, 2005)] 참조). 플라스미드 pClik int sacB의 서열은 WO 2005/059093에서 서열 24로서 찾을 수 있고; 여기서, 플라스미드는 pCIS로 불린다.
또다른 실시태양에서, 도입된 유전자의 조절된 발현을 허용하는 선택 시스템을 함유하는 재조합 미생물이 생산될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열을 lac 오페론의 제어 하에 벡터에 포함시키면, 유전자는 IPTG의 존재에서만 발현될 수 있다. 그러한 조절 시스템은 당업계에 잘 공지되어 있다.
에스체리키아 콜라이 및 코리네박테리움 글루타미쿰의 성장 - 배지 및 배양 조건
한 실시태양에서, 방법은 미생물을 정밀 화학물질 생산을 위해 적합한 배지 내에서 배양하는 것을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 방법은 배지 또는 숙주 세포로부터 정밀 화학물질을 단리하는 것을 추가로 포함한다.
당업자는 씨. 글루타미쿰 및 이. 콜라이와 같은 일반적인 미생물의 배양에 익숙하다. 따라서, 이. 콜라이 및 씨. 글루타미쿰의 배양에 대한 일반적인 교시내용을 아래에 제공할 것이다. 추가의 정보는 이. 콜라이 및 씨. 글루타미쿰의 배양에 대한 표준 교과서로부터 검색할 수 있다.
이. 콜라이 균주는 각각 MB 및 LB 브로쓰 내에서 일상적으로 성장된다 (Follettie et al. (1993) J. Bacteriol. 175:4096-4103). 이. 콜라이를 위한 최소 배지는 각각 M9 및 변형된 MCGC (Yoshihama et al. (1985) J. Bacteriol. 162:591-597)이다. 글루코스가 1％의 최종 농도로 첨가될 수 있다. 항생제는 다음 양 (㎍/ml)으로 첨가될 수 있다: 암피실린, 50; 카나마이신, 25; 날리딕산, 25. 아미노산, 비타민 및 다른 보충물이 다음 양으로 첨가될 수 있다: 메티오닌, 9.3 mM; 아르기닌, 9.3 mM; 히스티딘, 9.3 mM; 티아민, 0.05 mM. 이. 콜라이 세포는 각각 37℃에서 일상적으로 성장된다.
유전적으로 변형된 코리네박테리아는 일반적으로 합성 또는 천연 성장 배지에서 배양된다. 코리네박테리아에 대한 많은 상이한 성장 배지는 잘 공지되어 있고 쉽게 이용가능하다 ([Liebl et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol., 32:205-210]; [von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters, 11:11-16]; 특허 DE 4,120,867; [Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium", in: The Procaryotes, Volume II, Balows, A. et al., eds. Springer-Verlag]). 지시는 또한 문헌 [Handbook of Corynebacterium (edited by Eggeling and Bott, ISBN 0-8493-1821-1, 2005)]에서 찾을 수 있다.
이들 배지는 하나 이상의 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기 염, 비타민 및 미량 원소 (trace element)로 이루어진다. 바람직한 탄소 공급원은 당, 예를 들어 단당체, 이당체 또는 다당체이다. 예를 들어, 글루코스, 프럭토스, 만노스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 락토스, 말토스, 수크로스, 글리세롤, 라피노스, 전분 또는 셀룰로스가 매우 우수한 탄소 공급원으로서 적합하다.
복합 화합물, 예를 들어 당밀 또는 당 정제로부터 다른 부산물을 통해 당을 배지에 공급하는 것이 또한 가능하다. 상이한 탄소 공급원의 혼합물을 공급하는 것이 또한 유리할 수 있다. 다른 가능한 탄소 공급원은 알콜 및 유기산, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세트산 또는 락트산이다. 질소 공급원은 대체로 유기 또는 무기 질소 화합물, 또는 이들 화합물을 함유하는 물질이다. 예시적인 질소 공급원은 암모니아 기체 또는 암모니아 염, 예를 들어 NH4Cl 또는 (NH4)2SO4, NH4OH, 니트레이트, 요소, 아미노산 또는 복합 질소 공급원, 예를 들어 옥수수 침지액 (corn steep liquor), 대두분, 대두 단백질, 효모 추출물, 고기 추출물 등을 포함한다.
메티오닌의 과다생산은 상이한 황 공급원을 사용하여 가능하다. 술페이트, 티오술페이트, 술파이트 및 또한 보다 환원된 황 공급원, 예를 들어 H2S 및 술피드 및 유도체가 사용될 수 있다. 또한 유기 황 공급원, 예를 들어 메틸 머캅탄, 티오글리콜레이트, 티오시아네이트 및 티오우레아, 황 함유 아미노산, 예를 들어 시스테인, 및 다른 황 함유 화합물이 효율적인 메티오닌 생산을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 메탄올 또는 포름알데히드와 같은 다른 C1 공급원과 같이 보충물로서 포르메이트가 또한 가능할 수 있다.
배지 내에 포함될 수 있는 무기 염 화합물은 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브덴, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 클로라이드-, 인- 또는 술페이트-염을 포함한다. 금속 이온을 용액 내에 유지시키기 위해 킬레이팅 (chelating) 화합물을 배지에 첨가할 수 있다. 특히 유용한 킬레이팅 화합물은 디히드록시페놀, 예를 들어 카테콜 또는 프로토카테츄에이트, 또는 유기산, 예를 들어 시트르산을 포함한다. 배지에 다른 성장 인자, 예를 들어 비타민 또는 성장 촉진제를 또한 함유하는 것이 일반적이고, 그의 예는 비오틴, 리보플라빈, 티아민, 폴산, 니코틴산, 판토테네이트 및 피리독신을 포함한다. 성장 인자 및 염은 종종 복합 배지 성분, 예를 들어 효모 추출물, 당밀, 옥수수 침지액 등에서 유래한다. 배지 화합물의 정확한 조성은 직접적 실험에 강하게 의존적이고, 각각의 특수한 경우에 대해 개별적으로 결정된다. 배지 최적화에 대한 정보는 교과서 ["Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Eds. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)]에서 이용가능하다. 표준물 1 (머크 (Merck)) 또는 BHI (뇌심장즙, 디프코 (DIFCO)) 등과 같이 상업적인 공급자로부터 성장 배지를 선택하는 것이 또한 가능하다.
본 발명의 측면에서 바람직한 배지에 대한 예는 아래 실시예 섹션에 설명되어 있다.
모든 배지 성분은 열 (1.5 bar 및 121℃에서 20 min)에 의해 또는 멸균 여과에 의해 멸균되어야 한다. 성분들은 함께 또는 필요한 경우에 따로 멸균될 수 있다.
모든 배지 성분은 성장의 시작 시에 존재해야 하거나, 임의로 연속식으로 또는 배치식 (batchwise)으로 첨가될 수 있다. 배양 조건은 각각의 실험에 대해 따라 규정된다.
온도는 사용된 미생물에 따라 결정되고, 대체로 15℃ 내지 45℃ 범위 내이어야 한다. 온도는 실험하는 동안 일정하게 유지될 수 있거나 변경될 수 있다. 배지 pH는 5 내지 8.5 범위, 바람직하게는 약 7.0일 수 있고, 배지 내에 버퍼를 첨가하여 유지될 수 있다. 상기 목적을 위한 예시적인 버퍼는 인산칼륨 버퍼이다. MOPS, HEPES, ACES 등과 같은 합성 버퍼가 별법으로 또는 동시에 사용될 수 있다. 성장 동안 NaOH 또는 NH4OH의 첨가를 통해 일정한 배양 pH를 유지하는 것이 또한 가능하다. 효모 추출물과 같은 복합 배지 성분이 사용되면, 많은 복합 화합물은 높은 버퍼 능력을 갖는다는 사실로 인해 추가의 버퍼에 대한 필요가 감소될 수 있다. 미생물을 배양하기 위해 발효기가 사용되면, 기체상 암모니아를 사용하여 pH를 또한 제어할 수 있다.
인큐베이션 시간은 대체로 수 시간 내지 수 일 범위이다. 상기 시간은 최대량의 생성물이 브로쓰 내에 축적하도록 허용하기 위해 선택된다. 개시된 성장 실험은 다양한 용기, 예를 들어 미세적정 플레이트, 유리 튜브, 유리 플라스크, 또는 상이한 크기의 유리 또는 금속 발효기 내에서 수행할 수 있다. 다수의 클론을 스크리닝하기 위해, 미생물을 배플 (baffle)이 있거나 없는 미세적정 플레이트, 유리 튜브 또는 진탕 플라스크 내에서 배양해야 한다. 바람직하게는, 요구되는 성장 배지의 10％ (부피)를 채운 100 ml 진탕 플라스크를 사용한다. 플라스크는 회전 진탕기 (진폭 25 mm) 상에서 100-300 rpm의 속도 범위를 이용하여 진탕해야 한다. 증발 손실은 습한 분위기의 유지에 의해 감소시킬 수 있고; 별법으로, 증발 손실에 대한 수학적 보정을 수행할 수 있다.
바람직한 배양 조건에 대한 예는 아래 실시예 섹션에 설명되어 있다.
유전적으로 변형된 클론을 시험하면, 비변형된 대조군 클론 (예를 들어, 모 균주) 또는 임의의 삽입체 없이 기본 플라스미드를 함유하는 대조군 클론을 또한 시험해야 한다. 배지를 30℃에서 인큐베이팅한 CM 플레이트 (10 g/l 글루코스, 2.5 g/l NaCl, 2 g/l 요소, 10 g/l 폴리펩톤, 5 g/l 효모 추출물, 5 g/l 고기 추출물, 22 g/l NaCl, 2 g/l 요소, 10 g/l 폴리펩톤, 5 g/l 효모 추출물, 5 g/l 고기 추출물, 22 g/l 한천, pH 6.8 (2M NaOH 사용))와 같은 한천 (agar) 플레이트 상에서 성장시킨 세포를 사용하여 0.5-1.5의 OD600으로 접종한다.
배지의 접종은 CM 플레이트로부터 씨. 글루타미쿰 세포의 염수 현탁액의 도입 또는 상기 세균의 액체 예비배양액 (preculture)의 첨가에 의해 달성된다.
아미노산 및 그의 중간체의 정량
아미노산 및 그의 중간체의 정량은 당업자에게 공지된 임의의 교과서 방법에 의해 수행할 수 있다. 다음에서, 상기 정량은 메티오닌의 정량에 의해 예시된다. 정량의 추가의 예시는 실시예 섹션에 제시되어 있다. 후자가 본 발명의 측면에서 바람직하다.
분석은 가드 (guard) 카트리지 및 Synergi 4 ㎛ 컬럼 (MAX-RP 80Å, 150 * 4.6 mm) (페노메넥스 (Phenomenex, 독일 아샤펜부르크))을 사용하여 HPLC (애질런트 1100, 애질런트 (Agilent, 독일 발트브론))에 의해 이루어진다. 주입 전에, 분석물질을 o-프탈디알데히드 (OPA) 및 머캅토에탄올을 환원제 (2-MCE)로서 사용하여 유도체화한다. 추가로, 술프히드릴기를 요오도아세트산으로 차단한다. 분리는 극성상으로서 40 mM NaH2PO4 (용출액 A, pH=7.8, NaOH로 조정함) 및 비-극성상 (용출액 B)으로서 메탄올 물 혼합물 (100/1)을 사용하여 1 ml/min의 유속으로 수행한다. 다음 구배를 적용한다: 출발 0％ B; 39분 39％ B; 70분 64％ B; 3.5분에 동안 100％ B; 평형화를 위해 2분 0％ B. 실온에서 유도체화는 아래 설명된 바와 같이 자동화된다. 초기에, 바이신 (bicine) (0.5M, pH 8.5) 중 0.5％ 2-MCE 0.5 ㎕를 0.5 ㎕ 세포 추출물과 혼합한다. 후속적으로, 바이신 (0.5M, pH 8.5) 중 50 mg/ml 요오도아세트산 1.5 ㎕를 첨가한 후, 2.5 ㎕ 바이신 버퍼 (0.5M, pH 8.5)를 첨가한다. 유도체화는 1/45/54 v/v/v의 2-MCE/MeOH/바이신 (0.5M, pH 8.5) 내에 용해시킨 10 mg/ml OPA 시약 0.5 ㎕를 첨가함으로써 이루어진다. 마지막으로, 혼합물을 32 ㎕ H2O로 희석시킨다. 각각의 상기 피펫팅 단계 사이에, 1 min의 대기 시간이 존재한다. 이어서, 37.5 ㎕의 총 부피를 컬럼 상에 주입한다. 오토샘플러 바늘을 샘플 제조 동안 (예를 들어, 대기 시간 내에) 및 제조 후에 주기적으로 청소하면, 분석 결과가 유의하게 개선될 수 있다. 검출은 형광 검출기 (340 nm 여기, 방출 450 nm, 애길런트)에 의해 수행한다. 정량을 위해, α-아미노 부티르산 (ABA)을 내부 표준물로서 사용한다.
씨. 글루타미쿰에 대한 재조합 프로토콜
다음에서, 특수한 재조합 프로토콜을 이용하여 정밀 화학물질 생산 효율이 증가된 씨. 글루타미쿰의 균주를 제작할 수 있는 방식을 설명할 것이다.
"캠벨 인 (Campbell in)"은 본원에서 사용될 때, 전체 환상 이중 가닥 DNA 분자 (예를 들어 pClik int sacB에 기초하는 플라스미드)가, 상기 환상 DNA 분자의 선형화 버전을 상기 환상 DNA 분자의 제1 DNA 서열에 상동성인 염색체의 제1 DNA 서열 내로 효과적으로 삽입시키는 단일 상동성 재조합 사건 (크로쓰-인 (cross-in) 사건)에 의해 염색체 내로 통합되는, 원래의 숙주 세포의 형질전환체를 나타낸다. "캠벨드 인 (Campbelled in)"은 "캠벨 인" 형질전환체의 염색체 내로 통합된 선형화된 DNA 서열을 나타낸다. "캠벨 인"은 제1 상동성 DNA 서열의 중복을 함유하고, 여기서 그의 각각의 카피는 상동성 재조합 교차점 (crossover point)의 카피를 포함하고 둘러싼다. 상기 명칭은 상기한 종류의 재조합을 최초르 제안한 알랜 캠벨 교수 (Alan Campbell)의 이름으로부터 땄다.
"캠벨 아웃 (Campbell out)"은 본원에서 사용될 때, "캠벨 인" 형질전환체로부터 전해지는 세포를 나타내고, 여기서 제2 상동성 재조합 사건 (크로쓰 아웃 (cross out) 사건)이 "캠벨드 인" DNA의 선형화된 삽입된 DNA 상에 함유되는 제2 DNA 서열, 및 상기 선형화된 삽입체의 제2 DNA 서열에 상동성인 염색체 기원의 제2 DNA 서열 사이에서 일어나고, 상기 제2 재조합 사건은 통합된 DNA 서열의 일부의 결실 (제티스닝 (jettisoning))을 일으키지만, 중요하게는 또한 통합된 캠벨드 인 DNA의 일부 (이는 단일 염기만큼 작을 수 있다)를 염색체 내에 남아있도록 하여, 원래의 숙주 세포에 비해, "캠벨 아웃" 세포는 염색체 내에 하나 이상의 의도적인 변화를 함유한다 (예를 들어, 단일 염기 치환, 다수 염기 치환, 이종성 유전자 또는 DNA 서열의 삽입, 상동성 유전자 또는 변형된 상동성 유전자의 추가의 카피(들)의 삽입, 또는 상기 나열된 하나 초과의 상기한 예를 포함하는 DNA 서열의 삽입).
"캠벨 아웃" 세포 또는 균주는 반드시는 아니지만 대체로, "캠벨드 인" DNA 서열의 일부 (제티스닝되도록 요망되는 일부)에 함유되는 유전자, 예를 들어 약 5％ 내지 10％ 수크로스의 존재 하에 성장되는 세포 내에서 발현될 때 치명적인 바실러스 섭틸리스 sacB 유전자에 대한 역 (counter)-선택에 의해 수득된다. 역-선택을 이용하거나 이용하지 않을 때, 목적하는 "캠벨 아웃" 세포는 비제한적으로 콜로니 형태, 콜로니 색상, 항생제 내성의 존재 또는 부재, 중합효소 연쇄 반응에 의한 제공된 DNA 서열의 존재 또는 부재, 영양요구성의 존재 또는 부재, 효소의 존재 또는 부재, 콜로니 핵산 혼성화, 항체 스크리닝 등과 같은 임의의 스크리닝가능한 표현형을 사용하여 목적하는 세포에 대해 스크리닝함으로써 얻어지거나 확인될 수 있다. 용어 "캠벨 인" 및 "캠벨 아웃"은 또한 상기 설명된 방법 또는 과정을 나타내도록 다양한 시제로 동사로서 사용될 수 있다.
"캠벨 인" 또는 "캠벨 아웃"을 일으키는 상동성 재조합 사건은 상동성 DNA 서열 내에서 다양한 DNA 염기에 걸쳐 일어날 수 있음이 이해되고, 상동성 서열은 상기 범위의 적어도 일부에 대해 서로 동일할 것이므로, 교차 사건이 일어난 곳을 정확하게 명시하는 것은 대체로 가능하지 않다. 즉, 어떠한 서열이 삽입된 DNA로부터 기원하는지, 및 어떠한 서열이 염색체 DNA로부터 기원하는지를 정밀하게 명시하는 것은 가능하지 않다. 또한, 제1 상동성 DNA 서열 및 제2 상동성 DNA 서열은 대체로 부분적 비-상동성의 구역에 의해 분리되고, 비-상동성의 상기 구역은 "캠벨 아웃" 세포의 염색체 내에 퇴적되어 유지된다.
실용성을 위해, 씨. 글루타미쿰에서, 전형적인 제1 및 제2 상동성 DNA 서열은 길이가 적어도 약 200 염기쌍이고, 길이가 수천 개 이하의 염기쌍일 수 있지만, 절차는 보다 짧거나 보다 긴 서열을 사용하여 작업하도록 이루어질 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 상동성 서열에 대한 길이는 약 500 내지 2000 염기 범위일 수 있고, "캠벨 인"으로부터 "캠벨 아웃"을 수득하는 것은 대략 동일한 길이이고, 바람직하게는 200 염기쌍 미만의 차이를 갖고, 가장 바람직하게는 2개 중 더 짧은 것이 염기쌍이 더 긴 것의 길이의 적어도 70％인 제1 및 제2 상동성 서열을 배열함으로써 촉진된다. "캠벨 인 및 캠벨 아웃 방법"은 WO 2007/012078 및 문헌 [Eggeling and Bott (eds) Handbook of Corynebacterium (Taylor and Francis Group, 2005), Chapter 23]에 설명되어 있다.
씨. 글루타미쿰에 대한 바람직한 재조합 프로토콜은 실시예 섹션에 설명되어 있다.
본 발명은 다음 실시예를 참조하여 보다 상세히 설명된다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적을 위한 것이고 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되는 것을 이해해야 한다.
실시예
다음 실시예에서, 다양한 출판물, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press] 또는 [Ausubel et al. (2007), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols in Protein Science, edition as of 2002, Wiley Interscience]에 설명된 재조합 DNA 기술 및 분자 생물학의 표준 기술을 사용하였다. 달리 지시하지 않으면, 모든 세포, 시약, 장치 및 키트는 제조자의 지시에 따라 사용하였다.
코돈 사용 빈도를 통한 ICD 감소 및 메티오닌의 생산에 대한 그의 효과에 관한 한 PCT/EP2007/061151의 실시예를 본원에 참조로 포함시킨다.
실시예 1: 이소시트레이트 데히드로게나제 (icd)의 발현 감소, 및 라이신 및 트레할로스 생산에 대한 그의 효과
1.1. ICD 활성이 감소된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 제작
이소시트레이트 데히드로게나제 (Genbank 기탁 코드 X71489)의 활성을 감소시키기 위해, 코돈 사용 빈도를 변화시켰다. 원래의 출발 코돈 ATG를 GTG로 교체하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 icd 유전자의 염색체 카피에서만 조작하였다. ICD 활성의 후속 측정을 통해 효과를 직접 판독할 수 있다.
Figure pat00005
ICD ATG-GTG의 서열은 PCT/EP2007/061151의 도 2a)에 도시되어 있다. 상기 돌연변이를 icd 코딩 구역의 염색체 카피 내로 도입하기 위해, 2회의 연속적인 상동성 재조합 사건에 의해 마커-프리 조작을 허용하는 플라스미드를 제작하였다.
이를 위해, ICD ATG-GTG의 서열을 다음 요소를 함유하는 플라스미드인 벡터 pClik int sacB (Becker et al (2005), Applied and Environmental Microbiology, 71(12), p.8587-8596) 내로 클로닝하였다:
· 카나마이신-내성 유전자
· 양성 선택 마커로서 사용될 수 있는 SacB-유전자 (이 유전자를 보유하는 세포는 수크로스 함유 배지 상에서 성장할 수 없으므로)
· 이. 콜라이에 대한 복제 기점
· 다중 클로닝 부위 (MCS)
상기 플라스미드는 씨. 글루타미쿰의 게놈 로커스에서 서열의 통합을 허용한다.
플라스미드 pClik int sacB ICD ATG - GTG의 제작
삽입체를 주형으로서 ATCC13032의 게놈 DNA를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 코딩 구역의 변형은 다음 올리고뉴클레오티드를 사용하여 융합 PCR에 의해 달성하였다. 표는 사용된 프라이머 및 주형 DNA를 보여준다:
Figure pat00006
Figure pat00007
융합 PCR의 생성물을 정제하고, XhoI 및 MluI로 소화시키고, 다시 정제하고 동일한 제한 효소를 사용하여 선형화시킨 pClik int sacB 내로 라이게이팅하였다. 삽입체의 통합성은 서열결정에 의해 확인하였다.
최적화된 서열 ICD ATG → GTG의 코딩 서열은 PCT/EP2007/061151의 도 2에 도시되어 있다 (PCT/EP2007/061151의 서열 2; 본 발명의 서열 목록의 서열 4).
생성되는 플라스미드는 pClik int sacB ICD ATG - GTG로 불린다.
ICD 발현 수준이 변형된 균주의 제작
이어서, 플라스미드 pClik int sacB ICD ATG - GTG를 사용하여 icd 유전자의 천연 코딩 구역을 변형된 출발 코돈을 갖는 코딩 구역에 의해 교체하였다. 사용된 균주는 LU11424였다.
코딩 서열을 변화시키기 위해 2회의 연속적인 재조합 사건 (각각 상류 및 하류 구역에서 하나씩)이 필요하다. 내인성 유전자를 최적화된 유전자로 교체하는 방법은 원칙적으로 벡커 (Becker) 등 (위 참조)에 의한 출판물에 설명되어 있다. 가장 중요한 단계는 다음과 같다:
- 전기천공에 의한 균주 내에 플라스미드의 도입. 단계는 예를 들어 균주 내로 플라스미드의 도입이 여기에 개시되어 있는 한 본원에 참조로 포함되는 DE 10046870에 설명되어 있다.
- 플라스미드를 제1 상동성 재조합 사건 후에 게놈 내로 성공적으로 통합시킨 클론의 선택. 상기 선택은 카나마이신-함유 한천 플레이트 상의 성장에 의해 달성된다. 상기 선택 단계에 추가로, 성공적인 재조합은 콜로니 PCR을 통해 검토될 수 있다.
게놈 내의 플라스미드의 존재를 확인하기 위해 사용된 프라이머는
Figure pat00008
(PCT/EP2007/061151의 서열 12) 및
Figure pat00009
PCT/EP2007/061151의 서열 13)이었다. 양성 클론은 약 600 bp의 밴드를 제공한다.
- 카나마이신-비함유 배지 내에서 양성 클론을 인큐베이팅함으로써, 제2 재조합 사건이 허용된다.
- 벡터 백본이 제2 재조합 사건에 의해 성공적으로 제거된 클론은 수크로스-함유 배지 상의 성장에 의해 확인된다. SacB 유전자를 포함하는 벡터 백본을 상실한 클론만이 생존할 것이다.
- 이어서, 2개의 재조합 사건이 천연 idh-코딩 구역을 성공적으로 교체시킨 클론을 관련 구역에 걸치는 PCR-생성물의 서열결정 및 ICD 활성의 결정에 의해 확인하였다. PCR-생성물은 주형으로서 개별 클론의 게놈 DNA, 및 프라이머 OLD 441 및 OLD 442를 사용하여 생성하였다. PCR-생성물을 정제하고,
Figure pat00010
(PCT/EP2007/061151의 서열 14)을 사용하여 서열결정하였다.
icd의 내인성 카피를 교체하기 위해 상이한 씨. 글루타미쿰 균주를 사용할 수 있다. 그러나, 예를 들어 LU11424, 또는 ATCC13032의 다른 유도체, ATCC12032lysCfbr 또는 ATCC13286와 같은 씨. 글루타미쿰 라이신 생산 균주를 사용하는 것이 바람직하다. LU11424가 특히 바람직하다.
LU11424는 ATCC13032로부터 출발하여 몇몇 연속적인 단계의 유전공학에 의해 제작되었다.
LU11424는 다음 변형을 함유한다:
· 피드백 내성 효소를 일으키는 돌연변이된 lysC 유전자 (아스파르토키나제를 코딩함). 이를 위해, 생성되는 단백질이 위치 311에서 트레오닌 대신 이소류신을 보유하도록 뉴클레오티드 교환을 lysC 유전자 내로 도입하였다. 그러한 균주의 제작에 관한 상세한 내용은 WO 2005/059093에 설명되어 있다. lysC 유전자의 기탁 번호는 P26512이다.
· 파괴된 pepCK 유전자 (포스포에놀카르복시키나제를 코딩함). pepCK의 기탁 번호는 AB115091이다.
· 중복된 ddh 유전자 (디아미노피멜레이트 데히드로게나제를 코딩함). ddh의 기탁 번호는 Y00151이다.
· Psod 발현 단위에 의해 제어되는 향상된 dapB 유전자 (디히드로피콜리네이트 리덕타제를 코딩함). dapB의 기탁 번호는 X67737이다.
· 중복된 argS lysA 오페론 (아르기닐-tRNA 합성효소 및 디아미노피멜레이트 데카르복실라제를 코딩함). argS lysA 오페론의 기탁 번호는 X54740이다.
· Psod 발현 단위에 의해 제어되는 향상된 lysC 유전자.
· 아미노산 위치 59에서 발린 대신 알라닌을 보유하는 단백질을 생성시키는 돌연변이체 hom 유전자 (호모세린 데히드로게나제를 코딩함). hom의 기탁 번호는 Y00546이다.
· 발현 단위 Psod에 의해 제어되고, 아미노산 위치 458에서 프롤린 대신 세린을 보유하는 단백질을 생성시키는 점 돌연변이를 함유하는, 향상되고 돌연변이된 pycA 유전자 (피루베이트 카르복실라제를 코딩함). pycA의 기탁 번호는 AF038548이다.
· 아미노산 위치 243에서 알라닌 대신 트레오닌을 함유하는 단백질을 생성시키는 돌연변이된 zwf 유전자 (글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 코딩함). zwf의 기탁 번호는 BA000036.3, nt. 1667860-1669404이다.
발현 단위 Psod (리보좀 결합 부위를 포함하는 프로모터)는 WO 2005/059144에 설명되어 있다. Psod 서열은 다음과 같다 (5'에서 3'으로):
Figure pat00011
상기 변형은 모두 icd 유전자의 조작에 대한 것과 유사한 전략을 이용하여 도입되었다 (즉, 상기 설명된 "캠벨 인/캠벨 아웃" 방법에 의해). 조작을 위해 사용된 플라스미드는 모두 pClik int sacB (위 참조) 또는 pK19mobsacB (서열 21)에 기초하였다.
icd 출발 코돈을 ATG로부터 GTG로 변화시킴으로써 ICD 활성이 저하된 라이신 생산 균주 LU11424는 ICD ATG-GTG (동의어 ICD ATG → GTG)로 불린다.
1.2. ICD 활성, 라이신 생산, 및 트레할로스의 생산에 대한 효과
icd 유전자의 조작의 효과는 2개의 독립 시험 시리즈로 확인하였다. 이들 시리즈 중 처음에서, ICD 활성 및 라이신 생산을 결정하였다. 제2 시험 시리즈는 트레할로스 생산의 결정을 추가로 포함하였다.
1.2.1. 제1 시험 시리즈: ICD 활성 및 라이신 생산
ICD 활성에 대한 효과
icd 유전자의 성공적인 조작은 초기 균주 LU11424에 비해 균주 ICD ATG-GTG의 ICD 효소 활성의 결정에 의해 확인하였다. 이소시트레이트 데히드로게나제의 활성 결정을 위해, 무세포 추출물을 철야 배양액으로부터 제조하였다. 세포를 한천 플레이트로부터 단일 세포를 접종한 37 g/L BHI (Bacto™ 뇌심장즙)을 함유하는 복합 배지 내에서 성장시켰다. 세포를 원심분리 (13,000×g, 5 min, Centrifuge 5415 R, 에펜도르프 (Eppendorf, 독일 함부르크))에 의해 수거하고, 반응 버퍼 (100 mM Tris-HCl, pH 7.8)로 세척하고, 세포를 리볼라이저 (ribolyser) (쉬빙뮐레, 레취 (Schwingmuehle, Retsch, 독일 하안)) 내에서 글라스비드를 사용하여 파괴하였다. 세포 파편을 원심분리 (13,000×g, 15 min, Centrifuge 5415 R, 에펜도르프)에 의해 제거하고, 무세포 추출물을 사용하여 단백질 함량 및 효소 활성을 결정하였다. 단백질 농도는 브래드포드 (Bradford)의 방법에 의해 바이오-라드의 브래드포드 시약 (Quick Start™ Bradford Due Reagent, 바이오-라드 래보래토리스 (Bio-Rad Laboratories, 미국 캘리포니아주 허큘레스))을 사용하여 측정하였다. 효소 활성은 340 nm에서 흡광도의 증가에 따라 결정하였다. 반응은 100 mM Tris/HCl, 10 mM MgCl2, 0.5 mM NADP, 1 mM 이소시트레이트 및 50 ㎕의 조질 세포 추출물을 함유하는 1 ml의 총 부피에서 pH 7.8에서 수행하였다. 음성 대조군은 각각 이소시트레이트 없이 또는 세포 추출물 없이 수행하였다. 효소의 비활성은 mU/mg 단백질로 제시한다 (1 U = 30℃에서 1 μmol/min).
Figure pat00012
데이타는 균주 ICD ATG → GTG에서 ICD 활성이 초기 균주 LU11424에서보다 유의하게 더 낮음을 보여준다.
라이신 생산성에 대한 효과
라이신 생산에 대한 저하된 ICD 활성의 효과를 분석하기 위해, 생성된 균주를 모 균주에 비교하였다.
균주의 성장을 위한 조건은 다음과 같았다:
배지: 제1 예비-배양액을 5 g L-1 글루코스, 5 g L-1 효모 추출물, 10 g L-1 트립톤 및 5 g L-1 NaCl을 함유하는 복합 배지 내에서 성장시켰다. 한천 플레이트는 18 g L-1 한천을 첨가함으로써 제조하였다. 제2 예비-배양 및 주 배양은 55 mM 글루코스를 함유하는 최소 배지 내에서 수행하였다. 최소 배지는 1리터당 0.055 g CaCl2·2H2O, 0.2 g MgSO4·7H2O, 1 g NaCl, 25 g K2HPO4, 7.7 g KH2PO4, 15 g (NH4)2SO4, 0.5 mg 비오틴, 1 mg Ca-판토텐산, 1 mg 티아민·HCl, 20 mg FeSO4, 30 mg 3,4-디히드록시벤조산 및 10 ml의 100× 미량 원소 용액을 추가로 함유하였다. 미량 원소 용액은 리터당 200 mg FeCl3·6H2O, 200 mg MnSO4·H2O, 50 mg ZnSO4·7H2O, 20 mg CuCl2·2H2O, 20 mg NaB4O7·10H2O 및 10 mg (NH4)6Mo7O24·4 H2O을 함유하고, pH 1로 조정하였다.
배양: 한천 플레이트로부터 단일 콜로니를 사용하여 제1 예비-배양액에 접종하고, 이를 8 h 동안 50 mL 복합 배지 내에서 500 mL 배플형 (baffled) 플라스크 내에서 인큐베이팅하였다. 후속적으로, 세포를 원심분리 (8,800×g, 2 min, 4℃)에 의해 수거하고, 멸균 0.9％ NaCl로 세척하고, 제2 예비-배양액을 위한 접종물로서 사용하였다 (250 ml 배플형 플라스크 내의 25 ml 최소 배지). 주 배양은 50 ml 배지 내에서 500 ml 배플형 플라스크 내에서 수행하고, 제2 예비-배양액으로부터 지수적으로 성장하는 세포를 접종하였다. 모든 배양 실험은 30℃ 및 230 rpm에서 회전 진탕기 (진탕 직경 5 cm, 멀티트론 (Multitron), 인포스 아게 (Infors AG, 스위스 보트밍엔)) 상에서 수행하였다. pH는 배양 시간에 걸쳐 7.1±0.2 범위였다. 18시간 후에, 세포 농도, 기질 소비 및 생성물 형성을 분석하기 위해 지수적으로 성장하는 배양액으로부터 샘플을 취하였다. 세포 농도는 660 nm에서 광학 밀도를 측정하여 결정하였다 (분광광도계, Libra S11, 바이오크롬 (Biochrom, 영국 캠브리지)). 필요하다면, 샘플을 분석 저울 (CP255D, 사토리우스 (Sartorius, 독일 괴팅엔)) 상에서 희석시켜 0.05 내지 0.3의 흡광도 값을 얻었다.
글루코스의 농도는 뵈링거 만하임 (Boehringer Mannheim)의 글루코스 키트를 사용하여 결정하였다. 라이신 농도는 라이신 검정 곡선을 사용하여 광학 효소 시험을 이용하여 결정하였다. 반응은 1 ml의 부피로 수행하고, 0.9 ml 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mg ABTS, 80 mU 라이신 옥시다제, 400 mU 퍼옥시다제를 함유하였고, 반응은 100 ㎕ 배양 상등액을 첨가하여 개시시켰다. 6분 후에, 436 nm에서 흡광도를 측정하였다. 필요하다면, 배양 상등액을 희석시켜 검정 곡선의 범위 내에 있는 흡광도 값을 얻었다.
Figure pat00013
ICD 활성이 저하된 균주는 보다 높은 라이신 수율 (초기 균주에서보다 1.3배 초과로 더 높음)을 가짐을 쉽게 알 수 있다.
1.2.2. 제2 시험 시리즈: ICD 활성, 라이신 및 트레할로스의 생산
icd 유전자의 성공적인 조작을 초기 균주 LU11424에 비해 균주 ICD ATG → GTG의 ICD 효소 활성의 결정에 의해 및 라이신 생산의 결정에 의해 다시 확인하였다. 추가로, 트레할로스의 생산을 측정하였다.
배지 조성: 한천 플레이트 및 제1 예비-배양액을 위해 사용된 복합 배지는 각각 18 g L-1 한천을 함유하거나 함유하지 않으면서 10 g L-1 펩톤, 5 g L-1 소고기 추출물, 5 g L-1 효모 추출물, 2.5 g L-1 NaCl, 10 g L-1 글루코스 및 2 g L-1 요소를 함유하였다. 제2 예비-배양 및 주 배양은 milliQ 정제수로 1 L로 조정한 (A) 500 mL 염 용액 (1 g NaCl, 55 mg MgCl2·7H2O 및 200 mg CaCl), (B) 100 mL 기질 용액 (각각 100 g L-1 글루코스 또는 프럭토스), (C) 100 mL 버퍼 용액 (2 M 인산칼륨, pH 7.8), (D) 100 mL 용액 B (150 g L-1 (NH4)2SO4, pH 7.0), (E) 20 mL 비타민 용액 (25 mg L-1 비오틴, 50 mg L-1 티아민·HCl 및 50 mg L-1 판토텐산), (F) 10 mL FeSO4-용액 (2 g L-1 FeSO4, pH 1.0), (G) 10 ml 100×미량 원소 (Vallino, J.J., and G. Stephanopoulos, reprinted from Biotechnol Bioeng 41:633-646 (1993) in Biotechnol Bioeng 67:872-85 (1993)) 및 (H) 1 mL DHB-용액 (0.3 M NaOH 중 30 mg mL-1 3,4-디히드록시벤조산)을 함유하는 최소 배지 내에서 수행하였다. 용액은 고압멸균 (autoclaving) (A-D)에 의해 또는 여과 (E-H)에 의해 따로 멸균시켰다. 상이한 배지 화합물들은 사용하기 전에 신선하게 실온에서 혼합하였다.
배양 및 성장 조건: -80℃에서 저장된 글리세롤 원액 (10％ 글리세롤, 50 mg L-1 락토스)으로부터의 세포를 한천 플레이트 상에 도말하고, 48 h 동안 30℃에서 인큐베이팅하였다. 제1 예비-배양액을 25 ml 복합 배지 (250 ml 배플형 진탕 플라스크) 내에서 10 h 동안 30℃ 및 230 rpm에서 회전 진탕기 (멀티트론, 인포스 아게) 상에서 성장시켰다. 원심분리 (3 min, 7000×g, 비오푸게 슈트라토스 (Biofuge stratos), 헤라우스 (Heraeus, 독일 하나우)) 후에, 세포를 멸균 0.9％ NaCl로 세척하고, 제2 예비배양액을 위한 접종물로서 사용하였다 (500 ml 배플형 진탕 플라스크 내에 50 ml). 중간-지수 성장기에서, 세포를 상기 설명된 바와 같이 수거하고 세척하고, 주 배양액을 접종하기 위해 사용하였다. 이는 200 ml 배지를 함유하는 2 L 배플형 진탕 플라스크를 사용하여 삼중으로 수행하였다. 배양하는 동안, pH를 7.1±0.1 범위 내에 일정하게 유지하고, 충분한 산소 공급을 보장하였다.
기질 및 생성물 분석
글루코스, 라이신 및 추가의 생성물의 농도는 1:10으로 희석시킨 배양 상등액 내에서 결정하였다. 글루코스는 생화학적 분석기 (YSI 2700 Select, 크라이엔바움 (Kreienbaum, 독일 랑겐펠트))를 사용하여 정량하였다. 유기산 및 트레할로스의 농도는 오토샘플러 L-2200, 펌프 L-2130, UV 검출기 L-2400, RI 검출기 L-24900 및 컬럼 오븐 L-2350 (히다찌 (Hitachi), VWR (독일 다름스타트))로 이루어지는 LaChrome HPLC 시스템에 의해 아미넥스 (Aminex) HPX-87H 컬럼 (300 x 7.8; 바이오-라드) 상에서 45℃에서 결정하였고, 여기서 이동상으로서 10 mM H2SO4 및 0.5 ml/min의 유속, 및 굴절률 (당) 또는 210 nm에서 UV 흡광도 (유기산)를 통한 검출을 이용하였다. 아미노산의 정량을 위한 프로토콜은 문헌 (Kroemer, J.O. et al., Anal Biochem 340:171-3 (2005))에 설명된 바와 같이 o-프탈알데히드 (OPA)를 사용한 컬럼전 유도체화 및 C18 컬럼 (Gemini5u, 페노메넥스) 상의 분리를 포함하였다. 측정 시간을 감소시키기 위해, 구배 프로필을 변화시키고, 용출액 B를 4％ min-1로 첨가하였다. 세포 농도는 660 nm에서 광도계 (Libra S11, 바이오크롬)에서, 또는 세포 건조 질량 (CDM) (CP225D, 사토리우스)으로서 중량법으로 결정하였다. 후자를 위해, 15 mL 배양 브로쓰로부터 세포를 원심분리 (10 min, 9800×g, 비오푸게 슈트라토스, 헤라우스)에 의해 수거하고, 물로 3회 세척하고, 후속적으로 80℃에서 3일 동안 건조시켰다. OD660 (Libra S11, 바이오크롬) 및 CDM 사이의 상관계수는 1 OD = 0.258 (g CDM) L-1로 결정하였다.
세포 파괴
세포를 상기 설명된 바와 같이 50 ml의 주 배양 부피 (500 ml 배플형 진탕 플라스크)와 함께 성장시켰다. 세포를 지수 성장기에 원심분리 (5 min, 9800×g, 4℃, 비오푸게 슈트라토스, 헤라우스)에 의해 수거하고, 파괴 버퍼 (100 mM TrisHCl, pH 7.8)로 세척하고, 후속적으로 10 ml의 동일한 버퍼 내에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 750 ㎕ 양으로 유리 비드를 담은 2 ml 에펜도르프관에 분취하였다. 파괴는 리볼라이저 (MM301, 레취) 내에서 30 Hz에서 수행하였다 (2 x 5 min; 사이에 5분 휴식). 조질 세포 추출물을 13000×g (Centrifuge 5415R, 에펜도르프)에서 10분 동안 원심분리에 의해 수득하고, 효소 활성 및 단백질 함량의 결정을 위해 사용하였다. 후자는 브래드포드의 방법 (Anal Biochem 72:248-54 (1976))에 의해 바이오라드의 시약 용액 (Quick Start Bradford Dye, 바이오라드)을 사용하여 정량하였다.
이소시트레이트 데히드로게나제 활성
ICD의 시험관내 활성의 분석은 문헌 (Chen, R., and H. Yang, Arch Biochem Biophys 383:238-45 (2000))의 프로토콜을 기초로 한 것이다. 반응은 1 ml의 부피로 pH 7.8 및 30℃에서 1.5-ml 폴리스티렌 큐벳 내에서 수행하였다. 분석 혼합물은 100 mM Tris/HCl (pH 7.8), 10 mM MgCl2, 1 mM 이소시트레이트, 0.5 mM NADP 및 25 ㎕의 조질 세포 추출물을 함유하였다. NADPH 형성으로 인한 340 nm에서 흡광도의 변화를 온라인 (online)으로 모니터링하였다 (Specord 40, 아날리틱 예나 (Analytik Jena, 독일 예나)). 음성 대조군은 각각 이소시트레이트 없이 또는 세포 추출물 없이 수행하였다. 탄소 공급원으로서 글루코스를 함유하는 최소 배지 내에서 성장시킨 씨. 글루타미쿰 LU11424 및 ICD ATG → GTG의 조질 세포 추출물에서 ICD의 비활성을 표 5에 제공한다. 1 U = 30℃에서 1 μmol/min; NADPH의 몰 소광 계수 = 6.22 L mmoL-1 cm-1.
Figure pat00014
데이타는 균주 ICD ATG → GTG 내에서 ICD 활성이 초기 균주 LU11424에서보다 유의하게 더 작음을 보여준다.
라이신 및 트레할로스 생산
글루코스에 대한 라이신 생산 씨. 글루타미쿰 LU11424 및 ICD ATG → GTG의 생산 특징을 표 6에 제공한다. 표 6에 제공된 수율은 생체량 수율 (YX/S), 라이신 수율 (YLys/S), 및 트레할로스 수율 (YTre/S) (모두 소비된 글루코스 (S)에 대해)이고, 3회의 평행 배양 실험으로부터 평균값 및 대응하는 편차를 나타낸다. 수율은 생성물 형성 및 기질 소비를 플로팅할 때 선형 최선 피트 (best fit)의 기울기로서 결정되었다.
Figure pat00015
ICD 활성이 저하된 균주는 보다 높은 라이신 및 트레할로스 수율 (초기 균주에서보다 1.3배 초과로 더 높음)을 가짐을 쉽게 알 수 있다.
실시예 2: 메티오닌 생산을 위한 균주 제작 및 메티오닌 생산성에 대한 효과
PCT/EP2007/061151에 설명된 추가의 실험에서, 출발 코돈에서 상기 언급된 ATG-GTG 돌연변이를 보유하는 이소시트레이트 데히드로게나제 (실시예 1.1에 비교함)를 상기 설명된 바와 같이 pClik 내로 클로닝하여, pClik int sacB ICD (ATG-GTG) (PCT/EP2007/061151의 서열 15, 본 발명의 서열 목록의 서열 5는 벡터 삽입물을 보여준다)를 생성하였다. 후속적으로, 플라스미드 pClik int sacB ICD (ATG-GTG) (PCT/EP2007/061151의 서열 15)를 균주 OM469의 게놈 내로 캠벨 인 및 캠벨 아웃함으로써 균주 M2620을 제작하였다. 균주 OM469는 WO 2007/012078에서 설명되었다.
균주를 WO 2007/020295에 설명된 바와 같이 성장시켰다. 30℃에서 48h 인큐베이션 후에, 샘플을 당 소비에 대해 분석하였다. 균주는 모든 첨가된 당을 모두 사용한 것으로 밝혀졌고, 이는 모든 균주가 동일한 양의 탄소 공급원을 사용하였음을 의미한다. 합성된 메티오닌은 상기 및 WO 2007/020295에 설명된 바와 같이 HPLC에 의해 결정하였다.
Figure pat00016
표 7의 데이타로부터, 변경된 ICD 유전자의 출발 코돈이 변경되고, 따라서 ICD 활성이 변경된 균주 M2620은 보다 높은 메티오닌 생산성을 가짐을 알 수 있다. 모든 탄소 공급원은 48h시간 후에 모두 사용되므로, 또한 생산된 메티오닌에 대한 탄소 수율 (소비된 당에 대한 형성된 생성물의 양)이 상기 균주에서 더 높음을 직접 알 수 있다.
실시예 3: 디아미노펜탄 생산에서 ICD 발현 수준이 감소된 균주의 사용
ICD 발현 수준이 변형된 균주의 제작
플라스미드 pClik int sacB ICD ATG → GTG (실시예 1.1 참조, 동의어: pClik int sacB ICD (ATG-GTG), pClik int sacB ICD ATG - GTG, 벡터 삽입물은 서열 5 참조)를 숙주 균주에 비해 ICD 발현 수준이 변형된 디아미노펜탄 생산 균주의 제작을 위해 사용하였다.
사용된 모 균주는 점 돌연변이 T311I의 아스파르토키나제 유전자 (NCgl 0247)에 대한 포함, 및 강한 프로모터 Psod의 첨가에 의한 유전자 사용빈도의 후속적인 증폭, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제 유전자 (NCgl 2528)의 중복, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 유전자 (NGgl 2765)의 파괴, 및 이. 콜라이 라이신 데카르복실라제 유전자 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, Entry JW0181)의 염색체 통합에 의해 씨. 글루타미쿰 야생형 균주 ATCC13032로부터 유도된 1,5-디아미노펜탄 (1,5-DAP) 생산자였다. ATCC13032에 대한 각각의 상기 변형은 재조합 DNA 기술의 일반적으로 공지된 방법을 적용함으로써 수행하였다. 1,5-DAP 생산자 모 균주를 확립하기 위해 사용된 플라스미드의 서열을 서열 21 내지 24에 제시하였다. 서열 21은 pepCK 유전자의 결실 (델타 pepCK)을 위해 사용될 수 있다. 서열 22는 ddh 유전자의 중복 (2 x ddh)을 위해 사용될 수 있다. 서열 23은 ask 유전자의 상류에 Psod 프로모터의 통합 (Psodk ask)에 의한 ask 유전자 사용빈도의 증폭을 위해 사용될 수 있다. 서열 24는 씨. 글루타미쿰 라이신 생산자의 bioD 구역 내에 이. 콜라이 ldcC의 통합에 의한 디아미노펜탄 생산 균주의 제작을 위해 사용될 수 있다. 이어서, pClick int sacB ICD ATG → GTG, 또는 그의 통합이 숙주 세포에서 ICD 활성의 감소를 일으킬 임의의 다른 플라스미드는 라이신 생산자에 대해 실시예 1에서 "ICD 발현 수준이 변형된 균주의 제작" 아래에 설명된 방법에 의해 모 균주 내로 도입될 수 있다.
코돈 사용 빈도가 변경된 IDH ATG-GTG의 효과를 분석하기 위해, 최적화된 균주를 라이신 생산자에 대해 실시예 1에서 "ICD 활성의 결정" 아래에 설명된 바와 같이 모 균주의 1,5-DAP 생산성에 비교하였다.
1,5-DAP 생산성에 대한 효과
1,5-DAP 생산성에 대한 ICD의 변형된 발현의 효과를 분석하기 위해, 최적화 균주를 모 균주의 1,5-DAP 생산성에 비교하였다.
이를 위해, 균주를 CM-플레이트 (10％ 수크로스, 10 g/l 글루코스, 2.5 g/l NaCl, 2 g/l 요소, 10 g/l Bacto 펩톤, 10 g/l 효모 추출물, 22 g/l 한천) 상에서 2일 동안 30℃에서 성장시켰다. 후속적으로, 세포를 플레이트로부터 긁어내고 염수 내에 재현탁시켰다. 주 배양을 위해, 10 ml의 생산 배지 (40 g/l 수크로스, 60 g/l 당밀 (100％ 당 함량에 관하여 계산됨), 50 g/l (NH4)2SO4, 0.6 g/l KH2PO4, 0.4 g/l MgSO4·7H2O, 2 mg/l FeSO4·7H2O, 2 mg/l MnSO4·H2O, 0.3 mg/l 티아민·HCl, 1 mg/l 비오틴) 및 0.5 g의 고압멸균시킨 CaCO3을 100 ml 얼렌마이어 (Erlenmeyer) 플라스크 내에서 세포 현탁액과 함께 1.5의 OD600까지 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포를 72시간 동안 타입 인포스 AJ118 (인포스)의 진탕기 상에서 220 rpm에서 성장시켰다.
후속적으로, 배지 내로 분리된 1,5-DAP의 농도를 결정하였다. 이는 HPLC를 사용하여 애질런트 1100 시리즈 LC 시스템 HPLC 상에서 이루어졌다. 오르쏘-프탈알데히드를 사용한 컬럼전 유도체화로 형성된 1,5-DAP를 정량하였다. 혼합물의 분리는 Gemini C18 컬럼 (페노메넥스) 상에서 이루어질 수 있다. 용출액 A는 40 mM NaH2PO4·H2O, pH 7.8이고, 용출액 B는 아세토니트릴:메탄올:H2O (45:45:10)이었다. 검출은 형광 검출기에 의해 이루어졌다.
ICD 활성이 저하된 균주는 보다 높은 라이신 생산성을 가지므로, ICD 활성이 저하된 균주는 보다 높은 1,5-DAP 생산성을 가질 것임이 합리적인 것으로 보인다.
실시예 4: icd의 낙아웃
icd 코딩 구역을 결실시키기 위해, icd 코딩 구역의 하류의 300 - 600개의 연속적인 뉴클레오티드에 직접 융합된 icd 코딩 서열의 상류의 ~ 300 - 600개의 연속적인 뉴클레오티드를 함유하는 결실 카세트를 pClik int sacB 내로 삽입하였다. 생성되는 플라스미드는 pClik int sacB 델타 icd (서열 8)로 불린다.
이어서, 플라스미드를 표준 방법, 예를 들어 전기천공에 의해 씨. 글루타미쿰 내로 형질전환시켰다. 형질전환을 위한 방법은 예를 들어, 문헌 [Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29:356-362 (1988))], [Dunican und Shivnan (Biotechnology 7:1067-1070 (1989))], [Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994))] 및 DE 10046870에서 찾을 수 있다.
완전한 코딩 서열을 결실시키기 위해 2회의 연속적인 재조합 사건 (각각 상류 및 하류 구역에서 하나씩)이 필요하다. 플라스미드 pClik int sacB를 사용하여 내인성 유전자를 결실 카세트로 교체하는 방법은 원칙적으로 벡커 등 (위 참조)에 의한 출판물에 설명되어 있다. 가장 중요한 단계는 다음과 같다:
- 플라스미드를 제1 상동성 재조합 사건 후에 게놈 내로 성공적으로 통합시킨 클론의 선택. 상기 선택은 카나마이신-함유 한천 플레이트 상의 성장에 의해 달성된다. 선택 단계에 추가로, 성공적인 재조합은 콜로니 PCR을 통해 검토될 수 있다.
- 카나마이신-비함유 배지 내에서 양성 클론을 인큐베이팅함으로써, 제2 재조합 사건이 허용된다.
- 벡터 백본이 제2 재조합 사건에 의해 성공적으로 제거된 클론은 수크로스-함유 배지 상의 성장에 의해 확인된다. SacB 유전자를 포함하는 벡터 백본을 상실한 클론만이 생존할 것이다.
- 이어서, 2개의 재조합 사건이 천연 idh-코딩 구역을 결실시킨 클론을 PCR-특이적 프라이머를 사용하여 또는 서던 블로팅 (Southern blotting)에 의해 확인한다.
적합한 프라이머는 다음과 같다 (5'에서 3'으로):
Figure pat00017
ICD의 완전 코딩 구역이 제거된 균주는 약 440개 염기쌍 (보다 정밀하게, 442 bp)의 PCR 생성물을 생성할 것인 반면, 야생형 icd 유전자를 갖는 모 균주는 약 2660개 염기쌍의 밴드를 보일 것이다.
성공적인 결실은 또한 서던 블로팅에 의해 또는 ICD 활성을 측정함으로써 확인할 수 있다.
icd 코딩 구역이 완전히 결실된 생성 균주는 델타 icd로 불린다. 상기 균주는 ICD 활성이 결핍되고, 따라서 글루타메이트를 합성할 수 없으므로, 상기 균주를 풍부 배지 상에서 성장시키거나, 또는 최소 배지에서 성장되는 경우에는 글루타메이트를 공급하는 것이 유용하다.
씨. 글루타미쿰에서 유전자를 결실시키는 방법에 관한 보다 상세한 방법은 또한 문헌 [Eggeling and Bott (eds) "Handbook of Corynebacterium" (Taylor and Francis Group, 2005) Chapter 23.8]에 설명되어 있다.
라이신, 메티오닌, 베타- 라이신, 디아미노펜탄, 디피콜리네이트의 생산성에 대한 icd 결실의 효과는 상기 및 WO 2007/101867, WO 2007/113127에 설명된 바와 같이 모니터링할 수 있다.
일반적으로, 임의의 표적 정밀 화학물질의 생산을 위해, WO 2005/059139에 설명된 바와 같은 라이신 생산에 대한 것과 동일한 배양 배지 및 조건을 사용할 수 있다. 균주를 CM 한천 상에서 밤새 30℃에서 예비배양하였다. 배양된 세포를 1.5 ml의 0.9％ NaCl을 담은 마이크로튜브 내에 수거하고, 세포 밀도를 볼텍스 후에 610 nm에서 흡광도에 의해 결정하였다. 주 배양을 위해, 현탁된 세포를 1.5의 초기 OD를 달성하도록, 0.5 g의 CaCO3을 함유한 고압멸균시킨 100 ml의 얼렌마이어 플라스크 내에 담긴 10 ml의 생산 배지 (WO 2005/059139에서 배지 I로 불림) 내로 접종하였다. 주 배양은 회전 진탕기 (인포스 AJ118) 상에서 200 rpm로 48-78 시간 동안 30℃에서 수행하였다. 세포 성장 측정을 위해, 0.1 ml의 배양 브로쓰를 0.9 ml의 1 N HCl과 혼합하여 CaCO3을 제거하고, 610 nm에서 흡광도를 적절한 희석 후에 측정하였다. 생성물, 및 글루코스, 프럭토스 및 수크로스를 포함한 잔류 당의 농도를 HPLC 방법에 의해 측정하였다 (애질런트 1100 시리즈 LC 시스템).
실시예 5: 비활성이 보다 낮은 변이체를 사용한 천연 icd 코딩 구역의 교체
보다 상세한 실험 내용을 이제 원래의 icd 서열을 ICD 활성이 보다 낮은 돌연변이체 서열로 교체하기 위해 하나의 가능한 전략에 대해 설명한다.
1. 활성이 보다 낮은 icd 돌연변이체의 생성 및 선택
제1 단계에서, icd 코딩 서열을 씨. 글루타미쿰일 수 있는 숙주 세포 내에서 기능하는 프로모터, RBS 및 종결인자 서열과 같은 모든 조절 서열을 함유하는 복제 플라스미드 내로 클로닝하였다. 이상적으로, 이. 콜라이 및 씨. 글루타미쿰 내에서 복제할 수 있는 셔틀 플라스미드를 사용한다. 그러한 셔틀 벡터의 예는 pClik5aMCS (WO 2005/059093)이다. 보다 적합한 셔틀 벡터는 문헌 [Eikmanns et al. (Gene (1991) 102:93-8)] 또는 ["Handbook of Corynebacterium" (edited by Eggeling and Bott, ISBN 0-8493-1821-1, 2005)]에서 찾을 수 있다. 이. 콜라이 - 씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터의 목록 (표 23.1) 및 이. 콜라이 - 씨. 글루타미쿰 셔틀 발현 벡터의 목록 (표 23.2)이 존재함을 알 수 있다. 후자가 클로닝된 유전자의 발현을 유도하는 적합한 프로모터를 이미 함유하므로 바람직하다.
분자 생물학의 표준 방법, 예를 들어 PCR에 의한 증폭을 포함한 클로닝, 제한 효소를 사용한 소화, 라이게이션, 형질전환은 전문가에게 잘 공지되어 있고, 표준 프로토콜 서적, 예를 들어 문헌 [Ausubel et al. (eds) Current protocols in molecular biology. (John Wiley & Sons, Inc. 2007)], [Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] 및 [Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition (John Wiley & Sons, Inc. 1995)]에서 찾을 수 있다.
icd 코딩 서열의 돌연변이체 변이체의 세트를 부위-지정 돌연변이 유발에 의해 생성하였다. 돌연변이 유발 방법은 문헌 [Glick and Pasternak MOLECULAR BIOTECHNOLOGY. PRINCIPLES AND APPLICATIONS OF RECOMBINANT DNA; 2nd edition (American Sicienty for Microbiology, 1998), Chapter 8: Directed Mutagenensis and Protein Engineering], 및 [Ausubel et al. (eds) Current protocols in molecular biology (John Wiley & Sons, Inc. 2007). Chapter 8]에서 찾을 수 있다.
icd 변이체의 라이브러리를 코딩하는 생성되는 플라스미드의 세트는 대체로 이. 콜라이 내에서 생성된다.
후속적으로, 라이브러리는 표준 방법, 예를 들어 전기천공에 의해 씨. 글루타미쿰 내로 형질전환될 수 있다. 형질전환을 위한 방법은 예를 들어, 문헌 [Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29:356-362 (1988))], [Dunican und Shivnan (Biotechnology 7:1067-1070 (1989))], [Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123:343-347 (1994)], 또는 [Eggeling and Bott (eds) Handbook of Corynebacterium" (Taylor and Francis Group, 2005) ISBN 0-8493-1821-1]에서 찾을 수 있다.
이어서, 생성되는 클론을 ICD 활성에 대해 시험해야 한다. 조질 세포 추출물로부터 ICD 효소 활성을 측정하기 위한 방법은 실시예 1에 설명되어 있다.
대조군으로서, icd 변이체 라이브러리와 동일한 플라스미드 내에 클로닝된 야생형 icd 유전자를 평행으로 결정하였다.
이들 결과에 기초하여, 야생형 icd 유전자에 비해 활성이 더 낮은 ICD 변이체를 선택할 수 있다.
ICD 활성이 보다 낮은 돌연변이체는 보다 낮은 비활성을 갖거나 (예를 들어 각각의 단백질 분자는 활성이 더 적다), 덜 효율적으로 전사 또는 번역되거나, 덜 안정할 수 있다.
2. ICD 활성이 보다 낮은 돌연변이체를 사용한 야생형 icd 유전자의 교체
야생형 icd 코딩 구역을 ICD 활성이 보다 낮은 변이체로 교체하기 위해, 2 단계 전략을 적용할 수 있다. 제1 단계에서, 야생형 icd 유전자의 코딩 구역은 게놈으로부터 완전히 결실된다. icd가 파괴된 세포가 생육가능함을 설명하는 문헌이 존재한다 (Eikmanns et al (1995) J Bacteriol (1995) 177(3):774-782).
a) 야생형 icd의 결실
icd의 결실 방법은 실시예 4에 설명되어 있다. 생성되는 균주는 델타 icd로 불린다.
b) 돌연변이체 icd 서열의 삽입
제2 단계에서, 변이체 icd 코딩 서열을 델타 icd 균주 내로 삽입하였다. 이를 위해, 돌연변이체 icd 서열을 실시예 4에서 결실 구성체를 위해 사용된 것과 동일한 ~ 300-600개의 상류 및 하류 뉴클레오티드가 측면에 접하는 적합한 통합 플라스미드, 예를 들어 pClik int sacB (위 참조) 내로 클로닝하였다.
돌연변이체 icd를 함유하는 상기 플라스미드가 씨. 글루타미쿰 내로 형질전환되면, - 상동성 재조합의 2회 연속적인 단계 후에 - 돌연변이체 icd 코딩 구역을 icd 로커스 내로 삽입시킨 클론을 상기한 것과 유사한 전략에 의해 확인할 수 있다. 돌연변이체 ICD 코딩 구역에 특이적인 PCR 프라이머를 사용하여 델타 icd 균주 및 양성 클론을 구분할 수 있다.
야생형 icd 코딩 구역을 돌연변이체 icd 코딩 구역에 의해 성공적으로 교체한 클론을 이하 "icd (mut)"로 부를 것이다.
3. ICD 활성의 결정
균주 "icd (mut)"의 ICD 활성을 야생형 icd 유전자를 함유하는 모 균주의 활성에 비교할 것이다. 이를 위한 방법은 실시예 1에 설명되어 있다.
4. 정밀 화학물질의 생산을 위한 효과의 분석
돌연변이체 icd에 의한 야생형 icd의 상기 교체는 발효에 의해 상이한 화학물질을 생산하는 균주 내에서 이루어질 수 있다.
적합한 균주는 다음 화학물질을 생산하도록 공학 처리된 씨. 글루타미쿰을 포함한다 (괄호 내의 생산 균주로서 사용될 수 있는 균주 참조):
· 라이신 (예를 들어 LU11424, ATCC13032 lysC(fbr); ATCC13287, 21300, 21513: 예를 들어 문헌 [Eggeling and Bott (eds) Handbook of Corynebacterium" (Taylor and Francis Group, 2005) Chapter 20)]에 설명됨)
· 메티오닌 (예를 들어 WO 2007/012078, WO 2007/020295에 설명됨)
· 디아미노펜탄 (WO 2007/113127, 실시예 3)
· 베타-라이신 (WO 2007/101867)
· 디피콜리네이트 (EP 08151031.5)
· 트레오닌 ([Colon et al. (1995) Appl Environ Microbiol 61:71-78]; [Eikmanns et al. (1991) Appl Micorbiol Biotechnol 34:617-622]; [Ishida et al. (1994) Biosci Biotechnol Biochem 57:1755-1756]; [Kase et al. (1974) Agric Biol Chem 38:993-1000])
· 이소류신 ([Morbach et al. (1996) Appl Environ Microbiol 62:4345-4351]; [Ishida et al. (1993) Biosci Biotechnol Biochem 57:1755-1756]).
라이신, 메티오닌 및 디아미노펜탄 생산을 위한 배양 및 검출은 다른 실시예에 설명되어 있다. 일반적으로, 임의의 표적 정밀 화학물질에 대해, WO 2005/059139에 설명된 바와 같이 라이신 생산에 대한 것과 동일한 배양 배지 및 조건을 사용할 수 있다. 균주를 CM 한천 상에서 밤새 30℃에서 예비배양하였다. 배양된 세포를 1.5 ml의 0.9％ NaCl을 담은 마이크로튜브 내에 수거하고, 세포 밀도를 볼텍스 후에 610 nm에서 흡광도에 의해 결정하였다. 주 배양을 위해, 현탁된 세포를 1.5의 초기 OD를 달성하도록, 0.5 g의 CaCO3을 함유한 고압멸균시킨 100 ml의 얼렌마이어 플라스크 내에 담긴 10 ml의 생산 배지 (WO 2005/059139에서 배지 I로 불림) 내로 접종하였다. 주 배양은 회전 진탕기 (인포스 AJ118) 상에서 200 rpm로 48-78 시간 동안 30℃에서 수행하였다. 세포 성장 측정을 위해, 0.1 ml의 배양 브로쓰를 0.9 ml의 1 N HCl과 혼합하여 CaCO3을 제거하고, 610 nm에서 흡광도를 적절한 희석 후에 측정하였다. 생성물, 및 글루코스, 프럭토스 및 수크로스를 포함한 잔류 당의 농도를 HPLC 방법에 의해 측정하였다 (애질런트 1100 시리즈 LC 시스템).
표적 생성물의 축적은 ICD 활성이 감소된 균주 내에서 더 높은 것으로 예상된다.
실시예 6: 상류 서열의 변화에 의한 icd 전사/번역의 저하
a) 적합한 상류 서열의 확인 (프로모터 + RBS)
먼저, 천연 icd 프로모터보다 더 약한 상류 서열을 확인해야 한다. 새로운 상류 서열은 코리네박테리움 또는 다른 유기체로부터 유래할 수 있다. 세균, 보다 구체적으로 코리네형 세균 내에서 기능하는 몇몇 프로모터 (RBS 포함)가 확인되었다. 그러한 프로모터의 예는 DE-A-44 40 118, [Reinscheid et al., Microbiology 145:503 (1999)], [Patek et al., Microbiology 142:1297 (1996)], WO 02/40679, DE-A-103 59 594, DE-A-103 59 595, DE-A-103 59 660 및 DE-A-10 2004 035 065에 설명되어 있다.
추가로, 천연 icd 프로모터보다 더 약한 다른 상류 구역을 icd 프로모터의 교체를 위해 사용할 수 있다.
상류 구역의 강도는 문헌 [Patek et al (1996) Promoters from corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif. Microbiology 142:1297-1309]에 설명된 바와 같은 리포터 (reporter) 시스템을 이용하여 측정할 수 있다.
별법으로, 천연 상류 서열 내에 돌연변이를 도입하고, 후속적으로 그의 전사 활성을 분석할 수 있다. 바람직하게는, icd 출발 코돈의 83개 nt 상류 서열이 사용되고, 이는 상기 구역 내에 다른 유전자의 코딩 구역이 없기 때문이다. 상류 구역의 서열을 아래 제시한다 (굵은 글씨).
프로모터 서열을 포함한 DNA 서열을 돌연변이 유발하는 방법은 전문가에게 잘 공지되어 있고, 또한 예를 들어 문헌 [Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak: Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. 2nd edition. 1998. ISBN 1-55581-136-1; Chapter 8: Directed Mutagenesis and Protein engineering]에 설명되어 있다. 이어서, 적합한 프로모터 서열을 선택할 수 있다.
전사 또는 번역 활성이 보다 낮은 상류 구역은 ICD 발현을 유도시키는 원래의 프로모터를 교체하기 위해 사용될 것이다. 기술적으로, 교체는 2회의 연속적인 상동성 재조합 사건에 의해, 선행 실시예에 설명된 icd 코딩 구역의 교체와 동일한 방법에 의해 이루어질 수 있다.
생성되는 균주는 ICD 활성이 낮을 것이다. 생산성에 대한 효과를 실시예 5에 설명된 바와 같이 분석할 수 있다.
500개 nt 상류 및 하류 구역을 포함하는 ICD 유전자의 서열 (서열 2)
추정된 프로모터 구역 (상류 구역): 굵은 글씨체
굵고 밑줄치지 않음: icd의 상류에 위치한 유전자의 (부분적) 3' 코딩 구역
굵고 밑줄침: 임의의 코딩 구역이 없는 83개의 nt
코딩 구역: 이탤릭체
하류 구역: 일반적인 글씨체
Figure pat00018
SEQUENCE LISTING <110> BASF SE <120> Production process for fine chemicals using microorganisms with reduced isocitrate dehydrogenase activity <130> B 9115 / DB <150> EP08155436 <151> 2008-04-30 <150> EP09153149 <151> 2009-02-18 <160> 24 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 2217 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2217) <223> coding sequence of isocitrate dehydrogenase (icd) <400> 1 atggctaaga tcatctggac ccgcaccgac gaagcaccgc tgctcgcgac ctactcgctg 60 aagccggtcg tcgaggcatt tgctgctacc gcgggcattg aggtcgagac ccgggacatt 120 tcactcgctg gacgcatcct cgcccagttc ccagagcgcc tcaccgaaga tcagaaggta 180 ggcaacgcac tcgcagaact cggcgagctt gctaagactc ctgaagcaaa catcattaag 240 cttccaaaca tctccgcttc tgttccacag ctcaaggctg ctattaagga actgcaggac 300 cagggctacg acatcccaga actgcctgat aacgccacca ccgacgagga aaaagacatc 360 ctcgcacgct acaacgctgt taagggttcc gctgtgaacc cagtgctgcg tgaaggcaac 420 tctgaccgcc gcgcaccaat cgctgtcaag aactttgtta agaagttccc acaccgcatg 480 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gac cag ggc tac gac atc cca gaa 821 Lys Ala Ala Ile Lys Glu Leu Gln Asp Gln Gly Tyr Asp Ile Pro Glu 95 100 105 ctg cct gat aac gcc acc acc gac gag gaa aaa gac atc ctc gca cgc 869 Leu Pro Asp Asn Ala Thr Thr Asp Glu Glu Lys Asp Ile Leu Ala Arg 110 115 120 tac aac gct gtt aag ggt tcc gct gtg aac cca gtg ctg cgt gaa ggc 917 Tyr Asn Ala Val Lys Gly Ser Ala Val Asn Pro Val Leu Arg Glu Gly 125 130 135 aac tct gac cgc cgc gca cca atc gct gtc aag aac ttt gtt aag aag 965 Asn Ser Asp Arg Arg Ala Pro Ile Ala Val Lys Asn Phe Val Lys Lys 140 145 150 155 ttc cca cac cgc atg ggc gag tgg tct gca gat tcc aag acc aac gtt 1013 Phe Pro His Arg Met Gly Glu Trp Ser Ala Asp Ser Lys Thr Asn Val 160 165 170 gca acc atg gat gca aac gac ttc cgc cac aac gag aag tcc atc atc 1061 Ala Thr Met Asp Ala Asn Asp Phe Arg His Asn Glu Lys Ser Ile Ile 175 180 185 ctc gac gct gct gat gaa gtt cag atc aag cac atc gca gct gac ggc 1109 Leu Asp Ala Ala Asp Glu Val Gln Ile Lys His Ile Ala Ala Asp Gly 190 195 200 acc gag acc atc ctc aag gac agc ctc aag ctt ctt gaa ggc gaa gtt 1157 Thr Glu Thr Ile Leu Lys Asp Ser Leu Lys Leu Leu Glu Gly Glu Val 205 210 215 cta gac gga acc gtt ctg tcc gca aag gca ctg gac gca ttc ctt ctc 1205 Leu Asp Gly Thr Val Leu Ser Ala Lys Ala Leu Asp Ala Phe Leu Leu 220 225 230 235 gag cag gtc gct cgc gca aag gca gaa ggt atc ctc ttc tcc gca cac 1253 Glu Gln Val Ala Arg Ala Lys Ala Glu Gly Ile Leu Phe Ser Ala His 240 245 250 ctg aag gcc acc atg atg aag gtc tcc gac cca atc atc ttc ggc cac 1301 Leu Lys Ala Thr Met Met Lys Val Ser Asp Pro Ile Ile Phe Gly His 255 260 265 gtt gtg cgc gct tac ttc gca gac gtt ttc gca cag tac ggt gag cag 1349 Val Val Arg Ala Tyr Phe Ala Asp Val Phe Ala Gln Tyr Gly Glu Gln 270 275 280 ctg ctc gca gct ggc ctc aac ggc gaa aac ggc ctc gct gca atc ctc 1397 Leu Leu Ala Ala Gly Leu Asn Gly Glu Asn Gly Leu Ala Ala Ile Leu 285 290 295 tcc ggc ttg gag tcc ctg gac aac ggc gaa gaa atc aag gct gca ttc 1445 Ser Gly Leu Glu Ser Leu Asp Asn Gly Glu Glu Ile Lys Ala Ala Phe 300 305 310 315 gag aag ggc ttg gaa gac ggc cca gac ctg gcc atg gtt aac tcc gct 1493 Glu Lys Gly Leu Glu Asp Gly Pro Asp Leu Ala Met Val Asn Ser Ala 320 325 330 cgc ggc atc acc aac ctg cat gtc cct tcc gat gtc atc gtg gac gct 1541 Arg Gly Ile Thr Asn Leu His Val Pro Ser Asp Val Ile Val Asp Ala 335 340 345 tcc atg cca gca atg att cgt acc tcc ggc cac atg tgg aac aaa gac 1589 Ser Met Pro Ala Met Ile Arg Thr Ser Gly His Met Trp Asn Lys Asp 350 355 360 gac cag gag cag gac acc ctg gca atc atc cca gac tcc tcc tac gct 1637 Asp Gln Glu Gln Asp Thr Leu Ala Ile Ile Pro Asp Ser Ser Tyr Ala 365 370 375 ggc gtc tac cag acc gtt atc gaa gac tgc cgc aag aac ggc gca ttc 1685 Gly Val Tyr Gln Thr Val Ile Glu Asp Cys Arg Lys Asn Gly Ala Phe 380 385 390 395 gat cca acc acc atg ggt acc gtc cct aac gtt ggt ctg atg gct cag 1733 Asp Pro Thr Thr Met Gly Thr Val Pro Asn Val Gly Leu Met Ala Gln 400 405 410 aag gct gaa gag tac ggc tcc cat gac aag acc ttc cgc atc gaa gca 1781 Lys Ala Glu Glu Tyr Gly Ser His Asp Lys Thr Phe Arg Ile Glu Ala 415 420 425 gac ggt gtg gtt cag gtt gtt tcc tcc aac ggc gac gtt ctc atc gag 1829 Asp Gly Val Val Gln Val Val Ser Ser Asn Gly Asp Val Leu Ile Glu 430 435 440 cac gac gtt gag gca aat gac atc tgg cgt gca tgc cag gtc aag gat 1877 His Asp Val Glu Ala Asn Asp Ile Trp Arg Ala Cys Gln Val Lys Asp 445 450 455 gcc cca atc cag gat tgg gta aag ctt gct gtc acc cgc tcc cgt ctc 1925 Ala Pro Ile Gln Asp Trp Val Lys Leu Ala Val Thr Arg Ser Arg Leu 460 465 470 475 tcc gga atg cct gca gtg ttc tgg ttg gat cca gag cgc gca cac gac 1973 Ser Gly Met Pro Ala Val Phe Trp Leu Asp Pro Glu Arg Ala His Asp 480 485 490 cgc aac ctg gct tcc ctc gtt gag aag tac ctg gct gac cac gac acc 2021 Arg Asn Leu Ala Ser Leu Val Glu Lys Tyr Leu Ala Asp His Asp Thr 495 500 505 gag ggc ctg gac atc cag atc ctc tcc cct gtt gag gca acc cag ctc 2069 Glu Gly Leu Asp Ile Gln Ile Leu Ser Pro Val Glu Ala Thr Gln Leu 510 515 520 tcc atc gac cgc atc cgc cgt ggc gag gac acc atc tct gtc acc ggt 2117 Ser Ile Asp Arg Ile Arg Arg 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Leu Asn Glu Glu Lys Ser Pro Ser Arg Lys Val Gly Glu Ile Asp 640 645 650 aac cgt ggc tcc cac ttc tgg ctg acc aag ttc tgg gct gac gag ctc 2501 Asn Arg Gly Ser His Phe Trp Leu Thr Lys Phe Trp Ala Asp Glu Leu 655 660 665 gct gct cag acc gag gac gca gat ctg gct gct acc ttc gca cca gtc 2549 Ala Ala Gln Thr Glu Asp Ala Asp Leu Ala Ala Thr Phe Ala Pro Val 670 675 680 gca gaa gca ctg aac aca ggc gct gca gac atc gat gct gca ctg ctc 2597 Ala Glu Ala Leu Asn Thr Gly Ala Ala Asp Ile Asp Ala Ala Leu Leu 685 690 695 gca gtt cag ggt gga gca act gac ctt ggt ggc tac tac tcc cct aac 2645 Ala Val Gln Gly Gly Ala Thr Asp Leu Gly Gly Tyr Tyr Ser Pro Asn 700 705 710 715 gag gag aag ctc acc aac atc atg cgc cca gtc gca cag ttc aac gag 2693 Glu Glu Lys Leu Thr Asn Ile Met Arg Pro Val Ala Gln Phe Asn Glu 720 725 730 atc gtt gac gca ctg aag aag taa agtctcttca caaaaagcgc tgtgcttcct 2747 Ile Val Asp Ala Leu Lys Lys 735 cacatggaag cacagcgctt tttcatattt ttattgccat aatgggcaca tgcgtttttc 2807 tcgagttctt cccgcacttc 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Lys Ala Ala Phe Glu Lys Gly Leu Glu 305 310 315 320 Asp Gly Pro Asp Leu Ala Met Val Asn Ser Ala Arg Gly Ile Thr Asn 325 330 335 Leu His Val Pro Ser Asp Val Ile Val Asp Ala Ser Met Pro Ala Met 340 345 350 Ile Arg Thr Ser Gly His Met Trp Asn Lys Asp Asp Gln Glu Gln Asp 355 360 365 Thr Leu Ala Ile Ile Pro Asp Ser Ser Tyr Ala Gly Val Tyr Gln Thr 370 375 380 Val Ile Glu Asp Cys Arg Lys Asn Gly Ala Phe Asp Pro Thr Thr Met 385 390 395 400 Gly Thr Val Pro Asn Val Gly Leu Met Ala Gln Lys Ala Glu Glu Tyr 405 410 415 Gly Ser His Asp Lys Thr Phe Arg Ile Glu Ala Asp Gly Val Val Gln 420 425 430 Val Val Ser Ser Asn Gly Asp Val Leu Ile Glu His Asp Val Glu Ala 435 440 445 Asn Asp Ile Trp Arg Ala Cys Gln Val Lys Asp Ala Pro Ile Gln Asp 450 455 460 Trp Val Lys Leu Ala Val Thr Arg Ser Arg Leu Ser Gly Met Pro Ala 465 470 475 480 Val Phe Trp Leu Asp Pro Glu Arg Ala His Asp Arg Asn Leu Ala Ser 485 490 495 Leu Val Glu Lys Tyr Leu Ala Asp His Asp Thr Glu Gly Leu Asp Ile 500 505 510 Gln Ile Leu Ser Pro Val Glu 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cgaagttcta 660 gacggaaccg ttctgtccgc aaaggcactg gacgcattcc ttctcgagca ggtcgctcgc 720 gcaaaggcag aaggtatcct cttctccgca cacctgaagg ccaccatgat gaaggtctcc 780 gacccaatca tcttcggcca cgttgtgcgc gcttacttcg cagacgtttt cgcacagtac 840 ggtgagcagc tgctcgcagc tggcctcaac ggcgaaaacg gcctcgctgc aatcctctcc 900 ggcttggagt ccctggacaa cggcgaagaa atcaaggctg cattcgagaa gggcttggaa 960 gacggcccag acctggccat ggttaactcc gctcgcggca tcaccaacct gcatgtccct 1020 tccgatgtca tcgtggacgc ttccatgcca gcaatgattc gtacctccgg ccacatgtgg 1080 aacaaagacg accaggagca ggacaccctg gcaatcatcc cagactcctc ctacgctggc 1140 gtctaccaga ccgttatcga agactgccgc aagaacggcg cattcgatcc aaccaccatg 1200 ggtaccgtcc ctaacgttgg tctgatggct cagaaggctg aagagtacgg ctcccatgac 1260 aagaccttcc gcatcgaagc agacggtgtg gttcaggttg tttcctccaa cggcgacgtt 1320 ctcatcgagc acgacgttga ggcaaatgac atctggcgtg catgccaggt caaggatgcc 1380 ccaatccagg attgggtaaa gcttgctgtc acccgctccc gtctctccgg aatgcctgca 1440 gtgttctggt tggatccaga gcgcgcacac gaccgcaacc tggcttccct cgttgagaag 1500 tacctggctg accacgacac cgagggcctg gacatccaga tcctctcccc tgttgaggca 1560 acccagctct ccatcgaccg catccgccgt ggcgaggaca ccatctctgt caccggtaac 1620 gttctgcgtg actacaacac cgacctcttc ccaatcctgg agctgggcac ctctgcaaag 1680 atgctgtctg tcgttccttt gatggctggc ggcggactgt tcgagaccgg tgctggtgga 1740 tctgctccta agcacgtcca gcaggttcag gaagaaaacc acctgcgttg ggattccctc 1800 ggtgagttcc tcgcactggc tgagtccttc cgccacgagc tcaacaacaa cggcaacacc 1860 aaggccggcg ttctggctga cgctctggac aaggcaactg agaagctgct gaacgaagag 1920 aagtccccat cccgcaaggt tggcgagatc gacaaccgtg gctcccactt ctggctgacc 1980 aagttctggg ctgacgagct cgctgctcag accgaggacg cagatctggc tgctaccttc 2040 gcaccagtcg cagaagcact gaacacaggc gctgcagaca tcgatgctgc actgctcgca 2100 gttcagggtg gagcaactga ccttggtggc tactactccc ctaacgagga gaagctcacc 2160 aacatcatgc gcccagtcgc acagttcaac gagatcgttg acgcactgaa gaagtaa 2217 <210> 5 <211> 1002 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1002) <223> vector insert with isocitrate dehydrogenase (icd) of Corynebacterium glutamicum carrying an ATG-GTG mutation in the start codon <400> 5 ctcgagcgaa gacctcgcag attccgatat tccaggaacc gccatgatcg aaatcccctc 60 agatgacgat gcacttgcca tcgagggacc ttcctccatc gatgtgaaat ggctgccccg 120 caacggccgc aagcacggtg aattgttgat ggaaaccctg gccctccacc atgaagaaac 180 agaagctgca gccacctccg aaggcgaact tgtgtgggag actcctgtgt tctccgccac 240 tggcgaacag atcacagaat ccaacccacg ttcaggcgac tactactgga ttgctggcga 300 aagtggtgtc gtgaccagca ttcgtcgatc tctagtgaaa gagaaaggcc tcgaccgttc 360 ccaagtggca ttcatggggt attggaaaca cggcgtttcc atgcggggct gaaactgcca 420 ccataggcgc cagcaattag tagaacactg tattctaggt agctgaacaa aagagcccat 480 caaccaagga gactcgtggc taagatcatc tggacccgca ccgacgaagc accgctgctc 540 gcgacctact cgctgaagcc ggtcgtcgag gcatttgctg ctaccgcggg cattgaggtc 600 gagacccggg acatttcact cgctggacgc atcctcgccc agttcccaga gcgcctcacc 660 gaagatcaga aggtaggcaa cgcactcgca gaactcggcg agcttgctaa gactcctgaa 720 gcaaacatca ttaagcttcc aaacatctcc gcttctgttc cacagctcaa ggctgctatt 780 aaggaactgc aggaccaggg ctacgacatc ccagaactgc ctgataacgc caccaccgac 840 gaggaaaaag acatcctcgc acgctacaac gctgttaagg gttccgctgt gaacccagtg 900 ctgcgtgaag gcaactctga ccgccgcgca ccaatcgctg tcaagaactt tgttaagaag 960 ttcccacacc gcatgggcga gtggtctgca gattccacgc gt 1002 <210> 6 <211> 2217 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2217) <223> codon usage amended isocitrate dehydrogenase (icd) CA2 carrying a mutation from GGC (Gly) ATT (Ile) into GGG ATA at amino acid positions 32 and 33 <400> 6 atggctaaga tcatctggac ccgcaccgac gaagcaccgc tgctcgcgac ctactcgctg 60 aagccggtcg tcgaggcatt tgctgctacc gcggggatag aggtcgagac ccgggacatt 120 tcactcgctg gacgcatcct cgcccagttc ccagagcgcc tcaccgaaga tcagaaggta 180 ggcaacgcac tcgcagaact cggcgagctt gctaagactc ctgaagcaaa catcattaag 240 cttccaaaca tctccgcttc tgttccacag ctcaaggctg ctattaagga actgcaggac 300 cagggctacg acatcccaga actgcctgat aacgccacca ccgacgagga aaaagacatc 360 ctcgcacgct acaacgctgt taagggttcc gctgtgaacc cagtgctgcg tgaaggcaac 420 tctgaccgcc gcgcaccaat cgctgtcaag aactttgtta agaagttccc acaccgcatg 480 ggcgagtggt ctgcagattc caagaccaac gttgcaacca tggatgcaaa cgacttccgc 540 cacaacgaga agtccatcat cctcgacgct gctgatgaag ttcagatcaa gcacatcgca 600 gctgacggca ccgagaccat cctcaaggac agcctcaagc ttcttgaagg cgaagttcta 660 gacggaaccg ttctgtccgc aaaggcactg gacgcattcc ttctcgagca ggtcgctcgc 720 gcaaaggcag aaggtatcct cttctccgca cacctgaagg ccaccatgat gaaggtctcc 780 gacccaatca tcttcggcca cgttgtgcgc gcttacttcg cagacgtttt cgcacagtac 840 ggtgagcagc tgctcgcagc tggcctcaac ggcgaaaacg gcctcgctgc aatcctctcc 900 ggcttggagt ccctggacaa cggcgaagaa atcaaggctg cattcgagaa gggcttggaa 960 gacggcccag acctggccat ggttaactcc gctcgcggca tcaccaacct gcatgtccct 1020 tccgatgtca tcgtggacgc ttccatgcca gcaatgattc gtacctccgg ccacatgtgg 1080 aacaaagacg accaggagca ggacaccctg gcaatcatcc cagactcctc ctacgctggc 1140 gtctaccaga ccgttatcga agactgccgc aagaacggcg cattcgatcc aaccaccatg 1200 ggtaccgtcc ctaacgttgg tctgatggct cagaaggctg aagagtacgg ctcccatgac 1260 aagaccttcc gcatcgaagc agacggtgtg gttcaggttg tttcctccaa cggcgacgtt 1320 ctcatcgagc acgacgttga ggcaaatgac atctggcgtg catgccaggt caaggatgcc 1380 ccaatccagg attgggtaaa gcttgctgtc acccgctccc gtctctccgg aatgcctgca 1440 gtgttctggt tggatccaga gcgcgcacac gaccgcaacc tggcttccct cgttgagaag 1500 tacctggctg accacgacac cgagggcctg gacatccaga tcctctcccc tgttgaggca 1560 acccagctct ccatcgaccg catccgccgt ggcgaggaca ccatctctgt caccggtaac 1620 gttctgcgtg actacaacac cgacctcttc ccaatcctgg agctgggcac ctctgcaaag 1680 atgctgtctg tcgttccttt gatggctggc ggcggactgt tcgagaccgg tgctggtgga 1740 tctgctccta agcacgtcca gcaggttcag gaagaaaacc acctgcgttg ggattccctc 1800 ggtgagttcc tcgcactggc tgagtccttc cgccacgagc tcaacaacaa cggcaacacc 1860 aaggccggcg ttctggctga cgctctggac aaggcaactg agaagctgct gaacgaagag 1920 aagtccccat cccgcaaggt tggcgagatc gacaaccgtg gctcccactt ctggctgacc 1980 aagttctggg ctgacgagct cgctgctcag accgaggacg cagatctggc tgctaccttc 2040 gcaccagtcg cagaagcact gaacacaggc gctgcagaca tcgatgctgc actgctcgca 2100 gttcagggtg gagcaactga ccttggtggc tactactccc ctaacgagga gaagctcacc 2160 aacatcatgc gcccagtcgc acagttcaac gagatcgttg acgcactgaa gaagtaa 2217 <210> 7 <211> 1002 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1002) <223> vector insert with codon usage amended isocitrate dehydrogenase (icd) CA2 of Corynebacterium glutamicum carrying a mutation from GGC (Gly) ATT (Ile) into GGG ATA at amino acid positions 32 and 33 <400> 7 ctcgagcgaa gacctcgcag attccgatat tccaggaacc gccatgatcg aaatcccctc 60 agatgacgat gcacttgcca tcgagggacc ttcctccatc gatgtgaaat ggctgccccg 120 caacggccgc aagcacggtg aattgttgat ggaaaccctg gccctccacc atgaagaaac 180 agaagctgca gccacctccg aaggcgaact tgtgtgggag actcctgtgt tctccgccac 240 tggcgaacag atcacagaat ccaacccacg ttcaggcgac tactactgga ttgctggcga 300 aagtggtgtc gtgaccagca ttcgtcgatc tctagtgaaa gagaaaggcc tcgaccgttc 360 ccaagtggca ttcatggggt attggaaaca cggcgtttcc atgcggggct gaaactgcca 420 ccataggcgc 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misc_feature <222> (1)..(2148) <223> lysine decarboxylase gene (cadA) <400> 10 atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60 gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120 gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180 aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240 gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300 agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360 actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420 cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480 agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540 tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600 gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660 tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac cattctgatt 720 gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780 tatttccgcc 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gttttatgga 5400 cagcaagcga accggaattg ccagctgggg cgccctctgg taaggttggg aagccctgca 5460 aagtaaactg gatggctttc ttgccgccaa ggatctgatg gcgcagggga tcaagatctg 5520 atcaagagac aggatgagga tcgtttcgca tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt 5580 ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct 5640 gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga 5700 ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactcc aagacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg 5760 ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact 5820 ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg 5880 agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct 5940 gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg 6000 gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt 6060 tcgccaggct caaggcgcgg atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg 6120 cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc 6180 ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat 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caaaaggcct 7080 ggacgtttgg gacagctggc cattacaaaa cgctgacggc actgtcgcaa actatcacgg 7140 ctaccacatc gtctttgcat tagccggaga tcctaaaaat gcggatgaca catcgattta 7200 catgttctat caaaaagtcg gcgaaacttc tattgacagc tggaaaaacg ctggccgcgt 7260 ctttaaagac agcgacaaat tcgatgcaaa tgattctatc ctaaaagacc aaacacaaga 7320 atggtcaggt tcagccacat ttacatctga cggaaaaatc cgtttattct acactgattt 7380 ctccggtaaa cattacggca aacaaacact gacaactgca caagttaacg tatcagcatc 7440 agacagctct ttgaacatca acggtgtaga ggattataaa tcaatctttg acggtgacgg 7500 aaaaacgtat caaaatgtac agcagttcat cgatgaaggc aactacagct caggcgacaa 7560 ccatacgctg agagatcctc actacgtaga agataaaggc cacaaatact tagtatttga 7620 agcaaacact ggaactgaag atggctacca aggcgaagaa tctttattta acaaagcata 7680 ctatggcaaa agcacatcat tcttccgtca agaaagtcaa aaacttctgc aaagcgataa 7740 aaaacgcacg gctgagttag caaacggcgc tctcggtatg attgagctaa acgatgatta 7800 cacactgaaa aaagtgatga aaccgctgat tgcatctaac acagtaacag atgaaattga 7860 acgcgcgaac gtctttaaaa tgaacggcaa atggtacctg ttcactgact cccgcggatc 7920 aaaaatgacg attgacggca ttacgtctaa cgatatttac atgcttggtt atgtttctaa 7980 ttctttaact ggcccataca agccgctgaa caaaactggc cttgtgttaa aaatggatct 8040 tgatcctaac gatgtaacct ttacttactc acacttcgct gtacctcaag cgaaaggaaa 8100 caatgtcgtg attacaagct atatgacaaa cagaggattc tacgcagaca aacaatcaac 8160 gtttgcgccg agcttcctgc tgaacatcaa aggcaagaaa acatctgttg tcaaagacag 8220 catccttgaa caaggacaat taacagttaa caaataa 8257 <210> 23 <211> 8439 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8439) <223> plasmid pK19 mob sacB Psod ask <220> <221> misc_feature <222> (12)..(710) <223> upstream region of ask gene <220> <221> promoter <222> (1203)..(1394) <223> Psod promoter <220> <221> gene <222> (1395)..(2821) <223> ask gene including downstream region <400> 23 aattcgccct tcaccgcggc tttggacatc actgctacgt agccaaacaa tgcacccgtc 60 acaagaccaa ggatgagggc tttgtccttc tttaatacgt attccgcaag cagccacatt 120 ccacccatta ctgcaacgcc gactaaaagt actggaatcc atcgatcgag tgggggtggg 180 ggtttccggg aagggggcgt cccaaaacga tcatgatgcc cacggctacg gtgaggaggg 240 tagcccagaa gatttcagtt cggcgtagtc ggtagccatt gaatcgtgct gagagcggca 300 gcgtgaacat cagcgacagg acaagcactg gttgcactac caagagggtg ccgaaaccaa 360 gtgctactgt ttgtaagaaa tatgccagca tcgcggtact catgcctgcc caccacatcg 420 gtgtcatcag agcattgagt aaaggtgagc tccttaggga gccatctttt ggggtgcgga 480 gcgcgatccg gtgtctgacc acggtgcccc atgcgattgt taatgccgat gctagggcga 540 aaagcacggc gagcagattg ctttgcactt gattcagggt agttgactaa agagttgctc 600 gcgaagtagc acctgtcact tttgtctcaa atattaaatc gaatatcaat atatggtctg 660 tttattggaa cgcgtcccag tggctgagac gcatccgcta aagccccagg aagggcgaat 720 tctgcagata tccatcacac tggcggccgc tcgagcatgc atctagctta tcgccattcg 780 ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc 840 cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc 900 cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gaattccgtg gcacggaaat cgaggtagaa 960 gacattactc aggcaaccga aagggcgaat tccgtggcac ggaaatcgag gtagaagaca 1020 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  1. 정밀 화학물질의 생산을 위한 이소시트레이트 데히드로게나제 활성이 감소된 미생물의 용도.
KR1020137005383A 2008-04-30 2009-04-28 이소시트레이트 데히드로게나제 활성이 감소된 미생물을 사용한 정밀 화학물질의 생산 방법 KR20130038944A (ko)

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