KR20110008065A

KR20110008065A - 이소시트레이트 데하이드로게나제 활성이 감소된 미생물을 사용한 메티오닌 생산 방법

Info

Publication number: KR20110008065A
Application number: KR1020107024376A
Authority: KR
Inventors: 오스카 첼더; 하르트비크 슈뢰더; 코린나 크롭프록게; 안드레아 헤롤트; 스테판 해프너
Original assignee: 에보니크 데구사 게엠베하
Priority date: 2008-04-30
Filing date: 2009-04-27
Publication date: 2011-01-25
Also published as: MX2010011720A; EP2268826A2; CN102159720A; WO2009133063A3; WO2009133063A2; US20110117614A1

Abstract

본 발명은 이소시트레이트 데하이드로게나제 활성이 감소된 미생물을 사용한 메티오닌 생산 방법에 관한 것이다.

Description

이소시트레이트 데하이드로게나제 활성이 감소된 미생물을 사용한 메티오닌 생산 방법{PRODUCTION PROCESS FOR METHIONINE USING MICROORGANISMS WITH REDUCED ISOCITRATE DEHYDROGENASE ACTIVITY}

현재, 아미노산 메티오닌의 세계적 연간 생산량은 약 500,000 톤에 달한다. 표준 산업적 생산 방법은 발효에 의한 것이 아닌 방법이 아닌, 다단계 화학적 방법에 의한 것이다. 메티오닌은 가금류 가축 사료에서 제1의 제한 아미노산이며, 이 때문에 주로 사료 보충물로서 적용된다. 예로서, 미생물, 예를 들면, E. 콜라이(E. coli)를 사용하여 이루어지는 발효에 의해 메티오닌을 생산하고자 했던 다양한 시도가 선행 기술에서 공개된 바 있다.

예를 들면, 글루타메이트, 리신, 및 메티오닌과 같은 기타 다른 아미노산은 예를 들면, 발효 방법에 의해 생산된다. 이러한 목적을 위해 특정의 미생물, 예를 들면, C. 글루타미쿰(C. glutamicum)이 특히 적합하다고 입증된 바 있다. 발효에 의해 아미노산을 생산하게 되면, 오직 L-아미노산만이 생산이 되고, 전형적으로는 화학적 합성에서 사용되는 용매와 같은 환경학적으로 문제가 있는 화학물질을 피할 수 있다는 특별한 이점을 갖고 있다.

오늘날, 정밀 화학물질을 발효에 의해 생산하는 것은 전형적으로 미생물 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) (C. 글루타미쿰), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) (E. 콜라이), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) (S. 세레비시애), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (S. 폼베), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) (P. 파스토리스), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis), 애슈비아 거시피(Ashbya gossypii), 또는 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans)에서 수행된다. 특히, 예로서, L-글루타메이트 및 L-리신과 같은 아미노산을 다량으로 생산할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰의 능력에 대해서는 공지되어 있다 (문헌 [Kinoshita, S. (1985) Glutamic acid bacteria; p. 115-142 in: A.L. Demain and N.A. Solomon (ed.), Biology of industrial microorganisms, Bejamin/cummings Publishing Co., London]).

선행 기술에서는 예를 들면, 아미노산, 지질, 비타민 또는 당질과 같은 각각의 정밀 화학물질의 생합성 경로에 관여하는 유전자 발현을 증가시킴으로써 예를 들면, E. 콜라이 및 C. 글루타미쿰과 같은 미생물에서 상기 정밀 화학물질을 생산하고자 하는 여러 시도로 상기 목표가 이루어졌었다. 예로서, 아미노산, 예를 들면, 메티오닌 또는 리신의 생합성 경로 중 특정 단계가 속도-제한적인 것으로 알려져 있다면, 각 효소를 과발현시킴으로써 촉매화된 반응의 생성물을 더 많이 생산하는 미생물을 수득할 수 있게 되고, 이로써 궁극적으로는 각 아미노산의 생산은 증진될 것이다. 유사하게, 예로서, 원하는 아미노산의 생합성 경로 중 특정 효소 단계는 다량의 대사 에너지를 원치않는 부산물로 전한다는 이유로 상기 단계가 바람직하지 못한 것으로서 알려져 있다면, 궁극적으로는 해당 아미노산을 형성하는 대사 반응만을 촉진시키기 위하여 각 효소 활성의 발현을 하향조절하는 것이 주시될 수 있다.

메티오닌 또는 리신의 생합성 경로에 관여하는 유전자 발현을 상향- 및/또는 하향-조절함으로써 예로서, 메티오닌 또는 리신 생산을 증가시키고자 하는 시도는 예로서, WO 02/10209, WO 2006/008097, 및 WO 2005/059093에 기재되어 있다.

이소시트레이트 데하이드로게나제 (ICD, 종종 IDH로도 명명됨, EC 1.1.1.42, 서열번호: 3)는 예로서, C. 글루타미쿰의 시트르산 회로 (TCA)에 참여하는 효소이다 (도 1). 이는 상기 회로의 세번째 단계인, 알파-케토글루타레이트 및 CO₂를 생산하는, 이소시트레이트의 산화적 탈카르복실화를 촉매화시킨다.

C. 글루타미쿰에서 ICD를 코딩하는 유전자는 에이크만스(Eikmanns) 등에 의해서 동정되고, 클로닝되고, 그의 특징이 규명되었다 (문헌 [Eikmanns, B. et al., J. Bacteriol. (1995) 177:774-782]). C. 글루타미쿰에서 넉아웃에 의해 ICD를 코딩하는 염색체 icd 유전자를 불활성화시키면 글루타메이트 영양요구성이 된다 (문헌 [Eikmanns, B. et al., J. Bacteriol. (1995) 177:774-782]).

C. 글루타미쿰 및 E. 콜라이에서의 ICD 과발현은 글루타메이트 생산을 증진시키지는 못했다 (문헌 [Eikmanns, B. et al., J. Bacteriol. (1995) 177:774-782]). 그러나, DE 10210967에서는 E. 콜라이에서의 ICD 과발현이 메티오닌 생산을 증가시키는 것으로 보고된 바 있다. C. 글루타미쿰에서의 icd와, 글루타메이트 데하이드로게나제를 코딩하는 유전자의 공발현에 대한 상반된 결과가 보고되어 있다: 에이크만스는 어떤 효과도 기재하지 않은 반면, JP63214189 및 JP2520895에는 개선된 글루타메이트 수율이 보고되어 있다.

메티오닌 생산을 증가시키고자 하는 시도가 보고되어 있다는 점을 참작하여도 그에 대한 대체 생산 방법이 여전히 요구되고 있다.

본 발명의 목적 및 요약

본 발명의 목적은 이와 관련하여 알려지지 않는 특징들을 가진 산업적으로 중요한 미생물, 예를 들면, C. 글루타미쿰을 사용하여 메티오닌을 생산하는 대체 발효 방법, 및 상기 방법에서 사용하기 위한 미생물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다음의 설명으로부터 자명해지는 바와 같이 이러한 목적 및 기타 다른 목적은 독립항에 기술되어 있는 바와 같은 본 발명을 통해 해소될 것이다. 종속항은 본 발명의 바람직한 실시태양에 관한 것이다.

본 발명은 이소시트레이트 데하이드로게나제 활성이 감소된 세포를 사용하여 메티오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 효소의 하향조절이 메티오닌의 수율을 개선시키는지 이에 관련해서는 알려져 있지 않다.

본 생산 방법에 사용되는 세포는 원핵 생물, 하등 진핵 생물, 단리된 식물 세포, 효모 세포, 단리된 곤충 세포 또는 단리된 포유동물 세포, 특히, 세포 배양 시스템 중의 세포일 수 있다. 본 발명과 관련하여, "미생물"이라는 용어는 상기 종류의 세포에 대하여 사용된다.

본 발명의 수행을 위한, ICD 활성이 감소된 바람직한 종류의 미생물은 ICD 발현이 감소된 코리네박테리움, 특히 바람직한 것은 ICD 발현이 감소된 C. 글루타미쿰이다.

특히, 본 발명의 하기 실시태양을 제공한다:

(1) 상응하는 초기 미생물과 비교하여 이소시트레이트 데하이드로게나제 (ICD) 활성이 부분적으로 또는 완전하게 감소된 미생물을 사용하여 메티오닌을 생산하는 방법; 및

(2) 1단계로서 실시태양 (1)에 따른 방법에 의해 메티오닌을 생산하는 단계를 포함하는, 실시태양 (1)에 따른 방법에 의해 생산된 메티오닌으로부터 화학물질 및 화학적 최종 생성물, 예로서, 중합체를 제조하는 방법.

도 1:

정의
하기 약어, 용어, 및 정의가 본원에서 사용된다:
IDH, 이소시트레이트 데하이드로게나제; ICD, 이소시트레이트 데하이드로게나제; WT, 야생형; PPP, 펜토스 포스페이트 경로; "ICD" 및 "IDH"라는 약어는 이소시트레이트 데하이드로게나제에 대한 동의어로서 사용된다.
본 발명과 관련하여 사용되는 바, 단수형의 "하나"("a" 및 "an")는 또한 문맥상 다른 것을 명확하게 명시하지 않는 한, 각각에 대한 복수형도 포함한다. 따라서, "하나의 미생물"이라는 용어는 하나 초과의 미생물, 즉, 2, 3, 4, 5개 이상의 미생물 종류를 포함할 수 있다.
수치 또는 파라미터 범위와 관련하여 "약"이라는 용어는 당업자가 해당 특성의 기술상의 효과를 그대로 보장하는 것으로서 이해하고 있는 정확도 구간을 의미한다. 본 용어는 전형적으로 지정 수치로부터의 편차가 ±10%, 바람직하게는 ±5%인 것을 나타낸다.
달리 언급하지 않는 한, 본 발명과 관련하여 언급되는 화합물 또는 아미노산은 상이한 입체이성체의 혼합물을 포함한, 임의의 입체화학물질을 가질 수 있다. 바람직하게, 아미노산은 L-배열을 갖는다. 특히 바람직한 배열은 적절히 명시된다.
달리 언급하지 않는 한, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득되는 산은 유리 산, 상기 산의 부분적인 또는 완전한 염의 형태, 또는 상기 산 및 그의 염의 혼합물 형태일 수 있다. 반대로, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득되는 아민은 유리 아민, 상기 아민의 부분적인 또는 완전한 염의 형태, 또는 상기 아민 및 그의 염의 혼합물 형태일 수 있다.
본 발명의 목적을 위한 "숙주 세포"라는 용어는 예로서, 폴리펩티드 또는 정밀 화학물질을 생산시키기 위한 목적으로 뉴클레오티드 서열의 발현을 위해 보편적으로 사용되는 것인 임의의 단리된 세포를 지칭한다. 특히, "숙주 세포"라는 용어는 원핵 생물, 하등 진핵 생물, 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포 배양 시스템에 관한 것이다.
"미생물"이라는 용어는 원핵 생물, 하등 진핵 생물, 단리된 식물 세포, 효모 세포, 단리된 곤충 세포 또는 단리된 포유동물 세포, 특히, 세포 배양 시스템 중의 세포일 수 있다. 본 발명을 수행하는 데 적합한 미생물로는 효모, 예를 들면, S. 폼베 또는 S. 세레비시애 및 피치아 파스토리스를 포함한다. 포유동물 세포 배양 시스템은 예로서, NIH T3 세포, CHO 세포, COS 세포, 293 세포, Jurkat 세포 및 HeLa 세포를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명과 관련하여, 미생물은 원핵 생물 또는 효모 세포가 바람직하다. 본 발명과 관련하여 바람직한 미생물은 하기 "상세한 설명" 섹션에서 설명한다. 코리네박테리아가 특히 바람직하다.
"천연"이라는 것은 "야생형" 및 "천연적으로 발생"이라는 용어의 동의어이다. "야생형" 미생물은 달리 언급하지 않는 한, 일반 천연적으로 발생된 형태의 명시된 미생물이다. 일반적으로, 야생형 미생물은 비-재조합 미생물이다.
"초기"란 "출발"에 대한 동의어이다. "초기" 뉴클레오티드 서열 또는 효소 활성이 예로서, 돌연변이화 또는 저해제 첨가에 의해 이루어지는 그의 변형에 대한 출발점이 된다. 임의의 "초기" 서열, 효소 또는 미생물에는 그의 "최종" 또는 "변형된" 대조물이 소유하는 것으로서, 특정 문맥에서 명시되는 특유의 특성 (예로서, ICD 활성 감소)이 없다. 본 발명과 관련하여 "초기"라는 용어는 "천연"이라는 용어의 의미를 포함하며, 바람직한 측면에서는 "천연"이라는 용어의 동의어이다.
임의의 야생형 또는 돌연변이체 (비-재조합 또는 재조합 돌연변이체) 미생물은 비-재조합 (예로서, 특이적인 효소 저해제의 첨가) 또는 재조합 방법에 의해 추가로 변형될 수 있고, 이로써, 적어도 하나의 물리적 또는 화학적 특성, 본 발명의 하나의 특정 측면에서는 그의 ICD 활성이 초기 미생물과 상이한 미생물이 생성된다. 본 발명과 관련하여, 초기, 비-변형된 미생물은 "초기 미생물" 또는 "초기 (미생물) 균주"로서 명시된다. 소정의 ICD 발현 수준을 가진 초기 균주와 비교하여 미생물의 ICD 활성에 대한 임의의 감소는 유사한 조건하에서 두 미생물 모두의 ICD 활성을 비교함으로써 측정된다.
전형적으로, 본 발명에 따른 미생물은 유전자 변경을 보유하지 않는 초기 미생물에 유전자 변경을 도입함으로써 수득한다.
미생물 균주의 "유도체"란 예로서, 고전적 돌연변이유발법 및 선별법에 의해, 또는 지정 돌연변이유발법에 의해 그의 모체 균주로부터 유래된 균주이다. 예로서, 균주 C. 글루타미쿰 ATCC13032lysC^fbr (WO 2005/059093)는 ATCC13032로부터 유래된 리신 생산 균주이다.
본 발명의 목적을 위한 "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 서열"이라는 용어는 폴리펩티드, 예를 들면, 펩티드, 단백질 등을 코딩하는 임의의 핵산 분자에 관한 것이다. 이러한 핵산 분자는 DNA, RNA 또는 그의 유사체로 제조될 수 있다. 그러나, DNA로 제조된 핵산 분자가 바람직하다.
본 발명과 관련하여 "재조합"이란 "유전 공학에 의해 제조되거나, 그의 결과"인 것을 의미한다. 따라서, "재조합 미생물"은 적어도 하나의 "재조합 핵산" 또는 "재조합 단백질"을 포함한다. 재조합 미생물은 바람직하게 발현 벡터 또는 클로닝 벡터를 포함하거나, 숙주 세포의 내인성 게놈 중 클로닝된 핵산 서열(들)을 포함하도록 유전적으로 공학처리될 수 있다.
"이종성"이란 세포 또는 유기체와 관련된, 및 그의 기원이 되는 유기체와 상관없는, 유전공학에 의해 세포 또는 유기체에 도입된 임의의 핵산 또는 폴리펩티드/단백질을 말한다. 따라서, 비록 "동종성"이라는 용어가 때로는 당업계에서 이러한 종류의 유전적으로 공학처리된 변형에 관하여 사용되기는 하지만, 하나의 미생물로부터 단리되고, 동종의 또다른 미생물 내로 도입된 DNA가 본 발명과 관련하여 후자의 유전적으로 변형된 미생물과 관련된 이종성 DNA이다. 그러나, "이종성"이라는 용어는 바람직하게는 본 발명과 관련하여 비-동종성 핵산 또는 폴리펩티드/단백질을 지칭한다. "이종성 단백질/핵산"은 "재조합 단백질/핵산"의 동의어이다.
"발현하다," "발현하는," "발현된," 및 "발현"이라는 용어는 숙주 유기체에서의 유전자 생성물 (예로서, 경로의 유전자의 생합성 효소)의 발현을 지칭하는 것이다. 발현은 출발 유기체로서 사용되는 미생물의 유전자 변경에 의해 수행될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 미생물은 출발 미생물에 의해 생산되거나, 변경되지 않은 유사한 미생물에서 생산된 유전자 생성물과 비교하여 증가된 수준으로 유전자 생성물을 발현하도록 유전적으로 변경 (예로서, 유전적으로 공학처리)될 수 있다. 유전자 변경은 (예로서, 강한 프로모터, 유도가능한 프로모터 또는 다중 프로모터를 첨가함으로써, 또는 발현이 구성적 발현이 되도록 조절 서열을 제거함으로써) 조절 서열, 또는 특정 유전자의 발현과 관련된 부위를 변경 또는 변형시키는 것, 특정 유전자의 염색체 위치를 변형시키는 것, 특정 유전자에 인접한 핵산 서열, 예를 들면, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결인자를 변경시키는 것, 특정 유전자의 카피수를 증가시키는 것, 특정 유전자의 전사 및/또는 특정 유전자 생성물의 번역에 관여하는 단백질 (예로서, 조절 단백질, 서프레서, 인핸서, 전사 활성인자 등)을 변형시키는 것, 또는 당업계의 통상의 방법을 사용하여 특정 유전자의 발현을 하향조절하는 임의의 기타 다른 종래 수단 (예를 들면, 리프레서 단백질의 발현을 차단하기 위해 안티센스 핵산 분자를 사용하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"보존적 아미노산 치환"은 예로서, Val을 Ala로 치환하는 것과 같이, 초기 아미노산 서열 중에 있는 1개 이상의 아미노산을 화학적 특성이 유사한 아미노산으로 치환하는 것을 의미한다. 초기 폴리펩티드 서열과 비교하여 치환되는 아미노산의 비율은 초기 폴리펩티드 서열의 전체 아미노산 중 0 내지 30%인 것이 바람직하며, 0 내지 15%가 더욱 바람직하고, 0 내지 5%가 가장 바람직하다.
보존적 아미노산 치환은 하기 아미노산 군들 중 하나의 구성원들 사이에서 일어나는 것이 바람직하다:
- 산성 아미노산 (아스파르트산 및 글루탐산);
- 염기성 아미노산 (리신, 아르기닌, 히스티딘);
- 소수성 아미노산 (류신, 이소류신, 메티오닌, 발린, 알라닌);
- 친수성 아미노산 (세린, 글리신, 알라닌, 메티오닌);
- 지방족 측쇄를 가진 아미노산 (글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신);
- 지방족-하이드록실 측쇄를 가진 아미노산 (세린, 메티오닌);
- 아미드-함유 측쇄를 가진 아미노산 (아스파라긴, 글루타민);
- 방향족 측쇄를 가진 아미노산 (페닐알라닌, 티로신, 트립토판);
- 염기성 측쇄를 가진 아미노산 (리신, 아르기닌, 히스티딘);
- 황-함유 측쇄를 가진 아미노산 (시스테인, 메티오닌).
특히 바람직한 보존적 아미노산 치환은 하기와 같다:

"단리된"이라는 용어는 "그의 기원이 되는 유기체로부터 분리된 또는 정제된" 것을 의미한다. 더욱 특히, 다세포 유기체의 단리된 세포는 그의 기원이 되는 유기체로부터 분리된 또는 정제된 것이다. 이는 생화학적으로 정제되고 재조합적으로 생산된 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 아미노산의 "전구체" 또는 "생화학적 전구체"는 본 발명의 미생물에서 상기 아미노산을 형성시키는 생화학적 경로에서 본 아미노산에 선행하는 ("상류에 있는") 화합물, 특히, 상기 생화학적 경로 중 최종 몇 단계에서 형성된 화합물이다. 본 발명과 관련하여, 메티오닌의 "전구체"는 야생형 유기체의 생체내에서 아스파테이트가 메티오닌으로 생화학적 전환을 하는 동안 형성되는 임의의 중간체이다.
"탄소 수율"은 (발효에 사용되는 탄소 공급원, 보통은 당의) 소비된 탄소량당 (생성물의) 관측된 탄소량, 즉, 생성물 대 공급원의 탄소 비이다.
본 발명과 관련하여 "ICD 활성"이란 ICD의 임의의 효소 활성, 특히, ICD가 발휘하는 임의의 촉매 효과를 의미한다. 특히, "ICD 활성"이란 이소시트레이트에서 알파-케토글루타레이트로의 전환을 의미한다. ICD 활성은 효소 1 mg당 유닛으로서 (비활성) 또는 효소 분자 1개당 1분 동안에 형질전환되는 기질 분자 개수로서 표현될 수 있다.

본 발명의 상세한 설명

본 발명은 ICD 활성이 감소된 미생물에 의해서 메티오닌을 생화학적으로 합성하는 것에 관한 것이다.

ICD 활성은 세포에서 아미노산 생산에 필요한 NADPH/NADH를 일부 제공한다. 따라서, 세포의 메티오닌 생산을 증폭시키기 위하여 세포에서 ICD 활성을 감소시키는 것이 본 발명의 개념에 선행한다는 것이 분명한 것으로 보여지지는 않는다.

놀랍게도, 이에 미생물에서 ICD 활성이 감소하게 되면 메티오닌의 생산 수준이 증가하게 된다는 것을 발견하게 되었다. 메티오닌은 정밀 화학물질로서 상당한 관심의 대상이 된다.

본 발명의 바람직한 측면에서, 실시태양 (1)에 따른 생산 방법은 발효 방법이다. 그러나, 예를 들면, 식물 및 인간을 제외한 동물에서의 생체내 생산을 비롯한, 화학적 화합물을 생명공학적으로 생산하는 기타 다른 방법 또한 고려할 수 있다.

실시태양 (1)에 따른 발현에 의해 메티오닌을 생산하는 방법은 글리옥실레이트 션트를 통한 탄소 흐름이 증가할 수 있도록 ICD 활성이 감소된 적어도 하나의 - 바람직하게 재조합 - 미생물을 배양하는 것을 포함할 수 있다.

실시태양 (1)의 추가의 바람직한 측면에서, 본 생산 방법에 사용되는 미생물은 재조합 미생물이다. 예를 들면, 식물 및 인간을 제외한 동물에서의 생체내 생산을 비롯한, 화학적 화합물을 생명공학적으로 생산하는 기타 다른 방법 또한 고려할 수 있는 한, 최선의 유기체는 재조합 유기체인 것이 바람직하다.

본 발명의 임의의 실시태양에서, 본 실시태양에 사용되는 미생물에서 이소시트레이트 데하이드로게나제 활성은 부분적으로 또는 완전하게 감소하게 된다.

본 발명에 따라 ICD 활성이 감소된 미생물에서는 동종의 초기 미생물 및 유전적 배경과 비교하였을 때에 그의 천연 ICD 활성이 부분적으로 또는 완전하게 상실된 상태이다. 바람직하게, ICD의 초기 활성 중 약 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 4%, 적어도 6%, 적어도 8%, 적어도 10%, 더욱 바람직하게 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 60%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 그 모두가 상기 미생물에서는 상실되어 있다. 활성 감소 정도는 유사 조건하의 초기 미생물의 내인성 ICD 활성의 활성 수준과의 비교로 측정된다.

ICD 활성이 가능한 많이 감소되는 것이 항상 바람직한 것은 아님을 이해하여야 한다. 특정의 경우에서는 상기 언급한 수준들 중 어느 수준만큼 불완전하게 감소되는 것 뿐만 아니라, 예로서, 25%, 40%, 50% 등과 같은 중간 수준으로 불완전하게 감소되는 것이 충분하고 바람직할 수 있다.

ICD 활성이 불완전하게 감소되는 것이 바람직할 수 있는데, 이는 TCA가 유지되고, 미생물이 글루타메이트, 및 알파-케토글루타레이트로부터 합성되는 기타 다른 생체 분자를 추가로 생산할 수 있기 때문이다.

미생물이, ICD 활성이 완전하게 또는 거의 완전하게 (즉, 90% 이상) 상실되는 것을 특징으로 하는 것인 실시태양에서, 미생물용 배양 배지, 특히, 실시태양 (1)에 따른 생산에서 사용되는 배지는 ICD 활성의 억제로 인해 미생물에서 결핍 상태에 있게 되는 하나 이상의 필수 화합물을 보충적으로 제공받을 수 있다. 특히, 글루타메이트는 저렴하고, 쉽게 이용할 수 있는 화합물이기 때문에 배지에 보충할 수 있다.

하나 초과의 ICD 코딩 유전자 및/또는 하나 초과의 ICD 종류를 가지는 유기체에서 ICD 활성 감소는 상이한 종류의 ICD 모두, 여러개, 또는 오직 하나만의 활성이 감소되는 것일 수 있다. ICD가 불완전하게 상실되는 것과 관련하여 상기 명시한 이유로 인하여 모든 종류의 ICD보다 적게 특이적으로 감소되는 것이 바람직하다.

본 발명에 필수적인 ICD 활성 감소는 실시태양 (1)에 따른 방법에 사용되는 미생물의 내인성 특질, 예로서, 자발적인 돌연변이에 기인하거나, 또는 효소 활성을 부분적으로 또는 완전하게, 특히 효소 활성을 생체내에서 억제 또는 저해시키는, 당업계에 공지된 임의의 방법에 기인하는 특질일 수 있다. 효소 활성의 감소는 효소 합성 및 효소 반응의 임의 단계에서 유전자, 전사, 번역 또는 반응 수준으로 일어날 수 있다.

ICD 활성 감소는 바람직하게 유전공학의 결과이다. 숙주 세포에서 하나 이상의 내인성 ICD 유전자(들)의 발현량을 감소시킴으로써, icd 표적 유전자가 억제된 숙주 세포에서의 ICD의 양 및/또는 활성을 감소시키기 위해서는 당업계에 공지된 임의의 방법을 적용시킬 수 있다. 미생물, 예를 들면, E. 콜라이 또는 C. 글루타미쿰 또는 기타 다른 숙주 세포, 예를 들면, P. 파스토리스 및 A. 니거(A. niger) 내에서 유전자의 발현을 하향조절하기 위해서는 여러 기술, 예를 들면, 유전자 넉아웃 접근법, 안타센스 기술, RNAi 기술 등을 이용할 수 있다. 각 유전자의 초기 카피를 결실시킬 수 있고/거나, 감소된 활성, 특히 감소된 비활성을 보이는 돌연변이체 버전으로 초기 카피를 치환시킬 수 있거나, 약한 프로모터로부터 초기 카피를 발현시킬 수 있다. 또는 icd 유전자의 프로모터를 치환할 수 있거나, 무작위 또는 표적 돌연변이유발법에 의해 돌연변이를 도입할 수 있거나, icd 유전자를 파괴 또는 넉아웃시킬 수 있다. 추가로, 불안정화 요소를 mRNA로 도입할 수 있거나, 또는 유전자 변형을 도입하여 RNA의 리보솜 결합 부위(RBS)를 악화시킬 수 있다. 마지막으로, 특이적인 ICD 저해제를 반응 혼합물에 첨가할 수 있다.

실시태양 (1)의 첫번째 바람직한 측면에서, ICD 활성은 ICD 발현의 부분적인 또는 완전한 감소를 통해 감소하게 된다. "미생물에서 적어도 하나의 ICD의 발현을 감소시킨다"라는 것은 소정의 ICD 발현 수준을 가진 초기 미생물과 비교하여 미생물에서의 발현에 대한 임의의 감소를 의미하는 것이다. 이는, 물론 비교가 유사한 숙주 세포 유형, 유사한 유전자 배경 환경 등에 대하여 이루어지는 것으로 추정된다. 바람직하게, 발현 감소는 상기 열거한 바와 같이, 또는 하기에 기술하는 바와 같이 이루어진다.

본 발명의 특정 측면에서, 미생물은 ICD 발현 감소에 기인하여, 바람직하게는, 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 만큼의 감소에 기인하여 미생물의 초기 ICD 활성을 상실하게 되는 것이며, 발현 감소 정도는 초기 미생물에서의 폴리펩티드 발현 수준과의 비교로 측정할 수 있다. 발현 감소 정도는 유사 조건하에 초기 미생물에서 초기 icd 뉴클레오티드 서열로부터 발현되는 내인성 ICD의 발현 수준과의 비교로 측정된다.

하나 초과의 ICD 코딩 유전자 및/또는 하나 초과의 ICD 종류를 가지는 유기체에서 ICD 발현 감소는 하나, 수개 또는 모든 icd 유전자와 관련이 있을 수 있다. ICD가 불완전하게 상실되는 것과 관련하여 상기 명시한 이유로 인하여 모든 icd 유전자보다 적게 특이적으로 감소되는 것이 바람직하다.

하나의 바람직한 측면에서, "발현 감소"란 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 뉴클레오티드 서열을, 실질적으로는 동일한 아미노산 서열 및/또는 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 변형된 뉴클레오티드 서열로 치환시켰을 경우, 변형된 세포에서 코딩된 폴리펩티드가 감소된 양으로 발현이 되게 되는 상황을 의미하는 것이다.

하향조절 모드의 구체적인 측면은 icd 유전자의 넉아웃이다 (실시예 3과 비교). 이는 해당 미생물에 적합한 임의의 공지 넉아웃 프로토콜을 통해 달성될 수 있다. 특히 바람직한 넉아웃 방법 및 생성된 넉아웃 돌연변이체를 사용하여 메티오닌을 생산하는 방법은 실시예 2에 기술되어 있다.

icd를 넉아웃시키면 ICD 활성은 완전하게 또는 거의 완전하게 상실될 수 있다. 따라서, 결핍 증상을 막기 위해, 그리고 미생물이 살아있는 상태로 유지시키기 위해서는 글루타메이트와 같은 결핍된 ICD-의존성 생성물을 배양 배지에 보충하는 것이 넉아웃 돌연변이체에는 필수적일 수 있다.

추가의 바람직한 측면에서, "발현 감소"란 유전자 발현을 간섭하는 (적용가능할 경우, 예로서는 진핵 세포 배양물에서의) RNA 간섭 또는 안티센스 기술에 의해 발현을 하향조절하는 것을 의미한다. 이러한 기법은 icd mRNA 수준 및/또는 icd 번역율에 영향을 줄 수 있다.

추가의 다른 바람직한 측면에서, "발현 감소"란 "약한" icd 유전자, 즉, 효소 활성이 초기 ICD 활성보다 낮은 ICD를 코딩하는 유전자를 도입하는 것과 함께 조합하여, 또는 약하게 발현되는 부위에 icd 부위를 통합시켜 세포내에서 감소된 ICD 활성을 나타내도록 함으로써 icd 유전자를 결실시키거나 파괴시키는 것을 의미한다. 이는 그로부터 유전자의 전사가 덜 이루어지는 염색체 유전자좌에 icd 유전자를 통합시키거나, 또는 세포에서의 비활성이 더 낮거나, 전사가 덜 효율적으로 이루어지거나, 번역이 덜 효율적으로 이루어지거나, 안정성이 더 낮은 돌연변이체 또는 이종성 icd 유전자를 도입함으로써 수행될 수 있다. 이러한 돌연변이체 icd 유전자를 도입하는 것은 복제 플라스미드를 사용하거나, 게놈 내로 통합시킴으로써 수행될 수 있다.

추가의 다른 바람직한 측면에서, "발현 감소"란 ICD 활성 감소가 염색체에서 코딩되는 icd 유전자로부터의 전사를 저하시킴으로써, 바람직하게는, 초기 프로모터를 돌연변이화시키거나 또는 천연 ICD 프로모터를 약화된 버전의 상기 프로모터 또는 더 약한 이종성 프로모터로 치환시킴으로써 mRNA 수준을 저하시킨 결과라는 것을 의미한다. 상기 측면을 수행하는 데 있어서, 그리고 생성된 돌연변이체를 사용하여 메티오닌을 생산하는 데 있어서 특히 바람직한 방법은 실시예 4에 기술되어 있다.

추가의 다른 바람직한 측면에서, "발현 감소"란 ICD 활성 감소가, 리보솜이 번역 개시 부위에 결합하는 것을 감소시킴으로써 icd mRNA가 번역되는 것을 감소시키는 RBS 돌연변이의 결과라는 것을 의미한다. 상기 돌연변이는 간단한 뉴클레오티드 변경일 수 있고/거나, 출발 코돈과 관련하여 RBS의 이격화에 영향을 줄 수도 있다. 이러한 돌연변이를 달성하기 위해서 돌연변이화된 RBS 세트를 포함하는 돌연변이체 라이브러리를 생성할 수 있다. 예를 들면, 더 낮은 ICD 활성을 갖는 것에 대하여 선택함으로써 적합한 RBS를 선택할 수 있다. 이어서, 초기 RBS를 선택된 RBS로 치환할 수 있다. 상기 측면을 수행하는 데 있어서, 그리고 생성된 돌연변이체를 사용하여 메티오닌을 생산하는 데 있어서 특히 바람직한 방법은 실시예 4에 기술되어 있다.

추가의 다른 바람직한 측면에서, "발현 감소"는 mRNA의 안정성을 감소시켜, 예를 들면, 2차 구조를 변경시켜 mRNA 수준을 감소시킴으로써 달성될 수 있다.

추가의 다른 바람직한 측면에서, "발현 감소"는 icd 조절인자, 예로서, 전사 조절인자에 의해 달성될 수 있다.

추가의 다른 바람직한 측면에서, ICD 발현을 하향조절하는 구체적인 방법은 PCT/EP2007/061151 (이는 미생물, 특히, 코리네박테리움 및 E. 콜라이에서 ICD 활성을 하향조절하기 위한 코돈 사용 빈도 방법을 적용하는 것에 관한 것인 한, 본원에서 참고로 인용된다)에 기술된 코돈 사용 빈도 방법이다. 상기 숙주 세포에서 실질적으로는 동일한 아미노산 서열 및/또는 기능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 비-변형된 뉴클레오티드 서열 대신에 변형된 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 단계를 포함하되, 여기서, 상기 변형된 뉴클레오티드 서열은 비-변형된 뉴클레오티드 서열로부터 유래된 것으로서, 비-변형된 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 코돈이 변형된 뉴클레오티드 서열에서는 숙주 세포의 코돈 사용 빈도에 따라 덜 빈번하게 사용되는 코돈에 의해 치환된 것인, 숙주 세포에서 적어도 하나의 폴리펩티드의 양을 감소시키는 방법이 PCT/EP2007/061151에 기술되어 있다.

ICD의 양을 감소시키기 위한 것으로서 코리네박테리움 및 특히 바람직하게, C. 글루타미쿰에서 발현이 되는 변형된 뉴클레오티드 서열의 경우, 적어도 하나의, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 바람직하게 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 4%, 적어도 6%, 적어도 8%, 적어도 10%, 더욱 바람직하게 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 60%, 적어도 80%, 더욱더 바람직하게 적어도 90% 또는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 비변형된 뉴클레오티드 서열을 이루는 코돈 모두가 변형된 뉴클레오티드 서열에서는 각 아미노산에 대하여 덜 빈번하게 사용되는 코돈에 의해 치환된다. 더욱더 바람직한 실시태양에서, 상기 언급한 개수의, 치환시키고자 하는 코돈은 빈번, 매우 빈번, 극도로 빈번 또는 가장 빈번한 코돈을 언급하는 것이다. 특히 바람직한 또다른 실시태양에서, 상기 개수의 코돈이 가장 적은 빈도로 사용되는 코돈에 의해 치환된다. 이 모든 경우에 있어서, 기준 코돈 사용 빈도는 코리네박테리움 및 바람직하게 C. 글루타미쿰의 코돈 사용 빈도에 기초하게 될 것이며, 바람직하게는 코리네박테리움 및 바람직하게 C. 글루타미쿰에 풍부하게 존재하는 단백질의 코돈 사용 빈도에 기초하게 될 것이다. 상세한 설명을 위해 PCT/EP2007/061151 또한 참조할 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 측면은 PCT/EP2007/061151에 기술된 바와 같이 코돈 사용 빈도를 적합화시켜 미생물에서 이소시트레이트 데하이드로게나제의 발현을 감소시키는 것인 방법에 관한 것이다. 미생물은 코리네박테리움일 수 있고, C. 글루타미쿰이 바람직하다. 이러한 방법을 사용하여 메티오닌의 합성을 개선시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 바람직한 측면에서 PCT/EP2007/061151에 기술된 코돈 사용 빈도 방법을 적용시킴으로써 ICD 활성이 감소된 미생물이 실시태양 (1)에 따른 방법을 수행하는 데 있어 최선의 미생물이다. PCT/EP2007/061151은 특히, 하나의 실시태양으로는 출발 코돈을 GTG로 치환시킴으로써, 및 천연 ICD의 32번 및 33번 위치에서 GGC ATT에서 GGG ATA로 글리신 및 이소류신 코돈을 교체함으로써 C. 글루타미쿰 세포에서 이루어지는 ICD 감소를 기술하고 있다 (실시예 1과 비교). 실시태양 (1)의 생산 방법의 하나의 측면에서 PCT/EP2007/061151의 이러한 두 실시태양이 최선의 미생물이고, 따라서, 본 발명의 실시태양 (1)에 따른 방법에서의 그의 용도가 구체적으로 참고로 인용된다. 상기 미생물의 제조 및 용도는 실시예 1에서 입증된다.

한편, 본 발명의 특히 바람직한 다른 측면에서, PCT/EP2007/061151에 기술된 코돈 사용 빈도 방법을 적용시킴으로써 ICD 활성이 감소된 미생물을 실시태양 (1)에 따른 방법에 있어서의 최선의 미생물로부터 제외시킨다. 상기 측면에서 따라, 실시태양 (1)의 방법은 ICD 발현 감소가 미생물의 천연 icd 서열 대신에 변형된 ICD를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (icd 서열)의 발현으로 인한 것이 아닌 것을 조건으로 하되, 여기서, 상기 변형된 icd 코딩 서열은 비-변형된 icd 서열로부터 유래된 것으로서, 비-변형된 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 코돈이 변형된 icd 서열에서는 숙주 세포의 코돈 사용 빈도에 따라 덜 빈번하게 사용되는 코돈에 의해 치환된 것인, 본 발명의 실시태양이다. 다시 말해, 실시태양 (1)의 방법은 ICD 발현 감소가 PCT/EP2007/061151에 기술된 변형된 코돈 사용 빈도에 기인하는 것이 아니며, PCT/EP2007/061151에 기술된 어떤 미생물도 사용되지 않는다는 것을 조건으로 하는 본 발명의 실시태양이다. 더욱 바람직하게, 실시태양 (1)의 방법은 메티오닌이 생산될 때 ICD 발현 감소는 미생물의 천연 icd 서열 대신에 변형된 ICD를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (icd 서열)의 발현으로 인한 것이 아닌 것을 조건으로 하되, 여기서, 상기 변형된 icd 코딩 서열은 비-변형된 icd 서열로부터 유래된 것으로서, 비-변형된 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 코돈이 변형된 icd 서열에서는 미생물의 코돈 사용 빈도에 따라 덜 빈번하게 사용되는 코돈에 의해 치환된 것인, 본 발명의 실시태양이다.

실시태양 (1)의 두번째 바람직한 측면에서, ICD 활성은 효소의 부분적인 또는 완전한 저해를 통해 감소된다. 저해는 임의의 공지된 가역성 또는 비가역성 ICD 저해제가 ICD 저해제에 결합하여 이루어진 결과일 수 있다. 상기와 같은 저해제가 당업계에 공지되어 있으며, 그 예로는 옥살로아세테이트, 2-옥소글루타레이트 및 시트레이트 (이들은 C. 글루타미쿰에서의 ICD의 약한 저해제로서 알려져 있음), 또는 옥살로아세테이트 및 글리옥실레이트 (이들은 강한 저해제로서 알려져 있음)가 있다 (문헌 [Eikmanns et al (1995) loc. cit.]). 상기 저해제는 발효 배지에 첨가될 수 있거나, 또는 세포 내에서 이루어지는 그의 합성이 외부 자극에 의해서 유도될 수 있다.

실시태양 (1) 및 (2)의 수개의 바람직한 측면에서, ICD 활성 감소는 숙주 세포 (바람직하게, 미생물, 특히, 코리네박테리움)를 유전공학적으로 처리한 결과이지, ICD 발현 감소의 결과가 아니다.

특히, 세번째 바람직한 측면에서, icd 유전자의 초기 카피를 결실시키고, 상기 카피를, ICD 활성이 감소된 ICD를 코딩하는 돌연변이체 버전 또는 초기 ICD보다 ICD 활성이 작은 ICD를 코딩하는 이종성 icd 유전자로 치환하면 본 발명의 미생물의 ICD 활성은 감소하게 된다. 상기 측면을 수행하는 데 있어서, 그리고 생성된 돌연변이체를 사용하여 메티오닌을 생산하는 데 있어서 특히 바람직한 방법은 실시예 3에 기술되어 있다.

네번째 바람직한 측면에서, ICD 활성을 감소시키는 상기 언급한 특징들 중 2가지 이상을 조합하는 것이 본 발명에 따른 미생물에서 실현될 수 있다.

본 발명의 실시태양 (1)에 따른 바람직한 방법은 미생물, 바람직하게, 코리네박테리아 및 더욱 바람직하게, C. 글루타미쿰에서 ICD 활성을 감소시키는 단계 (여기서, 상기 원리가 사용된다)를 포함한다.

ICD 활성이 감소된 미생물에서 메티오닌의 생합성이 증가한 것은 ICD 저해의 결과로서 PPP 및 글리옥실레이트 션트를 통한 탄소 흐름이 증가하였기 때문일 수 있다. 전자는 아미노산 생산을 위한 환원 등가물, 즉, NAD(P)H를 충분히 제공하고, 후자는 메티오닌 생합성을 위해 필요한 탄소 전구체를 제공한다. 따라서, 본 발명의 하나의 바람직한 측면에서, 실시태양 (1)에서 사용되는 미생물 및 실시태양 (2)에 따른 미생물에서의

(i) 글리옥실레이트 션트 및/또는

(ii) 펜토스 포스페이트 경로 (PPP)를 통한 탄소 흐름은 야생형 미생물과 비교하여 증가하게 된다. 바람직하게, 글리옥실레이트 션트를 통한 탄소 흐름은 증가하게 된다. 상기와 같은 증가는 어느 것이든 ICD 활성 감소의 결과, 미생물을 유전공학적으로 처리한 결과, 미생물의 천연의 특질, 또는 이러한 인자들 중 임의의 것의 조합일 수 있다. 글리옥실레이트 션트를 통한 탄소 흐름의 증가는 바람직하게 ICD 활성 감소의 결과, 미생물을 유전공학적으로 처리한 결과이다. PPP를 통한 탄소 흐름의 증가는 바람직하게 미생물을 유전공학적으로 처리한 결과, 더욱 바람직하게는 예로서, Psod와 같은 강한 프로모터를 사용한, PPP 효소 발현 수준의 활성 상향조절의 결과이다 (WO 2005/059144).

상기 명시한 바와 같이, 본 발명은 미생물, 및 메티오닌 생산에서의 미생물의 용도에 관한 것이다. 그러나, 실시태양 (1)에 따른 생산 방법에서 미생물 이외의 기타 다른 유기체의 용도 또한 주시한다. 본 발명의 목적을 위한 "유기체"라는 용어는 정밀 화학물질을 생산하기 위하여 뉴클레오티드 서열을 발현시키는데 통상 사용되는 임의의, 인간을 제외한 유기체, 특히, 상기 정의된 바와 같은 미생물, 조류 및 이끼를 비롯한 식물, 효모, 및 인간을 제외한 동물을 지칭한다. 정밀 화학물질을 생산하는 데 특히 적합한, 미생물 이외의 유기체로는 식물 및 식물 부분이다. 그러한 식물은 단자엽 또는 쌍자엽, 예를 들면, 단자엽 또는 쌍자엽 작물 식물, 식용 식물 또는 마초 식물일 수 있다. 단자엽 식물의 예로는 아베나(avena) (귀리), 트리티쿰(Triticum) (밀), 세칼레(secale) (호밀), 호르데움(hordeum) (보리), 오리자(oryza) (벼), 파니쿰(panicum), 페니세툼(pennisetum), 세타리아(setaria), 소르굼(sorghum) (기장), 제아(zea) (옥수수) 속에 속하는 식물 등이다.

쌍자엽 작물 식물로는 특히 목화, 레구미노우스(leguminose), 예로서, 콩, 및 특히, 알파파, 대두, 평지씨, 토마토, 사탕무, 감자, 관상용 식물 뿐만 아니라, 수목도 포함한다. 추가의 작물 식물로는 과실 (특히, 사과, 배, 체리, 포도, 감귤, 파인애플 및 바나나), 기름 야자, 차나무(tea bush), 차나무 및 커피 나무, 담배, 사이잘초 뿐만 아니라, 관련된 약초 식물, 인도사목 및 디기탈리스(digitalis)를 포함할 수 있다. 곡물인 밀, 호밀, 귀리, 보리, 벼, 옥수수 및 기장, 사탕무, 평지씨, 콩, 토마토, 감자, 및 담배가 특히 바람직하다. 추가의 작물 식물에 대해서는 US 6,137,030으로부터 수득할 수 있다.

다른 유기체 및 세포, 예를 들면, 미생물, 식물 및 식물 세포, 동물 및 동물 세포 등의 세포 중 icd 유전자 및 ICD 단백질의 개수와 종류와 관련하여 이들은 상이할 수 있다는 것을 당업자는 잘 알고 있을 것이다. 동일의 유기체인 경우에도, 다른 균주는 단백질 수준에 있어서 다소 이종성인 발현 프로파일을 나타낼 수 있다.

미생물과 다른 유기체가 본 발명의 수행에 사용되는 경우, 비-발효적 생산 방법이 적용될 수 있다.

실시태양 (1) 및 (2)에 따른 본 발명에서, 상기 정의된 임의의 미생물이 사용될 수 있다. 미생물이 원핵 생물인 것이 바람직하다. 코리네박테리움 및 브레비박테리움(Brevibacterium), 바람직하게, 코리네박테리움 속 (특히 코리네박테리움 글루타미쿰에 관심이 집중된다), 에스케리키아(Escherichia) 속 (특히 에스케리키아 콜라이에 관심이 집중된다), 바실러스(Bacillus) 속 (특히 바실러스 섭틸러스에 관심이 집중된다), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 및 아스퍼질러스(Aspergillus)로부터 선택되는 미생물이 본 발명의 수행에 특히 바람직하다.

본 발명의 바람직한 실시태양은 코리네형 세균, 예를 들면, 코리네박테리움 속의 세균으로부터 선택되는 미생물의 용도에 관한 것이다. 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum), 코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola) 및 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens)와 같은 종이 특히 바람직하다. 본 발명의 기타 다른 바람직한 실시태양은 브레비박테리아, 및 특히, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum), 및 브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divarecatum)과 같은 종의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, C. 아세토글루타미쿰(C. acetoglutamicum) ATCC15806, C. 아세토아시도필룸(C. acetoacidophilum) ATCC13870, 코리네박테리움 써모아미노게네스 FERMBP-1539, 코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC17965, 코리네박테리움 에피시엔스 DSM 44547, 코리네박테리움 에피시엔스 DSM 44549, 브레비박테리움 플라붐 ATCC14067, 브레비박테리움 락토퍼멘툼 ATCC13869, 브레비박테리움 디바리카툼 ATCC14020, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10065 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21608, 뿐만 아니라, 예로서, 고전적 돌연변이유발법 및 선별법에 의해, 또는 지정 돌연변이유발법에 의해 그로부터 유래된 균주로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

C. 글루타미쿰의 기타 바람직한 균주는 ATCC13058, ATCC13059, ATCC13060, ATCC21492, ATCC21513, ATCC21526, ATCC21543, ATCC13287, ATCC21851, ATCC21253, ATCC21514, ATCC21516, ATCC21299, ATCC21300, ATCC39684, ATCC21488, ATCC21649, ATCC21650, ATCC19223, ATCC13869, ATCC21157, ATCC21158, ATCC21159, ATCC21355, ATCC31808, ATCC21674, ATCC21562, ATCC21563, ATCC21564, ATCC21565, ATCC21566, ATCC21567, ATCC21568, ATCC21569, ATCC21570, ATCC21571, ATCC21572, ATCC21573, ATCC21579, ATCC19049, ATCC19050, ATCC19051, ATCC19052, ATCC19053, ATCC19054, ATCC19055, ATCC19056, ATCC19057, ATCC19058, ATCC19059, ATCC19060, ATCC19185, ATCC13286, ATCC21515, ATCC21527, ATCC21544, ATCC21492, NRRL B8183, NRRL W8182, B12NRRLB12416, NRRLB12417, NRRLB12418 및 NRRLB11476으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

약어 KFCC는 한국 종균 협회(Korean Federation of Culture Collection)를 의미하고, ATCC는 미국 종균 협회(American Type Strain Culture Collection)를 의미하고, 약어 DSM은 독일 생물 자원 은행(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen)를 의미한다. 약어 NRRL은 미국 일리노이주 페오리아 소재의 미 북부지역 연구 실험국(Northern Regional Research Laboratory) ARS 종균 협회(ARS cultures collection)를 의미한다.

정밀 화학물질, 예를 들면, L-리신, L-메티오닌, L-이소류신 및/또는 L-메티오닌을 생산할 수 있는 능력을 이미 갖춘 코리네박테리움 글루타미쿰 균주가 본 발명을 수행하는 데 특히 바람직하다. 그러한 균주의 예로는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 및 그의 유도체가 있다. 리신을 생산하는 것으로 알려져 있는 균주 ATCC13286, ATCC13287, ATCC21086, ATCC21127, ATCC21128, ATCC21129, ATCC21253, ATCC21299, ATCC21300, ATCC21474, ATCC21475, ATCC21488, ATCC21492, ATCC21513, ATCC21514, ATCC21515, ATCC21516, ATCC21517, ATCC21518, ATCC21528, ATCC21543, ATCC21544, ATCC21649, ATCC21650, ATCC21792, ATCC21793, ATCC21798, ATCC21799, ATCC21800, ATCC21801, ATCC700239, ATCC21529, ATCC21527, ATCC31269 및 ATCC21526 또한 바람직하게 사용될 수 있다. 특히 바람직한 것은 정밀 화학물질, 예를 들면, L-리신, L-메티오닌 및/또는 L-메티오닌을 생산할 수 있는 능력을 이미 갖춘 코리네박테리움 글루타미쿰 균주이다. 따라서, 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 및 상기 균주의 유도체가 특히 바람직하다. 이와 같이 바람직한 것으로는 균주 ATCC13032lysC^fbr, 및 ATCC13286을 포함한다. 본 발명과 관련하여 C. 글루타미쿰 ATCC13032lysC^fbr, ATCC13032 또는 ATCC13286이 특히 바람직한 미생물이다.

본 발명에 적합한 것이 되기 위해서는 상기 열거된 미생물 모두가 부분적으로 또는 완전하게 감소된 ICD 활성을 보여야 한다는 것을 이해할 것이다. 본 발명과 관련하여 바람직한 미생물은 유전공학의 결과로서 ICD 활성이 감소된 것인 재조합 미생물이다.

본 발명의 실시태양 (1)은 메티오닌, 특히, L-메티오닌을 생산하기 위해 ICD 활성이 감소된 상기 언급한 미생물을 사용하는 그의 용도에 관한 것이다.

메티오닌은 제약 산업의 다른 부분, 농업 산업 뿐만 아니라, 화장품, 식품 및 사료 산업에서도 사용될 수 있다.

실시태양 (1)에 따른 방법의 경우, 감소된 ICD 활성을 가질 뿐만 아니라, 메티오닌 생산에 대하여 특이적으로 적합화된 미생물이 사용될 수 있다. 이러한 적합화는 원치않는 부산물/부생성물 합성의 원인이 되는 것으로 알려져 있는 효소 활성의 억제 또는 감소에 기인하는 것일 수 있다. 생합성 경로의 일부를 형성하는 효소의 양 또는 활성을 저하시키면 예로서, 부산물 생산을 차단시킴으로써, 및 대사 흐름을 메티오닌 생합성 경로로 전함으로써 메티오닌의 합성이 증가하게 될 수 있다. 한편, 이러한 적합화는 메티오닌 생합성에서 효소 활성의 증가에 기인하는 것일 수 있다. 미생물의 상기와 같은 적합화는, 메티오닌에까지 이르게 되는 전환 단계 중 하나 또는 하나 초과의 단계를 촉매화시키는 효소, 특히, 아스파테이트의 하류에 있는 전환 단계를 촉매화시키는 효소, 더욱 특히, 아스파테이트를 메티오닌으로 전환시키는 전환 단계를 촉매화시키는 효소의 활성 및/또는 발현 증가를 포함하는 것이 바람직하다. 상기와 같은 적합화는 미생물 중에 메티오닌 생산을 증진시키는 적어도 하나의 이종성 효소가 존재하도록 유전공학에 기인하여 이루어진 적합화가 추가로 바람직하다.

본 발명의 방법 (1)의 바람직한 실시태양에서, 미생물의 내인성 생합성 경로에서 ICD 활성 이외에도 하나 또는 하나 초과의 추가적인 효소 활성이 변형될 수 있고, 이를 통해 표적 화합물인 메티오닌에 대한 탄소 수율은 증가하게 된다. 바람직하게, 아스파테이트에서 리신, 메티오닌 또는 이소류신으로의 생화학적 형질전환을 촉매화시키는 효소들 중 하나 또는 하나 초과의 효소는 상향- 또는 하향조절된다.

바람직하게, 코리네박테리움 효소, 및 특히 C. 글루타미쿰 효소의 활성은 상향- 또는 하향조절된다.

바람직하게, 상기와 같은 변형은 상기 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 변형에 의해 이루어질 수 있다.

바람직하게 하향조절된, 변형된 효소 및/또는 뉴클레오티드 서열은 호모세린-키나제, 메티오닌-데하이드라타제, 메티오닌-신타제, 메조-디아미노피멜레이트 D-데하이드로게나제, 포스포에놀피루베이트-카르복시키나제, 피루베이트-옥시다제, 디하이드로디피콜리네이트-신타제, 디하이드로디피콜리네이트-리덕타제, 및 디아미노피콜리네이트-데카르복실라제를 코딩하는 서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 상기 효소는 하향조절된다. 이들 중 하기 효소가 하향조절되는 것이 바람직하다: 호모세린-키나제, 포스포에놀피루베이트-카르복시키나제 및 디하이드로디피콜리네이트-신타제.

상향조절되는 것이 바람직한 유전자 생성물은 하기 군으로부터 선택된다: 시스타티오닌 신타제, 시스타티오닌 리아제, 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제, O-아세틸호모세린-설프하이드릴라제, 호모세린-데하이드로게나제, 아스파테이트-키나제, 아스파테이트-세미알데히드-데하이드로게나제, 글리세린알데히드-3-포스페이트-데하이드로게나제, 3-포스포글리세레이트-키나제, 피루베이트-카르복실라제, 트리오스포스페이트-이소머라제, 트랜스알돌라제, 트랜스케톨라제, 글루코스-6-포스페이트-데하이드로게나제, 비오틴-리가제, 단백질 OpcA, 1-포스포프럭토-키나제, 6-포스포프럭토-키나제, 프럭토스-1,6-비스포스파타제, 6-포스포글루코네이트-데하이드로게나제, 호모세린-데하이드로게나제, 포스포글리세레이트-뮤타제, 피루베이트-키나제, 아스파테이트-트랜스아미나제, 조효소 B12-의존성 메티오닌-신타제, 조효소 B12-비의존성 메티오닌-신타제 및 말레이트-효소.

실시태양 (1)은 추가로 표적 화합물인 메티오닌을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. "회수하는"이라는 용어는 배양 배지로부터 상기 화합물을 추출, 수거, 단리 또는 정제시키는 것을 포함한다. 상기 화합물을 회수하는 것은 통상적인 수지 (예로서, 음이온 또는 양이온 교환 수지, 비이온성 흡착 수지 등)로의 처리, 통상적인 흡착제 (예로서, 활성탄, 규산, 실리카겔, 셀룰로스, 알루미나 등)로의 처리, pH 변경, (예로서, 통상적인 용매, 예를 들면, 알코올, 에틸 아세테이트, 헥산 등을 사용한) 용매 추출, 증류, 투석, 여과, 농축, 결정화, 재결정화, pH 조정, 동결건조 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 통상적인 단리 또는 정제 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 표적 화합물은 먼저 미생물을 제거함으로써 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 이어서, 남아있는 브로쓰를 양이온 교환 수지를 통해, 또는 그 위에 통과시켜 원치않는 양이온을 제거한 후, 음이온 교환 수지를 통해, 또는 그 위에 통과시켜 원치않는 무기 음이온과 유기산을 제거한다.

실시태양 (2)에서, 본 발명은 실시태양 (1)에 따른 방법에 의해 제조된 메티오닌으로부터 추가의 생성물을 생산하는 방법을 제공한다. 당업자는 예로서, 특정 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 또는 내인성 뉴클레오티드 서열을 변형된 뉴클레오티드 서열로 치환시키는 방법에 대해 알고 있다. 이러한 방법은 예를 들면, 전기천공, 화학적 형질전환, 접합 또는 기타 다른 적합한 형질전환 방법에 의해 이루어지는 적합한 작제물 (복제 기점을 포함하지 않는 플라스미드, 복제 기점을 포함하지 않는 선형 DNA 단편)의 도입에 의해 달성될 수 있다. 이어서, 예로는, 내인성의 천연적으로 발생된 서열 대신 변형된 뉴클레오티드 서열을 보유하는 세포만이 확실하게 동정될 수 있도록 하는 선별가능한 마커를 사용하는 동종성 재조합이 이루어진다. 기타 다른 방법으로는 내인성 염색체 유전자좌의 유전자 파괴, 및 예로서, 플라스미드로부터의 변형된 서열의 발현을 포함한다. 추가의 기타 다른 방법으로는 예로서, 전위를 포함한다. 사용될 수 있는 벡터 및 숙주 세포에 관한 추가 정보는 하기에서 제공할 것이다.

일반적으로, 당업자는 작제물, 예를 들면, 미생물, 예를 들면, E. 콜라이 및 C. 글루타미쿰에서 폴리펩티드의 발현을 유도하는 벡터를 디자인하는 것을 잘 알고 있다. 당업자는 또한 미생물, 예를 들면, C. 글루타미쿰 및 E. 콜라이의 배양 조건 뿐만 아니라, 상기 언급한 미생물로부터 메티오닌을 수거하고 정제하는 방법에 대해서도 잘 알고 있다. 이러한 측면 중 일부가 하기에서 추가로 상세히 설명될 것이다.

당업자는 또한 원래의 비-변형된 뉴클레오티드 서열을, 동일한 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하되, 핵산 서열은 상이한 변형된 뉴클레오티드 서열로 치환할 수 있는 기법에 대해서도 잘 알고 있다. 이러한 기법은 예로서, 중합효소 연쇄 반응 기반 돌연변이유발 기법에 의해, 보편적으로 알려져 있는 클로닝 방법에 의해, 화학적 합성법 등에 의해 달성될 수 있다. 재조합 DNA 기술 및 분자 생물학의 표준 기법은 예로서, [Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, or Ausubel et al. (eds) Current protocols in molecular biology. (John Wiley & Sons, Inc. 2007)], [Ausubel et al., Current Protocols in Protein Science, (John Wiley & Sons, Inc. 2002)], [Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition (John Wiley & Sons, Inc. 1995)]와 같은 다양한 공개문헌에 기재되어 있다. 구체적으로 C. 글루타미쿰에 대한 방법은 문헌 [Eggeling and Bott (eds) Handbook of Corynebacterium (Taylor and Francis Group, 2005)]에 기재되어 있다. 이러한 방법 중 일부는 하기 "실시예" 섹션에서 설명된다.

하기에서는 미생물, 예를 들면, E. 콜라이 및 특히 코리네박테리움 글루타미쿰에서 유전자 조작을 수행하는 방법을 상세하게 설명하고 기술할 것이다.

벡터 및 숙주 세포

본원에서 사용되는 바, "벡터"라는 용어는 그에 연결된 또다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다.

벡터 중 한 가지 유형은 "플라스미드"인데, 이는 추가의 DNA 절편이 결찰될 수 있는 환상의 더블 스트랜드 DNA 루프를 지칭한다. 또다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있는 바이러스 벡터이다.

특정 벡터는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자가 복제 가능하다 (예를 들어, 세균 복제 기점을 갖는 세균 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터). 기타 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피좀 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입될 때 숙주 세포의 게놈 내로 통합되고, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 그에 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다.

이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.

일반적으로, 재조합 DNA 기법에 유용한 발현 벡터는 대개 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는, 플라스미드가 가장 흔하게 사용되는 벡터 형태이기 때문에, 이들은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 등가의 기능을 수행하는 기타 다른 형태의 발현 벡터, 예를 들면, 바이러스 벡터 (예를 들면, 복제 결손 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함시키고자 한다.

본 발명의 재조합 미생물을 제조하는 데 적합한 재조합 발현 벡터는 상기 정의한 바와 같은 이종성 핵산을 숙주 세포에서 각각의 핵산 발현에 적합한 형태로 포함할 수 있으며, 이는 재조합 발현 벡터가 발현에 사용될 숙주 세포에 기초하여 선택되어 발현될 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 서열을 포함함을 의미한다.

재조합 발현 벡터 내에서, "작동가능하게 연결된"이란 관심의 대상이 되는 핵산 서열이 (예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템내 또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입된 경우 숙주 세포 내에서) 발현가능하도록 하는 방식으로 조절 서열(들)에 연결된 것을 의미한다. "조절 서열"이란 용어 프로모터, 리프레서 결합 부위, 활성인자 결합 부위, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소 (예를 들어, 종결인자, 폴리아데닐화 신호 또는 mRNA 2차 구조의 기타 다른 요소)를 포함하는 것으로 한다. 이러한 조절 서열은, 예를 들면, 문헌 [Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기재되어 있다. 조절 서열로는 많은 유형의 숙주 세포 내에서 뉴클레오티드 서열이 구성적으로 발현되도록 지시하는 서열 및 특정 숙주 세포 내에서만 뉴클레오티드 서열이 발현되도록 지시하는 서열을 포함한다. 바람직한 조절 서열은, 예를 들면, 프로모터, 예로서, cos-, tac-, trp-, tet-, trp-, tet-, lpp-, lac-, lpp- lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, arny, SP02, e-Pp- ore PL, SOD, EFTu, EFTs, GroEL, MetZ (C. 글루타미쿰으로부터의 마지막 5개)가 있으며, 이는 바람직하게 세균에서 사용된다. 추가의 조절 서열로는 예를 들면, 효모 및 진균으로부터 유래된 프로모터, 예를 들면, ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, 식물로부터 유래된 프로모터, 예를 들면, CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos 또는 유비퀴틴- 또는 파세올린-프로모터가 있다. 또한 인공 프로모터도 사용할 수 있다. 당업계의 숙련인은 발현 벡터를 디자인하는 것은 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 발현 벡터는 숙주 세포에 도입됨으로써 융합 단백질 또는 펩티드를 비롯한, 단백질 또는 펩티드를 생산할 수 있다.

숙주 세포, 바람직하게, 코리네박테리움 및 특히 바람직하게, C. 글루타미쿰에서 변형된 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 데 적합한 임의의 벡터가 이들 숙주 세포에서의 ICD 양을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 상기와 같은 벡터는 코리네형 세균에서 자가 복제가능한 플라스미드 벡터일 수 있다. 예로는 pZ1 (문헌 [Menkel et al. (1989), Applied and Environmental Microbiology 64: 549-554]), pEKEx1 (문헌 [Eikmanns et al.(1991), Gene 102: 93-98]), pHS2-1 (문헌 [Sonnen et al. (1991), Gene 107: 69-74])이 있다. 이러한 벡터는 잠적 플라스미드 pHM1519, pBL1 또는 pGA1에 기초한다. 기타 다른 적합한 벡터는 pCLiK5MCS (WO 2005059093), 또는 pCG4 (US-A 4,489,160) 또는 pNG2 (문헌 [Serwold-Davis et al. (1990), FEMS Microbiology Letters 66, 119-124]) 또는 pAG1 (US-A 5,158,891)에 기초한 벡터이다. 기타 다른 적합한 벡터에 대한 예는 문헌 [Handbook of Corynebacterium, Chapter 23 (edited by Eggeling and Bott, ISBN 0-8493-1821-1, 2005)]에서 살펴볼 수 있다.

원핵 생물 세포 또는 진핵 생물 세포에서 특정의 뉴클레오티드 서열을 발현시키기 위해 재조합 발현 벡터를 디자인할 수 있다. 예를 들면, 뉴클레오티드 서열은 세균 세포, 예를 들면, C. 글루타미쿰 및 E. 콜라이, 곤충 세포 (바큘로바이러스 발현 벡터 사용), 효모 및 기타 다른 진균 세포 (문헌 ([Romanos, M. A. et al. (1992), Yeast 8: 423-488]; [van den Hondel, C. A. M.J. J. et al.(1991) in: More Gene Manipulations in Fungi, J. W.Bennet & L. L. Lasure, eds.,p. 396-428: Academic Press: San Diego]; 및 [van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J.(1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J. F. et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge]) 참조), 조류 및 다세포 식물 세포 (문헌 [Schmidt, R. and Willmitzer, L. (1988) Plant Cell Rep:. 583-586] 참조)에서 발현될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 문헌 [Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에서 추가로 논의된 바 있다. 별법으로, 재조합 발현 벡터는 예를 들면, T7 프로모터 조절 서열 및 T7 폴리머라제의 사용으로 시험관내에서 전사되고 번역될 수 있다.

원핵 생물에서의 단백질 발현은 융합 또는 비-융합 단백질의 발현을 지시하는 구성적 또는 유도가능한 프로모터 함유 벡터로 수행하는 것이 가장 빈번하게 이루어진다.

융합 벡터는 그 안의 코딩되는 단백질에, 일반적으로는 재조합 단백질의 아미노 말단 뿐만 아니라, C-말단에 다수의 아미노산을 부가하거나, 상기 단백질의 적합한 영역 내에서 상기 아미노산을 융합시킨다. 이러한 융합 벡터는 전형적으로 다음의 4가지 목적을 위한 것이다: 1) 재조합 단백질의 발현 증가, 2) 재조합 단백질의 가용성 증가, 및 3) 친화성 정제시에 리간드로서 작용하여 재조합 단백질의 정제 보조, 4) 추후의 단백질 검출을 위한 "태그" 제공. 종종, 융합 발현 벡터 내에서는 융합 부분과 재조합 단백질의 접합부에 단백질 분해 절단 부위가 도입되어 있어서 융합 단백질을 정제한 후 융합 부분으로부터 재조합 단백질을 분리해낼 수 있다. 이러한 효소 및 그의 동족 인식 서열로는 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나제를 포함한다.

전형적인 융합 발현 벡터로는 pGEX (파마시아 바이오테크 인크 (Pharmacia Biotech Inc) (문헌 [Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40]), pMAL (매사추세츠주 비버리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)) 및 pRIT5 (뉴저지주 피스카타웨이 소재의 파마시아 (Pharmacia)) 등을 포함하며, 이들은 각각 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), 말토스 E 결합 단백질 또는 단백질 A를 융합시킨다 .

적합한 유도가능한 비-융합 E. 콜라이 발현 벡터의 예로는 pTrc (문헌 [Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315]), pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, egt11, pBdCl, 및 pET 11d (문헌 [Studier etal., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89]; 및 [Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York IBSN 0 444 904018]))를 포함한다. pTrc 벡터로부터의 표적 유전자 발현은 하이브리드 trp-lac 융합 프로모터로부터의 숙주 RNA 폴리머라제 전사에 의존한다. pET 11d 벡터로부터의 표적 유전자 발현은 공발현된 바이러스 RNA 폴리머라제 (T7gnl)에 의해 매개되는 T7 gnlO-lac 융합 프로모터로부터의 전사에 의존한다. 이러한 바이러스 폴리머라제는 lacUV 5 프로모터의 전사 제어하에 T7gnl 유전자를 보유하는 상주 X 프로파지로부터 숙주 균주 BL21 (DE3) 또는 HMS 174 (DE3)에 의해 공급받게 된다. 기타 다른 각종 세균의 형질전환을 위해 적절한 벡터를 선택할 수 있다. 예를 들면, 플라스미드 pIJ101, pIJ364, pIJ702 및 pIJ361은 스트렙토마이세스의 형질전환에 유용한 것으로 알려져 있는 반면, 플라스미드 pUB110, pC194 또는 pBD214는 바실러스 종의 형질전환에 적합하다. 유전 정보를 코리네박테리움으로 전달하는데 사용되는 수개의 플라스미드로는 pHM1519, pBL1, pSA77 또는 pAJ667 (문헌 [Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York IBSN 0 444 904018])을 포함한다.

적합한 C. 글루타미쿰 및 E. 콜라이 셔틀 벡터의 예로는 예로서, pClik5aMCS (WO 2005/059093; 또는 문헌 [Eikmanns et al {Gene. (1991) 102, 93-8]에서도 살펴볼 수 있다)가 있다.

코리네박테리아를 조작하는 데 적합한 벡터에 대한 예는 문헌 [Handbook of Corynebacterium (edited by Eggeling and Bott, ISBN 0-8493-1821-1, 2005)]에서 살펴볼 수 있다. E. 콜라이 - C. 글루타미쿰 셔틀 벡터 목록 (표 23.1), E. 콜라이 - C. 글루타미쿰 셔틀 발현 벡터 목록 (표 23.2), DNA를 C. 글루타미쿰 염색체로 통합시키는 데 사용될 수 있는 벡터 목록 (표 23.3), C. 글루타미쿰 염색체로 통합시키는 데 사용될 수 있는 벡터 목록 (표 23.4.) 뿐만 아니라, C. 글루타미쿰 염색체 내로 부위-특이적으로 통합시키는 데 사용될 수 있는 벡터 목록 (표 23.6)을 살펴볼 수 있다.

또다른 실시태양에서, 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 S. 세레비시애에서의 발현을 위한 벡터의 예로는 pYepSec1 (문헌 [Baldari, et al., (1987) Embo J. 6: 229-234]), 2i, pAG-1, Yep6, Yep13, PEMBLYe23, pMFa (문헌 [Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943]), pJRY88 (문헌 [Schultz et al., (1987) Gene 54: 113-123]), 및 pYES2 (캘리포니아주 샌디에고 소재의 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation))를 포함한다. 예를 들면, 사상균과 같은 기타 다른 진균에서 사용하기에 적절한 벡터 및 그러한 벡터 작제 방법은 문헌 ([van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt,P. J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge], 및 [Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York (IBSN 0 444 904018)])에 상세히 설명되어 있는 것을 포함한다.

본 발명의 목적을 위해, 작동가능한 연결이란 코딩 서열을 발현할 때에 각각의 조절 요소가 그의 결정에 따라서 그의 기능을 이행할 수 있도록 하는 방식으로 프로모터 (리보솜 결합 부위 (RBS) 포함), 코딩 서열, 종결인자, 및 임의로는 추가의 조절 요소가 순차적으로 배열되어 있는 것으로 이해되어야 한다.

또다른 실시태양에서, 이종성 뉴클레오티드 서열은 단세포 식물 세포 (예를 들면, 조류) 또는 고등 식물로부터의 식물 세포 (예를 들면, 종자 식물, 예를 들면, 작물 식물)에서 발현될 수 있다. 식물 발현 벡터의 예로는 문헌 [Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) Plant Mol . Biol. 20: 1195-1197]; 및 [Bevan, M. W. (1984) Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721])에 상세히 설명되어 있는 것을 포함하고, pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004, 및 pDH51을 포함한다 (문헌 [Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: New York IBSN 0 444 904018]).

원핵 생물 세포 및 진핵 생물 세포, 둘 모두에 대하여 적합한 기타 다른 발현 시스템에 대해서는 문헌 [chapters 16 and 17 of Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003]을 참조한다.

또다른 실시태양에서, 재조합 포유동물 발현 벡터는 우선적으로 특정 세포 유형, 예로서, 식물 세포에서 핵산의 발현을 지시할 수 있다 (예를 들면, 조직-특이적 조절 요소는 핵산을 발현하는 데 사용된다). 조직-특이적 조절 요소가 당업계에 공지되어 있다.

본 발명의 또다른 측면은, 실시태양 (1) 및 (2)에서 재조합 발현 벡터 또는 핵산이 도입된 유기체 또는 숙주 세포의 용도에 관한 것이다. 생성된 세포 또는 유기체는 각각 재조합 세포 또는 유기체이다. 상기 용어는 특정 피험체 세포 뿐만 아니라, 자손이 재조합 핵산을 포함한다면 상기 세포의 자손 또는 잠재적 자손도 의미할 수 있는 것으로 이해된다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인하여 잇따른 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에 상기와 같은 자손은 사실상 모체 세포와는 동일하지 않을 수 있지만, 상기 자손이 여전히 재조합 단백질을 발현하거나, 발현할 수 있는 한, 여전히 본원에서 사용되는 용어의 범주내 포함된다 .

벡터 DNA는 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기법을 통해 원핵 생물 세포 또는 진핵 생물 세포 내로 도입될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "형질전환" 및 "형질감염," "접합" 및 "형질도입"이라는 용어는 외래 핵산 (예를 들면, 선형 DNA 또는 RNA (예를 들면, 선형화된 벡터이거나, 또는 벡터가 없는 단독 유전자 작제물)) 또는 벡터 형태의 핵산 (예로서, 플라스미드, 파지, 파스피드, 파지미드, 트랜스포존 또는 기타 다른 DNA)을 숙주 세포 내에 도입하는, 당업계에 공지된 다양한 기법을 의미하는 것이며, 여기에는 인산 칼슘 또는 염화 칼슘 공-침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 리포펙션법, 자연 수용법(natural competence), 접합, 화학물질 매개 전달법, 또는 전기천공법 등이 포함된다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 데 적합한 방법은 문헌 [Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003)] 및 기타 다른 실험 매뉴얼에서 살펴볼 수 있다.

이들 통합체를 확인하고 선별하기 위해서는 일반적으로 선별가능한 마커 (예로서, 항생제 내성)를 코딩하는 유전자를 관심의 대상이 되는 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입시킨다. 바람직한 선별가능한 마커로는 예를 들면, G418, 하이그로마이신, 카나마이신, 테트라사이클린, 암피실린, 및 메토트렉세이트와 같은 약물 내성을 부여하는 마커들을 포함한다. 선별가능한 마커를 코딩하는 핵산은 상기 언급한 변형된 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 것과 동일한 벡터 상에서 숙주 세포 내로 도입될 수 있거나, 별도의 벡터 상에서 도입될 수 있다. 도입된 핵산이 안정적으로 형질감염된 세포는 약물 선별법을 통해 확인할 수 있다 (예를 들면, 선별가능한 마커 유전자가 혼입된 세포는 생존하게 되지만, 그렇지 않은 다른 세포는 사멸하게 된다).

복제 기점 및 2개의 서로 다른 마커 유전자를 포함하지 않는 플라스미드가 사용되는 경우 (예로서, pClik int sacB), 게놈 내로 삽입된 삽입체의 일부를 가진, 마커-무함유 균주 또한 생성될 수 있다. 이는 2개의 구성적 상동성 재조합 이벤트에 의해 이루어진다 (문헌 [Becker et al., APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 71 (12), p. 8587-8596; Eggeling and Bott (eds) Handbook of Corynebacterium (Taylor and Francis Group, 2005)]도 참조). 플라스미드 pClik int sacB의 서열은 WO 2005/059093에서 서열번호: 24로서 살펴볼 수 있으며, 상기 문헌에서 상기 플라스미드는 pCIS로 명명된다.

또다른 실시태양에서, 도입된 유전자의 발현이 조절될 수 있도록 하는 선택된 시스템을 포함하는 것으로서, 실시태양 (1) 및 (2)에서 사용하기 위한 재조합 미생물을 생산할 수 있다. 예를 들면, 뉴클레오티드 서열이 lac 오페론의 제어하에 배치되도록 벡터 상에 뉴클레오티드 서열을 포함하게 되면 유전자는 오직 IPTG의 존재하에서만 발현할 수 있게 된다. 그러한 조절 시스템이 당업계에 주지되어 있다.

에스케리키아 콜라이 및 코리네박테리움 글루타미쿰의 성장-배지 및 배양 조건

하나의 실시태양에서, 본 방법은 메티오닌 생산에 적합한 배지 중에서 미생물을 배양하는 것을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 본 방법은 추가로 배지 또는 숙주 세포로부터 메티오닌을 단리시키는 것을 포함한다.

당업자는 일반 미생물, 예를 들면, C. 글루타미쿰 및 E. 콜라이를 배양하는 방법을 잘 알고 있다. 따라서, E. 콜라이 및 C. 글루타미쿰의 배양에 관한 일반 교시가 하기에 주어질 것이다. E. 콜라이 및 C. 글루타미쿰의 배양에 관한 표준 교재로부터 추가의 정보를 검색할 수 있다.

E. 콜라이 균주는 통상적으로 각각 MB 및 LB 브로쓰에서 성장시킬 수 있다 (문헌 [Follettie et al. (1993) J. Bacteriol. 175, 4096-4103]). E. 콜라이용의 최소 배지는 각각 M9 및 변형된 MCGC (문헌 [Yoshihama et al. (1985) J. Bacteriol. 162,591-507])이다. 글루코스가 최종 농도 1%로 첨가될 수 있다. 항생제가 하기와 같은 양 (mg/ml)으로 첨가될 수 있다: 암피실린, 50; 카나마이신, 25; 날리딕스산, 25. 아미노산, 비타민, 및 기타 다른 보충물이 하기와 같은 양으로 첨가될 수 있다: 메티오닌, 9.3 mM; 아르기닌, 9.3 mM; 히스티딘, 9.3 mM; 티아민, 0.05 mM. E. 콜라이 세포는 통상적으로 각각 37℃에서 성장시킬 수 있다.

유전적으로 변형된 코리네박테리아는 전형적으로 합성 또는 천연 성장 배지 중에서 배양된다. 코리네박테리아용의 여러 상이한 성장 배지는 주지되어 있을 뿐만 아니라, 용이하게 이용할 수도 있다 (문헌 ([Liebl et al. (1989) Appl Microbiol . Biotechnol., 32: 205-210]; [von der Osten et al. (1998) Biotechnoogy Letters, 11:11-16]; 특허 DE 4,120,867; [Liebl(1992) "The Genus Corynebacterium, in: The Procaryotes, Volume II, Balows, A. et al., eds. Springer-Verlag]). 설명서 또한 문헌 [Handbook of Corynebacterium (edited by Eggeling and Bott, ISBN 0-8493-1821-1, 2005)]에서 살펴볼 수 있다.

이러한 배지는 하나 이상의 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기염, 비타민 및 미량 원소로 이루어진다. 바람직한 탄소 공급원은 당, 예로서, 단당류, 이당류 또는 다당류이다. 예를 들면, 글루코스, 프럭토스, 만노스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 리보스, 락토스, 말토스, 수크로스, 글리세롤, 라피노스, 전분 또는 셀룰로스가 매우 우수한 탄소 공급원으로서의 역할을 한다.

또한, 예로서, 당밀과 같은 복합 화합물, 또는 당 정제로부터의 기타 부산물을 통해 당을 배지에 공급할 수 있다. 또한, 상이한 탄소 공급원의 혼합물을 공급하는 것도 유리할 수 있다. 기타 다른 가능한 탄소 공급원은 알코올 및 유기산, 예로서, 메탄올, 에탄올, 아세트산 또는 락트산이다. 질소 공급원은 보통 유기 또는 무기 질소 화합물, 또는 상기 화합물을 함유하는 물질이다. l 또는 (NH₄)₂SO₄, NH₄OH, 니트레이트, 우레아, 아미노산 또는 복합 질소 공급원, 예를 들어, 옥수수 함침액, 대두분, 대두 단백질, 효모 추출물, 육류 추출물 등을 포함한다.

상이한 황 공급원을 사용할 경우, 메티오닌이 과잉 생산될 수 있다. 설페이트, 티오설페이트, 설파이트, 및 또한 더 환원된 형태의 황 공급원, 예로서, H₂S 및 설피드 및 유도체가 사용될 수 있다. 또한, 유기 황 공급원, 예로서, 메틸 머캅탄, 티오글리콜레이트, 티오시아네이트, 및 티오우레아, 황 함유 아미노산, 예로서, 시스테인 및 기타 다른 황 함유 화합물이 효과적인 메티오닌 생산을 위해 사용될 수 있다. 기타 C1 공급원, 예를 들면, 메탄올 또는 포름알데히드와 같이 포름에이트 또한 보충물로서 사용될 수 있다.

배지 중에 포함될 수 있는 무기 염 화합물로는 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브데넘, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 클로라이드-, 포스포러스-, 또는 설페이트-염을 포함한다. 킬레이트 화합물은 용액 중의 금속 이온을 유지하기 위해 배지에 첨가될 수 있다. 특히 유용한 킬레이트 화합물로는 카테콜 또는 프로토카테쿠에이트와 같은 디하이드록시페놀, 또는 시트르산과 같은 유기산을 포함한다. 배지는 또한 기타 다른 성장 인자, 예로서, 비타민 또는 성장 촉진제를 함유하는 것이 전형적이며, 그 예로는 비오틴, 리보플라빈, 티아민, 엽산, 니코틴산, 판토테네이트 및 피리독신을 포함한다. 성장 인자 및 염은 흔히 예로서, 효모 추출물, 당밀, 옥수수 함침액 등과 같은 복합 배지 성분으로부터 기원한다. 배지 화합물의 정확한 조성은 당해 실험에 대한 의존도가 매우 크며, 각각의 특정한 경우에 따라서 개별적으로 결정된다. 배지 최적화에 대한 정보는 교재 ["Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach (Eds. P. M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)]에서 이용가능하다. 또한, 상업적 공급업체로부터 입수가능한 성장 배지, 예로서, 스탠다드 1 (머크(Merck)) 또는 BHI (뇌 심장 침출액, 디프코 (DIFCO)) 등을 선택할 수도 있다.

모든 배지 성분은 열에 의해 (1.5 bar 및 121℃에서 20분), 또는 멸균 여과에 의해 멸균되어야 한다. 성분은 함께 멸균될 수 있거나, 필요에 따라 개별적으로 멸균될 수 있다.

모든 배지 성분은 성장의 시작시에 존재할 수 있거나, 또는 임의로는 연속적으로 또는 배취식으로 첨가될 수 있다. 배양 조건은 각각의 실험에 대해 개별적으로 정의된다.

온도는 미생물에 따라 달라질 수 있으며, 이는 15℃ 내지 45℃ 범위여야 한다. 온도는 일정하게 유지될 수 있거나, 실험하는 동안 변경될 수 있다. 배지의 pH는 5 내지 8.5 범위, 바람직하게는 약 7.0일 수 있으며, 배지에 완충액을 첨가함으로써 유지될 수 있다. 이러한 목적을 위한 예시적인 완충액으로는 인산칼륨 완충액이 있다. 합성 완충액, 예로서, MOPS, HEPES, ACES 등이 교대로 또는 동시에 사용될 수 있다. 또한, 성장시키는 동안 NaOH 또는 NH₄OH를 첨가함으로써 배양물의 pH를 일정하게 유지시킬 수 있다. 예로서, 효모 추출물과 같은 복합 배지 성분이 사용될 경우에는, 많은 복합 화합물이 큰 완충 능력을 갖는다는 사실 때문에 추가의 완충액에 대한 필요성이 감소될 수 있다. 발효기가 미생물 배양에 사용될 경우, pH는 또한 기체 암모니아를 이용하여 제어될 수 있다.

인큐베이션 시간은 보통 수시간 내지 수일 범위이다. 상기 시간은 브로쓰에 축적되는 생성물의 양을 최대화하기 위해 선택된 시간이다. 개시된 성장 실험은 다양한 베쓸, 예로서, 미세역가 플레이트, 유리관, 유리 플라스크 또는 여러 가지 다른 크기의 유리 또는 금속 발효기에서 수행될 수 있다. 대량의 클론을 스크리닝하기 위해, 미생물을 배플이 있거나 없는 미세역가 플레이트, 유리관 또는 진탕 플라스크에서 배양하여야 한다. 바람직하게는 필요한 성장 배지의 10부피%가 충진된 100 ml 진탕 플라스크가 사용된다. 플라스크는 100-300 rpm 범위의 속도를 이용하여 회전식 진탕기 (진폭 25 mm) 상에서 진탕시켜야 한다. 증발 손실은 습윤 대기를 유지함으로써 감소될 수 있고; 별법으로, 증발 소실에 대한 수학적 보정이 수행되어야 한다.

유전적으로 변형된 클론을 시험할 경우, 변형되지 않은 대조군 클론 (예로서, 모체 균주) 또는 어떠한 삽입체도 포함하지 않는, 기본 플라스미드를 함유하는 대조군 클론 또한 시험해야 한다. 배지는 30℃에서 인큐베이션된 아가 플레이트, 예로서, CM 플레이트 (10 g/ℓ 글루코스, 2.5 g/ℓ NaCl, 2 g/ℓ 우레아, 10 g/ℓ 폴리펩톤, 5 g/ℓ 효모 추출물, 5 g/ℓ 육류 추출물, 22 g/ℓ NaCl, 2 g/ℓ 우레아, 10 g/ℓ 폴리펩톤, 5 g/ℓ 효모 추출물, 5 g/ℓ 육류 추출물, 22 g/ℓ 아가, 2 M NaOH을 사용하여 pH 6.8로 조정) 상에서 성장시킨 세포를 이용하여 OD600이 0.5-1.5가 되도록 접종한다. 배지의 접종은 CM 플레이트로부터의 C. 글루타미쿰 세포의 염수 현탁액을 도입하거나, 또는 상기 세균의 액상 예비배양물을 첨가함으로써 달성된다.

메티오닌 정량

메티오닌 정량은 당업자에게 공지되어 있는, 교재에 기재되어 있는 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 하기에서 상기 정량을 예시한다.

분석은 가드 카트리지 및 시너지(Synergi) 4㎛ 칼럼 (MAX-RP 80 Å, 150 * 4.6 mm) (독일 아샤펜부르크 소재의 페노메넥스(Phenomenex))을 사용하여 HPLC (애질런트(Agilent) 1100, 독일, 발트브론 소재의 애질런트)에 의해 수행하였다. 주입하기 전, 분석물을 o-프탈디알데히드 (OPA) 및 환원제로서 머캅토에탄올 (2-MCE)을 사용하여 유도체화시킨다. 추가로, 설프하이드릴기를 요오도아세트산으로 차단한다. 극성 상으로서 40 mM NaH₂PO₄ (용리제 A, NaOH를 사용하여 pH=7.8로 조정), 및 비극성 상 (용리제 B)으로서 메탄올 물 혼합물 (100/1)을 사용하여 1 mL/분의 유속으로 분리를 수행한다. 하기 구배를 적용시킨다: 출발 0% B; 39분 39% B; 70분 64% B; 100% B, 3.5분 동안; 2분 0% B (평형화를 위해). 실온에서의 유도체화는 하기 기술하는 바와 같이 자동화된다. 처음에, 비신 (0.5 M, pH 8.5) 중 0.5㎕의 0.5% 2-MCE를 0.5 ㎕의 세포 추출물과 혼합한다. 이어서, 비신 (0.5 M, pH 8.5) 중 1.5 ㎕의 50 mg/mL 요오도아세트산을 첨가한 후, 2.5 ㎕의 비신 완충액 (0.5 M, pH 8.5)을 첨가한다. 유도체화는 1/45/54 v/v/v의 2-MCE/MeOH/비신 (0.5 M, pH 8.5)에 용해된 0.5 ㎕의 10 mg/mL OPA 시약을 첨가함으로써 수행된다. 마지막으로, 혼합물을 32 ㎕의 H₂O로 희석시킨다. 각각의 상기 피펫팅 단계 사이에 1분의 대기 시간을 둔다. 이어서, 총 부피 37.5 ㎕를 칼럼 상에 주입한다. 샘플이 제조되는 동안 (예를 들어, 대기 시간 이내에) 및 그 이후에 자동 샘플러 니들이 주기적으로 세정된다면, 분석 결과는 현저하게 개선될 수 있다. 검출은 형광 검출기 (340 nm 여기, 방출 450 nm, 독일 발트브론 소재의 애질런트)에 의해 수행한다. 정량을 위한 내부 표준물은 α-아미노 부티르산 (ABA)이다.

C. 글루타미쿰에 대한 재조합 프로토콜

하기에서는 구체적인 재조합 프로토콜을 사용하여 메티오닌 생산 효율이 증가된 C. 글루타미쿰 균주를 작제할 수 있는 방법에 대하여 기술할 것이다.

본원에서 사용되는 바, "캠벨 인(Campbell in)"이란 전체 환상 더블 스트랜드 DNA 분자 (예를 들어, pCLIK int sacB에 기초한 플라스미드)가 단일 상동성 재조합 이벤트 (크로스-인(cross-in) 이벤트)에 의해 염색체 내로 통합됨으로써 상기 환상 DNA 분자의 선형화된 버전이 상기 환상 DNA 분자의 제1 DNA 서열에 상동성인 염색체의 제1 DNA 서열 내로 효과적으로 삽입된 것인, 원래의 숙주 세포의 형질전환체를 의미한다. "캠벨드 인(Campbelled in)"이란 "캠벨 인" 형질전환체의 염색체 내로 통합된 선형화된 DNA 서열을 의미한다. "캠벨 인"은 제1 상동성 DNA 서열의 복제물을 포함하고, 그의 각각의 카피는 상동성 재조합 교차 지점의 카피를 포함하고, 상기 카피를 둘러싼다. 이 명칭은 상기와 같은 종류의 재조합을 처음 제안한 알랜 캠벨(Alan Campbell) 교수의 이름을 딴 것이다.

본원에서 사용되는 바, "캠벨 아웃(Campbell out)"이란 "캠벨 인" 형질전환체의 자손 세포로서, 여기서, 제2 상동성 재조합 이벤트 (크로스 아웃(cross out) 이벤트)는 "캠벨드 인" DNA의 선형화된 삽입된 DNA 상에 포함된 제2 DNA 서열과, 상기 선형화된 삽입체의 제2 DNA 서열에 상동성인 염색체 기원의 제2 DNA 서열 사이에 일어나고, 제2 재조합 이벤트를 통해 통합된 DNA 서열의 일부가 결실 (제거)될 뿐만 아니라, 중요하게는, 원래의 숙주 세포와 비교하여 "캠벨 아웃" 세포가 염색체에 하나 이상의 의도적인 변화 (예를 들어, 이종성 유전자 또는 DNA 서열의 단일 염기 치환, 다중 염기 치환, 삽입, 상동성 유전자 또는 변경된 상동성 유전자의 추가의 카피 또는 카피들의 삽입, 또는 상기 열거된 이들 상기 언급한 예를 하나 초과로 포함하는 DNA 서열의 삽입)를 포함하도록, 통합된 캠벨드 인 DNA의 일부 (이것은 단일 염기만큼 작을 수 있다)가 염색체에 잔류하게 된다.

"캠벨 아웃" 세포 또는 균주는 반드시 그러하지는 않지만, 보통은 "캠벨드 인" DNA 서열의 일부 (제거될 필요가 있는 부분)에 포함된 유전자, 예를 들면, 약 5% 내지 10%의 수크로스 존재하에 성장한 세포에서 발현될 때 치사되는 바실러스 섭틸리스 sacB 유전자에 대한 카운터-선별에 의해 수득된다. 카운터-선별을 수행하거나 또는 이를 수행하지 않으면서, 제한하는 것은 아니지만, 예를 들면, 콜로니 형태, 콜로니 색상, 항생제 내성의 존재 또는 부재, 중합효소 연쇄 반응에 의한 제시된 DNA 서열의 존재 또는 부재, 영양요구성의 존재 또는 부재, 효소의 존재 또는 부재, 콜로니 핵산 혼성화, 항체 스크리닝 등과 같이 스크리닝이 가능한 임의의 표현형을 사용하여 원하는 세포에 대해 스크리닝함으로써 원하는 "캠벨 아웃" 세포를 수득하거나 확인할 수 있다. 또한, 용어 "캠벨 인" 및 "캠벨 아웃"이란 상기 기술한 방법 또는 공정을 언급하기 위해 다른 시제 형태의 동사로서 사용될 수도 있다.

"캠벨 인" 또는 "캠벨 아웃"을 일으키는 상동성 재조합 이벤트가 상동성의 DNA 서열 내의 일정 범위의 DNA 염기에 걸쳐 발생할 수 있다는 것을 이해하여야 하며, 상동성 서열은 상기 범위의 적어도 일부에 대해 서로 동일하기 때문에, 교차 이벤트가 발생한 정확한 위치를 특정하는 것이 보통은 불가능하다는 것도 이해하여야 한다. 즉, 본래 어느 서열이 삽입된 DNA로부터 유도된 것인지 및 본래 어느 서열이 염색체 DNA로부터 유도된 것인지를 정확하게 특정하는 것은 불가능하다. 더욱이, 제1 상동성 DNA 서열 및 제2 상동성 DNA 서열은 보통 부분적인 비상동성 영역에 의해 분리되며, "캠벨 아웃" 세포의 염색체에 침적된 상태로 유지되는 것이 상기 비상동성 영역이다.

실제 사용을 위해 C. 글루타미쿰에서 전형적인 제1 및 제2 상동성 DNA 서열은 적어도 약 200개 염기쌍의 길이일 수 있고, 수천개 염기쌍 이하의 길이일 수 있지만, 상기 과정은 보다 짧거나 더 긴 서열을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 상동성 서열의 길이는 약 500 내지 2000개의 염기일 수 있고, "캠벨 인"으로부터 "캠벨 아웃"을 수득하는 것은 제1 및 제2 상동성 서열을 대략 동일한 길이로, 바람직하게는 차이가 200개 미만의 염기쌍만큼 나게, 가장 바람직하게는 두 서열 중 짧은 서열의 길이가 더 긴 서열의 염기쌍의 적어도 70%인 길이가 되도록 정렬시켜 용이하게 수행된다. "캠벨 인 및 캠벨 아웃 방법"에 관한 설명은 WO 2007012078 및 [Eggeling and Bott (eds) Handbook of Corynebacterium (Taylor and Francis Group, 2005), Chapter 23]에 기재되어 있다.

본 발명은 하기 실시예를 참고로 하여 더욱 상세하게 설명될 것이다. 이러한 실시예는 단지 예시적인 목적만을 위한 것이며, 본 발명을 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다는 사실을 이해하여야 한다.

실시예

하기 실시예에서는 예로서, 문헌 ([Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press], 또는 [Ausubel et al. (2007), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols in Protein Science, edition as of 2002, Wiley Interscience])과 같은 각종 공개문헌에 기재되어 있는 재조합 DNA 기술 및 분자 생물학의 표준 기법을 사용하였다. 달리 명시하지 않는 한, 모든 세포, 시약, 장치 및 키트는 제조사의 설명서에 따라 사용하였다.

PCT/EP2007/061151의 실시예가 코돈 사용 빈도를 통해 이루어지는 ICD 감소, 및 이것이 메티오닌 생산에 미치는 효과에 관한 것인 한, 상기 문헌의 실시예는 본원에서 참고로 인용된다. 실시예 1은 PCT/EP2007/061151의 실시예 3.1과 동일하다.

실시예 1: PCT / EP2007 /061151에 기술된, 이소시트레이트 데하이드로게나제 (icd) 발현 감소

클로닝

이소시트레이트 데하이드로게나제 (진뱅크 수탁 코드(Genbank Accession code) X71489)의 활성을 감소시키기 위하여 코돈 사용 빈도가 다르게 2개를 치환하였다. 모든 경우에 있어서, 코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 바꾸지 않으면서 코딩 서열의 코돈을 치환하였다. 모든 조작은 오직 코리네박테리움 글루타미쿰의 icd 유전자의 염색체 카피에 대해서만 이루어졌다. 효소 그 자체가 치환되지 않는다면 ICD 활성이 발현 수준을 반영한다고 가정할 수 있는 바, 이후 ICD 활성을 측정함으로써 상기 효과를 직접적으로 판독할 수 있다. 치환이 이루어진 변형을 표 1에 제시한다.

ICD ATG-GTG의 서열은 PCT/EP2007/061151의 도 2a)에 도시되어 있다. ICD CA의 서열은 PCT/EP2007/061151의 도 3a)에 도시되어 있다. 이러한 돌연변이를 icd 코딩 영역의 염색체 카피에 도입하기 위해서 2개의 구성적 상동성 재조합 이벤트에 의해 마커-무함유 조작이 이루어질 수 있도록 하는 2개의 상이한 플라스미드를 작제하였다.

이를 위해 ICD ATG-GTG 및 ICD CA2의 서열을, 하기 요소들을 함유하는 플라스미드인 벡터 pClik int sacB (문헌 [Becker et al (2005), Applied and Environmental Microbiology, 71 (12), p.8587-8596]) 내로 클로닝하였다:

카나마이신-내성 유전자

SacB-유전자를 보유하는 세포는 수크로스 함유 배지 상에서는 성장을 할 수 없는 바, 양성 선별 마커로서 사용될 수 있는 SacB-유전자

E. 콜라이에 대한 복제 기점

다중 클로닝 부위 (MCS)

상기 플라스미드를 통해 C. 글루타미쿰의 게놈 유전자좌에 서열이 통합될 수 있다.

플라스미드 작제

주형으로서 ATCC13032의 게놈 DNA를 사용하여 PCR에 의해 삽입체 모두를 증폭시켰다. 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 융합 PCR을 수행함으로써 코딩 영역을 변형시켰다. 표에는 사용된 프라이머 뿐만 아니라, 주형 DNA가 제시되어 있다:

모든 경우에서, 융합 PCR의 생성물을 정제하고, XhoI 및 MluI로 분해하고, 다시 정제하고, 동일한 제한 효소로 선형화된 pClik int sacB로 결찰시켰다. 삽입체의 통합성은 서열 분석을 통해 확인하였다.

최적화된 서열 ICD ATG → GTG의 코딩 서열은 PCT/EP2007/061151의 도 2에 제시되어 있다 (PCT/EP2007/061151의 서열번호: 2; 본 서열 목록의 서열번호: 4). 최적화된 서열 ICD CA2의 코딩 서열은 PCT/EP2007/061151의 도 3에 제시되어 있다 (PCT/EP2007/061151의 서열번호: 4; 본 서열 목록의 서열번호: 6).

ICD 발현 수준이 변형된 균주 작제

이어서, 상기 플라스미드를 사용하여 상기 유전자의 천연 코딩 영역을 코딩 사용 빈도가 변형된 코딩 영역으로 치환하였다. 사용된 균주는 ATCC13032lysC^fbr이었다.

각각 하나씩 상류 및 하류 영역에서 이루어지는 2개의 구성적 재조합 이벤트는 완전한 코딩 서열을 치환하는 데 필요하다. 내인성 유전자를 최적화된 유전자로 치환하는 방법은 대체로 베커(Becker) 등의 공개문헌 (상기 참고)에 기재되어 있다. 가장 중요한 단계는 하기와 같다:

- 전기천공에 의한 균주내 플라스미드 도입. 본 단계는 예로서, DE 10046870에 기재되어 있으며, 플라스미드를 균주 내로 도입하는 것이 상기 문헌에 개시되어 있는 한, 이 문헌은 참고로 인용된다.

- 제1 상동성 재조합 이벤트 이후 플라스미드를 게놈 내로 성공적으로 통합시킨 클론의 선별. 이러한 선별은 카나마이신-함유 아가 플레이트 상에서 성장시킴으로써 달성될 수 있다. 선별 단계 이외에도, 콜로니 PCR을 통해 성공적인 재조합에 관해 체크할 수 있다. 게놈 중 플라스미드의 존재를 확인하기 위해 사용된 프라이머는

BK1776 (AACGGCAGGTATATGTGATG) (PCT/EP2007/061151의 서열번호: 12) 및 OLD 450 (CGAGTAGGTCGCGAGCAG) (PCT/EP2007/061151의 서열번호: 13)이었다. 양성 클론은 약 600 bp의 밴드를 제공한다.

- 카나마이신-무함유 배지 중에서 양성 클론을 인큐베이션시킴으로써 제2 재조합 이벤트가 이루어질 수 있다.

- 수크로스-함유 배지 상에서 성장시킴으로써 제2 재조합 이벤트에 의해서 벡터 골격이 성공적으로 제거된 클론을 확인할 수 있다. SacB 유전자를 포함하는 벡터 골격을 상실한 클론만이 생존가능할 것이다.

- 이어서, 2개의 재조합 이벤트를 통해 천연 idh-코딩 영역이 성공적으로 치환된 클론은 관련 영역에 놓여 있는 PCR-생성물의 서열을 분석함으로써 확인하였다. 프라이머 OLD 441 및 OLD 442와, 주형으로서는 각 클론의 게놈 DNA를 사용하여 PCR-생성물을 생성하였다. PCR-생성물을 정제하고, Old 471 (GAATCCAACCCACGTTCAGGC) (PCT/EP2007/061151의 서열번호: 14)을 사용하여 서열 분석을 수행하였다.

icd의 내인성 카피를 치환하기 위한 상이한 C. 글루타미쿰 균주를 사용할 수 있다. 그러나, C. 글루타미쿰 리신 생산 균주, 예를 들면, 예를 들면, ATCC13032 lysC^fbr 또는 ATCC13032 또는 ATCC13286의 기타 다른 유도체를 사용하는 것이 바람직하다.

ATCC13032lysC^fbr은 ATCC13032로부터 출발하여 생산되는 것일 수 있다. 상기와 같은 리신 생산 균주를 생성하기 위해, C. 글루타미쿰 ATCC13032에서 lysC 야생형 유전자의 대립유전자 치환을 수행하였다. 이를 위해 뉴클레오티드 치환을 lysC 유전자 내로 도입하여 생성된 단백질이 311번 위치에 트레오닌 대신 이소류신을 보유하도록 하였다. 상기 균주의 작제에 관한 상세한 설명은 특허 출원 WO 2005/059093에 기재되어 있다. lysC 유전자의 수탁 번호는 P26512이다.

코돈 사용 빈도가 수정된 IDH ATG-GTG 및 IDH CA2의 효과를 분석하기 위하여 최적화된 균주를 모체 균주의 리신 생산성과 비교하였다.

ICD 활성 측정

각 돌연변이체 균주의 1 내지 2개의 클론을 ICD 활성에 대해 시험하였다. 세포를 30℃에서 밤새도록 액체 배양물 중에서 성장시키고, 원심분리에 의해 대수증식기에 수거하였다. 세포를 50 mM Tris-HCl (pH 7.0)으로 2회에 걸쳐 세척하였다. 200 mg 세포를 800 ㎕ 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl (pH 7.0), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 10% 글리세롤) 중에 재현탁시키고, 비드 비팅 (리보라이저(Ribolyser), 2x30s, 강도 6)에 의해 파괴시켰다. 세포 조직 파편을 원심분리 (테이블 상단의 원심분리기, 30분, 13 K)에 의해 펠릿화하였다. 생성된 상등액은 가용성 단백질의 추출물로서, 이는 하기 효소 분석법에서 사용하였다.

하기 조건하에서 총 부피 1 ml 중 NADP의 환원에 기인하여 이루어지는 340 nm에서의 흡착 증가를 통해 ICD 활성을 모니터링하였다:

30 mM 트리에탄올아민-클로라이드 (pH 7.4), 0.4 mM NADP, 8 mM DL-이소시트레이트, 2 mM MnSO₄, 0.1-0.2 mg 단백질에 상응하는 세포 용해물

NADPH에 대하여 6.22/mM*cm의 몰 흡광 계수를 사용하여 ICD 활성을 계산하였다.

결과

ICD 활성 측정치는 하기와 같았다:

리신 생산성에 미치는 효과

ICD의 발현 변형이 리신 생산성에 미치는 효과를 분석하기 위하여 최적화된 균주를 모체 균주의 리신 생산성과 비교하였다.

이를 위해 균주를 30℃에서 2일 동안 CM 플레이트 (10% 수크로스, 10 g/ℓ 글루코스, 2.5 g/ℓ NaCl, 2 g/ℓ 우레아, 10 g/ℓ 박토 펩톤, 10 g/ℓ 효모 추출물, 22 g/ℓ 아가) 상에서 성장시켰다. 이어서, 세포를 플레이트로부터 스크레이핑(scraping)하고, 염수 중에 재현탁시켰다. 본 배양을 위해, 100 ml 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크 중 10 ml의 배지 I (WO 2005/059139 참조) 및 0.5 g 고압 멸균처리된 CaCO₃을 세포 현탁액과 함께 OD₆₀₀이 1.5가 되도록 인큐베이션시켰다. 220 rpm에서 인포스(Infors) AJ118 (스위스 보트민겐 소재의 인포스)형 진탕기 상에서 72시간 동안 세포를 성장시켰다.

이어서, 배지로 분리된 리신의 농도를 측정하였다. 이는 HPLC를 사용하여 애질런트 1100 시리즈 LC 시스템 HPLC 상에서 수행하였다. 오르토-프탈알데히드를 사용하여 전치 칼럼의 유도체화를 수행함으로써 형성된 아미노산을 정량하였다. 하이퍼실(Hypersil) AA-칼럼 (애질런트) 상에서 아미노산 혼합물의 분리를 수행하였다.

제시된 리산 농도의 측정치는 2개의 독립된 배양물로부터 얻은 평균 데이타이다. 평균으로부터의 편차는 항상 4% 미만이었다.

ICD 활성이 저하된 균주의 리신 생산성이 더 높다는 것을 쉽게 알 수 있다. 모든 탄소 공급원이 72시간 후에는 다 소모되기 때문에, 탄소 수율 (소비된 당 1개당 형성되는 생성물의 양)이 이들 균주에서 더 높다는 것 또한 직접적으로 알 수 있다.

메티오닌 생산을 위한 균주 작제 및 메티오닌 생산성에 미치는 효과

PCT/EP2007/061151에 기술된 추가의 실험에서, 출발 코돈 중 상기 언급된 ATG-GTG 돌연변이를 보유하는 이소시트레이트 데하이드로게나제를 상기 기술된 바와 같이 pClik 내로 클로닝하여 pClik int sacB ICD (ATG-GTG)를 수득하였다 (PCT/EP2007/061151의 서열번호: 15, 본 서열 목록의 서열번호: 5는 벡터 삽입체를 나타낸다). 이어서, 플라스미드 pClik int sacB ICD (ATG-GTG) (PCT/EP2007/061151의 서열번호: 15)를 균주 OM469의 게놈 내로 캠벨 인 및 캠벨 아웃시켜 균주 M2620을 작제하였다. 균주 OM469는 WO 2007/012078에 기술되어 있다.

WO 2007/020295에 기술되어 있는 바와 같이 균주를 성장시켰다. 30℃에서 48시간 동안 인큐베이션시킨 후, 당 소비에 대하여 샘플을 분석하였다. 균주는 첨가된 당 모두를 소모하는 것으로 나타났고, 이는 균주 모두가 동일한 양의 탄소 공급원을 사용하였다는 것을 의미하는 것이다. 상기 및 WO 2007/020295에 기술된 바와 같이 HPLC에 의해 합성된 메티오닌을 측정하였다.

ICD 유전자의 출발 코돈이 변경됨으로써 ICD 활성이 변경된 균주 M2620의 메티오닌 생산성이 더 높다는 것을 표 5의 데이타로부터 알 수 있다. 모든 탄소 공급원이 48시간 후에는 다 소모되기 때문에, 생산된 메티오닌에 대한 탄소 수율 (소비된 당 1개당 형성되는 생성물의 양)이 상기 균주에서 더 높다는 것 또한 직접적으로 알 수 있다.

실시예 2: icd 의 넉아웃

icd 코딩 영역을 결실시키기 위하여, icd 코딩 영역 하류의 300-600개의 구성적 뉴클레오티드에 직접 융합된 icd 코딩 영역 상류의 ~300-600개의 구성적 뉴클레오티드를 함유하는 결실 카세트를 pClik int sacB 내로 삽입하였다. 생성된 플라스미드를 pClik int sacB 델타 icd (서열번호: 8)로 명명하였다.

이어서, 예로서, 전기천공과 같은 표준 방법에 의해 플라스미드를 C. 글루타미쿰으로 형질전환시켰다. 형질전환 방법은 예로서, 문헌 ([Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988))], [Dunican und Shivnan (Biotechnology 7, 1067-1070 (1989))], [Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123,343-347 (1994))], 및 DE 10046870)에서 살펴볼 수 있다.

각각 하나씩 상류 및 하류 영역에서 이루어지는 2개의 구성적 재조합 이벤트는 완전한 코딩 서열을 결실시키는 데 필요하다. 플라스미드 pClik int sacB를 사용하여 내인성 유전자를 결실 카세트로 치환하는 방법은 대체로 베커(Becker) 등의 공개문헌 (상기 참고)에 기재되어 있다. 가장 중요한 단계는 하기와 같다:

- 제1 상동성 재조합 이벤트 이후 플라스미드를 게놈 내로 성공적으로 통합시킨 클론의 선별. 이러한 선별은 카나마이신-함유 아가 플레이트 상에서 성장시킴으로써 달성될 수 있다. 선별 단계 이외에도, 콜로니 PCR을 통해 성공적인 재조합에 관해 체크할 수 있다.

- 이어서, 2개의 재조합 이벤트를 통해 천연 idh-코딩 영역이 결실된 클론을 PCR-특이적 프라이머를 사용하여, 또는 서던 블롯팅에 의해 확인할 수 있다. 적합한 프라이머는 하기와 같다 (5' → 3'):

ICD 상류: GAACAGATCACAGAATCCAACC

ICD 하류: TGGCGATGCACAATTCCTTG

ICD의 완전한 코딩 영역이 제거된 균주는 약 440개의 염기쌍 (보다 정확하게는 442 bp)으로 이루어진 PCR 생성물을 생산하여야 하지만, 야생형 icd 유전자를 포함하는 모체 균주는 약 2660개의 염기쌍으로 이루어진 밴드를 나타내어야 한다.

성공적인 결실이 이루어졌는지는 서던 블롯팅에 의해 또는 ICD 활성을 측정함으로써 추가적으로 확인할 수 있다.

icd 코딩 영역이 완전하게 결실된 것을 포함하는 생성된 균주는 델타 icd로 명명된다.

상기 균주는 ICD 활성을 갖고 있지 않고, 이로써 글루타메이트를 합성할 수 없는 바, 상기 균주를 풍부한 배지 상에서 성장시키거나, 최소 배지 주에서 성장시키는 경우라면 글루타메이트를 공급해 주는 것이 유용하다.

C. 글루타미쿰에서 유전자를 결실시키는 방법에 관한 보다 상세한 설명은 또한 문헌 [Eggeling and Bott (eds) Handbook of Corynebacterium" (Taylor and Francis Group, 2005) Chapter 23.8]에 기재되어 있다.

icd 결실이 메티오닌 생산성에 미치는 효과는 상기, 및 WO 2007/012078, WO 2007/020295에 기술된 바와 같이 모니터링할 수 있다.

일반적으로, 메티오닌 생산을 위해서 WO 2007/012078, WO 2007/020295에 기술되어 있는 것과 동일한 배양 배지 및 조건을 사용할 수 있다. 균주를 30℃에서 밤새도록 CM 아가 상에서 예비배양하였다. 배양된 세포를, 1.5 ml의 0.9% NaCl을 함유하는 마이크로튜브에 수거하고, 와동시킨 후, 610 nm에서의 흡광도에 의해 세포 밀도를 측정하였다. 본 배양을 위해, 0.5 g의 CaCO₃을 포함하는 고압 멸균처리된 100 ml 에를렌마이어 플라스크 중에 함유되어 있는 10 ml의 생산 배지에 현탁된 세포를 초기 OD가 1.5에 도달하도록 접종하였다. 본 배양은 30℃에서 48-78시간 동안 200 rpm으로 회전형 진탕기 (인포스 AJ118, 스위스 보트민겐 소재) 상에서 수행하였다. 세포 성장을 측정하기 위해 0.1 ml의 배양 브로쓰를 0.9 ml의 1 N HCl과 혼합하여 CaCO₃을 제거하고, 적절히 희석한 후 610 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성물과, 글루코스, 프럭토스 및 수크로스를 비롯한 잔류 당의 농도를 HPLC 방법 (애질런트 1100 시리즈 LC 시스템)에 의해 측정하였다.

실시예 3: 천연 icd 코딩 영역의 비활성이 더 낮은 변이체로의 치환

원래의 icd 서열을 ICD 활성이 더 낮은 돌연변이체 서열로 치환시킬 수 있는 가능한 한가지 전략법에 대한 추가의 실험적 설명을 이제 설명할 것이다.

1. 활성이 더 낮은 icd 돌연변이체의 생성 및 선별

제1 단계에서, 숙주 세포 (이는 C. 글루타미쿰일 수 있다)에서 기능을 발휘하는 모든 조절 서열, 예를 들면, 프로모터, RBS 및 종결인자 서열을 함유하는 복제 플라스미드 내로 icd 코딩 서열을 클로닝하였다. E. 콜라이 및 C. 글루타미쿰에서 복제가능한 셔틀 플라스미드를 사용하는 것이 이상적이다. 상기와 같은 셔틀 벡터에 대한 예로는 pClik5aMCS (WO 2005/059093)가 있다. 보다 적합한 셔틀 벡터는 문헌 ([Eikmanns et al (Gene. (1991) 102, 93-8)] 또는 ["Handbook of Corynebacterium" (edited by Eggeling and Bott, ISBN 0-8493-1821-1, 2005)])에서 살펴볼 수 있다. 상기 문헌에서 E. 콜라이 - C. 글루타미쿰 셔틀 벡터 목록 (표 23.1), 및 E. 콜라이 - C. 글루타미쿰 셔틀 발현 벡터 목록 (표 23.2)을 살펴볼 수 있다. 후자의 것이 클로닝 유전자의 발현을 지시하는 적합한 프로모터를 이미 함유하고 있는 바 더 바람직하다.

분자 생물학의 표준 방법, 예를 들면, PCR에 의한 증폭을 포함하는 클로닝, 제한 효소를 사용하는 분해, 결찰, 형질전환은 전문가에게 공지되어 있으며, 이는 표준 프로토콜 서적, 예를 들면, 문헌 ([Ausubel et al. (eds) Current protocols in molecular biology. (John Wiley & Sons, Inc. 2007)], [Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)], 및 [Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition (John Wiley & Sons, Inc. 1995)])에서 살펴볼 수 있다.

부위-지정 돌연변이유발에 의해 icd 코딩 서열의 돌연변이체 변이체 세트를 생성하였다. 돌연변이유발법은 문헌 ([Glick and Pasternak MOLECULAR BIOTECHNOLOGY. PRINCIPLES AND APPLICATIONS OF RECOMBINANT DNA; 2^nd edition (American Sicienty for Microbiology, 1998), Chapter 8: Directed Mutagenensis and Protein Engineering], 및 [Ausubel et al. (eds) Current protocols in molecular biology. (John Wiley & Sons, Inc. 2007). Chapter 8])에서 살펴볼 수 있다.

icd 변이체 라이브러리를 코딩하는 생성된 플라스미드 세트는 보통 E. 콜라이에서 생성한다. 이어서, 예를 들면, 전기천공과 같은 표준 방법에 의해 상기 라이브러리를 C. 글루타미쿰로 형질전환시킬 수 있다. 형질전환 방법은 예로서, 문헌 ([Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988))], [Dunican und Shivnan (Biotechnology 7, 1067-1070 (1989))], [Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123,343-347 (1994)]) 또는 [Eggeling and Bott (eds) Handbook of Corynebacterium" (Taylor and Francis Group, 2005) ISBN 0-8493-1821-1])에서 살펴볼 수 있다.

이어서, 생성된 클론을 ICD 활성에 관하여 시험하여야 한다. 조 세포 추출물로부터 ICD 효소 활성을 측정하는 방법은 실시예 1에 기술되어 있다.

대조군으로서는, icd 변이체 라이브러리와 동일한 플라스미드에서 클로닝된 야생형 icd 유전자를 동시에 측정한다.

이러한 결과에 기초하여, 야생형 icd 유전자와 비교하여 활성이 더 낮은 ICD 변이체를 선별할 수 있다.

ICD 활성을 더 낮게 저하시키는 돌연변이체는 더 낮은 비활성을 가질 수 있거나 (예로서, 각각의 단백질 분자의 활성은 낮거나), 더 낮은 효율로 전사 또는 번역될 수 있거나, 또는 안정성이 더 낮을 수 있다.

2. 야생형 icd 유전자의 ICD 활성이 더 낮은 돌연변이체로의 치환

야생형 icd 코딩 영역을 ICD 활성이 더 낮은 변이체로 치환시키기 위해서는 2단계 전략법을 적용시킬 수 있다. 제1 단계에서, 야생형 icd 유전자의 코딩 영역을 게놈으로부터 완전하게 결실시킨다. icd가 파괴된 세포가 생육가능하다고 문헌상에 기술되어 있다 (문헌 [Eikmanns et al (1995) J Bacteriol (1995) 177 (3), 774-782]).

a) 야생형 icd 결실

icd를 결실시키는 방법은 실시예 2에 기술되어 있다. 생성된 균주를 델타 icd로 명명한다.

b) 돌연변이체 icd 서열 삽입

제2 단계에서, 변이체 icd 코딩 서열을 델타 icd 균주 내로 삽입하였다. 이를 수행하기 위해, 실시예 2에서 결실 작제물을 위해 사용된 동일한 ~300-600개의 상류 및 하류 뉴클레오티드 측면에 위치하는 적합한 통합 플라스미드, 예로서, pClik int sacB (상기 참조)로 클로닝하였다.

일단 돌연변이체 icd를 함유하는 상기와 같은 플라스미드를 C. 글루타미쿰으로 형질전환시키고 나면, 2개의 구성적 상동성 재조합 단계 후에 돌연변이체 icd 코딩 영역이 icd 유전자좌 내로 삽입되어져 있는 클론을 상기와 유사한 전략법에 의해 확인할 수 있다. 돌연변이체 ICD 코딩 영역에 특이적인 PCR 프라이머를 사용하여 델타 icd 균주와 양성 클론을 식별할 수 있다.

야생형 icd 코딩 영역이 돌연변이체 icd 코딩 영역으로 성공적으로 치환되어져 있는 클론을 하기에서는 "icd (mut)"로 명명할 것이다.

3. ICD 활성 측정

균주 "icd (mut)"의 ICD 활성을 야생형 icd 유전자을 함유하는 모체 균주의 활성과 비교하여야 한다. 이러한 방법은 실시예 1에 기술되어 있다.

4. 메티오닌 생산에 대한 효과 분석

상기와 같이 야생형 icd를 돌연변이체 icd로 치환하는 것은 발효에 의해 메티오닌을 생산하는 다른 균주에서 수행할 수 있다.

적합한 균주로는 예로서, WO 2007/012078, WO 2007/020295에 기술된 바와 같이 메티오닌을 생산하도록 공학처리된 C. 글루타미쿰을 포함한다.

메티오닌 생산을 위한 배양 및 검출은 기타 다른 실시예에 기술되어 있다. 일반적으로, 메티오닌을 위해서는 WO 2007/012078, WO 2007/020295에 기술된 것과 동일한 배양 배지 및 조건을 사용할 수 있다. 균주를 30℃에서 밤새도록 CM 아가 상에서 예비배양하였다. 배양된 세포를, 1.5 ml의 0.9% NaCl을 함유하는 마이크로튜브에 수거하고, 와동시킨 후, 610 nm에서의 흡광도에 의해 세포 밀도를 측정하였다. 본 배양을 위해, 0.5 g의 CaCO₃을 포함하는 고압 멸균처리된 100 ml 에를렌마이어 플라스크 중에 함유되어 있는 10 ml의 생산 배지에 현탁된 세포를 초기 OD가 1.5에 도달하도록 접종하였다. 본 배양은 30℃에서 48-78시간 동안 200 rpm으로 회전형 진탕기 (인포스 AJ118, 스위스 보트민겐 소재) 상에서 수행하였다. 세포 성장을 측정하기 위해 0.1 ml의 배양 브로쓰를 0.9 ml의 1 N HCl과 혼합하여 CaCO₃을 제거하고, 적절히 희석한 후 610 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성물과, 글루코스, 프럭토스 및 수크로스를 비롯한 잔류 당의 농도를 HPLC 방법 (애질런트 1100 시리즈 LC 시스템)에 의해 측정하였다.

표적 생성물인 메티오닌의 축적은 ICD 활성이 감소된 균주에서 더 높을 것으로 예측된다.

실시예 4: 상류 서열을 변경시킴으로써 icd 전사/번역을 저하시킨다

a) 적합한 상류 서열 (프로모터 + RBS )의 확인

먼저, 천연 icd 프로모터보다 약한 서열을 확인하여야 한다. 새로운 상류 서열은 코리네박테리움으로부터, 또는 기타 다른 유기체로부터 유래될 수 있다. 세균, 더욱 특히, 코리네형 세균에서 기능을 발휘하는 수개의 프로모터 (incl RBS)를 확인하였다. 그러한 프로모터의 예는 문헌 (DE-A-44 40 118, [Reinscheid et al., Microbiology 145:503 (1999)], [Patek et al., Microbiology 142:1297 (1996)], WO 02/40679, DE-A-103 59 594, DE-A-103 59 595, DE-A-103 59 660 및 DE-A-10 2004 035 065)에 기재되어 있다.

추가로, icd 프로모터의 치환을 위해 천연 icd 프로모터보다 약한 기타 다른 상류 영역이 사용될 수 있다.

예를 들면, 문헌 [Patek et al (1996) Promoters from corynebacterium glutamicum: cloning, molecular analysis and search for a consensus motif. Microbiology 142, 1297-1309]에 기재되어 있는 것과 같은 리포터 시스템을 사용하여 상류 영역의 강도를 측정할 수 있다.

별법으로, 천연 상류 서열에 돌연변이를 도입한 후, 그의 전사 활성을 분석할 수 있다. icd 출발 코돈의 83 nt 상류 서열을 사용하는 것이 바람직한데, 이는 상기 영역 중에는 기타 다른 유전자의 코딩 영역이 존재하지 않기 때문이다. 상류 영역의 서열을 하기에 나타낸다 (굵은체).

프로모터 서열을 포함하는 DNA 서열을 돌연변이화시키는 방법은 전문가에게 주지되어 있고, 이는 또한 예로서, 문헌 [Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak: Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. 2^nd edition. 1998. ISBN 1-55581-136-1; Chapter 8: Directed Mutagenesis and Protein engineering]에 기재되어 있다. 이어서, 적합한 프로모터 서열을 선택할 수 있다.

ICD 발현을 지시하는 원래의 프로모터를 치환시키기 위해 전사 및 번역 활성이 더 낮은 상류 영역을 사용하여야 한다. 기술상, 이전 실시예에 기술된, icd 코딩 영역의 치환을 위해 사용된 것과 동일한 방법에 의해 2개의 구성적 상동성 재조합 이벤트에 의해 치환을 수행할 수 있다. 생성된 균주는 더 낮은 ICD 활성을 갖게 될 것이다. 생산성에 미치는 효과는 실시예 3에 기술된 바와 같이 분석할 수 있다.

500 nt 상류 및 하류 영역을 포함하는 ICD 유전자 서열 (서열번호: 2)

추정의 프로모터 영역 (상류 영역): 굵은체

밑줄이 없는 굵은체: icd 상류에 위치하는 유전자의 (부분) 3' 코딩 영역

밑줄이 있는 굵은체: 어떤 코딩 영역도 포함하지 않는 83 nt

코딩 영역: 이탤릭체

하류 영역: 보통체

SEQUENCE LISTING <110> Evonik Degussa GmbH <120> Production process for methionine using microorganisms with reduced isocitrate dehydrogenase activity <130> B 8668 / DB <160> 9 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 2217 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2217) <223> coding sequence of isocitrate dehydrogenase <400> 1 atggctaaga tcatctggac ccgcaccgac gaagcaccgc tgctcgcgac ctactcgctg 60 aagccggtcg tcgaggcatt tgctgctacc gcgggcattg aggtcgagac ccgggacatt 120 tcactcgctg gacgcatcct cgcccagttc ccagagcgcc tcaccgaaga tcagaaggta 180 ggcaacgcac tcgcagaact cggcgagctt gctaagactc ctgaagcaaa catcattaag 240 cttccaaaca tctccgcttc tgttccacag ctcaaggctg ctattaagga actgcaggac 300 cagggctacg acatcccaga actgcctgat aacgccacca ccgacgagga aaaagacatc 360 ctcgcacgct acaacgctgt taagggttcc gctgtgaacc cagtgctgcg tgaaggcaac 420 tctgaccgcc gcgcaccaat cgctgtcaag aactttgtta agaagttccc acaccgcatg 480 ggcgagtggt ctgcagattc caagaccaac gttgcaacca tggatgcaaa cgacttccgc 540 cacaacgaga agtccatcat cctcgacgct gctgatgaag ttcagatcaa gcacatcgca 600 gctgacggca ccgagaccat cctcaaggac agcctcaagc ttcttgaagg cgaagttcta 660 gacggaaccg ttctgtccgc aaaggcactg gacgcattcc ttctcgagca ggtcgctcgc 720 gcaaaggcag aaggtatcct cttctccgca cacctgaagg ccaccatgat gaaggtctcc 780 gacccaatca tcttcggcca cgttgtgcgc gcttacttcg cagacgtttt cgcacagtac 840 ggtgagcagc tgctcgcagc tggcctcaac ggcgaaaacg gcctcgctgc aatcctctcc 900 ggcttggagt ccctggacaa cggcgaagaa atcaaggctg cattcgagaa gggcttggaa 960 gacggcccag acctggccat ggttaactcc gctcgcggca tcaccaacct gcatgtccct 1020 tccgatgtca tcgtggacgc ttccatgcca gcaatgattc gtacctccgg ccacatgtgg 1080 aacaaagacg accaggagca ggacaccctg gcaatcatcc cagactcctc ctacgctggc 1140 gtctaccaga ccgttatcga agactgccgc aagaacggcg cattcgatcc aaccaccatg 1200 ggtaccgtcc ctaacgttgg tctgatggct cagaaggctg aagagtacgg ctcccatgac 1260 aagaccttcc gcatcgaagc agacggtgtg gttcaggttg tttcctccaa cggcgacgtt 1320 ctcatcgagc acgacgttga ggcaaatgac atctggcgtg catgccaggt caaggatgcc 1380 ccaatccagg attgggtaaa gcttgctgtc acccgctccc gtctctccgg aatgcctgca 1440 gtgttctggt tggatccaga gcgcgcacac gaccgcaacc tggcttccct cgttgagaag 1500 tacctggctg accacgacac cgagggcctg gacatccaga tcctctcccc tgttgaggca 1560 acccagctct ccatcgaccg catccgccgt ggcgaggaca ccatctctgt caccggtaac 1620 gttctgcgtg actacaacac cgacctcttc ccaatcctgg agctgggcac ctctgcaaag 1680 atgctgtctg tcgttccttt gatggctggc ggcggactgt tcgagaccgg tgctggtgga 1740 tctgctccta agcacgtcca gcaggttcag gaagaaaacc acctgcgttg ggattccctc 1800 ggtgagttcc tcgcactggc tgagtccttc cgccacgagc tcaacaacaa cggcaacacc 1860 aaggccggcg ttctggctga cgctctggac aaggcaactg agaagctgct gaacgaagag 1920 aagtccccat cccgcaaggt tggcgagatc gacaaccgtg gctcccactt ctggctgacc 1980 aagttctggg ctgacgagct cgctgctcag accgaggacg cagatctggc tgctaccttc 2040 gcaccagtcg cagaagcact gaacacaggc gctgcagaca tcgatgctgc actgctcgca 2100 gttcagggtg gagcaactga ccttggtggc tactactccc ctaacgagga gaagctcacc 2160 aacatcatgc gcccagtcgc acagttcaac gagatcgttg acgcactgaa gaagtaa 2217 <210> 2 <211> 3217 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> gene <222> (1)..(3217) <223> isocitrate dehydrogenase gene including 500 nt upstream and downstream native regions <220> <221> promoter <222> (1)..(500) <223> presumed promoter region <220> <221> CDS <222> (501)..(2717) <223> coding region of isocitrate dehydrogenase from Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_signal <222> (2718)..(3217) <223> downstream region of the isocitrate dehydrogenase gene of Corynebacterium glutamicum <400> 2 gcgcgcatcc tcgaagacct cgcagattcc gatattccag gaaccgccat gatcgaaatc 60 ccctcagatg acgatgcact tgccatcgag ggaccttcct ccatcgatgt gaaatggctg 120 ccccgcaacg gccgcaagca cggtgaattg ttgatggaaa ccctggccct ccaccatgaa 180 gaaacagaag ctgcagccac ctccgaaggc gaacttgtgt gggagactcc tgtgttctcc 240 gccactggcg aacagatcac agaatccaac ccacgttcag gcgactacta ctggattgct 300 ggcgaaagtg gtgtcgtgac cagcattcgt cgatctctag tgaaagagaa aggcctcgac 360 cgttcccaag tggcattcat ggggtattgg aaacacggcg tttccatgcg gggctgaaac 420 tgccaccata ggcgccagca attagtagaa cactgtattc taggtagctg aacaaaagag 480 cccatcaacc aaggagactc atg gct aag atc atc tgg acc cgc acc gac gaa 533 Met Ala Lys Ile Ile Trp Thr Arg Thr Asp Glu 1 5 10 gca ccg ctg ctc gcg acc tac tcg ctg aag ccg gtc gtc gag gca ttt 581 Ala Pro Leu Leu Ala Thr Tyr Ser Leu Lys Pro Val Val Glu Ala Phe 15 20 25 gct gct acc gcg ggc att gag gtc gag acc cgg gac att tca ctc gct 629 Ala Ala Thr Ala Gly Ile Glu Val Glu Thr Arg Asp Ile Ser Leu Ala 30 35 40 gga cgc atc ctc gcc cag ttc cca gag cgc ctc acc gaa gat cag aag 677 Gly Arg Ile Leu Ala Gln Phe Pro Glu Arg Leu Thr Glu Asp Gln Lys 45 50 55 gta ggc aac gca ctc gca gaa ctc ggc gag ctt gct aag act cct gaa 725 Val Gly Asn Ala Leu Ala Glu Leu Gly Glu Leu Ala Lys Thr Pro Glu 60 65 70 75 gca aac atc att aag ctt cca aac atc tcc gct tct gtt cca cag ctc 773 Ala Asn Ile Ile Lys Leu Pro Asn Ile Ser Ala Ser Val Pro Gln Leu 80 85 90 aag gct gct att aag gaa ctg cag gac cag ggc tac gac atc cca gaa 821 Lys Ala Ala Ile Lys Glu Leu Gln Asp Gln Gly Tyr Asp Ile Pro Glu 95 100 105 ctg cct gat aac gcc acc acc gac gag gaa aaa gac atc ctc gca cgc 869 Leu Pro Asp Asn Ala Thr Thr Asp Glu Glu Lys Asp Ile Leu Ala Arg 110 115 120 tac aac gct gtt aag ggt tcc gct gtg aac cca gtg ctg cgt gaa ggc 917 Tyr Asn Ala Val Lys Gly Ser Ala Val Asn Pro Val Leu Arg Glu Gly 125 130 135 aac tct gac cgc cgc gca cca atc gct gtc aag aac ttt gtt aag aag 965 Asn Ser Asp Arg Arg Ala Pro Ile Ala Val Lys Asn Phe Val Lys Lys 140 145 150 155 ttc cca cac cgc atg ggc gag tgg tct gca gat tcc aag acc aac gtt 1013 Phe Pro His Arg Met Gly Glu Trp Ser Ala Asp Ser Lys Thr Asn Val 160 165 170 gca acc atg gat gca aac gac ttc cgc cac aac gag aag tcc atc atc 1061 Ala Thr Met Asp Ala Asn Asp Phe Arg His Asn Glu Lys Ser Ile Ile 175 180 185 ctc gac gct gct gat gaa gtt cag atc aag cac atc gca gct gac ggc 1109 Leu Asp Ala Ala Asp Glu Val Gln Ile Lys His Ile Ala Ala Asp Gly 190 195 200 acc gag acc atc ctc aag gac agc ctc aag ctt ctt gaa ggc gaa gtt 1157 Thr Glu Thr Ile Leu Lys Asp Ser Leu Lys Leu Leu Glu Gly Glu Val 205 210 215 cta gac gga acc gtt ctg tcc gca aag gca ctg gac gca ttc ctt ctc 1205 Leu Asp Gly Thr Val Leu Ser Ala Lys Ala Leu Asp Ala Phe Leu Leu 220 225 230 235 gag cag gtc gct cgc gca aag gca gaa ggt atc ctc ttc tcc gca cac 1253 Glu Gln Val Ala Arg Ala Lys Ala Glu Gly Ile Leu Phe Ser Ala His 240 245 250 ctg aag gcc acc atg atg aag gtc tcc gac cca atc atc ttc ggc cac 1301 Leu Lys Ala Thr Met Met Lys Val Ser Asp Pro Ile Ile Phe Gly His 255 260 265 gtt gtg cgc gct tac ttc gca gac gtt ttc gca cag tac ggt gag cag 1349 Val Val Arg Ala Tyr Phe Ala Asp Val Phe Ala Gln Tyr Gly Glu Gln 270 275 280 ctg ctc gca gct ggc ctc aac ggc gaa aac ggc ctc gct gca atc ctc 1397 Leu Leu Ala Ala Gly Leu Asn Gly Glu Asn Gly Leu Ala Ala Ile Leu 285 290 295 tcc ggc ttg gag tcc ctg gac aac ggc gaa gaa atc aag gct gca ttc 1445 Ser Gly Leu Glu Ser Leu Asp Asn Gly Glu Glu Ile Lys Ala Ala Phe 300 305 310 315 gag aag ggc ttg gaa gac ggc cca gac ctg gcc atg gtt aac tcc gct 1493 Glu Lys Gly Leu Glu Asp Gly Pro Asp Leu Ala Met Val Asn Ser Ala 320 325 330 cgc ggc atc acc aac ctg cat gtc cct tcc gat gtc atc gtg gac gct 1541 Arg Gly Ile Thr Asn Leu His Val Pro Ser Asp Val Ile Val Asp Ala 335 340 345 tcc atg cca gca atg att cgt acc tcc ggc cac atg tgg aac aaa gac 1589 Ser Met Pro Ala Met Ile Arg Thr Ser Gly His Met Trp Asn Lys Asp 350 355 360 gac cag gag cag gac acc ctg gca atc atc cca gac tcc tcc tac gct 1637 Asp Gln Glu Gln Asp Thr Leu Ala Ile Ile Pro Asp Ser Ser Tyr Ala 365 370 375 ggc gtc tac cag acc gtt atc gaa gac tgc cgc aag aac ggc gca ttc 1685 Gly Val Tyr Gln Thr Val Ile Glu Asp Cys Arg Lys Asn Gly Ala Phe 380 385 390 395 gat cca acc acc atg ggt acc gtc cct aac gtt ggt ctg atg gct cag 1733 Asp Pro Thr Thr Met Gly Thr Val Pro Asn Val Gly Leu Met Ala Gln 400 405 410 aag gct gaa gag tac ggc tcc cat gac aag acc ttc cgc atc gaa gca 1781 Lys Ala Glu Glu Tyr Gly Ser His Asp Lys Thr Phe Arg Ile Glu Ala 415 420 425 gac ggt gtg gtt cag gtt gtt tcc tcc aac ggc gac gtt ctc atc gag 1829 Asp Gly Val Val Gln Val Val Ser Ser Asn Gly Asp Val Leu Ile Glu 430 435 440 cac gac gtt gag gca aat gac atc tgg cgt gca tgc cag gtc aag gat 1877 His Asp Val Glu Ala Asn Asp Ile Trp Arg Ala Cys Gln Val Lys Asp 445 450 455 gcc cca atc cag gat tgg gta aag ctt gct gtc acc cgc tcc cgt ctc 1925 Ala Pro Ile Gln Asp Trp Val Lys Leu Ala Val Thr Arg Ser Arg Leu 460 465 470 475 tcc gga atg cct gca gtg ttc tgg ttg gat cca gag cgc gca cac gac 1973 Ser Gly Met Pro Ala Val Phe Trp Leu Asp Pro Glu Arg Ala His Asp 480 485 490 cgc aac ctg gct tcc ctc gtt gag aag tac ctg gct gac cac gac acc 2021 Arg Asn Leu Ala Ser Leu Val Glu Lys Tyr Leu Ala Asp His Asp Thr 495 500 505 gag ggc ctg gac atc cag atc ctc tcc cct gtt gag gca acc cag ctc 2069 Glu Gly Leu Asp Ile Gln Ile Leu Ser Pro Val Glu Ala Thr Gln Leu 510 515 520 tcc atc gac cgc atc cgc cgt ggc gag gac acc atc tct gtc acc ggt 2117 Ser Ile Asp Arg Ile Arg Arg Gly Glu Asp Thr Ile Ser Val Thr Gly 525 530 535 aac gtt ctg cgt gac tac aac acc gac ctc ttc cca atc ctg gag ctg 2165 Asn Val Leu Arg Asp Tyr Asn Thr Asp Leu Phe Pro Ile Leu Glu Leu 540 545 550 555 ggc acc tct gca aag atg ctg tct gtc gtt cct ttg atg gct ggc ggc 2213 Gly Thr Ser Ala Lys Met Leu Ser Val Val Pro Leu Met Ala Gly Gly 560 565 570 gga ctg ttc gag acc ggt gct ggt gga tct gct cct aag cac gtc cag 2261 Gly Leu Phe Glu Thr Gly Ala Gly Gly Ser Ala Pro Lys His Val Gln 575 580 585 cag gtt cag gaa gaa aac cac ctg cgt tgg gat tcc ctc ggt gag ttc 2309 Gln Val Gln Glu Glu Asn His Leu Arg Trp Asp Ser Leu Gly Glu Phe 590 595 600 ctc gca ctg gct gag tcc ttc cgc cac gag ctc aac aac aac ggc aac 2357 Leu Ala Leu Ala Glu Ser Phe Arg His Glu Leu Asn Asn Asn Gly Asn 605 610 615 acc aag gcc ggc gtt ctg gct gac gct ctg gac aag gca act gag aag 2405 Thr Lys Ala Gly Val Leu Ala Asp Ala Leu Asp Lys Ala Thr Glu Lys 620 625 630 635 ctg ctg aac gaa gag aag tcc cca tcc cgc aag gtt ggc gag atc gac 2453 Leu Leu Asn Glu Glu Lys Ser Pro Ser Arg Lys Val Gly Glu Ile Asp 640 645 650 aac cgt ggc tcc cac ttc tgg ctg acc aag ttc tgg gct gac gag ctc 2501 Asn Arg Gly Ser His Phe Trp Leu Thr Lys Phe Trp Ala Asp Glu Leu 655 660 665 gct gct cag acc gag gac gca gat ctg gct gct acc ttc gca cca gtc 2549 Ala Ala Gln Thr Glu Asp Ala Asp Leu Ala Ala Thr Phe Ala Pro Val 670 675 680 gca gaa gca ctg aac aca ggc gct gca gac atc gat gct gca ctg ctc 2597 Ala Glu Ala Leu Asn Thr Gly Ala Ala Asp Ile Asp Ala Ala Leu Leu 685 690 695 gca gtt cag ggt gga gca act gac ctt ggt ggc tac tac tcc cct aac 2645 Ala Val Gln Gly Gly Ala Thr Asp Leu Gly Gly Tyr Tyr Ser Pro Asn 700 705 710 715 gag gag aag ctc acc aac atc atg cgc cca gtc gca cag ttc aac gag 2693 Glu Glu Lys Leu Thr Asn Ile Met Arg Pro Val Ala Gln Phe Asn Glu 720 725 730 atc gtt gac gca ctg aag aag taa agtctcttca caaaaagcgc tgtgcttcct 2747 Ile Val Asp Ala Leu Lys Lys 735 cacatggaag cacagcgctt tttcatattt ttattgccat aatgggcaca tgcgtttttc 2807 tcgagttctt cccgcacttc ttatcaccac cgccgtgagc atcccaacag catctgctgc 2867 cacactcacc gccgacaccg acaaggaatt gtgcatcgcc agcaacaccg acgattccgc 2927 ggtggttacc ttctggaact ccattgaaga ctccgtgcgc gaacaacgcc tcgacgaact 2987 agacgcccaa gatccaggaa tcaaagcggc gattgaaagc tacatcgccc aagatgacaa 3047 cgccccaact gctgctgaac tgcaagtacg cctcgatgcc atcgaatccg gcgaaggcct 3107 agccatgctc ctcccagacg atcccacgct ggcagacccc aacgccgagg aaagtttcaa 3167 aacggagtac acatacgacg aagccaaaga catcatcagc ggattctcca 3217 <210> 3 <211> 738 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 Met Ala Lys Ile Ile Trp Thr Arg Thr Asp Glu Ala Pro Leu Leu Ala 1 5 10 15 Thr Tyr Ser Leu Lys Pro Val Val Glu Ala Phe Ala Ala Thr Ala Gly 20 25 30 Ile Glu Val Glu Thr Arg Asp Ile Ser Leu Ala Gly Arg Ile Leu Ala 35 40 45 Gln Phe Pro Glu Arg Leu Thr Glu Asp Gln Lys Val Gly Asn Ala Leu 50 55 60 Ala Glu Leu Gly Glu Leu Ala Lys Thr Pro Glu Ala Asn Ile Ile Lys 65 70 75 80 Leu Pro Asn Ile Ser Ala Ser Val Pro Gln Leu Lys Ala Ala Ile Lys 85 90 95 Glu Leu Gln Asp Gln Gly Tyr Asp Ile Pro Glu Leu Pro Asp Asn Ala 100 105 110 Thr Thr Asp Glu Glu Lys Asp Ile Leu Ala Arg Tyr Asn Ala Val Lys 115 120 125 Gly Ser Ala Val Asn Pro Val Leu Arg Glu Gly Asn Ser Asp Arg Arg 130 135 140 Ala Pro Ile Ala Val Lys Asn Phe Val Lys Lys Phe Pro His Arg Met 145 150 155 160 Gly Glu Trp Ser Ala Asp Ser Lys Thr Asn Val Ala Thr Met Asp Ala 165 170 175 Asn Asp Phe Arg His Asn Glu Lys Ser Ile Ile Leu Asp Ala Ala Asp 180 185 190 Glu Val Gln Ile Lys His Ile Ala Ala Asp Gly Thr Glu Thr Ile Leu 195 200 205 Lys Asp Ser Leu Lys Leu Leu Glu Gly Glu Val Leu Asp Gly Thr Val 210 215 220 Leu Ser Ala Lys Ala Leu Asp Ala Phe Leu Leu Glu Gln Val Ala Arg 225 230 235 240 Ala Lys Ala Glu Gly Ile Leu Phe Ser Ala His Leu Lys Ala Thr Met 245 250 255 Met Lys Val Ser Asp Pro Ile Ile Phe Gly His Val Val Arg Ala Tyr 260 265 270 Phe Ala Asp Val Phe Ala Gln Tyr Gly Glu Gln Leu Leu Ala Ala Gly 275 280 285 Leu Asn Gly Glu Asn Gly Leu Ala Ala Ile Leu Ser Gly Leu Glu Ser 290 295 300 Leu Asp Asn Gly Glu Glu Ile Lys Ala Ala Phe Glu Lys Gly Leu Glu 305 310 315 320 Asp Gly Pro Asp Leu Ala Met Val Asn Ser Ala Arg Gly Ile Thr Asn 325 330 335 Leu His Val Pro Ser Asp Val Ile Val Asp Ala Ser Met Pro Ala Met 340 345 350 Ile Arg Thr Ser Gly His Met Trp Asn Lys Asp Asp Gln Glu Gln Asp 355 360 365 Thr Leu Ala Ile Ile Pro Asp Ser Ser Tyr Ala Gly Val Tyr Gln Thr 370 375 380 Val Ile Glu Asp Cys Arg Lys Asn Gly Ala Phe Asp Pro Thr Thr Met 385 390 395 400 Gly Thr Val Pro Asn Val Gly Leu Met Ala Gln Lys Ala Glu Glu Tyr 405 410 415 Gly Ser His Asp Lys Thr Phe Arg Ile Glu Ala Asp Gly Val Val Gln 420 425 430 Val Val Ser Ser Asn Gly Asp Val Leu Ile Glu His Asp Val Glu Ala 435 440 445 Asn Asp Ile Trp Arg Ala Cys Gln Val Lys Asp Ala Pro Ile Gln Asp 450 455 460 Trp Val Lys Leu Ala Val Thr Arg Ser Arg Leu Ser Gly Met Pro Ala 465 470 475 480 Val Phe Trp Leu Asp Pro Glu Arg Ala His Asp Arg Asn Leu Ala Ser 485 490 495 Leu Val Glu Lys Tyr Leu Ala Asp His Asp Thr Glu Gly Leu Asp Ile 500 505 510 Gln Ile Leu Ser Pro Val Glu Ala Thr Gln Leu Ser Ile Asp Arg Ile 515 520 525 Arg Arg Gly Glu Asp Thr Ile Ser Val Thr Gly Asn Val Leu Arg Asp 530 535 540 Tyr Asn Thr Asp Leu Phe Pro Ile Leu Glu Leu Gly Thr Ser Ala Lys 545 550 555 560 Met Leu Ser Val Val Pro Leu Met Ala Gly Gly Gly Leu Phe Glu Thr 565 570 575 Gly Ala Gly Gly Ser Ala Pro Lys His Val Gln Gln Val Gln Glu Glu 580 585 590 Asn His Leu Arg Trp Asp Ser Leu Gly Glu Phe Leu Ala Leu Ala Glu 595 600 605 Ser Phe Arg His Glu Leu Asn Asn Asn Gly Asn Thr Lys Ala Gly Val 610 615 620 Leu Ala Asp Ala Leu Asp Lys Ala Thr Glu Lys Leu Leu Asn Glu Glu 625 630 635 640 Lys Ser Pro Ser Arg Lys Val Gly Glu Ile Asp Asn Arg Gly Ser His 645 650 655 Phe Trp Leu Thr Lys Phe Trp Ala Asp Glu Leu Ala Ala Gln Thr Glu 660 665 670 Asp Ala Asp Leu Ala Ala Thr Phe Ala Pro Val Ala Glu Ala Leu Asn 675 680 685 Thr Gly Ala Ala Asp Ile Asp Ala Ala Leu Leu Ala Val Gln Gly Gly 690 695 700 Ala Thr Asp Leu Gly Gly Tyr Tyr Ser Pro Asn Glu Glu Lys Leu Thr 705 710 715 720 Asn Ile Met Arg Pro Val Ala Gln Phe Asn Glu Ile Val Asp Ala Leu 725 730 735 Lys Lys <210> 4 <211> 2217 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> mutation <222> (1)..(1) <223> isocitrate dehydrogenase carrying an ATG-GTG mutation in the start codon <400> 4 gtggctaaga tcatctggac ccgcaccgac gaagcaccgc tgctcgcgac ctactcgctg 60 aagccggtcg tcgaggcatt tgctgctacc gcgggcattg aggtcgagac ccgggacatt 120 tcactcgctg gacgcatcct cgcccagttc ccagagcgcc tcaccgaaga tcagaaggta 180 ggcaacgcac tcgcagaact cggcgagctt gctaagactc ctgaagcaaa catcattaag 240 cttccaaaca tctccgcttc tgttccacag ctcaaggctg ctattaagga actgcaggac 300 cagggctacg acatcccaga actgcctgat aacgccacca ccgacgagga aaaagacatc 360 ctcgcacgct acaacgctgt taagggttcc gctgtgaacc cagtgctgcg tgaaggcaac 420 tctgaccgcc gcgcaccaat cgctgtcaag aactttgtta agaagttccc acaccgcatg 480 ggcgagtggt ctgcagattc caagaccaac gttgcaacca tggatgcaaa cgacttccgc 540 cacaacgaga agtccatcat cctcgacgct gctgatgaag ttcagatcaa gcacatcgca 600 gctgacggca ccgagaccat cctcaaggac agcctcaagc ttcttgaagg cgaagttcta 660 gacggaaccg ttctgtccgc aaaggcactg gacgcattcc ttctcgagca ggtcgctcgc 720 gcaaaggcag aaggtatcct cttctccgca cacctgaagg ccaccatgat gaaggtctcc 780 gacccaatca tcttcggcca cgttgtgcgc gcttacttcg cagacgtttt cgcacagtac 840 ggtgagcagc tgctcgcagc tggcctcaac ggcgaaaacg gcctcgctgc aatcctctcc 900 ggcttggagt ccctggacaa cggcgaagaa atcaaggctg cattcgagaa gggcttggaa 960 gacggcccag acctggccat ggttaactcc gctcgcggca tcaccaacct gcatgtccct 1020 tccgatgtca tcgtggacgc ttccatgcca gcaatgattc gtacctccgg ccacatgtgg 1080 aacaaagacg accaggagca ggacaccctg gcaatcatcc cagactcctc ctacgctggc 1140 gtctaccaga ccgttatcga agactgccgc aagaacggcg cattcgatcc aaccaccatg 1200 ggtaccgtcc ctaacgttgg tctgatggct cagaaggctg aagagtacgg ctcccatgac 1260 aagaccttcc gcatcgaagc agacggtgtg gttcaggttg tttcctccaa cggcgacgtt 1320 ctcatcgagc acgacgttga ggcaaatgac atctggcgtg catgccaggt caaggatgcc 1380 ccaatccagg attgggtaaa gcttgctgtc acccgctccc gtctctccgg aatgcctgca 1440 gtgttctggt tggatccaga gcgcgcacac gaccgcaacc tggcttccct cgttgagaag 1500 tacctggctg accacgacac cgagggcctg gacatccaga tcctctcccc tgttgaggca 1560 acccagctct ccatcgaccg catccgccgt ggcgaggaca ccatctctgt caccggtaac 1620 gttctgcgtg actacaacac cgacctcttc ccaatcctgg agctgggcac ctctgcaaag 1680 atgctgtctg tcgttccttt gatggctggc ggcggactgt tcgagaccgg tgctggtgga 1740 tctgctccta agcacgtcca gcaggttcag gaagaaaacc acctgcgttg ggattccctc 1800 ggtgagttcc tcgcactggc tgagtccttc cgccacgagc tcaacaacaa cggcaacacc 1860 aaggccggcg ttctggctga cgctctggac aaggcaactg agaagctgct gaacgaagag 1920 aagtccccat cccgcaaggt tggcgagatc gacaaccgtg gctcccactt ctggctgacc 1980 aagttctggg ctgacgagct cgctgctcag accgaggacg cagatctggc tgctaccttc 2040 gcaccagtcg cagaagcact gaacacaggc gctgcagaca tcgatgctgc actgctcgca 2100 gttcagggtg gagcaactga ccttggtggc tactactccc ctaacgagga gaagctcacc 2160 aacatcatgc gcccagtcgc acagttcaac gagatcgttg acgcactgaa gaagtaa 2217 <210> 5 <211> 1002 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1002) <223> vector insert with isocitrate dehydrogenase of Corynebacterium glutamicum carrying an ATG-GTG mutation in the start codon <400> 5 ctcgagcgaa gacctcgcag attccgatat tccaggaacc gccatgatcg aaatcccctc 60 agatgacgat gcacttgcca tcgagggacc ttcctccatc gatgtgaaat ggctgccccg 120 caacggccgc aagcacggtg aattgttgat ggaaaccctg gccctccacc atgaagaaac 180 agaagctgca gccacctccg aaggcgaact tgtgtgggag actcctgtgt tctccgccac 240 tggcgaacag atcacagaat ccaacccacg ttcaggcgac tactactgga ttgctggcga 300 aagtggtgtc gtgaccagca ttcgtcgatc tctagtgaaa gagaaaggcc tcgaccgttc 360 ccaagtggca ttcatggggt attggaaaca cggcgtttcc atgcggggct gaaactgcca 420 ccataggcgc cagcaattag tagaacactg tattctaggt agctgaacaa aagagcccat 480 caaccaagga gactcgtggc taagatcatc tggacccgca ccgacgaagc accgctgctc 540 gcgacctact cgctgaagcc ggtcgtcgag gcatttgctg ctaccgcggg cattgaggtc 600 gagacccggg acatttcact cgctggacgc atcctcgccc agttcccaga gcgcctcacc 660 gaagatcaga aggtaggcaa cgcactcgca gaactcggcg agcttgctaa gactcctgaa 720 gcaaacatca ttaagcttcc aaacatctcc gcttctgttc cacagctcaa ggctgctatt 780 aaggaactgc aggaccaggg ctacgacatc ccagaactgc ctgataacgc caccaccgac 840 gaggaaaaag acatcctcgc acgctacaac gctgttaagg gttccgctgt gaacccagtg 900 ctgcgtgaag gcaactctga ccgccgcgca ccaatcgctg tcaagaactt tgttaagaag 960 ttcccacacc gcatgggcga gtggtctgca gattccacgc gt 1002 <210> 6 <211> 2217 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2217) <223> codon usage amended isocitrate dehydrogenase (icd) CA2 carrying a mutation from GGC (Gly) ATT (Ile) into GGG ATA at amino acid positions 32 and 33 <400> 6 atggctaaga tcatctggac ccgcaccgac gaagcaccgc tgctcgcgac ctactcgctg 60 aagccggtcg tcgaggcatt tgctgctacc gcggggatag aggtcgagac ccgggacatt 120 tcactcgctg gacgcatcct cgcccagttc ccagagcgcc tcaccgaaga tcagaaggta 180 ggcaacgcac tcgcagaact cggcgagctt gctaagactc ctgaagcaaa catcattaag 240 cttccaaaca tctccgcttc tgttccacag ctcaaggctg ctattaagga actgcaggac 300 cagggctacg acatcccaga actgcctgat aacgccacca ccgacgagga aaaagacatc 360 ctcgcacgct acaacgctgt taagggttcc gctgtgaacc cagtgctgcg tgaaggcaac 420 tctgaccgcc gcgcaccaat cgctgtcaag aactttgtta agaagttccc acaccgcatg 480 ggcgagtggt ctgcagattc caagaccaac gttgcaacca tggatgcaaa cgacttccgc 540 cacaacgaga agtccatcat cctcgacgct gctgatgaag ttcagatcaa gcacatcgca 600 gctgacggca ccgagaccat cctcaaggac agcctcaagc ttcttgaagg cgaagttcta 660 gacggaaccg ttctgtccgc aaaggcactg gacgcattcc ttctcgagca ggtcgctcgc 720 gcaaaggcag aaggtatcct cttctccgca cacctgaagg ccaccatgat gaaggtctcc 780 gacccaatca tcttcggcca cgttgtgcgc gcttacttcg cagacgtttt cgcacagtac 840 ggtgagcagc tgctcgcagc tggcctcaac ggcgaaaacg gcctcgctgc aatcctctcc 900 ggcttggagt ccctggacaa cggcgaagaa atcaaggctg cattcgagaa gggcttggaa 960 gacggcccag acctggccat ggttaactcc gctcgcggca tcaccaacct gcatgtccct 1020 tccgatgtca tcgtggacgc ttccatgcca gcaatgattc gtacctccgg ccacatgtgg 1080 aacaaagacg accaggagca ggacaccctg gcaatcatcc cagactcctc ctacgctggc 1140 gtctaccaga ccgttatcga agactgccgc aagaacggcg cattcgatcc aaccaccatg 1200 ggtaccgtcc ctaacgttgg tctgatggct cagaaggctg aagagtacgg ctcccatgac 1260 aagaccttcc gcatcgaagc agacggtgtg gttcaggttg tttcctccaa cggcgacgtt 1320 ctcatcgagc acgacgttga ggcaaatgac atctggcgtg catgccaggt caaggatgcc 1380 ccaatccagg attgggtaaa gcttgctgtc acccgctccc gtctctccgg aatgcctgca 1440 gtgttctggt tggatccaga gcgcgcacac gaccgcaacc tggcttccct cgttgagaag 1500 tacctggctg accacgacac cgagggcctg gacatccaga tcctctcccc tgttgaggca 1560 acccagctct ccatcgaccg catccgccgt ggcgaggaca ccatctctgt caccggtaac 1620 gttctgcgtg actacaacac cgacctcttc ccaatcctgg agctgggcac ctctgcaaag 1680 atgctgtctg tcgttccttt gatggctggc ggcggactgt tcgagaccgg tgctggtgga 1740 tctgctccta agcacgtcca gcaggttcag gaagaaaacc acctgcgttg ggattccctc 1800 ggtgagttcc tcgcactggc tgagtccttc cgccacgagc tcaacaacaa cggcaacacc 1860 aaggccggcg ttctggctga cgctctggac aaggcaactg agaagctgct gaacgaagag 1920 aagtccccat cccgcaaggt tggcgagatc gacaaccgtg gctcccactt ctggctgacc 1980 aagttctggg ctgacgagct cgctgctcag accgaggacg cagatctggc tgctaccttc 2040 gcaccagtcg cagaagcact gaacacaggc gctgcagaca tcgatgctgc actgctcgca 2100 gttcagggtg gagcaactga ccttggtggc tactactccc ctaacgagga gaagctcacc 2160 aacatcatgc gcccagtcgc acagttcaac gagatcgttg acgcactgaa gaagtaa 2217 <210> 7 <211> 1002 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA sequence <220> <221> misc_feature <223> vector insert with codon usage amended isocitrate dehydrogenase (icd) CA2 of Corynebacterium glutamicum carrying a mutation from GGC (Gly) ATT (Ile) into GGG ATA at amino acid positions 32 and 33 <400> 7 ctcgagcgaa gacctcgcag attccgatat tccaggaacc gccatgatcg aaatcccctc 60 agatgacgat gcacttgcca tcgagggacc ttcctccatc gatgtgaaat ggctgccccg 120 caacggccgc aagcacggtg aattgttgat ggaaaccctg gccctccacc atgaagaaac 180 agaagctgca gccacctccg aaggcgaact tgtgtgggag actcctgtgt tctccgccac 240 tggcgaacag atcacagaat ccaacccacg ttcaggcgac tactactgga ttgctggcga 300 aagtggtgtc gtgaccagca ttcgtcgatc tctagtgaaa gagaaaggcc tcgaccgttc 360 ccaagtggca ttcatggggt attggaaaca cggcgtttcc atgcggggct gaaactgcca 420 ccataggcgc cagcaattag tagaacactg tattctaggt agctgaacaa aagagcccat 480 caaccaagga gactcatggc taagatcatc tggacccgca ccgacgaagc accgctgctc 540 gcgacctact cgctgaagcc ggtcgtcgag gcatttgctg ctaccgcggg gatagaggtc 600 gagacccggg acatttcact cgctggacgc atcctcgccc agttcccaga gcgcctcacc 660 gaagatcaga aggtaggcaa cgcactcgca gaactcggcg agcttgctaa gactcctgaa 720 gcaaacatca ttaagcttcc aaacatctcc gcttctgttc cacagctcaa ggctgctatt 780 aaggaactgc aggaccaggg ctacgacatc ccagaactgc ctgataacgc caccaccgac 840 gaggaaaaag acatcctcgc acgctacaac gctgttaagg gttccgctgt gaacccagtg 900 ctgcgtgaag gcaactctga ccgccgcgca ccaatcgctg tcaagaactt tgttaagaag 960 ttcccacacc gcatgggcga gtggtctgca gattccacgc gt 1002 <210> 8 <211> 5364 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA sequence <220> <221> misc_feature <223> plasmid pClik int sacB delta icd <400> 8 tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtacca cgcgtaaacc gcagcacccg caatcgcgcg 60 catcctcgaa gacctcgcag attccgatat tccaggaacc gccatgatcg aaatcccctc 120 agatgacgat gcacttgcca tcgagggacc ttcctccatc gatgtgaaat ggctgccccg 180 caacggccgc aagcacggtg aattgttgat ggaaaccctg gccctccacc atgaagaaac 240 agaagctgca gccacctccg aaggcgaact tgtgtgggag actcctgtgt tctccgccac 300 tggcgaacag atcacagaat ccaacccacg ttcaggcgac tactactgga ttgctggcga 360 aagtggtgtc gtgaccagca ttcgtcgatc tctagtgaaa gagaaaggcc tcgaccgttc 420 ccaagtggca ttcatggggt attggaaaca cggcgtttcc atgcggggct gaaactgcca 480 ccataggcgc cagcaattag tagaacactg tattctaggt agctgaacaa aagagcccat 540 caaccaagga gactcagtct cttcacaaaa agcgctgtgc ttcctcacat ggaagcacag 600 cgctttttca tatttttatt gccataatgg gcacatgcgt ttttctcgag ttcttcccgc 660 acttcttatc accaccgccg tgagcatccc aacagcatct gctgccacac tcaccgccga 720 caccgacaag gaattgtgca tcgccagcaa caccgacgat tccgcggtgg ttaccttctg 780 gaactccatt gaagactccg tgcgcgaaca acgcctcgac gaactagacg cccaagatcc 840 aggaatcaaa gcggcgattg aaagctacat cgcccaagat gacaacgccc caactgctgc 900 tgaactgcaa gtacgcctcg atgccatcga atccggcgaa ggcctagcca tgctcctccc 960 agacgatccc acgctggcag accccaacgc cgaggaaagt ttcaaaacgg agtacacata 1020 cgacgaagcc aaagacatca tcagcggatt ctccagcgat ccagccagcg atgtactcac 1080 tagttcggac ctagggatat cgtcgacatc gatgctcttc tgcgttaatt aacaattggg 1140 atcctctaga cccgggattt aaatgatccg ctagcgggct gctaaaggaa gcggaacacg 1200 tagaaagcca gtccgcagaa acggtgctga ccccggatga atgtcagcta ctgggctatc 1260 tggacaaggg aaaacgcaag cgcaaagaga aagcaggtag cttgcagtgg gcttacatgg 1320 cgatagctag actgggcggt tttatggaca gcaagcgaac cggaattgcc agctggggcg 1380 ccctctggta aggttgggaa gccctgcaaa gtaaactgga tggctttctt gccgccaagg 1440 atctgatggc gcaggggatc aagatctgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg 1500 attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc 1560 tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg 1620 caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag 1680 gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc 1740 gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat 1800 ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg 1860 cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc 1920 gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag 1980 catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc 2040 gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc 2100 cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata 2160 gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc 2220 gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac 2280 gagttcttct gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc 2340 catcacgaga tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt 2400 tccgggacgc cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag ttcttcgccc 2460 acgctagcgg cgcgccggcc ggcccggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 2520 taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 2580 ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 2640 gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 2700 gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 2760 cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 2820 ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 2880 tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 2940 gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 3000 tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 3060 ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 3120 ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 3180 ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 3240 accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 3300 tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 3360 cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaag 3420 gccggccgcg gccgccatcg gcattttctt ttgcgttttt atttgttaac tgttaattgt 3480 ccttgttcaa ggatgctgtc tttgacaaca gatgttttct tgcctttgat gttcagcagg 3540 aagctcggcg caaacgttga ttgtttgtct gcgtagaatc ctctgtttgt catatagctt 3600 gtaatcacga cattgtttcc tttcgcttga ggtacagcga agtgtgagta agtaaaggtt 3660 acatcgttag gatcaagatc catttttaac acaaggccag ttttgttcag cggcttgtat 3720 gggccagtta aagaattaga aacataacca agcatgtaaa tatcgttaga cgtaatgccg 3780 tcaatcgtca tttttgatcc gcgggagtca gtgaacaggt accatttgcc gttcatttta 3840 aagacgttcg cgcgttcaat ttcatctgtt actgtgttag atgcaatcag cggtttcatc 3900 acttttttca gtgtgtaatc atcgtttagc tcaatcatac cgagagcgcc gtttgctaac 3960 tcagccgtgc gttttttatc gctttgcaga agtttttgac tttcttgacg gaagaatgat 4020 gtgcttttgc catagtatgc tttgttaaat aaagattctt cgccttggta gccatcttca 4080 gttccagtgt ttgcttcaaa tactaagtat ttgtggcctt tatcttctac gtagtgagga 4140 tctctcagcg tatggttgtc gcctgagctg tagttgcctt catcgatgaa ctgctgtaca 4200 ttttgatacg tttttccgtc accgtcaaag attgatttat aatcctctac accgttgatg 4260 ttcaaagagc tgtctgatgc tgatacgtta acttgtgcag ttgtcagtgt ttgtttgccg 4320 taatgtttac cggagaaatc agtgtagaat aaacggattt ttccgtcaga tgtaaatgtg 4380 gctgaacctg accattcttg tgtttggtct tttaggatag aatcatttgc atcgaatttg 4440 tcgctgtctt taaagacgcg gccagcgttt ttccagctgt caatagaagt ttcgccgact 4500 ttttgataga acatgtaaat cgatgtgtca tccgcatttt taggatctcc ggctaatgca 4560 aagacgatgt ggtagccgtg atagtttgcg acagtgccgt cagcgttttg taatggccag 4620 ctgtcccaaa cgtccaggcc ttttgcagaa gagatatttt taattgtgga cgaatcaaat 4680 tcagaaactt gatatttttc atttttttgc tgttcaggga tttgcagcat atcatggcgt 4740 gtaatatggg aaatgccgta tgtttcctta tatggctttt ggttcgtttc tttcgcaaac 4800 gcttgagttg cgcctcctgc cagcagtgcg gtagtaaagg ttaatactgt tgcttgtttt 4860 gcaaactttt tgatgttcat cgttcatgtc tcctttttta tgtactgtgt tagcggtctg 4920 cttcttccag ccctcctgtt tgaagatggc aagttagtta cgcacaataa aaaaagacct 4980 aaaatatgta aggggtgacg ccaaagtata cactttgccc tttacacatt ttaggtcttg 5040 cctgctttat cagtaacaaa cccgcgcgat ttacttttcg acctcattct attagactct 5100 cgtttggatt gcaactggtc tattttcctc ttttgtttga tagaaaatca taaaaggatt 5160 tgcagactac gggcctaaag aactaaaaaa tctatctgtt tcttttcatt ctctgtattt 5220 tttatagttt ctgttgcatg ggcataaagt tgccttttta atcacaattc agaaaatatc 5280 ataatatctc atttcactaa ataatagtga acggcaggta tatgtgatgg gttaaaaagg 5340 atcggcggcc gctcgattta aatc 5364 <210> 9 <211> 1055 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA sequence <220> <221> misc_feature <223> insert of pClik int sacB delta icd <400> 9 acgcgtaaac cgcagcaccc gcaatcgcgc gcatcctcga agacctcgca gattccgata 60 ttccaggaac cgccatgatc gaaatcccct cagatgacga tgcacttgcc atcgagggac 120 cttcctccat cgatgtgaaa tggctgcccc gcaacggccg caagcacggt gaattgttga 180 tggaaaccct ggccctccac catgaagaaa cagaagctgc agccacctcc gaaggcgaac 240 ttgtgtggga gactcctgtg ttctccgcca ctggcgaaca gatcacagaa tccaacccac 300 gttcaggcga ctactactgg attgctggcg aaagtggtgt cgtgaccagc attcgtcgat 360 ctctagtgaa agagaaaggc ctcgaccgtt cccaagtggc attcatgggg tattggaaac 420 acggcgtttc catgcggggc tgaaactgcc accataggcg ccagcaatta gtagaacact 480 gtattctagg tagctgaaca aaagagccca tcaaccaagg agactcagtc tcttcacaaa 540 aagcgctgtg cttcctcaca tggaagcaca gcgctttttc atatttttat tgccataatg 600 ggcacatgcg tttttctcga gttcttcccg cacttcttat caccaccgcc gtgagcatcc 660 caacagcatc tgctgccaca ctcaccgccg acaccgacaa ggaattgtgc atcgccagca 720 acaccgacga ttccgcggtg gttaccttct ggaactccat tgaagactcc gtgcgcgaac 780 aacgcctcga cgaactagac gcccaagatc caggaatcaa agcggcgatt gaaagctaca 840 tcgcccaaga tgacaacgcc ccaactgctg ctgaactgca agtacgcctc gatgccatcg 900 aatccggcga aggcctagcc atgctcctcc cagacgatcc cacgctggca gaccccaacg 960 ccgaggaaag tttcaaaacg gagtacacat acgacgaagc caaagacatc atcagcggat 1020 tctccagcga tccagccagc gatgtactca ctagt 1055

Claims

상응하는 초기 미생물과 비교하여 이소시트레이트 데하이드로게나제 활성이 부분적으로 또는 완전하게 감소된 미생물을 사용하여 메티오닌을 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 이소시트레이트 데하이드로게나제 활성이 부분적으로 또는 완전하게 감소된 미생물이 재조합 미생물인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 이소시트레이트 데하이드로게나제 활성이 이소시트레이트 데하이드로게나제 발현의 부분적인 또는 완전한 감소에 기인하여 감소되는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum ), 바람직하게 C. 글루타미쿰(C. glutamicum ) ATCC13032, ATCC13032lysC^fbr 또는 ATCC13286 또는 이들 균주들 중 하나의 유도체인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 메티오닌이 L-메티오닌인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 이소시트레이트 데하이드로게나제 발현 감소가 미생물의 천연 이소시트레이트 데하이드로게나제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 대신에 변형된 이소시트레이트 데하이드로게나제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현으로 인한 것이 아닌 것을 조건으로 하되, 여기서, 상기 변형된 이소시트레이트 데하이드로게나제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 비-변형된 이소시트레이트 데하이드로게나제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로부터 유래된 것으로서, 비-변형된 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 코돈이 변형된 이소시트레이트 데하이드로게나제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에서는 미생물의 코돈 사용 빈도에 따라 덜 빈번하게 사용되는 코돈에 의해 치환된 것인 방법.