JP4808742B2 - Pgro発現ユニット - Google Patents
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Description
遺伝子を転写させるために、
A) 配列番号1の核酸配列、または
B) 配列番号1の配列からヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失により誘導され、かつ配列番号1の配列に対して核酸レベルで少なくとも90%の同一性を有する配列、または
C) 配列番号1の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、または
D) A)、B)もしくはC)の配列の機能的に等価な断片、
を含んでなる、プロモーター活性を有する核酸を使用することによって達成されることを見出した。
本発明のプロモーター活性(適宜改変された比プロモーター活性)を有する1以上の核酸を微生物のゲノム中に導入して、1以上の内因性遺伝子の転写が、導入された本発明のプロモーター活性(適宜改変された比プロモーター活性)を有する核酸の制御下で起こるようにする;または
1以上の遺伝子を微生物のゲノム中に導入して、1以上の導入された遺伝子の転写が、本発明のプロモーター活性(適宜改変された比プロモーター活性)を有する内因性核酸の制御下で起こるようにする;または
本発明のプロモーター活性(適宜改変された比プロモーター活性)を有する核酸と機能的に連結された1以上の転写すべき核酸を含んでなる1以上の核酸構築物を、微生物中に導入する。
A) 配列番号1の核酸配列、または
B) 配列番号1の配列からヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失によって誘導されかつ配列番号1の配列に対して核酸レベルで少なくとも90%の同一性を有する配列、または
C) 配列番号1の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、または
D) A)、B)もしくはC)の配列の機能的に等価な断片、
を含んでなる。
多重アラインメントパラメーター(Multiple alignment parameter):
Gap opening penalty 10
Gap extension penalty 10
Gap separation penalty range 8
Gap separation penalty off
% identity for alignment delay 40
Residue specific gaps off
Hydrophilic residue gap off
Transition weighing 0
ペアワイズアラインメントパラメーター(Pairwise alignment parameter):
FAST algorithm on
K-tuplesize 1
Gap penalty 3
Window size 5
Number of best diagonals 5
50%ホルムアミド、5 x SSC(750mM NaCl、75mMクエン酸ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH 7.6)、5 x Denhardt's溶液、10%硫酸デキストランおよび20g/ml変性せん断サケ精子DNAからなる溶液中での42℃における一晩のインキュベーション、その後の0.1 x SSCによる65℃でのフィルターの洗浄。
A) 配列番号1の核酸配列、または
B) この配列からヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失によって誘導されかつ配列番号1の配列に対して核酸レベルで少なくとも90%の同一性を有する配列、または
C) 配列番号1の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、または
D) A)、B)もしくはC)の配列と機能的に等価な断片、
を含んでなるプロモーター活性を有する核酸に関する。ただし、配列番号1の配列を有する核酸は除外される。
1以上の本発明の発現ユニット(適宜改変された比発現活性をもつ)を微生物のゲノム中に導入して、1以上の内因性遺伝子の発現が、導入された本発明の発現ユニット(適宜改変された比発現活性をもつ)の制御下で行われるようにする;または
1以上の遺伝子を微生物のゲノム中に導入して、1以上の導入された遺伝子の発現が本発明の内因性発現ユニット(適宜改変された比発現活性をもつ)の制御下で行われるようにする;または
本発明の発現ユニット(適宜改変された比発現活性をもつ)および機能的に連結された発現すべき1以上の核酸を含んでなる1以上の核酸構築物を微生物中に導入する。
E) 配列番号2の核酸配列、または
F) 配列番号2の配列からヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失により誘導されかつ配列番号2の配列に対して核酸レベルで少なくとも90%の同一性を有する配列、または
G) 配列番号2の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、または
H) E)、F)もしくはG)の配列の機能的に等価な断片、
を含んでなる。
50%ホルムアミド、5 x SSC(750mM NaCl、75mMクエン酸ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH 7.6)、5 x Denhardt's溶液、10%硫酸デキストランおよび20g/ml変性せん断サケ精子DNAからなる溶液中での42℃における一晩のインキュベーション、その後の0.1 x SSCによる65℃でのフィルターの洗浄。
E) 配列番号2の核酸配列、または
F) この配列からヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失により誘導されかつ配列番号2の配列に対して核酸レベルで少なくとも90%の同一性を有する配列、または
G) 配列番号2の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、または
H) E)、F)もしくはG)の配列の機能的に等価な断片、
を含んでなる発現ユニットに関し、ただし、配列番号2の配列を有する核酸は除外される。
Davisら, 「分子生物学の基礎的方法(Basic Methods In Molecular Biology)」 (1986);J. H. Miller, 「分子遺伝学実験(Experiments in Molecular Genetics)」, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1972);J.H. Miller, 「細菌遺伝学の短期講習(A Short Course in Bacterial Genetics)」, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1992);M. Singer and P. Berg, 「遺伝子とゲノム(Genes & Genomes)」, University Science Books, Mill Valley, California (1991);J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, 「分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989);P.B. Kaufmannら, 「生物学と医学における分子的および細胞的方法のハンドブック(Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine)」, CRC Press, Boca Raton, Florida (1995);「植物分子生物学およびバイオテクノロジーの方法(Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology)」, B.R. GlickおよびJ.E. Thompson編, CRC Press, Boca Raton, Florida (1993);ならびにP.F. Smith-Keary, 「大腸菌の分子遺伝学(Molecular Genetics of Escherichia coli)」, The Guilford Press, New York, NY (1989)。
a) 内因性遺伝子の転写を調節する、本発明のプロモーター活性を有する内因性核酸の微生物内での比プロモーター活性を、野生型と比較して改変させるか、または
b) 本発明のプロモーター活性を有する核酸によりもしくは実施形態a)に従って比プロモーター活性を改変させた核酸により、微生物内での遺伝子(該遺伝子はプロモーター活性を有する核酸に対して異種である)の転写を調節する、
ことによる上記方法に関する。
b1) 適宜に比プロモーター活性を改変させた、1以上の本発明のプロモーター活性を有する核酸を微生物のゲノム中に導入して、1以上の内因性遺伝子の転写が、導入された該プロモーター活性を有する核酸の制御下で起こるようにする、または
b2) 1以上の遺伝子を微生物のゲノム中に導入して、1以上の導入された遺伝子の転写が、適宜に比プロモーター活性を改変させた本発明のプロモーター活性を有する内因性核酸の制御下で起こるようにする、または
b3) 適宜に比プロモーター活性を改変させた、本発明のプロモーター活性を有する核酸および機能的に連結された1以上の転写すべき核酸を含んでなる1以上の核酸構築物を微生物中に導入する。
実施形態b1)に従って、適宜に比プロモーター活性を改変させた、1以上の本発明のプロモーター活性を有する核酸を微生物のゲノム中に導入して、1以上の内因性遺伝子の転写が、導入された該プロモーター活性を有する核酸の制御下で起こるようにする、または
実施形態b2)に従って、1以上の外因性遺伝子を微生物のゲノム中に導入して、1以上の導入された外因性遺伝子の転写が、適宜に比プロモーター活性を改変させたプロモーター活性を有する本発明の内因性核酸の制御下で起こるようにする、または
実施形態b3)に従って、適宜に比プロモーター活性を改変させたプロモーター活性を有する本発明の核酸および機能的に連結された1以上の転写すべき内因性核酸を含んでなる1以上の核酸構築物を微生物中に導入する。
実施形態b2)に従って、1以上の外因性遺伝子を微生物のゲノム中に導入して、1以上の導入された外因性遺伝子の転写が、適宜に比プロモーター活性を改変させたプロモーター活性を有する本発明の内因性核酸の制御下で起こるようにする、または
実施形態b3)に従って、適宜に比プロモーター活性を改変させたプロモーター活性を有する本発明の核酸および機能的に連結された1以上の転写すべき外因性核酸を含んでなる1以上の核酸構築物を微生物中に導入する。
ah) 内因性遺伝子の転写を調節する本発明のプロモーター活性を有する内因性核酸の微生物内での比プロモーター活性を野生型と比較して増加させる、または
bh) 本発明のプロモーター活性を有する核酸により、もしくは実施形態a)に従って比プロモーター活性を増加させた核酸により、該プロモーター活性を有する核酸に対して異種である遺伝子の微生物内での転写を調節する、
ことによる上記方法である。
bh1) 適宜に比プロモーター活性を増加させた、本発明のプロモーター活性を有する1以上の核酸を微生物のゲノム中に導入して、1以上の内因性遺伝子の転写が、導入された該プロモーター活性を有する核酸の制御下で起こるようにする、または
bh2) 1以上の遺伝子を微生物のゲノム中に導入して、1以上の導入された遺伝子の転写が、適宜に比プロモーター活性を増加させた本発明のプロモーター活性を有する内因性核酸の制御下で起こるようにする、または
bh3) 適宜に比プロモーター活性を増加させた本発明のプロモーター活性を有する核酸および機能的に連結された1以上の転写すべき核酸を含んでなる1以上の核酸構築物を、微生物中に導入する。
ar) 内因性遺伝子の転写を調節する本発明のプロモーター活性を有する内因性核酸の微生物内での比プロモーター活性を、野生型と比較して低下させる、または、
br) 実施形態a)に従って比プロモーター活性を低下させた核酸を微生物のゲノム中に導入して、内因性遺伝子の転写が、導入されたプロモーター活性の低下した核酸の制御下で起こるようにする、
ことによる上記方法である。
c) 内因性遺伝子の発現を調節する本発明の内因性発現ユニットの微生物内での比発現活性を、野生型と比較して改変させる、または
d) 本発明の発現ユニットにより、もしくは実施形態c)に従って比発現活性を改変させた本発明の発現ユニットにより、該発現ユニットに対して異種である遺伝子の微生物内での発現を調節する、
ことによる上記方法である。
d1) 適宜に比発現活性を改変させた1以上の本発明の発現ユニットを微生物のゲノム中に導入して、1以上の内因性遺伝子の発現が、導入された発現ユニットの制御下で起こるようにする、または
d2) 1以上の遺伝子を微生物のゲノム中に導入して、1以上の導入された遺伝子の発現が、適宜に比発現活性を改変させた本発明の内因性発現ユニットの制御下で起こるようにする、または
d3) 適宜に比発現活性を改変させた本発明の発現ユニットおよび機能的に連結された1以上の発現すべき核酸を含んでなる1以上の核酸構築物を、微生物中に導入する。
実施形態d1)に従って、適宜に比発現活性を改変させた1以上の本発明の発現ユニットを微生物のゲノム中に導入して、1以上の内因性遺伝子の発現が、導入された発現ユニットの制御下で起こるようにする、または
実施形態d2)に従って、1以上の外因性遺伝子を微生物のゲノム中に導入して、1以上の導入された遺伝子の発現が、適宜に比発現活性を改変させた本発明の内因性発現ユニットの制御下で起こるようにする、または
実施形態d3)に従って、適宜に比発現活性を改変させた本発明の発現ユニットおよび機能的に連結された1以上の発現すべき核酸を含んでなる1以上の核酸構築物を微生物中に導入する。
実施形態d2)に従って、1以上の外因性遺伝子を微生物のゲノム中に導入して、1以上の導入された遺伝子の発現が、適宜に比発現活性を改変させた本発明の内因性発現ユニットの制御下で起こるようにする、または
実施形態d3)に従って、適宜に比発現活性を改変させた本発明の発現ユニットおよび機能的に連結された1以上の発現すべき外因性核酸を含んでなる1以上の核酸構築物を微生物中に導入する。
ch) 内因性遺伝子の発現を調節する本発明の内因性発現ユニットの微生物内での比発現活性を、野生型と比較して増加させる、または
dh) 本発明の発現ユニットにより、もしくは実施形態a)に従って比発現活性を増加させた発現ユニットにより、該発現ユニットに対して異種である遺伝子の微生物内での発現を調節する、
ことによる上記方法である。
dh1) 適宜に比発現活性を増加させた1以上の本発明の発現ユニットを微生物のゲノム中に導入して、1以上の内因性遺伝子の発現が、導入された該発現ユニットの制御下で起こるようにする、または
dh2) 1以上の遺伝子を微生物のゲノム中に導入して、1以上の導入された遺伝子の発現が、適宜に比発現活性を増加させた本発明の内因性発現ユニットの制御下で起こるようにする、または
dh3) 適宜に比発現活性を増加させた本発明の発現ユニットおよび機能的に連結された1以上の発現すべき核酸を含んでなる1以上の核酸構築物を微生物中に導入する。
cr) 内因性遺伝子の発現を調節する本発明の内因性発現ユニットの微生物内での比発現活性を、野生型と比較して低下させる、または
dr) 実施形態cr)に従って比発現活性を低下させた発現ユニットを微生物のゲノム中に導入して、内因性遺伝子の発現が、導入された発現活性の低下した発現ユニットの制御下で起こるようにする、
ことによる上記方法である。
列1「身元確認」において、表1に関係するそれぞれの配列の明確な名称を示す。
A アラニン
C システイン
D アスパラギン酸
E グルタミン酸
F フェニルアラニン
G グリシン
H ヒスチジン
I イソロイシン
K リシン
L ロイシン
M メチオニン
N アスパラギン
P プロリン
Q グルタミン
R アルギニン
S セリン
T トレオニン
V バリン
W トリプトファン
Y チロシン
少なくとも1つの本発明の発現ユニット、
少なくとも1つのさらなる発現すべき核酸配列、すなわち発現すべき遺伝子、および
適宜に、さらなる遺伝子制御エレメント(例えばターミネーター)、
を含んでなる発現カセットに関し、ここで、
少なくとも1つの発現ユニットおよびさらなる発現すべき核酸配列は互いに機能的に連結され、かつさらなる発現すべき核酸配列は発現ユニットに対して異種である。
a) 少なくとも1つの内因性遺伝子の転写を調節する少なくとも1つの請求項1に記載のプロモーター活性を有する内因性核酸の微生物内での比プロモーター活性を改変させる、または
b) 請求項1に記載のプロモーター活性を有する核酸により、または実施形態a)に従って比プロモーター活性を改変させた請求項1に記載のプロモーター活性を有する核酸により、該プロモーター活性を有する核酸に対して異種である遺伝子の微生物内での転写を調節する、
ことによるものである。
b1) 適宜に比プロモーター活性を改変させた、1以上の請求項1に記載のプロモーター活性を有する核酸を微生物のゲノム中に導入して、1以上の内因性遺伝子の転写が、導入されたプロモーター活性を有する核酸の制御下で起こるようにする、または
b2) 1以上の遺伝子を微生物のゲノム中に導入して、1以上の導入された遺伝子の転写が、適宜に比プロモーター活性を改変させた請求項1に記載のプロモーター活性を有する内因性核酸の制御下で起こるようにする、または
b3) 適宜に比プロモーター活性を改変させた請求項1に記載のプロモーター活性を有する核酸および機能的に連結された1以上の転写すべき核酸を含んでなる1以上の核酸構築物を微生物中に導入する。
ah) 内因性遺伝子の転写を調節する請求項1に記載のプロモーター活性を有する内因性核酸の微生物内での比プロモーター活性が、野生型と比較して増加している、または
bh) プロモーター活性を有する核酸に対して異種である遺伝子の微生物内での転写が、請求項1に記載のプロモーター活性を有する核酸により、または実施形態ah)に従って比プロモーター活性を増加させた核酸により調節されている。
bh1) 適宜に比プロモーター活性を増加させた1以上の請求項1に記載のプロモーター活性を有する核酸を微生物のゲノム中に導入して、1以上の内因性遺伝子の転写が、導入されたプロモーター活性を有する核酸の制御下で起こるようにする、または
bh2) 1以上の遺伝子を微生物のゲノム中に導入して、1以上の導入された遺伝子の転写が、適宜に比プロモーター活性を増加させた請求項1に記載のプロモーター活性を有する内因性核酸の制御下で起こるようにする、または
bh3) 適宜に比プロモーター活性を増加させた請求項1に記載のプロモーター活性を有する核酸および機能的に連結された1以上の転写すべき核酸を含んでなる1以上の核酸構築物を微生物中に導入する。
ar) 少なくとも1つの内因性遺伝子の転写を調節する、請求項1に記載のプロモーター活性を有する少なくとも1つの内因性核酸の微生物内での比プロモーター活性が、野生型と比較して低下している、または
br) 実施形態a)に従ってプロモーター活性を低下させた1以上の核酸が微生物のゲノム中に導入されており、少なくとも1つの内因性遺伝子の転写が、導入されたプロモーター活性の低下した核酸の制御下で起こるようになっている。
c) 少なくとも1つの内因性遺伝子の発現を調節する、少なくとも1つの請求項2または3に記載の内因性発現ユニットの微生物内での比発現活性を、野生型と比較して改変させる、または
d) 請求項2または3に記載の発現ユニットにより、または実施形態a)に従って比発現活性を改変させた請求項2または3に記載の発現ユニットにより、該発現ユニットに対して異種である遺伝子の微生物内での発現を調節する、
ことによるものである。
d1) 適宜に比発現活性を改変させた1以上の請求項2または3に記載の発現ユニットを微生物のゲノム中に導入して、1以上の内因性遺伝子の発現が、導入された発現ユニットの制御下で起こるようにする、または
d2) 1以上の遺伝子を微生物のゲノム中に導入して、1以上の導入された遺伝子の発現が、適宜に比発現活性を改変させた請求項2または3に記載の内因性発現ユニットの制御下で起こるようにする、または
d3) 適宜に比発現活性を改変させた請求項2または3に記載の発現ユニットおよび機能的に連結された1以上の発現すべき核酸を含んでなる1以上の核酸構築物を微生物中に導入する。
ch) 内因性遺伝子の発現を調節する、少なくとも1つの請求項2または3に記載の内因性発現ユニットの微生物内での比発現活性が、野生型と比較して増加している、または
dh) 発現ユニットに対して異種である遺伝子の微生物内での発現が、請求項2または3に記載の発現ユニットによりもしくは実施形態a)に従って比発現活性を増加させた請求項2または3に記載の発現ユニットにより調節されている。
dh1) 適宜に比発現活性を増加させた1以上の請求項2または3に記載の発現ユニットを微生物のゲノム中に導入して、1以上の内因性遺伝子の発現が、導入された発現ユニットの制御下で起こるようにする、または
dh2) 1以上の遺伝子を微生物のゲノム中に導入して、1以上の導入された遺伝子の発現が、適宜に比発現活性を増加させた請求項2または3に記載の内因性発現ユニットの制御下で起こるようにする、または
dh3) 適宜に比発現活性を増加させた請求項2または3に記載の発現ユニットおよび機能的に連結された1以上の発現すべき核酸を含んでなる1以上の核酸構築物を微生物中に導入する。
cr) 少なくとも1つの内因性遺伝子の発現を調節する、請求項2または3に記載の少なくとも1つの内因性発現ユニットの微生物内での比発現活性が、野生型と比較して低下している、または
dr) 低下した発現活性の低下した請求項2または3に記載の1以上の発現ユニットが微生物のゲノム中に導入されており、少なくとも1つの内因性遺伝子の発現が、導入された発現ユニットの制御下で起こるようになっている。
ATCC:American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)
FERM:Fermentation Research Institute(Chiba, Japan)
NRRL:ARS Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory(Peoria, IL, USA)
CECT:Coleccion Espanola de Cultivos Tipo(Valencia, Spain)
NCIMB:National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd.(Aberdeen, UK)
CBS:Centraalbureau voor Schimmelcultures(Baarn, NL)
NCTC:National Collection of Type Cultures(London, UK)
DSMZ:Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(Braunschweig, Germany)
アミノ酸は全てのタンパク質の基本的な構成単位を構成しており、従って正常な細胞機能に必須である。用語「アミノ酸」は当技術分野で公知である。20種が存在するタンパク原性アミノ酸はタンパク質の構成単位として役目を果たし、タンパク質中でこれらのアミノ酸は互いにペプチド結合で連結しているが、非タンパク原性アミノ酸(数百種が公知である)は通常タンパク質中に存在しない(Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol.A2, pp.57-97 VCH: Weinheim (1985)を参照)。アミノ酸はDまたはL立体配置でありうるが、通常天然のタンパク質中に見出されるタイプはL-アミノ酸だけである。20種のタンパク原性アミノ酸のそれぞれの生合成および分解経路は、原核生物および真核生物の両方の細胞においてよく特徴付けられている(例えば、Stryer, L. Biochemistry, 第3版, pp. 578-590 (1988)を参照)。「必須」アミノ酸(ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファンおよびバリン)は、その生合成の複雑さ故に食品から摂取する必要があるのでこのように呼ばれているが、これらの必須アミノ酸は単純な生合成経路により他の11種の「非必須」アミノ酸(アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリンおよびチロシン)に変換される。高等動物はこれらのアミノ酸のいくつかを合成する能力を有するが、必須アミノ酸は、正常なタンパク質合成が行われるように、食品により摂取しなければならない。
ビタミン、補因子および栄養補助食品は別の分子グループを構成している。高等動物はこれらの分子を合成する能力を喪失しているので、これらの摂取を必要とするが、これらは細菌などの他の生物により容易に合成される。これらの分子は、生理活性分子それ自体または生理活性物質の前駆体のいずれかであって、いくつかの代謝経路において電子担体または中間体として作用する。これらの化合物はまた、その栄養的価値に加えて、着色剤、酸化防止剤および触媒またはその他の加工助剤として重要な産業上の価値を有する(これらの化合物の構造、活性および産業上の応用については、例えば、Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 「ビタミン(Vitamins)」, vol. A27, pp. 443-613, VCH: Weinheim、1996を参照)。用語「ビタミン」は当技術分野で公知であって、正常に機能するには生物にとって必要であるが、その生物自体によっては合成され得ない栄養素を含む。ビタミンのグループは補因子および栄養補助食品化合物を含んでもよい。用語「補因子」には、正常な酵素活性の存在に必要とされる非タンパク質化合物が含まれる。これらの化合物は有機物であっても無機物であってもよく、本発明の補因子分子は好ましくは有機物である。用語「栄養補助食品」には、植物および動物、とりわけヒトの健康を増進する食品添加物が含まれる。かかる分子の例は、ビタミン、酸化防止剤、ならびにある種の脂質(例えば高度不飽和脂肪酸)である。
プリンとピリミジン代謝のための遺伝子およびそれらの対応するタンパク質は、新生物疾患およびウイルス感染の療法のための重要な標的である。用語「プリン」または「ピリミジン」は、核酸、補酵素およびヌクレオチドの構成成分である窒素塩基を含む。用語「ヌクレオチド」は、窒素塩基、五炭糖(RNAの糖はリボース、DNAの糖はD-デオキシリボース)およびリン酸を含んでなる、核酸分子の基本構成単位を構成する。用語「ヌクレオシド」はヌクレオチドの前駆体として作用するが、ヌクレオチドと対照的にリン酸単位を含まない分子である。核酸分子を形成するためのこれらの分子の生合成またはそれらの移動を抑制することによって、RNAおよびDNA合成を抑制することが可能である。癌性細胞におけるこの活性の標的化した抑制によって、腫瘍細胞の分裂能および複製能を抑制することが可能である。
トレハロースはα,α-1,1結合を介して互いに連結された2つのグルコース分子から成る。トレハロースは通常、食品産業において甘味剤として、乾燥または凍結食品へのおよび飲料への添加剤として使用される。しかし、トレハロースはまた、医薬品産業、化粧品およびバイオテクノロジー産業においても使用される(例えば、Nishimotoら, (1998) 米国特許第5 759 610号;Singer, M.A.およびLindquist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467;Paiva, C.L.A.およびPanek, A.D. Biotech Ann. Rev. 2 (1996) 293-314;ならびにShiosaka, M. FFIJ. Japan 172 (1997) 97-102を参照)。トレハロースは多数の微生物の酵素により生産されて自然な方法で周囲の培地中に放出されるので、培地から当技術分野で公知の方法により単離することができる。
ch) 内因性遺伝子の発現を調節する少なくとも1つの本発明の内因性発現ユニットの微生物内での比発現活性が、野生型と比較して増加しているか、または
dh) 発現ユニットに対して異種である遺伝子の微生物内での発現が、本発明の発現ユニットにより、もしくは実施形態ch)に従って比発現活性を増加させた発現ユニットにより調節されており、そして
前記遺伝子がアスパラギン酸キナーゼをコードする核酸、アスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする核酸、ジヒドロジピコリン酸シンテターゼをコードする核酸、ジヒドロジピコリン酸還元酵素をコードする核酸、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする核酸、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸、トリオースリン酸イソメラーゼをコードする核酸、転写レギュレーターLuxRをコードする核酸、転写レギュレーターLysR1をコードする核酸、転写レギュレーターLysR2をコードする核酸、リンゴ酸-キノン酸化還元酵素をコードする核酸、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、トランスケトラーゼをコードする核酸、トランスアルドラーゼをコードする核酸、リシンエクスポーターをコードする核酸、ビオチンリガーゼをコードする核酸、アルギニル-tRNAシンテターゼをコードする核酸、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼをコードする核酸、タンパク質OpcAをコードする核酸、1-ホスホフルクトキナーゼをコードする核酸、および6-ホスホフルクトキナーゼをコードする核酸からなる群より選択される。
dh1) 適宜に比発現活性を増加させた1以上の本発明の発現ユニットを微生物のゲノム中に導入して、1以上の内因性遺伝子の発現が、導入された発現ユニットの制御下で起こるようにする、または
dh2) 1以上のこれらの遺伝子を微生物のゲノム中に導入して、1以上の導入された遺伝子の発現が、適宜に比発現活性を増加させた本発明の内因性発現ユニットの制御下で起こるようにする、または
dh3) 適宜に比発現活性を増加させた本発明の発現ユニットおよび機能的に連結された1以上の発現すべき核酸を含んでなる1以上の核酸構築物を微生物中に導入する。
ch) 内因性遺伝子の発現を調節する少なくとも1つの本発明の内因性発現ユニットの微生物内での比発現活性が、野生型と比較して増加しているか、または
dh) 発現ユニットに対して異種である遺伝子の微生物内での発現が、本発明の発現ユニットにより、もしくは実施形態ch)に従って比発現活性を増加させた発現ユニットにより調節されており、そして
前記遺伝子がアスパラギン酸キナーゼをコードする核酸、アスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸、ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする核酸、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする核酸、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸、トリオースリン酸イソメラーゼをコードする核酸、ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸、シスタチオニンγ-シンターゼをコードする核酸、シスタチオニンβ-リアーゼをコードする核酸、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする核酸、O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする核酸、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素をコードする核酸、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼをコードする核酸、ホスホセリンホスファターゼをコードする核酸、セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする核酸、システインシンターゼIをコードする核酸、システインシンターゼII活性をコードする核酸、補酵素B12依存性メチオニンシンターゼ活性をコードする核酸、補酵素B12非依存性メチオニンシンターゼ活性をコードする核酸、硫酸アデニリルトランスフェラーゼ活性をコードする核酸、ホスホアデノシンホスホ硫酸還元酵素活性をコードする核酸、フェレドキシン-亜硫酸還元酵素活性をコードする核酸、フェレドキシンNADPH-還元酵素活性をコードする核酸、フェレドキシン活性をコードする核酸、硫酸還元のタンパク質RXA077をコードする核酸、硫酸還元のタンパク質RXA248をコードする核酸、硫酸還元のタンパク質RXA247をコードする核酸、RXA0655レギュレーターをコードする核酸、およびRXN2910レギュレーターをコードする核酸からなる群より選択される。
dh1) 適宜に比発現活性を増加させた1以上の本発明の発現ユニットを微生物のゲノム中に導入して、1以上の内因性遺伝子の発現が、導入された発現ユニットの制御下で起こるようにする、または
dh2) 1以上の遺伝子を微生物のゲノム中に導入して、1以上の導入された遺伝子の発現が、適宜に比発現活性を増加させた本発明の内因性発現ユニットの制御下で起こるようにする、または
dh3) 適宜に比発現活性を増加させた本発明の発現ユニットおよび機能的に連結された1以上の発現すべき核酸を含んでなる1以上の核酸構築物を微生物中に導入する。
ch) 内因性遺伝子の発現を調節する少なくとも1つの本発明の内因性発現ユニットの微生物内での比発現活性が、野生型と比較して増加しているか、または
dh) 発現ユニットに対して異種である遺伝子の微生物内での発現が、本発明の発現ユニットにより、もしくは実施形態ch)に従って比発現活性を増加させた発現ユニットにより調節されており、そして
前記遺伝子がアスパラギン酸キナーゼをコードする核酸、アスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、3-ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする核酸、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸、トリオースリン酸イソメラーゼをコードする核酸、ホモセリンキナーゼをコードする核酸、トレオニンシンターゼをコードする核酸、トレオニンエクスポーター担体をコードする核酸、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、トランスアルドラーゼをコードする核酸、トランスケトラーゼをコードする核酸、リンゴ酸-キノン酸化還元酵素をコードする核酸、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸、リシンエクスポーターをコードする核酸、ビオチンリガーゼをコードする核酸、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする核酸、トレオニン流出タンパク質をコードする核酸、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼをコードする核酸、OpcAタンパク質をコードする核酸、1-ホスホフルクトキナーゼをコードする核酸、6-ホスホフルクトキナーゼをコードする核酸、およびホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする核酸からなる群より選択される。
dh1) 適宜に比発現活性を増加させた1以上の本発明の発現ユニットを微生物のゲノム中に導入して、1以上の内因性遺伝子の発現が、導入された発現ユニットの制御下で起こるようにする、または
dh2) 1以上の遺伝子を微生物のゲノム中に導入して、1以上の導入された遺伝子の発現が、適宜に比発現活性を増加させた本発明の内因性発現ユニットの制御下で起こるようにする、または
dh3) 適宜に比発現活性を増加させた本発明の発現ユニットおよび機能的に連結された1以上の発現すべき核酸を含んでなる1以上の核酸構築物を微生物中に導入する。
・同時抑制を誘導する少なくとも1つのセンスリボ核酸配列の導入、またはその発現を確実にする発現カセットの導入;
・対応する遺伝子、RNAもしくはタンパク質に対する少なくとも1つのDNA-もしくはタンパク質-結合因子の導入、またはその発現を確実にする発現カセットの導入、
・RNA分解を引き起こす少なくとも1つのウイルス核酸配列の導入、またはその発現を確実にする発現カセットの導入;
・遺伝子の機能の喪失(例えば、停止コドンの生成、または読み枠のシフト)を、例えば挿入、欠失、逆位もしくは突然変異を遺伝子内にもたらすことよって、生じさせる少なくとも1つの構築物の導入(相同的組換えによる所望の標的遺伝子への標的化された挿入により、または標的遺伝子に対する配列特異的ヌクレアーゼの導入により、ノックアウト突然変異体を作製することが可能であり好適である);
・プロモーター活性を低下させたプロモーターまたは発現活性を低下させた発現ユニットの導入。
異種発現ユニットPgro(配列番号2)を用いる、pycA遺伝子の過剰発現用の組込み型プラスミドの作製
シャペロニンGroESをコードする遺伝子のプロモーターを増幅するために、次のオリゴヌクレオチドを設計した:
配列番号5:
gro3: 5'-gccgcagcaaacccagtag-3'
配列番号6:
gro11: 5'-agtcgacacgatgaatccctccatgagaaaa-3'
これらのプライマーをC. glutamicum ATCC 13032由来の染色体DNAとともにPCR反応に使用した。この手法を用いて、予想される427bpのサイズに相当するDNA断片を増幅することができた。
配列番号7:
pyc6:5'-tttttctcatggagggattcatcgtgtcgactcacacatcttcaacgcttccag-3'
配列番号8:
pyc3:5'-cccgcagcaacgcacgcaagaaa-3'
これらのプライマーをC. glutamicum ATCC13032由来の染色体DNAとともにPCR反応に使用した。この手法を用いて、予想される1344bpのサイズに相当するDNA断片を増幅することができた。
配列番号9:
gro12:5'-gcattcgcgccgctcgtaacta-3'
配列番号10:
pyc11:5'-ggttcccgcgccctggtaa-3'
を用いた。
配列番号12:
pyc14:5'-ccggcgaagtgtctgctcgcgtga-3'
配列番号13:
pyc15:5'-accccgccccagtttttc-3'
これらのプライマーをC. glutamicum ATCC13032由来の染色体DNAとともにPCR反応に使用した。この手法を用いて、予想される487bpのサイズに相当するDNA断片を増幅することができた。このDNA断片をベクターpCR2.1(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany)中にクローニングした。次いで、593bpのSpeI/XbaI断片を(制限酵素 NheIで前もって消化しておいた)ベクターpK19 mob sacB Pgro/pycA中にクローニングした。得られたプラスミドをpK19 mob sacB Pgro pycA + US(配列番号14)と命名した。このステップまで、全てのクローニングは大腸菌XL-1 Blue(Stratagene, Amsterdam, Netherlands)において実施した。
ベクターpCLiK5MCSの作製
最初に、ベクターpBR322の複製起点およびアンピシリン耐性をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によりオリゴヌクレオチドプライマー配列番号15および配列番号16を用いて増幅した:
配列番号15
5'-CCCGGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGTGAAATACCGCACAG-3'
配列番号16
5'-TCTAGACTCGAGCGGCCGCGGCCGGCCTTTAAATTGAAGACGAAAGGGCCTCG-3'
オリゴヌクレオチドプライマー配列番号15は、pBR322に相補的な配列に加えて、5'-3'方向にSmaI、BamHI、NheIおよびAscIの制限酵素切断部位を含有し、そしてオリゴヌクレオチドプライマー配列番号16は、5'-3'方向にXbaI、XhoI、NotIおよびDraIの制限酵素切断部位を含有する。PCR反応はPfu Turboポリメラーゼ(Stratagene, La Jolla, USA)を用いてInnisら(「PCRプロトコル:方法と応用の手引き(PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications)」, Academic Press (1990))などに記載の標準方法により行った。得られるおよそ2.1kbのサイズのDNA断片を、DNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR(Amersham Pharmacia, Freiburg)を用いてメーカーの使用説明書に従って精製した。DNA断片の平滑末端同士を、迅速DNAライゲーションキット(Roche Diagnostics, Mannheim)を用いてメーカーの使用説明書に従ってライゲートし、このライゲーション混合物をコンピテント大腸菌XL-1 Blue(Stratagene, La Jolla, USA)中に、Sambrookら(「分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning. A Laboratory Manual)」, Cold Spring Harbor (1989)に記載の標準方法により形質転換した。プラスミドを保持する細胞を、アンピシリン(50μg/ml)を含有するLB寒天(Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にまいて選択した。
配列番号17:
5'-GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGA-3'
配列番号18:
5'-GAGAGGCGCGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCAGCA-3'
オリゴヌクレオチドプライマー配列番号17は、pWLT1に相補的な配列に加えて、5'-3'方向にXbaI、SmaI、BamHI、NheIの制限酵素切断部位を含有し、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号18は、5'-3'方向にAscIおよびNheIの制限酵素切断部位を含有する。PCR反応はPfuTurboポリメラーゼ(Stratagene, La Jolla, USA)を用いてInnisら(「PCRプロトコル:方法と応用の手引き(PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications)」, Academic Press (1990))などに記載の標準方法により行った。得られるほぼ1.3kbのサイズのDNA断片を、DNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR(Amersham Pharmacia, Freiburg)を用いてメーカーの使用説明書に従って精製した。DNA断片を制限酵素XbaIおよびAscI(New England Biolabs, Beverly, USA)で切断し、次いで再びDNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR(Amersham Pharmacia, Freiburg)を用いてメーカーの使用説明書に従って精製した。ベクターpCLiK1を同様に制限酵素XbaIおよびAscIで切断し、アルカリホスファターゼ(I (Roche Diagnostics, Mannheim))を用いてメーカーの使用説明書に従って脱リン酸した。0.8%アガロースゲルでの電気泳動の後、線状化したベクター(ほぼ2.1kb)をDNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR(Amersham Pharmacia, Freiburg)を用いてメーカーの使用説明書に従って単離した。このベクター断片を切断したPCR断片と、迅速DNAライゲーションキット(Roche Diagnostics, Mannheim)を用いてメーカーの使用説明書に従ってライゲートし、ライゲーション混合物をコンピテント大腸菌XL-1 Blue(Stratagene, La Jolla, USA)中にSambrookら(Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989))に記載の標準方法により形質転換した。プラスミドを保持する細胞を、アンピシリン(50μg/ml)およびカナマイシン(20μg/ml)を含有するLB寒天(Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にまいて選択した。
配列番号19:
5'-GAGAGGGCGGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3'
配列番号20:
5'-GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3'
オリゴヌクレオチドプライマー配列番号19および配列番号20は、pWLQ2に相補的な配列に加えて、制限酵素NotIの切断部位を含有する。PCR反応はPfuTurboポリメラーゼ(Stratagene, La Jolla, USA)を用いてInnisら(「PCRプロトコル:方法と応用の手引き(PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications)」, Academic Press (1990))などに記載の標準方法により行った。得られるほぼ2.7kbのサイズのDNA断片を、DNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR(Amersham Pharmacia, Freiburg)を用いてメーカーの使用説明書に従って精製した。DNA断片を制限酵素NotI(New England Biolabs, Beverly, USA)を用いて切断し、次いで再びDNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR(Amersham Pharmacia, Freiburg)を用いてメーカーの使用説明書に従って精製した。ベクターpCLiK3を同様に制限酵素NotIで切断し、アルカリホスファターゼ(I (Roche Diagnostics, Mannheim))を用いてメーカーの使用説明書に従って脱リン酸した。0.8%アガロースゲルでの電気泳動の後、線状化したベクター(ほぼ2.3kb)をDNAおよびゲルバンド精製キットGFXTMPCR(Amersham Pharmacia, Freiburg)を用いてメーカーの使用説明書に従って単離した。このベクター断片を切断したPCR断片と、迅速DNAライゲーションキット(Roche Diagnostics, Mannheim)を用いてメーカーの使用説明書従ってライゲートし、ライゲーション混合物をコンピテント大腸菌XL-1 Blue(Stratagene, La Jolla, USA)中にSambrookら(Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989))に記載の標準方法により形質転換した。プラスミドを保持する細胞を、カナマイシン(20μg/ml)を含有するLB寒天(Lennox, 1955, Virology, 1:190)上にまいて選択した。
配列番号21:
5'-TCGAATTTAAATCTCGAGAGGCCTGACGTCGGGCCCGGTACCACGCGTCATAT
GACTAGTTCGGACCTAGGGATATCGTCGACATCGATGCTCTTCTGCGTTAATTAAC
AATTGGGATCCTCTAGACCCGGGATTTAAAT-3'
配列番号22:
5'-GATCATTTAAATCCCGGGTCTAGAGGATCCCAATTGTTAATTAACGCAGAAGAG
CATCGATGTCGACGATATCCCTAGGTCCGAACTAGTCATATGACGCGTGGTACCG
GGCCCGACGTCAGGCCTCTCGAGATTTAAAT-3'
プラスミドPmetA metAの作製
染色体DNAはC. glutamicum ATCC 13032から、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828に記載のように調製した。非コード5'領域を含むmetA遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってInnisら(1990)「PCRプロトコル:方法と応用の手引き(PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications)」, Academic Press に記載の標準方法により、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号24および配列番号25、テンプレートとしての染色体DNAならびにPfu Turboポリメラーゼ(Stratagene)を用いて増幅した:
配列番号24
5'-GCGCGGTACCTAGACTCACCCCAGTGCT-3'
および
配列番号25
5'-CTCTACTAGTTTAGATGTAGAACTCGATGT-3'
プラスミドpCLiK5MCS Pgro metAの作製
染色体DNAをC. glutamicum ATCC 13032から、Tauchら (1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら (1994) Microbiology 140:1817-1828に記載のように調製した。遺伝子GroES(Pgro)の非コード5'領域(発現ユニットの領域)由来のほぼ200塩基対のDNA断片は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってInnisら(1990)「PCRプロトコル:方法と応用の手引き(PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications)」, Academic Press に記載の標準方法により、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号27および配列番号28、テンプレートとしての染色体DNAならびにPfu Turboポリメラーゼ(Stratagene)を用いて増幅した:
配列番号27
5'-GAGACTCGAGCGGCTTAAAGTTTGGCTGCC-3'
および
配列番号28
5'-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATGATGAATCCCTCCATGAG-3'
配列番号29
5'-CCCACCCTCGCGCCTTCAG-3'
および
配列番号30
5'-CTGGGTACATTGCGGCCC-3'
MetA活性
株Corynebacterium glutamicum ATCC13032を、プラスミドpClik5 MCS、pClik MCS PmetA metA、pCLiK5MCS PGroESmetAのそれぞれを用いて、Lieblら(1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303に記載の方法により形質転換した。形質転換混合物を、プラスミド含有細胞を選択するために20mg/l カナマイシンをさらに含有するCMプレート上にまいた。得られるKan耐性クローンを拾って単離した。
開始コドンをもたないプラスミドpClik5MCS metAの作製
染色体DNAをC. glutamicum ATCC 13032から、Tauchら(1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら(1994) Microbiology 140:1817-1828に記載のように調製した。オリゴヌクレオチドプライマー配列番号32および配列番号33、テンプレートとしての染色体DNAならびにPfu Turboポリメラーゼ(Stratagene)をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)においてInnisら(1990)「PCRプロトコル:方法と応用の手引き(PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications)」, Academic Press に記載の標準方法により用いて、groEL遺伝子の終止領域を増幅した:
配列番号32
5'-GGATCTAGAGTTCTGTGAAAAACACCGTG-3'
配列番号33
5'-GCGACTAGTGCCCCACAAATAAAAAACAC-3'
配列番号35
5'-GAGACATATGCCCACCCTCGCGCCTTCAGG-3'
および
配列番号36
5'-CTCTACTAGTTTAGATGTAGAACTCGATGT-3'
異なるRBS配列および開始コドンからのmetAの距離のために異なる比発現活性を有するPgro発現ユニットの構築
染色体DNAをC. glutamicum ATCC 13032から、Tauchら(1995) Plasmid 33:168-179またはEikmannsら(1994) Microbiology 140:1817-1828に記載のように調製した。オリゴヌクレオチドプライマー配列番号38から配列番号43、テンプレートとしての染色体DNAならびにPfu Turboポリメラーゼ(Stratagene)をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)においてInnisら(1990)「PCRプロトコル:方法と応用の手引き(PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications)」, Academic Press に記載の標準方法により用いて、様々な発現ユニットを増幅した。この場合には、オリゴヌクレオチドプライマー1701(配列番号38)をセンスプライマーとして使用し、その他のオリゴヌクレオチドプライマーと組み合わせた。
オリゴヌクレオチドプライマー1701
5'-GAGACTCGAGCGGCTTAAAGTTTGGCTGCC-3'
配列番号39
オリゴヌクレオチドプライマー1828
5'-ctctcatatgcAATCCCTCCATGAGAAAAATT-3'
配列番号40
オリゴヌクレオチドプライマー1831
5'-ctctcatatgcgcggccgcAATCCCTCCATGAGAAAAATT-3'
配列番号41
オリゴヌクレオチドプライマー1832
5'-ctctcatatgcAAtctctccATGAGAAAAATTTTGTGTG-3'
配列番号42
オリゴヌクレオチドプライマー1833
5'-ctctcatatgcAAtctcctcATGAGAAAAATTTTGTGTG-3'
配列番号43
オリゴヌクレオチドプライマー1834
5'-ctctcatatgcAAtcccttcATGAGAAAAATTTTGTGTG-3'
Claims (12)
- (A)配列番号1の核酸配列を含むプロモーター活性を有する核酸、または(B)配列番号1の配列からヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失により誘導され、かつ配列番号1の配列に対して核酸レベルで少なくとも90%の同一性を有する配列を含むプロモーター活性を有する核酸、または(C)配列番号1の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含むプロモーター活性を有する核酸により、微生物内での遺伝子の転写を調節することによって、該微生物における該遺伝子の転写速度を、野生型と比較して改変させるまたは生起させる方法であって、該遺伝子がプロモーター活性を有する該核酸に対して異種である、上記方法。
- 請求項1に記載のプロモーター活性を有する該核酸により、微生物内での遺伝子の転写を調節することが、
b1) 請求項1に記載のプロモーター活性を有する1以上の該核酸を微生物のゲノムに導入して、1以上の内因性遺伝子の転写が、該プロモーター活性を有する導入された核酸の制御下で起こるようにする、または
b2) 1以上の遺伝子を微生物のゲノムに導入して、導入された1以上の遺伝子の転写が、請求項1に記載のプロモーター活性を有する内因性核酸の制御下で起こるようにする、または
b3) 請求項1に記載のプロモーター活性を有する核酸および機能的に連結された1以上の転写すべき核酸を含んでなる1以上の核酸構築物を微生物中に導入する、
ことによって達成される、請求項1に記載の方法。 - 微生物における遺伝子の転写速度を、野生型と比較して増加させるまたは生起させるために、請求項1に記載のプロモーター活性を有する核酸により、該プロモーター活性を有する核酸に対して異種である遺伝子の微生物内での転写を調節する、請求項1または2に記載の方法。
- 請求項1に記載のプロモーター活性を有する核酸により、微生物内での遺伝子の転写を調節することが、
bh1) 請求項1に記載のプロモーター活性を有する1以上の該核酸を微生物のゲノム中に導入して、1以上の内因性遺伝子の転写が、該プロモーター活性を有する導入された核酸の制御下で起こるようにする、または
bh2) 1以上の遺伝子を微生物のゲノム中に導入して、1以上の導入された遺伝子の転写が、請求項1に記載のプロモーター活性を有する内因性核酸の制御下で起こるようにする、または
bh3) 請求項1に記載のプロモーター活性を有する核酸、および機能的に連結された1以上の転写すべき核酸を含んでなる1以上の核酸構築物を微生物に導入する、
ことによって達成される、請求項3に記載の方法。 - 前記遺伝子が、タンパク原性および非タンパク原性アミノ酸の生合成経路からのタンパク質をコードする核酸、ヌクレオチドおよびヌクレオシドの生合成経路からのタンパク質をコードする核酸、有機酸の生合成経路からのタンパク質をコードする核酸、脂質および脂肪酸の生合成経路からのタンパク質をコードする核酸、ジオールの生合成経路からのタンパク質をコードする核酸、炭水化物の生合成経路からのタンパク質をコードする核酸、芳香族化合物の生合成経路からのタンパク質をコードする核酸、ビタミンの生合成経路からのタンパク質をコードする核酸、補因子の生合成経路からのタンパク質をコードする核酸、および酵素の生合成経路からのタンパク質をコードする核酸からなる群より選択され、その場合、該遺伝子はさらなる調節エレメントを含んでいてもよい、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- アミノ酸の生合成経路からのタンパク質が、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンテターゼ、ジヒドロジピコリン酸還元酵素、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、転写レギュレーターLuxR、転写レギュレーターLysR1、転写レギュレーターLysR2、リンゴ酸-キノン酸化還元酵素、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼ、シスタチオニンγ-シンターゼ、シスタチオニンβ-リアーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、ホスホセリンホスファターゼ、セリンアセチルトランスフェラーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼ、トレオニンエクスポーターキャリアー、トレオニンデヒドラターゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、リシンエクスポーター、ビオチンリガーゼ、システインシンターゼI、システインシンターゼII、補酵素B12依存性メチオニンシンターゼ、補酵素B12非依存性メチオニンシンターゼ、硫酸アデニリルトランスフェラーゼサブユニット1および2、ホスホアデノシン-ホスホ硫酸還元酵素、フェレドキシン-亜硫酸還元酵素、フェレドキシンNADP還元酵素、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、RXA00655レギュレーター、RXN2910レギュレーター、アルギニル-tRNAシンテターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、トレオニン流出タンパク質、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ、硫酸還元のタンパク質RXA077、硫酸還元のタンパク質RXA248、硫酸還元のタンパク質RXA247、タンパク質OpcA、1-ホスホフルクトキナーゼ、および6-ホスホフルクトキナーゼからなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 遺伝的に改変された微生物であって、遺伝的改変が、少なくとも1つの遺伝子の転写速度を野生型と比較して改変させるかまたは生起させるものであり、かつ遺伝的改変が、(A)配列番号1の核酸配列を含むプロモーター活性を有する核酸、または(B)配列番号1の配列からヌクレオチドの置換、挿入もしくは欠失により誘導され、かつ配列番号1の配列に対して核酸レベルで少なくとも90%の同一性を有する配列を含むプロモーター活性を有する核酸、または(C)配列番号1の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含むプロモーター活性を有する核酸により、該プロモーター活性を有する核酸に対して異種である遺伝子の微生物内での転写を調節することによるものである、上記遺伝的に改変された微生物。
- 請求項7に記載のプロモーター活性を有する核酸により、遺伝子の微生物内での転写を調節することが、
b1) 請求項7に記載のプロモーター活性を有する1以上の核酸を微生物のゲノム中に導入して、1以上の内因性遺伝子の転写が、該プロモーター活性を有する導入された核酸の制御下で起こるようにする、または
b2) 1以上の遺伝子を微生物のゲノム中に導入して、1以上の導入された遺伝子の転写が、請求項7に記載のプロモーター活性を有する内因性核酸の制御下で起こるようにする、または
b3) 請求項7に記載のプロモーター活性を有する核酸および機能的に連結された1以上の転写すべき核酸を含んでなる1以上の核酸構築物を微生物中に導入する、
ことによって達成される、請求項7に記載の遺伝的に改変された微生物。 - 少なくとも1つの遺伝子の転写速度が、野生型と比較して増加しているかまたは生起されており、該プロモーター活性を有する核酸に対して異種である遺伝子の微生物内での転写が、請求項7に記載のプロモーター活性を有する核酸により調節されている、請求項7または8に記載の遺伝的に改変された微生物。
- プロモーター活性を有する核酸により、微生物内での遺伝子の転写を調節することが、
bh1) 請求項7に記載のプロモーター活性を有する1以上の核酸を微生物のゲノム中に導入して、1以上の内因性遺伝子の転写が、該プロモーター活性を有する導入された核酸の制御下で起こるようにする、または
bh2) 1以上の遺伝子を微生物のゲノム中に導入して、1以上の導入された遺伝子の転写が、請求項7に記載のプロモーター活性を有する内因性核酸の制御下で起こるようにする、または
bh3) 請求項7に記載のプロモーター活性を有する核酸および機能的に連結された1以上の転写すべき核酸を含んでなる1以上の核酸構築物を微生物中に導入する、
ことによって達成される、請求項9に記載の遺伝的に改変された微生物。 - 前記遺伝子が、タンパク原性および非タンパク原性アミノ酸の生合成経路からのタンパク質をコードする核酸、ヌクレオチドおよびヌクレオシドの生合成経路からのタンパク質をコードする核酸、有機酸の生合成経路からのタンパク質をコードする核酸、脂質および脂肪酸の生合成経路からのタンパク質をコードする核酸、ジオールの生合成経路からのタンパク質をコードする核酸、炭水化物の生合成経路からのタンパク質をコードする核酸、芳香族化合物の生合成経路からのタンパク質をコードする核酸、ビタミンの生合成経路からのタンパク質をコードする核酸、補因子の生合成経路からのタンパク質をコードする核酸および酵素の生合成経路からのタンパク質をコードする核酸からなる群より選択され、その場合、該遺伝子はさらなる調節エレメントを含んでいてもよい、請求項7〜10のいずれか1項に記載の遺伝的に改変された微生物。
- アミノ酸の生合成経路からのタンパク質が、アスパラギン酸キナーゼ、アスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンテターゼ、ジヒドロジピコリン酸還元酵素、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、転写レギュレーターLuxR、転写レギュレーターLysR1、転写レギュレーターLysR2、リンゴ酸-キノン酸化還元酵素、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、ホモセリンO-アセチルトランスフェラーゼ、シスタチオニンγ-シンターゼ、シスタチオニンβ-リアーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、O-アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ、ホスホセリンホスファターゼ、セリンアセチル-トランスフェラーゼ、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホモセリンキナーゼ、トレオニンシンターゼ、トレオニンエクスポーターキャリアー、トレオニンデヒドラターゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、リシンエクスポーター、ビオチンリガーゼ、システインシンターゼI、システインシンターゼII、補酵素B12依存性メチオニンシンターゼ、補酵素B12非依存性メチオニンシンターゼ、硫酸アデニリルトランスフェラーゼサブユニット1および2、ホスホアデノシン-ホスホ硫酸還元酵素、フェレドキシン-亜硫酸還元酵素、フェレドキシンNADP還元酵素、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、RXA00655レギュレーター、RXN2910レギュレーター、アルギニル-tRNAシンテターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、トレオニン流出タンパク質、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ、硫酸還元のタンパク質RXA077、硫酸還元のタンパク質RXA248、硫酸還元のタンパク質RXA247、タンパク質OpcA、1-ホスホフルクトキナーゼおよび6-ホスホフルクトキナーゼからなる群より選択される、請求項11に記載の遺伝的に改変された微生物。
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