KR100876655B1

KR100876655B1 - Ｐｇｒｏ 발현 유니트

Info

Publication number: KR100876655B1
Application number: KR1020067014365A
Authority: KR
Inventors: 부르크하드 크뢰거; 오스카 젤더; 코리나 클로프프로게; 하트빅 슈뢰더; 스테판 해프너
Original assignee: 백광산업 주식회사
Priority date: 2003-12-18
Filing date: 2004-12-15
Publication date: 2009-01-09
Also published as: EP1697524A1; CA2548306A1; JP2007536908A; WO2005059143A1; TW200533749A; CN1898388A; EP1921150A1; CY1114595T1; PL1921150T3; CN101230352B; DE10359595A1; KR20070004579A; US20090246836A1; CN101230352A; IN2008CH00439A; JP4808742B2; PT1921150E; EP1921150B1; JP2008237218A; ZA200605862B

Abstract

본 발명은 유전자 전사 및 발현을 조절하기 위한 핵산 서열의 사용, 상기 신규한 프로모터 및 발현 유니트, 유전자 전사 속도 및(또는) 발현 속도를 변경 또는 유발하는 방법, 상기 발현 유니트를 함유하는 발현 카세트, 변경 또는 유발된 전사 속도 및(또는) 발현 속도를 갖는 유전학적으로 변형된 미생물, 및 상기 유전학적으로 변형된 미생물을 배양함으로써 생합성 산물을 생산하기 위한 방법에 관한 것이다.

유전자 전사, 유전자 발현, 핵산 서열, 발현 유니트, 유전학적으로 변형된 미생물

Description

ＰＧＲＯ 발현 유니트 {PGRO EXPRESSION UNITS}

다양한 생합성 산물, 예를 들어 미세 화학물질, 예를 들어 특히 아미노산, 비타민 및 단백질은 자연 대사 과정에 의해 세포 내에서 생산되고 화장품, 사료, 식품 및 제약업을 포함하는 많은 산업 분야에서 사용된다. 미세 화학물질/단백질로서 총칭되는 이들 물질은 특히 유기산, 단백성 및 비단백성 아미노산, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드, 지질 및 지방산, 디올, 탄수화물, 방향족 화합물, 비타민 및 보조인자, 및 단백질 및 효소를 포함한다. 이들의 제조는 다량의 특정 바람직한 물질을 제조하고 분비하도록 개발된 세균을 배양함으로써 산업 규모로 가장 편리하게 일어난다. 상기 목적에 특히 적합한 유기체는 코리네형 세균, 그람-양성 비-병원성 세균이다.

아미노산은 코리네형 세균의 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)의 발효에 의해 제조될 수 있음이 공지되어 있다. 매우 중요하기 때문에, 생산 공정을 개선하는데 지속적인 작업이 이루어진다. 공정 개선은 발효 기술 수단, 예를 들어, 교반 및 산소 공급 또는 영양 배지의 조성, 예를 들어 발효 동안 당 농도 또는 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피 또는 분무 건조에 의한 생성물을 제공하기 위한 마무리 처리, 또는 미생물 자체의 고유한 성능 특성에 관련될 수 있다.

재조합 DNA 기술의 방법이 마찬가지로 개별 유전자를 증폭시키고 미세 화학물질/단백질의 생산에 대한 효과를 연구함으로써, 미세 화학물질/단백질을 생산하는 코리네박테리움 균주의 개선을 위해 수년간 사용되었다.

미세 화학물질, 아미노산 또는 단백질을 제조하기 위한 공정을 개발하기 위한, 또는 미세 화학물질, 아미노산 또는 단백질을 생산하기 위한 기존 공정의 생산성을 증가시키거나 개선하기 위한 다른 방법은 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시키거나 변경시키고(시키거나) 적합한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 RNA의 번역에 영향을 끼치는 것이다. 이점에서, 영향을 끼치는 것은 유전자의 발현의 증가, 감소, 또는 다른 파라미터, 예를 들어 연대학상 발현 패턴을 포함할 수 있다.

세균 조절 서열의 다양한 구성분이 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다. 레귤레이터 (regulator)에 대한 결합 부위 (또한 오퍼레이터 (operator)로 불림), RNA 폴리머라제 전효소에 대한 결합 부위 (또한 -35 및 - 10 영역으로 불림), 및 리보좀 16S RNA에 대한 결합 부위 (또한 리보좀 결합 부위 또는 달리 샤인-달가르노 (Shine-Dalgarno) 서열로 불림) 사이에 구별이 존재한다.

리보좀 결합 부위의 서열 (또한 샤인-달가르노 서열로 불림)은 본 발명의 목적에서 번역 개시 코돈 상류의 20 베이스 이하에 위치하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.

문헌 (E. coli and S. typhimurium, Neidhardt F.C. 1995 ASM Press)에 샤인-달가르노 서열의 폴리뉴클레오티드 서열의 조성, 염기의 서열 스트링뿐만 아니라 샤인-달가르노 서열 내에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열의 거리도 또한 번역 개시 속도에 상당한 영향을 갖는다고 보고된 바 있다.

프로모터 활성을 갖는 핵산 서열은 다양한 방법으로 mRNA의 형성에 영향을 끼칠 수 있다. 그 활성이 유기체의 생리학적 성장기에 의존하는 프로모터는 구성적 (constitutive)으로 불린다. 다른 프로모터는 다시 외부 화학적 및 물리적 자극, 예를 들어 산소, 대사체, 열, pH 등에 반응한다. 다른 것은 상이한 성장기에서 그의 활성이 강하게 의존하는 것을 보인다. 예를 들어, 미생물의 지수적 성장기 동안, 또는 달리 정확하게는 미생물 성장의 정지기에서 특히 현저한 활성을 보이는 프로모터가 문헌에 설명되어 있다. 프로모터의 두 특성은 대사 경로에 따라 미세 화학물질 및 단백질의 생산을 위한 생산성에 유익한 효과를 가질 수 있다.

예를 들어, 성장 동안 유전자의 발현을 스위치 오프 (switch off)하지만, 최적 성장 후 스위치 온 (switch on)시키는 프로모터가 대사체의 생산을 제어하는 유전자를 조절하기 위해 사용될 수 있다. 따라서 변형된 균주는 출발 균주와 동일한 성장 파라미터를 나타내지만, 세포당 보다 많은 생성물을 생산한다. 이러한 종류의 변형은 역가 (생성물 g/리터) 및 C 수율 (생성물 g/C원 g)을 모두 증가시킬 수 있다.

코리네박테리움종에서 유전자 발현을 증가시키거나 감소시키기 위해 사용될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 단리하는 것은 이미 가능하다. 이들 조절된 프로모터는 세포의 내부 및(또는) 외부 조건에 따라 유전자가 전사되는 속도를 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 몇몇 경우에, 인듀서 (inducer)로서 공지된 특정 인자의 존재가 프로모터로부터 전사 속도를 자극할 수 있다. 인듀서는 프로모터로부터 전사에 직접적으로 또는 간접적으로 영향을 끼칠 수 있다. 서프레서 (suppressor)로서 공지된 다른 종류의 인자는 프로모터로부터 전사를 감소시키거나 억제할 수 있다. 인듀서와 같이, 서프레서는 또한 직접적으로 또는 간접적으로 작용할 수 있다. 그러나, 온도 조절된 프로모터가 또한 공지되어 있다. 따라서 상기 프로모터의 전사 수준은 예를 들어, 성장 온도를 세포의 정상 성장 온도를 초과하여 증가시킴으로써 증가되거나 감소될 수 있다.

지금까지 씨. 글루타미쿰 (C. glutamicum)으로부터 적은 수의 프로모터가 설명되었다. 씨. 글루타미쿰으로부터 말레이트 신타제 유전자의 프로모터가 DE 4440118에 설명되었다. 이들 프로모터는 단백질을 코딩하는 구조 유전자의 상류에 삽입되었다. 상기 구성체를 코리네형 세균 내로 형질전환시킨 후, 프로모터의 하류에 구조 유전자의 발현 조절이 존재한다. 구조 유전자의 발현은 적절한 인듀서를 배지에 첨가하자마자 유발된다.

문헌 [Reinscheid et al., Microbiology 145: 503 (1999)]에서는 씨. 글루타미쿰으로부터 pta-ack 프로모터와 리포터 유전자 (클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제) 사이의 전사 융합체를 설명한다. 상기 전사 융합체를 포함하는 씨. 글루타미쿰의 세포는 아세테이트 함유 배지 상의 성장에 대해 리포터 유전자의 증가된 발현을 나타냈다. 이와 대조적으로, 글루코스 상에서 성장된 형질전환된 세포는 상기 리포터 유전자의 증가된 발현을 나타내지 않았다.

문헌 [Pa'tek et al., Microbiology 142: 1297 (1996)]에서는 씨. 글루타미쿰 세포 내에서 리포터 유전자의 발현을 향상시킬 수 있는 씨. 글루타미쿰으로부터의 일부 DNA 서열을 설명한다. 이들 서열은 씨. 글루타미쿰 프로모터에 대한 컨센서스 (consensus) 서열을 규정하기 위해 함께 비교되었다.

유전자 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있는 씨. 글루타미쿰으로부터 추가의 DNA 서열이 국제 출원 공개 WO 02/40679에 기재되어 있다. 이들 단리된 폴리뉴클레오티드는 유전자 발현을 증가시키거나 감소시키기 위해 사용될 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 발현 유니트를 나타낸다. 상기 특허 공개에서는 그 위에서 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 발현 유니트가 이종성 유전자와 연합되는 재조합 플라스미드를 부가적으로 설명한다. 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 프로모터를 이종성 유전자와 융합시키는 상기 특허 공개에 기재된 방법은 특히 아미노산 생합성의 유전자를 조절하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 목적은 유익한 특성을 갖는 추가의 프로모터 및(또는) 발현 유니트를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 목적이

유전자의 전사를 위한

서열 1의 핵산 서열을 포함하는, 프로모터 활성을 갖는 핵산의 사용에 의해 달성됨을 발견하기에 이르렀다.

삭제

"전사"는 본 발명에 따라 DNA 템플레이트 (template)로부터 출발하여 상보성 RNA 분자가 생산되는 과정을 의미한다. 단백질, 예를 들어 RNA 폴리머라제, 소위 시그마 인자 및 전사 레귤레이터 단백질이 상기 과정에 관여한다. 이어서 합성된 RNA은 번역 과정에서 템플레이트로서 사용되고, 이어서 생합성적 활성 단백질을 생성한다.

생합성적 활성 단백질이 생산되는 형성 속도는 전사 및 번역 속도의 곱이다. 두 속도는 본 발명에 따라 영향을 받을 수 있고, 따라서 미생물에서 생성물의 형성 속도에 영향을 끼친다.

"프로모터" 또는 "프로모터 활성을 갖는 핵산"은 본 발명에 따라 전사시킬 핵산에 대한 기능적 연결기에서 상기 핵산의 전사를 조절하는 핵산을 의미한다.

"기능적 연결기"는 여기에서 예를 들어 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 하나의 핵산, 및 전사시킬 핵산 서열 및 적절한 경우 각각의 조절 요소가 핵산 서열의 전사에서 그의 기능을 완수할 수 있도록 하는 방식으로 추가의 조절 요소, 예를 들어 핵산의 전사를 보장하는 핵산 서열 및 예를 들어 터미네이터 (terminator)의 순차적인 배열을 의미한다. 화학적인 의미에서 직접 연결기는 절대적으로 그에 필요한 것은 아니다. 유전적 조절 서열, 예를 들어 인핸서 (enhancer) 서열은 심지어 먼 위치로부터 또는 심지어 다른 DNA 분자로부터의 표적 서열에서 그의 기능을 발휘할 수 있다. 2개의 서열이 함께 공유 결합되도록 전사시킬 핵산 서열이 본 발명의 프로모터 서열의 뒷쪽에 (즉, 3' 말단에) 위치하는 배열이 바람직하다. 이와 관련하여, 프로모터 서열과 유전자도입으로 발현시킬 핵산 서열 사이의 거리는 바람직하게는 200 염기쌍보다 작고, 특히 바람직하게는 100 염기쌍보다 작고, 더 특히 바람직하게는 50 염기쌍보다 작다.

"프로모터 활성"은 본 발명에 따라 특정 시간에 프로모터에 의해 형성된 RNA의 양, 즉 전사 속도를 의미한다.

"특이적 프로모터 활성"은 본 발명에 따라 각각의 프로모터에 대해 특정 시간에 프로모터에 의해 형성된 RNA의 양을 의미한다.

용어 "야생형"은 본 발명에 따라 적절한 출발 미생물을 의미한다.

문맥에 따라, 용어 "미생물"은 출발 미생물 (야생형) 또는 본 발명의 유전학적으로 변형된 미생물 또는 둘 모두를 의미한다.

바람직하게는, 특히 미생물 또는 야생형이 명백하게 지정될 수 없는 경우에, "야생형"은 각각의 경우에 참조 유기체에서 프로모터 활성 또는 전사 속도의 변경 또는 유발, 발현 활성 또는 발현 속도의 변경 또는 유발, 및 생합성 산물의 함량의 증가를 위한 것임을 의미한다.

바람직한 실시태양에서, 상기 참조 유기체는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032이다.

바람직한 실시태양에서, 사용되는 출발 미생물은 이미 요구되는 미세 화학물질을 생산할 수 있다. 이와 관련하여 코리네박테리움 속의 세균의 특히 바람직한 미생물 및 특히 바람직한 미세 화학물질 L-라이신, L-메티오닌 및 L-트레오닌 중에서, 이미 L-라이신, L-메티오닌 및(또는) L-트레오닌을 생산할 수 있는 출발 미생물이 특히 바람직하다. 이들은 특히 바람직하게는 예를 들어, 아스파르토키나제를 코딩하는 유전자 (ask 유전자)가 탈조절되거나 피드백 억제가 폐지되거나 감소되는 코리네박테리아이다. 상기 세균은 예를 들어 ask 유전자 내에 피드백 억제의 감소 또는 폐지를 일으키는 돌연변이, 예를 들어 돌연변이 T311l을 갖는다.

따라서, 야생형과 비교한 유전자에 관련된 "유발된 프로모터 활성" 또는 전사 속도의 경우, 상기 방식으로 야생형에 존재하지 않은 RNA의 형성이 유발된다.

따라서, 야생형과 비교한 유전자에 관련된 변경된 프로모터 활성 또는 전사 속도의 경우, 특정 시간에 생산된 RNA의 양이 변경된다.

이와 관련하여 "변경된"은 바람직하게는 증가된 또는 감소된을 의미한다.

이는 예를 들어 프로모터를 돌연변이시키거나 프로모터를 자극 또는 억제함으로써 본 발명의 내재성 프로모터의 특이적 프로모터 활성을 증가 또는 감소시켜 일어날 수 있다.

유전자가 프로모터 활성을 갖는 핵산과 관련하여 이종성인 경우, 예를 들어 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 또는 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 미생물 내에서 유전자의 전사를 조절하여 증가된 프로모터 활성 또는 전사 속도를 달성하는 것이 추가로 가능하다.

프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 또는 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 미생물에서 유전자 전사의 조절은 바람직하게는

프로모터 활성, 적절하게는 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 하나 이상의 핵산을 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 내재성 유전자의 전사가 프로모터 활성, 적절하게는 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 도입된 핵산의 제어 하에 일어나도록 하거나,

하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 전사가 프로모터 활성, 적절하게는 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 내재성 핵산의 제어 하에 일어나도록 하거나,

프로모터 활성, 적절하게는 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 전사시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 구성물을 미생물 내에 도입함으로써 달성된다.

프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산은

서열 1의 핵산 서열을 포함한다.

삭제

서열 1의 핵산 서열은 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 GroES 샤퍼로닌 (Chaperonin) (Pgro)의 프로모터 서열을 나타낸다. 서열 1은 야생형 프로모터 서열에 대응한다.

삭제

본 발명의 프로모터에 대한 본 발명의 추가의 천연 예는 상기 서열 1의 서열과 데이타베이스로부터의 핵산 서열의 동일성 비교에 의해 그의 게놈 서열이 공지된 상이한 유기체로부터 쉽게 발견될 수 있다.

본 발명의 인공 프로모터 서열은 인공 변이 및 돌연변이에 의해, 예를 들어 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결손에 의해 서열 1의 핵산 서열로부터 출발하여 쉽게 알 수 있다.

용어 "치환"은 하나 이상의 뉴클레오티드에 의한 하나 이상의 뉴클레오티드의 대체를 의미한다. "결손"은 직접 연결에 의한 뉴클레오티드의 대체를 의미한다. 삽입은 핵산 서열 내로 뉴클레오티드의 삽입을 의미하고, 직접 연결을 하나 이상의 뉴클레오티드로 대체한다.

두 핵산 사이의 동일성은 각각의 경우에 핵산의 완전한 길이에 걸친 뉴클레오티드의 동일성, 특히 다음 파라미터를 설정한 Clustal 방법 (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci.1989 Apr; 5(2): 151-1)을 사용하여 벡터 NTI Suite 7.1 소프트웨어 (인포맥스 (Informax), 미국)를 사용하여 비교에 의해 계산된 동일성을 의미한다.

다중 배열 파라미터:

갭 오프닝 페널티 10

갭 연장 페널티 10

갭 분리 페널티 범위 8

갭 분리 페널티 오프 (off)

정렬 지연에 대한 동일성% 40

잔기 특이적 갭 오프

친수성 잔기 갭 오프

전치 중량 (Transition weighing) 0

페어형 (Pairwise) 배열 파라미터:

FAST 알고리즘 온 (on)

K-터플크기 (tuplesize) 1

갭 페널티 3

윈도우 크기 5

최적 항의 수 5

따라서, 서열 1의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 서열은 특히 상기 파라미터 세트를 갖는 상기 프로그래밍 알고리즘에 따라 서열 1의 서열과 비교시, 적어도 90%의 동일성을 보이는 핵산 서열을 의미한다.

특히 바람직한 프로모터는 서열 1의 핵산 서열과 91%, 보다 바람직하게는 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 특히 바람직하게는 99%의 동일성을 보인다.

프로모터의 추가의 천연 예는 상기한 핵산 서열로부터 출발하여, 특히 그의 게놈 서열이 알려지지 않은 다양한 유기체로부터 서열 1의 서열로부터 출발하여 그 자체로 공지된 방식으로 혼성화 기술에 의해 쉽게 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 추가의 측면은 엄격 조건 하에 서열 1의 핵산 서열과 혼성화하는 핵산 서열을 포함하는, 프로모터 활성을 갖는 핵산에 관한 것이다. 상기 핵산 서열은 적어도 10, 보다 바람직하게는 12, 15, 30, 50 초과, 특히 바람직하게는 150 초과의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

혼성화는 엄격 조건 하에 본 발명에 따라 발생할 수 있다. 상기 혼성화 조건은 예를 들어 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd editon, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57 또는 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에 기재되어 있다.

엄격한 혼성화 조건은 특히 42℃에서 50% 포름아미드, 5 x SSC (750 mM NaCl, 75 mM 시트르산 3나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 g/ml 변성, 전단된 연어 정자 DNA로 이루어진 용액 중에서 철야 인큐베이팅한 후, 65℃의 0.1 x SSC로 필터를 세척하는 것을 의미한다.

"기능적으로 동등한 단편"은 출발 서열과 실질적으로 동일하거나 더 높은 특이적 프로모터 활성을 갖는 프로모터 활성 단편을 갖는 핵산 서열을 의미한다.

"실질적으로 동일한"은 출발 서열의 특이적 프로모터 활성의 적어도 50%, 바람직하게는 60%, 보다 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90%, 특히 바람직하게는 95%를 보이는 특이적 프로모터 활성을 의미한다.

"단편"은 실시태양 A), B) 또는 C)에 의해 설명되는 프로모터 활성을 갖는 핵산의 부분 서열을 의미한다. 상기 단편은 서열 1의 핵산 서열의 바람직하게는 10 초과, 보다 바람직하게는 12, 15, 30, 50 초과, 특히 바람직하게는 150 초과의 연결된 뉴클레오티드를 갖는다.

서열 1의 핵산 서열을 프로모터로서, 즉 유전자 전사를 위해 사용하는 것이 특히 바람직하다.

서열 1은 Genbank 번호 AP005283에서 기능 부여 없이 설명된 바 있다. 따라서, 본 발명은 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 신규한 핵산 서열에 관한 것이다.

삭제

상기 언급된 프로모터 활성을 갖는 모든 핵산은 뉴클레오티드 빌딩 블록으로부터 화학적 합성에 의해, 예를 들어 이중 나선체의 개개의 중복하는 상보성 핵산 빌딩 블록의 단편 축합에 의해 그 자체로 공지된 방법으로 추가로 제조할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성은 예를 들어 포스포르아미다이트 방법 (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pp. 896-897)에 의해 공지된 방식으로 발생할 수 있다. DNA 폴리머라제의 클레나우 (Klenow) 단편 및 라이게이션 반응에 의한 합성 올리고뉴클레오티드의 첨가 및 갭 충전, 및 일반적인 클로닝 방법은 문헌 [Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기재되어 있다.

또한, 본 발명은 유전자의 발현을 위한, 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 중 하나 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 추가의 핵산 서열을 포함하는 발현 유니트의 용도에 관한 것이다.

발현 유니트는 본 발명에 따라 발현 활성을 갖는 핵산, 즉 발현시킬 핵산 또는 유전자와 기능적으로 연결되어 상기 핵산 또는 유전자의 발현, 즉, 전사 및 번역을 조절하는 핵산을 의미한다.

"기능적 연결"은 여기에서 예를 들어 본 발명의 하나의 발현 유니트, 및 유전자도입으로 발현시킬 핵산 서열 및 적절한 경우 각각의 조절 요소가 핵산 서열의 유전자도입적 발현에서 그의 기능을 완수할 수 있도록 하는 방식으로 추가의 조절 요소, 예를 들어 터미네이터의 순차적인 배열을 의미한다. 화학적인 의미에서 직접 연결기는 절대적으로 그에 필요한 것은 아니다. 유전적 제어 서열, 예를 들어 인핸서 서열은 또한 보다 먼 위치로부터 또는 심지어 다른 DNA 분자로부터의 표적 서열에 대해 그의 기능을 발휘할 수 있다. 2개의 서열이 함께 공유 결합되도록 유전자도입으로 발현시킬 핵산 서열이 본 발명의 발현 유니트 서열의 뒷쪽에 (즉, 3' 말단에) 위치하는 배열이 바람직하다. 이 경우, 발현 유니트 서열과 유전자도입으로 발현시킬 핵산 서열 사이의 거리는 바람직하게는 200 염기쌍보다 작고, 특히 바람직하게는 100 염기쌍보다 작고, 더 특히 바람직하게는 50 염기쌍보다 작다.

"발현 활성"은 본 발명에 따라 발현 유니트에 의해 특정 시간에 생산된 단백질의 양, 즉 발현 속도를 의미한다.

"특이적 발현 활성"은 본 발명에 따라 각각의 발현 유니트에 대해 특정 시간에 발현 유니트에 의해 생산된 단백질의 양을 의미한다.

따라서, 야생형과 비교한 유전자에 관련된 "유발된 발현 활성" 또는 발현 속도의 경우, 상기 방식으로 야생형에 존재하지 않은 단백질의 생산이 유발된다.

따라서, 야생형과 비교한 유전자에 관련된 "변경된 발현 활성" 또는 발현 속도의 경우, 특정 시간에 생산된 단백질의 양이 변경된다.

이는 예를 들어 발현 유니트를 돌연변이시키거나 발현 유니트를 자극 또는 억제함으로써 본 발명의 내재성 발현 유니트의 특이적인 활성을 증가 또는 감소시켜 일어날 수 있다.

증가된 발현 활성 또는 발현 속도는 유전자가 발현 유니트에 관련하여 이종성인 경우, 예를 들어 본 발명의 발현 유니트 또는 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 발현 유니트에 의해 미생물 내에서 유전자의 발현을 조절하여 추가로 달성될 수 있다.

본 발명의 발현 유니트 또는 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유니트에 의한 미생물 내에서의 유전자 발현의 조절은 바람직하게는

적절하게는 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 하나 이상의 발현 유니트를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 내재성 유전자의 발현이 적절하게는 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 도입된 발현 유니트의 제어 하에 일어나도록 하거나,

하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 적절하게는 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 내재성 발현 유니트의 제어 하에 일어나도록 하거나,

적절하게는 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유니트 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 구성물을 미생물 내에 도입함으로써 달성된다.

본 발명의 발현 유니트는 프로모터 활성을 갖는 상기한 본 발명의 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 추가의 핵산 서열을 포함한다.

리보핵산의 번역을 보장하는 핵산 서열은 바람직하게는 리보좀 결합 부위로서 서열 42의 핵산 서열을 포함한다.

바람직한 실시태양에서, 본 발명의 발현 유니트는

서열 2의 핵산 서열을 포함한다.

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서열 2의 핵산 서열은 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 GroES 샤퍼로닌 (Pgro)의 발현 유니트의 핵산 서열을 나타낸다. 서열 2는 야생형의 발현 유니트의 서열에 대응한다.

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본 발명의 발현 유니트에 대한 본 발명의 추가의 천연 예는 상기 서열 2의 서열과 데이타베이스로부터 핵산 서열의 동일성 비교에 의해 예를 들어 그의 게놈 서열이 공지된 다양한 유기체로부터 쉽게 발견될 수 있다.

발현 유니트의 본 발명의 인공적인 서열은 인공적인 변이 및 돌연변이에 의해, 예를 들어 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결손에 의해 서열 2의 서열로부터 출발하여 쉽게 발견될 수 있다.

따라서, 서열 2의 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 핵산 서열은 특히 상기 파라미터 세트를 갖는 상기 프로그래밍 알고리즘에 따라 그의 서열을 서열 2의 서열과 비교시 적어도 90%의 동일성을 보이는 핵산 서열을 의미한다.

특히 바람직한 발현 유니트는 서열 2의 핵산 서열과 91%, 보다 바람직하게는 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 특히 바람직하게는 99%의 동일성을 보인다.

발현 유니트의 추가의 예는 그 자체로 공지된 방식으로 혼성화 기술에 의해 상기한 핵산 서열로부터 출발하여, 특히 그의 게놈 서열이 공지되지 않은 다양한 유기체로부터 서열 2의 서열로부터 출발하여 더욱 쉽게 발견될 수 있다.

따라서, 본 발명의 추가의 측면은 엄격 조건 하에 서열 2의 핵산 서열과 혼성화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 유니트에 관한 것이다. 상기 핵산 서열은 적어도 10, 보다 바람직하게는 12, 15, 30, 50 초과 또는 특히 바람직하게는 150 초과의 뉴클레오티드를 포함한다.

"혼성화"는 엄격 조건 하에 실질적으로 상보성인 서열에 결합하지만, 이들 조건 하에 비상보성 파트너 사이의 비특이적 결합이 일어나지 않는 폴리- 또는 올리고뉴클레오티드의 능력을 의미한다. 이를 위해, 서열은 바람직하게는 90-100% 상보성이어야 한다. 서로 특이적으로 결합할 수 있는 상보성 서열의 특성은 예를 들어 노던 (Northern) 또는 서던 (Southern) 블로팅 기술에서 또는 PCR 또는 RT-PCR에서 프라이머 결합에 이용된다.

혼성화는 본 발명에 따라 엄격 조건 하에 일어난다. 상기 혼성화 조건은 예를 들어 문헌 ([Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57] 또는 [Current Protocols in Molecular Biolo gy, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6])에 기재되어 있다.

엄격한 혼성화 조건은 특히 50% 포름아미드, 5 x SSC (750 mM NaCl, 75 mM 시트르산 3나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 g/ml 변성, 전단된 연어 정자 DNA로 이루어진 용액 중에서 42℃에서 철야 인큐베이팅한 후, 필터를 65℃의 0.1 x SSC로 세척하는 것을 의미한다.

본 발명의 뉴클레오티드 서열은 다른 세포 종류 및 미생물에서 동종성 서열을 확인하고(하거나) 클로닝하기 위해 사용될 수 있는 프로브 및 프라이머를 생산하는 것을 추가로 가능하게 한다. 상기 프로브 및 프라이머는 정상적으로 엄격 조건 하에 본 발명의 핵산 서열의 센스 스트랜드 또는 상응하는 안티센스 스트랜드의 적어도 약 12, 바람직하게는 적어도 약 25, 예를 들어 약 40, 50 또는 75 연속 뉴클레오티드에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열 영역을 포함한다.

본 발명에 따라 소위 침묵 돌연변이를 포함하거나 또는 구체적으로 언급된 서열 및 자연적으로 발생하는 변이체, 예를 들어 그의 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체와 비교된 특수한 원래의 또는 숙주 유기체의 코돈 사용 빈도에 따라 변형된 핵산 서열이 또한 포함된다.

"기능적으로 동등한 단편"은 출발 서열과 실질적으로 동일하거나 더 높은 특이적 발현 활성을 갖는 발현 유니트 단편을 의미한다.

"실질적으로 동일한"은 출발 서열의 특이적 발현 활성의 적어도 50%, 바람직하게는 60%, 보다 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90%, 특히 바람직하게는 95%를 보이는 특이적 발현 활성을 의미한다.

"단편"은 실시태양 E), F) 또는 G)에 의해 설명되는 발현 유니트의 부분 서열을 의미한다. 이들 단편은 서열 1의 핵산 서열의 바람직하게는 10 초과, 보다 바람직하게는 12, 15, 30, 50 초과, 특히 바람직하게는 150 초과의 연결된 뉴클레오티드를 갖는다.

서열 2의 핵산 서열을 발현 유니트로서, 즉 유전자의 발현을 위해 사용하는 것이 특히 바람직하다.

서열 2는 Genbank 번호 AP005283에서 기능 부여 없이 설명된 바 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 본 발명의 신규한 발현 유니트에 관한 것이다.

본 발명은 특히 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 추가의 핵산 서열을 포함하는 발현 유니트에 관한 것이다.

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본 발명의 발현 유니트는 하나 이상의 다음 유전 요소를 포함한다: 마이너스 10 ("-10") 서열; 마이너스 35 ("-35") 서열; 전사 개시 서열, 인핸서 영역; 및 오퍼레이터 영역.

이들 유전 요소는 바람직하게는 코리네박테리아종, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰에 특이적이다.

상기 언급된 모든 발현 유니트는 뉴클레오티드 빌딩 블록으로부터 화학적 합성에 의해, 예를 들어 이중 나선체의 개개의 중복하는 상보성 핵산 빌딩 블록의 단편 축합에 의해 그 자체로 공지된 방법으로 추가로 제조할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성은 예를 들어 포스포르아미다이트 방법 (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pp. 896-897)에 의해 공지된 방식으로 발생할 수 있다. DNA 폴리머라제의 클레나우 단편 및 라이게이션 반응에 의한 합성 올리고뉴클레오티드의 첨가 및 갭 충전, 및 일반적인 클로닝 방법은 문헌 [Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기재되어 있다.

본 특허에서 본 발명을 위해 사용된 방법 및 기술은 미생물학 및 재조합 DNA 기술에서 숙련된 기술자에게 공지되어 있다. 세균 세포를 성장시키고, 단리된 DNA 분자를 숙주 세포 내로 삽입하고, 단리된 핵산 분자를 단리, 클로닝 및 서열분석하기 위한 방법 및 기술이 상기 기술 및 방법의 예이다. 이들 방법은 많은 표준 문헌에 기재되어 있다 (Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986); J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1972); J.H. Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1992); M. Singer and P. Berg, Genes & Genomes, University Science Books, Mill Valley, California (1991); J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); P.B. Kaufmann et al., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Boca Raton, Florida (1995); Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B.R. Glick and J.E. Thompson, eds., CRC Press, Boca Raton, Florida (1993); 및 P.F. Smith-Keary, Molecular Genetics of Escherichia coli, The Guilford Press, New York, NY (1989)).

본 발명의 모든 핵산 분자는 바람직하게는 단리된 핵산 분자 형태이다. "단리된" 핵산 분자는 핵산의 천연 공급원 내에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리되고, 부가적으로 재조합 기술에 의해 제조된 경우 다른 세포성 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없을 수 있거나, 화학적으로 합성된 경우 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.

본 발명은 부가적으로 구체적으로 설명된 뉴클레오티드 서열에 상보성인 뉴클레오티드 분자 또는 그의 섹션을 포함한다.

본 발명의 프로모터 및(또는) 발현 유니트는 예를 들어 이후 설명하는 바와 같은 발효에 의한 생합성 산물의 제조를 위한 개선된 방법에서 특히 유리하게 사용될 수 있다.

본 발명의 프로모터 및(또는) 발현 유니트는 스트레스에 의해 미생물에서 유도되는 점에서 특히 유리하다. 요구되는 유전자의 전사/발현 속도를 특이적으로 증가시키기 위해 상기 스트레스 유도를 조절하는 것은 발효 과정을 적절하게 조절함으로써 가능하다. 특히 L-라이신의 생산에서, 상기 스트레스 페이스는 매우 조기에 도달하여, 이 경우에 요구되는 유전자의 전사/발현 속도 증가를 매우 조기에 달성할 수 있다.

프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산은 야생형에 비해 미생물의 유전자의 전사 속도의 변경, 즉 증가 또는 감소를 위해, 또는 전사 속도를 유발하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 발현 유니트는 야생형에 비해 미생물의 유전자의 발현 속도의 변경, 즉 증가 또는 감소를 위해, 또는 전사 속도를 유발하기 위해 사용될 수 있다.

프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 및 본 발명의 발현 유니트는 또한 미생물, 특히 코리네박테리움 종에서 다양한 생합성 산물, 예를 들어 미세 화학물질, 단백질, 특히 아미노산의 생산의 조절 및 증강을 위해 기능할 수도 있다.

따라서, 본 발명은

a) 내재성 유전자의 전사를 조절하는, 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 내재성 핵산의 미생물 내에서의 특이적 프로모터 활성을 야생형에 비해 변경하거나,

b) 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산에 의해 또는 실시태양 a)에 따라 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 미생물에서 유전자의 전사를 조절함으로써 미생물 내에서 프로모터 활성을 갖는 핵산에 관하여 이종성인 유전자의 전사 속도를 야생형에 비해 변경 또는 유발하는 방법에 관한 것이다.

실시태양 a)에 따르면, 야생형에 비해 미생물 내에서 유전자의 전사 속도의 변경 또는 유발은 미생물 내에서 특이적 프로모터 활성을 변경, 즉 증가 또는 감소시켜 발생할 수 있다. 이것은 예를 들어 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 서열의 표적 돌연변이에 의해, 즉 뉴클레오티드의 표적 치환, 결손 또는 삽입에 의해 발생할 수 있다. 증가 또는 감소된 프로모터 활성은 RNA 폴리머라제 전효소 결합 부위 (당업계의 숙련인에게 -10 영역 및 -35 영역으로도 알려짐)에서 뉴클레오티드를 치환시켜 달성할 수 있다. 추가로, 뉴클레오티드의 결손 또는 삽입에 의해 서로로부터 설명된 RNA 폴리머라제 전효소 결합 부위의 거리를 감소 또는 증가시켜 달성할 수 있다. 추가로, RNA 폴리머라제 전효소의 결합 부위에 공간적으로 가까운 위치에 조절 단백질 (당업계에 억제제 및 활성화제로도 알려짐)을 위한 결합 부위 (당업계에 오퍼레이터로도 알려짐)를 위치시킴으로써 프로모터 서열에 결합한 후에 상기 레귤레이터는 RNA 폴리머라제 전효소의 결합 및 전사 활성을 감소 또는 증가시키거나, 새로운 조절 영향 하에 위치시킨다.

서열 53의 핵산 서열은 바람직하게는 본 발명의 발현 유니트의 리보좀 결합 부위를 나타내고, 서열 52의 서열은 본 발명의 발현 유니트의 -10 영역을 나타낸다. 상기 영역에서 핵산 서열의 변경은 특이적 발현 활성을 변경시킨다.

따라서, 본 발명은 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속의 세균에서 유전자가 발현되도록 하는 발현 유니트에서 리보좀 결합 부위로서의 서열 53의 핵산 서열의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 세균에서 유전자가 발현되도록 하는 발현 유니트에서 -10 영역으로서의 서열 52의 핵산 서열의 용도에 관한 것이다.

특히 본 발명은 서열 53의 핵산 서열을 포함하는, 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 세균에서 유전자가 발현되도록 하는 발현 유니트에 관한 것이다. 이 경우에, 서열 53의 핵산 서열은 리보좀 결합 부위로서 바람직하게 사용된다.

또한, 본 발명은 서열 52의 핵산 서열을 포함하는, 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 세균에서 유전자가 발현되도록 하는 발현 유니트에 관한 것이다. 이 경우에, 서열 52의 핵산 서열은 -10 영역으로서 바람직하게 사용된다.

"특이적 프로모터 활성"과 관련하여, 야생형에 비해 증가 또는 감소는 야생형의 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산에 비해, 즉 서열 1에 비해 특이적인 활성의 증가 또는 감소를 의미한다.

실시태양 b)에 따르면, 야생형에 비해 미생물 내에서 유전자의 전사 속도의 변경 또는 유발은 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산에 의해 또는 실시태양 a)에 따라 특이적 프로모터 활성이 변경된 핵산에 의해 미생물 내에서 유전자의 전사를 조절함으로써 발생할 수 있고, 여기서 유전자는 프로모터 활성을 갖는 핵산에 대해 이종성이다.

이것은 바람직하게는

b1) 프로모터 활성, 적절하게는 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 하나 이상의 핵산을 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 내재성 유전자의 전사가 프로모터 활성, 적절하게는 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 도입된 핵산의 제어 하에 일어나도록 하거나,

b2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 전사가 프로모터 활성, 적절하게는 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 내재성 핵산의 제어 하에 일어나도록 하거나,

b3) 프로모터 활성, 적절하게는 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 전사시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 구성물을 미생물 내에 도입함으로써 달성된다.

따라서, 실시태양 b1)에 따라, 프로모터 활성, 적절하게는 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 하나 이상의 핵산을 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 내재성 유전자의 전사가 프로모터 활성, 적절하게는 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 도입된 핵산의 제어 하에 일어나도록 하거나,

실시태양 b2)에 따라, 하나 이상의 내재성 유전자를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 도입된 내재성 유전자의 전사가 프로모터 활성, 적절하게는 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 내재성 핵산의 제어 하에 일어나도록 하거나,

실시태양 b3)에 따라, 프로모터 활성, 적절하게는 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 전사시킬 내재성 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 구성물을 미생물 내에 도입함으로써, 야생형의 내재성 유전자의 전사 속도를 변경시키는, 즉, 증가시키거나 감소시키는 것이 가능하다.

따라서, 실시태양 b2)에 따라, 하나 이상의 외인성 유전자를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 도입된 외인성 유전자의 전사가 프로모터 활성, 적절하게는 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 내재성 핵산의 제어 하에 일어나도록 하거나,

실시태양 b3)에 따라, 프로모터 활성, 적절하게는 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 전사시킬 외인성 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 구성물을 미생물 내에 도입함으로써, 야생형에 비해 외인성 유전자의 전사 속도를 유발시키는 것이 추가로 가능하다.

실시태양 b2)에 따른 유전자의 삽입은 유전자를 코딩 영역 또는 비코딩 영역 내로 통합시킴으로써 일어날 수 있다. 삽입은 바람직하게는 비코딩 영역 내로 일어난다.

실시태양 b3)에 따른 핵산 구성물의 삽입은 염색체에서 또는 염색체외에서 일어날 수 있다. 핵산 구성물의 염색체 삽입이 바람직하다. "염색체" 통합은 외인성 DNA 단편을 숙주 세포의 염색체 내로 삽입하는 것이다. 상기 용어는 외인성 DNA 단편과 숙주 세포의 염색체 상의 적절한 영역 사이의 상동성 재조합에 대해 또한 사용된다.

실시태양 b)에서, 바람직하게는 실시태양 a)에 따라 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산이 또한 사용된다. 실시태양 b)에서, 실시태양 a)에 기재된 바와 같이, 이들은 미생물 내에 존재하거나 미생물 내에서 제조될 수 있거나, 단리된 형태로 미생물 내로 도입될 수 있다.

"내재성"은 야생형 게놈 내에 이미 존재하는 유전 정보, 예를 들어 유전자를 의미한다.

"외인성"은 야생형 게놈 내에 존재하지 않는 유전 정보, 예를 들어 유전자를 의미한다

프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산에 의한 전사의 조절과 관련하여 용어 "유전자"는 바람직하게는 전사시킬 영역, 즉 예를 들어 번역을 조절하는 영역, 및 코딩 영역, 및 적절하게는 추가의 조절 요소, 예를 들어 터미네이터를 포함하는 핵산을 의미한다.

본 발명의 발현 유니트에 의한 발현의 조절 (이후 설명됨)과 관련하여 용어 "유전자"는 바람직하게는 코딩 영역, 및 적절하게는 추가의 조절 요소, 예를 들어 터미네이터를 포함하는 핵산을 의미한다.

"코딩 영역"은 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 의미한다.

프로모터 활성을 갖는 핵산 및 유전자와 관련하여 "이종성"은 사용된 유전자가 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산의 제어 하에 전사되는 야생형 내에 존재하지 않지만, 야생형에서 발생하지 않는 새로운 기능적 연결기가 생산되고, 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산과 특이적 유전자의 기능적 조합물이 야생형에 발생하지 않는 것을 의미한다

발현 유니트 및 유전자와 관련하여 "이종성"은 사용된 유전자가 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 발현 유니트의 제어 하에 발현되는 야생형 내에 존재하지 않지만, 야생형에서 발생하지 않는 새로운 기능적 연결기가 생산되고, 본 발명의 발현 유니트와 특이적 유전자의 기능적 조합물이 야생형에 발생하지 않는 것을 의미한다.

본 발명은 추가로 바람직한 실시태양에서

ah) 내재성 유전자의 전사를 조절하는, 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 내재성 핵산의 미생물 내의 특이적 프로모터 활성을 야생형에 비해 증가시키거나,

bh) 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산에 의해 또는 실시태양 a)에 따라 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 미생물에서 프로모터 활성을 갖는 핵산에 관하여 이종성인 유전자의 전사를 조절함으로써 미생물에서 유전자의 전사 속도를 야생형에 비해 증가 또는 유발하는 방법에 관한 것이다.

프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 또는 실시태양 ah)에 따라 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산에 의한 미생물에서 유전자 전사의 조절은 바람직하게는

bh1) 프로모터 활성, 적절하게는 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 하나 이상의 핵산을 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 내재성 유전자의 전사가 프로모터 활성, 적절하게는 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 도입된 핵산의 제어 하에 일어나도록 하거나,

bh2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 전사가 프로모터 활성, 적절하게는 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 내재성 핵산의 제어 하에 일어나도록 하거나,

bh3) 프로모터 활성, 적절하게는 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 전사시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 구성물을 미생물 내로 도입함으로써 달성된다.

본 발명은 추가로 바람직한 실시태양에서

ar) 내재성 유전자의 전사를 조절하는, 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 내재성 핵산의 미생물 내의 특이적 프로모터 활성을 야생형에 비해 감소시키거나,

br) 실시태양 a)에 따라 감소된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산을 미생물의 게놈에 도입하여, 내재성 유전자의 전사가 감소된 프로모터 활성을 갖는 도입된 핵산의 제어 하에 일어나도록 함으로써, 미생물에서 유전자의 전사 속도를 야생형에 비해 감소시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 추가로

c) 내재성 유전자의 발현을 조절하는 본 발명의 내재성 발현 유니트의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성을 야생형에 비해 변경시키거나,

d) 본 발명의 발현 유니트에 의해 또는 실시태양 c)에 따라 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유니트에 의해 미생물에서 발현 유니트에 관하여 이종성인 유전자의 발현을 조절함으로써 미생물에서 유전자의 발현 속도를 야생형에 비해 변경 또는 유발하는 방법에 관한 것이다.

실시태양 c)에 따르면, 야생형에 비해 미생물에서 유전자의 발현 속도를 변경 또는 유발하는 것은 미생물 내에서의 특이적 발현 활성을 변경, 즉 증가 또는 감소시킴으로써 일어날 수 있다. 이는 예를 들어 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 서열의 표적화 돌연변이에 의해, 즉 뉴클레오티드의 표적화 치환, 결손 또는 삽입에 의해 일어날 수 있다. 예를 들어, 샤인-달가르노 서열과 번역 개시 코돈 사이의 거리를 연장하면 특이적 발현 활성의 변화, 감소 또는 향상을 일으킨다. 특이적 발현 활성의 변경은 또한 뉴클레오티드의 결손 또는 삽입에 의해 번역 개시 코돈으로부터 샤인-달가르노 영역 (리보좀 결합 부위)의 서열의 거리를 짧게하거나 연장함으로써 달성될 수 있다. 그러나, 또한 상보성 3' 측면 16S rRNA에 대한 상동성이 향상되거나 감소되는 방식으로 샤인-달가르노 영역의 서열을 변경함으로써 달성될 수 있다.

"특이적 발현 활성"과 관련하여, 야생형에 비해 증가 또는 감소는 본 발명의 발현 유니트와 비교하여, 즉 서열 2와 비교하여 야생형의 특이적인 활성의 증가 또는 감소를 의미한다.

실시태양 d)에 따르면, 야생형에 비해 미생물에서 유전자의 발현 속도를 변경 또는 유발하는 것은 본 발명의 발현 유니트에 의해 또는 실시태양 c)에 따라 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유니트에 의해 미생물에서 발현 유니트에 관하여 이종성인 유전자의 발현을 조절함으로써 일어날 수 있다.

이는 바람직하게는

d1) 적절하게는 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 하나 이상의 발현 유니트를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 내재성 유전자의 발현이 도입된 발현 유니트의 제어 하에 일어나도록 하거나,

d2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 적절하게는 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 내재성 발현 유니트의 제어 하에 일어나도록 하거나,

d3) 적절하게는 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유니트 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 구성물을 미생물 내에 도입함으로써 달성된다.

따라서, 실시태양 d1)에 따라, 적절하게는 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 하나 이상의 발현 유니트를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 내재성 유전자의 발현이 도입된 발현 유니트의 제어 하에 일어나도록 하거나,

실시태양 d2)에 따라, 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 적절하게는 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 내재성 발현 유니트의 제어 하에 일어나도록 하거나,

실시태양 d3)에 따라, 적절하게는 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유니트 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 내재성 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 구성물을 미생물 내에 도입함으로써, 야생형의 내재성 유전자의 전사 속도를 변경시키는, 즉, 증가시키거나 감소시키는 것이 가능하다.

따라서, 실시태양 d2)에 따라, 하나 이상의 외인성 유전자를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 적절하게는 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 내재성 발현 유니트의 제어 하에 일어나도록 하거나,

실시태양 d3)에 따라, 적절하게는 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유니트 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 외인성 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 구성물을 미생물 내에 도입함으로써, 야생형에 비해 외인성 유전자의 발현 속도를 유발하는 것이 추가로 가능하다.

실시태양 d2)에 따른 유전자의 삽입은 유전자를 코딩 영역 또는 비코딩 영역 내로 통합시킴으로써 일어날 수 있다. 삽입은 바람직하게는 비코딩 영역 내로 일어난다.

실시태양 d3)에 따른 핵산 구성물의 삽입은 염색체에서 또는 염색체외에서 일어날 수 있다. 핵산 구성물의 염색체 삽입이 바람직하다.

핵산 구성물은 또한 이하 발현 카세트로서 칭한다.

실시태양 d)에서, 바람직하게는 실시태양 c)에 따른 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유니트가 또한 사용된다. 실시태양 d)에서, 실시태양 c)에 기재된 바와 같이, 이들은 미생물 내에 존재하거나 미생물 내에서 제조될 수 있거나, 단리된 형태로 미생물 내로 도입될 수 있다.

본 발명은 추가로 바람직한 실시태양에서

ch) 내재성 유전자의 발현을 조절하는 본 발명의 내재성 발현 유니트의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성을 야생형에 비해 증가시키거나,

dh) 본 발명의 발현 유니트에 의해 또는 실시태양 a)에 따라 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 발현 유니트에 의해 미생물에서 발현 유니트에 관하여 이종성인 유전자의 발현을 조절함으로써 미생물에서 유전자의 발현 속도를 야생형에 비해 증가 또는 유발하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 발현 유니트 또는 실시태양 c)에 따라 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유니트에 의한 미생물 내에서의 유전자 발현의 조절은 바람직하게는

dh1) 적절하게는 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 하나 이상의 발현 유니트를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 내재성 유전자의 발현이 적절하게는 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 도입된 발현 유니트의 제어 하에 일어나도록 하거나,

dh2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 적절하게는 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 내재성 발현 유니트의 제어 하에 일어나도록 하거나,

dh3) 적절하게는 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유니트 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 구성물을 미생물 내로 도입함으로써 달성된다.

본 발명은 추가로

cr) 내재성 유전자의 발현을 조절하는 본 발명의 내재성 발현 유니트의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성을 야생형에 비해 감소시키거나,

dr) 실시태양 cr)에 따라 감소된 특이적 발현 활성을 갖는 발현 유니트를 미생물의 게놈에 도입하여, 내재성 유전자의 발현이 감소된 발현 활성을 갖는 도입된 발현 유니트의 제어 하에 일어나도록 함으로써, 미생물에서 유전자의 발현 속도를 야생형에 비해 감소시키는 방법에 관한 것이다.

미생물에서 유전자의 전사 속도 및(또는) 발현 속도를 변경 또는 유발하기 위한 상기한 본 발명의 방법의 바람직한 실시태양에서, 유전자는 미세 화학물질의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산의 군으로부터 선택되고, 여기서 유전자는 임의로 추가의 조절 요소를 포함할 수 있다.

미생물에서 유전자의 전사 속도 및(또는) 발현 속도를 변경 또는 유발하기 위한 상기한 본 발명의 방법의 특히 바람직한 실시태양에서, 유전자는 단백성 및 비단백성 아미노산의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 유기산의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 지질 및 지방산의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 디올의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 탄수화물의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 방향족 화합물의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 비타민의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 보조인자의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산 및 효소의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 여기서 유전자는 임의로 추가의 조절 요소를 포함할 수 있다.

특히 바람직한 실시태양에서, 아미노산의 생합성 경로로부터의 단백질은 아스파르테이트 키나제, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 디히드로디피콜리네이트 합성효소, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 3-포스포글리세레이트 키나제, 피루베이트 카르복실라제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 전사 레귤레이터 LuxR, 전사 레귤레이터 LysR1, 전사 레귤레이터 LysR2, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 호모세린-0-아세틸트랜스퍼라제, 시스타티오닌 감마-신타제, 시스타티오닌 베타-리아제, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제, 포스포세린 포스파타제, 세린 아세틸트랜스퍼라제, 호모세린 데히드로게나제, 호모세린 키나제, 트레오닌 신타제, 트레오닌 엑스포터 캐리어, 트레오닌 데히드라타제, 피루베이트 옥시다제, 라이신 엑스포터, 비오틴 리가제, 시스테인 신타제 I, 시스테인 신타제 II, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제 활성, 술페이트 아데닐트랜스퍼라제 서브유닛 1 및 2, 포스포아데노신 포스포술페이트 리덕타제, 페레독신-술파이트 리덕타제, 페레독신 NADP 리덕타제, 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제, RXA00655 레귤레이터, RXN2910 레귤레이터, 아르기닐-tRNA 합성효소, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 트레오닌 유출 단백질(efflux protein), 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, 프럭토스-1,6-비스포스파타제, 술페이트 환원 단백질 RXA077, 술페이트 환원 단백질 RXA248, 술페이트 환원 단백질 RXA247, 단백질 OpcA, 1-포스포프럭토키나제 및 6-포스포프럭토키나제로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

아미노산의 생합성 경로로부터 상기한 단백질의 바람직한 단백질 및 이들 단백질을 코딩하는 핵산은 각각 미생물 기원, 바람직하게는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움속으로부터, 바람직하게는 코리네형 세균으로부터, 특히 바람직하게는 코리노박테리움 글루타미쿰으로부터의 단백질 서열 및 핵산 서열이다.

아미노산의 생합성 경로로부터의 특히 바람직한 단백질 서열 및 이들 단백질을 코딩하는 상응하는 핵산 서열의 예, 이를 언급하는 문헌 및 참조 문헌에서 그의 명칭을 표 1에 나열한다.

단백질	단백질 코딩 핵산	참조 문헌	참조 문헌에서 서열
아스파르테이트 키나제	ask 또는 lysC	EP1108790	DNA: 281 단백질: 3781
아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제	asd	EP1108790	DNA: 331 단백질: 3831
디히드로디피콜리네이트 합성효소	dapA	WO 0100843	DNA: 55 단백질: 56
디히드로디피콜리네이트 리덕타제	dapB	WO 0100843	DNA: 35 단백질: 36
메조-디아미노피멜레이트 D-데히드로게나제	ddh	EP1108790	DNA: 3494 단백질: 6944
디아미노피콜리네이트 데카르복실라제	lysA	EP1108790	DNA: 3451 단백질: 6951
라이신 엑스포터	lysE	EP1108790	DNA: 3455 단백질: 6955
아르기닐-tRNA 합성효소	argS	EP1108790	DNA: 3450 단백질: 6950
글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제	zwf	WO 0100844	DNA: 243 단백질: 244

글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제	gap	WO 0100844	DNA: 187 단백질: 188
3-포스포글리세레이트 키나제	pgk	WO 0100844	DNA: 69 단백질: 70
피루베이트 카르복실라제	pycA	EP1108790	DNA: 765 단백질: 4265
트리오스포스페이트 이소머라제	tpi	WO 0100844	DNA: 61 단백질: 62
비오틴 리가제	birA	EP1108790	DNA: 786 단백질: 4286
PEP 카르복실라제	pck	EP1108790	DNA: 3470 단백질: 6970
호모세린 키나제	thrB	WO 0100843	DNA: 173 단백질: 174
트레오닌 신타제	thrC	WO 0100843	DNA: 175 단백질: 176
트레오닌 엑스포트 캐리어	thrE	WO 0251231	DNA: 41 단백질: 42
트레오닌 유출 단백질	RXA2390	WO 0100843	DNA: 7 단백질: 8
트레오닌 데히드라타제	ilvA	EP 1108790	DNA: 2328 단백질: 5828
호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제	metA	EP 1108790	DNA: 727 단백질: 4227
시스타티오닌 감마-신타제	metB	EP 1108790	DNA: 3491 단백질: 6991
시스타티오닌 베타-리아제	metC	EP 1108790	DNA: 2535 단백질: 6035
조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제	metH	EP 1108790	DNA: 1663 단백질: 5163
O-아세틸호모세린 술프히드릴라제	metY	EP 1108790	DNA: 726 단백질: 4226
메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제	metF	EP 1108790	DNA: 2379 단백질: 5879
D-3-포스포글리세레이트 데히드로게나제	serA	EP 1108790	DNA: 1415 단백질: 4915
포스포세린 포스파타제 1	serB	WO 0100843	DNA: 153 단백질: 154
포스포세린 포스파타제 2	serB	EP 1108790	DNA: 467 단백질: 3967

포스포세린 포스파타제 3	serB	EP 1108790	DNA: 334 단백질: 3834
포스포세린 아미노트랜스퍼라제	serC	WO 0100843	DNA: 151 단백질: 152
세린 아세틸트랜스퍼라제	cysE	WO 0100843	DNA: 243 단백질: 244
시스테인 신타제 I	cysK	EP 1108790	DNA: 2817 단백질: 6317
시스테인 신타제 II	CysM	EP 1108790	DNA: 2338 단백질: 5838
호모세린 데히드로게나제	hom	EP 1108790	DNA: 3452 단백질: 6952
조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제	metE	WO 0100843	DNA: 755 단백질: 756
세린 히드록시메틸트랜스퍼라제	glyA	WO 0100843	DNA: 143 단백질: 144
술페이트 환원 단백질	RXA247	EP 1108790	DNA: 3089 단백질: 6589
술페이트 환원 단백질	RXA248	EP 1108790	DNA: 3090 단백질: 6590
술페이트 아데닐일트랜스퍼라제 서브유닛 1	CysN	EP 1108790	DNA: 3092 단백질: 6592
술페이트 아데닐일트랜스퍼라제 서브유닛 2	CysD	EP 1108790	DNA: 3093 단백질: 6593
포스포아데노신 포스포술페이트 리덕타제	CysH	WO 02729029	DNA: 7 단백질:8
페레독신-술파이트 리덕타제	RXA073	WO 0100842	DNA: 329 단백질: 330
페레독신 NADP 리덕타제	RXA076	WO 0100843	DNA: 79 단백질: 80
전사 레귤레이터 LuxR	luxR	WO 0100842	DNA: 297 단백질: 298
전사 레귤레이터 LysR1	lysR1	EP 1108790	DNA: 676 단백질: 4176

전사 레귤레이터 LysR2	lysR2	EP 1108790	DNA: 3228 단백질: 6728
전사 레귤레이터 LysR3	lysR3	EP 1108790	DNA: 2200 단백질: 5700
말레이트-퀴논 옥시도리덕타제	mqo	WO 0100844	DNA: 569 단백질: 570
트랜스케톨라제	RXA2739	EP 1108790	DNA: 1740 단백질: 5240
트랜스알돌라제	RXA2738	WO 0100844	DNA: 245 단백질: 246
OpcA	OpcA	WO 0100804	DNA: 79 단백질: 80
1-포스포프럭토키나제 1	pfk1	WO 0100844	DNA: 55 단백질: 56
1-포스포프럭토키나제 2	pfk2	WO 0100844	DNA: 57 단백질: 58
6-포스포프럭토키나제 1	6-pfk1	EP 1108790	DNA: 1383 단백질: 4883
6-포스포프럭토키나제 2	6-pfk2	DE 10112992	DNA: 1 단백질: 2
프럭토스-1,6-비스포스파타제 1	fbr1	EP 1108790	DNA: 1136 단백질: 4636
피루베이트 옥시다제	poxB	WO 0100844	DNA: 85 단백질: 86
RXA00655 레귤레이터	RXA655	US2003162267.2	DNA: 1 단백질: 2
RXN02910 레귤레이터	RXN2910	US2003162267.2	DNA: 5 단백질: 6
6-포스포글루코노락토나제	RXA2735	WO 0100844	DNA: 1 단백질: 2

아미노산의 생합성 경로로부터 특히 바람직한 단백질 서열 및 상기 단백질을 코딩하는 대응하는 핵산 서열의 추가의 예는 프럭토스-1,6-비스포스파타제 2 (fbr2로도 불림) (서열 51) 및 프럭토스-1,6-비스포스파타제 2를 코딩하는 대응하는 핵산 서열 (서열 50)이다.

아미노산의 생합성 경로로부터 특히 바람직한 단백질 서열 및 상기 단백질을 코딩하는 대응하는 핵산 서열의 추가의 예는 술페이트 환원 단백질 (RXA077로도 불림) (서열 4) 및 술페이트 환원 단백질을 코딩하는 대응하는 핵산 서열 (서열 3)이다.

추가로, 아미노산의 생합성 경로로부터 특히 바람직한 단백질 서열은 각각의 경우에 상기 단백질에 대한 표 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, 여기서 각각의 단백질은 상기 아미노산 서열에 대해 표 2/컬럼 2에 나타낸 적어도 하나의 아미노산 위치에서 동일한 행에 표 2/컬럼 3에 나타낸 각각의 아미노산보다는 상이한 단백성 아미노산을 갖는다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 단백질은 아미노산 서열에 대해 표 2/컬럼 2에 나타낸 적어도 하나의 아미노산 위치에서 동일한 행에 표 2/컬럼 4에 나타낸 아미노산을 갖는다. 표 2에 나타낸 단백질은 특히 유리한 특성을 갖고 따라서 본 발명의 프로모터를 통한 대응하는 핵산의 발현 및 아미노산 생산에 특히 적합한 아미노산의 생합성 경로의 돌연변이된 단백질이다. 예를 들어, 돌연변이 T3111은 스위치 오프되는 ask의 피드백 억제를 야기한다.

표 2로부터 상기한 돌연변이된 단백질을 코딩하는 대응하는 핵산은 통상의 방법에 의해 제조할 수 있다.

돌연변이된 단백질을 코딩하는 핵산 서열 제조에 적합한 출발점은 예를 들어 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection)으로부터 기탁번호 ATCC 13032로 입수가능한 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 또는 표 1에 언급된 핵산 서열이다. 돌연변이된 단백질의 아미노산 서열을 상기 단백질을 코딩하는 핵산 서열로 역번역하기 위해, 핵산 서열이 도입되거나 핵산 서열이 존재하는 유기체의 코돈 사용 빈도를 사용하는 것이 유리하다. 예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰에 대해 코리네박테리움 글루타미쿰의 코돈 사용 빈도를 사용하는 것이 유리하다. 특정 유기체의 코돈 사용 빈도는 요구되는 유기체로부터 상기 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 단백질 및 하나의 유전자를 설명하는 데이타베이스 또는 모출원로부터 공지의 방식으로 확인할 수 있다.

표 2의 정보는 다음과 같이 이해할 수 있다.

컬럼 1 "ID"에서, 표 1에 관련하여 각 서열에 대한 명확한 명칭이 제시된다.

컬럼 2 "AA-POS"에서, 각각의 숫자는 표 1로부터 대응하는 폴리펩티드 서열의 아미노산 위치를 의미한다. 따라서, 컬럼 "AA-POS"에서 "26"은 대응하여 나타낸 폴리펩티드 서열의 아미노산 위치 26을 의미한다. 위치 넘버링은 N 말단에서 +1로 시작한다.

컬럼 3 "AA-야생형"에서, 각각의 문자는 표 1의 서열의 대응하는 야생형 균주에서 컬럼 2에 나타낸 위치에서 1문자 코드로 나타낸 아미노산을 의미한다.

컬럼4 "AA-돌연변이체"에서, 각각의 문자는 대응하는 돌연변이체 균주에서 컬럼 2에 나타낸 위치에서 1문자 코드로 나타낸 아미노산을 의미한다.

컬럼 5 "기능"에서, 대응하는 폴리펩티드 서열의 생리학적 기능이 제시된다.

특정 기능 (컬럼 5) 및 특정 초기 아미노산 서열 (표 1)을 갖는 돌연변이된 단백질에 대해, 컬럼 2, 3 및 4는 적어도 하나의 돌연변이 및 일부 서열에 대해 다수의 돌연변이를 설명한다. 상기 다수의 돌연변이는 항상 각각의 경우에 상기 가장 근접한 초기 아미노산 서열을 나타낸다 (표 1). 특정 아미노산 서열의 "적어도 하나의 아미노산 위치"는 바람직하게는 컬럼 2, 3 및 4에서 상기 아미노산 서열에 대해 설명된 돌연변이의 적어도 하나를 의미한다.

단백성 아미노산의 1문자 코드는 다음과 같다.

A 알라닌

C 시스테인

D 아스파르테이트

E 글루타메이트

F 페닐알라닌

G 글라이신

H 히스티딘

I 이소류신

K 라이신

L 류신

M 메티오닌

N 아스파라긴

P 프롤린

Q 글루타민

R 아르기닌

S 세린

T 트레오닌

V 발린

W 트립토판

Y 티로신

컬럼 1	컬럼 2	컬럼 3	컬럼 4	컬럼 5
ID	AA 위치	AA 야생형	AA 돌연변이체	기능
ask	317	S	A	아스파르테이트 키나제
	311	T	I
	279	A	T
asd	66	D	G	아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제
	234	R	H
	272	D	E
	285	K	E
	20	L	F
dapA	2	S	A	디히드로디피콜리네이트 합성효소
	84	K	N
	85	L	V
dapB	91	D	A	디히드로디피콜리네이트 리덕타제
	83	D	N
ddh	174	D	E	메조-디아미노피멜레이트 D-데히드로게나제
	235	F	L
	237	S	A
lysA	265	A	D	디아미노피콜리네이트 데카르복실라제
	320	D	N
	332	I	V
argS	355	G	D	아르기닐-tRNA 합성효소
	156	A	S
	513	V	A
	540	H	R
zwf	8	S	T	글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제
	150	T	A
	321	G	S

gap	264	G	S	글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제
pycA	7	S	L	피루베이트 카르복실라제
	153	E	D
	182	A	S
	206	A	S
	227	H	R
	455	A	G
	458	P	S
	639	S	T
	1008	R	H
	1059	S	P
	1120	D	E
pck	162	H	Y	PEP 카르복실라제
	241	G	D
	829	T	R
thrB	103	S	A	호모세린 키나제
	190	T	A
	133	A	V
	138	P	S
thrC	69	G	R	트레오닌 신타제
	478	T	I
RXA330	85	I	M	트레오닌 유출 단백질
	161	F	I
	195	G	D
hom	104	V	I	호모세린 데히드로게나제
	116	T	I
	148	G	A
	59	V	A
	270	T	S
	345	R	P
	268	K	N
	61	D	H
	72	E	Q
lysR1	80	R	H	전사 레귤레이터 LysR1
lysR3	142	R	W	전사 레귤레이터 LysR3
	179	A	T
RXA2739	75	N	D	트랜스케톨라제

	329	A	T
	332	A	T
	556	V	I
RXA2738	242	K	M	트랜스알돌라제
OpcA	107	Y	H	OpcA
	219	K	N
	233	P	S
	261	Y	H
	312	S	F
	65	G	R	아스파르테이트-1-데카르복실라제
	33	G	S	6-포스포글루코노락토나제

미생물에서 유전자의 전사 속도 및(또는) 발현 속도를 변경 또는 유발하기 위한 상기한 본 발명의 방법 및 유전학적으로 변형된 미생물을 제조하기 위한 추후 설명되는 방법에서, 추후 설명되는 유전학적으로 변형된 미생물 및 생합성 산물 제조를 위한 추후 설명되는 방법에서, 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산의, 본 발명의 발현 유니트의, 상기 설명한 유전자의 및 상기 설명한 핵산 구성물 또는 발현 카세트의 미생물, 특히 코리네형 세균 내로의 도입은 SacB 방법에 의해 수행된다.

SacB 방법은 당업계의 숙련인에게 알려져 있고, 예를 들어 문헌 [Schaefer A, Tauch A, Jaeger W, Kalinowski J, Thierbach G, Puhler A.; SmaII mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum, Gene. 1994 Jul 22; 145(1): 69-73 및 Blomfield IC, Vaughn V, Rest RF, Eisenstein BI.; Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature-sensitive pSC101 replicon; Mol Microbiol. 1991 Jun; 5(6): 1447-57]에 기재되어 있다.

상기한 본 발명의 방법의 바람직한 실시태양에서, 미생물에서 유전자의 전사 속도 및(또는) 발현 속도의 변경 또는 유발은 본 발명의 프로모터 활성을 갖는 핵산 또는 본 발명의 발현 유니트를 미생물에 도입함으로써 실시된다.

상기한 본 발명의 방법의 다른 바람직한 실시태양에서, 미생물에서 유전자의 전사 속도 및(또는) 발현 속도의 변경 또는 유발은 상기한 핵산 구성체 또는 발현 카세트를 미생물에 도입함으로써 실시된다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 발현 유니트, 발현되는 적어도 하나의 추가의 핵산 서열, 즉 발현되는 유전자 및 적절한 경우 추가의 유전자 조절 요소, 예를 들어 터미네이터를 포함하는 발현 카세트에 관한 것으로서, 상기 적어도 하나의 발현 유니트 및 발현되는 추가의 핵산 서열은 함께 기능적으로 연결되고, 발현되는 추가의 핵산 서열은 발현 유니트에 대해 이종성이다.

발현되는 핵산 서열은 바람직하게는 미세 화학물질의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이다.

발현되는 추가의 핵산 서열은 특히 바람직하게는 단백성 및 비단백성 아미노산의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 유기산의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 지질 및 지방산의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 디올의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 탄수화물의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 방향족 화합물의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 비타민의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 보조인자의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산 및 효소의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

아미노산의 생합성 경로로부터 바람직한 단백질은 상기 설명한 바와 같고, 그 예는 표 1 및 2에 기재되어 있다.

본 발명의 발현 카세트 내에서 발현시킬 유전자에 대한 발현 유니트의 물리적 위치는 발현 유니트가 발현시킬 유전자의 전사 및 바람직하게는 또한 번역을 조절하여, 하나 이상의 단백질의 생산이 가능하도록 선택된다. 이와 관련하여 "가능한 생산"은 생산을 구성적으로 증가시키고(시키거나), 특이적 조건 하에 생산을 감소 또는 차단하고(하거나) 특이적 조건 하에 생산을 증가시키는 것을 의미한다. 이와 관련하여 "조건"은 (1) 구성성분을 배양 배지에 첨가하는 것, (2) 구성성분을 배양 배지로부터 제거하는 것, (3) 배양 배지 내의 한 구성성분을 제2 구성성분으로 교체하는 것, (4) 배양 배지의 온도를 증가시키는 것, (5) 배양 배지의 온도를 감소시키는 것, 및 (6) 배양 배지가 유지되는 대기 조건, 예를 들어 산소 또는 질소 농도를 조절하는 것을 포함한다

본 발명의 추가로 상기한 본 발명의 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

벡터는 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있고, 문헌 ["Cloning Vectors" (Pouwels P.H. et al., editors, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)]에서 찾을 수 있다. 플라스미드와 별개로 벡터는 또한 당업계의 숙련인에게 공지된 다른 모든 벡터, 예를 들어 파지, 트랜스포존 (transposon), IS 요소, 파지미드, 코스미드, 및 선형 또는 환형 DNA를 의미한다. 이들 벡터는 숙주 유기체 내에서 자발적 복제 또는 염색체 복제를 겪을 수 있다.

적합하고 특히 바람직한 플라스미드는 코리네형 세균에서 복제되는 것이다. 많은 공지된 플라스미드 벡터, 예를 들어 pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) 또는 pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991))는 잠적 (cryptic) 플라스미드 pHM1519, pBL1 또는 pGA1에 기초한다. 다른 플라스미드 벡터, 예를 들어 pCLiK5MCS, 또는 pCG4 (US-A 4,489,160) 또는 pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)) 또는 pAG1 (US-A 5,158,891)에 기초한 것이 동일한 방식으로 사용될 수 있다.

hom-thrB 오페론의 복제 및 증폭을 위해 예를 들어 문헌 (Remscheid et al. Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132(1994))에 기재된 바와 같이 그의 도움으로 염색체 내 통합에 의한 유전자 증폭 방법이 사용될 수 있는 플라스미드 벡터가 또한 적합하다. 이들 방법에서, 완전한 유전자가 숙주 (전형적으로 이. 콜리 (E. coli))에서 복제할 수 있지만 씨. 글루타미쿰에서는 복제하지 않는 플라스미드 벡터 내로 클로닝된다. 적합한 벡터의 예는 pSUP301 (Sirnon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob 또는 pK19mob (Schaefer et al., Gene 145, 69-73 (1994), Bernard et al., Joumal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) 또는 pBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene 41: 337-342)이다. 증폭시킬 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터는 후속적으로 씨. 글루타미쿰의 목적하는 균주 내로의 형질전환에 의해 전달된다. 형질전환 방법은 예를 들어 문헌 (Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), (Dunican and Shivnan, Biotechnology 7, 1067-1070 (1989)) 및 (Tauch et al., FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994))에 기재되어 있다.

본 발명은 추가로 유전학적으로 변형된 미생물에 관한 것이고, 여기서 유전학적 변형은 야생형에 비해 적어도 하나의 유전자의 전사 속도를 변경 또는 유발하고,

a) 적어도 하나의 내재성 유전자의 전사를 조절하는, 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 적어도 하나의 내재성 핵산의 미생물 내에서 특이적 프로모터 활성을 변경하거나,

b) 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 또는 실시태양 a)에 따라 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 프로모터 활성을 갖는 핵산에 관하여 이종성인 미생물에서 유전자의 전사를 조절함으로써 이루어진다.

방법에 대해 상기한 바와 같이, 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 또는 실시태양 a)에 따라 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 미생물에서 유전자 전사의 조절은

b1) 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절하게는 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 핵산을 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 내재성 유전자의 전사가 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절하게는 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 도입된 핵산의 제어 하에 일어나도록 하거나,

b2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 전사가 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절하게는 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 내재성 핵산의 제어 하에 일어나도록 하거나,

b3) 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절하게는 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 전사시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 구성물을 미생물 내에 도입함으로써 달성된다.

본 발명의 추가로 야생형에 비해 적어도 하나의 유전자의 증가된 또는 유발된 전사 속도를 갖는 유전학적으로 변형된 미생물에 관한 것이고, 여기서

ah) 내재성 유전자의 전사를 조절하는, 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 내재성 핵산의 미생물 내의 특이적 프로모터 활성이 야생형에 비해 증가되거나,

bh) 미생물에서 유전자의 전사는 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 또는 실시태양 ah)에 따라 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 조절되고, 여기서, 유전자는 프로모터 활성을 갖는 핵산에 관하여 이종성이다.

방법에 대해 상기한 바와 같이, 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 또는 실시태양 a)에 따라 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 미생물에서 유전자 전사의 조절이

bh1) 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절하게는 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 핵산을 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 내재성 유전자의 전사가 프로모터 활성, 적절하게는 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 제1항에 따른 도입된 핵산의 제어 하에 일어나도록 하거나,

bh2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 전사가 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절하게는 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 내재성 핵산의 제어 하에 일어나도록 하거나,

bh3) 제1항에 따른 프로모터 활성, 적절하게는 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 전사시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 구성물을 미생물 내로 도입함으로써 달성된다.

본 발명은 추가로 야생형에 비해 적어도 하나의 유전자의 감소된 전사 속도를 갖는 유전학적으로 변형된 미생물에 관한 것이고, 여기서

ar) 적어도 하나의 내재성 유전자의 전사를 조절하는, 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 적어도 하나의 내재성 핵산의 미생물 내의 특이적 프로모터 활성은 야생형에 비해 감소되거나,

br) 실시태양 a)에 따라 감소된 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 핵산이 미생물의 게놈에 도입되어, 적어도 하나의 내재성 유전자의 전사가 감소된 프로모터 활성을 갖는 도입된 핵산의 제어 하에 일어난다.

본 발명은 추가로 유전학적으로 변형된 미생물에 관한 것이고, 여기서 유전학적 변형은 야생형에 비해 적어도 하나의 유전자의 발현 속도를 변경 또는 유발하고,

c) 적어도 하나의 내재성 유전자의 발현을 조절하는, 제2항 또는 제3항에 따른 적어도 하나의 내재성 발현 유니트의 미생물 내에서 특이적 발현 활성을 야생형에 비해 변경시키거나,

d) 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유니트에 의해 또는 실시태양 a)에 따라 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유니트에 의해 미생물에서 발현 유니트에 관하여 이종성인 유전자의 발현을 조절하는 것에 의존한다.

방법에 대해 상기한 바와 같이, 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유니트에 의해 또는 실시태양 a)에 따라 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유니트에 의한 미생물 내에서의 유전자 발현의 조절이

d1) 적절하게는 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 하나 이상의 발현 유니트를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 내재성 유전자의 발현이 적절하게는 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 도입된 발현 유니트의 제어 하에 일어나도록 하거나,

d2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 적절하게는 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 내재성 발현 유니트의 제어 하에 일어나도록 하거나,

d3) 적절하게는 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유니트 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 구성물을 미생물 내에 도입함으로써 달성된다.

본 발명은 추가로 야생형에 비해 적어도 하나의 유전자의 증가된 또는 유발된 발현 속도를 갖는 유전학적으로 변형된 미생물에 관한 것이고, 여기서

ch) 내재성 유전자의 발현을 조절하는 제2항 또는 제3항에 따른 적어도 하나의 내재성 발현 유니트의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성이 야생형에 비해 증가되거나,

dh) 미생물에서 발현 유니트에 관하여 이종성인 유전자의 발현이 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유니트에 의해 또는 실시태양 a)에 따라 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유니트에 의해 조절된다.

방법에 대해 상기한 바와 같이, 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유니트 또는 실시태양 a)에 따라 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유니트에 의한 미생물 내에서의 유전자 발현의 조절은

dh1) 적절하게는 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 하나 이상의 발현 유니트를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 내재성 유전자의 발현이 적절하게는 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 도입된 발현 유니트의 제어 하에 일어나도록 하거나,

dh2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 적절하게는 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 내재성 발현 유니트의 제어 하에 일어나도록 하거나,

dh3) 적절하게는 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유니트 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 구성물을 미생물 내로 도입함으로써 달성된다.

본 발명은 추가로 야생형에 비해 적어도 하나의 유전자의 감소된 발현 속도를 갖는 유전학적으로 변형된 미생물에 관한 것이고, 여기서

cr) 적어도 하나의 내재성 유전자의 발현을 조절하는 제2항 또는 제3항에 따른 적어도 하나의 내재성 발현 유니트의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성이 야생형에 비해 감소되거나,

dr) 감소된 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 하나 이상의 발현 유니트가 미생물의 게놈에 도입되어, 적어도 하나의 내재성 유전자의 발현이 감소된 발현 활성을 갖는 제2항 또는 제3항에 따른 도입된 발현 유니트의 제어 하에 일어난다.

본 발명은 추가로 제2항 또는 제3항에 따른 발현 유니트 및 기능적으로 연결된, 발현 유니트에 관하여 이종성인 발현시킬 유전자를 포함하는 유전학적으로 변형된 미생물에 관한 것이다.

상기 유전학적으로 변형된 미생물은 특히 바람직하게는 본 발명의 발현 카세트를 포함한다.

본 발명은 특히 바람직하게는 유전학적으로 변형된 미생물, 특히 본 발명에 따라 정의된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 핵산 구성물을 포함하는 벡터, 특히 셔틀 (shuttle) 벡터 또는 플라스미드 벡터를 포함하는 코리네형 세균에 관한 것이다.

유전학적으로 변형된 미생물의 바람직한 실시태양에서, 상기한 유전자는 미세 화학물질의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산이다.

유전학적으로 변형된 미생물의 특히 바람직한 실시태양에서, 상기한 유전자는 단백성 및 비단백성 아미노산의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 유기산의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 지질 및 지방산의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 디올의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 탄수화물의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 방향족 화합물의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 비타민의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 보조인자의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산 및 효소의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 여기서 유전자는 임의로 추가의 조절 요소를 포함할 수 있다.

아미노산의 생합성 경로로부터의 바람직한 단백질은 아스파르테이트 키나제, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 디히드로디피콜리네이트 합성효소, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 3-포스포글리세레이트 키나제, 피루베이트 카르복실라제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 전사 레귤레이터 LuxR, 전사 레귤레이터 LysR1, 전사 레귤레이터 LysR2, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 호모세린-0-아세틸트랜스퍼라제, 시스타티오닌 감마-신타제, 시스타티오닌 베타-리아제, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제, 포스포세린 포스파타제, 세린 아세틸트랜스퍼라제, 호모세린 데히드로게나제, 호모세린 키나제, 트레오닌 신타제, 트레오닌 엑스포터 캐리어, 트레오닌 데히드라타제, 피루베이트 옥시다제, 라이신 엑스포터, 비오틴 리가제, 시스테인 신타제 I, 시스테인 신타제 II, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제 활성, 술페이트 아데닐트랜스퍼라제 서브유닛 1 및 2, 포스포아데노신 포스포술페이트 리덕타제, 페레독신-술파이트 리덕타제, 페레독신 NADP 리덕타제, 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제, RXA00655 레귤레이터, RXN2910 레귤레이터, 아르기닐-tRNA 합성효소, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 트레오닌 유출 단백질, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, 프럭토스-1,6-비스포스파타제, 술페이트 환원 단백질 RXA077, 술페이트 환원 단백질 RXA248, 술페이트 환원 단백질 RXA247, 단백질 OpcA, 1-포스포프럭토키나제 및 6-포스포프럭토키나제로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

아미노산의 생합성 경로로부터의 단백질 및 유전자의 특히 바람직한 예는 상기 표 1 및 표 2에 기재한 바 있다.

특히 바람직한 미생물 또는 유전학적으로 변형된 미생물은 세균, 조류, 진균 또는 효모이다.

특히 바람직한 미생물은 특히 코리네형 세균이다.

바람직한 코리네형 세균은 코리네박테리움속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 (C. acetoglutamicum), 코리네박테리움 아세토아시도필룸 (C. acetoacidophilum), 코리네박테리움 써모아미노제네스 (C. thermoaminogenes), 코리네박테리움 멜라세콜라 (C. melassecola) 및 코리네박테리움 에피시엔스 (C. efficiens) 종 또는 브레비박테리움속, 특히 브레비박테리움 플라붐 (B. flavum), 브레비박테리움 락토페르멘툼 (B. lactofermentum) 및 브레비박테리움 디바리카툼 (B. divaricatum) 종의 세균이다.

코리네박테리움 및 브레비박테리움속의 특히 바람직한 세균은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC 15806, 코리네박테리움 아세토아시도필룸 ATCC 13870, 코리네박테리움 써모아미노제네스 FERM BP-1539, 코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC 17965, 코리네박테리움 에피시엔스 DSM 44547, 코리네박테리움 에피시엔스 DSM 44548. 코리네박테리움 에피시엔스 DSM 44549, 브레비박테리움 플라붐 ATCC 14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC 13869, 브레비박테리움 디바리카툼 ATCC 14020, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10065 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21608로 이루어진 군 중에서 선택된다.

약자 KFCC는 한국 종균 협회 (Korean Federation of Culture Collection)을 의미하고, 약자 ATCC는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션을 의미하고, 약자 DSM은 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen)을 의미한다.

코리네박테리움 및 브레비박테리움속의 추가로 특히 바람직한 세균은 표 3에 나열한다.

세균		기탁 번호
속	종	ATCC	FERM	NRRL	CECT	NCIMB	CBS	NCTC	DSMZ
브레비박테리움	암모니아제네스 (ammoniagenes)	21054
		19350
		19351
		19352
		19353
		19354
		19355
		19356
		21055
		21077
		21553
		21580
		39101
	부타니쿰 (butanicum)	21196
	디바리카툼	21792	P928
	플라붐	21474
		21129
		21518
				B11474
				B11472
		21127
		21128
		21427
		21475
		21517
		21528
		21529
				B11477
				B11478
		21127
				B11474
	헤알리이 (healii)	15527
	케토글루타미쿰 (ketoglutamicum)	21004
		21089
	케토소레덕툼 (ketosoreductum)	21914

브레비박테리움	락토페르멘툼			70
				74
				77
		21798
		21799
		21800
		21801
			B11470
			B11471
		21086
		21420
		21086
		31269
	리넨스 (linens)	9174
		19391
		8377
	파라피놀리티쿰 (paraffinolyticum)				11160
	스펙. (spec.)					717.73
						717.73
		14604
		21860
		21864
		21865
		21866
		19240
코리네박테리움	아세토아시도필룸	21476
		13870
	아세토글루타미쿰		B11473
			B11475
		15806
		21491
		31270
	아세토필룸 (acetophilum)		B3671
	암모니아제네스	6872					2399
		15511
	푸지오켄세 (fujiokense)	21496
	글루타미쿰	14067
		39137
		21254
		21255
		31830
		13032

코리네박테리움	글루타미쿰	14305
		15455
		13058
		13059
		13060
		21492
		21513
		21526
		21543
		13287
		21851
		21253
		21514
		21516
		21299
		21300
		39684
		21488
		21649
		21650
		19223
		13869
		21157
		21158
		21159
		21355
		31808
		21674
		21562
		21563
		21564
		21565
		21566
		21567
		21568
		21569
		21570
		21571
		21572
		21573
		21579
		19049

코리네박테리움	글루타미쿰	19050
		19051
		19052
		19053
		19054
		19055
		19056
		19057
		19058
		19059
		19060
		19185
		13286
		21515
		21527
		21544
		21492
				B8183
				B8182
				B12416
				B12417
				B12418
				B11476
		21608
	릴륨 (lilium)		P973
	니트릴로필루스 (nitrilophilus)	21419			11594
	스펙.		P4445
			P4446
		31088
		31089
		31090
		31090
		31090
		15954				20145
		21857
		21862
		21863

약어는 다음과 같은 의미를 갖는다.

ATCC: 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션,

FERM: 퍼멘테이션 리서치 인스티튜트 (Fermentation Research Institute, 일본 지바),

NRRL: ARS 컬쳐 컬렉션, 노던 리져널 리서치 래보래토리 (Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory, 미국 일리노이주 페오리아),

CECT: 컬렉시온 에스파놀라 드 컬티보스 티포 (Coleccion Espanola de Cultivos Tipo, 스페인 발렌시아),

NCIMB: 내셔날 컬렉션 오브 인더스트리얼 앤드 머린 박테리아 엘티디. (National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd., 영국 애버딘),

CBS: 센트라알부로 보어 쉬멜컬쳐스 (Centraalbureau voor Schimmelcultures, 네덜란드 바른),

NCTC: 내셔널 컬렉션 오브 타입 컬쳐스 (National Collection of Type Cultures, 영국 런던),

DSMZ: 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘.

프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 및 본 발명의 발현 유니트를 통해 상기한 본 발명의 방법을 사용하여 상기한 본 발명의 유전적으로 변형된 미생물에서 대사 경로를 특이적인 생합성 산물로 조절할 수 있다.

이를 위해, 예를 들어 특이적인 생합성 산물로 이끄는 대사 경로는 생합성 경로의 유전자의 전사 속도 또는 발현 속도를 유발 또는 증가시킴으로써 증가되고, 여기서 증가된 양의 단백질은 요구되는 생합성 경로의 상기 단백질의 총 활성을 증가시키고 요구되는 생합성 산물 쪽으로 대사 유입을 증가시킨다.

또한, 특이적인 생합성 산물로부터 분지하는 대사 경로는 분지하는 생합성 경로의 유전자의 전사 속도 또는 발현 속도를 감소시킴으로써 감소될 수 있고, 여기서 감소된 양의 단백질은 원치 않는 생합성 경로의 상기 단백질의 총 활성을 감소시키고, 요구되는 생합성 산물 쪽으로 대사 유입을 추가로 증가시킨다.

본 발명의 유전학적으로 변형된 미생물은 예를 들어 글루코스, 슈크로스, 락토스, 프럭토스, 말토스, 당밀, 전분, 셀룰로스 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 생합성 산물을 제조할 수 있다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 유전학적으로 변형된 미생물을 배양함으로써 생합성 산물을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.

요구되는 생합성 산물에 따라, 다양한 유전자의 전사 속도 또는 발현 속도는 증가되거나 감소되어야 한다. 통상적으로, 많은 유전자의 전사 속도 또는 발현 속도의 변경, 즉 유전자 조합물의 전사 속도 또는 발현 속도의 증가 및(또는) 유전자 조합물의 전사 속도 또는 발현 속도의 감소가 유리하다.

본 발명의 유전학적으로 변형된 미생물에서, 유전자의 적어도 하나의 변경된, 즉 증가 또는 감소된 전사 속도 또는 발현 속도는 본 발명의 프로모터 활성을 갖는 핵산 또는 발현 유니트에 의한 것일 수 있다.

또한, 유전학적으로 변형된 미생물에서 유전자의 추가로 변경된, 즉 추가로 증가 또는 추가로 감소된 전사 속도 또는 발현 속도는 반드시 그럴 필요는 없지만 본 발명의 프로모터 활성을 갖는 핵산 또는 발현 유니트에서 유래할 수 있다.

따라서, 본 발명은 추가로 본 발명의 유전학적으로 변형된 미생물을 배양함으로써 생합성 산물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

바람직한 생합성 산물은 미세 화학물질이다.

용어 "미세 화학물질"은 당업계에 공지되어 있고, 유기체에 의해 생산되는 화합물을 포함하며, 다양한 산업 분야, 예를 들어 제약업, 농업, 화장업, 식품 및 원료 산업에 사용되고, 이로 제한되지 않는다. 이들 화합물은 유기산, 예를 들어 타르타르산, 이타콘산 및 디아미노피멜산, 및 단백성 및 비단백성 아미노산, 퓨린 염기 및 피리미딘 염기, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 (예를 들어 Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, pp. 561-612, in Biotechnology vol. 6, Rehm et al., editors. VCH: Weinheim 및 여기에 인용된 문헌에 기재된), 지질, 포화 및 불포화 지방산 (예를 들어 아라키돈산), 디올 (예를 들어 프로판디올 및 부탄디올), 탄수화물 (예를 들어 히알루론산 및 트레할로스), 방향족 화합물 (예를 들어 방향족 아민, 바닐린 및 인디고), 비타민 및 보조인자 (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, "Vitamins", pp. 443-613 (1996) VCH: Weinheim 및 여기에 인용된 문헌; 및 Ong, A. S., Niki, E. and Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research-Asia, held on Sept. 1-3, Sept. 1994 in Penang, Malysia, AOCS Press (1995)), 효소 및 문헌 [Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 및 여기에 인용된 문헌]에 기재된 다른 모든 화학물질을 포함한다. 특정 미세 화학물질의 대사 및 용도는 아래에서 상세히 설명한다.

I. 아미노산 대사 및 용도

아미노산은 모든 단백질의 기본 구조 단위를 구성하므로 모든 생물에서 정상적인 세포 기능에 필수적이다. 용어 "아미노산"은 당업계에 인지되어 있다. 아미노산 중 단백질 생성 아미노산은 20종이며 펩티드 결합으로 연결되어 있는 단백질의 구조 단위로 작용하는 반면, 비단백성 아미노산 (수백종이 공지되어 있음)은 정상적으로는 단백질에서 발견되지 않는다 (문헌 [Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p.57-97 VCH: Weinheim (1985)] 참조). 아미노산은 D 또는 L 구조일 수 있지만, L-아미노산이 통상적으로 자연발생 단백질에서 발견되는 유일한 형태이다. 20종의 단백질 생성 아미노산 각각의 생합성 및 분해 경로의 특징은 원핵세포 및 진핵세포 둘다에서 잘 규명되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Stryer, L. Biochemistry, 3rd edition, pages 578-590 (1988)] 참조). 생합성의 복잡성으로 인한 일반적인 영양 요구물이기 때문에 "필수" 아미노산이라고 지칭되는 아미노산 (히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판 및 발린)은 단순한 생합성 경로에 의해 나머지 11종의 "비필수" 아미노산 (알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르테이트, 시스테인, 글루타메이트, 글루타민, 글라이신, 프롤린, 세린 및 티로신)으로 쉽게 전환된다. 고등동물은 이들 아미노산 중 일부를 합성하는 능력을 보유하지만, 필수 아미노산은 식사로부터 공급되어야 정상적인 단백질 합성이 일어난다.

아미노산의 단백질 생합성에서의 기능 이외에도, 이들 아미노산은 그 자체가 흥미로운 화학물질이고, 다수의 아미노산이 식품, 사료, 화학물질, 화장품, 농업 및 제약산업에 다양하게 사용될 수 있는 것으로 밝혀져 있다. 라이신은 인간뿐만 아니라 가금 및 돼지와 같은 단위(monogastric) 동물의 영양에 있어서도 중요한 아미노산이다. 글루타메이트는 향미제 첨가물(모노-소듐글루타메이트, MSG)로서 가장 흔히 사용되고, 아스파르테이트, 페닐알라닌, 글라이신 및 시트테인도 식품산업 전반에 걸쳐 광범위하게 사용된다. 글라이신, L-메티오닌 및 트립토판은 모두 제약산업에 사용된다. 글루타민, 발린, 류신, 이소류신, 히스티딘, 아르기닌, 프롤린, 세린 및 알라닌은 제약 및 화장품 산업 둘다에 사용된다. 트레오닌, 트립토판 및 D/L-메티오닌은 통상적인 사료 첨가제이다 (문헌 [Leuchtenberger, W. (1996) Amino Acids - technical production and use, p.466-502 in Rehm et al. (eds.) Biotechnology vol. 6, chapter 14a, VCH: Weinheim]). 또한, 이들 아미노산은 합성 아미노산 및 단백질, 예를 들어 N-아세틸시스테인, S-카르복시메틸-L-시스테인, (S)-5-히드록시트립토판, 및 문헌 [Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p.57-97, VCH: Weinheim, 1985]에 기재된 다른 것의 합성을 위한 전구체로 유용하다는 것이 밝혀져 있다.

박테리아 등과 같이 이들 천연 아미노산을 생산할 수 있는 생물에서의 이들 천연 아미노산의 생합성 특징은 잘 규명되어 있다 (박테리아 아미노산 생합성 및 그의 조절에 대한 검토는 문헌 [Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 533-606] 참조). 글루타메이트는 시트르산 사이클의 중간체인 α-케토글루타레이트의 환원성 아미노화에 의해 합성된다. 글루타민, 프롤린 및 아르기닌은 각각 글루타메이트로부터 생성된다. 세린의 생합성은 3-포스포글리세레이트(해당작용의 중간체)로 출발하여, 산화, 트랜스아미노화 및 가수분해의 3 단계 과정 후에 세린이 생성된다. 시스테인 및 글라이신은 둘다 세린으로부터 생성되는데, 시스테인은 호모시스테인과 세린의 축합에 의해 생성되며, 글라이신은 세린 트랜스히드록시메틸라제에 의해 촉매되는 반응에서 측쇄 β-탄소 원자가 테트라히드로폴레이트로 전달되어 생성된다. 페닐알라닌 및 티로신은 프레페네이트의 합성후 최종 두단계에서만 다른 9 단계 생합성 경로에서 해당작용 및 펜토스포스페이트 경로 전구체인 에리쓰로스 4-포스페이트 및 포스포에놀피루베이트로부터 합성된다. 트립토판도 이들 두 초기 분자로부터 합성되지만, 그의 합성은 11 단계 경로이다. 티로신은 페닐알라닌 히드록실라제에 의해 촉매되는 반응에서 페닐알라닌으로부터 합성될 수도 있다. 알라닌, 발린 및 류신은 해당작용의 최종 생성물인 피루베이트의 모든 생합성 산물이다. 아스파르테이트는 시트르산 사이클의 중간체인 옥살로아세테이트로부터 형성된다. 아스파라긴, 메티오닌, 트레오닌 및 라이신 각각은 아스파르테이트의 전환에 의해 생성된다. 이소류신은 트레오닌으로부터 형성된다. 히스티딘은 5-포스포리보실 1-피로포스페이트, 활성화된 당으로부터 9 단계 경로로 형성된다.

세포의 단백질 합성 필요량을 초과하는 아미노산은 저장될 수 없고, 그대신에 분해되어 세포의 주요 대사경로에 대한 중간체로 제공된다 (이에 대한 검토는 문헌 [Stryer, L. Biochemistry 3rd ed. Ch. 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle" p.495-516 (1988)] 참조). 세포가 불필요한 아미노산을 유용한 대사 중간체로 전환시킬 수 있다 하더라도, 아미노산 생성은 에너지, 전구체 분자, 및 이들 아미노산을 합성하는데 필요한 효소를 고려할 때 손실이 큰 합성이다. 따라서, 특정한 아미노산의 존재가 그 자신의 생성을 서서히 또는 완전히 중지시키는 피드백 억제에 의해 아미노산의 생합성이 조절된다는 것은 놀라운 일이 아니다 (아미노산 생합성 경로의 피드백 메카니즘에 대한 검토는 문헌 [Stryer, L. Biochemistry 3rd ed. Ch. 24 "Biosynthesis of Amino Acids and Heme", p. 575-600 (1988)] 참조). 따라서, 임의의 특정 아미노산의 생산량은 세포에 존재하는 아미노산의 양에 의해 제한된다.

II. 비타민, 보조인자 및 영양제의 대사 및 용도

비타민, 보조인자 및 영양제는 박테리아와 같은 다른 생물에 의해 쉽게 합성된다 하더라도 고등동물이 합성 능력을 상실하여 섭취해야 하는 분자의 다른 군을 구성한다. 이들 분자는 그 자체가 생물 활성 물질이거나, 다양한 대사경로에서 전자전달자 또는 중간체로 작용할 수 있는 생물학적 활성 물질의 전구체이다. 이들 화합물은 그 영양적 가치뿐만 아니라, 착색제, 산화방지제 및 촉매로서, 또는 다른 과정의 보조제로서도 상당한 산업적 가치를 갖는다 (이들 화합물의 구조, 활성 및 산업적인 용도에 대한 검토는 예를 들어 문헌 [Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins" vol. A27, p.443-613, VCH: Weinheim, 1996] 참조). 용어 "비타민"은 당업계에 인지되어 있고, 생물의 정상적인 기능을 위해서는 필요하지만 생물이 스스로 합성할 수 없는 영양분을 포함한다. 비타민군은 보조인자 및 영양제 화합물도 포함할 수 있다. 용어 "보조인자"는 정상적인 효소 활성이 일어나는데 필요한 비단백질성 화합물을 포함한다. 이러한 화합물은 유기성또는 무기성일 수 있고, 본 발명의 보조인자 분자는 유기성인 것이 바람직하다. 용어 "영양제(nutraceutical)"는 식물 및 동물, 특히 인간에게 건강상 유익한 식이성 보충물을 포함한다. 이러한 분자의 예로는 비타민, 산화방지제 및 특정지질 (예를 들어, 다불포화 지방산)이 있다.

이들을 생산할 수 있는 생물, 예를 들어 박테리아에서 일어나는 이들 분자의 생합성의 특징은 잘 규명되어 있다 (문헌 [Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins" vol. A27, p.443-613, VCH: Weinheim, 1996], 문헌 [Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley ＆.. Sons], 문헌 [Ong, A.S., Niki, E. ＆.. Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health, and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and the Society for Free Radical Research-Asia, held Sept. 1-3, 1994 at Penang, Malaysia, AOCS Press: Champaign, IL X, 374 S]).

티아민(비타민 B₁)은 피리미딘과 티아졸 잔기의 화학적 커플링에 의해 생성된다. 리보플라빈(비타민 B₂)는 구아노신-5'-트리포스페이트(GTP) 및 리보스-5'-포스페이트로부터 합성된다. 그 다음, 상기 리보플라빈은 플라빈 모노뉴클레오티드(FMN) 및 플라빈-아데닌 디뉴클레오티드(FAD)의 합성에 사용된다. 총칭하여 "비타민 B6"로 지칭되는 화합물족 (예를 들어, 피리독신, 피리독사민, 피리독살 5'-포스페이트, 및 상업적으로 시판되는 피리독신 히드로클로라이드)은 모두 공통적인 구조 단위인 5-히드록시-6-메틸피리딘의 유도체이다. 판토테네이트(판토텐산, (R)(+)-N-(2,4-디히드록시-3,3-디메틸-1-옥소부틸)-β-알라닌)은 화학적인 합성 또는 발효에 의해 생성될 수 있다. 판토테네이트의 생합성의 최종 단계는 β-알라닌과 판토산의 ATP-유도 축합으로 구성된다. 판토산으로 전환하는 생합성 단계, β-알라닌으로 전환하는 생합성 단계 및 판토텐산으로의 축합에 관여하는 효소는 공지되어 있다. 판토테네이트의 대사 활성 형태는 조효소 A인데, 이 조효소 A를 위한 생합성은 5 단계 효소 반응으로 진행된다. 판토테네이트, 피리독살 5'-포스페이트, 시스테인 및 ATP는 조효소 A의 전구체이다. 이들 효소는 판토테네이트의 형성을 촉매할뿐만 아니라 (R)-판토산, (R)-판토락톤, (R)-판테놀(프로비타민 B₅), 판테테인( 및 그의 유도체), 및 조효소 A의 생성도 촉매한다.

미생물에서 전구체 분자인 피멜로일-CoA로부터의 바이오틴 생합성 과정은 자세히 연구되어 있고, 이에 관련된 여러 가지 유전자가 확인되어 있다. 상응하는 다수의 단백질이 Fe-클러스터 합성에도 관여하는 것으로 밝혀져 있고, 이들 단백질은 nifS 클래스 단백질의 구성원이다. 리포산은 옥탄산으로부터 유도되고, 에너지 대사에서 조효소로 작용하는데, 상기 리포산은 에너지 대사에서 피루베이트 데히드로게나제 복합체 및 α-케토글루타레이트 데히드로게나제 복합체의 일부가 된다. 폴레이트는 모두 엽산 유도체 물질의 군이고, 엽산은 L-글루탐산, p-아미노-벤조산 및 6-메틸프테린으로부터 유도된다. 대사 중간체인 구아노신 5'-트리포스페이트(GTP), L-글루탐산 및 p-아미노벤조산으로부터 출발하는, 엽산 및 그의 유도체의 생합성은 일부 미생물에서 상세히 연구되어 있다.

코리노이드(예를 들어, 코발라민 및 특히 비타민 B₁₂) 및 포르피린은 테트라피롤 고리계에 의해 특징지워지는 화학물질의 군에 속한다. 비타민 B₁₂의 생합성은 그 특징이 완전히 규명되어 있지는 않을 정도로 매우 복잡하지만, 이에 관련된 다수의 효소 및 기질이 현재 공지되어 있다. 니코틴산(니코티네이트) 및 니코틴아미드는 "니아신"으로도 지칭되는 피리딘 유도체이다. 니아신은 중요한 조효소인 NAD (니코틴아미드-아데닌 디뉴클레오티드), NADP (니코틴아미드-아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트) 및 그들의 환원형 전구체이다.

이들 화합물의 대규모 생산은, 비록 이들 화학물질 중 일부, 예를 들어 리보플라빈, 비타민 B₆, 판토테네이트 및 바이오틴이 미생물의 대규모 배양에 의해 생산되기는 하지만, 주로 무세포 화학합성에 의존하고 있는 실정이다. 비타민 B₁₂만이 오직 발효에 의해 생성되는데, 이는 비타민 B₁₂ 합성의 복잡성 때문이다. 시험관 내방법론은 상당한 재료 및 시간을 요하며, 종종 많은 비용이 소요된다.

III. 퓨린, 피리미딘, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 대사 및 용도

퓨린 및 피리미딘 대사 유전자 및 이들의 상응하는 단백질은 종양 질환 및 바이러스 감염의 치료에 중요한 표적이다. 용어 "퓨린" 또는 "피리미딘"은 핵산, 조효소 및 뉴클레오티드의 구성 성분인 질소 함유 염기를 포함한다. 용어 "뉴클레오티드"는 질소 함유 염기, 오탄당(RNA의 경우, 상기 당은 리보스이고, DNA의 경우, 상기 당은 D-데옥시리보스임) 및 인산으로 구성된, 핵산 분자의 기본 구조 단위를 포함한다. 용어 "뉴클레오시드"는 뉴클레오티드의 전구체로 작용하지만 뉴클레오티드가 갖는 인산 잔기가 없는 분자를 포함한다. 이들 분자의 생합성을 억제하거나 핵산 분자를 형성하기 위한 이들 분자의 동원(動員)을 억제함으로써, RNA 및 DNA 합성 억제가 가능하고, 암세포에 표적화시키는 방식으로 상기 활성을 억제하여 종양 세포의 분열 및 복제 능력을 억제할 수 있다.

또한, 핵산 분자를 형성하기보다는 에너지 저장물(즉, AMP) 또는 조효소(즉, FAD 및 NAD)로 작용하는 뉴클레오티드도 있다.

이들 화학물질이 퓨린 및(또는) 피리미딘 대사에 영향을 미침으로써 상기 의학적 증상에 사용될 수 있다는 것은 여러 가지 문헌에 기재되어 있다(예를 들어, 문헌 [Christopherson, R.I. and Lyons, S.D. (1990) "Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents." Med. Res. Reviews 10: 505548]). 퓨린 및 피리미딘 대사에 관여하는 효소의 연구는 예를 들어, 면역 억제제 또는 항증식제로 사용할 수 있는 신약의 개발에 초점을 두고 있다(문헌 [Smith, J.L., (1995) "Enzymes in nucleotide synthesis." Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 752-757, (1995) Biochem Soc. Transact. 23: 877-902]). 그러나, 퓨린 및 피리미딘 염기, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 여러 가지 미세 화학물질(예를 들어, 티아민, S-아데노실메티오닌, 폴레이트 또는 리보플라빈)의 생합성에 있어서 중간체로서의 용도, 세포를 위한 에너지 전달자(예를 들어, ATP 또는 GTP)로서의 용도, 및 통상적으로 향증진제(예를 들어, IMP 또는 GMP)로 사용되는 화학물질 자체를 위한 용도 또는 여러 가지 의학 용도를 갖는다(예를 들어, 문헌 [Kuninaka, A. (1996) "Nucleotides and Related Compounds" in Biotechnology vol. 6, Rehm et al., eds. VCH: Weinheim, p.561-612] 참조). 또한, 퓨린, 피리미딘, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 대사에 관여하는 효소를 표적으로 사용하여 살진균제, 제초제 및 살충제를 비롯한, 농작물 보호용 화학물질을 개발하는 연구가 증가하고 있다.

박테리아에서 이들 화합물 대사의 특징은 규명되어 있다(이에 대한 검토는 예를 들어 문헌 [Zalkin, H. and Dixon, J. E. (1992) "de novo purine nucleotide biosynthesis", in: Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology, vol. 42, Academic Press:, p.259-287], 및 문헌 [Michal, G. (1999) "Nucleotides and Nucleosides", Chapter 8 in: Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley: New York] 참조). 퓨린의 대사는 집중적인 연구의 대상이고, 세포의 정상적인 기능에 필수적이다. 고등동물의 손상된 퓨린 대사는 통풍과 같은 심각한 질환을 초래할 수 있다. 퓨린 뉴클레오티드는 구아노신 5'-모노포스페이트(GMP) 또는 아데노신 5'-모노포스페이트(AMP)를 생성시키는 중간체 화합물인 이노신 5'-포스페이트(IMP)를 통해 일련의 단계에서 리보스 5-포스페이트로부터 합성되고, 이들 GMP 또는 AMP로부터 뉴클레오티드로 사용되는 트리포스페이트가 용이하게 형성된다. 이들 화합물은 에너지 저장물로도 사용되므로, 이들의 분해는 세포에서 다수의 다양한 생합성 과정을 위한 에너지를 공급한다. 피리미딘 생합성은 리보스 5-포스페이트로부터의 유리딘 5'-모노포스페이트(UMP)의 형성에 의해 진행된다. 그 다음, UMP가 시티딘 5'-트리포스페이트(CTP)로 전환된다. 이들 모든 뉴클레오티드의 데옥시 형태는 뉴클레오티드의 디포스페이트 리보스 형태가 뉴클레오티드의 디포스페이트 데옥시리보스 형태로 전환되는 1단계 환원 반응에서 생성된다. 인산화시, 이들 분자는 DNA 합성에 참여할 수 있다.

IV. 트레할로스 대사 및 용도

트레할로스는 α,α-1,1 연결에 의해 연결된 2개의 글루코스 분자로 구성된다. 트레할로스는 감미료, 건조 또는 동결식품용 첨가제를 위한 식품산업, 및 음료산업에 통상적으로 사용된다. 그러나, 제약, 화장품 및 생물공학 산업에도 사용된다(예를 들어, 문헌 [Nishimoto et al., (1998) 미국 특허 5,759,610], 문헌 [Singer, M.A. and Lindquist, S. (1998) Trends Biotech. 16: 460-467], 문헌 [Paiva, C.L.A. and Panek, A.D. (1996) Biotech. Ann. Rev. 2: 293-314], 문헌 [Shiosaka, M. (1997) J. Japan 172: 97-10] 참조). 트레할로스는 다수의 미생물로부터 효소에 의해 생성되고 주변 배지 내로 자연적으로 방출되는데, 트레할로스는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 상기 배지로부터 단리할 수 있다.

특히 바람직하게는, 생합성 산물은 유기산, 단백질, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드, 단백성 및 비단백성 아미노산, 지질 및 지방산, 디올, 탄수화물, 방향족 화합물, 비타민 및 보조인자, 효소 및 단백질로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

바람직한 유기산은 타르타르산, 이타콘산 및 디아미노피멜산이다.

바람직한 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 예를 들어 문헌 [Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, pp. 561-612, in Biotechnology vol. 6, Rehm et al., editors. VCH: Weinheim] 및 인용된 참고문헌에 기재되어 있다.

바람직한 생합성 산물은 추가로 예를 들어 문헌 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, "Vitamins", pp. 443-613 (1996) VCH: Weinheim 및 인용된 참고문헌; 및 Ong, A. S., Niki, E. and Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research Asia, held on Sept. 1-3, Sept. 1994 in Penang, Malysia, AOCS Press(1995)), Enzyme Polyketide (Cane et al. (1998) Science 282: 63-68)]에 기재된 지질, 포화 및 불포화 지방산, 예를 들어 아라키돈산, 디올, 예를 들어 프로판디올 및 부탄디올, 탄수화물, 예를 들어 히알루론산 및 트레할로스, 방향족 화합물, 예를 들어 방향족 아민, 바닐린 및 인디고, 비타민 및 보조인자, 및 문헌 [Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 및 여기에 인용된 문헌]에 기재된 다른 모든 화학물질이다.

특히 바람직한 생합성 산물은 아미노산, 특히 바람직하게는 필수 아미노산, 특히 L-글라이신, L-알라닌, L-류신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-트립토판, L-라이신, L-글루타민, L-글루탐산, L-세린, L-프롤린, L-발린, L-이소류신, L-시스테인, L-티로신, L-히스티딘, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산 및 L-트레오닌, L-호모세린, 특히 L-라이신, L-메티오닌 및 L-트레오닌이다. 예를 들어 라이신, 메티오닌 및 트레오닌과 같은 아미노산은 이하에서 각각의 경우에 아미노산의 L 및 D 형태 모두, 바람직하게는 L 형태, 예를 들어 L-라이신, L-메티오닌 및 L-트레오닌을 의미한다.

본 발명은 특히 야생형에 비해 적어도 하나의 유전자의 증가 또는 유발된 발현 속도를 갖는 유전학적으로 변형된 미생물을 배양함으로써 라이신을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 여기서

ch) 내재성 유전자의 발현을 조절하는, 본 발명의 적어도 하나의 내재성 발현 유니트의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성이 야생형에 비해 증가되거나,

dh) 미생물에서 발현 유니트와 관련하여 이종성인 유전자의 발현이 본 발명의 발현 유니트에 의해 또는 실시태양 a)에 따라 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 발현 유니트에 의해 조절되고,

상기 유전자는 아스파르테이트 키나제를 코딩하는 핵산, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제를 코딩하는 핵산, 디히드로디피콜리네이트 합성효소를 코딩하는 핵산, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제를 코딩하는 핵산, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 3-포스포글리세레이트 키나제를 코딩하는 핵산, 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 트리오스포스페이트 이소머라제를 코딩하는 핵산, 전사 레귤레이터 LuxR을 코딩하는 핵산, 전사 레귤레이터 LysR1을 코딩하는 핵산, 전사 레귤레이터 LysR2를 코딩하는 핵산, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제를 코딩하는 핵산, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 트랜스케톨라제를 코딩하는 핵산, 트랜스알돌라제를 코딩하는 핵산, 라이신 엑스포터를 코딩하는 핵산, 비오틴 리가제를 코딩하는 핵산, 아르기닐-tRNA 합성효소를 코딩하는 핵산, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 프럭토스-1,6-비스포스파타제를 코딩하는 핵산, 단백질 OpcA를 코딩하는 핵산, 1-포스포프럭토키나제를 코딩하는 핵산 및 6-포스포프럭토키나제를 코딩하는 핵산으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

방법에 대해 상기한 바와 같이, 본 발명의 발현 유니트 또는 실시태양 ch)에 따라 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 발현 유니트에 의한 미생물 내에서의 유전자 발현의 조절은

dh1) 적절하게는 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 하나 이상의 발현 유니트를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 내재성 유전자의 발현이 적절하게는 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 도입된 발현 유니트의 제어 하에 일어나도록 하거나,

dh2) 하나 이상의 상기 유전자를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 적절하게는 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 본 발명의 내재성 발현 유니트의 제어 하에 일어나도록 하거나,

라이신 제조를 위한 상기 방법의 추가의 바람직한 실시태양은 아스파르테이트 키나제 활성, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제 활성, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제 활성, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제 활성, 디히드로디피콜리네이트 합성효소 활성, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제 활성, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 활성, 3-포스포글리세레이트 키나제 활성, 피루베이트 카르복실라제 활성, 트리오스포스페이트 이소머라제 활성, 전사 레귤레이터 LuxR의 활성, 전사 레귤레이터 LysR1의 활성, 전사 레귤레이터 LysR2의 활성, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제 활성, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제 활성, 트랜스케톨라제 활성, 트랜스알돌라제 활성, 라이신 엑스포터 활성, 아르기닐-tRNA 합성효소 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 활성, 프럭토스-1,6-비스포스파타제 활성, 단백질 OpcA 활성, 1-포스포프럭토키나제 활성, 6-포스포프럭토키나제 활성 및 비오틴 리가제 활성으로 이루어지는 군 중에서 선택되는, 야생형에 비해 추가로 증가된 적어도 하나의 활성을 갖는 유전학적으로 변형된 미생물을 포함한다.

라이신 제조를 위한 상기 방법의 추가의 특히 바람직한 실시태양은 트레오닌 데히드라타제 활성, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 활성, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성, 피루베이트 옥시다제 활성, 호모세린 키나제 활성, 호모세린 데히드로게나제 활성, 트레오닌 엑스포터 활성, 트레오닌 유출 단백질 활성, 아스파라기나제 활성, 아스파르테이트 데카르복실라제 활성 및 트레오닌 신타제 활성으로 이루어지는 군 중에서 선택되는, 야생형에 비해 추가로 감소된 적어도 하나의 활성을 갖는 유전학적으로 변형된 미생물을 포함한다.

상기한 적어도 하나의 활성의 상기 추가의 증가 또는 감소된 활성은 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 및(또는) 본 발명의 발현 유니트에 의해 유발될 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다.

본 발명은 추가로 야생형에 비해 적어도 하나의 유전자의 증가 또는 유발된 발현 속도를 갖는 유전학적으로 변형된 미생물을 배양함으로써 메티오닌을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 여기서

dh) 미생물에서 발현 유니트와 관련하여 이종성인 유전자의 발현이 본 발명의 발현 유니트에 의해 또는 실시태양 a)에 따라 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 발현 유니트에 의해 조절되고,

상기 유전자는 아스파르테이트 키나제를 코딩하는 핵산, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 호모세린 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 3-포스포글리세레이트 키나제를 코딩하는 핵산, 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 트리오스포스페이트 이소머라제를 코딩하는 핵산, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산, 시스타티오닌 감마-신타제를 코딩하는 핵산, 시스타티오닌 베타-리아제를 코딩하는 핵산, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제를 코딩하는 핵산, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제를 코딩하는 핵산, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산, 포스포세린 포스파타제를 코딩하는 핵산, 세린 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산, 시스테인 신타제 I을 코딩하는 핵산, 시스테인 신타제 II 활성을 코딩하는 핵산, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제 활성을 코딩하는 핵산, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제 활성을 코딩하는 핵산, 술페이트 아데닐일트랜스퍼라제 활성을 코딩하는 핵산, 포스포아데노신 포스포술페이트 리덕타제 활성을 코딩하는 핵산, 페레독신-술파이트 리덕타제 활성을 코딩하는 핵산, 페레독신 NADPH-리덕타제 활성을 코딩하는 핵산, 페레독신 활성을 코딩하는 핵산, 술페이트 환원 단백질 RXA077을 코딩하는 핵산, 술페이트 환원 단백질 RXA248을 코딩하는 핵산, 술페이트 환원 단백질 RXA247을 코딩하는 핵산, RXA0655 레귤레이터를 코딩하는 핵산 및 RXN2910 레귤레이터를 코딩하는 핵산으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

메티오닌 제조를 위한 상기 방법의 추가의 바람직한 실시태양은 아스파르테이트 키나제 활성, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제 활성, 호모세린 데히드로게나제 활성, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 활성, 3-포스포글리세레이트 키나제 활성, 피루베이트 카르복실라제 활성, 트리오스포스페이트 이소머라제 활성, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 활성, 시스타티오닌 감마-신타제 활성, 시스타티오닌 베타-리아제 활성, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 활성, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제 활성, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제 활성, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제 활성, 포스포세린 포스파타제 활성, 세린 아세틸트랜스퍼라제 활성, 시스테인 신타제 I 활성, 시스테인 신타제 II 활성, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제 활성, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제 활성, 술페이트 아데닐일트랜스퍼라제 활성, 포스포아데노신 포스포술페이트 리덕타제 활성, 페레독신-술파이트 리덕타제 활성, 페레독신 NADPH-리덕타제 활성, 페레독신 활성, 술페이트 환원 단백질 RXA077의 활성, 술페이트 환원 단백질 RXA248의 활성, 술페이트 환원 단백질 RXA247의 활성, RXA655 레귤레이터의 활성 및 RXN2910 레귤레이터의 활성으로 이루어지는 군 중에서 선택되는, 야생형에 비해 추가로 증가된 적어도 하나의 활성을 갖는 유전학적으로 변형된 미생물을 포함한다.

메티오닌 제조를 위한 상기 방법의 추가의 특히 바람직한 실시태양은 호모세린 키나제 활성, 트레오닌 데히드라타제 활성, 트레오닌 신타제 활성, 메조-디아미노피멜레이트 D-데히드로게나제 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성, 피루베이트 옥시다제 활성, 디히드로디피콜리네이트 신타제 활성, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제 활성, 및 디아미노피콜리네이트 데카르복실라제 활성으로 이루어지는 군 중에서 선택되는, 야생형에 비해 추가로 감소된 적어도 하나의 활성을 갖는 유전학적으로 변형된 미생물을 포함한다.

상기한 적어도 하나의 활성의 상기 추가의 증가 또는 감소된 활성은 프로모터 활성을 갖는 본 발명의 핵산 및(또는) 본 발명의 발현 유니트에 의해 유도될 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다.

본 발명은 추가로 야생형에 비해 적어도 하나의 유전자의 증가 또는 유발된 발현 속도를 갖는 유전학적으로 변형된 미생물을 배양함으로써 트레오닌을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 여기서

상기 유전자는 아스파르테이트 키나제를 코딩하는 핵산, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 3-포스포글리세레이트 키나제를 코딩하는 핵산, 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 트리오스포스페이트 이소머라제를 코딩하는 핵산, 호모세린 키나제를 코딩하는 핵산, 트레오닌 신타제를 코딩하는 핵산, 트레오닌 엑스포터 캐리어를 코딩하는 핵산, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 트랜스알돌라제를 코딩하는 핵산, 트랜스케톨라제를 코딩하는 핵산, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제를 코딩하는 핵산, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 라이신 엑스포터를 코딩하는 핵산, 비오틴 리가제를 코딩하는 핵산, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 트레오닌 유출 단백질을 코딩하는 핵산, 프럭토스-1,6-비스포스파타제를 코딩하는 핵산, 단백질 OpcA를 코딩하는 핵산, 1-포스포프럭토키나제를 코딩하는 핵산, 6-포스포프럭토키나제를 코딩하는 핵산 및 호모세린 데히드로게나제를 코딩하는 핵산으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

트레오닌 제조를 위한 상기 방법의 추가의 바람직한 실시태양은 아스파르테이트 키나제 활성, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제 활성, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 활성, 3-포스포글리세레이트 키나제 활성, 피루베이트 카르복실라제 활성, 트리오스포스페이트 이소머라제 활성, 트레오닌 신타제 활성, 트레오닌 엑스포터 캐리어 활성, 트랜스알돌라제 활성, 트랜스케톨라제 활성, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제 활성, 호모세린 키나제 활성, 비오틴 리가제 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 활성, 트레오닌 유출 단백질 활성, 단백질 OpcA 활성, 1-포스포프럭토키나제 활성, 6-포스포프럭토키나제 활성, 프럭토스-1,6-비스포스파타제 활성, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제 및 호모세린 데히드로게나제 활성으로 이루어지는 군 중에서 선택되는, 야생형에 비해 추가로 증가된 적어도 하나의 활성을 갖는 유전학적으로 변형된 미생물을 포함한다.

트레오닌 제조를 위한 상기 방법의 추가의 특히 바람직한 실시태양은 트레오닌 데히드라타제 활성, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 활성, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 활성, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제 활성, 메조-디아미노피멜레이트 D-데히드로게나제 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성, 피루베이트 옥시다제 활성, 디히드로디피콜리네이트 합성효소 활성, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제 활성, 아스파라기나제 활성, 아스파르테이트 데카르복실라제 활성, 라이신 엑스포터 활성, 아세토락테이트 신타제 활성, 케톨-산 리덕토이소머라제 활성, 분지쇄 아미노트랜스퍼라제 활성, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제 활성, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제 활성, 디히드록시-산 데히드라타제 활성 및 디아미노피콜리네이트 데카르복실라제 활성으로 이루어지는 군 중에서 선택되는, 야생형에 비해 추가로 감소된 적어도 하나의 활성을 갖는 유전학적으로 변형된 미생물을 포함한다.

용어 "단백질의 활성"은 효소의 경우 대응하는 단백질의 효소 활성을, 다른 단백질, 예를 들어 구조 또는 수송 단백질의 경우 단백질의 생리학적 활성을 의미한다.

효소는 통상 기질을 생성물로 전환시키거나 상기 전환 단계를 촉매할 수 있다.

따라서, 효소의 "활성"은 특정 시간 내에 효소에 의해 전환되는 기질의 양 또는 형성된 생성물의 양을 의미한다.

따라서, 야생형에 비해 활성이 증가된 경우, 특정 시간 내에 효소에 의해 전환되는 기질의 양 또는 형성된 생성물의 양은 야생형에 비해 증가된다.

상기 "활성"의 증가는 본원에서 상기 설명하거나 추후 설명하는 모든 활성에 대해 바람직하게는 "야생형 활성"의 적어도 5%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 보다 더 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 100%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 300%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 500%, 특히 적어도 600% 증가에 해당한다.

따라서, 야생형에 비해 활성이 감소된 경우, 특정 시간 내에 효소에 의해 전환되는 기질의 양 또는 형성된 생성물의 양은 야생형에 비해 감소한다.

감소된 활성은 바람직하게는 다양한 세포 생물학적 메카니즘을 기초로 하여 미생물에서 상기 효소의 기능의 부분적인 또는 실질적으로 완전한 억제 또는 차단을 의미한다.

활성의 감소는 효소의 실질적으로 완전한 부재 (즉, 대응하는 활성의 검출가능성 결여 또는 효소의 면역학적 검출가능성 결여)까지의 효소의 정량적인 감소를 포함한다. 미생물의 활성은 야생형에 비해 바람직하게는 적어도 5%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 보다 더 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 100% 감소한다. 또한, "감소"는 특히 대응하는 활성의 완전한 부재를 의미한다.

유전학적으로 변형된 미생물 및 야생형에서 특정 효소의 활성 및 이에 따른 효소 활성의 증가 또는 감소는 공지된 방법, 예를 들어 효소 분석에 의해 측정할 수 있다.

예를 들어, 피루베이트 카르복실라제는 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환시키는 효소 활성을 보여주는 단백질을 의미한다.

따라서, 피루베이트 카르복실라제 활성은 특정 시간 내에 피루베이트 카르복실라제 단백질에 의해 전환된 피루베이트의 양 또는 형성된 옥살로아세테이트의 양을 의미한다.

따라서, 피루베이트 카르복실라제 활성이 야생형에 비해 증가될 경우, 특정 시간 내에 피루베이트 카르복실라제 단백질에 의해 전환된 피루베이트의 양 또는 형성된 옥살로아세테이트의 양은 야생형에 비해 증가한다.

피루베이트 카르복실라제 활성의 상기 증가는 바람직하게는 야생형의 피루베이트 카르복실라제 활성의 적어도 5%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 보다 더 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 100%, 보다 더 바람직하게는 적어도 300%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 500%, 특히 적어도 600%이다.

추가로, 예를 들어 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성은 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제의 효소 활성을 의미한다.

포스포에놀피루베이트 카르복시키나제는 옥살로아세테이트를 포스포에놀피루베이트로 전환하는 효소 활성을 보이는 단백질을 의미한다.

따라서, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성은 특정 시간 내에 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 단백질에 의해 전환되는 옥살로아세테이트의 양 또는 형성된 포스포에놀피루베이트의 양을 의미한다.

따라서, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성이 야생형에 비해 감소될 때, 특정 시간 내에 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 단백질에 의해 전환되는 옥살로아세테이트의 양 또는 형성된 포스포에놀피루베이트의 양은 야생형에 비해 감소한다.

포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성의 감소는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제의 실질적으로 완전한 부재 (즉, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성의 검출가능성 결여 또는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제의 면역학적 검출가능성 결여)까지의 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제의 정량적인 감소를 포함한다. 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제의 활성은 야생형에 비해 바람직하게는 적어도 5%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 보다 더 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 100% 감소한다. 특히, "감소"는 또한 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성의 완전한 부재를 의미한다.

활성의 추가의 증가는 다양한 방법으로, 예를 들어 발현 및 단백질 수준에서 억제 조절 메카니즘의 스위치를 차단하거나 야생형에 비해 상기 단백질을 코딩하는 핵산의 유전자 발현을 증가시켜 일어날 수 있다.

마찬가지로, 야생형에 비해 상기 단백질을 코딩하는 핵산의 유전자 발현의 증가는 다양한 방법으로, 예를 들어 활성화제에 의해 유전자를 유도하거나, 상기한 바와 같이 프로모터 활성을 증가시키거나, 발현 활성을 증가시키거나, 하나 이상의 유전자 카피를 미생물에 도입함으로써 달성할 수 있다.

또한, 단백질을 코딩하는 핵산의 유전자 발현의 증가는 본 발명에 따르면 미생물에 고유한 내재성 단백질의 발현 조작을 의미한다.

이것은 예를 들어 상기한 바와 같이 유전자의 프로모터 및(또는) 발현 유니트 서열을 변경시켜 달성할 수 있다. 유전자의 발현 속도를 증가시키는 상기 변경은 예를 들어 DNA 서열의 결손 또는 삽입에 의해 발생할 수 있다.

상기한 바와 같이, 외인성 자극을 인가함으로써 내재성 단백질의 발현을 변경시킬 수 있다. 이것은 특정 생리학적 조건을 통해, 즉 외래 물질의 적용을 통해 발생할 수 있다.

숙련인은 유전자 발현의 증가를 달성하기 위해 추가의 상이한 과정을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 따라서, 예를 들어 적절한 유전자의 카피수는 증가될 수 있거나, 구조 유전자의 상류에 위치한 프로모터 및 조절 영역 또는 리보좀 결합 부위를 돌연변이시킬 수 있다. 추가로, 유도가능 프로모터를 통해 발효 제조 동안 발현을 증가시킬 수 있다. mRNA의 수명을 연장시키는 과정도 발현을 개선시킨다. 효소 활성도 효소 단백질의 분해를 방지함으로써 개선된다. 유전자 또는 유전자 구성물은 카피 수를 변경시켜 플라스미드에 존재할 수 있거나 염색체 내에 통합되어 증폭될 수 있다. 또한, 별법으로 배지의 조성 및 배양 제어를 변경시켜 관련 유전자의 과다 발현을 달성할 수도 있다.

숙련인은 문헌 [Martin et al. (Biotechnology 5, 137-146 (1987)), Guerrero et al. (Gene 138, 35-41(1994), Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), 유럽 특허 0472869, US 특허 4,601,893, Schwarzer and Puehler (Biotechnology 9, 84-87 (1991), Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), 국제 출원 공개 WO 96/l5246, Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), 일본 특허 공개 JP-A-10-229891, Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58,. 191-195 (1998)), Makrides (Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)] 및 유전학 및 분자생물학의 공지된 교재에서 상기 내용에 대한 지침을 알 수 있다.

추가로, 유전자의 발현 또는 증강 이외에 생합성 산물, 특히 L-라이신, L-메티오닌 및 L-트레오닌의 제조를 위해 원치 않는 부반응을 제거하는 것이 유리할 수 있다 (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).

바람직한 실시태양에서, 상기 설명한 단백질의 하나를 코딩하는 핵산의 유전자 발현은 대응하는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 핵산을 미생물에 도입시킴으로써 증가된다. 핵산의 도입은 염색체에서 또는 염색체 외부에서, 즉 염색체 상의 카피 수의 증가 및(또는) 숙주 미생물에서 복제되는 플라스미드 상의 유전자의 카피의 증가에 의해 발생할 수 있다.

예를 들어 핵산을 포함하는 발현 카세트의 형태로 핵산의 도입은 바람직하게는 특히 상기 설명한 SacB 방법에 의해 염색체 내에서 발생할 수 있다.

원칙적으로 상기 목적을 위해 상기 설명한 단백질의 하나를 코딩하는 임의의 유전자를 사용하는 것이 가능하다.

인트론을 포함하는 진핵세포 공급원으로부터의 게놈 핵산 서열의 경우에, 숙주 미생물이 대응하는 단백질을 발현할 수 없거나 발현하도록 제조될 수 없을 때 이미 프로세싱된 핵산 서열, 예를 들어 대응하는 cDNA를 사용하는 것이 바람직하다.

대응하는 유전자의 예는 표 1 및 2에 나열되어 있다.

미생물에서 상기 설명한 활성은 바람직하게는 적어도 하나의 다음 방법에 의해 감소된다.

- 동시 억제를 유도하기 위한 적어도 하나의 센스 리보핵산 서열의 또는 그의 발현을 보장하는 발현 카세트의 도입.

- 대응하는 유전자, RNA 또는 단백질에 대한 적어도 하나의 DNA- 또는 단백질-결합 인자의 또는 그의 발현을 보장하는 발현 카세트의 도입.

- RNA 분해를 유발하는 적어도 하나의 바이러스 핵산 서열의 또는 그의 발현을 보장하는 발현 카세트의 도입.

- 예를 들어 유전자에 삽입, 결손, 역위 또는 돌연변이를 생성시켜 유전자의 정지 코돈의 생성 또는 해독 프레임의 이동과 같은, 기능 상실을 발생시키는 적어도 하나의 구성물의 도입. 상동성 재조합에 의한 요구되는 표적 유전자 내로의 표적화 삽입 또는 표적 유전자에 대한 서열 특이적 뉴클레아제의 도입에 의해 낙아웃 돌연변이체를 생성시키는 것이 가능하고, 바람직하다.

- 감소된 프로모터 활성을 갖는 프로모터의 또는 감소된 발현 활성을 갖는 발현 유니트의 도입.

숙련인은 그의 활성 또는 기능을 감소시키기 위해 추가의 방법을 본 발명의 범위 내에서 사용할 수 있음을 알 수 있다. 예를 들어, 단백질의 우성 음성 변이체의 도입 또는 그의 발현을 보장하는 발현 카세트의 도입도 유리할 수 있다.

또한, 상기 각각의 방법은 단백질의 양, mRNA의 양 및(또는) 단백질의 활성의 감소를 야기할 수도 있다. 또한, 조합 사용도 생각할 수 있다. 추가의 방법은 당업계의 숙련인에게 알려져 있고, 단백질의 프로세싱, 단백질 또는 mRNA의 수송의 방해 또는 억제, 리보좀 부착의 억제, RNA 스플라이싱의 억제, RNA 분해 효소의 유도 및(또는) 번역 연장 또는 종결의 억제를 포함할 수 있다.

생합성 산물을 생산하기 위한 본 발명의 방법에서, 유전학적으로 변형된 미생물의 배양 단계 후에 바람직하게는 미생물로부터 및(또는) 발효조로부터 생합성 산물의 단리가 수행된다. 이 단계는 동시에 및(또는) 바람직하게는 배양 단계 후에 수행될 수 있다.

본 발명의 유전학적으로 변형된 미생물은 배치 방식 (배치 배양) 또는 유가식 배양 또는 반복 유가식 배양 방법에서 연속적으로 또는 불연속적으로 생합성 산물, 특히 L-라이신, L-메티오닌 및 L-트레오닌 생산을 위해 배양될 수 있다. 공지의 배양 방법의 개요는 문헌 [Chmiel, Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart,1991) 또는 Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)]을 참조한다.

사용되는 배양 배지는 각 균주의 요구를 적합한 방식으로 충족시켜야 한다. 다양한 미생물의 배양 배지에 대한 설명은 문헌 ["Manual of Methods for General Bacteriology" of American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981)]에 기재되어 있다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 배지는 대체로 하나 이상의 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기염, 비타민 및(또는) 미량원소를 포함한다.

바람직한 탄소 공급원은 당, 예를 들어 단당류, 이당류 또는 다당류이다. 매우 우수한 탄소 공급원의 예는 글루코스, 프럭토스, 만노스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 리불로스, 락토스, 말토스, 슈크로스, 라피노스, 전분 또는 셀룰로스이다. 당은 또한 복합 화합물, 예를 들어 당밀, 또는 다른 당 정제 부산물을 통해 배지로 공급될 수도 있다. 또한, 상이한 탄소 공급원의 혼합물을 첨가하는 것도 유리할 수 있다. 다른 가능한 탄소 공급원은 오일 및 지방, 예를 들어 대두유, 해바라기 오일, 땅콩유 및 코코넛 지방, 지방산, 예를 들어 팔미트산, 스테아르산 또는 리놀레산, 알콜, 예를 들어 글리세롤, 메탄올 또는 에탄올 및 유기산, 예를 들어 아세트산 또는 락트산이다.

질소 공급원은 대체로 유기 또는 무기 질소 화합물 또는 이들 화합물을 포함하는 물질이다. 질소 공급원의 예는 암모니아 가스 또는 암모늄 염, 예를 들어 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 또는 질산암모늄, 니트레이트, 우레아, 아미노산 또는 복합 질소 공급원, 예를 들어 옥수수 침지수, 대두분, 대두 단백질, 효소 추출물, 고기 추출물 등을 포함한다. 질소 공급원은 단독으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

배지에 존재할 수 있는 무기염 화합물은 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브덴, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 염화물, 인산염 또는 황산염을 포함한다.

미세 화학물질, 특히 메티오닌의 제조를 위해, 황 공급원으로서 무기 화합물, 예를 들어 술페이트, 술파이트, 디티오나이트, 테트라티오네이트, 티오술페이트, 술파이드, 및 유기 황화합물, 예를 들어 머캅탄 및 티올을 사용할 수 있다.

인 공급원으로서 인산, 인산이수소칼륨 또는 인산일수소이칼륨 또는 대응하는 나트륨 함유 염을 사용할 수 있다.

금속 이온을 용액에 유지시키기 위해 킬레이팅제가 배지에 첨가될 수 있다. 특히 적합한 킬레이팅제는 디히드록시페놀, 예를 들어 카테콜 또는 프로토카테츄에이트, 또는 유기산, 예를 들어 시트르산을 포함한다.

또한, 본 발명에 따라 사용되는 발효 배지는 통상 다른 성장 인자, 예를 들어 비타민 또는 성장 촉진제, 예를 들어 비오틴, 리보플라빈, 티아민, 엽산, 니코틴산, 판토테네이트 및 피리독신을 포함한다. 성장 인자 및 염은 종종 배지의 복합 성분, 예를 들어 효모 추출물, 당밀, 옥수수 침지수 등에서 유도된다. 적합한 전구체가 배양 배지에 첨가될 수도 있다. 배지 내의 화합물의 정확한 조성은 특정 실험에 크게 좌우되고, 각각의 구체적인 상황에 따라 개별적으로 결정될 것이다. 배지의 최적화에 대한 정보는 문헌 ["Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (editors. P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)에서 얻을 수 있다. 또한, 성장 배지는 시판 공급처, 예를 들어 Standard 1 (머크 (Merck)) 또는 BHI (뇌-심장 침출 배지, 딥코 (DIFCO)) 등으로부터 구입할 수 있다.

배지의 모든 성분은 가열 (1.5 bar 및 121℃에서 20분) 또는 멸균 여과에 의해 멸균된다. 성분은 함께 또는 필요한 경우 별개로 멸균될 수 있다. 배지의 모든 성분은 배양 개시시에 존재할 수 있거나, 임의로 연속적으로 또는 배치식으로 첨가될 수 있다.

배양 온도는 통상 15℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이고, 실험 동안 일정하게 유지되거나 변경될 수 있다. 배지의 pH는 5 내지 8.5, 바람직하게는 약 7.0이어야 한다. 배지의 pH는 염기성 화합물, 예를 들어 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 수성 암모니아 또는 산성 화합물, 예를 들어 인산 또는 황산을 첨가하여 배양 동안 조절할 수 있다. 거품 발생은 소포제, 예를 들어 지방산 폴리글리콜 에스테르를 사용하여 조절할 수 있다. 플라스미드의 안정성은 선택 작용을 갖는 적합한 물질, 예를 들어 항생제를 배지에 첨가하여 유지할 수 있다. 호기 조건은 산소 또는 산소 함유 기체 혼합물, 예를 들어 주위 공기를 배양액에 공급하여 유지된다. 배지 온도는 통상 20℃ 내지 45℃이다. 배양은 요구되는 생성물의 형성이 최대로 될 때까지 계속된다. 상기 목적은 통상 10시간 내지 160시간 내에 달성된다.

상기 방식으로 얻은 발효조의 건조 물질 함량은 통상 7.5 내지 25 중량%이다.

또한, 발효를 적어도 종료 시점에서, 특히 발효 시간의 적어도 30%에 걸쳐서 당 공급을 제한하면서 실시하는 것이 추가로 유리하다. 이것은 상기 시간 동안 발효 배지 내의 이용가능한 당의 농도가 0 내지 3 g/l에서 유지되거나, 감소됨을 의미한다.

생합성 산물은 요구되는 생합성 산물 및 생합성 부산물의 물리적/화학적 특성에 따라 그 자체로 공지된 방식으로 발효조 및(또는) 미생물로부터 단리된다.

이어서, 발효조는 예를 들어 추가로 처리될 수 있다. 필요에 따라, 생물질은 예를 들어 원심분리, 여과, 따라내기 또는 이들 방법의 조합에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 발효조로부터 제거되거나 그 내부에 완전히 유지될 수 있다.

발효조는 이어서 공지의 방법, 예를 들어 회전 증발기, 박막 증발기, 낙하 필름 증발기의 도움을 받아 역삼투압 또는 나노여과에 의해 농축될 수 있다. 상기 농축된 발효조는 이어서 동결건조, 분무 건조, 분무 과립화 또는 다른 방법에 의해 마무리 처리될 수 있다.

그러나, 생합성 산물, 예를 들어 L-라이신, L-메티오닌 및 L-트레오닌을 정제하는 것도 가능하다. 이를 위해, 생성물 함유 조는 생물질 제거 후에 적합한 수지를 사용하여 크로마토그래피에 적용하여 요구되는 산물 또는 불순물을 전체적으로 또는 부분적으로 크로마토그래피 수지에 유지시킨다. 상기 크로마토그래피 단계는 필요한 경우 동일하거나 상이한 크로마토그래피 수지를 사용하여 반복할 수 있다. 숙련인은 적합한 크로마토그래피 수지의 선택 및 그의 가장 효율적인 사용을 잘 알고 있다. 정제된 산물은 여과 또는 한외여과에 의해 농축하여 산물의 안정성이 최대로 유지되는 온도에서 보관할 수 있다.

생합성 산물은 다양한 형태, 예를 들어 그의 염 또는 에스테르 형태를 생성시킬 수 있다.

단리된 화합물(들)의 구조 및 정제는 선행 기술에 의해 결정할 수 있다. 이것은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 분광법, 염색법, 박층 크로마토그래피, NIRS, 효소 분석 또는 미생물학적 분석을 포함한다. 상기 분석 방법은 문헌 [Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; 및 Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19: 67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) vol. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp. 559-566, 575-581 및 pp. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17]에 개관되어 있다.

본 발명은 이제 하기 비제한적 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다.

실시예 1

이종성 발현 유니트 Pgro (서열 2)의 도움으로 pycA 유전자의 과발현을 위한 통합 플라스미드의 제조

샤퍼로닌 Gro ES를 코딩하는 유전자의 프로모터의 증폭을 위해 하기 올리고뉴클레오티드가 규정되었다.

서열 5:

gro3: 5'-gccgcagcaaacccagtag-3'

서열 6:

gro11: 5'-agtcgacacgatgaatccctccatgagaaaa-3'

프라이머를 씨. 글루타미쿰 ATCC13032로부터의 염색체 DNA를 사용하는 PCR 반응에서 사용하였다. 본 방법으로 427 bp의 예상된 크기에 대응하는 DNA 단편을 증폭하는 것이 가능하였다.

피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 유전자의 일부의 증폭을 위해 하기 올리고뉴클레오티드가 규정되었다.

서열 7:

pyc6: 5-tttttctcatggagggattcatcgtgtcgactcacacatcttcaacgcttccag-3'

서열 8:

pyc3: 5'-cccgcagcaacgcacgcaagaaa-3'

프라이머를 씨. 글루타미쿰 ATCC13032로부터의 염색체 DNA를 사용하는 PCR 반응에서 사용하였다. 본 방법으로 1344 bp의 예상된 크기에 대응하는 DNA 단편을 증폭하는 것이 가능하였다.

프라이머 gro11 및 pyc6은 중복 서열을 함유하고 5'-말단에서 서로 상동성이다.

상기 수득한 PCR 생성물을 하기 프라이머가 사용되는 추가의 PCR을 위한 템플레이트로서 사용하였다.

서열 9:

gro12:

5'-gcattcgcgccgctcgtaacta-3'

서열 10:

pyc11: 5'-ggttcccgcgccctggtaa-3'

본 방법으로 1107 bp의 예상된 크기에 대응하는 DNA 단편을 증폭하는 것이 가능하였다. 이어서 상기 Pgro/pycA 융합체를 벡터 pCR2.1 (인비트로겐 게엠베하 (Invitrogen GmbH, 독일 칼스루헤)) 내로 클로닝하였다. 추가의 단계에서, Pgro/pycA 융합체를 플라스미드 pCR2.1 (인비트로겐 게엠베하)로부터 1125 bp EcoRI 단편으로서, 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI를 사용하여 앞서 절단된 통합 벡터 pK19 mob sacB 서열 11 내로 클로닝하였다. 생성되는 플라스미드는 pk19 mob sacB Pgro/pycA로 칭하였다.

pycA 유전자의 5'-영역의 증폭을 위해 하기 올리고뉴클레오티드가 규정되었다.

서열 12:

pyc14: 5'-ccggcgaagtgtctgctcgcgtga-3'

서열 13:

pyc15: 5'-accccgccccagtttttc-3'

프라이머를 씨. 글루타미쿰 ATCC13032로부터의 염색체 DNA를 사용하는 PCR 반응에서 사용하였다. 본 방법으로 487 bp의 예상된 크기에 대응하는 DNA 단편을 증폭하는 것이 가능하였다. 이들 DNA 단편을 벡터 pCR2.1 (인비트로겐 게엠베하) 내로 클로닝하였다. 이어서 593 bp SpeI/XbaI 단편을 후속적으로 제한 효소 NheI를 사용하여 앞서 절단된 벡터 pK19 mob sacB Psod ask 내로 클로닝하였다. 생성되는 플라스미드는 pK19 mob sacB Pgro pycA + US (서열 14)로 칭하였다. 본 단계까지, 모든 클로닝은 에스케리치아 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠 (Stratagene, 네 덜란드 암스테르담))에서 수행하였다.

이어서 형질전환 플라스미드 pK19 mob sacB Pgro pycA + US를 문헌 [Liebl, et al. (1989) FEMS Microbiology Letters 53: 299-303]에 기재된 바와 같이 플라스미드 pTc15AcgIM과 함께 이. 콜라이 Mn522 (스트라타젠)을 형질전환하기 위해 사용하였다. 플라스미드 pTc15AcgIM은 DNA가 코리네박테리움 글루타미쿰의 메틸화 패턴에 따라 메틸화될 수 있도록 한다 (DE 10046870). 상기 단계에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰은 후속적으로 통합 플라스미드 pK19 mob sacB Pgro pycA + US를 사용하여 전기천공될 수 있다. 상기 전기천공 및 카나마이신 (25 ㎍/ml)를 갖는 CM 플레이트 (10 g/l 글루코스; 2.5 g/l NaCl; 2 g/l 우레아, 10 g/l Bacto Peptone (딥코); 10 g/l 효모 추출물, 22.0 g/l 한천 (딥코)) 상의 후속적 선택으로 다수의 트랜스컨쥬건트 (transconjugant)를 생성하였다.

벡터를 pycA 프로모터 및 pycA 유전자와 함께 절단하여야 하는 제2 재조합 사건을 위해 선택하기 위해, 상기 트랜스컨쥬건트를 카나마이신을 갖지 않는 CM 배지에서 밤새 배양한 후, 선택을 위해 10% 슈크로스를 갖는 CM 플레이트 상에 플레팅하였다. 벡터 pK19 mob sacB 상에 존재하는 sacB 유전자는 효소 레반슈크라제를 코딩하고, 슈크로스 상의 성장시 레반을 합성시킨다. 레반은 씨. 글루타미쿰에 독성이므로, 제2 재조합 단계를 통해 통합 플라스미드를 상실한 씨. 글루타미쿰 세포만이 슈크로스 함유 배지 상에 성장할 수 있다 (Jager et al., Journal of Bacteriology 174 (1992) 5462-5466). 100개의 슈크로스 내성 클론을 카나마이신 감수성에 대해 검사하였다. 15개의 시험된 클론이 슈크로스에 대해 내성일 뿐만 아니라 카나마이신에 감수성임을 증명할 수 있었다. 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)을 이용하여 Pgro 발현 유니트에 의한 천연 발현 유니트의 목적하는 대체가 또한 일어났는지 검토하였다. 본 분석을 위해, 염색체 DNA는 출발 균주 및 15개의 클론으로부터 단리하였다. 상기 목적을 위해 개별 클론을 이쑤시개로 한천 플레이트로부터 제거하고, 100 ㎕의 H₂O에 현탁시키고 10분 동안 95℃에서 비등하였다. 생성되는 용액의 10 ㎕ 부분을 PCR에서 템플레이트로서 사용하였다. 사용된 프라이머는 Pgro 발현 유니트 및 pycA 유전자에 상동성인 올리고뉴클레오티드이었다.

PCR 조건은 다음과 같이 선택하였다: 예비변성: 95℃에서 5분; 변성 95℃에서 30초; 혼성화 56℃에서 30초; 증폭 72℃에서 1분; 30 사이클; 최종 연장 72℃에서 5분. 출발 균주의 DNA와의 혼합물에서, 올리고뉴클레오티드의 선택 때문에 PCR 생성물을 생성되지 않았다. Pgro에 의한 천연 발현 유니트 (PpycA)의 대체에 제2 재조합이 영향을 미친 클론만이 예상된 310 bp의 크기를 갖는 밴드였다. 시험된 15개 클론 중 총 7개 클론이 양성이었다.

이어서 7개의 양성 클론 및 출발 균주를 10 ml의 CM 배지 (10 g/l 글루코스; 2.5 g/l NaCl; 2 g/l 우레아, 10 g/l Bacto Peptone (딥코); 10 g/l 효모 추출물)에서 밤새 배양하였다. 이어서 세포를 펠렛화하고 0.5 ml의 버퍼 (50 mM Tris, 10 mM MgCl₂, 50 mM KCl; pH 7.7))에 용해시켰다. 세포를 Ribolyzer (레벨 6에서 3 x 30초, 하이베이드 (Hybaid))에 의해 파괴하였다. 브래드포드 (Bradford) 방법에 의해 단백질 결정한 후, 단백질의 15 ㎍ 부분을 10% SDS 겔 상으로 로딩하고, 단백 질을 분획화하였다. 출발 균주와 비교하여 PycA 단백질의 증가량이 검출가능하였다 (도 1). 도 1은 Pgro pycA 클론의 10% SDS 겔을 도시한 것이다.

실시예 2

벡터 pCLiK5MCS의 제조

먼저, 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 15 및 서열 16을 사용하여 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)에 의해 벡터 pBR322의 암피실린 내성 및 복제 기점을 증폭시켰다.

서열 15

5'-CCCGGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGTGAAATACCGCACAG-3'

서열 16

5'-TCTAGACTCGAGCGGCCGCGGCCGGCCTTTAAATTGAAGACGAAAGGGCCTCG-3'

pBR322에 상보성인 서열 외에, 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 15는 5'-3' 방향에서 제한 엔도뉴클레아제 SmaI, BamHI, NheI 및 AscI에 대한 절단 부위를 포함하고, 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 16은 5'-3' 방향에서 제한 엔도뉴클레아제 XbaI, XhoI, NotI 및 DraI에 대한 절단 부위를 포함한다. PCR 반응은 표준 방법, 예를 들어 문헌 [Innis et al. PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)]의 방법에 의해 PfuTurbo 폴리머라제 (스트라타젠, 미국 라졸라)를 사용하여 수행하였다. 생성되는 크기가 약 2.1 kb인 DNA 단편을 제조자의 지시에 따라 GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마 시아 (Amersham Pharmacia), 독일 프라이부르크)를 사용하여 정제하였다. 신속 DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스 (Roche Diagnostics), 독일 만하임)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 DNA 단편의 블런트 말단을 함께 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 문헌 [Sambrook et al, Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor (1989)]에 기재된 표준 방법에 의해 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠, 미국 라 졸라) 내로 형질전환시켰다. 플라스미드 함유 세포를 암피실린 (50 ㎍/ml) 함유 LB 한천 (Lennox, 1955, Virology, 1:190)에 플레이팅하여 선택하였다.

개별 클론의 플라스미드 DNA는 제조자의 지시에 따라 Qiaprep 스핀 미니프렙 키트 (퀴아겐 (Qiagen), 독일 힐덴)을 사용하여 단리하고, 제한 소화에 의해 조사하였다. 상기 방식으로 얻은 플라스미드를 pCLiK1으로 명명하였다.

PCR 반응을 위한 템플레이트로서 플라스미드 pWLT1 (Liebl et al., 1992)로부터 출발하여 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 17 및 서열 18을 사용하여 카나마이신 내성 카세트를 증폭하였다.

서열 17

5'-GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGA-3'

서열 18

5'-GAGAGGCGCGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCAGCA-3'

pWLT1에 상보성인 서열 이외에, 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 17은 5'-3' 방향으로 제한 엔도뉴클레아제 XbaI, SmaI, BamHI, NheI에 대한 절단 부위를 함 유하고, 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 18은 5'-3' 방향으로 제한 엔도뉴클레아제 AscI 및 NheI에 대한 절단 부위를 함유한다. PCR 반응은 표준 방법, 예를 들어 문헌 [Innis et al. PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)]의 방법에 의해 PfuTurbo 폴리머라제 (스트라타젠, 미국 라졸라)를 사용하여 수행하였다. 생성되는 크기가 약 1.3 kb인 DNA 단편을 제조자의 지시에 따라 GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아, 독일 프라이부르크)를 사용하여 정제하였다. DNA 단편을 제한 엔도뉴클레아제 XbaI 및 AscI (뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs), 미국 비벌리)로 절단한 후, 다시 제조자의 지시에 따라 GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아, 독일 프라이부르크)를 사용하여 정제하였다. 벡터 pCLiK1을 마찬가지로 제한 엔도뉴클레아제 XbaI 및 AscI로 절단하고, 제조자의 지시에 따라 알칼린 포스파타제 (I (로셰 다이아그노스틱스, 독일 만하임))로 탈포스포릴화시켰다. 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동한 후, GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아, 독일 프라이부르크)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 선형화된 벡터 (약 2.1 kb)를 단리하였다. 상기 벡터 단편을 제조자의 지시에 따라 신속 DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스, 독일 만하임)를 사용하여 절단된 PCR 단편과 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 문헌 [Sambrook et al, Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor (1989)]에 기재된 표준 방법에 의해 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠, 미국 라 졸라) 내로 형질전환시켰다. 플라 스미드 함유 세포를 암피실린 (50 ㎍/ml) 및 카나마이신 (20 ㎍/ml) 함유 LB 한천 (Lennox, 1955, Virology, 1:190)에 플레이팅하여 선택하였다.

개별 클론의 플라스미드 DNA는 제조자의 지시에 따라 Qiaprep 스핀 미니프렙 키트 (퀴아겐, 독일 힐덴)을 사용하여 단리하고, 제한 소화에 의해 조사하였다. 상기 방식으로 얻은 플라스미드를 pCLiK2로 명명하였다.

벡터 pCLiK2를 제한 엔도뉴클레아제 DraI (뉴 잉글랜드 바이오랩스, 미국 비벌리)로 절단하였다. 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동한 후, GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아, 독일 프라이부르크)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 벡터 단편 (약 2.3 kb)를 단리하였다. 상기 벡터 단편을 제조자의 지시에 따라 신속 DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스, 독일 만하임)를 사용하여 다시 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 문헌 [Sambrook et al, Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor (1989)]에 기재된 표준 방법에 의해 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠, 미국 라 졸라) 내로 형질전환시켰다. 플라스미드 함유 세포를 카나마이신 (20 ㎍/ml) 함유 LB 한천 (Lennox, 1955, Virology, 1:190)에 플레이팅하여 선택하였다.

개별 클론의 플라스미드 DNA는 제조자의 지시에 따라 Qiaprep 스핀 미니프렙 키트 (퀴아겐, 독일 힐덴)을 사용하여 단리하고, 제한 소화에 의해 조사하였다. 상기 방식으로 얻은 플라스미드를 pCLiK3으로 명명하였다.

PCR 반응을 위한 템플레이트로서 플라스미드 pWLQ2 (Liebl et al., 1992)로 부터 출발하여 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 19 및 서열 20을 사용하여 복제 기점 pHM1519를 증폭하였다.

서열 19

5'-GAGAGGGCGGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3'

서열 20

5'-GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3'

pWLQ2에 상보성인 서열 이외에, 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 19 및 20은 제한 엔도뉴클레아제 NotI에 대한 절단 부위를 함유한다. PCR 반응은 표준 방법, 예를 들어 문헌 [Innis et al. PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)]의 방법에 의해 PfuTurbo 폴리머라제 (스트라타젠, 미국 라졸라)를 사용하여 수행하였다. 생성되는 크기가 약 2.7 kb인 DNA 단편을 제조자의 지시에 따라 GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아, 독일 프라이부르크)를 사용하여 정제하였다. DNA 단편을 제한 엔도뉴클레아제 NotI (뉴 잉글랜드 바이오랩스, 미국 비벌리)로 절단한 후, 다시 제조자의 지시에 따라 GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아, 독일 프라이부르크)를 사용하여 정제하였다. 벡터 pCLiK3을 마찬가지로 제한 엔도뉴클레아제 NotI로 절단하고, 제조자의 지시에 따라 알칼린 포스파타제 (I (로셰 다이아그노스틱스, 독일 만하임))로 탈포스포릴화시켰다. 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동한 후, GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아, 독일 프라이부르크)를 제 조자의 지시에 따라 사용하여 선형화된 벡터 (약 2.3 kb)를 단리하였다. 상기 벡터 단편을 제조자의 지시에 따라 신속 DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스, 독일 만하임)를 사용하여 절단된 PCR 단편과 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 문헌 [Sambrook et al, Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor (1989)]에 기재된 표준 방법에 의해 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠, 미국 라 졸라) 내로 형질전환시켰다. 플라스미드 함유 세포를 카나마이신 (20 ㎍/ml) 함유 LB 한천 (Lennox, 1955, Virology, 1:190)에 플레이팅하여 선택하였다.

개별 클론의 플라스미드 DNA는 제조자의 지시에 따라 Qiaprep 스핀 미니프렙 키트 (퀴아겐, 독일 힐덴)을 사용하여 단리하고, 제한 소화에 의해 조사하였다. 상기 방식으로 얻은 플라스미드를 pCLiK5로 명명하였다.

pCLiK5를 다중 클로닝 부위 (MCS)에 의해 연장시키기 위해, 실질적으로 매우 상보성인 2개의 합성 올리고뉴클레오티드 서열 21 및 서열 22 (제한 엔도뉴클레아제 SwaI, XhoI, AatI, ApaI, Asp718, MluI, NdeI, SpeI, EcoRV, SalI, ClaI, BamHI, XbaI 및 SmaI에 대한 절단 부위를 함유함)를 95℃에서 함께 가열한 후 서서히 냉각시켜 조합하여 이중 가닥 DNA 단편을 얻었다.

서열 21

5'-TCGAATTTAAATCTCGAGAGGCCTGACGTCGGGCCCGGTACCACGCGTCATAT

GACTAGTTCGGACCTAGGGATATCGTCGACATCGATGCTCTTCTGCGTTAATTAAC

AATTGGGATCCTCTAGACCCGGGATTTAAAT-3'

서열 22

5'-GATCATTTAAATCCCGGGTCTAGAGGATCCCAATTGTTAATTAACGCAGAAGAG

CATCGATGTCGACGATATCCCTAGGTCCGAACTAGTCATATGACGCGTGGTACCG

GGCCCGACGTCAGGCCTCTCGAGATTTAAAT-3'

벡터 pCLiK5를 제한 엔도뉴클레아제 XhoI 및 BamHI (뉴 잉글랜드 바이오랩스, 미국 비벌리)로 절단하고, 제조자의 지시에 따라 알칼린 포스파타제 (I (로셰 다이아그노스틱스, 독일 만하임))로 탈포스포릴화시켰다. 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동한 후, GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아, 독일 프라이부르크)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 선형화된 벡터 (약 5.0 kb)를 단리하였다. 상기 벡터 단편을 제조자의 지시에 따라 신속 DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스, 독일 만하임)를 사용하여 합성 이중 가닥 DNA 단편과 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 문헌 [Sambrook et al, Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor (1989)]에 기재된 표준 방법에 의해 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠, 미국 라 졸라) 내로 형질전환시켰다. 플라스미드 함유 세포를 카나마이신 (20 ㎍/ml) 함유 LB 한천 (Lennox, 1955, Virology, 1:190)에 플레이팅하여 선택하였다.

개별 클론의 플라스미드 DNA는 제조자의 지시에 따라 Qiaprep 스핀 미니프렙 키트 (퀴아겐, 독일 힐덴)을 사용하여 단리하고, 제한 소화에 의해 조사하였다. 상기 방식으로 얻은 플라스미드를 pCLiK5MCS로 명명하였다.

서열분석 반응을 문헌 [Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463-5467]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 서열분석 반응은 ABI prism 377 (피이 어플라이드 바이오시스템즈 (PE Applied Biosystems), 독일 바이터슈타트)을 사용하여 분획화하고 평가하였다.

생성되는 플라스미드 pCLiK5MCS는 서열 23으로서 나타내었다.

실시예 3

플라스미드 PmetA metA의 제조

염색체 DNA를 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 문헌 [Tauch et al. (1995) Plasmid 33: 168-179] 또는 [Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140: 1817-1828]에 기재된 바와 같이 제조하였다. 비코딩 5'-영역을 포함하는 metA 유전자를 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 24 및 서열 25, 템플레이트로서 염색체 DNA 및 Pfu Turbo 폴리머라제 (스트라타젠)를 사용하여 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 표준 방법에 의해 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)에 의해 증폭하였다.

서열 24

5'-GCGCGGTACCTAGACTCACCCCAGTGCT-3'

서열 25

5'-CTCTACTAGTTTAGATGTAGAACTCGATGT-3'

생성되는 크기가 약 1.3 kb인 DNA 단편을 제조자의 지시에 따라 GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아, 독일 프라이부르크)를 사용하여 정제하였다. 이어서 이를 제한 효소 Asp718 및 SpeI (로셰 다이아그노스틱스, 독일 만하임)로 절단하고, DNA 단편을 GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트를 사용하여 정제하였다.

벡터 pClik5MCS 서열 23을 제한 효소 Asp718 및 SpeI로 절단하고, 전기천공에 의해 분획화한 후 5 kb 크기의 단편을 GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트를 사용하여 단리하였다.

벡터 단편을 PCR 단편과 함께 신속 DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스, 독일 만하임)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 문헌 [Sambrook et al, Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor (1989)]에 기재된 표준 방법에 의해 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠, 미국 라 졸라) 내로 형질전환시켰다. 플라스미드 함유 세포를 카나마이신 (20 ㎍/ml) 함유 LB 한천 (Lennox, 1955, Virology, 1:190)에 플레이팅하여 선택하였다.

플라스미드 DNA를 퀴아겐의 방법에 의해 퀴아겐의 물질을 사용하여 제조하였다. 서열분석 반응을 문헌 [Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463-5467]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 서열분석 반응은 ABI prism 377 (피이 어플라이드 바이오시스템즈, 독일 바이터슈타트)을 사용하여 분획화하고 평가하였다.

생성되는 플라스미드 pCLiK5MCS PmetA metA는 서열 26으로서 나타내었다.

실시예 9

플라스미드 pCLiK5MCS Pgro metA의 제조

염색체 DNA를 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 문헌 [Tauch et al. (1995) Plasmid 33: 168-179] 또는 [Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140: 1817-1828]에 기재된 바와 같이 제조하였다. 유전자 GroES (Pgro)의 비코딩 5' 영역 (발현 유니트의 영역)으로부터 약 200 염기쌍의 DNA 단편을 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 27 및 서열 28, 템플레이트로서 염색체 DNA 및 Pfu Turbo 폴리머라제 (스트라타젠)를 사용하여 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 표준 방법에 의해 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)에 의해 증폭하였다.

서열 27

5'-GAGACTCGAGCGGCTTAAAGTTTGGCTGCC-3' 및

서열 28

5'-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATGATGAATCCCTCCATGAG-3'

생성되는 DNA 단편을 제조자의 지시에 따라 GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아, 독일 프라이부르크)를 사용하여 정제하였다.

PCR 반응을 위한 템플레이트로서 플라스미드 PmetA metA로부터 출발하여, metA의 일부를 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 29 및 서열 30을 사용하여 증폭 하였다.

서열 29

5'-CCCACCCTCGCGCCTTCAG-3'

서열 30

5'-CTGGGTACATTGCGGCCC-3'

약 470 염기쌍의 생성되는 DNA 단편을 제조자의 지시에 따라 GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트를 사용하여 정제하였다.

추가의 PCR 반응에서, 상기 수득한 2개의 단편을 템플레이트로서 함께 사용하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 28을 사용하여 도입된, metA에 상동성인 서열 때문에, PCR 반응 동안 2개의 단편은 서로 부착되고 연장되어 사용된 폴리머라제에 의해 연속 DNA 스트랜드를 제공한다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 27 및 서열 30을 제2 사이클의 출발시에만 반응 혼합물에 첨가함으로써 표준 방법을 변형시켰다.

약 675 염기쌍의 증폭된 DNA 단편을 제조자의 지시에 따라 GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 이어서 이를 제한 효소 XhoI 및 NcoI (로셰 다이아그노스틱스, 독일 만하임)로 절단하고 겔 전기영동에 의해 분획화하였다. 후속적으로, 약 620 염기쌍 크기의 DNA 단편을 GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 아가로스로부터 정제하였다. 플라스미드 PmetA metA 서열 26을 제한 효소 NcoI 및 SpeI (로셰 다이아그노스틱스, 독 일 만하임)로 절단하였다. 겔 전기영동에 의한 분획화 후 약 0.7 kb 크기의 metA 단편을 GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트를 사용하여 아가로스로부터 정제하였다.

벡터 pClik5MCS 서열 23을 제한 효소 XhoI 및 SpeI (로셰 다이아그노스틱스, 독일 만하임)로 절단하고, 전기영동에 의한 분획화 후 5 kb 크기의 단편을 GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트를 사용하여 단리하였다.

벡터 단편을 PCR 단편 및 metA 단편과 함께 제조자의 지시에 따라 신속 DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스, 독일 만하임)를 사용하여 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 문헌 [Sambrook et al, Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor (1989)]에 기재된 표준 방법에 의해 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠, 미국 라 졸라) 내로 형질전환시켰다. 플라스미드 함유 세포를 카나마이신 (20 ㎍/ml) 함유 LB 한천 (Lennox, 1955, Virology, 1:190)에 플레이팅하여 선택하였다.

생성되는 플라스미드 pCLiK5MCS PGroESmetA는 서열 31로서 나타내었다.

실시예 10

MetA 활성

균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 각각의 플라스미드 pClik5 MCS, pClik MCS PmetA metA 및 pCLiK5MCS PGroESmetA를 사용하여 문헌 [Liebl, et al. (1989) FEMS Microbiology Letters 53: 299-303]에 기재된 방법에 의해 형질전환시켰다. 형질전환 혼합물을 플라스미드 함유 세포를 선택하기 위해 부가적으로 20 mg/l 카나마이신을 함유하는 CM 플레이트 상에 플레이팅하였다. 생성되는 Kan-내성 클론을 집어 단리하였다.

이들 플라스미드 구성물 중 하나를 함유하는 씨. 글루타미쿰 균주를 MMA 배지 (40 g/l 슈크로스, 20 g/l (NH₄)₂SO₄, 1 g/l KH₂P0₄, 1 g/l K₂HPO₄, 0.25 g/l MgSO₄ x 7H₂O, 54 g Aces, 1 ml CaCl₂ (10 g/l), 1 ml 프로토카테츄에이트 (300 mg/10 ml), 1 ml 미량원소 용액 (10 g/l FeSO₄ x 7H₂O, 10 g/l MnSO₄ x H₂O, 2 g/l ZnSO₄ x 7H₂O, 0.2 g/l CuSO₄, 0.02 g/l NiCl₂ x 6H₂O), 100 ㎍/l 비타민 B₁₂, 0.3 mg/l 티아민, 1 mM 류신, 1 mg/l 피리독살 HCl, 1 ml 비오틴 (100 mg/l), pH 7.0) 내에서 30℃에서 밤새 배양하였다. 세포를 4℃에서 원심분리시키고 냉 Tris-HCl 버퍼 (0.1%, pH 8.0)로 2회 세척하였다. 새로 원심분리시킨 후, 세포를 냉 Tris-HCl 버퍼 (0.1%, pH 8.0)에 용해시키고, 160의 OD₆₀₀으로 조정하였다. 세포 파괴를 위해, 1 ml의 상기 세포 현탁액을 2 ml Ribolyser 튜브 (하이베이드)에 옮기고 6.0 의 회전 세팅으로 Ribolyser (하이베이드) 내에서 각각 30초 동안 3회 용해시켰다. 용해물을 15,000 rpm 및 4℃에서 에펜도르프 (Eppendorf) 원심분리기에서 30분 원심분리에 의해 청정화하고, 상등액을 새로운 에펜도르프 컵에 옮겼다. 단백질 함량은 문헌 [Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254]에 기재된 바와 같이 측정하였다.

metA의 효소 활성을 다음과 같이 측정하였다. 1 ml의 반응 혼합물은 100 mM 인산칼륨 버퍼 (pH 7.5), 5 mM MgCl₂, 100 μM 아세틸-CoA, 5mM L-호모세린, 500 μM DTNB (엘만 (Ellman) 시약) 및 세포 추출물을 함유하였다. 분석은 개별적인 단백질 용해물을 첨가하여 개시하고, 실온에서 인큐베이팅하였다. 이어서 412 nm에서 10분 동안 운동학을 기록하였다.

결과를 표 1a에 나타낸다.

균주	특이적인 활성 [nmol/mg/min]
ATCC 13032 pClik5MCS	12.6
ATCC 13032 pClik5MCS PmetA metA	50.7
ATCC 13032 pCLik5MCS PGroESmetA	109.0

이종성 발현 유니트를 사용함으로써 MetA 활성을 상당히 증가시키는 것이 가능하였다.

실시예 11

개시 코돈이 없는 플라스미드 pClik5MCS metA의 제조

염색체 DNA를 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 문헌 [Tauch et al. (1995) Plasmid 33: 168-179] 또는 [Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140: 1817-1828]에 기재된 바와 같이 제조하였다. groEL 유전자의 종결 영역을 증폭시키기 위해 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 32 내지 서열 33, 템플레이트로서 염색체 DNA 및 Pfu Turbo 폴리머라제 (스트라타젠)를 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 표준 방법에 의해 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)에 사용하였다.

서열 32

5'-GGATCTAGAGTTCTGTGAAAAACACCGTG-3'

서열 33

5'-GCGACTAGTGCCCCACAAATAAAAAACAC-3'

생성되는 약 60 bp 크기의 DNA 단편을 제조자의 지시에 따라 GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하였다. 이어서 이를 제한 효소 XbaI 및 BcnI (로셰 다이아그노스틱스, 독일 만하임)로 절단하고, DNA 단편을 GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트를 사용하여 정제하였다.

벡터 pClik5MCS 서열 23을 제한 효소 XbaI로 절단하고, 전기영동에 의한 분획화 후 5 kb 크기의 단편을 GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트를 사용하여 단리하였다.

벡터 단편을 60 bp 크기의 단편과 함께 제조자의 지시에 따라 신속 DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스, 독일 만하임)를 사용하여 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 문헌 [Sambrook et al, Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor (1989)]에 기재된 표준 방법에 의해 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠, 미국 라 졸라) 내로 형질전환시켰다. 플라스미드 함유 세포를 카나마이신 (20 ㎍/ml) 함유 LB 한천 (Lennox, 1955, Virology, 1:190)에 플레이팅하여 선택하였다.

생성되는 플라스미드 pCLiK5MCS PgroES term는 서열 34로서 나타내었다.

염색체 DNA를 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 문헌 [Tauch et al. (1995) Plasmid 33: 168-179] 또는 [Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140: 1817-1828]에 기재된 바와 같이 제조하였다. 개시 코돈이 없는 metA 유전자를 증폭시키기 위해 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 35 및 서열 36, 템플레이트로서 염색체 DNA 및 Pfu Turbo 폴리머라제 (스트라타젠)를 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 표준 방법에 의해 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)에서 사용하였다.

서열 35

5'-GAGACATATGCCCACCCTCGCGCCTTCAGG-3'

서열 36

5'-CTCTACTAGTTTAGATGTAGAACTCGATGT-3'

생성되는 약 1.2 kb 크기의 DNA 단편을 제조자의 지시에 따라 GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하였다. 이어서 이를 제한 효소 XbaI 및 BcnI (로셰 다이아그노스틱스, 독일 만하임)로 절단하고, DNA 단편을 GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트를 사용하여 정제하였다.

벡터 pClik5MCS groEL term 서열 34를 제한 효소 NdeI 및 BcnI로 절단하고, 전기영동에 의한 분획화 후 5 kb 크기의 단편을 GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트를 사용하여 단리하였다.

벡터 단편을 PCR 단편과 함께 제조자의 지시에 따라 신속 DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스, 독일 만하임)를 사용하여 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 문헌 [Sambrook et al, Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor (1989)]에 기재된 표준 방법에 의해 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠, 미국 라 졸라) 내로 형질전환시켰다. 플라스미드 함유 세포를 카나마이신 (20 ㎍/ml) 함유 LB 한천 (Lennox, 1955, Virology, 1:190)에 플레이팅하여 선택하였다.

생성되는 개시 코돈이 없는 플라스미드 pCLiK5MCS metA는 서열 37로서 나타내었다.

실시예 12

상이한 RBS 서열 및 개시 코돈으로부터 metA의 거리 때문에 상이한 특이적 발현 활성을 갖는 Pgro 발현 유니트의 제작

염색체 DNA를 씨. 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 문헌 [Tauch et al. (1995) Plasmid 33: 168-179] 또는 [Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140: 1817-1828]에 기재된 바와 같이 제조하였다. 다양한 발현 유니트를 증폭시키기 위해 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 38 내지 서열 43, 템플레이트로서 염색체 DNA 및 Pfu Turbo 폴리머라제 (스트라타젠)를 문헌 [Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press]에 기재된 표준 방법에 의해 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)에 사용하였다. 이 경우, 올리고뉴클레오티드 프라이머 1701 (서열 38)을 센스 프라이머로서 사용하고, 다른 올리고뉴클레오티드 프라이머와 조합하였다.

서열 38

올리고뉴클레오티드 프라이머 1701

5'-GAGACTCGAGCGGCTTAAAGTTTGGCTGCC-3'

서열 39

올리고뉴클레오티드 프라이머 1828

5'-ctctcatatgcAATCCCTCCATGAGAAAAATT-3'

서열 40

올리고뉴클레오티드 프라이머 1831

5'-ctctcatatgcgcggccgcAATCCCTCCATGAGAAAAATT-3'

서열 41

올리고뉴클레오티드 프라이머 1832

5'-ctctcatatgcAAtctctccATGAGAAAAATTTTGTGTG-3'

서열 42

올리고뉴클레오티드 프라이머 1833

5'-ctctcatatgcAAtctcctcATGAGAAAAATTTTGTGTG-3'

서열 43

올리고뉴클레오티드 프라이머 1834

5'-ctctcatatgcAAtcccttcATGAGAAAAATTTTGTGTG-3'

생성되는 약 200 bp 크기의 DNA 단편을 제조자의 지시에 따라 GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하였다.

벡터 pBS KS+ (서열 44)를 제한 효소 EcoRV로 절단하고, 전기영동에 의한 분획화 후 2.9 kb 크기의 단편을 GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트를 사용하여 단리하였다.

생성되는 플라스미드는 pKS Pgro 1701/1828, pKS Pgro 1701/1831, pKS Pgro 1701/1832, pKS Pgro 1701/1833 및 pKS Pgro 1701/1834으로 칭하였다.

이어서 상기 플라스미드를 제한 효소 NdeI 및 XhoI로 절단하였다. 생성되는 약 200 bp 크기의 DNA 단편을 단리하고, 제조자의 지시에 따라 GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트 (아머샴 파마시아)를 사용하여 정제하였다.

개시 코돈이 없는 벡터 pCLiK5MCS metA 서열 37을 제한 효소 NdeI 및 XhoI로 절단하고, 전기영동에 의한 분획화 후 5 kb 크기의 단편을 GFX^TMPCR, DNA and Gel Band 정제 키트를 사용하여 단리하였다.

벡터 단편을 200 bp 크기의 단편과 함께 제조자의 지시에 따라 신속 DNA 라이게이션 키트 (로셰 다이아그노스틱스, 독일 만하임)를 사용하여 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 문헌 [Sambrook et al, Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor (1989)]에 기재된 표준 방법에 의해 전능성 이. 콜라이 XL-1 Blue (스트라타젠, 미국 라 졸라) 내로 형질전환시켰다. 플라스미드 함유 세포를 카나마이신 (20 ㎍/ml) 함유 LB 한천 (Lennox, 1955, Virology, 1:190)에 플레이팅하여 선택하였다.

생성되는 플라스미드 pCLiK5MCS Pgro 1701/1828 metA, pCLiK5MCS Pgro 1701/1831 metA, pCLiK5MCS Pgro 1701/1832 metA, pCLiK5MCS Pgro 1701/1833 metA 및 pCLiK5MCS Pgro 1701/1834 metA를 서열 45 내지 49로 나타냈다.

Pgro 발현 유니트를 도 2에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드의 선택을 통해 변경시켰다.

균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 각각의 플라스미드 pClik5 MCS, pClik MCS Pgro metA, pCLiK5MCS Pgro 1701/1828 metA, pCLiK5MCS Pgro 1701/1831 metA, pCLiK5MCS Pgro 1701/1832 metA, pCLiK5MCS Pgro 1701/1833 metA 및 pCLiK5MCS Pgro 1701/1834를 사용하여 문헌 (Liebl, et al. (1989) FEMS Microbiology Letters 53: 299-303)에 기재된 방법에 의해 형질전환시켰다. 형질전환 혼합물을 플라스미드 함유 세포를 선택하기 위해 부가적으로 20 mg/l 카나마이신을 함유하는 CM 플레이트 상에 플레이팅하였다. 생성되는 Kan-내성 클론을 집어 단리하였다.

이들 플라스미드 구성물 중 하나를 함유하는 씨. 글루타미쿰 균주를 MMA 배지 (40 g/l 슈크로스, 20 g/l (NH₄)₂SO₄, 1 g/l KH₂P0₄, 1 g/l K₂HPO₄, 0.25 g/l MgSO₄ x 7H₂O, 54 g Aces, 1 ml CaCl₂ (10 g/l), 1 ml 프로토카테츄에이트 (300 mg/10 ml), 1 ml 미량원소 용액 (10 g/l FeSO₄ x 7H₂O, 10 g/l MnSO₄ x H₂O, 2 g/l ZnSO₄ x 7H₂O, 0.2 g/l CuSO₄, 0.02 g/l NiCl₂ x 6H₂O), 100 ㎍/l 비타민 B₁₂, 0.3 mg/l 티아민, 1 mM 류신, 1 mg/l 피리독살 HCl, 1 ml 비오틴 (100 mg/l), pH 7.0) 내에서 30℃에서 5시간 동안 배양하였다. 세포를 4℃에서 원심분리시킨 다음 냉 Tris-HCl 버퍼 (0.1%, pH 8.0)로 2회 세척하였다. 새로 원심분리시킨 후, 세포를 냉 Tris-HCl 버퍼 (0.1%, pH 8.0)에 용해시키고, 160의 OD₆₀₀으로 조정하였다. 세포 파괴를 위해, 1 ml의 상기 세포 현탁액을 2 ml Ribolyser 튜브 (하이베이드)에 옮기고 6.0의 회전 세팅으로 Ribolyser (하이베이드) 내에서 각각 30초 동안 3회 용해시켰다. 용해물을 15,000 rpm 및 4℃에서 에펜도르프 원심분리기에서 30분 원심분리에 의해 청정화하고, 상등액을 새로운 에펜도르프 컵에 옮겼다. 단백질 함량은 문헌 [Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254]에 기재된 바와 같이 측정하였다.

metA의 효소 활성을 다음과 같이 측정하였다. 1 ml의 반응 혼합물은 100 mM 인산칼륨 버퍼 (pH 7.5), 5 mM MgCl₂, 100 μM 아세틸-CoA, 5mM L-호모세린, 500 μM DTNB (엘만 (Ellman) 시약) 및 세포 추출물을 함유하였다. 분석은 각각의 단백질 용해물을 첨가하여 개시하고, 실온에서 인큐베이팅하였다. 이어서 412 nm에서 10분 동안 운동학을 기록하였다.

결과를 표 2a에 나타낸다.

균주	특이적인 활성 [nmol/mg/min]
ATCC 13032 pClik5MCS	7.5
ATCC 13032 pCLiK5MCS Pgro metA	109.0
ATCC 13032 pCLiK5MCS Pgro 1701/1828 metA	30.6
ATCC 13032 pCLiK5MCS Pgro 1701/1831 metA	8.7
ATCC 13032 pCLiK5MCS Pgro 1701/1832 metA	60.6
ATCC 13032 pCLiK5MCS Pgro 1701/1833 metA	217.3
ATCC 13032 pCLiK5MCS Pgro 1701/1835 metA	96.3

<110> BASF Aktiengesellschaft <120> Pgro-Expressionseinheiten <130> PF 55184/Mec <160> 53 <210> 1 <211> 164 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <223> SEQ_ID_1_GROES_RXA00497_PROMOTOR <400> 1 cggcttaaag tttggctgcc atgtgaattt ttagcaccct caacagttga gtgctggcac 60 tctcgggggt agagtgccaa ataggttgtt tgacacacag ttgttcaccc gcgacgacgg 120 ctgtgctgga aacccacaac cggcacacac aaaatttttc tcat 164 <210> 2 <211> 177 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <223> SEQ_ID_2_GROES_RXA00497_GESAMTE_EXPRESSIONSEINHEIT <400> 2 cggcttaaag tttggctgcc atgtgaattt ttagcaccct caacagttga gtgctggcac 60 tctcgggggt agagtgccaa ataggttgtt tgacacacag ttgttcaccc gcgacgacgg 120 ctgtgctgga aacccacaac cggcacacac aaaatttttc tcatggaggg attcatc 177 <210> 3 <211> 1365 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <223> SEQ_ID_3_RXA00077 <400> 3 atgaatgatg agaatattca aagctccaac tatcagccat tcccgagttt tgacgattgg 60 aaacagatcg aggtgtcgct cttagatgtc atcgaatcct cacgccattt ttctgatttg 120 aaagatagca ctgatcgttc tgcgttagat gctgcgctag agagagcaaa aagagctgcc 180 gcagttgata ccaatgccat agaaggaatc ttccaaactg atcgcggttt tacccataca 240 gttgcaacgc aggtaggggc ttgggagcaa caaatggcga tgaaaggcaa acatgttaag 300 cctgcgtttg acgatactct agaaggcttt gagtatgttc tcgatgcagt aactggtaga 360 actccaatct ctcagcaatg gattagaaat ttgcacgccg tcattctgcg gagccaagaa 420 agccacgagg tttttacagc cgttggagtc caaaatcagg cgcttcagaa aggcgagtat 480 aaaactcagc caaatagtcc acagcgctca gatggatctg tacatgcata cgccccagtt 540 gaagatactc ctgctgaaat ggctagattt atttcagaac ttgaatctaa ggaattctta 600 gcagccgaga aggttattca agctgcctat gcccactatg ctttcgtatg tattcatcct 660 tttgcagatg ggaatggacg agttgcacga gccttggcta gtgtttttct atacaaagat 720 cctggtgtcc ctctcgtaat ctaccaagat caacgcagag attacatcca tgctctagaa 780 gcagcggaca agaataaccc gctcctgctg attagattct ttgctgaacg agtgaccgat 840 actattaact ctattatcgt tgatctcact accccgatcg cgggtaaatc tggttcggct 900 aagctttcgg atgcgctacg ccccactcgc gtattaccag aattacatga tgctgcacat 960 aggctccaag aaagtttatt tacagaaatc cgatctcgat tggatgaaga aggaaaaagg 1020 aatgggttgg agtttctact tcaacggatt tttatcggtt ccccattcaa tctgccagag 1080 ggctataacg ctttccctga tagctattgt ctgaccttag ctttcaatag caactctcca 1140 aaacaaatct tccacccgct atccatagta atagcagctc gagatgggaa aagagcgagc 1200 agcgacctcg tggcagctac ttctattgga tacaactttc acgcttacgg acgtgaagtc 1260 gagcctgttg ttactgaaag ctttcgagaa cgtgtgaaaa tttacgccga cgggattgta 1320 gatcacttct taaccgaact ggctaaaaag tttcaacaga attaa 1365 <210> 4 <211> 454 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 4 Met Asn Asp Glu Asn Ile Gln Ser Ser Asn Tyr Gln Pro Phe Pro Ser 1 5 10 15 Phe Asp Asp Trp Lys Gln Ile Glu Val Ser Leu Leu Asp Val Ile Glu 20 25 30 Ser Ser Arg His Phe Ser Asp Leu Lys Asp Ser Thr Asp Arg Ser Ala 35 40 45 Leu Asp Ala Ala Leu Glu Arg Ala Lys Arg Ala Ala Ala Val Asp Thr 50 55 60 Asn Ala Ile Glu Gly Ile Phe Gln Thr Asp Arg Gly Phe Thr His Thr 65 70 75 80 Val Ala Thr Gln Val Gly Ala Trp Glu Gln Gln Met Ala Met Lys Gly 85 90 95 Lys His Val Lys Pro Ala Phe Asp Asp Thr Leu Glu Gly Phe Glu Tyr 100 105 110 Val Leu Asp Ala Val Thr Gly Arg Thr Pro Ile Ser Gln Gln Trp Ile 115 120 125 Arg Asn Leu His Ala Val Ile Leu Arg Ser Gln Glu Ser His Glu Val 130 135 140 Phe Thr Ala Val Gly Val Gln Asn Gln Ala Leu Gln Lys Gly Glu Tyr 145 150 155 160 Lys Thr Gln Pro Asn Ser Pro Gln Arg Ser Asp Gly Ser Val His Ala 165 170 175 Tyr Ala Pro Val Glu Asp Thr Pro Ala Glu Met Ala Arg Phe Ile Ser 180 185 190 Glu Leu Glu Ser Lys Glu Phe Leu Ala Ala Glu Lys Val Ile Gln Ala 195 200 205 Ala Tyr Ala His Tyr Ala Phe Val Cys Ile His Pro Phe Ala Asp Gly 210 215 220 Asn Gly Arg Val Ala Arg Ala Leu Ala Ser Val Phe Leu Tyr Lys Asp 225 230 235 240 Pro Gly Val Pro Leu Val Ile Tyr Gln Asp Gln Arg Arg Asp Tyr Ile 245 250 255 His Ala Leu Glu Ala Ala Asp Lys Asn Asn Pro Leu Leu Leu Ile Arg 260 265 270 Phe Phe Ala Glu Arg Val Thr Asp Thr Ile Asn Ser Ile Ile Val Asp 275 280 285 Leu Thr Thr Pro Ile Ala Gly Lys Ser Gly Ser Ala Lys Leu Ser Asp 290 295 300 Ala Leu Arg Pro Thr Arg Val Leu Pro Glu Leu His Asp Ala Ala His 305 310 315 320 Arg Leu Gln Glu Ser Leu Phe Thr Glu Ile Arg Ser Arg Leu Asp Glu 325 330 335 Glu Gly Lys Arg Asn Gly Leu Glu Phe Leu Leu Gln Arg Ile Phe Ile 340 345 350 Gly Ser Pro Phe Asn Leu Pro Glu Gly Tyr Asn Ala Phe Pro Asp Ser 355 360 365 Tyr Cys Leu Thr Leu Ala Phe Asn Ser Asn Ser Pro Lys Gln Ile Phe 370 375 380 His Pro Leu Ser Ile Val Ile Ala Ala Arg Asp Gly Lys Arg Ala Ser 385 390 395 400 Ser Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Ile Gly Tyr Asn Phe His Ala Tyr 405 410 415 Gly Arg Glu Val Glu Pro Val Val Thr Glu Ser Phe Arg Glu Arg Val 420 425 430 Lys Ile Tyr Ala Asp Gly Ile Val Asp His Phe Leu Thr Glu Leu Ala 435 440 445 Lys Lys Phe Gln Gln Asn 450 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <223> SEQ_ID_5_GRO3 <400> 5 gccgcagcaa acccagtag 19 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <223> SEQ_ID_6_GRO11 <400> 6 agtcgacacg atgaatccct ccatgagaaa a 31 <210> 7 <211> 54 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <223> SEQ_ID_7_PYC6 <400> 7 tttttctcat ggagggattc atcgtgtcga ctcacacatc ttcaacgctt ccag 54 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <223> SEQ_ID_8_PYC3 <400> 8 cccgcagcaa cgcacgcaag aaa 23 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <223> SEQ_ID_9_GRO12 <400> 9 gcattcgcgc cgctcgtaac ta 22 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <223> SEQ_ID_10_PYC11 <400> 10 ggttcccgcg ccctggtaa 19 <210> 11 <211> 5720 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <223> SEQ_ID_11_PK19_MOB_SACB <220> <221> misc_feature <222> (562 )..(1356 ) <223> KanR <220> <221> misc_feature <222> (1385 )..(1847 ) <223> PsacB <220> <221> misc_feature <222> (1848 )..(3266 ) <223> SacB <400> 11 ggtcgactct agaggatccc cgggtaccga gctcgaattc actggccgtc gttttacaac 60 gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt 120 tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca 180 gcctgaatgg cgaatggcga taagctagct tcacgctgcc gcaagcactc agggcgcaag 240 ggctgctaaa ggaagcggaa cacgtagaaa gccagtccgc agaaacggtg ctgaccccgg 300 atgaatgtca gctactgggc tatctggaca agggaaaacg caagcgcaaa gagaaagcag 360 gtagcttgca gtgggcttac atggcgatag ctagactggg cggttttatg gacagcaagc 420 gaaccggaat tgccagctgg ggcgccctct ggtaaggttg ggaagccctg caaagtaaac 480 tggatggctt tcttgccgcc aaggatctga tggcgcaggg gatcaagatc tgatcaagag 540 acaggatgag gatcgtttcg catgattgaa caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc 600 gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat 660 gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg 720 tccggtgccc tgaatgaact ccaagacgag gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg 780 ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta 840 ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta 900 tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac ctgcccattc 960 gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc 1020 gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg 1080 ctcaaggcgc ggatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga tgcctgcttg 1140 ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt 1200 gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga agagcttggc 1260 ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc 1320 atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgagcgg gactctgggg ttcgctagag 1380 gatcgatcct ttttaaccca tcacatatac ctgccgttca ctattattta gtgaaatgag 1440 atattatgat attttctgaa ttgtgattaa aaaggcaact ttatgcccat gcaacagaaa 1500 ctataaaaaa tacagagaat gaaaagaaac agatagattt tttagttctt taggcccgta 1560 gtctgcaaat ccttttatga ttttctatca aacaaaagag gaaaatagac cagttgcaat 1620 ccaaacgaga gtctaataga atgaggtcga aaagtaaatc gcgcgggttt gttactgata 1680 aagcaggcaa gacctaaaat gtgtaaaggg caaagtgtat actttggcgt caccccttac 1740 atattttagg tcttttttta ttgtgcgtaa ctaacttgcc atcttcaaac aggagggctg 1800 gaagaagcag accgctaaca cagtacataa aaaaggagac atgaacgatg aacatcaaaa 1860 agtttgcaaa acaagcaaca gtattaacct ttactaccgc actgctggca ggaggcgcaa 1920 ctcaagcgtt tgcgaaagaa acgaaccaaa agccatataa ggaaacatac ggcatttccc 1980 atattacacg ccatgatatg ctgcaaatcc ctgaacagca aaaaaatgaa aaatatcaag 2040 tttctgaatt tgattcgtcc acaattaaaa atatctcttc tgcaaaaggc ctggacgttt 2100 gggacagctg gccattacaa aacgctgacg gcactgtcgc aaactatcac ggctaccaca 2160 tcgtctttgc attagccgga gatcctaaaa atgcggatga cacatcgatt tacatgttct 2220 atcaaaaagt cggcgaaact tctattgaca gctggaaaaa cgctggccgc gtctttaaag 2280 acagcgacaa attcgatgca aatgattcta tcctaaaaga ccaaacacaa gaatggtcag 2340 gttcagccac atttacatct gacggaaaaa tccgtttatt ctacactgat ttctccggta 2400 aacattacgg caaacaaaca ctgacaactg cacaagttaa cgtatcagca tcagacagct 2460 ctttgaacat caacggtgta gaggattata aatcaatctt tgacggtgac ggaaaaacgt 2520 atcaaaatgt acagcagttc atcgatgaag gcaactacag ctcaggcgac aaccatacgc 2580 tgagagatcc tcactacgta gaagataaag gccacaaata cttagtattt gaagcaaaca 2640 ctggaactga agatggctac caaggcgaag aatctttatt taacaaagca tactatggca 2700 aaagcacatc attcttccgt caagaaagtc aaaaacttct gcaaagcgat aaaaaacgca 2760 cggctgagtt agcaaacggc gctctcggta tgattgagct aaacgatgat tacacactga 2820 aaaaagtgat gaaaccgctg attgcatcta acacagtaac agatgaaatt gaacgcgcga 2880 acgtctttaa aatgaacggc aaatggtacc tgttcactga ctcccgcgga tcaaaaatga 2940 cgattgacgg cattacgtct aacgatattt acatgcttgg ttatgtttct aattctttaa 3000 ctggcccata caagccgctg aacaaaactg gccttgtgtt aaaaatggat cttgatccta 3060 acgatgtaac ctttacttac tcacacttcg ctgtacctca agcgaaagga aacaatgtcg 3120 tgattacaag ctatatgaca aacagaggat tctacgcaga caaacaatca acgtttgcgc 3180 cgagcttcct gctgaacatc aaaggcaaga aaacatctgt tgtcaaagac agcatccttg 3240 aacaaggaca attaacagtt aacaaataaa aacgcaaaag aaaatgccga tgggtaccga 3300 gcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg 3360 ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga cgccctcgcg gacgtgctca 3420 tagtccacga cgcccgtgat tttgtagccc tggccgacgg ccagcaggta ggccgacagg 3480 ctcatgccgg ccgccgccgc cttttcctca atcgctcttc gttcgtctgg aaggcagtac 3540 accttgatag gtgggctgcc cttcctggtt ggcttggttt catcagccat ccgcttgccc 3600 tcatctgtta cgccggcggt agccggccag cctcgcagag caggattccc gttgagcacc 3660 gccaggtgcg aataagggac agtgaagaag gaacacccgc tcgcgggtgg gcctacttca 3720 cctatcctgc ccggctgacg ccgttggata caccaaggaa agtctacacg aaccctttgg 3780 caaaatcctg tatatcgtgc gaaaaaggat ggatataccg aaaaaatcgc tataatgacc 3840 ccgaagcagg gttatgcagc ggaaaagcgc tgcttccctg ctgttttgtg gaatatctac 3900 cgactggaaa caggcaaatg caggaaatta ctgaactgag gggacaggcg agagacgatg 3960 ccaaagagct cctgaaaatc tcgataactc aaaaaatacg cccggtagtg atcttatttc 4020 attatggtga aagttggaac ctcttacgtg ccgatcaacg tctcattttc gccaaaagtt 4080 ggcccagggc ttcccggtat caacagggac accaggattt atttattctg cgaagtgatc 4140 ttccgtcaca ggtatttatt cggcgcaaag tgcgtcgggt gatgctgcca acttactgat 4200 ttagtgtatg atggtgtttt tgaggtgctc cagtggcttc tgtttctatc agctcctgaa 4260 aatctcgata actcaaaaaa tacgcccggt agtgatctta tttcattatg gtgaaagttg 4320 gaacctctta cgtgccgatc aacgtctcat tttcgccaaa agttggccca gggcttcccg 4380 gtatcaacag ggacaccagg atttatttat tctgcgaagt gatcttccgt cacaggtatt 4440 tattcggcgc aaagtgcgtc gggtgatgct gccaacttac tgatttagtg tatgatggtg 4500 tttttgaggt gctccagtgg cttctgtttc tatcagggct ggatgatcct ccagcgcggg 4560 gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 4620 aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 4680 gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 4740 acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 4800 tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag 4860 ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 4920 atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 4980 agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 5040 cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 5100 agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 5160 acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 5220 gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 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atgctggagt tcttcgccca 3480 cgctagcggc gcgccggccg gcccggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat 3540 accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 3600 tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 3660 ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 3720 ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 3780 gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 3840 gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 3900 ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 3960 tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 4020 gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 4080 tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 4140 tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 4200 tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 4260 ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 4320 ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 4380 gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaagg 4440 ccggccgcgg ccgcgcaaag tcccgcttcg tgaaaatttt cgtgccgcgt gattttccgc 4500 caaaaacttt aacgaacgtt cgttataatg gtgtcatgac cttcacgacg aagtactaaa 4560 attggcccga atcatcagct atggatctct ctgatgtcgc gctggagtcc gacgcgctcg 4620 atgctgccgt cgatttaaaa acggtgatcg gatttttccg agctctcgat acgacggacg 4680 cgccagcatc acgagactgg gccagtgccg cgagcgacct agaaactctc gtggcggatc 4740 ttgaggagct ggctgacgag ctgcgtgctc ggccagcgcc aggaggacgc acagtagtgg 4800 aggatgcaat cagttgcgcc tactgcggtg gcctgattcc tccccggcct gacccgcgag 4860 gacggcgcgc aaaatattgc tcagatgcgt gtcgtgccgc agccagccgc gagcgcgcca 4920 acaaacgcca cgccgaggag ctggaggcgg ctaggtcgca aatggcgctg gaagtgcgtc 4980 ccccgagcga aattttggcc atggtcgtca cagagctgga agcggcagcg agaattatcg 5040 cgatcgtggc ggtgcccgca ggcatgacaa acatcgtaaa tgccgcgttt cgtgtgccgt 5100 ggccgcccag gacgtgtcag cgccgccacc acctgcaccg aatcggcagc agcgtcgcgc 5160 gtcgaaaaag cgcacaggcg gcaagaagcg ataagctgca cgaatacctg aaaaatgttg 5220 aacgccccgt gagcggtaac tcacagggcg tcggctaacc cccagtccaa acctgggaga 5280 aagcgctcaa aaatgactct agcggattca cgagacattg acacaccggc ctggaaattt 5340 tccgctgatc tgttcgacac ccatcccgag ctcgcgctgc gatcacgtgg ctggacgagc 5400 gaagaccgcc gcgaattcct cgctcacctg ggcagagaaa atttccaggg cagcaagacc 5460 cgcgacttcg ccagcgcttg gatcaaagac ccggacacgg agaaacacag ccgaagttat 5520 accgagttgg ttcaaaatcg cttgcccggt gccagtatgt tgctctgacg cacgcgcagc 5580 acgcagccgt gcttgtcctg gacattgatg tgccgagcca ccaggccggc gggaaaatcg 5640 agcacgtaaa ccccgaggtc tacgcgattt tggagcgctg ggcacgcctg gaaaaagcgc 5700 cagcttggat cggcgtgaat ccactgagcg ggaaatgcca gctcatctgg ctcattgatc 5760 cggtgtatgc cgcagcaggc atgagcagcc cgaatatgcg cctgctggct gcaacgaccg 5820 aggaaatgac ccgcgttttc ggcgctgacc aggctttttc acataggctg agccgtggcc 5880 actgcactct ccgacgatcc cagccgtacc gctggcatgc ccagcacaat cgcgtggatc 5940 gcctagctga tcttatggag gttgctcgca tgatctcagg cacagaaaaa cctaaaaaac 6000 gctatgagca ggagttttct agcggacggg cacgtatcga agcggcaaga aaagccactg 6060 cggaagcaaa agcacttgcc acgcttgaag caagcctgcc gagcgccgct gaagcgtctg 6120 gagagctgat cgacggcgtc cgtgtcctct ggactgctcc agggcgtgcc gcccgtgatg 6180 agacggcttt tcgccacgct ttgactgtgg gataccagtt aaaagcggct ggtgagcgcc 6240 taaaagacac caagggtcat cgagcctacg agcgtgccta caccgtcgct caggcggtcg 6300 gaggaggccg tgagcctgat ctgccgccgg actgtgaccg ccagacggat tggccgcgac 6360 gtgtgcgcgg ctacgtcgct aaaggccagc cagtcgtccc tgctcgtcag acagagacgc 6420 agagccagcc g 6431 <210> 50 <211> 1005 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <223> SEQ_ID_50_FRUCTOSE_1_6_BISPHOSPHATASE <400> 50 atgaacctaa agaaccccga aacgccagac cgtaaccttg ctatggagct ggtgcgagtt 60 acggaagcag ctgcactggc ttctggacgt tgggttggac gtggcatgaa gaatgaaggc 120 gacggtgccg ctgttgacgc catgcgccag ctcatcaact cagtgaccat gaagggcgtc 180 gttgttatcg gcgagggcga aaaagacgaa gctccaatgc tgtacaacgg cgaagaggtc 240 ggaaccggct ttggacctga ggttgatatc gcagttgacc cagttgacgg 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Claims

서열 1의 핵산 서열을 포함하는, 프로모터 활성을 갖는 핵산을 포함하는 DNA 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 유전자 전사용 조성물.
제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 추가의 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 발현 유니트를 포함하는 DNA 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 유전자 발현용 조성물.
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a) 내재성 유전자의 전사를 조절하는, 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 내재성 핵산의 미생물 내에서의 특이적 프로모터 활성을 야생형에 비해 변경하거나,

b) 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 또는 실시태양 a)에 따라 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 미생물에서 프로모터 활성을 갖는 핵산에 관하여 이종성인 유전자의 전사를 조절함으로써, 미생물 내에서 유전자의 전사 속도를 야생형에 비해 변경하는 방법.
제8항에 있어서, 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 또는 실시태양 a)에 따라 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 미생물에서 유전자 전사의 조절이

b1) 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성, 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 핵산을 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 내재성 유전자의 전사가 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성, 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 도입된 핵산의 제어 하에 일어나도록 하거나,

b2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 전사가 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성, 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 내재성 핵산의 제어 하에 일어나도록 하거나,

b3) 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성, 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 전사시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 구성물을 미생물 내에 도입함으로써 달성되는 것인 방법.
제8항에 있어서, 야생형에 비해 미생물에서 유전자의 전사 속도를 증가하기 위해

ah) 내재성 유전자의 전사를 조절하는, 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 내재성 핵산의 미생물 내의 특이적 프로모터 활성이 야생형에 비해 증가되거나,

bh) 미생물에서 프로모터 활성을 갖는 핵산에 관하여 이종성인 유전자의 전사가 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 또는 실시태양 a)에 따라 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 조절되는 것인 방법.
제8항에 있어서, 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 또는 실시태양 a)에 따라 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 미생물에서 유전자 전사의 조절이

bh1) 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성, 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 핵산을 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 내재성 유전자의 전사가 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성, 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 도입된 핵산의 제어 하에 일어나도록 하거나,

bh2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 전사가 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성, 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 내재성 핵산의 제어 하에 일어나도록 하거나,

bh3) 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성, 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 전사시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 구성물을 미생물 내로 도입함으로써 달성되는 것인 방법.
제8항에 있어서, 야생형에 비해 미생물에서 유전자의 전사 속도를 감소시키기 위해

ar) 내재성 유전자의 전사를 조절하는, 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 내재성 핵산의 미생물 내의 특이적 프로모터 활성이 야생형에 비해 감소되거나,

br) 실시태양 a)에 따라 감소된 프로모터 활성을 갖는 핵산이 미생물의 게놈에 도입되어, 내재성 유전자의 전사가 감소된 프로모터 활성을 갖는 도입된 핵산의 제어 하에 일어나는 것인 방법.
c) 내재성 유전자의 발현을 조절하는 제2항에 따른 내재성 발현 유니트의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성을 야생형에 비해 변경시키거나,

d) 제2항에 따른 발현 유니트에 의해 또는 실시태양 c)에 따라 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항에 따른 발현 유니트에 의해 미생물에서 발현 유니트에 관하여 이종성인 유전자의 발현을 조절함으로써 미생물에서 유전자의 발현 속도를 야생형에 비해 변경하는 방법.
제13항에 있어서, 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 발현 유니트에 의한 또는 실시태양 a)에 따라 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 발현 유니트에 의한 미생물 내에서의 유전자 발현의 조절이

d1) 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 유니트를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 내재성 유전자의 발현이 도입된 발현 유니트의 제어 하에 일어나도록 하거나,

d2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 내재성 발현 유니트의 제어 하에 일어나도록 하거나,

d3) 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 발현 유니트 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 구성물을 미생물 내에 도입함으로써 달성되는 것인 방법.
제13항에 있어서, 미생물에서 야생형에 비해 유전자의 발현 속도를 증가시키기 위해

ch) 내재성 유전자의 발현을 조절하는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 내재성 발현 유니트의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성을 야생형에 비해 증가시키거나,

dh) 미생물에서 발현 유니트에 관하여 이종성인 유전자의 발현이 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 발현 유니트에 의해 또는 실시태양 a)에 따라 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 발현 유니트에 의해 조절되는 것인 방법.
제13항에 있어서, 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 발현 유니트에 의한 또는 실시태양 c)에 따라 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 발현 유니트에 의한 미생물 내에서의 유전자 발현의 조절이

dh1) 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 유니트를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 내재성 유전자의 발현이 적절하게는 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 도입된 발현 유니트의 제어 하에 일어나도록 하거나,

dh2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 내재성 발현 유니트의 제어 하에 일어나도록 하거나,

dh3) 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 발현 유니트 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 구성물을 미생물 내로 도입함으로써 달성되는 것인 방법.
제13항에 있어서, 야생형에 비해 미생물 내에서 유전자 발현을 감소시키기 위해

cr) 내재성 유전자의 발현을 조절하는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 내재성 발현 유니트의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성이 야생형에 비해 감소되거나,

dr) 실시태양 cr)에 따라 감소된 특이적 발현 활성을 갖는 발현 유니트를 미생물의 게놈에 도입하여, 내재성 유전자의 발현이 감소된 발현 활성을 갖는 도입된 발현 유니트의 제어 하에 일어나는 것인 방법.
제8항 또는 제13항에 있어서, 유전자가 단백성 및 비단백성 아미노산의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 유기산의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 지질 및 지방산의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 디올의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 탄수화물의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 방향족 화합물의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 비타민의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 보조인자의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산 및 효소의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 여기서 유전자는 임의로 추가의 조절 요소를 포함할 수 있는 것인 방법.
제18항에 있어서, 아미노산의 생합성 경로로부터의 단백질이 아스파르테이트 키나제, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 디히드로디피콜리네이트 합성효소, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 3-포스포글리세레이트 키나제, 피루베이트 카르복실라제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 전사 레귤레이터 LuxR, 전사 레귤레이터 LysR1, 전사 레귤레이터 LysR2, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 호모세린-0-아세틸트랜스퍼라제, 시스타티오닌 감마-신타제, 시스타티오닌 베타-리아제, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제, 포스포세린 포스파타제, 세린 아세틸트랜스퍼라제, 호모세린 데히드로게나제, 호모세린 키나제, 트레오닌 신타제, 트레오닌 엑스포터 캐리어, 트레오닌 데히드라타제, 피루베이트 옥시다제, 라이신 엑스포터, 비오틴 리가제, 시스테인 신타제 I, 시스테인 신타제 II, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제, 술페이트 아데닐트랜스퍼라제 서브유닛 1 및 2, 포스포아데노신 포스포술페이트 리덕타제, 페레독신-술파이트 리덕타제, 페레독신 NADP 리덕타제, 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제, RXA00655 레귤레이터, RXN2910 레귤레이터, 아르기닐-tRNA 합성효소, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 트레오닌 유출 단백질(efflux protein), 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, 프럭토스-1,6-비스포스파타제, 술페이트 환원 단백질 RXA077, 술페이트 환원 단백질 RXA248, 술페이트 환원 단백질 RXA247, 단백질 OpcA, 1-포스포프럭토키나제 및 6-포스포프럭토키나제로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
a) 제2항에 따른 하나 이상의 발현 유니트,

b) 발현시킬 하나 이상의 추가의 핵산, 및

c) 적절하게는 추가의 유전 조절 요소를 포함하며,

하나 이상의 발현 유니트 및 발현시킬 추가의 핵산 서열이 함께 기능적으로 연결되고, 발현시킬 추가의 핵산 서열이 발현 유니트에 관하여 이종성인 발현 카세트.
제20항에 있어서, 발현시킬 추가의 핵산 서열이 단백성 및 비단백성 아미노산의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 유기산의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 지질 및 지방산의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 디올의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 탄수화물의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 방향족 화합물의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 비타민의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 보조인자의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산 및 효소의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 발현 카세트.
제21항에 있어서, 아미노산의 생합성 경로로부터의 단백질이 아스파르테이트 키나제, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 디히드로디피콜리네이트 합성효소, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나 제, 3-포스포글리세레이트 키나제, 피루베이트 카르복실라제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 전사 레귤레이터 LuxR, 전사 레귤레이터 LysR1, 전사 레귤레이터 LysR2, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 호모세린-0-아세틸트랜스퍼라제, 시스타티오닌 감마-신타제, 시스타티오닌 베타-리아제, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제, 포스포세린 포스파타제, 세린 아세틸트랜스퍼라제, 호모세린 데히드로게나제, 호모세린 키나제, 트레오닌 신타제, 트레오닌 엑스포터 캐리어, 트레오닌 데히드라타제, 피루베이트 옥시다제, 라이신 엑스포터, 비오틴 리가제, 시스테인 신타제 I, 시스테인 신타제 II, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제 활성, 술페이트 아데닐트랜스퍼라제 서브유닛 1 및 2, 포스포아데노신 포스포술페이트 리덕타제, 페레독신-술파이트 리덕타제, 페레독신 NADP 리덕타제, 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제, RXA00655 레귤레이터, RXN2910 레귤레이터, 아르기닐-tRNA 합성효소, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 트레오닌 유출 단백질, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, 프럭토스-1,6-비스포스파타제, 술페이트 환원 단백질 RXA077, 술페이트 환원 단백질 RXA248, 술페이트 환원 단백질 RXA247, 단백질 OpcA, 1-포스포프럭토키나제 및 6-포스포프럭토키나제로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 발현 카세트.
제20항에 따른 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터.
유전학적으로 변형된 미생물로서, 유전학적 변형이 야생형에 비해 하나 이상의 유전자의 전사 속도의 변형을 야기하고, 유전학적 변형이

a) 하나 이상의 내재성 유전자의 전사를 조절하는, 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 내재성 핵산의 미생물 내에서의 특이적 프로모터 활성의 변경, 또는

b) 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 또는 실시태양 a)에 따라 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 제1항에 따른 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한, 미생물에서 프로모터 활성을 갖는 핵산에 관하여 이종성인 유전자의 전사의 조절에 의존하는 것인 유전학적으로 변형된 미생물.
제24항에 있어서, 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 또는 실시태양 a)에 따라 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 미생물에서 유전자 전사의 조절이

b1) 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성, 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 핵산을 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 내재성 유전자의 전사가 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성, 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 도입된 핵산의 제어 하에 일어나도록 하거나,

b2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 전사가 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성, 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 내재성 핵산의 제어 하에 일어나도록 하거나,

b3) 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성, 변경된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 전사시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 구성물을 미생물 내에 도입함으로써 달성되는 것인 유전학적으로 변형된 미생물.
제24항에 있어서, 야생형에 비해 하나 이상의 유전자의 전사 속도의 증가를 갖고,

ah) 내재성 유전자의 전사를 조절하는, 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 내재성 핵산의 미생물 내의 특이적 프로모터 활성이 야생형에 비해 증가되거나,

bh) 미생물에서 프로모터 활성을 갖는 핵산에 관하여 이종성인 유전자의 전사가 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 또는 실시태양 ah)에 따라 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의해 조절되는 것인 유전학적으로 변형된 미생물.
제26항에 있어서, 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 또는 실시태양 ah)에 따라 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산에 의한 미생물에서 유전자 전사의 조절이

bh1) 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성, 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 핵산을 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 내재성 유전자의 전사가 프로모터 활성, 적절하게는 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 도입된 핵산의 제어 하에 일어나도록 하거나,

bh2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 전사가 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성, 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 내재성 핵산의 제어 하에 일어나도록 하거나,

bh3) 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성, 증가된 특이적 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 전사시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 구성물을 미생물 내로 도입함으로써 달성되는 것인 유전학적으로 변형된 미생물.
제24항에 있어서, 야생형에 비해 하나 이상의 유전자의 감소된 전사 속도를 갖고,

ar) 하나 이상의 내재성 유전자의 전사를 조절하는, 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 내재성 핵산의 미생물 내의 특이적 프로모터 활성이 야생형에 비해 감소되거나,

br) 실시태양 a)에 따라 감소된 프로모터 활성을 갖는 하나 이상의 핵산이 미생물의 게놈에 도입되어, 하나 이상의 내재성 유전자의 전사가 감소된 프로모터 활성을 갖는 도입된 핵산의 제어 하에 일어나는 것인 유전학적으로 변형된 미생물.
유전학적으로 변형된 미생물로서, 유전학적 변형이 야생형에 비해 하나 이상의 유전자의 발현 속도의 변형을 야기하고, 유전학적 변형이

c) 하나 이상의 내재성 유전자의 발현을 조절하는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 내재성 발현 유니트의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성을 야생형에 비해 변경하거나 또는

d) 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 발현 유니트에 의해 또는 실시태양 c)에 따라 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 발현 유니트에 의해 미생물에서 발현 유니트에 관하여 이종성인 유전자의 발현을 조절하는 것에 의존하는 것인 유전학적으로 변형된 미생물.
제29항에 있어서, 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 발현 유니트에 의한 또는 실시태양 c)에 따라 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 발현 유니트에 의한 미생물 내에서의 유전자 발현의 조절이

d1) 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 유니트를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 내재성 유전자의 발현이 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 도입된 발현 유니트의 제어 하에 일어나도록 하거나,

d2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 내재성 발현 유니트의 제어 하에 일어나도록 하거나,

d3) 변경된 특이적 발현 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 발현 유니트 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 구성물을 미생물 내에 도입함으로써 달성되는 것인 유전학적으로 변형된 미생물.
제29항에 있어서, 야생형에 비해 하나 이상의 유전자의 증가된 발현 속도를 갖고,

ch) 내재성 유전자의 발현을 조절하는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 내재성 발현 유니트의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성이 야생형에 비해 증가하거나,

dh) 미생물에서 발현 유니트에 관하여 이종성인 유전자의 발현이 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 발현 유니트에 의해 또는 실시태양 a)에 따라 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 발현 유니트에 의해 조절되는 것인 유전학적으로 변형된 미생물.
제31항에 있어서, 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 발현 유니트에 의한 또는 실시태양 ch)에 따라 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 제2항에 따른 발현 유니트에 의한 미생물 내에서의 유전자 발현의 조절이

dh1) 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 유니트를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 내재성 유전자의 발현이 적절하게는 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 도입된 발현 유니트의 제어 하에 일어나도록 하거나,

dh2) 하나 이상의 유전자를 미생물의 게놈 내로 도입하여, 하나 이상의 도입된 유전자의 발현이 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 내재성 발현 유니트의 제어 하에 일어나도록 하거나,

dh3) 증가된 특이적 발현 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 발현 유니트 및 기능적으로 연결된 하나 이상의 발현시킬 핵산을 포함하는 하나 이상의 핵산 구성물을 미생물 내로 도입함으로써 달성되는 것인 유전학적으로 변형된 미생물.
제29항에 있어서, 야생형에 비해 하나 이상의 유전자의 감소된 발현 속도를 갖고,

cr) 하나 이상의 내재성 유전자의 발현을 조절하는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 내재성 발현 유니트의 미생물 내에서의 특이적 발현 활성이 야생형에 비해 감소되거나,

dr) 감소된 발현 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 유니트를 미생물의 게놈에 도입하여, 하나 이상의 유전자의 발현이 감소된 발현 활성을 갖는 서열 1의 핵산 서열을 포함하는 프로모터 활성을 갖는 핵산 및 리보핵산의 번역을 보장하는 기능적으로 연결된 서열 2의 핵산 서열을 포함하는 도입된 발현 유니트의 제어 하에 일어나는 것인 유전학적으로 변형된 미생물.
제2항에 따른 발현 유니트, 및 발현 유니트에 관하여 이종성인 기능적으로 연결된 발현시킬 유전자를 포함하는 유전학적으로 변형된 미생물.
삭제
제24항, 제29항 또는 제34항에 있어서, 유전자가 단백성 및 비단백성 아미노산의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 유기산의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 지질 및 지방산의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 디올의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 탄수화물의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 방향족 화합물의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 비타민의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산, 보조인자의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산 및 효소의 생합성 경로로부터의 단백질을 코딩하는 핵산으로 이루어진 군 중에서 선택되고, 여기서 유전자는 임의로 추가의 조절 요소를 포함할 수 있는 것인 유전학적으로 변형된 미생물.
제36항에 있어서, 아미노산의 생합성 경로로부터의 단백질이 아스파르테이트 키나제, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제, 디아미노피멜레이트 데히드 로게나제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 디히드로디피콜리네이트 합성효소, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 3-포스포글리세레이트 키나제, 피루베이트 카르복실라제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 전사 레귤레이터 LuxR, 전사 레귤레이터 LysR1, 전사 레귤레이터 LysR2, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 호모세린-0-아세틸트랜스퍼라제, 시스타티오닌 감마-신타제, 시스타티오닌 베타-리아제, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제, 포스포세린 포스파타제, 세린 아세틸트랜스퍼라제, 호모세린 데히드로게나제, 호모세린 키나제, 트레오닌 신타제, 트레오닌 엑스포터 캐리어, 트레오닌 데히드라타제, 피루베이트 옥시다제, 라이신 엑스포터, 비오틴 리가제, 시스테인 신타제 I, 시스테인 신타제 II, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제, 술페이트 아데닐트랜스퍼라제 서브유닛 1 및 2, 포스포아데노신 포스포술페이트 리덕타제, 페레독신-술파이트 리덕타제, 페레독신 NADP 리덕타제, 3-포스포글리세레이트 데히드로게나제, RXA00655 레귤레이터, RXN2910 레귤레이터, 아르기닐-tRNA 합성효소, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 트레오닌 유출 단백질, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제, 프럭토스-1,6-비스포스파타제, 술페이트 환원 단백질 RXA077, 술페이트 환원 단백질 RXA248, 술페이트 환원 단백질 RXA247, 단백질 OpcA, 1-포스포프럭토키나제 및 6-포스포프럭토키나제로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 유전학적 으로 변형된 미생물.
제24항, 제29항 또는 제34항 중 어느 한 항에 따른 유전학적으로 변형된 미생물을 배양함으로써 생합성 산물을 제조하는 방법.
제24항에 따른 유전학적으로 변형된 미생물을 배양함으로써 라이신을 제조하는 방법으로서, 유전자가 아스파르테이트 키나제를 코딩하는 핵산, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제를 코딩하는 핵산, 디히드로디피콜리네이트 합성효소를 코딩하는 핵산, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제를 코딩하는 핵산, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 3-포스포글리세레이트 키나제를 코딩하는 핵산, 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 트리오스포스페이트 이소머라제를 코딩하는 핵산, 전사 레귤레이터 LuxR을 코딩하는 핵산, 전사 레귤레이터 LysR1을 코딩하는 핵산, 전사 레귤레이터 LysR2를 코딩하는 핵산, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제를 코딩하는 핵산, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 트랜스케톨라제를 코딩하는 핵산, 트랜스알돌라제를 코딩하는 핵산, 라이신 엑스포터를 코딩하는 핵산, 비오틴 리가제를 코딩하는 핵산, 아르기닐-tRNA 합성효소를 코딩하는 핵산, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 프럭토스-1,6-비스포스파타제를 코딩하는 핵산, 단백질 OpcA를 코딩하는 핵산, 1-포스포프럭토키나제를 코딩하는 핵산 및 6-포스포프럭토키나제를 코딩하는 핵산으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
제39항에 있어서, 유전학적으로 변형된 미생물이 아스파르테이트 키나제 활성, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제 활성, 디아미노피멜레이트 데히드로게나제 활성, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제 활성, 디히드로디피콜리네이트 합성효소 활성, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제 활성, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 활성, 3-포스포글리세레이트 키나제 활성, 피루베이트 카르복실라제 활성, 트리오스포스페이트 이소머라제 활성, 전사 레귤레이터 LuxR의 활성, 전사 레귤레이터 LysR1의 활성, 전사 레귤레이터 LysR2의 활성, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제 활성, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제 활성, 트랜스케톨라제 활성, 트랜스알돌라제 활성, 라이신 엑스포터 활성, 아르기닐-tRNA 합성효소 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 활성, 프럭토스-1,6-비스포스파타제 활성, 단백질 OpcA 활성, 1-포스포프럭토키나제 활성, 6-포스포프럭토키나제 활성 및 비오틴 리가제 활성으로 이루어지는 군 중에서 선택되는, 야생형에 비해 추가로 증가된 하나 이상의 활성을 갖는 것인 방법.
제39항에 있어서, 유전학적으로 변형된 미생물이 트레오닌 데히드라타제 활성, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 활성, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성, 피루베이트 옥시다제 활성, 호모세린 키나제 활성, 호모세린 데히드로게나제 활성, 트레오닌 엑스포터 활성, 트레오닌 유출 단백질 활성, 아스파라기나제 활성, 아스파르테이트 데카르복실라제 활성 및 트레오닌 신타제 활성으로 이루어지는 군 중에서 선택되는, 야생형에 비해 추가로 감소된 하나 이상의 활성을 갖는 것인 방법.
제24항에 따른 유전학적으로 변형된 미생물을 배양함으로써 메티오닌을 제조하는 방법으로서, 유전자가 아스파르테이트 키나제를 코딩하는 핵산, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 호모세린 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 3-포스포글리세레이트 키나제를 코딩하는 핵산, 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 트리오스포스페이트 이소머라제를 코딩하는 핵산, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산, 시스타티오닌 감마-신타제를 코딩하는 핵산, 시스타티오닌 베타-리아제를 코딩하는 핵산, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제를 코딩하는 핵산, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제를 코딩하는 핵산, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산, 포스포세린 포스파타제를 코딩하는 핵산, 세린 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산, 시스테인 신타제 I을 코딩하는 핵산, 시스테인 신타제 II 활성을 코딩하는 핵산, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제 활성을 코딩하는 핵산, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제 활성을 코딩하는 핵산, 술페이트 아데닐일트랜스퍼라제 활성을 코딩하는 핵산, 포스포아데노신 포스포술페이트 리덕타제 활성을 코딩하는 핵산, 페레독신-술파이트 리덕타제 활성을 코딩하는 핵산, 페레독신 NADPH-리덕타제 활성을 코딩하는 핵산, 페레독신 활성을 코딩하는 핵산, 술페이트 환원 단백질 RXA077을 코딩하는 핵산, 술페이트 환원 단백질 RXA248을 코딩하는 핵산, 술페이트 환원 단백질 RXA247을 코딩하는 핵산, RXA0655 레귤레이터를 코딩하는 핵산 및 RXN2910 레귤레이터를 코딩하는 핵산으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
제42항에 있어서, 유전학적으로 변형된 미생물이 아스파르테이트 키나제 활성, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제 활성, 호모세린 데히드로게나제 활성, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 활성, 3-포스포글리세레이트 키나제 활성, 피루베이트 카르복실라제 활성, 트리오스포스페이트 이소머라제 활성, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 활성, 시스타티오닌 감마-신타제 활성, 시스타티오닌 베타-리아제 활성, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 활성, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제 활성, 메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제 활성, 포스포세린 아미노트랜스퍼라제 활성, 포스포세린 포스파타제 활성, 세린 아세틸트랜스퍼라제 활성, 시스테인 신타제 I 활성, 시스테인 신타제 II 활성, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제 활성, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제 활성, 술페이트 아데닐일트랜스퍼라제 활성, 포스포아데노신 포스포술페이트 리덕타제 활성, 페레독신-술파이 트 리덕타제 활성, 페레독신 NADPH-리덕타제 활성, 페레독신 활성, 술페이트 환원 단백질 RXA077의 활성, 술페이트 환원 단백질 RXA248의 활성, 술페이트 환원 단백질 RXA247의 활성, RXA655 레귤레이터의 활성 및 RXN2910 레귤레이터의 활성으로 이루어지는 군 중에서 선택되는, 야생형에 비해 추가로 증가된 하나 이상의 활성을 갖는 것인 방법.
제42항에 있어서, 유전학적으로 변형된 미생물이 호모세린 키나제 활성, 트레오닌 데히드라타제 활성, 트레오닌 신타제 활성, 메조-디아미노피멜레이트 D-데히드로게나제 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성, 피루베이트 옥시다제 활성, 디히드로디피콜리네이트 신타제 활성, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제 활성, 및 디아미노피콜리네이트 데카르복실라제 활성으로 이루어지는 군 중에서 선택되는, 야생형에 비해 추가로 감소된 하나 이상의 활성을 갖는 것인 방법.
제24항에 따른 유전학적으로 변형된 미생물을 배양함으로써 트레오닌을 제조하는 방법으로서, 유전자가 아스파르테이트 키나제를 코딩하는 핵산, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 3-포스포글리세레이트 키나제를 코딩하는 핵산, 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 트리오스포스페이트 이소머라제를 코딩하는 핵산, 호모세린 키나제를 코딩하는 핵산, 트레오닌 신타제를 코딩하는 핵산, 트레오닌 엑스포터 캐리어를 코딩하는 핵산, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 트랜스알돌라제를 코딩하는 핵산, 트랜스케톨라제를 코딩하는 핵산, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제를 코딩하는 핵산, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제를 코딩하는 핵산, 라이신 엑스포터를 코딩하는 핵산, 비오틴 리가제를 코딩하는 핵산, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 핵산, 트레오닌 유출 단백질을 코딩하는 핵산, 프럭토스-1,6-비스포스파타제를 코딩하는 핵산, 단백질 OpcA를 코딩하는 핵산, 1-포스포프럭토키나제를 코딩하는 핵산, 6-포스포프럭토키나제를 코딩하는 핵산 및 호모세린 데히드로게나제를 코딩하는 핵산으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
제45항에 있어서, 유전학적으로 변형된 미생물이 아스파르테이트 키나제 활성, 아스파르테이트-세미알데히드 데히드로게나제 활성, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 활성, 3-포스포글리세레이트 키나제 활성, 피루베이트 카르복실라제 활성, 트리오스포스페이트 이소머라제 활성, 트레오닌 신타제 활성, 트레오닌 엑스포터 캐리어 활성, 트랜스알돌라제 활성, 트랜스케톨라제 활성, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성, 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제 활성, 호모세린 키나제 활성, 비오틴 리가제 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 활성, 트레오닌 유출 단백질 활성, 단백질 OpcA 활성, 1-포스포프럭토키나제 활성, 6-포스포프럭토키나제 활성, 프럭토스-1,6-비스포스파타제 활성, 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제 및 호모세린 데히드로게나제 활성으로 이루어지는 군 중에서 선택 되는, 야생형에 비해 추가로 증가된 하나 이상의 활성을 갖는 것인 방법.
제45항에 있어서, 유전학적으로 변형된 미생물이 트레오닌 데히드라타제 활성, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 활성, 세린 히드록시메틸트랜스퍼라제 활성, O-아세틸호모세린 술프히드릴라제 활성, 메조-디아미노피멜레이트 D-데히드로게나제 활성, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 활성, 피루베이트 옥시다제 활성, 디히드로디피콜리네이트 합성효소 활성, 디히드로디피콜리네이트 리덕타제 활성, 아스파라기나제 활성, 아스파르테이트 데카르복실라제 활성, 라이신 엑스포터 활성, 아세토락테이트 신타제 활성, 케톨-산 리덕토이소머라제 활성, 분지쇄 아미노트랜스퍼라제 활성, 조효소 B12-의존성 메티오닌 신타제 활성, 조효소 B12-비의존성 메티오닌 신타제 활성, 디히드록시-산 데히드라타제 활성 및 디아미노피콜리네이트 데카르복실라제 활성으로 이루어지는 군 중에서 선택되는, 야생형에 비해 추가로 감소된 하나 이상의 활성을 갖는 것인 방법.
제38항에 있어서, 생합성 산물이 배양 단계 후 또는 배양 단계 동안 배양 배지로부터 단리되고, 적절한 경우 정제되는 것인 방법.
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