KR20070026355A - 발효에 의해서 정밀화학 약품을 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 효소 코딩 유전자, 즉, 락테이트 데하이드로게나제를 조절해제하는 방식으로 미생물, 예를 들어, 코리네박테리움으로부터 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신의 생산을 증가시키는 방법을 특징으로 한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 락테이트 데하이드로게나제 활성의 발현을 증가시키는 방식으로 코리네박테리움 글루타미쿰에서 라이신의 생산을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 옥살로아세테이트 (OAA) 쪽으로의 탄소 플럭스를 조절하는 방식으로 라이신을 생산하는 신규한 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 탄소 공급원으로서 프럭토즈 또는 슈크로즈를 이용하는 방식으로 라이신을 생산하는 방법을 제공한다.

정밀화학 약품, 라이신, 코리네박테리움, 코리네박테리움 글루타미쿰, 락테이트 데하이드로게나제, 조절해제, 펜토즈 포스페이트 생합성 경로.

Description

발효에 의해서 정밀화학 약품을 제조하는 방법{METHODS FOR THE PREPARATION OF A FINE CHEMICAL BY FERMENTATION}

발명의 배경

아미노산 라이신의 산업적 생산은 경제적으로 중요한 산업적 방법이 되었다. 라이신은 다른 아미노산의 흡수를 증가시킴으로써 사료의 품질을 개선시키는 그의 능력으로 인하여 동물사료 첨가물로서, 인간 의약에서, 특히 주입용액의 성분으로서, 및 제약산업에서 상업적으로 사용된다.

이러한 라이신의 상업적 생산은 주로 그람 양성인 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum) 및 브레비박테리움 락토페르멘툼 (Brevibacterium lactofermentum)을 이용하여 수행된다 (Kleemann, A., et al., "Amino Acids," in ULLMANN'S ENCYCLOPEDIA OF INDUSTRIAL CHEMISTRY, vol. A2, pp. 57-97, Weinham: VCH-Verlagsgesellschaft (1985)). 이들 유기체는 현재, 연간 생산된 라이신의 약 250,000 톤을 차지한다. 상당한 양의 연구가 더 대량의 라이신을 생산하는 돌연변이체 박테리아 균주를 단리시키는 것에 관한 것이다. 아미노산 생산을 위한 미생물적 방법에서 사용된 미생물은 야생형 균주, 영양요구성 (auxotrophic) 돌연변이체, 조절성 (regulatory) 돌연변이체 및 영양요구성 조절성 돌연변이체의 4가지 클래스로 분류된다 (K. Nakayama et al ., in Nutritional Improvement of Food and Feed Proteins, M. Friedman, ed., (1978), pp. 649-661). 코리네박테리움의 돌연변이체 및 관련된 유기체는 값싼 탄소 공급원, 예를 들어, 당밀, 아세트산 및 에탄올로부터 직접 발효에 의해서 아미노산의 저렴한 생산을 가능하게 한다. 또한, 발효에 의해서 생산된 아미노산의 입체특이성 (L 이성체)은 이 방법을 합성방법에 비해서 유리하게 만든다.

라이신의 상업적 생산의 효율을 개선시키는 또 다른 방법은 라이신 생산과 펜토즈 포스페이트 경로를 통한 대사성 플럭스 (metabolic flux) 사이의 상관관계를 조사함에 의한 것이다. 발효방법에 의한 라이신 생산의 경제적 중요성을 가정하여, 표면적으로 생산된 라이신의 총량을 증가시키고, 생산비용을 감소시킬 목적으로 라이신 합성을 위한 생화학적 경로가 집중적으로 조사되었다 (Sahm et al ., (1996) Ann . N. Y. Acad . Sci . 782:25-39에서 검토됨). 글루코즈 유도된 탄소의 방향족 아미노산 형성쪽으로의 플럭스를 지시하는 대사성 엔지니어링을 사용하는데 약간의 성공이 있었다 (Flores, N. et al ., (1996) Nature Biotechnol . 14:620-623). 세포 흡수시에 글루코즈는 포스포에놀피루베이트를 소비함으로써 포스포릴화되며 (포스포트랜스퍼라제 시스템)(Malin & Bourd, (1991) Journal of Applied Bacteriology 71, 517-523), 그 다음에 글루코즈-6-포스페이트로서 세포에 이용될 수 있다. 슈크로즈는 포스포트랜스퍼라제 시스템 (Shio et al., (1990) Agricultural and Biological Chemistry 54, 1513-1519) 및 인버타제 반응 (Yamamoto et al., (1986) Journal of Fermentation Technology 64, 285-291)에 의해서 프럭토즈 및 글루코즈-6-포스페이트로 전환된다.

글루코즈 이화작용 중에, 효소 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제 (EC 1.1.14.9) 및 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제 (EC 5.3.1.9)는 기질 글루코즈-6-포스페이트에 대해서 경쟁적이다. 효소 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제는 엠덴-마이어호프-파르나스 경로 (Embden-Meyerhof-Parnas pathway)의 제 1 반응단계, 또는 해당작용, 즉 프럭토즈-6-포스페이트로의 전환을 촉진시킨다. 효소 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제는 펜토즈 포스페이트 사이클의 산화적 부분의 제 1 반응단계, 즉 6-포스포글루코노락톤으로의 전환을 촉진시킨다.

펜토즈 포스페이트 사이클의 산화적 부분에서, 글루코즈-6-포스페이트는 리불로즈-5-포스페이트로 전환됨으로써 NADPH 형태의 환원 등가물 (reduction equivalents)을 생성시킨다. 펜토즈 포스페이트 사이클이 더 진행함에 따라서 펜토즈 포스페이트, 헥소즈 포스페이트 및 트리오즈 포스페이트가 상호전환된다. 예를 들어, 5-포스포리보실-1-피로포스페이트와 같은 펜토즈 포스페이트가 예를 들어, 뉴클레오타이드 생합성에서 필요하다. 5-포스포리보실-1-피로포스페이트는 더구나 방향족 아미노산 및 아미노산 L-히스티딘의 전구체이다. NADPH는 다수의 동화적 생합성에서 환원 등가물로서 작용한다. 따라서, 옥살아세트산으로부터 하나의 라이신 분자를 생합성하기 위해서는 NADPH의 4개의 분자가 소모된다. 따라서, 옥살로아세테이트 (OAA) 쪽으로의 탄소 플럭스는 시스템 동요와 무관하게 일정하게 유지된다 (J. Vallino et al ., (1993) Biotechnol . Bioeng., 41, 633-646).

발명의 요약

본 발명은 적어도 부분적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)에서 펜토즈 포스페이트 경로의 주요 효소-코딩 유전자, 예를 들어, 락테이트 데하이드로게나제의 발견, 및 예를 들어, 락테이트 데하이드로게나제의 발현 또는 활성을 조절해제 (deregulation), 예를 들어, 감소시키는 것이 라이신 생산의 증가를 제공한다는 발견을 기초로 한다. 또한, 락테이트 데하이드로게나제 발현 또는 활성을 조절해제, 예를 들어, 감소시킴으로써 라이신의 생산 중에 탄소 수율을 증가시키는 것은 증가된 라이신 생산을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 한가지 구체예에서, 탄소 공급원은 프럭토즈 또는 슈크로즈이다. 따라서, 본 발명은 미생물, 예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰에 의한 라이신의 생산을 증가시키는 방법을 제공하며, 여기에서 프럭토즈 또는 슈크로즈가 기질이다.

따라서, 한가지 관점에서 본 발명은 펜토즈 포스페이트 경로를 통한 대사성 플럭스가 증가되도록 하는 조건 하에서 조절해제된 유전자를 포함하는 미생물을 배양하는 것을 포함하여, 미생물에서 펜토즈 포스페이트 경로를 통한 대사성 플럭스를 증가시키는 방법을 제공한다. 한가지 구체예에서, 미생물은 발효되어 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신을 제공한다. 또 다른 구체예에서는, 프럭토즈 또는 슈크로즈가 탄소 공급원으로 사용된다. 또 다른 구체예에서, 유전자는 락테이트 데하이드로게나제이다. 관련된 구체예에서, 락테이트 데하이드로게나제 유전자는 코리네박테리움, 예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유도된다. 또 다른 구체예에서, 락테이트 데하이드로게나제 유전자는 발현저하된다. 추가의 구체예에서, 락테이트 데하이드로게나제 유전자에 의해서 코딩된 단백질은 감소된 활성을 갖는다.

또 다른 구체예에서, 미생물은 하나 이상의 추가의 조절해제된 유전자를 더 포함한다. 하나 이상의 추가의 조절해제된 유전자에는 ask 유전자, dapA 유전자, asd 유전자, dapB 유전자, ddh 유전자, lysA 유전자, lysE 유전자, pycA 유전자, zwf 유전자, pepCL 유전자, gap 유전자, zwa1 유전자, tkt 유전자, tad 유전자, mqo 유전자, tpi 유전자, pgk 유전자, 및 sigC 유전자가 포함될 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. 특정한 구체예에서, 유전자는 과발현되거나 발현저하될 수 있다. 또한, 조절해제된 유전자는 피드-백 (feed-back) 저항성 아스파르토키나제, 디하이드로디피콜리네이트 신타제, 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제, 디아미노피멜레이트 데하이드로게나제, 디아미노피멜레이트 에피머라제, 라이신 엑스포터 (exporter), 피루베이트 카복실라제, 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제, RPF 단백질 전구체, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 메나퀴닌 옥시도리덕타제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 키나제, 및 RNA-폴리머라제 시그마 인자 sigC로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 코딩할 수 있다. 특정한 구체예에서, 단백질은 증가되거나 감소된 활성을 가질 수 있다.

본 발명의 방법에 따라, 하나 이상의 추가의 조절해제된 유전자는 또한, pepCK 유전자, malE 유전자, glgA 유전자, pgi 유전자, dead 유전자, menE 유전자, citE 유전자, mikE17 유전자, poxB 유전자, zwa2 유전자, 및 sucC 유전자를 포함할 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. 특정한 구체예에서는, 적어도 하나의 유전자의 발현이 상향조절되거나, 약화되거나, 감소되거나, 하향조절되거나, 억제된다. 또한, 조절해제된 유전자는 포스포에놀피루베이트 카복시키나제, 말릭 효소, 글리코젠 신타제, 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제, ATP 의존성 RNA 헬리카제, o-숙시닐벤조산-CoA 리가제, 시트레이트 리아제 베타 체인, 전사 조절자, 피루베이트 데하이드로게나제, RPF 단백질 전구체, 및 숙시닐-CoA-신테타제로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 코딩할 수 있다. 특정한 구체예에서, 단백질은 감소되거나 증가된 활성을 갖는다.

한가지 구체예에서, 본 발명의 방법에서 사용된 미생물은 코리네박테리움속, 예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰에 속한다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 락테이트 데하이드로게나제가 조절해제된 미생물을 발효시키고, 배지 내에 또는 미생물의 세포 내에 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신을 축적시킴으로써 정밀화학 약품을 생성시키는 것을 포함하여 정밀화학 약품을 생산하는 방법을 제공한다. 한가지 구체예에서, 이 방법은 정밀화학 약품을 회수하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 락테이트 데하이드로게나제 유전자는 발현저하된다. 또 다른 구체예에서는, 프럭토즈 또는 슈크로즈가 탄소 공급원으로 사용된다.

한가지 관점에서, 락테이트 데하이드로게나제는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유도되며, 서열 1의 뉴클레오타이드 서열 및 서열 2의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 그 밖의 다른 특징 및 이점은 이하의 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 명백해 질 것이다.

도 1은 펜토즈 포스페이트 생합성 경로의 개략도이다.

도 2는 글루코즈 및 프럭토즈 상에서의 라이신 생산 중에 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21526의 추적실험에서 GC/MS에 의해 측정된 분비된 라이신과 트레할로즈의 상대적 질량 이소토포머 분획 (relative mass isotopomer fractions)을 비교한 것이다.

도 3은 각각 GC/MS에 의한 분비된 라이신 및 트레할로즈의 라벨링 측정에 의한 ¹³C 추적실험을 위한 조합된 대사산물 균형화 (balancing) 및 이소토퍼머 모델링의 포괄적 접근방법을 사용한 실험적 결과에 대한 최적의 적합성으로부터 추정된, 글루코즈 상에서 라이신 생산 중의 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21526의 중추적 대사 (central metabolism) 시의 생체내 탄소 플러스 분포를 나타낸 것이다. 순수한 플럭스는 정사각형 심볼로 표시되며, 여기에서 가역적 반응의 경우에 순수한 플럭스의 방향은 상응하는 블랙 박스 (black box) 옆의 화살표로 나타낸다. 트 랜스알돌라제, 트랜스케톨라제 및 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제의 플럭스 아래의 괄호 안에 있는 숫자는 플럭스 가역성을 나타낸 것이다. 모든 플럭스는 평균 특이적 글루코즈 흡수율 (1.77 mmol g^-1h^-1)의 몰 백분율로 표현된다.

도 4는 각각 GC/MS에 의한 분비된 라이신 및 트레할로즈의 라벨링 측정에 의한 ¹³C 추적실험을 위한 조합된 대사산물 균형화 (balancing) 및 이소토퍼머 모델링의 포괄적 접근방법을 사용한 실험적 결과에 대한 최적의 적합성으로부터 추정된, 프럭토즈 상에서 라이신 생산 중의 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21526의 중추적 대사 시의 생체내 탄소 플러스 분포를 나타낸 것이다. 순수한 플럭스는 정사각형 심볼로 표시되며, 여기에서 가역적 반응의 경우에 순수한 플럭스의 방향은 상응하는 블랙 박스 (black box) 옆의 화살표로 나타낸다. 트랜스알돌라제, 트랜스케톨라제 및 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제의 플럭스 아래의 괄호 안에 있는 숫자는 플럭스 가역성을 나타낸 것이다. 모든 플럭스는 평균 특이적 프럭토즈 흡수율 (1.93 mmol g^-1h^-1)의 몰 백분율로 표현된다.

도 5는 수송 플럭스, 동화성 플럭스, 및 중간 대사산물 저장소 (pool) 사이의 플럭스를 포함한, 글루코즈-성장 (A) 및 프럭토즈-성장 (B) 라이신 생성 코리네박테리움 글루타미쿰에 대한 중추적 대사의 대사성 네트워크를 나타낸 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 적어도 부분적으로, 펜토즈 포스페이트 경로의 필수 효소를 코딩 하는 유전자, 예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰 유전자의 확인을 기초로 한다. 본 발명은 탄소 수율이 증가되고, 특정의 바람직한 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신이 생산되도록, 예를 들어, 증가된 수율로 생산되도록 미생물, 예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 펜토즈 포스페이트 생합성 경로를 조작하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다. 특히, 본 발명은 조절해제된, 예를 들어, 감소된 락테이트 데하이드로게나제 발현 또는 활성을 갖는 미생물, 예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰의 발효에 의해서 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신을 생산하는 방법을 포함한다. 한가지 구체예에서는, 미생물의 발효 시에 탄소 공급원으로서 프럭토즈 또는 사카로즈가 사용된다. 프럭토즈는 미생물로부터 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신의 생산을 위한 덜 효율적인 기질인 것으로 확립되어 있다. 그러나, 본 발명은 미생물, 예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰에 의한 라이신의 생산을 최적화하기 위한 방법을 제공하는데, 여기에서는 프럭토즈 또는 슈크로즈가 기질이다. 락테이트 데하이드로게나제 발현 또는 활성의 조절해제, 예를 들어, 감소는 펜토즈 포스페이트 경로를 통한 더 큰 플럭스를 유도함으로써 증가된 NADPH 생성 및 증가된 라이신 수율을 제공한다.

용어 "펜토즈 포스페이트 경로"는 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신의 형성 또는 합성에 이용된 포스페이트 효소 (예를 들어, 생합성 효소-코딩 유전자에 의해서 코딩된 폴리펩타이드), 화합물 (예를 들어, 전구체, 기질, 중간체 또는 생성물), 보조인자 (cofactor) 등을 수반하는 경로를 포함한다. 펜토즈 포스페이트 경로는 글루코즈 분자를 생화학적으로 유용한 더 작은 분자로 전환시킨다.

본 발명을 더 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해서, 여기에서는 특정의 용어들이 일차로 정의된다.

용어 "펜토즈 포스페이트 생합성 경로"는 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신의 형성 또는 합성에 이용된 펜토즈 포스페이트 생합성 유전자, 효소 (예를 들어, 생합성 효소-코딩 유전자에 의해서 코딩된 폴리펩타이드), 화합물 (예를 들어, 전구체, 기질, 중간체 또는 생성물), 보조인자 등을 수반하는 생합성 경로를 포함한다. 용어 "펜토즈 포스페이트 생합성 경로"는 미생물에서 (예를 들어, 생체내에서) 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신의 합성을 유도하는 생합성 경로, 및 시험관내에서 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신의 합성을 유도하는 생합성 경로를 포함한다.

용어 "펜토즈 포스페이트 생합성 경로 단백질" 또는 "펜토즈 포스페이트 생합성 경로 효소"는 펜토즈 포스페이트 생합성 경로에 직접적으로 또는 간접적으로 연관된 이들 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 효소 및 그의 단편, 예를 들어, 락테이트 데하이드로게나제 효소를 포함한다.

용어 "펜토즈 포스페이트 생합성 경로 유전자"는 펜토즈 포스페이트 생합성 경로에 직접적으로 또는 간접적으로 연관된 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 및 효소를 코딩하는 이들 유전자 및 유전자 단편, 예를 들어, 락테이트 데하이드로게나제 유전자를 포함한다.

용어 "아미노산 생합성 경로 유전자"는 아미노산의 합성에 직접적으로 연관된 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 및 효소, 예를 들어, 락테이트 데하이드로게나 제를 코딩하는 이들 유전자 및 유전자 단편을 포함하는 것을 의미한다. 이들 유전자는 숙주 세포 내에 천연적으로 존재하며, 그 숙주 세포 내에서 아미노산, 특히 라이신의 합성에 연관되는 것과 동일할 수 있다.

용어 "라이신 생합성 경로 유전자"는 라이신의 합성에 직접적으로 또는 간접적으로 연관된 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 및 효소, 예를 들어, 락테이트 데하이드로게나제를 코딩하는 이들 유전자 및 유전자 단편을 포함한다. 이들 유전자는 숙주 세포 내에 천연적으로 존재하며, 그 숙주 세포 내에서 라이신의 합성에 연관되는 것과 동일할 수 있다. 대신으로, 여기에는 이러한 유전자의 변형 또는 돌연변이가 있을 수 있으며, 예를 들어, 유전자는 코딩된 단백질의 생물학적 활성에 유의적으로 영향을 미치지 않는 변형 또는 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 천연 유전자는 돌연변이유발에 의해서, 또는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 도입시키거나 치환시킴으로써, 또는 유전자의 비필수적인 부위를 제거함으로써 변형될 수 있다. 이러한 변형은 표준 기술에 의해서 용이하게 수행된다.

용어 "라이신 생합성 경로 단백질"은 라이신의 합성에 직접적으로 연관된 이들 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 효소 및 그의 단편을 포함하는 것을 의미한다. 이들 단백질은 숙주 세포 내에 천연적으로 존재하며, 그 숙주 세포 내에서 라이신의 합성에 연관되는 것과 동일할 수 있다. 대신으로, 여기에는 이러한 단백질의 변형 또는 돌연변이가 있을 수 있으며, 예를 들어, 단백질은 단백질의 생물학적 활성에 유의적으로 영향을 미치지 않는 변형 또는 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 천연 단백질은 돌연변이유발에 의해서, 또는 하나 이상의 아미노산을 도 입시키거나 치환시킴으로써, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환에 의해서, 또는 단백질의 비필수적인 부위를 제거함으로써 변형될 수 있다. 이러한 변형은 표준 기술에 의해서 용이하게 수행된다. 대신으로, 라이신 생합성 단백질은 특정의 숙주 세포에 대해 이종일 수 있다. 이러한 단백질은 동일하거나 유사한 생합성적 역할을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 갖는 어떤 유기체로부터도 유도될 수 있다.

용어 "탄소 플럭스"는 경쟁적 경로에 비해서 특정의 대사성 경로를 아래로 진행시키는 글루코즈 분자의 수를 나타낸다. 특히, 미생물 내에서 증가된 NADPH는 그 유기체의 해당작용성 및 펜토즈 포스페이트 경로 사이에서 탄소 플럭스 분포를 변화시킴으로써 이루어진다.

"락테이트 데하이드로게나제 활성"은 표준 기술에 따라 시험관내 또는 생체내에서 측정된 것으로 락테이트 데하이드로게나제 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산 분자에 의해서 발휘된 활성을 포함한다. 락테이트 데하이드로게나제는 진핵 및 원핵 유기체에 존재한다. 바람직하게는, 락테이트 데하이드로게나제 활성은 피루베이트의 락테이트로의 가역적 NAD-의존성 상호전환의 촉매작용을 포함한다. 척추동물 근육 및 락트산 박테리아에서 이것은 동화성 해당작용의 최종 단계를 나타낸다.

용어 '정밀화학 약품'은 본 기술분야에서 인지되고 있는 것이며, 제약, 농업 및 화장품 산업과 같은 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 다양한 산업에서 적용성을 갖는 유기체에 의해서 생산된 분자를 포함한다. 이러한 화합물에는 타르타르산, 이타콘산 및 디아미노피멜산과 같은 유기산, 단백질성 및 비-단백질성 아미노산 모두, 퓨린 및 피리미딘 염기, 뉴클레오사이드, 및 뉴클레오타이드 (예를 들어, 문헌 (Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, p. 561-612, in Biotechnology vol. 6, Rehm et al ., eds. VCH: Weinheim) 및 여기에 포함된 문헌에 기술되어 있음), 리피드, 포화 및 불포화된 지방산 모두 (예를 들어, 아라키돈산), 디올 (예를 들어, 프로판디올 및 부탄디올), 카보하이드레이트 (예를 들어, 히알우론산 및 트레할로즈), 비타민 및 보조인자 [문헌 (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A27, "Vitamins", p. 443-613 (1996) VCH: Weinheim 및 여기에 언급된 문헌; 및 Ong, A.S., Niki, E. & Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health, and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and the Society for Free Radical Research - Asia, held Sept. 1-3, 1994 at Penang, Malaysia, AOCS Press (1995)]에 기술되어 있음], 효소, 폴리케타이드 (Cane et al., (1998) Science 282: 63-68), 및 문헌 (Gutcho (1983) Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 및 여기에 인용된 문헌)에 기술된 그 밖의 모든 화학약품이 포함된다. 이들 정밀화학 약품 중의 특정한 것의 대사 및 용도는 이하에 더 설명된다.

아미노산 대사 및 용도

아미노산은 모든 단백질의 기본적인 구조 단위를 포함하며, 그 자체로서 모든 유기체에서 정상적인 세포성 기능에 필수적이다. 용어 "아미노산"은 본 기술분야에서 인지된 것이다. 20 종의 단백질성 아미노산은 단백질을 위한 구조 단위로 서 제공되며, 여기에서 이들은 펩타이드 결합에 의해서 연결되는 반면에, 비단백질성 아미노산 (100여 개가 공지되어 있음)은 단백질에 통상적으로 존재하지 않는다 (참조: Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p. 57-97 VCH: Weinheim (1985)). 아미노산은 D- 또는 L-광학적 배열로 존재할 수 있지만, L-아미노산이 일반적으로 천연적으로 존재하는 단백질에서 발견되는 유일한 타입이다. 20개의 단백질성 아미노산 각각의 생합성 및 분해 경로는 원핵성 및 진핵성 세포 둘다에서 잘 특정화되어 있다 (참조예: Stryer, L. Biochemistry, 3^rd edition, pages 578-590 (1988)). 이들의 생합성의 복잡성으로 인하여 일반적으로 영양적 필요조건이기 때문에 이렇게 부르는 '필수' 아미노산 (히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 및 발린)은 간단한 생합성 경로에 의해서 나머지 11개의 '비필수' 아미노산 (알라닌, 아르지닌, 아스파라진, 아스파르테이트, 시스테인, 글루타메이트, 글루타민, 글리신, 프롤린, 세린 및 타이로신)으로 쉽게 전환된다. 더 고등 동물은 이들 아미노산의 몇가지를 합성하는 능력을 보유하지만, 정상적인 단백질 합성이 일어나도록 필수 아미노산은 식사를 통해서 공급되어야 한다.

단백질 생합성에서의 그들의 기능과는 별도로, 이들 아미노산은 당연히 흥미로운 화학물질이며, 대부분이 식품, 사료, 화학약품, 화장품, 농업 및 제약산업에서 다양한 적용성을 갖는 것으로 밝혀져 있다. 라이신은 인간의 영양뿐만 아니라 가금 및 돼지와 같은 단위동물의 영양에서 중요한 아미노산이다. 글루타메이트는 방향성 첨가제로서 가장 통상적으로 사용되며 (모노-나트륨 글루타메이트, MSG), 아스파르테이트, 페닐알라닌, 글리신 및 시스테인과 같이 식품 산업 전반에 걸쳐서 광범하게 사용된다. 글리신, L-메티오닌 및 트립토판은 모두 제약산업에서 이용된다. 글루타민, 발린, 류신, 이소류신, 히스티딘, 아르지닌, 프롤린, 세린 및 알라닌은 제약산업 및 화장품 산업 둘 다에서 유용하다. 트레오닌, 트립토판, 및 D/L-메티오닌은 통상적인 사료 첨가제이다 (Leuchtenberger, W. (1996) Amino aids - technical production and use, p. 466-502 in Rhem et al . (eds.) Biotechnology vol. 6, chapter 14a, VCH: Weinheim). 추가로, 이들 아미노산은 N-아세틸시스테인, S-카복시메틸-L-시스테인, (S)-5-하이드록시트립토판 및 그 밖에 문헌 (Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A2, p. 57-97 VCH: Weinheim (1985))에 기술된 것과 같은 합성 아미노산 및 단백질의 합성을 위한 전구체로서 유용한 것으로 확인되었다.

박테리아와 같이 이들 천연 아미노산을 생성할 수 있는 유기체에서 이들의 생합성은 잘 특정화되어 있다 (박테리아성 아미노산 생합성 및 그의 조절에 대한 검토: 참조 Umbarger, H.E. (1978) Ann . Rev . Biochem . 47: 533-606). 글루타메이트는 시트르산 사이클에서의 중간체인 α-케토글루타레이트의 환원적 아미노화 반응에 의해서 합성된다. 글루타민, 프로릴 및 아르기닌은 각각 글루타메이트로부터 순차적으로 생성된다. 세린의 생합성은 3-포스포글리세레이트 (해당반응에서의 중간체)로부터 시작하고, 산화, 트랜스아미노화 및 가수분해 단계 후에 이 아미노산을 생성하는 3-단계 방법이다. 시스테인과 글리신은 둘 다 세린으로부터 생성되 며; 시스테인은 호모시스테인과 세린의 축합반응에 의해서 생성되고, 글리신은 세린 트랜스하이드록시메틸라제에 의해서 촉진되는 반응에서 측쇄-β-탄소원자를 테트라하이드로폴레이트로 전이시킴으로써 생성된다. 페닐알라닌 및 타이로신은 프레페네이트의 합성 이후의 최종 2 단계에서만 상이한 9-단계 생합성 경로에서 해당반응성 및 펜토즈 포스페이트 경로 전구체인 에리트로즈 4-포스페이트 및 포스포에놀피루베이트로부터 합성된다. 트립토판은 또한 이들 두 개의 초기 분자로부터 생성되지만, 그의 합성은 11-단계 경로이다. 타이로신은 또한 페닐알라닌 하이드록실라제에 의해서 촉진되는 반응에서 페닐알라닌으로부터 합성될 수도 있다. 알라닌, 발린 및 류신은 모두 해당반응의 최종 생성물인 피루베이트의 생합성 생성물이다. 아스파르테이트는 시트르산 사이클의 중간체로서 옥살로아세테이트로부터 형성된다. 아스파라진, 메티오닌, 트레오닌 및 라이신은 각각 아스파르테이트의 전환반응에 의해서 생성된다. 이소류신은 트레오닌으로부터 형성된다. 복잡한 9-단계 경로는 히스티딘의 생성시에 활성화된 당인 5-포스포리보실-1-피로포스페이트로부터 생성된다.

세포에서 단백질 합성 필요량을 초과하는 아미노산은 저장될 수 없으며, 대신에 분해되어 세포의 주요 대사경로를 위한 중간체를 제공하게 된다 (참조: Stryer, L. Biochemistry 3^rd ed. Ch. 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle" p. 495-516 (1988)). 세포는 원치않는 아미노산을 유용한 대사 중간체로 전환시킬 수 있지만, 아미노산 생성은 에너지, 전구체 분자, 및 이들을 합성하는데 필요한 효소의 관점에서 비용이 많이 든다. 따라서, 아미노산 생합성이 특정한 아미노산의 전재가 그 자신의 생성을 느리게 하거나 완전히 중지시키는 작용을 하는 피드백 억제 (feedback inhibition)에 의해서 조절된다는 것을 놀라운 것이 아니다 (아미노산 생합성 경로에서의 피드백 기전에 대한 개관에 대한 참조: Stryer, L. Biochemistry 3^rd ed. Ch. 21 "Biosynthesis of Amino Acids and Heme" p. 575-600 (1988)). 따라서, 어떤 특정 아미노산의 생산이라도 세포 내에 존재하는 해당 아미노산의 양에 의해서 제한된다.

비타민, 보조인자 및 뉴트라슈티칼 ( neutraceutical ) 대사 및 용도

비타민, 보조인자 및 뉴트라슈티칼은 박테리아와 같은 다른 유기체에 의해서는 쉽게 합성되지만, 이들은 더 고등동물이 합성하는 능력을 상실하였으며, 따라서 반드시 섭취하여야 하는 또 다른 분자의 군이다. 이들 분자는 생물활성 물질 그 자체이거나, 다양한 대사경로에서 전자 캐리어 또는 중간체로 작용할 수 있는 생물학적 활성물질의 전구체이다. 그들의 영양적 가치는 차치하고, 이들 화합물은 또한 착색제, 산화방지제, 및 촉매 또는 그 밖의 가공보조제 (processing aids)로서 상당한 산업적 가치를 갖는다. (이들 화합물의 구조, 활성 및 산업적 용도에 관한 개관에 대한 참조예: Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins" vol. A27, p. 443-613, VCH: Weinheim, 1996). 용어 "비타민"은 본 기술분야에서 인지되고 있는 것이며, 정상적인 기능을 위해서 유기체가 필요로 하는 것이지만, 유기체가 그 자체로 합성할 수는 없는 영양소를 포함한다. 비타민의 군은 보조인자 및 뉴트라슈티칼 화합물을 포함할 수 있다. 용어 "보조인자"는 정상적인 효소적 활성이 나타나도록 하는데 필요한 비단백질성 화합물을 포함한다. 이러한 화합물은 유기 또는 무기물질일 수 있으며; 본 발명의 보조인자 분자는 바람직하게는 유기물질이다. 용어 "뉴트라슈티칼"은 식물 및 동물, 바람직하게는 인간에게서 건강적 이점을 갖는 식이성 첨가물을 포함한다. 이러한 분자의 예는 비타민, 산화방지제, 및 또한 특정의 리피드 (예를 들어, 다중불포화된 지방산)이다.

박테리아와 같이 이들 분자를 생산할 수 있는 유기체에서의 이들 분자의 생합성은 대부분 특정화되어 있다 (Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins" vol. A27, p. 443-613, VCH: Weinheim, 1996; Michael, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley& Sons; Ong, A.S., Niki, E. & Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health, and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and the Society for Free Radical Research - Asia, held Sept. 1-3, 1994 at Penang, Malaysia, AOCS Press: Champaign, IL X, 374 S).

티아민 (비타민 B₁)은 피리미딘 및 티아졸 부위의 화학적 커플링에 의해서 생산된다. 리보플라빈 (비타민 B₂)은 구아노신-5'-트리포스페이트 (GTP) 및 리보즈-5'-포스페이트로부터 합성된다. 리보플라빈은 다시 플라빈 모노뉴클레오타이드 (FMN) 및 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드 (FAD)의 합성을 위해서 이용된다. 총괄적으로 '비타민 B₆'로 불리는 화합물 (예를 들어, 피리독신, 피리독사민, 피리독사-5'-포스페이트, 및 시판품으로 사용되는 피리독신 하이드로클로라이드)의 군은 모두 공통적인 구조단위인 5-하이드록시-6-메틸피리딘의 유도체이다. 판토테네이트 (판토텐산, (R)-(+)-N-(2,4-디하이드록시-3,3-디메틸-1-옥소부틸)-β-알라닌)는 화학적 합성에 의해서, 또는 발효에 의해서 생산될 수 있다. 판토테네이트 생합성에서 최종 단계는 β-알라닌과 판토산의 ATP-구동된 축합반응으로 구성된다. 판토산으로, β-알라닌으로의 전환반응 및 판토텐산으로 축합반응을 책임지는 효소는 공지되어 있다. 판토테네이트의 대사적 활성형은 조효소 (Coenzyme) A이며, 이것에 대한 생합성은 5개의 효소적 단계로 진행한다. 판토테네이트, 피리독살-5'-포스페이트, 시스테인 및 ATP는 조효소 A의 전구체이다. 이들 효소는 판토탄테의 형성을 촉진시킬 뿐만 아니라, (R)-판토산, (R)-판토락톤, (R)-판테놀 (프로비타민 B₅), 판테테인 (및 그의 유도체) 및 조효소 A의 생산을 촉진시킨다.

미생물 내에서 전구체 분자인 피멜로일-CoA로부터의 비오틴 생합성이 상세히 연구되었으며, 수반된 유전자 중의 몇 가지가 확인되었다. 대부분의 상응하는 단백질은 또한, Fe-클러스터 (cluster) 합성에 수반되는 것으로 확인되었으며, 단백질의 nifS 군의 구성원이다. 리포산은 옥탄산으로부터 유도되며, 피루베이트 데하이드로게나제 컴플렉스 및 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 컴플렉스의 일부분이 되는, 에너지 대사에서 조효소로서 작용한다. 폴레이트는 모두, 또한 L-글루 탐산, p-아미노-벤조산 및 6-메틸프테린으로부터 유도되는 폴산의 유도체인 물질들의 군이다. 대사 중간체인 구아노신-5'-트리포스페이트 (GTP), L-글루탐산 및 p-아미노-벤조산으로부터 출발하는 폴산 및 그의 유도체의 생합성은 특정의 미생물에서 상세하게 연구되었다.

코리노이드 (예를 들어, 코발라민 및 특히 비타민 B₁₂) 및 포르피린은 테트라피롤 환 시스템을 특징으로 하는 화학물질의 군에 속한다. 비타민 B₁₂의 생합성은 완전하게 특정화되지 않고 충분히 복잡한 것이지만, 연관된 다수의 효소 및 물질은 현재 공지되어 있다.

니코틴산 (니코티네이트) 및 니코틴아미드는 또한 '나이아신'으로 불리는 피리딘 유도체이다. 나이아신은 중요한 조효소인 NAD (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드) 및 NADP (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 포스페이트) 및 이들의 환원된 형태의 전구체이다.

이들 화합물의 대규모 생산은 대부분 세포-부재 화학적 합성방법을 기초로 하지만, 리보플라빈, 비타민 B₆, 판토테네이트 및 비오틴과 같은 이들 화학물질 중의 일부는 미생물의 대규모 배양에 의해서도 생산되었다. 단지 비타민 B₁₂는 그의 합성의 복잡성으로 인하여 발효에 의해서만 생산된다. 시험관내 방법은 물질 및 시간의 상당한 투입 및 종종 많은 비용을 필요로 한다.

퓨린, 피리미딘, 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드 대사 및 용도

퓨린 및 피리미딘 대사 유전자 및 그들의 상응하는 단백질은 종양질환 및 바이러스 감염의 치료를 위한 중요한 표적이다. 용어 "퓨린" 또는 "피리미딘"은 핵산, 조효소 및 뉴클레오타이드의 구성성분인 질소성 염기를 포함한다. 용어 "뉴클레오타이드"는 질소성 염기, 펜토즈 당 (RNA의 경우에 당은 리보즈이고; DNA의 경우에 당은 D-데옥시리보즈이다) 및 인산으로 이루어지는 핵산 분자의 기본적 구조 단위를 포함한다. 용어 "뉴클레오사이드"는 뉴클레오타이드에 대한 전구체로 작용하지만, 뉴클레오타이드가 가지고 있는 인산 부위가 결여되어 있는 분자를 포함한다. 이들 분자의 생합성, 또는 핵산 분자를 형성하기 위한 이들의 동원 (mobilization)을 억제함으로써 RNA 및 DNA 합성을 억제할 수 있으며; 암세포에 대해서 표적화된 방식으로 그의 활성을 억제함으로써 종양세포가 분열하고 복제하는 능력을 억제할 수 있다. 추가로, 핵산 분자를 형성하지는 않지만, 에너지 저장소 (즉, AMP)로서, 또는 조효소 (즉, FAD 및 NAD)로서 작용하는 뉴클레오타이드도 있다.

몇가지 문헌에는 퓨린 및/또는 피리미딘 대사에 영향을 미침으로써 이들 의학적 적응증에 대한 이들 화학물질의 용도가 기술되었다 (예를 들어, Christopherson, R.I. 및 Lyons, S.D. (1990) "Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents." Med . Res . Reviews 10: 505-548). 퓨린 및 피리미딘 대사에 포함된 효소의 연구는 예를 들어, 면역억제제 또는 항-증식제로서 사용될 수 있는 새로운 약물의 개발에 집중되었다 (Smith, J.L., (1995) "Enzymes in nucleotide synthesis." Curr . Opin. Struct . Biol . 5: 752-757; (1995) Biochem Soc . Transact . 23: 877-902). 그러나, 퓨린 및 피리미딘 염기, 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 몇 가지 정밀화학 약품 (예를 들어, 티아민, S-아데노실-메티오닌, 폴레이트 또는 리포플라빈)의 생합성에 있어서의 중간체로서, 세포에 대한 에너지 캐리어로서 (예를 들어, ATP 또는 GTP), 및 통상적으로 향미 증진제로서 사용되는 화학물질 그 자체 (예를 들어, IMP 또는 GMP) 또는 몇 가지 의학적 용도 (참조예: Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology vol. 6, Rehm et al ., eds. VCH: Weinheim, p. 561-612)를 위한 그 밖의 다른 유용성을 갖는다. 또한, 퓨린, 피리미딘, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 대사에 연관된 효소는 살진균제, 제초제 및 살충제를 포함하는 농작물 보호용 화학약품을 개발하기 위한 표적으로서의 작용이 증가하고 있다.

박테리아에서 이들 화합물의 대사는 특정화되어 있다 (참조예: Zalkin, H. 및 Dioxon, J.E. (1992) "de novo purine nucleotide biosynthesis", in: Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, vol. 42, Academic Press, p. 259-287; 및 Michael, G. (1999) "Nucleotides and Nucleosides", Chapter 8 in: Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley: New York). 퓨린 대사는 집중적인 연구의 대상이 되었으며, 세포의 정상적인 기능에 필수적이다. 고등동물에서 손상된 퓨린 대사는 통풍과 같은 심각한 질병의 원인이 될 수 있다. 퓨린 뉴클레오타이드는 리보즈-5-포스페이트로부터 출발하여 중간체 화합물인 이노신-5'-포스페이트 (IMP)를 통해서 구아노신-5'-모노포스페이트 (GMP) 또는 아데노신-5'-모노포스페이트 (AMP) (이들로부터 뉴클레오타이드로서 이용되는 트리포스페이트 형태가 쉽게 형성된다)의 생성을 유도하는 일련의 단계들에서 합성된다. 이들 화합물은 또한, 이들의 분해가 세포 내에서 다수의 상이한 생화학적 방법을 위한 에너지를 제공하기 때문에 에너지 저장소로서 이용된다. 피리미딘 생합성은 리보즈-5-포스페이트로부터 유리딘-5'-모노포스페이트 (UMP)의 형성에 의해서 진행된다. UMP는 다시 사이티딘-5'-트리포스페이트 (CTP)로 전환된다. 이들 모든 뉴클레오타이드의 데옥시- 형태는 뉴클레오타이드의 디포스페이트 리보즈 형태로부터 뉴클레오타이드의 디포스페이트 데옥시리보즈 형태로의 일단계 환원반응에서 생성된다. 포스포릴화하면, 이들 분자는 DNA 합성에 참여할 수 있다.

트레할로즈 대사 및 용도

트레할로즈는 α,α-1,1 결합으로 결합된 두개의 글루코즈 분자로 구성된다. 이것은 통상적으로 식품산업에서 감미제, 건조 또는 동결된 식품을 위한 첨가제로서, 및 음료에서 사용된다. 그러나, 이것은 또한 약제, 화장품 및 생명공학 산업에서 용도를 갖는다 (참조예: Nishimoto et al., (1998) 미국 특허 제 5,759,610 호; Singer, M.A. 및 Lindquist, S. (1998) Trends Biotech . 16: 460-467; Paiva, C.L.A. 및 Panek, A.D. (1996) Biotech . Ann . Rev . 2: 293-314; 및 Shiosaka, M. (1997) J. Japan 172: 97-102). 트레할로즈는 다수의 미생물로부터 효소에 의해서 생산되며, 천연적으로 주변 매질 내로 방출되고, 이것으로부터 본 기술분야에서 공지된 방법을 사용하여 수집될 수 있다.

I. 재조합 미생물 및 정밀화학 약품을 생산하도록 미생물을 배양하는 방법

본 발명의 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같고/같거나 목적하는 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신의 생산을 유도하는 방식으로 배양된, 바람직하게는 벡터 또는 유전자 (예를 들어, 야생형 및/또는 돌연변이된 유전자)를 포함한 미생물, 예를 들어, 재조합 미생물을 특징으로 한다. 용어 "재조합" 미생물은 이것이, 이것을 유도하는 천연적으로 존재하는 미생물에 비해서 변화되거나, 변형되거나 상이한 유전자형 및/또는 표현형 (예를 들어, 유전자 변형이 미생물의 핵산 서열 코딩에 영향을 미치는 경우)을 나타내도록 유전적으로 변화되거나, 변형되거나 조작된 (예를 들어, 유전적으로 조작된) 미생물 (예를 들어, 박테리아, 효모세포, 진균세포 등)을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 "재조합" 미생물은 본 명세서에 기술된 바와 같은 재조합 벡터 내에 포함된 본 명세서에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 박테리아 유전자 또는 유전자 생성물, 바람직하게는 생합성 효소 코딩 유전자, 예를 들어, 락테이트 데하이드로게나제, 및/또는 생합성 효소, 예를 들어, 재조합 벡터로부터 발현된 락테이트 데하이드로게나제를 저발현 (underexpress)하도록 유전적으로 조작된다. 통상적으로 숙련된 전문가는 유전자 생성물을 발현 또는 덜 발현하는 미생물은 핵산 서열 및/또는 유전자 생성물을 코딩하는 유전자의 저발현의 결과로 유전자 생성물을 생산하거나 저생산한다는 것을 인식할 것이다. 한가지 구체예에서, 재조합 미생물은 감소된 생합성 효소 활성, 예를 들어, 락테이트 데하이드로게나제 활성을 갖는다.

본 발명의 특정한 구체예에서는, 락테이트 데하이드로게나제 유전자 또는 효소 이외에 적어도 하나의 유전자 또는 단백질이 L-아미노산의 생산을 증진시키도록 조절해제될 수 있다. 생합성 경로, 예를 들어, 해당반응, 보전 (anaplerosis), 시트르산 사이클, 펜토즈 포스페이트 사이클, 또는 아미노산 전파의 유전자 또는 효소가 조절해제될 수 있다. 추가로, 조절 유전자 또는 단백질이 조절해제될 수 있다.

다양한 구체예에서, 유전자의 발현은 유전자에 의해서 코딩된 단백질의 세포내 활성 또는 농도를 증가시키도록 증가될 수 있으며, 이렇게 함으로써 궁극적으로는 원하는 아미노산의 생산을 개선시킬 수 있다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 원하는 결과를 수득하기 위하여 다양한 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, 숙련된 전문가는 유전자 또는 유전자들의 카피 (copy)의 수를 증가시키고, 프로모터를 사용하고/거나, 높은 활성을 갖는 상응하는 유전자에 대해 코딩하는 유전자 또는 대립유전자를 이용할 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여, 예를 들어, 특정의 유전자를 과발현시킴으로써 상응하는 단백질의 활성 또는 농도는 출발 활성 또는 농도를 기준으로 하여 적어도 약 10％, 25％, 50％, 75％, 100％, 150％, 200％, 300％, 400％, 500％, 1000％ 또는 2000％까지 증가될 수 있다.

다양한 구체예에서, 조절해제된 유전자에는 이하의 유전자 또는 단백질 중의 적어도 하나가 포함될 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다:

● 피드-백 내성 아스파르토키나제를 코딩하는 ask 유전자 (국제공개 제 WO2004069996 호에 기술된 바와 같음);

● 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 코딩하는 dapA 유전자 (국제공개 제 WO200100843 호에서 각각 서열 55 및 56으로 기술된 바와 같음);

● 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제를 코딩하는 asd 유전자 (유럽공개 제 1108790 호에서 각각 서열 3435 및 6935로 기술된 바와 같음);

● 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제를 코딩하는 dapB 유전자 (국제공개 제 WO200100843 호에서 각각 서열 35 및 36으로 기술된 바와 같음);

● 디아미노피멜레이트 데하이드로게나제를 코딩하는 ddh 유전자 (유럽공개 제 1108790 호에서 각각 서열 3444 및 6944로 기술된 바와 같음);

● 디아미노피멜레이트 에피머라제를 코딩하는 lysA 유전자 (유럽공개 제 1108790 호에서 각각 서열 3451 및 6951로 기술된 바와 같음);

● 라이신 익스포터 (exporter)를 코딩하는 lysE 유전자 (유럽공개 제 1108790 호에서 각각 서열 3455 및 6955로 기술된 바와 같음);

● 피루베이트 카복실라제를 코딩하는 pycA 유전자 (유럽공개 제 1108790 호에서 각각 서열 765 및 4265로 기술된 바와 같음);

● 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제를 코딩하는 zwf 유전자 (국제공개 제 WO200100844 호에서 각각 서열 243 및 244로 기술된 바와 같음);

● 포스포에놀피루베이트 카복실라제를 코딩하는 pepCL 유전자 (유럽공개 제 1108790 호에서 각각 서열 3470 및 6970으로 기술된 바와 같음);

● 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제를 코딩하는 gap 유전자 (국제공개 제 WO200100844 호에서 각각 서열 67 및 68로 기술된 바와 같음);

● RPF 단백질 전구체를 코딩하는 zwa1 유전자 (유럽공개 제 1108790 호에서 각각 서열 917 및 4417로 기술된 바와 같음);

● 트랜스케톨라제를 코딩하는 tkt 유전자 (국제공개 제 WO200100844 호에서 각각 서열 247 및 248로 기술된 바와 같음);

● 트랜스알돌라제를 코딩하는 tad 유전자 (국제공개 제 WO200100844 호에서 각각 서열 245 및 246으로 기술된 바와 같음);

● 메나퀴닌 옥시도리덕타제를 코딩하는 mqo 유전자 (국제공개 제 WO200100844 호에서 각각 서열 569 및 570으로 기술된 바와 같음);

● 트리오세포스페이트 이소머라제를 코딩하는 tpi 유전자 (국제공개 제 WO200100844 호에서 각각 서열 61 및 62로 기술된 바와 같음);

● 3-포스포글리세레이트 키나제를 코딩하는 pgk 유전자 (국제공개 제 WO200100844 호에서 각각 서열 69 및 70으로 기술된 바와 같음); 및

● RNA-폴리머라제 인자 sigC를 코딩하는 sigC 유전자 (유럽공개 제 1108790 호에서 각각 서열 284 및 3784로 기술된 바와 같음).

특정한 구체예에서, 유전자는 과발현될 수 있고/있거나, 단백질의 활성이 증가될 수 있다.

대신으로, 또 다른 구체예에서 유전자의 발현은 유전자에 의해서 코딩된 단백질의 세포내 활성 또는 농도를 감소, 예를 들어, 배제시키기 위하여 약화되거나, 감소되거나, 억제될 수 있으며, 이렇게 함으로써 궁극적으로 원하는 아미노산의 생산을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 약한 프로 모터를 사용할 수 있다. 대신으로, 또한 조합하여, 숙련된 전문가는 낮은 활성을 갖는 상응하는 효소에 대해서 코딩하거나, 상응하는 유전자 또는 효소를 불활성화시키는 유전자 또는 대립유전자를 사용할 수도 있다. 본 발명의 방법을 사용하여, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도는 야생형 단백질의 활성 또는 농도의 약 0 내지 50％, 0 내지 25％, 0 내지 10％, 0 내지 9％, 0 내지 8％, 0 내지 7％, 0 내지 6％, 0 내지 5％, 0 내지 4％, 0 내지 3％, 0 내지 2％ 또는 0 내지 1％로 감소될 수 있다.

특정의 구체예에서, 조절해제된 유전자에는 이하의 유전자 또는 단백질 중의 적어도 하나가 포함될 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다:

● 포스포에놀피루베이트 카복시키나제를 코딩하는 pepCK 유전자 (국제공개 제 WO200100844 호에서 각각 서열 179 및 180으로 기술된 바와 같음);

● 말릭 효소를 코딩하는 mal E 유전자 (유럽공개 제 1108790 호에서 각각 서열 3328 및 6828로 기술된 바와 같음);

● 글리코겐 신타제를 코딩하는 glgA 유전자 (유럽공개 제 1108790 호에서 각각 서열 1239 및 4739로 기술된 바와 같음);

● 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제를 코딩하는 pgi 유전자 (국제공개 제 WO200100844 호에서 각각 서열 41 및 42로 기술된 바와 같음);

● ATP 의존성 RNA 헬리카제를 코딩하는 ded 유전자 (유럽공개 제 1108790 호에서 각각 서열 1278 및 4778로 기술된 바와 같음);

● o-숙시닐벤조산-CoA 리가제를 코딩하는 menE 유전자 (유럽공개 제 1108790 호에서 각각 서열 505 및 4005로 기술된 바와 같음);

● 시트레이트 라이아제 베타 쇄 (chain)를 코딩하는 citE 유전자 (국제공개 제 WO200100844 호에서 각각 서열 547 및 548로 기술된 바와 같음);

● 전사 조절자를 코딩하는 mikE17 유전자 (유럽공개 제 1108790 호에서 각각 서열 411 및 3911로 기술된 바와 같음);

● 피루베이트 데하이드로게나제를 코딩하는 poxB 유전자 (국제공개 제 WO200100844 호에서 각각 서열 85 및 86으로 기술된 바와 같음);

● RPF 단백질 전구체를 코딩하는 zwa2 유전자 (유럽공개 제 1106693 호에 기술된 바와 같음); 및

● 숙시닐-CoA-신테타제를 코딩하는 sucC 유전자 (유럽공개 제 1103611 호에 기술된 바와 같음).

특정한 구체예에서, 유전자의 발현은 약화되거나, 감소되거나 억제될 수 있고/있거나, 단백질의 활성이 감소될 수 있다.

용어 "처리된 (manipulated) 미생물"은 탄소의 대사에서 변화를 야기하도록 대사성 경로의 붕괴 또는 변화를 제공하도록 조작 (예를 들어, 유전적으로 조작)되거나, 변형된 미생물을 포함한다. 효소가, 이것이 발현이 전혀 없는 상황을 포함하는 (단, 이것으로 제한되지는 않는다) 비교가능한 야생형 세포에서 발현된 수준보다 더 낮은 수준으로 대사적으로 조작된 세포에서 발현되는 경우에, 효소는 대사적으로 조작된 세포에서 "저발현"된다. 유전자의 저발현은 유전자에 의해서 코딩된 단백질, 예를 들어, 락테이트 데하이드로게나제의 감소된 활성을 유도할 수 있 다.

이러한 미생물의 변형 또는 조작은 생합성 경로의 조절해제 및/또는 적어도 하나의 생합성 효소의 저발현을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다), 본 명세서에 기술된 어떤 방법에 따라서라도 이루어질 수 있다. "처리된" 효소 (예를 들어, "처리된" 생합성 효소)에는 그의 발현 또는 생산이 효소의 적어도 하나의 상류 또는 하류 전구체, 기질 또는 생성물이 변화되거나 변형되도록, 예를 들어, 상응하는 야생형 또는 천연적으로 존재하는 효소에 비해서 감소된 활성을 갖도록 변화되거나 변형된 효소가 포함된다.

용어 "저발현된" 또는 "저발현"은 미생물의 처리 전에, 또는 처리되지 않은 비교가능한 미생물에서 발현된 것보다 더 낮은 수준으로 유전자 생성물 (예를 들어, 펜토즈 포스페이트 생합성 효소)이 발현되는 것을 포함한다. 한가지 구체예에서, 미생물은 미생물의 조작 전에 또는 처리되지 않은 비교가능한 미생물에서 발현된 수준보다 더 작은 수준으로 유전자 생성물이 발현하도록 유전적으로 처리 (예를 들어, 유전적으로 조작)될 수 있다. 유전적 처리는 표적 유전자의 발현과 연관된 조절 서열 또는 부위를 변화 또는 변형시키거나 (예를 들어, 강력한 프로모터, 유도가능한 프로모터 또는 다수의 프로모터를 제거함으로써), 특정한 유전자의 염색체 위치를 변형시키거나, 리보좀 결합부위 또는 전사 종결자 (terminator)와 같이 특정 유전자에 인접한 핵산 서열을 변화시키거나, 특정 유전자의 카피수를 감소시키거나, 특정 유전자의 전사 및/또는 특정한 유전자 생성물의 해독에 연루된 단백질 (예를 들어, 조절 단백질, 억제자, 인핸서, 전사 활성자 등)을 변형시키거나, 본 기술분야에서 일상적인 특정 유전자의 발현을 조절해제하는 그 밖의 다른 통상적인 수단을 사용 (안티센스 핵산 분자의 사용, 또는 표적 단백질의 발현을 녹-아웃 또는 차단하는 그 밖의 다른 방법을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다)하는 것을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.

또 다른 구체예에서, 미생물은 미생물을 처리하기 전에 또는 처리되지 않은 비교가능한 미생물에서 발현된 것보다 더 낮은 수준의 유전자 생성물을 발현하도록 물리적으로 또는 환경적으로 처리될 수 있다. 예를 들어, 미생물은 전사 및/또는 해독이 감소되도록 특정 유전자의 전사 및/또는 특정 유전자 생성물의 해독을 감소시키는 것으로 공지되었거나 예상되는 약제로 처리되거나, 그러한 약제의 존재하에서 배양될 수 있다. 대신으로, 미생물은 전사 및/또는 해독이 감소되도록 특정 유전자 및/또는 특정 유전자 생성물의 해독을 감소시키는 것으로 선택된 온도에서 배양될 수 있다.

용어 "조절해제된" 또는 "조절해제"는 미생물 내에서 생합성 효소의 수준 또는 활성이 변화되거나 변형되도록, 생합성 경로 내의 효소를 코딩하는 미생물 내의 적어도 하나의 유전자를 변화 또는 변형시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 생합성 경로 내의 효소를 코딩하는 적어도 하나의 유전자는 유전자 생성물이 감소되도록 변화 또는 변형시킴으로써 유전자 생성물의 활성을 감소시킨다. 문구 "조절해제된 경로"는 또한, 생합성 경로 내의 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자가 하나 이상의 생합성 효소의 수준 또는 활성이 변화 또는 변형되도록 변화 또는 변형된 생합성 경로를 포함할 수 있다. 미생물에서 경로를 "조절해제"하는 (예를 들 어, 소정의 생합성 경로에서 하나 이상의 유전자를 동시에 조절해제하는) 능력은 하나 이상의 효소 (예를 들어, 두개 또는 세개의 생합성 효소)가 "오페론 (operon)"이라 불리는 유전적 물질의 근접한 피스 (contiguous piece) 상에서 서로에 대해 인접하여 나타나는 유전자에 의해서 코딩되는 미생물의 특정한 현상으로부터 야기된다.

용어 "오페론"은 프로모터 및 가능하게는 하나 이상, 바람직하게는 적어도 두개의 구조 유전자 (예를 들어, 효소, 예를 들어, 생합성 효소를 코딩하는 유전자)와 연관된 조절요소를 함유하는, 유전자 발현의 공조된 단위 (coordinated unit)를 포함한다. 구조 유전자의 발현은 예를 들어, 조절요소에 결합한 조절 단백질에 의해, 또는 전사의 종결-억제 (anti-termination)에 의해 동등하게 조절될 수 있다. 구조 유전자는 전사되어 모든 구조 단백질을 코딩하는 단일 mRNA를 제공할 수 있다. 오페론 내에 포함된 유전자의 공조된 조절에 기인하여, 단일 프로모터 및/또는 조절요소의 변화 또는 변형은 오페론에 의해서 코딩된 각각의 유전자 생성물의 변화 또는 변형을 야기할 수 있다. 조절요소의 변화 또는 변형은 내인성 프로모터 및.또는 조절요소(들)의 제거, 유전자 생성물이 변형되도록 하는 강력한 프로모터, 유도가능한 프로모터 또는 다수의 프로모터의 첨가 또는 조절서열의 제거, 오페론의 염색체 위치의 변형, 리보좀 결합부위와 같은 오페론에 인접하거나 오페란 내에 있는 핵산 서열의 변화, 오페론의 카피수의 감소, 오페론의 전사 및/또는 오페론의 유전자 생성물의 해독에 연루된 단백질 (예를 들어, 조절 단백질, 억제자, 인핸서, 전사 활성자 등)의 변형, 또는 본 기술분야에서 일상적인 유전자 의 발현을 조절해제하는 그 밖의 다른 통상적인 수단 (예를 들어, 억제자 단백질의 발현을 차단하기 위한 안티센스 핵산 분자의 사용을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다)하는 것을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 조절해제는 또한 하나 이상의 유전자의 코딩 부위를 변화시켜 예를 들어, 피드백 내성이거나, 더 크거나 작은 특이활성 (specific activity)을 갖는 효소를 수득하는 것을 포함할 수도 있다.

본 발명의 특히 바람직한 "재조합" 미생물은 박테리아-유도된 유전자 또는 유전자 생성물을 저발현하도록 유전적으로 조작된다. 용어 "박테리아-유도된" 또는, 예를 들어, 박테리아"로부터 유도된"은 박테리아에서 천연적으로 발견되는 유전자 또는 박테리아 유전자에 의해서 코딩된 (예를 들어, 락테이트 데하이드로게나제에 의해서 코딩된) 유전자 생성물을 포함한다.

본 발명의 방법은 하나 이상의 유전자, 예를 들어, 락테이트 데하이드로게나제 유전자를 저발현하거나, 락테이트 데하이드로게나제 활성이 감소한 재조합 미생물을 특징으로 한다. 본 발명의 특히 바람직한 재조합 미생물 (예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 (acetoglutamicum), 코리네박테리움 아세토애시도필룸 (acetoacidophilum) 및 코리네박테리움 터모아미노제네스 (thermoaminogenes) 등)은 생합성 효소 (예를 들어, 락테이트 데하이드로게나제, 서열 2의 또는 서열 1의 핵산 서열에 의해서 코딩된 아미노산 서열)를 저발현하도록 유전적으로 조작되었다.

본 발명의 그 밖의 다른 바람직한 "재조합" 미생물은 펜토즈 포스페이트 경 로에서 조절해제된 효소를 갖는다. 문구 "조절해제된 펜토즈 포스페이트 경로를 갖는 미생물"은 펜토즈 포스페이트 경로의 효소를 코딩하는 적어도 하나의 유전자에서 변화 또는 변형을 갖거나, 펜토즈 포스페이트 경로의 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 오페론에서 변화 또는 변형을 갖는 미생물을 포함한다. 바람직한 "조절해제된 펜토즈 포스페이트 경로를 갖는 미생물"은 코리네박테리움 (예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰) 생합성 효소를 저발현하도록 유전적으로 조작되었다 (예를 들어, 락테이트 데하이드로게나제를 저발현하도록 조작되었다).

또 다른 바람직한 구체예에서, 재조합 미생물은 하나 이상의 펜토즈 포스페이트 생합성 효소가 저발현되거나 조절해제되도록 디자인되거나 조작된다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 박테리아-유도된 유전자 또는 생합성 효소 (예를 들어, 펜토즈 포스페이트 생합성 효소)를 저발현하거나, 이들에 대해서 돌연변이된다. 용어 "박테리아-유도된" 또는, 예를 들어, 박테리아"로부터 유도된-형태"는 박테리아 유전자에 의해서 코딩된 유전자 생성물 (예를 들어, 락테이트 데하이드로게나제)을 포함한다.

한가지 구체예에서, 본 발명의 재조합 미생물은 그람 양성 미생물 (예를 들어, 미생물을 둘러싸는 그람-양성 벽의 존재로 인하여 염기성 염료, 예를 들어, 크리스탈 바이올렛 (crystal violet)를 보유하는 미생물)이다. 바람직한 구체예에서, 재조합 미생물은 바실루스, 브레비박테리움, 코리네박테리움, 락토바실루스 (Lactobacillus), 락토코사이 (Lactococci) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)로 구성된 군으로부터 선택된 속에 속하는 미생물이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 재조합 미생물은 코리네박테리움 속의 미생물이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 재조합 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰, 코리네박테리움 아세토애시도필룸 또는 코리네박테리움 터모아미노제네스로 구성된 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 구체예에서, 재조합 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰이다.

본 발명의 중요한 관점은 목적하는 화합물 (예를 들어, 목적하는 정밀화학 약품)이 생산되도록 본 명세서에 기술된 재조합 미생물을 배양하는 것을 포함한다. 용어 "배양"은 본 발명의 생존 미생물을 유지시키고/시키거나 성장시키는 (예를 들어, 배양물 또는 균주를 유지시키고/시키거나 성장시키는) 것을 포함한다. 한가지 구체예에서, 본 발명의 미생물은 액체배지 중에서 배양된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 미생물은 고체배지 또는 반고체배지에서 배양된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 미생물은 미생물의 유지 및/또는 성장에 필수적이거나 유익한 영양소를 포함하는 배지 (예를 들어, 멸균, 액체배지)에서 배양된다. 사용될 수 있는 탄소 공급원에는 예를 들어, 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 프럭토즈, 말토즈, 당밀, 전분 및 셀룰로즈와 같은 당 및 카보하이드레이트, 예를 들어, 대두유, 해바라기유, 낙화생유 및 야자유와 같은 오일 및 지방, 예를 들어, 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산과 같은 지방산, 예를 들어, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알콜, 및 예를 들어, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 바람직한 구체예에서는 프럭토즈 또는 슈크로즈가 탄소 공급원으로 사용된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로 사용될 수 있다.

사용될 수 있는 질소 공급원에는 펩톤, 효모 추출물, 미트 (meat) 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두 분말 및 우레아와 같은 유기화합물, 또는 암모늄 설페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 포스페이트, 암모늄 카보네이트 및 암모늄 니트레이트와 같은 무기화합물이 포함된다. 질소 공급원은 개별적으로 또는 혼합물로 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 인 공급원은 인산, 칼륨 디하이드로젠 포스페이트 또는 디칼륨 하이드로젠 포스페이트, 또는 나트륨을 함유하는 상응하는 염이다. 배양 배지는 예를 들어, 성장을 위해서 필요한 마그네슘 설페이트 또는 철 설페이트와 같은 금속염을 더 함유하여야 한다. 마지막으로, 아미노산 및 비타민과 같은 필수적인 성장-촉진물질도 또한, 상기 언급된 물질에 더하여 사용될 수 있다. 적합한 전구체가 배양 배지에 더 첨가될 수도 있다. 언급된 공급물질은 단일 배취로서 배지에 첨가될 수 있거나, 배양 중에 적절하게 공급될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 미생물은 조절된 pH 하에서 배양된다. 용어 "조절된 pH"는 목적하는 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신의 생산을 제공하는 모든 pH를 포함한다. 한가지 구체예에서, 미생물은 약 7의 pH에서 배양된다. 또 다른 구체예에서, 미생물은 6.0 내지 8.5의 pH에서 배양된다. 목적하는 pH는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 어떤 수의 방법에 의해서도 유지될 수 있다. 예를 들어, 나트륨 하이드록사이드, 칼륨 하이드록사이드, 암모니아 또는 암모니아수와 같은 염기성 화합물, 또는 인산 또는 황산과 같은 산성 화합물을 사용하여 배양물의 pH를 적절하게 조절한다.

또한 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 조절된 통기 하에서 배양된다. 용 어 "조절된 통기"는 목적하는 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신의 생산을 야기하는데 충분한 통기 (예를 들어, 산소)를 포함한다. 한가지 구체예에서, 통기는 예를 들어, 배양 배지 내에 용해된 산소의 양을 조절함으로써, 배양물에서 산소 수준을 조절함으로써 조절된다. 바람직하게는, 배양액의 통기는 배양물을 교반함으로써 조절된다. 교반은 프로펠러 또는 유사한 기계적 교반장치에 의해서, 또는 성장용기 (예를 들어, 발효기)를 회전 또는 진탕시킴으로써, 또는 다양한 펌프장치에 의해서 제공될 수 있다. 통기는 배지를 통해서 (예를 들어, 발효 혼합물을 통해서) 멸균 공기 또는 산소를 통과시킴으로써 더 조절될 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 과도한 발포가 없이 배양된다 (예를 들어, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 첨가함으로써).

또한, 본 발명의 미생물은 조절된 온도에서 배양될 수 있다. 용어 "조절된 온도"는 목적하는 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신의 생산을 야기하는 어떠한 온도라도 포함한다. 한가지 구체예에서, 조절된 온도는 15℃ 내지 95℃ 사이의 온도를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 조절된 온도는 15℃ 내지 70℃ 사이의 온도를 포함한다. 바람직한 온도는 20℃ 내지 55℃, 더욱 바람직하게는 30℃ 내지 45℃, 또는 30℃ 내지 50℃ 사이이다.

미생물은 액체 배지 중에서 배양 (예를 들어, 유지 및/또는 성장)될 수 있으며, 바람직하게는 정치 배양 (standing culture), 시험관 배양, 진탕 배양 (예를 들어, 회전 진탕 배양, 진탕 플라스크 배양 등), 통기 스피너 (spinner) 배양, 또는 발효와 같은 통상적인 배양방법에 의해서 연속적으로 또는 간헐적으로 배양된 다. 바람직한 구체예에서, 미생물은 진탕 플라스크 내에서 배양된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 미생물은 발효기에서 배양된다 (예를 들어, 발효방법). 본 발명의 발효방법에는 발효의 배취식 (batch), 유가식 (fed-batch) 및 연속식 방법이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 문구 "배취식 방법" 또는 "배취식 발효"는 배지, 영양소, 보충 첨가제 등의 조성이 발효의 처음부터 설정되어 발효 중에 변화되지 않지만, 과잉의 배지 산성화 및/또는 미생물 사멸을 방지하기 위하여 pH 및 산소 농도와 같은 인자들을 조절하는 시도는 이루어질 수 있는 밀폐된 시스템을 의미한다. 문구 "유가식 방법" 또는 "유가식 발효"는 발효가 진행함에 따라서 하나 이상의 물질 또는 첨가물이 첨가되는 (예를 들어, 증량식 또는 연속식으로 첨가되는) 것을 제외하고는 배취식 발효를 나타낸다. 문구 "연속식 방법" 또는 "연속식 발효"는 규정된 발효 배지를 연속적으로 발효기에 첨가하고, 바람직하게는 목적하는 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신을 회수하기 위하여 동시에 동량의 사용되거나 "조건화된 (conditioned)" 배지를 첨가하는 시스템을 나타낸다. 다양한 이러한 방법들이 개발되었으며, 본 기술분야에서 잘 알려져 있다.

문구 "목적하는 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신이 생산되도록 하는 조건 하에서 배양"은 목적하는 정밀화학 약품의 생성을 수득하거나, 생성되는 특정한 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신의 목적하는 수율을 수득하도록 하는데 적절하거나 충분한 조건 (예를 들어, 온도, 압력, pH, 지속시간 등) 하에서 미생물을 유지 및/또는 성장시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 배양은 원하는 양의 정밀화학 약품 (예를 들어, 라이신)을 생성하기에 충분한 시간 동안 계속된다. 바람직하게는, 배 양은 정밀화학 약품의 최대 생산에 실질적으로 도달하도록 하는데 충분한 시간 동안 계속된다. 한가지 구체예에서, 배양은 약 12 내지 24 시간 동안 계속된다. 또 다른 구체예에서, 배양은 약 24 내지 36 시간, 36 내지 48 시간, 48 내지 72 시간, 72 내지 96 시간, 96 내지 120 시간, 120 내지 144 시간, 또는 144 시간 이상 동안 계속된다. 또 다른 구체예에서, 배양은 정밀화학 약품의 생산수율에 도달하도록 하는데 충분한 시간 동안 계속되는데, 예를 들어, 세포는 적어도 약 15 내지 20 g/L의 정밀화학 약품이 생산되도록, 적어도 약 20 내지 25 g/L의 정밀화학 약품이 생산되도록, 적어도 약 25 내지 30 g/L의 정밀화학 약품이 생산되도록, 적어도 약 30 내지 35 g/L의 정밀화학 약품이 생산되도록, 적어도 약 35 내지 40 g/L의 정밀화학 약품이 생산되도록, 적어도 약 40 내지 50 g/L의 정밀화학 약품이 생산되도록, 적어도 약 50 내지 60 g/L의 정밀화학 약품이 생산되도록, 적어도 약 60 내지 70 g/L의 정밀화학 약품이 생산되도록, 적어도 약 70 내지 80 g/L의 정밀화학 약품이 생산되도록, 적어도 약 80 내지 90 g/L의 정밀화학 약품이 생산되도록, 적어도 약 90 내지 100 g/L의 정밀화학 약품이 생산되도록, 적어도 약 100 내지 110 g/L의 정밀화학 약품이 생산되도록, 적어도 약 110 내지 120 g/L의 정밀화학 약품이 생산되도록, 적어도 약 120 내지 130 g/L의 정밀화학 약품이 생산되도록, 적어도 약 130 내지 140 g/L의 정밀화학 약품이 생산되도록, 또는 적어도 약 140 내지 160 g/L의 정밀화학 약품이 생산되도록 배양된다. 또 다른 구체예에서, 미생물은 정밀화학 약품의 바람직한 수율, 예를 들어, 상기 설정된 범위 이내의 수율이 약 24 시간 이내에, 약 36 시간 이내에, 약 40 시간 이내에, 약 48 시간 이내에, 약 72 시 간 이내에, 약 96 시간 이내에, 약 108 시간 이내에, 약 122 시간 이내에, 또는 약 144 시간 이내에 생성되도록 하는 조건 하에서 배양된다.

본 발명의 방법은 목적하는 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신을 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다. 용어 목적하는 정밀화학 약품의 "회수"는 배양 배지로부터 화합물을 추출, 수거, 단리 또는 정제하는 것을 포함한다. 화합물의 회수는 통상적인 수지 (예를 들어, 음이온 또는 양이온 교환수지, 비-이온성 흡착수지 등)에 의한 처리, 통상적인 흡착제 (예를 들어, 활성탄, 규산, 실리카젤, 셀룰로즈, 알루미나 등)에 의한 처리, pH의 변화, 용매 추출 (예를 들어, 알콜, 에틸 아세테이트, 헥산 등과 같은 통상적인 용매에 의함), 투석, 여과, 농축, 결정화, 재결정화, pH 조정, 동결건조 등을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 본 기술분야에서 공지된 통상적인 단리 또는 정제방법 중의 어떤 것에 따라서도 수행될 수 있다. 예를 들어, 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신은 우선 미생물을 배양물로부터 제거함으로써 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 그 후, 배지를 양이온 교환수지를 통해서, 또는 양이온 교환수지 상에 통과시켜 원치않는 양이온을 제거한 다음에, 음이온 교환수지를 통해서, 또는 음이온 교환수지 상에 통과시켜 원치않는 무기 음이온 및 목적하는 정밀화학 약품 (예를 들어, 라이신)보다 더 강한 산성도를 갖는 유기산을 제거한다.

바람직하게는, 본 발명의 목적하는 정밀화학 약품은 생성된 제제가 실질적으로 다른 성분들을 포함하지 않도록 (예를 들어, 배지 성분 및/또는 발효 부산물을 포함하지 않도록) "추출", "단리" 또는 "정제"된다. 용어 "실질적으로 다른 성분 들을 포함하지 않는"은 화합물이 생성된 배양물의 배지 성분 또는 발효 부산물로부터 화합물이 단리되는 (예를 들어, 정제되거나 부분적으로 정제되는) 목적하는 화합물의 제제를 포함한다. 한가지 구체예에서, 제제는 약 80％ (건조 중량 기준) 이상의 목적화합물 (예를 들어, 약 20％ 미만의 다른 배지 성분 또는 발효 부산물), 더욱 바람직하게는 약 90％ 이상의 목적화합물 (예를 들어, 약 10％ 미만의 다른 배지 성분 또는 발효 부산물), 더 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상의 목적화합물 (예를 들어, 약 5％ 미만의 다른 배지 성분 또는 발효 부산물), 및 가장 바람직하게는 약 98-99％ 이상의 목적화합물 (예를 들어, 약 1-2％ 미만의 다른 배지 성분 또는 발효 부산물)을 갖는다.

대용 구체예에서, 목적하는 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신은 예를 들어, 미생물이 생물학적으로 위험하지 않은 경우 (예를 들어, 안전한 경우)에는 미생물로부터 정제되지 않는다. 예를 들어, 전체 배양물 (또는 배양 상등액)을 생성물 (예를 들어, 조생성물)의 공급원으로 사용할 수 있다. 한가지 구체예에서는, 배양물 (또는 배양 상등액)이 변형되지 않고 사용된다. 또 다른 구체예에서는, 배양물 (또는 배양 상등액)을 농축시킨다. 또 다른 구체예에서는, 배양물 (또는 배양 상등액)을 건조시키거나 동결건조시킨다.

II . 전구체 공급 필요조건과는 무관하게 정밀화학 약품을 생산하는 방법

처리된 생합성 효소 또는 생합성 효소의 배합물에 따라서, 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신이 생산되도록 본 발명의 미생물에 적어도 하나의 펜토즈 포스페 이트 경로 생합성 전구체를 제공 (예를 들어, 공급)하는 것이 바람직하거나 필요할 수 있다. 용어 "펜토즈 포스페이트 경로 생합성 전구체" 또는 "전구체"는 미생물의 배양 배지에 제공되거나, 이들과 접촉하도록 유도되거나, 또는 여기에 포함되는 경우에, 펜토즈 포스페이트 생합성을 증진시키거나 증가시키는 작용을 하는 약제 또는 화합물을 포함한다. 한가지 구체예에서, 펜토즈 포스페이트 생합성 전구체 또는 전구체는 글루코즈이다. 또 다른 구체예에서, 펜토즈 포스페이트 생합성 전구체는 프럭토즈이다. 첨가되는 글루코즈 또는 프럭토즈의 양은 바람직하게는, 배양 배지 내에서 미생물의 생산성을 증진시키기에 충분한 농도 (예를 들어, 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신의 생산을 증진시키기에 충분한 농도)를 제공하는 양이다. 본 발명의 펜토즈 포스페이트 생합성 전구체는 농축된 용액 또는 현탁액 (예를 들어, 물과 같은 적합한 용매 또는 완충제 중에서)의 형태로, 또는 고체의 형태 (예를 들어, 분말의 형태)로 첨가될 수 있다. 더구나, 본 발명의 펜토즈 포스페이트 생합성 전구체는 소정의 시간에 걸쳐서 단일 분취액으로서 연속적으로 또는 간헐적으로 첨가될 수 있다.

본 발명의 펜토즈 포스페이트 생합성 방법에서 펜토즈 포스페이트 생합성 전구체를 제공하는 것은 예를 들어, 정밀화학 약품의 고수율을 제공하기 위해서 방법이 사용되는 경우에 고비용과 연관될 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 방법은 라이신 또는 그 밖의 다른 목적하는 정밀화학 약품이 전구체 공급과는 무관한 방식으로 생성되도록 처리된 적어도 하나의 생합성 효소 또는 생합성 효소의 배합물 (예를 들어, 적어도 하나의 펜토즈 포스페이트 생합성 효소)을 갖는 미생물을 특징으로 한다. 예를 들어, 목적하는 화합물을 생산하는 방법을 언급하는 경우에 문구 "전구체 공급과는 무관한 방식"은 목적하는 화합물을 생산하기 위해서 이용되는 미생물에 제공되는 (예를 들어, 공급되는) 전구체에 따라 좌우되거나, 그에 근거하지 않는 목적 화합물을 생산하는 방법 또는 모드를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서 특징으로 하는 미생물을 사용하여 전구체인 글루코즈 또는 프럭토즈를 공급할 필요가 없는 방식으로 정밀화학 약품을 생산할 수 있다.

본 발명의 대용의 바람직한 방법은 라이신 또는 그 밖의 다른 정밀화학 약품이 전구체 공급과는 실질적으로 무관한 방식으로 생산되도록 처리된 적어도 하나의 생합성 효소 또는 생합성 효소의 배합물을 갖는 미생물을 특징으로 한다. 문구 "전구체 공급과는 실질적으로 무관한 방식"은 이용되는 미생물에 제공되는 (예를 들어, 공급되는) 전구체에 적은 정도로 좌우되거나, 그에 근거하는 목적 화합물을 생산하는 방법 또는 모드를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서 특징으로 하는 미생물을 사용하여 전구체인 글루코즈 또는 프럭토즈를 공급할 필요가 없는 방식으로 정밀화학 약품을 생산할 수 있다.

전구체 공급과는 무관한 방식으로, 또는 대신으로 전구체 공급과는 실질적으로 무관한 방식으로 목적하는 정밀화학 약품을 생산하는 바람직한 방법은 적어도 하나의 펜토즈 포스페이트 생합성 효소의 발현이 변형되도록 처리된 (예를 들어, 디자인되거나 조작된, 예를 들어, 유전적으로 조작된) 미생물을 배양하는 것을 포함한다. 예를 들어, 한가지 구체예에서, 미생물은 적어도 하나의 펜토즈 포스페이트 생합성 효소의 생산이 조절해제되도록 처리된다 (예를 들어, 디자인되거나, 조 작된다). 바람직한 구체예에서, 미생물은 이것이 본 명세서에 정의한 바와 같은 조절해제된 생합성 경로, 예를 들어, 조절해제된 펜토즈 포스페이트 생합성 경로를 갖도록 처리된다 (예를 들어, 디자인되거나, 조작된다). 또 다른 바람직한 구체예에서, 미생물은 적어도 하나의 펜토즈 포스페이트 생합성 효소, 예를 들어, 락테이트 데하이드로게나제가 저발현되도록 처리된다 (예를 들어, 디자인되거나 조작된다).

III . 고수율 생산방법

본 발명의 특히 바람직한 구체예는 라이신이 유의적으로 높은 수율로 생산되도록 하는 조건 하에서 처리된 미생물을 배양하는 것을 포함하여, 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신을 생산하는 고수율 생산방법이다. 문구 "고수율 생산방법", 예를 들어, 목적하는 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신을 생산하는 고수율 생산방법은 증진되거나, 비교가능한 생산방법에 대해서 통상적인 것 이상인 수준으로 목적하는 정밀화학 약품의 생산을 유도하는 방법을 포함한다. 바람직하게는, 고수율 생산방법은 유의적으로 높은 수율로 목적 화합물의 생산을 제공한다. 문구 "유의적으로 높은 수율"은 충분하게 증진되거나, 비교가능한 생산방법에 대해서 통상적인 것 이상인, 예를 들어, 목적생성물의 상업적 생산 (예를 들어, 상업적으로 적합한 비용으로 생성물의 생산)에 충분한 수준까지 증진된 생산 수준 또는 수율을 포함한다. 한가지 구체예에서, 본 발명은 라이신이 2 g/L, 10 g/L, 15 g/L, 20 g/L, 25 g/L, 30 g/L, 35 g/L, 40 g/L, 45 g/L, 50 g/L, 55 g/L, 60 g/L, 65 g/L, 70 g/L, 75 g/L, 80 g/L, 85 g/L, 90 g/L, 95 g/L, 100 g/L, 110 g/L, 120 g/L, 130 g/L, 140 g/L, 150 g/L, 160 g/L, 170 g/L, 180 g/L, 190 g/L, 또는 200 g/L 이상의 수준으로 생산되도록 하는 조건 하에서 처리된 미생물을 배양하는 것을 포함하여 라이신을 생산하는 고수율 생산방법을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 화합물의 충분히 증진된 수준이 상업적으로 바람직한 기간 이내에 생산되도록 하는 조건 하에서 처리된 미생물을 배양하는 것을 포함하여 목적하는 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신을 생산하는 고수율 생산방법을 특징으로 한다. 예시적 구체예에서, 본 발명은 라이신이 5 시간 이내에 15-20 g/L 이상의 수준으로 생산되도록 하는 조건 하에서 처리된 미생물을 배양하는 것을 포함하여 라이신을 생산하는 고수율 생산방법을 특징으로 한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 라이신이 10 시간 이내에 25-40 g/L 이상의 수준으로 생산되도록 하는 조건 하에서 처리된 미생물을 배양하는 것을 포함하여 라이신을 생산하는 고수율 생산방법을 특징으로 한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 라이신이 20 시간 이내에 50-100 g/L 이상의 수준으로 생산되도록 하는 조건 하에서 처리된 미생물을 배양하는 것을 포함하여 라이신을 생산하는 고수율 생산방법을 특징으로 한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 라이신이 40 시간 이내에 140-160 g/L 이상, 예를 들어, 40 시간 이내에 150 g/L 이상의 수준으로 생산되도록 하는 조건 하에서 처리된 미생물을 배양하는 것을 포함하여 라이신을 생산하는 고수율 생산방법을 특징으로 한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 라이신이 40 시간 이내에 130-160 g/L 이상, 예를 들어, 40 시간 이내에 135, 145 또는 150 g/L 이상의 수준으로 생산되도록 하는 조 건 하에서 처리된 미생물을 배양하는 것을 포함하여 라이신을 생산하는 고수율 생산방법을 특징으로 한다. 본 명세서에 기술된 범위 내에 포함되는 값 및 범위 및/또는 중간값도 또한 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 해석된다. 예를 들어, 40 시간 이내에 적어도 140, 141, 142, 143, 145, 146, 147, 148, 149 및 150 g/L의 수준의 라이신 생산이 40 시간 이내에 140-150 g/L의 범위 내에 포함되는 것으로 해석된다. 또 다른 예로서, 140-145 g/L 또는 145-150 g/L의 범위가 40 시간 이내의 140-150 g/L의 범위 내에 포함되는 것으로 해석된다. 또한, 숙련된 전문가는 예를 들어, "40 시간 이내에 140-150 g/L"의 생산 수준을 수득하도록 처리된 미생물을 배양하는 것에는 임의로 더 고수율로 라이신이 생산되도록 추가의 시간 동안 (예를 들어, 40시간 이상의 시간) 미생물을 배양하는 것이 포함된다는 것을 인식할 것이다.

IV . 단리된 핵산 분자 및 유전자

본 발명의 또 다른 관점은 단백질 (예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰 단백질), 예를 들어, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 코리네박테리움 펜토즈 포스페이트 생합성 효소 (예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰 펜토즈 포스페이트 효소)를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 특징으로 한다. 한가지 구체예에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 단리된 핵산 분자는 락테이트 데하이드로게나제 핵산 분자이다.

용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 (예를 들어, 선형, 원형, cDNA 또는 염색체 DNA) 및 RNA 분자 (예를 들어, tRNA, rRNA, mRNA) 및 뉴클레오타이드 유사체를 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체를 포함한다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중-가닥 DNA이다. 용어 "단리된" 핵산 분자는 핵산이 유도되는 유기체의 염색체 DNA에서 천연적으로 핵산 분자의 측면에 존재하는 서열 (즉, 핵산 분자의 5' 및 3' 말단에 위치하는 서열)을 갖지 않는 핵산 분자를 포함한다. 다양한 구체예에서, 단리된 핵산 분자는 핵산 분자가 유도되는 미생물의 염색체 DNA에서 천연적으로 핵산 분자의 측면에 존재하는 뉴클레오타이드 서열의 약 10 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 0.1 kb, 50 bp, 25 bp 또는 10 bp 미만을 함유할 수 있다. 또한, cDNA 분자와 같은 "단리된" 핵산 분자는 재조합 기술에 의해서 생산되는 경우에는 실질적으로 다른 세포성 물질을 함유하지 않거나, 화학적으로 합성된 경우에는 화학적 전구체 또는 그 밖의 다른 화학물질을 실질적으로 함유하지 않을 수 있다.

본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "유전자"는 유기체 내에서 유전자간 DNA (즉, 유기체의 염색체 DNA에서 천연적으로 유전자의 측면에 존재하고/하거나, 유전자를 단리시키는 개입성 (intervening) 또는 스페이서 (spacer) DNA)에 의해서 또 다른 유전자 또는 다른 유전자들로부터 단리되는 핵산 분자 (예를 들어, DNA 분자 또는 그의 절편), 예를 들어, 단백질 또는 RNA-코딩 핵산 분자를 포함한다. 유전자는 효소 또는 그 밖의 다른 단백질 분자의 합성을 지시할 수 있거나 (예를 들어, 단백질을 코딩하는 코딩 서열, 예를 들어, 인접한 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함할 수 있거나), 유기체에서 그 자체가 작용성일 수 있다. 유기체 내의 유전자는 본 명세서에서 정의한 바와 같이 오페론에서 집락을 형성할 수 있으며, 상기의 오페론은 유전자간 DNA에 의해서 다른 유전자 및/또는 오페론으로부터 단리된다. 오페론 내에 함유된 개개 유전자들은 개개 유전자들 사이에 유전자간 DNA가 없이 부분적으로 중복될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것으로 "단리된 유전자"는 유전자가 유도되는 유기체의 염색체 DNA에서 천연적으로 유전자의 측면에 존재하는 서열이 본질적으로 존재하지 않으며 (즉, 두번째 또는 별개의 단백질 또는 RNA 분자, 인접한 구조서열 등을 코딩하는 인접한 코딩 서열이 존재하지 않으며), 임의로 5' 및 3' 조절서열, 예를 들어, 프로모터 서열 및/또는 종결자 (terminator) 서열을 포함하는 유전자를 포함한다. 한가지 구체예에서, 단리된 유전자는 주로 단백질에 대한 코딩 서열 (예를 들어, 코리네박테리움 단백질을 코딩하는 서열)을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 단리된 유전자는 단백질에 대한 (예를 들어, 코리네박테리움 단백질에 대한) 코딩 서열, 및 유전자가 유도되는 유기체의 염색체 DNA로부터의 인접한 5' 및/또는 3' 조절 (예를 들어, 인접한 5' 및/또는 3' 코리네박테리움 조절서열)을 포함한다. 바람직하게는, 단리된 유전자는 유전자가 유도되는 유기체의 염색체 DNA에서 천연적으로 유전자의 측면에 존재하는 뉴클레오타이드 서열의 약 10 kb, 5 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 0.2 kb, 0.1 kb, 50 bp, 25 bp 또는 10 bp 미만을 함유한다.

한가지 관점에서, 본 발명의 방법은 단리된 락테이트 데하이드로게나제 핵산 서열 또는 유전자의 사용을 특징으로 한다.

바람직한 구체예에서, 핵산 또는 유전자는 코리네박테리움으로부터 유도된다 (예를 들어, 코리네박테리움-유도된다). 용어 "코리네박테리움으로부터 유도된" 또는 "코리네박테리움-유도된"은 코리네박테리움 속의 미생물에 천연적으로 존재하는 핵산 또는 유전자를 포함한다. 바람직하게는, 핵산 또는 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰, 코리네박테리움 아세토애시도필룸 또는 코리네박테리움 더모아미노제네스로 구성된 군으로부터 선택된 미생물로부터 유도된다. 특히 바람직한 구체예에서, 핵산 또는 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유도된다 (예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰-유도된다). 또 다른 바람직한 구체예에서, 핵산 또는 유전자는 코리네박테리윰 유전자 동족체이다 (예를 들어, 코리네박테리움과는 다르지만, 본 발명의 코리네박테리움 유전자, 예를 들어, 코리네박테리움 락테이트 데하이드로게나제 유전자에 대하여 유의적인 상동성을 갖는 종으로부터 유도된다).

본 발명의 범주 내에는 박테리아-유도된 핵산 분자 또는 유전자 및/또는 코리네박테리움-유도된 핵산 분자 또는 유전자 (예를 들어, 코리네박테리움-유도된 핵산 분자 또는 유전자), 예를 들어, 본 발명자들에 의해서 확인된 유전자, 예를 들어, 코리네박테리움 또는 코리네바테리움 글루타미쿰 락테이트 데하이드로게나제 유전자가 포함된다. 또한, 본 발명의 범주 내에는 천연적으로 존재하는 박테리아 및/또는 코리네박테리움 핵산 분자 또는 유전자 (예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰 핵산 분자 또는 유전자)와는 상이한 박테리아-유도된 핵산 분자 또는 유전자 및/또는 코리네박테리움-유도된 핵산 분자 또는 유전자 (예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰-유도된 핵산 분자 또는 유전자)(예를 들어, 코리네박테리움 글루 타미쿰 핵산 분자 또는 유전자), 예를 들어, 치환되거나, 삽입되거나 결실된 핵산을 가지며, 본 발명의 천연적으로 존재하는 유전자 생성물과 실질적으로 유사한 단백질을 코딩하는 핵산 분자 또는 유전자가 포함된다. 한가지 구체예에서, 단리된 핵산 분자는 서열 1로 기술된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 서열 2로 기술된 아미노산 서열을 코딩한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 서열 1로 기술된 뉴클레오타이드 서열에 대해서 적어도 약 60-65％, 바람직하게는 적어도 약 70-75％, 더욱 바람직하게는 적어도 약 80-85％, 더 더욱 바람직하게는 적어도 약 90-95％ 또는 그 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 단리된 핵산 분자는 엄격한 조건 하에서 서열 1로 기술된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자에 대해 하이브리드화한다. 이러한 엄격한 조건은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지되어 있으며, 문헌 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6)에서 볼 수 있다. 엄격한 (예를 들어, 높은 엄격성) 하이브리드화 조건의 바람직한 비-제한적 예는 약 45℃에서 6×나트륨 클로라이드/나트륨 시트레이트 (SSC) 중에서 하이브리드화시킨 다음에, 50-65℃에서 0.2×SSC, 0.1％ SDS 중에서 1회 또는 그 이상 세척하는 것이다. 바람직하게는, 엄격한 조건 하에서 서열 1의 서열에 대해 하이브리드화하는 본 발명의 단리된 핵산 분자는 천연적으로 존재하는 핵산 분자에 상응한다. 본 명세서에서 사용된 것으로, "천연적으로 존재하는" 핵산 분자는 천연에서 나타나는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 RNA 또는 DNA 분자를 의미한다.

본 발명의 핵산 분자 (예를 들어, 서열 1의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자)는 표준 분자생물학 기술 및 본 명세서에 제공된 서열 정보를 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 표준 하이브리드화 및 클로닝 기술 (예를 들어, 문헌 (Sambrook, J., Fritsh, E.F., and Maniatis, T. Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 2 nd , ed ., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)에 기술된 바와 같음)을 사용하여 단리될 수 있거나, 서열 1의 서열을 기준으로 하여 디자인된 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 폴리머라제 연쇄반응에 의해서 단리될 수 있다. 본 발명의 핵산은 표준 PCR 증폭기술에 따라 주형으로서 cDNA, mRNA 또는 대신으로 지놈성 DNA, 및 적절한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 서열 1로 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 보체 (complement)인 핵산 분자를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 단리된 핵산 분자는 락테이트 데하이드로게나제 유전자 또는 그의 일부분 또는 단편이거나, 이들을 포함한다. 한가지 구체예에서, 단리된 락테이트 데하이드로게나제 핵산 분자 또는 유전자는 서열 1로 기술된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다 (예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰 락테이트 데하이드로게나제 뉴클레오타이드 서열을 포함한다). 또 다른 구체예에서, 단리된 락테이트 데하이드로게나제 핵산 분자 또는 유전자는 서열 2로 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 (예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰 락테이트 데하이드로게나제 아미노산 서열을 코딩한) 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 단리된 락테이트 데하이드로게나제 핵산 분자 또는 유전자는 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 락테이트 데하이드로게나제 단백질의 동족체를 코딩한다. 본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "동족체"는 본 명세서에 기술된 야생형 단백질 또는 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 적어도 약 30-35％, 바람직하게는 적어도 약 35-40％, 더욱 바람직하게는 적어도 약 40-50％, 더 더욱 바람직하게는 적어도 약 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 그 이상의 동일성을 공유하며, 야생형 단백질 또는 폴리펩타이드와 실질적으로 동등한 작용적 또는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 락테이트 데하이드로게나제 동족체는 서열 2로 기술된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 적어도 약 30-35％, 바람직하게는 적어도 약 35-40％, 더욱 바람직하게는 적어도 약 40-50％, 더 더욱 바람직하게는 적어도 약 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 그 이상의 동일성을 공유하며, (예를 들어, 실질적으로 동등한 판토테네이트 키나제 활성을 갖는) 서열 2로 기술된 아미노산 서열을 갖는 단백질의 실질적으로 동등한 작용적 또는 생물학적 활성을 갖는다 (즉, 작용적 등가물이다). 바람직한 구체예에서, 단리된 락테이트 데하이드로게나제 핵산 분자 또는 유전자는 서열 2로 기술된 바와 같은 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 단리된 락테이트 데하이드로게나제 핵산 분자는 서열 1로 기술된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자의 전부 또는 일부분에 하이브리드화하거나, 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자의 전부 또는 일부분에 하이브리드화한다. 이러한 하이브리드화 조건은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공 지되어 있으며, 문헌 (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. (1995), sections 2, 4 and 6)에서 볼 수 있다. 추가의 엄격한 조건은 문헌 (Molecular Cloning : A Laboratory Manual , Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), chapters 7, 9 and 11)에서 볼 수 있다. 엄격한 하이브리드화 조건의 바람직한 비-제한적인 예로는 약 65-70℃에서 4×나트륨 클로라이드/나트륨 시트레이트 (SSC) 중에서 하이브리드화 (또는 약 42-50℃에서 4×SSC+50％ 포름아미드 중에서 하이브리드화)시킨 다음에, 약 65-70℃에서 1×SSC 중에서 1회 또는 그 이상 세척하는 것을 포함한다. 고도로 엄격한 하이브리드화 조건의 바람직한 비-제한적인 예로는 약 65-70℃에서 1×SSC 중에서 하이브리드화 (또는 약 42-50℃에서 1×SSC+50％ 포름아미드 중에서 하이브리드화)시킨 다음에, 약 65-70℃에서 0.3×SSC 중에서 1회 또는 그 이상 세척하는 것을 포함한다. 감소된 엄격한 하이브리드화 조건의 바람직한 비-제한적인 예로는 약 50-60℃에서 4×SSC 중에서 하이브리드화 (또는 대신으로 약 40-45℃에서 6×SSC+50％ 포름아미드 중에서 하이브리드화)시킨 다음에, 약 50-60℃에서 2×SSC 중에서 1회 또는 그 이상 세척하는 것을 포함한다. 상기 열거된 값에 대한 중간 범위, 예를 들어, 65-70℃ 또는 42-50℃도 또한, 본 발명에 포함되는 것으로 해석된다. SSPE (1×SSPE는 0.15 M NaCl, 10 mM NaH₂PO₄ 및 1.25 mM EDTA, pH 7.4이다)는 하이브리드화 및 세척 완충액 중에서 SSC (1×SSC는 0.15 M NaCl 및 15 mM 나트륨 시트레이트이다)에 대해 대체될 수 있으며; 세척은 각각의 하이브리드화가 완료된 후에 15분 동안 수행된다. 길이가 50 염기쌍 미만인 것으로 예상되는 하이브리드에 대한 하이브리드화 온도는 하이브리드의 융점 (T_m) 보다 5-10℃ 미만이어야 하며, 여기에서 T_m은 이하의 수학식에 따라서 측정된다. 길이가 18 염기쌍 미만인 하이브리드의 경우에, T_m (℃) = 2(A+T 염기의 #) + 4(G+C 염기의 #). 길이가 18 내지 49 염기쌍 사이인 하이브리드의 경우에, T_m (℃) = 8.15 + 16.6(log₁₀[Na⁺]) + 0.41(％G+C) - (600/N)이며, 여기에서 N은 하이브리드에서 염기의 수이고, [Na⁺]는 하이브리드화 완충액 중에서 나트륨 이온의 농도이다 (1×SSC의 경우에 [Na⁺] = 0.165 M). 또한, 막, 예를 들어, 니트로셀룰로즈 또는 나일론 막에 대한 핵산 분자의 비-특이적 하이브리드화를 감소시키기 위해서 차단제 (예를 들어, BSA 또는 연어 또는 청어 정자 캐리어 DNA), 세정제 (예를 들어, SDS), 킬레이트화제 (예를 들어, EDTA), 피콜 (Ficoll), PVP 등을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 추가의 시약이 하이브리드화 및/또는 세척 완충액에 첨가될 수 있다. 나일론 막을 사용하는 경우에, 특히 엄격한 하이브리드화 조건의 추가의 바람직한 비-제한적 예는 약 65℃에서 0.25-0.5 M NaH₂PO₄, 7％ SDS 중에서 하이브리드화시킨 다음에, 약 65℃에서 0.02 M NaH₂PO₄, 1％ SDS (참조예: Church and Gilbert (1984) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81:1991-1995)(또는 대신으로 0.2×SSC, 1％ SDS)에서 1회 또는 그 이상 세척하는 것이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 단리된 핵산 분자 는 본 명세서에 기술된 락테이트 데하이드로게나제 뉴클레오타이드 서열에 대해서 상보적인 (예를 들어, 서열 1로 기술된 뉴클레오타이드 서열의 전체 보체인) 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 핵산 분자 (예를 들어, 락테이트 데하이드로게나제 핵산 분자 또는 유전자)는 표준 분자생물학 기술 및 본 명세서에 제공된 서열 정보를 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 표준 하이브리드화 및 클로닝 기술 (예를 들어, 문헌 (Sambrook, J., Fritsh, E.F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2 nd , ed ., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)에 기술된 바와 같음)을 사용하여 단리될 수 있거나, 본 명세서에 기술된 락테이트 데하이드로게나제 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 측면 서열 (flanking sequence)을 기준으로 하여 디자인된 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 폴리머라제 연쇄반응에 의해서 단리될 수 있다. 본 발명의 핵산 (예를 들어, 락테이트 데하이드로게나제 핵산 분자 또는 유전자)은 표준 PCR 증폭기술에 따라 주형으로서 cDNA, mRNA 또는 대신으로 염색체 DNA, 및 적절한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예는 돌연변이체 락테이트 데하이드로게나제 핵산 분자 또는 유전자를 특징으로 한다. 본 명세서에서 사용된 것으로 문구 "돌연변이체 핵산 분자" 또는 "돌연변이체 유전자"는 해당 돌연변이체에 의해서 코딩될 수 있는 폴리펩타이드 또는 단백질이 야생형 핵산 분자 또는 유전자에 의해서 코딩된 폴리 펩타이드 또는 단백질과는 상이한 활성을 나타내도록 적어도 하나의 변화 (예를 들어, 치환, 삽입, 결실)를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자 또는 유전자를 포함한다. 바람직하게는, 돌연변이체 핵산 분자 또는 돌연변이체 유전자 (예를 들어, 돌연변이체 락테이트 데하이드로게나제 유전자)는 예를 들어, 유사한 조건 하에서 시험하는 (예를 들어, 동일한 온도에서 배양된 미생물에서 시험하는) 경우에 야생형 핵산 분자 또는 유전자에 의해서 코딩된 폴리펩타이드 또는 단백질과 비교하여 증가된 활성을 갖는 (예를 들어, 증가된 락테이트 데하이드로게나제 활성을 갖는) 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩한다. 돌연변이체 유전자는 또한, 야생형 폴리펩타이드의 생산의 감소된 수준을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용된 것으로, "감소된 활성" 또는 "감소된 효소활성"은 야생형 핵산 분자 또는 유전자에 의해서 코딩된 폴리펩타이드 또는 단백질의 활성보다 적어도 5％ 적은, 또는 야생형 핵산 분자 또는 유전자에 의해서 코딩된 폴리펩타이드 또는 단백질의 활성보다 바람직하게는 적어도 5-10％ 적은, 더욱 바람직하게는 적어도 10-25％ 적은, 더 더욱 바람직하게는 적어도 25-50％, 50-75％ 또는 75-100％ 적은 것이다. 상기 열거된 값에 대해 중간인 범위, 예를 들어, 75-80％, 85-90％, 90-95％도 또한 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다. 본 명세서에서 사용된 것으로, "감소된 활성" 또는 "감소된 효소활성"은 또한, 결실되거나 녹-아웃된 활성을 포함한다. 활성은 관심이 있는 특정 단백질의 활성을 측정하는 잘 인정된 시험방법에 따라서 측정될 수 있다. 활성은 예를 들어, 세포로부터 단리되거나 정제된 단백질의 활성을 측정하여 직접적으로 측정되거나 시험할 수 있다. 대신으 로, 활성은 세포 내에서 또는 세포외 매질에서 측정되거나 시험할 수 있다.

핵산 또는 유전자 서열에서의 단일 치환 (예를 들어, 상응하는 아미노산 서열에서 아미노산 변화를 코딩하는 염기 치환) 조차도 상응하는 야생형 폴리펩타이드 또는 단백질에 비해서 코딩된 폴리펩타이드 또는 단백질의 활성에 현격하게 영향을 미칠 수 있다는 것은 숙련된 전문가에 의해서 인지될 수 있다. 본 명세서에서 정의된 바와 같은 돌연변이체 핵산 또는 돌연변이체 유전자 (예를 들어, 돌연변이체 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는)는 임의로, 야생형 유전자 또는 핵산을 발현하거나 돌연변이체 단백질 또는 폴리펩타이드 생산하는 상응하는 미생물에 비해서, 돌연변이체 유전자 또는 핵산을 발현하거나 돌연변이체 단백질 또는 폴리펩타이드를 생산하는 미생물 (즉, 돌연변이체 미생물)에서 상이하거나 별개의 표현형으로 관찰가능한 변화된 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩한다는 점에서 상술한 바와 같은 단백질 동족체를 코딩하는 핵산 또는 유전자로부터 쉽게 식별이 가능하다. 대조해 보면, 단백질 동족체는 야생형 유전자 또는 핵산을 발현하는 상응하는 미생물에 비해서, 미생물에서 생산되는 경우에 임의로 표현형적으로 식별하기 어려운 동일하거나 실질적으로 유사한 활성을 갖는다. 따라서, 이것은 예를 들어, 동족체와 돌연변이체를 구분하는 작용을 하는 핵산 분자, 유전자, 단백질 또는 폴리펩타이드 사이에서의 서열 동일성의 정도가 아니라, 이것은 동족체와 돌연변이체 사이를 구분하는 코딩된 단백질 또는 폴리펩타이드의 활성이다: 여기에서 동족체는 예를 들어, 낮은 (예를 들어, 30-50％ 서열 동일성) 서열 동일성을 갖지만 실질적으로 동등한 작용적 활성을 가지며, 돌연변이체는 예를 들어, 99％ 서열 동일성을 갖지만 현격하게 상이하거나 변화된 작용적 활성을 갖는다.

V. 재조합 핵산 분자 및 벡터

본 발명은 또한, 본 명세서에 기술된 핵산 분자 및/또는 유전자 (예를 들어, 단리된 핵산 분자 및/또는 유전자), 바람직하게는 코리네박테리움 유전자, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 유전자, 더 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 락테이트 데하이드로게나제 유전자를 포함하는 재조합 핵산 분자 (예를 들어, 재조합 DNA 분자)를 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 본 명세서에 기술된 핵산 분자 (예를 들어, 단리되거나 재조합체인 핵산 분자 및/또는 유전자)를 포함하는 벡터 (예를 들어, 재조합 벡터)를 특징으로 한다. 특히, 본 명세서에 기술된 바와 같은 박테리아 유전자 생성물, 바람직하게는 코리네박테리움 유전자 생성물, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 유전자 생성물 (예를 들어, 펜토즈 포스페이트 효소, 예를 들어, 락테이트 데하이드로게나제)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터가 특징이 된다.

용어 "재조합 핵산 분자"는 (예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 첨가, 결실 또는 치환에 의해서) 재조합 핵산 분자가 유도되는 천연 또는 자연적인 핵산 분자로부터의 뉴클레오타이드 서열에서 상이하도록 변화, 변형 또는 조작된 핵산 분자 (예를 들어, DNA 분자)를 포함한다. 바람직하게는, 재조합 핵산 분자 (예를 들어, 재조합 DNA 분자)는 조절서열에 작동적으로 연결된 본 발명의 단리된 핵산 분자 또는 유전자 (예를 들어, 단리된 락테이트 데하이드로게나제 유전자)를 포함한다.

용어 "재조합 벡터"는 이것이 재조합 벡터가 유도되는 천연 또는 자연적인 핵산 분자에 포함되는 것보다 더 크거나, 적거나 상이한 핵산 서열을 함유하도록 변화, 변형 또는 조작된 벡터 (예를 들어, 플라스미드, 파지, 파스미드 (phasmid), 바이러스, 코스미드 또는 그 밖의 정제된 핵산 벡터)를 포함한다. 바람직하게는, 재조합 벡터는 조절서열, 예를 들어, 프로모터 서열, 종결자 서열 및/또는 인공적 리보좀 결합부위 (RBSs)에 작동적으로 연결된 이러한 락테이트 데하이드로게나제 유전자를 포함하는 락테이트 데하이드로게나제 유전자 또는 재조합 핵산 분자를 포함한다.

문구 "조절서열(들)에 작동적으로 연결된"은 관심있는 핵산 분자 또는 유전자의 뉴클레오타이드 서열이 뉴클레오타이드 서열의 발현 (예를 들어, 증진된, 증가된, 구성적, 기초적인, 약화된, 감소된 또는 억제된 발현), 바람직하게는 뉴클레오타이드 서열에 의해서 코딩된 유전자 생성물의 발현 (예를 들어, 재조합 핵산 분자가 본 명세서에 정의한 바와 같이 재조합 벡터 내에 포함되어 미생물 내에 도입된 경우)이 가능하도록 하는 방식으로 조절서열(들)에 연결되는 것을 의미한다.

용어 "조절서열"은 다른 핵산 서열의 발현에 영향을 미치는 (예를 들어, 변조시키거나 조절하는) 핵산 서열을 포함한다. 한가지 구체예에서, 조절서열은 관심있는 특정의 유전자에 대비하여, 천연에 존재하는 것으로서 관심있는 조절서열 및 유전자에 대해서 관찰되는 것과 유사하거나 동일한 위치 및/또는 배향으로, 예 를 들어, 천연적 위치 및/또는 배향으로 재조합 핵산 분자 또는 재조합 벡터 내에 도입된다. 예를 들어, 관심있는 유전자는 천연 유기체 내에서 관심있는 유전자에 수반되거나 인접한 조절서열에 작동적으로 연결된 (예를 들어, "천연" 조절서열, 예를 들어, "천연" 프로모터에 작동적으로 연결된) 재조합 핵산 분자 또는 재조합 벡터 내에 포함될 수 있다. 대신으로, 관심있는 유전자는 천연 유기체 내의 또 다른 (예를 들어, 상이한) 유전자에 수반되거나 인접한 조절서열에 작동적으로 연결된 재조합 핵산 분자 또는 재조합 벡터 내에 포함될 수 있다. 대신으로, 관심있는 유전자는 또 다른 유기체로부터의 조절서열에 작동적으로 연결된 재조합 핵산 분자 또는 재조합 벡터 내에 포함될 수 있다. 예를 들어, 다른 미생물로부터의 조절서열 (예를 들어, 그 밖의 다른 박테리아 조절서열, 박테리오파아지 조절서열 등)은 관심있는 특정의 유전자에 작동적으로 연결될 수 있다.

한가지 구체예에서, 조절서열은 비-천연적으로 또는 비-자연적으로 존재하는 서열 (예를 들어, 화학적으로 합성된 서열을 포함하여 변형되거나, 돌연변이되거나, 치환되거나, 유도체화되거나, 결실된 서열)이다. 바람직한 조절서열은 프로모터, 인핸서, 종결 시그날, 안티-종결 시그날 및 그 밖의 다른 발현 조절요소 (예를 들어, 억제자 또는 유도자 (inducer)가 결합하는 서열 및/또는 예를 들어, 전사된 mRNA 내에서 전사 및/또는 해독 조절 단백질을 위한 결합부위)를 포함한다. 이러한 조절서열은 예를 들어, 문헌 (Sambrook, J., Fritsh, E.F., and Maniatis, T. Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 2nd, ed ., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)에 기술되어 있다. 조절서열은 미생물 내에서 뉴클레오타이드 서열의 구성적 발현을 지시하는 것 (예를 들어, 구성적 프로모터 및 강력한 구성적 프로모터), 미생물 내에서 뉴클레오타이드 서열의 유도성 발현을 지시하는 것 (예를 들어, 유도성 프로모터, 예를 들어, 자일로즈 유도성 프로모터), 및 미생물 내에서 뉴클레오타이드 서열의 발현을 약화시키거나 억제하는 것 (예를 들어, 약화 시그날 또는 억제 시그날)을 포함한다. 또한, 조절서열을 제거하거나 결실시킴으로써 관심있는 유전자의 발현을 조절하는 것도 본 발명의 범주 내에 포함된다. 예를 들어, 증가되거나 구성적인 전사가 일어나도록 전사의 조절에 연관된 서열은 관심있는 유전자의 발현이 감소되도록 제거될 수 있다.

한가지 구체예에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 재조합 벡터는 프로모터 또는 프로모터 서열에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 박테리아 유전자 생성물 (예를 들어, 펜토즈 포스페이트 생합성 효소, 예를 들어, 락테이트 데하이드로게나제)을 코딩하는 핵산 서열 또는 유전자를 포함한다. 본 발명의 바람직한 프로모터에는 코리네박테리움 프로모터 및/또는 박테리오파아지 프로모터 (예를 들어, 코리네박테리움을 감염시킨 박테리오파아지)가 포함된다. 한가지 구체예에서, 프로모터는 코리네박테리움 프로모터, 바람직하게는 강력한 코리네박테리움 프로모터 (예를 들어, 코리네박테리움에서 생화학적 관리유전자 (biochemical housekeeping gene)와 결합된 프로모터 또는 코리네박테리움에서 해당경로 유전자와 결합된 프로모터)이다. 또 다른 구체예에서, 프로모터는 박테리오파아지 프로모터이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 재조합 벡터에는 종 결자 서열 또는 종결자 서열들 (예를 들어, 전사 종결자 서열)을 포함한다. 용어 "종결자 서열"은 유전자의 전사를 종결시키는 작용을 하는 조절서열을 포함한다. 종결자 서열 (또는 탠덤 (tandem) 전사 종결자)은 또한, 예를 들어, 뉴클레아제에 대하여 mRNA를 안정화시키는 (예를 들어, mRNA에 구조를 첨가함으로써) 작용을 할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 재조합 벡터는 상기 서열을 함유하는 벡터의 결실을 가능하게 하는 서열 (즉, 검출가능하고/하거나 선택가능한 마커), 예를 들어, 영양요구성 돌연변이를 극복하는 서열, 예를 들어, ura3 또는 ilvE, 형광성 마커, 및/또는 비색성 마커 (예를 들어, lacZ/β-갈락토시다제), 및/또는 항생제 내성 유전자 (예를 들어, amp 또는 tet)를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 재조합 벡터는 항생제 내성 유전자를 포함한다. 용어 "항생제 내성 유전자"는 숙주 유기체 (예를 들어, 바실루스)에 항생제에 대한 내성을 증진시키거나 부여하는 서열을 포함한다. 한가지 구체예에서, 항생제 내성 유전자는 cat (클로람페니콜 내성) 유전자, tet (테트라사이클린 내성) 유전자, erm (에리트로마이신 내성) 유전자, neo (네오마이신 내성) 유전자 및 spec (스펙티노마이신 내성) 유전자로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 재조합 벡터는 동족성 재조합 서열 (예를 들어, 숙주 유기체의 염색체 내로 관심있는 유전자의 재조합이 가능하도록 디자인된 서열)을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, amyE 서열은 숙주 염색체 내로 재조합시키기 위한 상동성 표적으로 사용될 수 있다.

또한, 벡터의 디자인은 유전적으로 조작될 미생물의 선택, 목적하는 유전자 생성물의 발현 수준 등과 같은 인자들에 따라서 맞추어질 수 있다는 것은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 인식될 것이다.

VI . 단리된 단백질

본 발명의 또 다른 관점은 단리된 단백질 (예를 들어, 단리된 펜토즈 포스페이트 생합성 효소, 예를 들어, 단리된 락테이트 데하이드로게나제)을 특징으로 한다. 한가지 구체예에서, 단백질 (예를 들어, 단리된 펜토즈 포스페이트 효소, 예를 들어, 단리된 락테이트 데하이드로게나제)은 재조합 DNA 기술에 의해서 생산되며, 표준 단백질 정제기술을 사용하여 적절한 정제방법에 의해서 본 발명의 미생물로부터 단리될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 단백질은 표준 펩타이드 합성기술을 사용하여 화학적으로 합성된다.

"단리"되거나 "정제"된 단백질 (예를 들어, 단리되거나 정제된 생합성 효소)은 단백질이 유도되는 미생물로부터 유래하는 세포성 물질 또는 그 밖의 오염성 단백질을 실질적으로 함유하지 않거나, 화학적으로 합성된 경우에는 화학적 전구체 또는 그 밖의 화학물질을 실질적으로 함유하지 않는다. 한가지 구체예에서, 단리되거나 정제된 단백질은 약 30％ (건조 중량 기준) 미만의 오염성 단백질 또는 화학물질, 더욱 바람직하게는 약 20％ 미만의 오염성 단백질 또는 화학물질, 더 더욱 바람직하게는 약 10％ 미만의 오염성 단백질 또는 화학물질, 가장 바람직하게는 약 5％ 미만의 오염성 단백질 또는 화학물질을 갖는다.

바람직한 구체예에서, 단백질 또는 유전자 생성물은 코리네박테리움으로부터 유도된다 (예를 들어, 코리네박테리움-유도된다). 용어 "코리네박테리움으로부터 유도된" 또는 "코리네박테리움-유도된"은 코리네박테리움 유전자에 의해서 코딩된 단백질 또는 유전자 생성물을 포함한다. 바람직하게는, 유전자 생성물은 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰, 코리네박테리움 아세토애시도필룸 또는 코리네박테리움 더모아미노제네스로 구성된 군으로부터 선택된 미생물로부터 유도된다. 특히 바람직한 구체예에서, 단백질 또는 유전자 생성물은 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유도된다 (예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰-유도된다). 용어 "코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유도된" 또는 "코리네박테리움 글루타미쿰-유도된"은 코리네박테리움 글루타미쿰 유전자에 의해서 코딩된 단백질 또는 유전자 생성물을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 단백질 또는 유전자 생성물은 코리네박테리윰 유전자 동족체 (예를 들어, 코리네박테리움과는 다르지만, 본 발명의 코리네박테리움 유전자, 예를 들어, 코리네박테리움 락테이트 데하이드로게나제 유전자에 대하여 유의적인 상동성을 갖는 종으로부터 유도된 유전자)에 의해서 코딩된다.

본 발명의 범주 내에는 천연적으로 존재하는 박테리아 및/또는 코리네박테리움 유전자 (예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰 유전자), 예를 들어, 본 발명자들에 의해서 확인된 유전자, 예를 들어, 코리네박테리움 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 락테이트 데하이드로게나제 유전자에 의해서 코딩된 박테리아-유도된 단백질 또는 유전자 생성물 및/또는 코리네박테리움-유도된 단백질 또는 유전자 생성물 (예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰-유도된 유전자 생성물)이 포함된다. 또 한, 본 발명의 범주 내에는 천연적으로 존재하는 박테리아 및/또는 코리네박테리움 유전자 (예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰 유전자)와는 상이한 코딩된 박테리아 및/또는 코리네박테리움 유전자 (예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰 유전자), 예를 들어, 돌연변이되거나, 삽입되거나 결실된 핵산을 가지며, 본 발명의 천연적으로 존재하는 유전자 생성물과 실질적으로 유사한 단백질을 코딩하는 핵산 분자 또는 유전자인 박테리아-유도된 단백질 또는 유전자 생성물 및/또는 코리네박테리움-유도된 단백질 또는 유전자 생성물 (예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰-유도된 유전자 생성물)이 포함된다. 예를 들어, 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 유전자 코드의 변성에 기인하여 천연적으로 존재하는 유전자에 의해서 코딩된 것과 동일한 아미노산에 대해서 코딩하는 핵산을 돌연변이 (예를 들어, 치환)시킬 수 있는 것으로 잘 이해된다. 또한, 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 보존적 아미노산 치환에 대해서 코딩하는 핵산을 돌연변이 (예를 들어, 치환)시킬 수 있는 것으로 잘 이해된다. 또한, 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 천연적으로 존재하는 유전자 생성물과 비교하여 유전자 생성물의 기능을 실질적으로 변화시키지 않으면서 특정한 정도까지 아미노산을 치환, 첨가 또는 결실시킬 수 있는 것으로 잘 이해되며, 이들 각각의 경우는 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 이해된다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 단리된 단백질 (예를 들어, 단리된 펜토즈 포스페이트 생합성 효소, 예를 들어, 단리된 락테이트 데하이드로게나제)은 서열 2로 나타낸 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 단리된 단백질은 서열 2로 기술된 단백질의 동족체이다 (예를 들어, 서열 2의 아미노산 서열에 대해서 적어도 약 30-40％ 동일하고, 바람직하게는 약 40-50％ 동일하며, 더욱 바람직하게는 약 50-60％ 동일하고, 더 더욱 바람직하게는 약 60-70％, 70-80％, 80-90％, 90-95％ 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 서열 2의 아미노산에 의해서 코딩된 단백질의 활성과 실질적으로 유사한 활성을 갖는다).

두가지 아미노산 서열, 또는 두가지 핵산의 상동성 ％를 측정하기 위해서, 서열은 최적 비교목적으로 정렬된다 (예를 들어, 갭 (gap)이 두번째 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적의 정렬을 위하여 첫번째 아미노산 또는 핵산 분자의 서열에 도입될 수 있다). 첫번째 서열 내의 위치가 두번째 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해서 점유된 경우에는, 분자가 해당 위치에서 동일하다. 두개의 서열 사이의 동일성 ％는 바람직하게는, 최적 정렬을 제공하는데 필요한 갭의 수 및 갭의 크기를 고려하여 서열에 의해서 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, 동일성 ％ = 동일한 위치의 #/위치의 총 # × 100).

두개의 서열 사이의 서열의 비교 및 상동성 ％의 측정은 수학적 알고리듬을 사용하여 이루어질 수 있다. 서열의 비교를 위해서 이용된 수학적 알고리듬의 바람직한 비-제한적 예는 문헌 (Karlin and Altschul (1993) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 90:5873-77)에서와 같이 변형된 칼린과 알츠철 (Karlin and Altschul (1990) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87:2264-68)의 알고리듬이다. 이러한 알고리듬은 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버젼 2.0)(Altschul et al. (1990) J. Mol . Biol . 215:403-10)에 통합된다. BLAST 뉴클레오타이드 탐색은 NBLAST 프로그램 (스코어 (score) = 100, 단어길이 (wordlength) = 12)을 사용하여 수행되어 본 발명의 핵산 분자에 대해서 동족성인 뉴클레오타이드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 탐색은 XBLAST 프로그램 (스코어 = 50, 단어길이 = 3)을 사용하여 수행되어 본 발명의 단백질 분자에 대해서 동족성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해서는 문헌 (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25(17):3389-3402)에 기술된 바와 같이 갭드 (Gapped) BLAST가 이용될 수 있다. BLAST 및 갭드 BLAST 프로그램이 이용되는 경우에, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라메터 (default parameter)가 사용될 수 있다 (참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 서열의 비교를 위해서 이용되는 수학적 알고리듬의 또 다른 바람직한 비-제한적 예는 마이어스와 밀러의 알고리듬 (Meyers and Miller (1998) Comput Appl Biosci . 4:11-17)이다. 이러한 알고리듬은 예를 들어, GENESTREAM 네트워크 서버 (network server) (IGH Montpellier, FRANCE) (http://vega.igh.cnrs.fr)에서, 또는 ISREC 서버(http://www.ch.embnet.org)에서 이용할 수 있는 ALIGN 프로그램에 통합된다. 아미노산 서열을 비교하기 위하여 ALIGN 프로그램을 이용하는 경우에는, PAM120 웨이트 레지듀 테이블 (weight residue table), 12의 갭 길이 페널티 (penalty) 및 4의 갭 페널티가 사용될 수 있다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 두개의 아미노산 서열 사이의 상동성 ％는 블로섬 (Blossom) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 웨이트 및 2, 3 또는 4의 길이 웨이트를 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 이용할 수 있음)에서 GAP 프로그램을 사용하여 측정될 수 있다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 두개의 핵산 서열 사이의 상동성 ％는 50의 갭 웨이트 및 3의 길이 웨이트를 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 이용할 수 있음)에서 GAP 프로그램을 사용하여 이루어질 수 있다.

본 발명은 제한적인 것으로 이해되지 않아야 하는 이하의 실시예에 의해서 더 설명된다. 본 출원 전체적으로 인용된 모든 문헌, 특허, 서열 리스트, 도면 및 공개된 특허출원의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.

일반적 방법

균주. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21526은 아메리칸 타입 앤드 컬쳐 콜렉션 (Amercian Type and Culture Collection, Manassas, USA)로부터 수득되었다. 이러한 호모세린 영양요구성 균주는 일치된 (concerted) 아스파르테이트 키나제 억제의 우회로 인하여 L-트레오닌 제한 중에 라이신을 배출한다. 전배양물은 5 g L^-1의 프럭토즈 또는 글루코즈를 함유하는 복합배지 (complex medium)에서 성장시켰다. 한천 플레이트의 경우에, 복합배지는 추가로 12 g L^-1 한천에 의해서 보정되었다. 추적 실험 및 추적 연구를 위한 접종물 그 자체로서의 세포의 생산을 위해서는 1 ㎎ ㎖^-1 칼슘 판토테네이트ㆍHCl로 보정된 최소배지가 사용되었다 (Wittmann, C. and E. Heinzle. 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68:5843-5859). 이 배지에서 탄소 공급원인 글루코즈 또는 프럭토즈, 필수아미노산인 트레오닌, 메티오닌 및 류신, 및 시트레이트의 농도는 이하에 명시한 바와 같이 변화되었다.

배양. 전배양은 (i) 접종물로서 한천 플레이트로부터의 세포를 사용한 복합배지에서의 개시 배양, (ii) 최소배지에 적응시키기 위한 단기 배양, 및 (iii) 필수 아미노산의 증가된 농도를 갖는 최소배지 상에서의 장기간 배양으로 구성되었다. 한천 플레이트로부터 접종된 전배양물은 10 ㎖ 복합배지 상에서 100 ㎖ 배플 (baffled) 진탕 플라스크에서 밤새 성장시켰다. 그 후에, 세포를 원심단리 (800 g, 2 분, 30℃)에 의해서 수거하여, 최소배지에 접종하고, 2의 광학밀도까지 성장시켜 최소배지에 적합한 기하급수적으로 성장하는 세포를 수득하였다. 그 후에, 세포를 멸균 0.9％ NaCl을 사용한 세척단계를 포함한 원심단리 (8800 g, 30℃ 및 2 분)에 의해서 수거하였다. 그 후, 이들을 0.30 g L^-1 트레오닌, 0.88 g L^-1 메티오닌, 0.20 g L^-1 류신, 및 0.57 g L^-1 시트레이트의 초기 농도를 갖는 50 ㎖ 배플 진탕 플라스크 내의 6 ㎖ 최소배지에 접종하였다. 탄소 공급원으로서 70 mM 글루코즈 또는 80 mM 프럭토즈를 각각 첨가하였다. 세포는 HPLC 분석에 의해서 체크한 것으로 필수 아미노산이 고갈될 때까지 성장시켰다. 성장기의 종료시에 세포를 수거하여 멸균 NaCl (0.9％)로 세척하였다. 이어서, 이들을 라이신 생성조건 하에서 대사 플럭스 (metabolic flux) 분석을 위해 25 ㎖ 배플 진탕 플라스크 내에서 4 ㎖ 최소 추적배지 (tracer medium)에 옮겼다. 추적배지는 트레오닌, 메티오닌, 류신 및 시트레이트 중의 어떤 것도 함유하지 않았다. 각각의 탄소 공급원에 대하여, (i) 40 mM [1-¹³C] 라벨링된 기질, 및 (ii) 20 mM [¹³C₆] 라벨링된 기질 + 20 mM의 천연적으로 라벨링된 기질을 각각 함유하는 2 개의 병렬식 플라스크를 배양하였다. 모든 배양은 30℃ 및 150 rpm에서 회전진탕기 (rotary shaker)(Inova 4230, New Brunswick, Edison, NJ, USA) 상에서 수행되었다.

화학물질. 99％ [1-¹³C] 글루코즈, 99％ [1-¹³C] 프럭토즈, 99％ [¹³C₆] 글루코즈 및 99％ [¹³C₆] 프럭토즈는 캠프로 사이언티픽 (Campro Scientific, Veenendaal, Netherlands)로부터 구입하였다. 효모 추출물 및 트립톤은 디프코 래보래토리즈 (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA)로부터 수득되었다. 그 밖의 적용된 모든 화학물질은 각각 시그마 (Sigma, St. Louis, MI, USA), 머크 (Merck, Darmstadt, Germany) 또는 플루카 (Fluka, Buchs, Switzerland)로부터 분석용 등급으로 입수되었다.

기질 및 생성물 분석. 세포 농도는 광도계 (Marsha Pharmacia biotech, Freiburg, Germany)를 사용하여 660 ㎚에서의 세포밀도 (OD_{660 ㎚})의 측정에 의해서, 또는 중량측정에 의해서 측정되었다. 후자는 10 ㎖의 세포를 배양 브로스로부터 3700 g으로 10분 동안 실온에서 수거하고, 물에 의한 세척단계를 포함시킴으로써 측정되었다. 세척된 세포는 항량이 될 때까지 80℃에서 건조시켰다. 건조세포 건조 질량과 OD_{660 ㎚} 사이의 상관인자 (correlation factor)는 0.353으로 측정되었다.

세포외 기질 및 생성물의 농도는 16000 g에서 3분 원심단리함으로써 수득된 배양 상등액에서 측정되었다. 프럭토즈, 글루코즈, 슈크로즈 및 트레할로즈는 옥심 트리메틸실릴 유도체로 유도체화시킨 후에 GC에 의해서 정량분석하였다. 이러한 목적으로, HP 5MS 칼럼 (5％ 페닐-메틸-실옥산-디페닐디메틸폴리실옥산, 30 m×250 ㎛, Hewlett Packard, Paolo Alto, CA, USA), 및 70 eV에서 전자충격 이온화가 있는 사중극자 질량 선택적 검출기 (quadrupole mass selective detector)를 갖는 HP 6890 가스 크로마토그라프 (Hewlett Packard, Palo Alto, USA)가 적용되었다. 샘플 제조는 배양 상등액의 동결건조, 피리딘에 용해, 및 이어서 하이드록실아민 및 (트리메틸실릴(트리플루오로아세트아미드 (BSTFA)에 의한 당의 2-단계 유도체화를 포함하였다 (Macherey & Nagel, Duren, Germany). β-D-리보즈가 정량분석을 위한 내부 표준물로 사용되었다. 주입된 샘플 부피는 0.2 ㎕였다. GC 분석을 위한 시간 프로그램은 다음과 같았다: 150℃ (0-5 분), 8℃ 분^-1 (5-25 분), 310℃ (25-35 분). 캐리어 가스로는 1.5 l 분^-1로 헬륨이 사용되었다. 유입 온도는 310℃였으며, 검출기 온도는 320℃였다. 아세테이트, 락테이트, 피루베이트, 2-옥소글루타레이트 및 디하이드록시아세톤은 이동상으로 4 mM 황산을 0.8 ㎖ 분^-1의 유속으로 사용하고 210 ㎚에서 UV-검출하는 아미넥스 (Aminex)-HPX-87H 바이오래드 칼럼 (Biorad Column)(300×7.8 ㎜, Hercules, CA, USA)을 이용한 HPLC에 의해서 측정되었다. 글리세롤은 효소적 측정 (Boehringer, Mannheim, Germany)에 의해서 정량되었다. 아미노산은 조르박스 (Zorbax) 에클립스 (Eclypse)-AAA 칼럼 (150×4.6 ㎜, 5 ㎛, Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)을 이용하여 2 ㎖ 분^-1의 유속으로 자동화된 온라인 유도체화 (o-프탈디알데히드-3-머캅토프로피온산) 및 형광 검출을 하는 HPLC (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)에 의해서 분석되었다. 상세한 사항은 사용설명서에 제시되어 있다. α-아미노 부티레이트가 정량분석을 위한 내부 표준물로 사용되었다.

¹³ C 라벨링 분석. 배양 상등액에서 라이신과 트레할로즈의 라벨링 패턴은 GC-MS에 의해서 정량되었다. 이에 의하여, 단일 질량 이소토포머 (single mass isotopomer) 분획을 측정하였다. 현재의 작업에서, 이들은 M₀ (비-라벨링된 질량 이소토포머 분획의 상대적 양), M₁ (단일 라벨링된 질량 이소토포머 분획의 상대적 양) 및 더 고급 라벨링에 대한 상응하는 용어로 정의된다. 라이신의 GC-MS 분석은 전술한 바와 같이 t-부틸-디메틸실릴 (TBDMS) 유도체로 전환시킨 후에 수행되었다 (Rubino, F.M. 1989, J. Chromatogr. 473:125-133). 질량 이소토포머 분포의 정량분석은 이온 클러스터 (ion cluster) m/z 431-437에 대하여 선택적 이온 모니터링 (SIM) 모드로 수행되었다. 이러한 이온 클러스터는 유도체화 잔기로부터 t-부틸기의 상실에 의해서 형성된 단편 이온 (fragment ion)에 상응하며, 따라서 라이신의 완전한 탄소 골격을 포함한다 (Wittmann, C., M. Hans and E. Heinzle. 2002. Analytical Biochem. 307:379-382). 트레할로즈의 라벨링 패턴은 전술한 바와 같이 트리메틸실릴 (TMS) 유도체로부터 측정되었다 (Wittmann, C., H.M. Kim and E. Heinzle. 2003. Metabolic flux anlysis at miniaturized scle. submitted). 트레할로즈의 라벨링 패턴은 트레할로즈의 전체 단량체 단위 및 따라서 글루코즈-6-포스페이트의 탄소 골격과 동등한 탄소 골격을 함유한 단편 이온에 상응하는 m/z 361-367에서 이온 클러스터를 통해서 평가되었다. 모든 샘플은 우선, 분석된 생성물과 다른 샘플 성분 사이의 동중 간섭 (isobaric interference)을 배제하고 이들에 의한 스캔 모드 (scan mode)로 측정되었다. SIM에 의한 모든 측정은 이중으로 수행되었다. 프럭토즈 상에서의 추적실험에서 단일 질량 이소토포머 분획의 실험적 오차는 각각 [1-¹³C] 프럭토즈 상에서 라이신에 대하여 0.85％ (M₀), 0.16％ (M₁), 0.27％ (M₂), 0.35％ (M₃), 0.45％ (M₄), [1-¹³C] 프럭토즈 상에서 트레할로즈에 대하여 0.87％ (M₀), 0.19％ (M₁), 0.44％ (M₂), 0.45％ (M₃), 0.88％ (M₄), 및 50％ [¹³C₆] 프럭토즈 상에서 트레할로즈에 대하여 0.44％ (M₀), 0.54％ (M₁), 0.34％ (M₂), 0.34％ (M₃), 0.19％ (M₄), 0.14％ (M₅) 및 0.52％ (M₆)였다. 글루코즈 추적실험에서 MS 측정의 실험적 오차는 각각 [1-¹³C] 글루코즈 상에서 라이신에 대하여 0.47％ (M₀), 0.44％ (M₁), 0.21％ (M₂), 0.26％ (M₃), 0.77％ (M₄), [1-¹³C] 글루코즈 상에서 트레할로즈에 대하여 0.71％ (M₀), 0.85％ (M₁), 0.17％ (M₂), 0.32％ (M₃), 0.46％ (M₄), 및 50％ [¹³C₆] 글루코즈 상에서 트레할로즈에 대하여 1.29％ (M₀), 0.50％ (M₁), 0.83％ (M₂), 0.84％ (M₃), 1.71％ (M₄), 1.84％ (M₅) 및 0.58％ (M₆)였다.

대사 모델링 및 파라메터 평가. 모든 대사 모의실험은 개인용 컴퓨터 상에서 수행되었다. 라이신-생성 코리네박테리움 글루타미쿰의 대사 네트워크는 Matlab 6.1 및 Simulink 3.0 (Mathworks, Inc., Natick, MA USA)에서 임플리멘트되었다. 소프트웨어 임플리멘테이션 (implementation)은 네트워크에서 ¹³C 라벨링 분포를 계산하기 위하여 Simulink에 이소토포머 모델을 포함하였다. 파라메터 평가를 위해서, 이소토포머 모델은 Matlab에서 반복적인 최적화 알고리듬과 짝을 이루었다. 적용된 컴퓨터 도구에 대한 상세한 사항은 위트만 (Wittmann)과 하인츨레 (Heinzle)에 의해서 제시되었다 (Wittmann, C. and E. Heinzle. 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68:5843-5859).

대사 네트워크는 이전의 작업을 기초로 하였으며, 해당반응, 펜토즈 포스페이트 경로 (PPP), 트리카복실산 (TCA) 사이클, 피루베이트의 보전성 (anaplerotic) 카복실화, 라이신 및 그 밖의 분비된 생성물의 생합성 (표 1), 및 중간 전구체로부터 바이오매스 (biomass)로의 동화성 플럭스 (anabolic flux)를 포함하였다. 또한, 글루코즈 및 프럭토즈에 대한 흡수 (uptake) 시스템이 대신으로 임플리멘트되었다. 글루코즈의 흡수는 PTS를 통한 글루코즈 6-포스페이트로의 포스포릴화를 포 함하였다 (Ohnishi, J., S. Mitsuhashi, M. Hayashi, S. Ando, H. Yokoi, K. Ochiai and M.A. Ikeda. 2002. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58:217-223). 프럭토즈의 경우에는 두개의 흡수 시스템이 고려되었다: 각각 (i)PTS_프럭토즈에 의한 흡수 및 프럭토즈 1-포스페이트를 경유한 프럭토즈의 프럭토즈 1,6-비스포스페이트로의 전환, 및 (ii) 프럭토즈 6-포스페이트로 유도하는 PTS_만노즈에 의한 흡수 (Dominguez, H., C. Rollin, A. Guyonvarch, J.L. Guerquin-Kern, M. Cocaign-Bousquet and N.D. Lindley. 1998. Eur. J. Biochem. 254:96-102). 또한, 프럭토즈-1,6-비스포스페이트를 모델에 임플리멘트시켜 상부 해당작용에서 양방향으로 탄소 플럭스를 허용하였다. 가역적인 것으로 간주되는 반응은 PPP에서 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제였다. 추가로, 글루코즈 6-포스페이트 이소머라제는 글루코즈 상에서의 실험에 대해서 가역적인 것으로 생각되었으며, 이에 의해서 트레할로즈 라벨링은 이 효소의 가역성에 민감하게 영향을 미쳤다. 반대로, 글루코즈 6-포스페이트 이소머라제의 가역성은 프럭토즈 상에서는 측정될 수 없었다. 프럭토즈-성장된 세포에서는, 글루코즈 6-포스페이트가 프럭토즈 6-포스페이트로부터 독점적으로 형성되어 두개의 프로토콜에 대하여 동일한 라벨링 패턴을 유도한다. 따라서, 가역적인 글루코즈 6-포스페이트 이소머라제에 의한 글루코즈 6-포스페이트와 프럭토즈 6-포스페이트 사이의 상호전환은 글루코즈 6-포스페이트 이소머라제 가역성의 평가를 위해서 사용될 수 있는 라벨링 차이를 제공하지 않는다. 라이신과 트레할로즈의 측정된 라벨링은 (i) 포스포에놀피루베이트/피루베이트 및 말레이트/옥살로아세테 이트의 럼프 풀 (lumped pool) 사이의 플럭스의 가역성 및 (ii) TCA 사이클에서 말레이트 데하이드로게나제 및 푸마레이트 하이드라타제의 가역성에 대하여 민감하지 않다. 따라서, 이들 반응은 비가역적인 것으로 간주되었다. 이들 플럭스 파라메터에 대해 민감한, 천연적 라벨링 및 [¹³C₆] 라벨링 기질의 혼합물로부터의 알라닌의 라벨링은 본 시험에서 이용할 수 없었다. 이전의 결과들을 기초로 하여 글리옥실레이트 경로는 불활성인 것으로 추정되었다 (Wittmann, C. and E. Heinzle. 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68:5843-5859).

분비된 라이신과 트레할로즈의 질량 분광적 라벨링 데이타와 함께 코리네박테리움 글루타미쿰의 성장, 생성물 형성 및 바이오매스 조성에 대한 화학량론적 데이타를 사용하여 대사성 플럭스 분포를 계산하였다. 두가지 병행 실험의 라이신 및 트레할로즈의 실험적 (M_{i , exp}) 및 모의 (M_{i , calc}) 질량 이소토포머 분획 상의 최소 편차를 제공하는 플럭스의 셋트가 세포내 플럭스 분포에 대한 최상의 평가치로서 채택되었다. 부록에 기술된 바와 같이, 글루코즈-성장 및 프럭토즈-성장 세포의 두개의 네트워크가 되풀이하여 측정되었다. 따라서, 최소 자승방법이 가능하였다. 오차 기준으로는 최소 자승의 가중된 합계가 사용되었으며, 여기에서 S_{i , exp}는 측정치의 표준편차이다 (수학식 1).

다수의 파라메터 초기설정을 적용하여 수득된 플럭스 분포가 포괄적인 최적값을 나타내었는지 여부를 조사하였다. 모든 균주에 대하여, 라이신 생산 중의 글루코즈 흡수 플럭스를 100％로 설정하였으며, 네트워크의 다른 플럭스는 글루코즈 흡수 플럭스에 대해 표준화된 상대적 몰 플럭스로 제시된다.

통계학적 평가. 수득된 대사성 플럭스의 통계학적 평가는 이미 기술된 바와 같이 몬테-카를로 방법 (Monte-Carlo approach)에 의해서 수행되었다 (Wittmann, C. and E. Heinzle. 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68:5843-5859). 각각의 균주에 대하여, 통계학적 분석은 100 회의 파라메터 평가작업에 의해서 수행되었으며, 이렇게 함으로써 측정된 질량 이소토포머 비율 및 측정된 플럭스를 포함한 실험적 데이타는 통계학적으로 변화되었다. 수득된 데이타로부터 단일 파라메터에 대한 90％ 신뢰한계가 계산되었다.

실시예 1: 프럭토즈 및 글루코즈 상에서 코리네박테리움 글루타미쿰에 의한 라이신 생산

라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰의 대사성 플럭스는 글루코즈 및 프럭토즈 상에서의 비교 배취 배양에서 분석되었다. 이러한 목적으로, 전-성장된 세포를 추적배지에 옮겨서 약 5 시간 동안 배양하였다. 추적실험의 시작 및 종 료시에 기질 및 생성물의 분석은 두가지 탄소 공급원 사이의 현저한 차이를 나타내었다. 전체적으로 11.1 mM 라이신이 글루코즈 상에서 생산되었으며, 그 반면에 프럭토즈 상에서는 단지 8.6 mM의 낮은 농도가 수득되었다. 5 시간에 걸친 배양 중에, 세포 농도는 3.9 g L-1으로부터 6.0 g L-1로 (글루코즈), 및 3.5 g L-1으로부터 4.4 g L-1로 (프럭토즈) 증가하였다. 트레오닌과 메티오닌이 배지 내에 존재하지 않았다는 사실로 인하여, 내부 공급원은 아마도 바이오매스 합성을 위한 세포에 의해서 이용되었다. 평균 특이적 당 흡수율은 글루코즈 (1.71 mmol g-1 h-1)에 비해서 프럭토즈 (1.93 mmol g-1 h-1) 상에서 더 높았다. 표 1에 도시한 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21526의 수득된 수율은 프럭토즈와 글루코즈 상에서 현저하게 상이하였다. 이것은 주생성물 라이신과 다양한 부산물을 포함하였다. 라이신에 관하여 프럭토즈 상에서의 수율은 244 mmol mol-1이었으며, 따라서 글루코즈 상에서의 수율 (281 mmol mol-1)에 비해서 더 낮았다. 추가로, 탄소 공급원은 글루코즈에 비해서 프럭토즈 상에서 거의 50％까지 감소된 바이오매스 수율에 대하여 현저한 영향을 가졌다. 부산물 형성에 대한 탄소 공급원의 가장 유의적인 영향은 디하이드록시아세톤, 글리세롤 및 락테이트에 대해서 관찰되었다. 프럭토즈 상에서, 이들 부산물의 축적은 강력하게 증가되었다. 글리세롤에 대한 수율은 10 배 더 컸으며, 그 반면에 디하이드록시아세톤 및 락테이트 분비는 6의 인수까지 증가하였다. 디하이드록시아세톤은 프럭토즈 상에서의 주된 부산물이었다. 더 낮은 바이오매스 수율로 인하여, 프럭토즈-성장된 세포의 경우에는 동화성 전구체에 대한 수요가 현저하게 감소하였다 (표 2).

글루코즈 (왼쪽) 및 프럭토즈 (오른쪽)로부터 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21526에 의한 라이신 생산의 단계에서 바이오매스 및 대사산물 [실험적 수율은 (i) 40 mM [1-¹³C] 라벨링된 기질 및 (ii) 20 mM [¹³C₆] 라벨링 기질 + 20 mM 천연적으로 라벨링된 기질 상에서의 두개의 병렬식 배양의 평균값과 두개의 배양 사이의 상응하는 편차이다. 모든 수율은 (건조 바이오매스의 ㎎)(mmol)^-1로 제시된 바이오매스에 대한 수율을 제외하고는 (mmol 생성물)(mol)^-1로 제시된다].

수율	글루코즈 상에서의 라이신 생산	프럭토즈 상에서의 라이신 생산
바이오매스	54.1±0.8	28.5±0.0
라이신	281.0±2.0	244.4±23.3
발린	0.1±0.0	0.0±0.0
알라닌	0.1±0.0	0.4±0.1
글리신	6.6±0.0	7.1±0.4
디하이드록시아세톤	26.3±15.3	156.6±25.8
글리세롤	3.8±2.4	38.4±3.9
트레할로즈	3.3±0.5	0.9±0.1
α-케토글루타레이트	1.6±0.4	6.5±0.3
아세테이트	45.1±0.3	36.2±5.7
피루베이트	1.2±0.4	2.1±0.5
락테이트	7.1±1.7	38.3±3.5

글루코즈 (왼쪽) 및 프럭토즈 (오른쪽)로부터 라이신 생산의 단계에서 세포내 대사산물에 대한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21526의 동화성 수요 [실험적 데이타는 (i) [1-¹³C] 라벨링된 기질 및 (ii) 천연적으로 라벨링된 기질과 [¹³C₆] 기질의 1:1 혼합물 상에서의 두개의 병렬식 배양의 평균값과 두개의 배양 사이의 상응하는 편차이다].

전구체 수요* mmol (mol 글루코즈)-1	글루코즈 상에서의 라이신 생산	프럭토즈 상에서의 라이신 생산
글루코즈 6-포스페이트	11.09±0.16	5.84±0.05
프럭토즈 6-포스페이트	3.84±0.06	2.02±0.02
펜토즈 5-포스페이트	47.50±0.70	25.05±0.21
에리트로즈 4-포스페이트	14.50±0.22	7.64±0.06
글리세르알데히드 3-포스페이트	6.98±0.10	3.68±0.03
3-포스포글리세레이트	59.95±0.89	36.85±0.31
피루베이트/포스포에놀피루베이트	107.80±1.60	56.80±0.48
α-케토글루타레이트	92.51±1.37	48.73±0.41
옥살로아세테이트	48.91±0.72	45.76±0.38
아세틸 CoA	135.30±2.00	71.25±0.60
디아미노피멜레이트+라이신**	18.83±0.28	9.92±0.08
*) 전구체 수요의 평가는 각각의 균주에 대해 수득된 실험적 바이오매스 수율 (표 1) 및 코리네박테리움 글루타미쿰에 대해서 이미 측정된 바이오매스 조성을 기초로 하였다 (Marx, A., A.A. de Gaaf, W. Wiechert, L. Eggeling and H. Sahm. 1996. Biotechnol. Bioeng. 49:111-129). **) 디아미노피멜레이트 및 라이신은 별개의 동화성 전구체로 간주된다. 이것은 피루베이트 및 옥살로아세테이트로부터 디아미노피멜레이트 (세포벽) 및 라이신 (단백질)으로의 동화성 플럭스가 라이신 분비의 플럭스 이외에도 라이신 생합성 경로를 통한 전반적 플럭스에도 기여한다는 사실에 기인한다.

실시예 II : 추적실험에서 ¹³ C- 라벨링 파트너의 수동적 검사

분비된 라이신 및 트레할로즈의 상대적 질량 이소토포머 분획은 GC-MS에 의해서 정량분석되었다. 이들 질량 이소토포머 분획은 세포내 플럭스에 대해서 민감하며, 따라서 조사한 생물학적 시스템의 플럭솜 (fluxome)에 대한 핑거프린트 (fingerprint)를 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 분비된 라이신과 트레할로즈의 라벨링 패턴은 코리네박테리움 글루타미쿰의 글루코즈 및 프럭토즈-생성된 세포 사이에서 현저하게 달랐다. 차이는 적용된 추적 라벨링 둘 다에 대해서, 및 측정된 생성물 둘 다에 대해서 나타났다. 이것은 적용된 탄소 공급원에 따른 탄소 플럭스 패턴에서의 상당한 차이를 시사한다. 이미 나타낸 바와 같이, [1-¹³C] 및 [¹³C₆] 글루코즈의 혼합물 상에서의 코리네박테리움 글루타미쿰의 두개의 병렬식 배양으로부터 수득한 질량 이소토포머 분획은 거의 동일하였다 (Wittmann, C., H.M. Kim and E. Heinzle. 2003. Metabolic flux analysis at miniaturized scale. submitted). 따라서, 관찰된 차이는 대사성 플럭스에서의 기질 특이적인 차이와 명백하게 연관될 수 있다.

실시예 III : 세포내 플럭스의 평가

수행된 시험의 중추적인 논점은 각각 탄소 공급원으로서 글루코즈 및 프럭토즈 상에서의 라이신 생산 중에 코리네박테리움 글루타미쿰의 세포내 플럭스의 비교 조사였다. 이러한 목적으로, 추적실험으로부터 수득된 실험적 데이타를 사용하여 상술한 바와 같은 플럭스 평가 소프트웨어를 적용한 각각의 기질에 대한 대사성 플럭스 분포를 계산하였다. 파라메터 평가는 실험적 및 계산된 질량 이소토포머 분획 사이의 편차를 최소화시킴으로써 수행되었다. 수행된 방법은 각각의 최적화 단계 중에 대사산물 밸런싱 (balancing)을 이용하였다. 이것은 (i) 생성물 분비에 대한 화학량론적 데이타 (표 2) 및 (ii) 바이오매스 전구체에 대한 동화성 수요에 대한 화학량론적 데이타 (표 3)을 포함하였다. 실험적 라벨링 패턴과 모의 라벨링 패턴 사이의 최소 편차를 제공하는 세포내 플럭스의 셋트는 세포내 플럭스 분포에 대한 최상의 평가로 채택되었다. 두가지 시나리오 모두의 경우에, 동일한 플럭스 분포가 다수의 초기설정 값에 의해서 수득되었으며, 이것은 전역적 최소점 (global minima)이 확인되었음을 시사한다. 명백하게, 실험적으로 측정 및 계산된 질량 이소토포머 비율 사이의 우수한 합치가 수득되었다 (표 4).

실시예 IV : 라이신 생산 중에 프럭토즈 및 글루코즈 상에서의 대사성 플럭스

글루코즈 및 프럭토즈 상에서 라이신-생성 코리네박테리움 글루타미쿰에 대해 수득된 세포내 플럭스 분포는 도 4, 5에 나타내었다. 명백하게, 세포내 플럭스는 적용된 탄소 공급원에 따라서 엄청난 차이를 나타내었다. 글루코즈 상에서는 탄소 플럭스의 62％가 PPP 쪽으로 지시되었으며, 그 반면에 단지 36％ 만이 해당적 체인을 통해서 유동하였다 (도 4). 이것으로 인하여, 비교적 큰 양인 124％ NADPH가 PPP 효소인 글루코즈 6-포스페이트 데하이드로게나제 및 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제에 의해서 생성되었다. 프럭토즈 상에서의 상황은 완전히 상이하였다 (도 5). 수행된 플럭스 분석은 프럭토즈의 흡수에 대한 두가지 PTS의 생체내 활성을 밝혀내었으며, 이에 의해서 프럭토즈의 92.3％가 프럭토즈 특이적 PTS_프럭토즈에 의해서 흡수되었다. 프럭토즈의 7.7％의 비교적 작은 분획이 PTS_만노즈에 의해서 흡수되었다. 따라서, 대부분의 프럭토즈는 프럭토즈 1,6-비스포스파타제의 수준에서 해당작용에 들어갔으며, 그 반면에 단지 작은 분획이 해당적 체인 내로 프럭토즈 6-포스페이트에서 상류로 보내졌다. 글루코즈-성장된 세포에 비해서 PPP는 단지 14.4％의 현격하게 감소된 활성을 나타내었다. 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제는 두가지 탄소 공급원 상에서 반대 방향으로 작용하였다. 글루코즈-성장된 세포에서 36.2％의 순플럭스 (net flux)는 글루코즈 6-포스페이트로부터 프럭토즈 6-포스페이트로 향하게 되었으며, 반면에 15.2％의 역 순플럭스가 프럭토즈 상에서 관찰되었다.

프럭토즈 상에서, 글루코즈 6-포스페이트 이소머라제 및 PPP를 통한 플럭스는 PTS_만노즈를 통한 플럭스의 약 2배로 더 컸다. 그러나, 이것은 PPP 쪽으로 여분의 탄소 플럭스를 공급할 수 있는 프럭토즈 1,6-비스포스파타제로부터 프럭토즈 6-포스페이트로의 탄소의 당신생성 플럭스에 기인하는 것은 아니었다. 실제로, 이러한 반응을 촉진시키는 프럭토즈 1,6-비스포스파타제를 통한 플럭스는 0이었다. PPP 쪽으로의 추가의 플럭스의 원인이 되는 대사성 반응은 PPP에서 가역성 효소 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제이다. 이러한 추가의 플럭스의 약 3.5％는 PPP로부터의 탄소 스테밍 (stemming)을 이 경로로 다시 재순환시키는 트랜스케톨라제 2에 의해서 공급되었다. 또한, 플럭스의 4.2％는 트랜스알돌라제의 작용에 의해서 프럭토즈 6-포스페이트 및 PPP 쪽으로 향하였다.

탄소 공급원에 따라, 라이신 생성 코리네박테리움 글루타미쿰에서 완전히 상이한 플럭스 패턴이 또한 피루베이트 노드 (node) 주위에서 관찰되었다 (도 4, 5). 글루코즈 상에서, 라이신 경로 내로의 플럭스는 30.0％였으며, 반면에 25.4％의 감소된 플럭스가 프럭토즈 상에서 확인되었다. 프럭토즈에 비해서 글루코즈 상에서 증가된 라이신 수율이 이러한 플럭스 차리에 대한 주된 이유이지만, 세포벽 합성을 위한 디아미노피멜레이트 및 단백질 합성을 위한 라이신에 대한 더 큰 수요를 야기하는 더 큰 바이오매스 수율도 또한 이것에 기여한다. 글루코즈 상에서의 보전성 플럭스는 44.5％였으며, 따라서 프럭토즈 에서의 플럭스 (33.5％)에 비해서 뚜렷하게 더 컸다. 이것은 주로 라이신 생산을 위한 옥살로아세테이트에 대한 더 큰 수요뿐만 아니라, 또한 글루코즈 상에서의 옥살로아세테이트 및 2-옥소글루타레이트에 대한 더 큰 동화성 수요에 기인하는 것이다. 다른 한편으로, 피루베이트 데하이드로게나제를 통한 플럭스는 프럭토즈 (95.2％)에 비해서 글루코즈 (70.9％) 상에서 상당히 더 낮았다. TCA 사이클 내로의 이러한 감소된 탄소 플럭스는 글루코즈 상에서 TCA 사이클 효소를 통한 30％ 이상의 감소된 플럭스를 제공하였다 (도 3, 4).

몬테-카를로 방법에 의한 수득된 플럭스의 통계학적 평가를 사용하여 측정된 플럭스 파라메터에 대한 90％ 신뢰구간을 계산하였다. 표 5에서 다양한 주요 플럭스에 대해서 나타낸 바와 같이, 신뢰구간은 일반적으로 좁았다. 예로서, 글루코즈 6-포스페이트 데하이드로게나제를 통한 플럭스에 대한 신뢰구간은 글루코즈-성장 세포의 경우에는 단지 1.2％이고 프럭토즈-성장 세포의 경우에는 3.5％였다. 따라서, 선택된 방법은 정확한 플럭스 평가를 가능하게 하였다. 글루코즈 및 프럭토즈 상에서 각각 관찰된 플럭스 차이는 명백히 적용된 탄소 공급원에 의해서 야기되는 것으로 결론을 내릴 수 있다.

프럭토즈 상에서 1.93 mmol g^-1 h^-1의 평균 특이적 기질 흡수는 글루코즈 상에서 확인된 1.77 mmol g^-1 h^-1의 평균 특이적 기질 흡수보다 약간 더 컸다는 것을 알 수 있었다. 이것으로 인하여 mmol g^-1 h^{- 1}으로 표현된 절대 세포내 플럭스는 상술한 상대적 플럭스에 비해서 글루코즈에 관하여 약간 증가한다. 그러나, 프럭토즈 및 글루코즈 각각 상에서 라이신 생성 코리네박테리움 글루타미쿰의 플럭스 분포는 상기에서 도출된 모든 비교가 절대 탄소 플럭스에 대해서도 유지되도록 완전히 상이하였다.

질량 분광법과 대사산물 밸런싱에 의한 ¹³C 추적시험으로 측정된 프럭토즈 (왼쪽) 및 글루코즈 (오른쪽) 상에서 성장시킨 라이신-생성 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21526의 대사성 플럭스의 통계학적 평가: 주요 플럭스 파라메터의 90％ 신뢰구간은 통계학적으로 변화된 실험적 데이타를 갖는 각각의 기질에 대한 100회의 독립적인 파라메터 평가 수행을 포함하는 몬테-카를로 방법에 의해서 수득되었다.

플럭스 파라메터	글루코즈	프럭토즈
순플럭스
PTSFrc에 의한 프럭토즈 흡수	-	[ 90.0 96.1]
PTSMan에 의한 프럭토즈 흡수	-	[ 3.9 10.0]
글루코즈 6-포스페이트 이소머라제	[ 35.7 36.8]	[ 13.4 16.9]
포스포프럭토키나제	[ 35.7 36.8]	-
프럭토즈 1,6-비스포스파타제*	-	[ -2.1 3.4]
프럭토즈 1,6-비스포스파타제 알돌라제	[ 73.7 73.8]	[ 91.7 92.9]
글루코즈 6-포스페이트 데하이드로게나제	[ 62.5 63.7]	[ 12.6 16.1]
트랜스알돌라제	[ 19.4 19.8]	[ 3.6 4.1]
트랜스케톨라제 1	[ 19.4 19.8]	[ 3.6 4.1]
트랜스케톨라제 2	[ 17.9 18.3]	[ 2.9 4.0]
글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이로게나제	[158.1 164.5]	[163.3 174.6]
피루베이트 키나제	[156.2 167.4]	[158.9 168.2]
피루베이트 데하이드로게나제	[ 69.5 72.5]	[ 87.1 102.3]
피루베이트 카복실라제	[ 43.7 44.8]	[ 29.9 37.3]
시트레이트 신타제	[ 51.2 54.8]	[ 76.5 91.5]
이소시트레이트 데하이드로게나제	[ 51.2 54.8]	[ 76.5 91.5]
옥소글루타레이트 데하이드로게나제	[ 41.6 45.6]	[ 70.9 86.0]
아스파르토키나제	[ 29.6 30.3]	[ 21.8 29.2]
플럭스 가역성 **
글루코즈 6-포스페이트 이소머라제	[ 4.5 5.1]
트랜스알돌라제	[ 4.3 4.9]	[ 14.5 18.2]
트랜스케톨라제 1	[ 0.0 0.0]	[ 0.0 0.1]
트랜스케톨라제 2	[ 0.4 0.6]	[ 0.0 0.1]
* 하한 신뢰경계에 대한 네가티브 플럭스는 (포스포프럭토키나제를 통해서) 역방향으로 포지티브 플럭스에 대해 동등하다. ** 플럭스 가역성은 순플럭스에 대한 역플럭스의 비로서 정의된다.

실시예 I- IV 의 고찰:

A. 기질 특이적 배양특성

각각 프럭토즈 및 글루코즈 상에서 라이신-생성 코리네박테리움 글루타미쿰의 배양은 성장 및 생성물 형성은 이용된 탄소 공급원에 따라 강력하게 좌우되는 것으로 밝혀졌다. 프럭토즈 상에서 유의적으로 감소된 라이신 및 바이오매스의 수율은 또한, 이미 코리네박테리움 글루타미쿰의 또 다른 균주에 대해서도 보고되었으며, 여기에서는 라이신 및 바이오매스 수율이 글루코즈에 비해서 각각 30％ 및 20％ 더 적었다 (Kiefer, P., E. Heinzle and C. Wittmann. 2002. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 28:338-43). 프럭토즈 상에서 코리네박테리움 글루타미쿰 및 코리네박테리움 멜라시콜라 (C. melassecola)의 배양은 글루코즈에 비해서 더 높은 이산화탄소 생성률과 연관된다 (Dominguez, H., C. Rollin, A. Guyonvarch, J.L. Guerquin-Kern, M. Cocaign-Bousquet and N.D. Lindley. 1998. Eur. J. Biochem. 254:96-102; Kiefer, P., E. Heinzle and C. Wittmann. 2002. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 28:338-43). 이것은 이 탄소 공급원에 대한 본 작업에서 관찰된 TCA 사이클을 통한 증가된 플럭스와 일치한다. 기질 특이적 차이는 또한, 부산물에 대해서도 관찰되었다. 트레할로즈의 형성은 글루코즈에 비해서 프럭토즈 상에서 더 낮았다. 이것은 해당작용에 대한 글루코즈 및 프럭토즈의 상이한 도입점과 연관될 수 있다 (Kiefer, P., E. Heinzle and C. Wittmann. 2002. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 28:338-43). 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 흡수 시스템을 고려하여, 글루코즈의 이용은 트레할로즈 전구체인 글루코즈 6-포스페이트의 형성을 유도하는 반면에, 프럭토즈는 프럭토즈 1,6-비스포스파타제로 전환됨으로써 글루코즈 6-포스페이트로부터 하류의 중추대사 (central metabolism)에 들어간다 (Dominguez, H., C. Rollin, A. Guyonvarch, J.L. Guerquin-Kern, M. Cocaign-Bousquet and N.D. Lindley. 1998. Eur. J. Biochem. 254:96-102). 프럭토즈가 탄소 공급원으로 적용되는 경우에, 디하이드록시아세톤, 글리세롤 및 락테이트와 같은 다른 부산물이 강력하게 증가되었다. 라이신 생산의 관점에서, 이것은 바람직하지 않은데, 이는 탄소의 상당한 분획이 중추대사로부터 형성된 부산물로 회수되기 때문이다. 프럭토즈 상에서의 특이적 기질 흡수 (1.93 mmol g^-1 h^-1)는 글루코즈 상에서의 흡수 (1.77 mmol g^-1 h^-1)보다 더 컸다. 이 결과는 프럭토즈 및 글루코즈 상에서 유사한 특이적 흡수율이 관찰된, 기하급수적으로 성장하는 코리네박테리움 멜라시콜라 ATCC 17965 상에서의 이전의 시험 (Dominguez, H., C. Rollin, A. Guyonvarch, J.L. Guerquin-Kern, M. Cocaign-Bousquet and N.D. Lindley. 1998. Eur. J. Biochem. 254:96-102)과는 상이하다. 본 발명자들의 시험에서 관찰된 프럭토즈에 대한 더 큰 흡수율은 시험한 균주가 상이하다는 사실에 기인하는 것임에 틀림이 없다. 코리네박테리움 말레시콜라 및 콜리네박테리움 글루타미쿰은 동류의 종이지만, 특정의 대사적 특성에 있어서는 다를지 모른다. 본 작업에서 시험한 균주는 고전적인 균주 최적화에 의해서 이전에 유도되었다. 이것은 기질 흡수에 영향을 미치는 돌연변이를 도입시킬 수 있었다. 또 다른 설명은 배양조건에서의 차이이다. 프럭토즈는 제한된 성장 및 라이신 생성의 조건 하에서 더 효과적으로 이용될지 모른다.

B. 대사성 플럭스 분포

글루코즈 및 프럭토즈 상에서 라이신-생성 코리네박테리움 글루타미쿰에 대해서 수득된 세포내 플럭스 분포는 현격한 차이를 나타내었다. 수득된 플럭스의 통계학적 평가는 관찰된 플럭스 차이가 명백하게, 적용된 탄소 공급원에 기인할 수 있도록 좁은 90％ 신뢰구간을 나타내었다. 가장 뚜렷한 차이 중의 하나는 해당작용과 PPP 사이에서의 플럭스 분배에 관한 것이다. 글루코즈 상에서 탄소의 62.3％는 PPP를 통해서 유동하였다. 이 기질 상에서 라이신-생성 코리네박테리움 글루타미쿰의 PPP의 우세함은 상이한 시험에서 이미 관찰되었다 (Marx, A., A.A. de Graaf, W. Wiechert, L. Eggeling and H. Sahm. 1996. Biotechnol. Bioeng. 49:111-129; Wittmann, C. and E. Heinzle. 2001. Eur. J. Biochem. 268:2441-2455; Wittmann, C. and E. Heinzle. 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68:5843-5859). 프럭토즈 상에서 PPP로의 플럭스는 14.4％로 감소하였다. 수행된 대사성 플럭스 분석에 의해서 확인되는 바와 같이, 이것은 주로 프럭토즈 1,6-비스포스타테이트의 수준에서의 프럭토즈의 유입과 프럭토즈 1,6-비스포스파타제의 불활성의 바람직하지 못한 조합으로 인한 것이었다. 관찰된 프럭토즈 1,6-비스포스파타제의 불활성은 각각 프럭토즈 및 글루코즈 상에서의 기하급수적 성장 중에 코리네박테리움 멜라시콜라 ATCC 17965의 효소적 측정과 잘 일치한다 (Dominguez, H., C. Rollin, A. Guyonvarch, J.L. Guerquin-Kern, M. Cocaign-Bousquet and N.D. Lindley. 1998. Eur. J. Biochem. 254:96-102).

놀랍게도, 글루코즈 6-포스페이트 이소머라제와 PPP를 통한 플럭스는 코리네박테리움 글루타미쿰이 프럭토즈 상에서 배양된 경우에 PTS_만노즈를 통한 플럭스보다 대략 2배 정도로 컸다. 프럭토즈 1,6-비스포스파타제의 불활성으로 인하여, 이것은 당신생성 플럭스에 의해서 야기되지 않았다. 실제로, 코리네박테리움 글루타미쿰은 프럭토즈 6-포스페이트, 글루코즈 6-포스페이트 및 리보즈 5-포스페이트를 통한 작동성 대사 사이클을 가지고 있다. PPP로의 추가의 플럭스는 PPP로부터의 탄소 스티밍을 다시 이 경로로 재순환시키는 트랜스케톨라제 2에 의해서, 및 글리세르알데히드 3-포스페이트를 역으로 다시 PPP로 향하도록 하는 트랜스알돌라제의 작용에 의해서 공급되었으며, 이렇게 함으로써 당신생작용을 우회하였다. 이러한 순환적 활성은 세포가 프럭토즈 상에서의 NADPH 제한을 극복하는 것을 도와줄 수 있다. 프럭토즈-성장 코리네박테리움 글루타미쿰의 경우에 글루코즈 6-포스페이트에 도달하는 현저하게 감소된 플럭스는 또한, 이러한 기질 상에서 트레할로즈의 감소된 형성을 설명하는 것이다 (Kiefer, P., E. Heinzle and C. Whittmann. 2002. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 28:338-43). 글루코즈 6-포스페이트 이소머라제는 탄소 공급원에 따라서 반대 방향으로 작동하였다. 글루코즈-성장된 경우에 순플럭스는 글루코즈 6-포스페이트로부터 프럭토즈 6-포스페이트로 향하게 되는 반면에, 반전 순플러스는 프럭토즈 상에서 관찰되었다. 이것은 코리네박테리움 글루타미쿰에서 대사 유연성을 위한 이 효소의 가역성의 중요성을 강조한 것이다.

C. NADPH 대사

다음의 계산들은 프럭토즈 및 글루코즈 상에서의 라이신-생성 코리네박테리움 글루타미쿰의 NADPH 대사의 비교를 제공한다. NADPH의 총괄적인 공급은 글루코즈 6-포스페이트 데하이드로게나제, 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제, 및 이소시트레이트 데하이드로게나제를 통하여 평가된 플럭스로부터 계산되었다. 글루코즈 상에서 PPP 효소 글루코즈 6-포스페이트 데하이드로게나제 (62.0％) 및 글루코즈 6-포스페이트 데하이드로게나제 (62.0％)는 NADPH의 주분획을 제공하였다. 이소시트레이트 데하이드로게나제 (52.9％)는 단지 작은 정도로만 기여하였다. NADPH 공급에 대한 PPP 및 TCA 사이클의 완전히 상이한 기여는 프럭토즈 상에서 관찰되었으며, 여기에서는 이소시트레이트 데하이드로게나제 (83.3％)가 NADPH에 대한 주공급원이었다. 글루코즈 6-포스페이트 데하이드로게나제 (14.4％) 및 글루코즈 6-포스페이트 데하이드로게나제 (14.4％)는 프럭토즈 상에서 훨씬 적은 NADPH을 생성하였다. NADPH는 성장 및 라이신의 형성을 위해서 필요하다. 성장을 위해서 필요한 NADPH는 글루코즈 및 프럭토즈에 대해서 동일한 것으로 추정된 11.51 mmol NADPH (g 바이오매스)^-1의 화학량론적 수요 (Dominguez, H., C. Rollin, A. Guyonvarch, J.L. Guerquin-Kern, M. Cocaign-Bousquet and N.D. Lindley. 1998. Eur. J. Biochem. 254:96-102), 및 본 작업의 실험적 바이오매스 수율 (표 1)로부터 계산되었다. 코리네박테리움 글루타미쿰은 글루코즈 상에서 바이오매스 생성을 위해서 62.3％의 소비하였으며, 이것은 탄소 공급원으로서 프럭토즈 (32.8％)에 비해서 훨씬 더 큰 것이었다. 생성물 합성을 위해서 필요한 NADPH의 양은 평가된 라이신으로의 플럭스 (표 1) 및 4 mol (mol 라이신)^-1의 상응하는 화학량론족 NADPH 수요로부터 결정되었다. 이것은 글루코즈로부터 라이신 생성의 경우에는 112.4％이고, 프럭토즈로부터 라이신 생성의 경우에는 97.6％였다. 글루코즈 상에서 총괄적인 NADPH 공급은 프럭토즈 (112.1％)에 비해서 훨씬 더 컸으며, 이것은 글루코즈 상에서 증가된 PPP 플럭스에 주로 기인할 수 있다. NADPH 밸런스는 글루코즈 상에서 거의 접근하였다. 반대로, 18.3％의 NADPH에 대한 유의적인 겉보기 결핍이 프럭토즈 상에서 관찰되었다. 이것은 상기 언급된 효소 글루코즈 6-포스페이트 데하이드로게나제, 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제 및 이소시트레이트 데하이드로게나제 이외에 NADPH를 공급할 수 있는 대사적 반응을 촉진하는 효소에 대한 의문을 제기하였다. 가능하다고 생각되는 후보물질은 NADPH-의존성 말릭 효소로 보인다. 이미 이 효소의 증가된 특이적 활성은 글루코즈-성장된 세포에 비해서 프럭토즈-성장된 코리네박테리움 멜라시콜라 상에서 검출되었다 (Dominguez, H., C. Rollin, A. Guyonvarch, J.L. Guerquin-Kern, M. Cocaign-Bousquet and N.D. Lindley. 1998. Eur. J. Biochem. 254:96-102). 그러나, 이러한 특정의 효소를 통한 플럭스는 본 작업에서의 실헙적 셋업 (setup)에 의해서 해결될 수 없었다. 누락된 NADPH 생성 효소로 말릭 효소를 가정하여, 18.3％의 플럭스는 명백하게 누락된 NADPH를 공급하는데 충분할 것이다. 탄소 공급원으로 글루코즈에 의한 코리네박테리움 글루타미쿰의 상세한 플럭스 시험은 말릭 효소가 유의적인 활성이 없음을 밝혀내었다 (Petersen, S., A.A. de Graaf, L. Eggeling, M. Mollney, W. Wiechert and H. Sahm. 2000. J. Biol. Chem. 75:35932-35941). 그러나, 프럭토즈 상에서의 상황은 이 효소의 증진된 생체내 활성과 연관될 수도 있을 것이다.

D. NADH 대사

프럭토즈 상에서 코리네박테리움 글루타미쿰은 NADPH 형성 효소의 증가된 활성을 나타내었다. 421.2％ NADPH는 글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제, 피루베이트 데하이드로게나제, 2-옥소글루타레이트 데하이드로게나제, 및 말레이트 데하이드로게나제에 의해 프럭토즈 상에서 형성되었다. 글루코즈 상에서 NADPH 생산은 단지 322,4％였다. 추가로, 동화성 NADH 수요는 글루코즈에 비해서 프럭토즈 상에서 유의적으로 더 낮았다. 감소된 대사성 수요와 결합된 유의적으로 증진된 NADH 생산은 증가된 NADH/NAD 비를 제공할 수 있었다. 코리네박테리움 멜라시콜라의 경우에는 프럭토즈가 글루코즈에 비해서 증가된 NADH/NAD 비를 제공한다는 것은 이미 보고되었다 (Dominguez, H., C. Rollin, A. Guyonvarch, J.L. Guerquin-Kern, M. Cocaign-Bousquet and N.D. Lindley. 1998. Eur. J. Biochem. 254:96-102). 이것은 프럭토즈 상에서의 라이신 생산 중에 NADH 생성 기전에 대한 의문을 제기한다. 프럭토즈-성장된 세포는 디하이드록시아세톤, 글리세롤 및 락테이트의 증진된 분비를 나타내었다. 디하이드록시아세톤 및 글리세롤의 증가된 형성은 당연히 더 큰 NADH/NAD 비가 될 수 있다. NADH는 이미 글리세르알데히드 데하이드로게나제를 억제하는 것으로 나타났으며, 따라서 디하이드록시아세톤과 글리세롤의 과잉유출 (overflow)은 이 효소의 플럭스 용량의 감소와 연관될 수도 있다. 피루베이트로부터 NADPH 수요 락테이트 형성은 글리세롤의 생산과 유사한 백그라운드를 가질 수 있다. 기하급수적 성장에 비해서, 비교적 큰 TCA 사이클 활성 및 감소된 바이오매스 수율을 특징으로 하는 라이신 생성조건 하에서의 NADH 과잉은 더 클 수도 있을 것이다.

E. 프럭토즈 상에서 라이신-생성 코리네박테리움 글루타미쿰의 최적화를 위한 잠재적 표적

수득된 플럭스 패턴을 기초로 하여, 프럭토즈 상에서 코리네박테리움 글루타미쿰에 의한 라이신 생산의 최적화를 위한 몇가지 잠재적인 표적이 고안될 수 있다. 중심점은 NADPH의 공급이다. 프럭토즈 1,6-비스포스파타제가 NADPH의 공급을 증가시키기 위한 하나의 표적이다. 조절해제, 예를 들어, 그의 활성의 증폭은 PPP를 통한 더 큰 플럭스를 유도함으로써 증가된 NADPH 생성 및 증가된 라이신 수율을 제공한다. 프럭토즈 1,6-비스포스파타제의 증폭을 경유하여 PPP를 통한 플럭스의 증가는 또한, 방향족 아미노산 생산에 유익할 수 있다 (Ikeda, M. 2003. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 79:1-36). 프럭토즈 상에서의 성장 중에 프럭토즈 1,6-비스포스파타제의 불활성은 라이신 생산의 관점에서는 유해하지만, 이러한 당신생성 효소는 당 위에서의 성장 중에는 필요하지 않고 아마도 억제되기 때문에 놀라운 것은 아니다. 원핵세포에서, 이 효소는 예를 들어, 프럭토즈 1,6-비스포스파타제, 프럭토즈-2,6-비스포스파타제, 금속 이온 및 AMP에 의한 효율적인 대사성 조절하에 있다 (Skrypal, I.G. and O.V. Iastrebova. 2002. Mikrobiol Z. 64:82-94). 코리네박테리움 글루타미쿰은 아세테이트 상에서 성장할 수 있으며 (Wendisch, V.F., A.A. de Graaf, H. Sahm H. and B. Eikmans), 여기에서 이 효소는 당신생작용을 유지하는데 필수적인 것으로 공지되어 있다. PPP를 통한 플럭스를 증가시키기 위한 또 다른 잠재적 표적은 프럭토즈 흡수를 위한 PTS이다. PTS_프럭토즈 및 PTS_만노즈 사이에서 플럭스 분배의 변형은 더 큰 비율의 프럭토즈를 수득할 수 있었으며, 이것은 프럭토즈 6-포스페이트의 수준에서 유입하여 또한, 증가된 PPP 프럭스를 유도한다. 추가로, 프럭토즈 상에서 NADPH 공급에 아마도 현저하게 기여하는 말릭 효소의 증폭도 관심이 있는 표적이 될 수 있다.

또 다른 장애는 디하이드록시아세톤, 글리세롤 및 락테이트의 강력한 분비를 포함한다. 디하이드록시아세톤 및 글리세롤의 형성은 조절해제, 예를 들어, 상응하는 효소의 결실에 의해서 차단될 수 있다. 디하이드록시아세톤 포스페이트의 디하이드록시아세톤으로의 전환은 상응하는 포스파타제에 의해서 촉진될 수 있다. 그러나, 디하이드록시아세톤 포스파타제는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 아직 주석이 달리지 않았다 (참조: National Center for Biotechnology Information (NCBI) Taxonomy website: http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/). 이 반응은 또한, 키나제, 예를 들어, 락테이트 데하이드로게나제에 의해서 촉진될 수 있다. 현재, 코리네박테리움 글루타미쿰의 지놈 데이타 베이스에서 두가지 엔트리는 디하이드록시아세톤 키나제에 관한 것이다 (참조: National Center for Biotechnology Information (NCBI) Taxonomy website: http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/).

한가지 구체예에서, 상기 유전자 중의 하나 이상의 조절해제는 함께 정밀화학 약품, 예를 들어, 라이신의 생산에 유용하다.

락테이트 분비는 또한, 조절해제, 예를 들어, 락테이트 데하이드로게나제의 녹아웃에 의해서 회피될 수 있다. 글리세롤 및 락테이트 형성은 NADH 재생에 중요할 수 있기 때문에, 유기체의 총괄적인 성능에 부정적인 영향은 그러나 배제될 수 없다. 하부 해당적 체인을 통한 탄소 플럭스가 이미 추측된 바와 같이 글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제의 용량에 의해서 제한되는 경우에 (Dominguez, H., C. Rollin, A. Guyonvarch, J.L. Guerquin-Kern, M. Cocaign-Bousquet and N.D. Lindley. 1998. Eur. J. Biochem. 254:96-102), 디하이드록시아세톤 및 글리세롤 생산의 억제는 결국 프럭토즈 1,6 비스포스파타제의 활성화 및 PPP를 통한 탄소 플럭스의 방향수정 (redirection)을 유도할 수 있었다. 디하이드록시아세톤은 코리네박테리움 글루타미쿰의 배양 중에 이용되지 않으며, 따라서 생성물 합성에 관하여는 소용이 없는 탄소를 나타내는 반면에, 이것은 락테이트의 경우와는 다르다 (Cocaign-Bousquet, M. and N.D. Lindley. 1995. Enz. Microbiol. Technol. 17:260-267).

또한, 슈크로즈는 예를 들어, 본 발명의 방법과 함께 사용되는 코리네박테리움 글루타미쿰에 의해서 라이신 생산을 위한 탄소 공급원으로 유용하다. 슈크로즈는 당밀에서 주된 탄소 공급원이다. 이미 보고된 바와 같이, 슈크로즈의 프럭토즈 단위는 프럭토즈 1,6-비스포스파타제의 수준에서 해당작용에 들어간다 (Dominguez, H. and N.D. Lindley. 1996. Appl. Environ. Microbiol. 62:3878-3880). 따라서, 불활성 프럭토즈 1,6-비스포스파타제를 나타내는 슈크로즈 분자의 이러한 부분은 아마도 PPP 내로 들어가지 않을 것이기 때문에 라이신 생성 균주에서 NADPH 공급은 제한될 수 있었다.

실시예 V: 플라스미드 PCIS LYSC 의 작제

균주 작제의 제 1 단계는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에서 lysC 야생형 유전자의 대립유전자 치환을 필요로 한다. 여기에서는, lysC 유전자에서 뉴클레오타이드 치환이 수행되며, 따라서 생성된 단백질은 311 위치에서 아미노산 Thr이 Ile에 의해서 치환된다. PCR 반응을 위한 주형으로서 ATCC 13032로부터의 염색체성 DNA를 출발물질로 하고, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 서열 3 및 서열 4를 사용하여, lysC는 제조자의 지침에 따라서 Pfu Turbo PCR 시스템 (Stratagene USA)을 이용하여 증폭시킨다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터의 염색체 DNA는 문헌 (Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179 또는 Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828)에 따라 제조된다. 증폭된 단편은 그의 5' 말단에서는 SalI 제한 절단에 의해서, 그리고 그의 3' 말단에서는 MluI 제한 절단에 의해서 플랭킹된다. 클로닝하기 전에, 증폭된 단편을 이들 두가지 제한효소에 의해서 분해시키고, GFX™ PCR DNA 및 젤밴드 정제 키트 (Gel Ban Purification Kin; Amersham Pharmacia, Freiburg)를 사용하여 정제한다.

서열 3

5'-GAGAGAGAGACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATC-3'

서열 4

5'-CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTGC-3'

수득된 폴리뉴클레오타이드를 이하에서 pCIS (서열 5)로 칭하며, 이. 콜라이 (E. coli) XL-1 블루(blue)에서 형질전환시킨 통합된 SacB를 갖는 pCLIK5 MCS에서 SalI 및 MluI 제한 절단을 통해서 클로닝한다. 플라스미드-보유 세포에 대한 선택은 카나마이신 (20 ㎍/㎖)-함유 LB 한천 상에 도말함으로써 수행된다 (Lennox, 1995, Virololy, 1:190). 플라스미드를 단리하여 예상되는 뉴클레오타이드 서열을 서열결정 (sequencing)에 의해서 확인한다. 플라스미드 DNA의 제조는 회사 퀴아겐 (Quiagen)의 방법에 따라서 그의 물질을 사용하여 수행된다. 서열결정 반응은 문헌 (Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467)에 따라서 수행된다. 서열결정 반응은 ABI 프리즘 (Prism) 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt)를 이용하여 단리시키고 분석한다. 수득된 플라스미드 pCIS lysC는 서열 6으로 기록하였다.

실시예 VI : 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 LYSC 유전자의 돌연변이유발

코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 lysC 유전자의 표적화된 돌연변이유발은 제조자의 지침에 따라서 퀵체인지 키트 (QuickChange Kit)(제조사: Stratagene/USA)를 사용하여 수행된다. 돌연변이유발은 플라스미드 pCIS lysC, 서열 6에서 수행된다. 퀵체인지 방법 (Stratagene)을 사용하여 thr 311을 311ile로 치환시키기 위한 다음의 올리고뉴클레오타이드 프라미어를 합성한다:

서열 7

5'-CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCG-3'

서열 8

5'-CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCG-3'

퀵체인지 반응에서 이들 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 사용은 lysC 유전자 서열 9에서 위치 932에서 뉴클레오타이드의 치환을 유도한다 (C로부터 T로). 이. 콜라이 XL1-블루에서의 형질전환 및 플라스미드 제조 후에, [a] 서열결정 반응에 의해서 lysC 유전자에서 생성된 아미노산 치환 Thr311Ile를 확인한다. 플라스미드는 pCIS lysC thr311ile로 지정하고, 서열 10으로 제시된다.

플라스미드 pCIS lysC thr311ile를 문헌 (Liebl, et al. (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303)에 기술된 바와 같이 전기천공 (electroporation)을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에 형질전환시킨다. 프로토콜의 변형은 DE 10046870에 기술되어 있다. 개개 형질전환체의 lysC 로커스 (locus)의 염색체 배열은 문헌 (Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)에 기술된 바와 같이 사우던 블럿 (Southern blot) 및 하이브리드화에 의한 표준방법을 사용하여 검사한다. 이렇게 함으로써, 연루된 형질전환체는 lysC 로커스에서 동족성 재조합체에 의해 형질전환된 플라스미드를 통합시킨 것으로 확립되었다. 이러한 콜로니를 항생제를 함유하지 않는 배지에서 밤새 성장시킨 후에, 세포를 사카로즈 CM 한천배지 (10％ 사카로즈) 상에 도말하고, 30℃에서 24 시간 동안 배양한다. 벡터 pCIS lysC thr311ile에 함유된 sacB 유전자는 사카로즈를 독성 생성물로 전환시키기 때문에, 야생형 lysC 유전자와 돌연변이된 유전자 lysC thr311ile 사이에서 제 2 동족성 재조합 단계에 의해 sacB 유전자를 결실시킨 콜로니 만이 성장할 수 있다. 동족성 재조합 중에, 야생형 유전자 또는 돌연변이된 유전자는 sacB 유전자와 함께 결실될 수 있다. sacB 유전자가 야생형 유전자와 함께 제거된 경우에는 돌연변이된 형질전환체가 생성된다.

성장하는 콜로니를 취하여, 카나마이신-민감성 표현형에 대해서 검사한다. 결실된 SacB 유전자를 갖는 클론은 반드시 동시에 카나마이신-민감성 성장거동을 나타내야 한다. 이러한 카나마이신-민감성 클론은 진탕 플라스크 내에서 그들의 라이신 생산성에 대하여 조사한다 (참조: 실시예 6). 비교를 위해서, 비-처리된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032를 택한다. 대조군에 비해서 증가된 라이신 생산을 갖는 클론을 선택하여, 염색체 DNA를 회수하고, lysC 유전자의 상응하는 부위를 PCR 반응에 의해서 증폭시키고 서열결정을 한다. 증가된 라이신 합성 및 lysC에서 위치 932에서의 검출된 돌연변이의 특성을 갖는 이러한 한가지 클론을 ATCC 13032 lysCfbr로 지정한다.

실시예 VII : 플라스미드 PK19 MOB SACB 델타 락테이트 데하이드로게나제의 제조

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터의 염색체 DNA는 문헌 (Tauch et al. (1995) Plasmid 33:168-179 또는 Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140:1817-1828)에 따라 제조된다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머 SEQ ID NO 및 서열 11 및 12, 주형으로서 염색체 DNA, 및 Pfu Turbo 폴리머라제 (제조사: Stratagene)을 사용하여 플랭킹 부위를 갖는 락테이트 데하이드로게나제의 유전자를 문헌 (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press)에 기술된 바와 같이 표준방법에 따라 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)을 이용하여 증폭시킨다.

서열 11

5'-CTAGCTAGCCATTGTCCTTCTGGCAGT-3'; 및

서열 12

5'-CTAGTCTAGACGCTCGTGTTCCTTTAGA-3'

크기가 약 2.0 kb인 수득된 DNA 단편은 제조자의 지침에 따라서 GFX™ PCR DNA 및 젤밴드 정제 키트 (Amersham Pharmacia, Freiburg)를 사용하여 정제한다. 그 후에, 이것을 제한효소 NheI 및 XbaI (Roche Diagnostics, Mannheim)를 사용하여 분해시키고, DNA 단편을 GFX™ PCR DNA 및 젤밴드 정제 키트를 사용하여 정제한다.

플라스미드 pK19 mob sacB 서열 13을 또한 제한효소 NheI 및 XbaI로 절단하고, 전기영동 단리한 후에 GFX™ PCR DNA 및 젤밴드 정제 키트를 사용하여 5.5 kb 크기의 단편을 단리시킨다.

벡터 단편을 제조자의 지침에 따라서 래피드 DNA 연결키트 (Rapid DNA Ligation Kit; Roche Diagnostics, Mannheim)를 사용하여 PCR 단편과 함께 연결시키고, 연결 배취 (ligation batch)를 문헌 (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989))에 기술된 바와 같이 표준방법에 따라 적격의 이. 콜라이 XL-1 블루 (Stratagene, La Jolla, USA)에서 형질전환시킨다. 플라스미드-보유 세포에 대한 선택은 카나마이신 (20 ㎍/㎖)-함유 LB 한천 상에 도말함으로써 수행된다 (Lennox, 1995, Virololy, 1:190).

플라스미드 DNA의 제조는 회사 퀴아겐 (Quiagen)의 방법에 따라서 그의 물질을 사용하여 수행된다. 서열결정 반응은 문헌 (Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467)에 따라서 수행된다. 서열결정 반응은 ABI 프리즘 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt)를 이용하여 단리시키고 분석한다.

생성된 플라스미드는 pK19 락테이트 데하이드로게나제 (서열 14)로 지정한다.

이어서, 플라스미드 pK19 락테이트 데하이드로게나제를 제한효소 EcoRI 및 BglI (Roche Diagnostics, Mannheim)로 절단하고, 전기영동 단리한 후에 GFX™ PCR DNA 및 젤밴드 정제 키트를 사용하여 6.7 kb 크기의 단편을 단리시킨다. 이 단편을 제조자의 지침에 따라서 클레노우 (Klenow) 효소로 처리한 후에, 제조자의 지침에 따라서 래피드 DNA 연결키트 (Roche Diagnostics, Mannheim)를 사용하여 재연결을 수행한다. 연결 배취를 문헌 (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989))에 기술된 바와 같이 표준방법에 따라 적격의 이. 콜라이 XL-1 블루 (Stratagene, La Jolla, USA)에서 형질전환시킨다. 플라스미드-보유 세포에 대한 선택은 카나마이신 (20 ㎍/㎖)-함유 LB 한천 상에 도말함으로써 수행된다 (Lennox, 1995, Virololy, 1:190).

플라스미드 DNA의 제조는 회사 퀴아겐 (Quiagen)의 방법에 따라서 그의 물질을 사용하여 수행된다. 서열결정 반응은 문헌 (Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463-5467)에 따라서 수행된다. 서열결정 반응은 ABI 프리즘 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt)를 이용하여 단리시키고 분석한다.

생성된 플라스미드 pK19 델타 락테이트 데하이드로게나제는 서열 15로 제시된다.

실시예 VIII : 라이신의 생산

플라스미드 pK19 델타 락테이트 데하이드로게나제를 문헌 (Liebl, et al. (1989) FEMS Microbiology Letters 53:299-303)에 기술된 바와 같이 전기천공을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 lysC^fbr에 형질전환시킨다. 프로토콜의 변형은 DE 10046870에 기술되어 있다. 개개 형질전환체의 락테이트 데하이드로게나제 로커스의 염색체 배열은 문헌 (Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)에 기술된 바와 같이 사우던 블럿 및 하이브리드화에 의한 표준방법을 사용하여 검사한다. 이렇게 함으로써, 형질전환체는 락테이트 데하이드로게나제 유전자 로커스에서 동족성 재조합체에 의해 형질전환된 플라스미드를 통합시킨 것을 포함하는 것으로 확립되었다. 이러한 콜로니를 항생제를 함유하지 않는 배지에서 밤새 성장시킨 후에, 세포를 사카로즈 CM 한천배지 (10％ 사카로즈) 상에 도말하고, 30℃에서 24 시간 동안 배양한다. 벡터 pK19 델타 락테이트 데하이드로게나제에 함유된 sacB 유전자는 사카로즈를 독성 생성물로 전환시키기 때문에, 야생형 락테이트 데하이드로게나제 유전자와 단축된 유전자 사이에서 제 2 동족성 재조합 단계에 의해 sacB 유전자를 결실시킨 콜로니 만이 성장할 수 있다. 동족성 재조합 중에, 야생형 유전자 또는 단축된 유전자는 sacB 유전자와 함께 결실될 수 있다. sacB 유전자가 야생형 유전자와 함께 제거된 경우에는 돌연변이된 형질전환체가 생성된다.

성장하는 콜로니를 취하여, 카나마이신-민감성 표현형에 대해서 검사한다. 결실된 SacB 유전자를 갖는 클론은 반드시 동시에 카나마이신-민감성 성장거동을 나타내야 한다. 단축된 유전자에 의한 천연 유전자의 목적하는 치환이 일어났는지 여부는 문헌 (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press)에 기술된 바와 같이 표준방법에 따라 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)을 이용하여 검사한다. 이 분석을 위해서, 출발 균주 및 생성된 클론으로부터의 염색체 DNA를 단리시킨다. 이러한 목적으로, 각각의 클론을 이쑤시개를 사용하여 한천 플레이트로부터 단리하여 100 ㎕의 H₂O에 현탁시키고, 10분 동안 95℃에서 비등시킨다. 각각의 경우에 10 ㎕의 생성된 용액을 PCR에서 주형으로 사용한다. 프라이머로 사용된 것은 올리고뉴클레오타이드 CK 345 및 CK 346이다. 올리고뉴클레오타이드의 선택에 따라서 단축된 유전자의 경우에서 보다 더 큰 PCR 생성물이 출발 균주의 DNA를 사용한 배취에서 예상된다. 포지티브 클론을 ATCC 13032 Psod lysC^fbr 델타 락테이트 데하이드로게나제로 지정한다.

라이신 생산에 대한 델타 락테이트 데하이드로게나제 작제물의 효과를 조사하기 위하여, 균주 ATCC 13032, ATCC 13032 lysC^fbr, 및 ATCC 13032 lysC^fbr 델타 락테이트 데하이드로게나제를 CM 플레이트 (10.0 g/L D-글루코즈, 2.5 g/L NaCl, 2.0 g/L 우레아, 10.0 g/L 박토 펩톤 (Difco), 5.0 g/L 효모 추출물 (Difco), 5.0 g/L 비프 (beef) 추출물 (Difco), 22.0 g/L 한천 (Difco), 고압멸균됨 (20 분, 121℃)) 상에서 2 일 동안 30℃에서 배양한다. 이어서, 세포를 플레이트로부터 긁어내고, 식염수에 재현탁시킨다. 주배양을 위해서, 10 ㎖의 배지 I 및 0.5 g의 고압멸균된 CaCO₃ (Riedel de Haen)를 세포현탁액을 갖는 100 ㎖의 삼각플라스크에 1.5의 OD₆₀₀까지 접종하고, 타입 인포스 (Infors) AJ118 (제조사: Infors, Bottmingen, Switzerland)의 [진탕배양기] 상에서 39 시간 동안, 220 rpm으로 배양한다. 이어서, 배지에서 단리한 라이신의 농도를 측정한다.

배지 I:

40 g/L 사카로즈

60 g/L 당밀 (100％ 당 함량에 대하여 계산됨)

10 g/L (NH₄)₂SO₄

0.4 g/L MgSO₄*7H₂O

0.6 g/L KH₂PO₄

0.3 ㎎/L 티아민*HCl

1 ㎎/L 비오틴 (NH₄OH에 의해서 pH 8.0으로 조정된 1 ㎎/㎖ 멸균-여과된 저장액으로부터)

2 ㎎/L FeSO₄

2 ㎎/L MnSO₄

NH₄OH에 의해서 pH 7.8로 조정되고, 고압멸균됨 (121℃, 20 분).

또한, 저장액 (200 ㎍/㎖, 멸균-여과됨)으로부터 비타민 B12 (하이드록시코발라민 Sigma Chemicals)를 100 ㎍/L의 최종 농도까지 첨가한다.

아미노산 농도의 측정은 애질런트 (Agilent) 1100 시리즈 LC 시스템 HPLC 상에서 애질런트 (Agilent)에 따라 고압 액체크로마토그라피를 이용하여 수행된다. 오르토-프탈알데히드에 의한 전칼럼 유도체화는 형성된 아미노산의 정량분석을 허용하며; 아미노산 혼합물의 단리는 하이퍼실 (Hypersil) AA 칼럼 (Agilent)에서 수행한다.

또한, 락테이트의 농도는 효소시험을 사용하여 측정된다.

동등물

본 기술분야에서 숙련된 전문가는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에 기술된 발명의 특정한 구체예에 대한 다수의 동등한 사항을 인지하고, 확인할 수 있을 것이다. 이러한 동등한 사항도 이하의 특허청구범위에 포함되는 것으로 해석된다.

SEQUENCE LISTING <110> BASF AKTIENGESELLSCHAFT et al. <120> METHODS FOR THE PREPARATION OF A FINE CHEMICAL BY FERMENTATION <130> BGI-160PC2 <150> PCT/IB2003/006435 <151> 2003-12-18 <160> 15 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1660 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (301)...(1563) <400> 1 tcggcatcct ctggggtagc gtcaacgcaa tcctcggaac cgtcatcgca gaaaacttcg 60 cacctgaggt ccgctacacc ggcgctaccc tgggttacca agtcggagca gcactcttcg 120 gcggtaccgc acccattatc gcagcatggc tgttcgaaat ctccggcgga caatggtggc 180 caatcgccgt ctacgtcgct gcatgttgcc ttctctctgt gatcgcctcg ttcttcatcc 240 aacgcgtcgc gcaccaagag aactaaaatc taagtaaaac ccctccgaaa ggaaccaccc 300 atg gtg aaa cgt caa ctg ccc aac ccc gca gaa cta ctc gaa ctc atg 348 Met Val Lys Arg Gln Leu Pro Asn Pro Ala Glu Leu Leu Glu Leu Met 1 5 10 15 aag ttc aaa aag cca gag ctc aac ggc aag aaa cga cgc cta gac tcc 396 Lys Phe Lys Lys Pro Glu Leu Asn Gly Lys Lys Arg Arg Leu Asp Ser 20 25 30 gcg ctc acc atc tac gac ctg cgt aaa att gct aaa cga cgc acc cca 444 Ala Leu Thr Ile Tyr Asp Leu Arg Lys Ile Ala Lys Arg Arg Thr Pro 35 40 45 gct gcc gcg ttc gac tac acc gac ggc gca gcc gag gcc gaa ctc tca 492 Ala Ala Ala Phe Asp Tyr Thr Asp Gly Ala Ala Glu Ala Glu Leu Ser 50 55 60 atc aca cgc gca cgt gaa gca ttc gaa aac atc gaa ttc cac cca gac 540 Ile Thr Arg Ala Arg Glu Ala Phe Glu Asn Ile Glu Phe His Pro Asp 65 70 75 80 atc ctc aag cct gca gaa cac gta gac acc acc acc caa atc ctg ggc 588 Ile Leu Lys Pro Ala Glu His Val Asp Thr Thr Thr Gln Ile Leu Gly 85 90 95 gga acc tcc tcc atg cca ttc ggc atc gca cca acc ggc ttc acc cgc 636 Gly Thr Ser Ser Met Pro Phe Gly Ile Ala Pro Thr Gly Phe Thr Arg 100 105 110 ctc atg cag acc gaa ggt gaa atc gca ggt gcc gga gct gca ggc gct 684 Leu Met Gln Thr Glu Gly Glu Ile Ala Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ala 115 120 125 gca gga att cct ttc acc ctg tcc acc ctg ggc act acc tcc atc gaa 732 Ala Gly Ile Pro Phe Thr Leu Ser Thr Leu Gly Thr Thr Ser Ile Glu 130 135 140 gac gtc aag gcc acc aac ccc aac ggc cga aac tgg ttc cag ctc tac 780 Asp Val Lys Ala Thr Asn Pro Asn Gly Arg Asn Trp Phe Gln Leu Tyr 145 150 155 160 gtc atg cgc gac cgc gaa atc tcc tac ggc ctc gtc gaa cgc gca gcc 828 Val Met Arg Asp Arg Glu Ile Ser Tyr Gly Leu Val Glu Arg Ala Ala 165 170 175 aaa gca gga ttc gac acc ctg atg ttc acc gtg gat acc ccc atc gcc 876 Lys Ala Gly Phe Asp Thr Leu Met Phe Thr Val Asp Thr Pro Ile Ala 180 185 190 ggc tac cgc atc cgc gat tcc cgc aac gga ttc tcc atc ccg cca cag 924 Gly Tyr Arg Ile Arg Asp Ser Arg Asn Gly Phe Ser Ile Pro Pro Gln 195 200 205 ctg acc cca tcc acc gtg ctc aat gca atc cca cgc cca tgg tgg tgg 972 Leu Thr Pro Ser Thr Val Leu Asn Ala Ile Pro Arg Pro Trp Trp Trp 210 215 220 atc gac ttc ctg acc acc cca acc ctt gag ttc gca tcc ctt tcc tcg 1020 Ile Asp Phe Leu Thr Thr Pro Thr Leu Glu Phe Ala Ser Leu Ser Ser 225 230 235 240 acc ggc gga acc gtg ggc gac ctc ctc aac tcc gcg atg gat ccc acc 1068 Thr Gly Gly Thr Val Gly Asp Leu Leu Asn Ser Ala Met Asp Pro Thr 245 250 255 att tct tac gaa gac ctc aag gtc atc cgt gaa atg tgg cca ggc aag 1116 Ile Ser Tyr Glu Asp Leu Lys Val Ile Arg Glu Met Trp Pro Gly Lys 260 265 270 ctc gta gtc aag ggt gtc cag aac gtt gaa gac tcc gtc aaa ctc ctc 1164 Leu Val Val Lys Gly Val Gln Asn Val Glu Asp Ser Val Lys Leu Leu 275 280 285 gac caa ggc gtc gac ggc ctc atc ctc tcc aac cac ggt ggc cgt caa 1212 Asp Gln Gly Val Asp Gly Leu Ile Leu Ser Asn His Gly Gly Arg Gln 290 295 300 ctc gac cgc gca cca gtc cca ttc cac ctc ctg cca cag gta cgc aag 1260 Leu Asp Arg Ala Pro Val Pro Phe His Leu Leu Pro Gln Val Arg Lys 305 310 315 320 gaa gtc gga tct gaa cca acc atc atg atc gac acc ggc atc atg aac 1308 Glu Val Gly Ser Glu Pro Thr Ile Met Ile Asp Thr Gly Ile Met Asn 325 330 335 ggc gcc gac atc gtc gca gcc gta gcc atg ggc gct gac ttc acc ctc 1356 Gly Ala Asp Ile Val Ala Ala Val Ala Met Gly Ala Asp Phe Thr Leu 340 345 350 atc ggt cgt gcc tac ctc tac gga ctc atg gcc gga ggc cgc gaa ggc 1404 Ile Gly Arg Ala Tyr Leu Tyr Gly Leu Met Ala Gly Gly Arg Glu Gly 355 360 365 gtc gac cgc acc atc gcc att ctc cgc agc gag atc acc cgc acc atg 1452 Val Asp Arg Thr Ile Ala Ile Leu Arg Ser Glu Ile Thr Arg Thr Met 370 375 380 gct ctc ctc ggt gtt tcc tcc ctc gaa gaa ctc gag cca cgc cac gtc 1500 Ala Leu Leu Gly Val Ser Ser Leu Glu Glu Leu Glu Pro Arg His Val 385 390 395 400 acc cag ctg gcc aag atg gtt cca gtt tct gac gca act cgt tct gca 1548 Thr Gln Leu Ala Lys Met Val Pro Val Ser Asp Ala Thr Arg Ser Ala 405 410 415 gcg gcg gag att taa aagtttctct ccttagctat taaaaggtgc ccatccgttt 1603 Ala Ala Glu Ile * 420 ggatgggcac cttctcgttt cttgcaatcg gcatattcag tcaaaaaatg ttgaaat 1660 <210> 2 <211> 420 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Met Val Lys Arg Gln Leu Pro Asn Pro Ala Glu Leu Leu Glu Leu Met 1 5 10 15 Lys Phe Lys Lys Pro Glu Leu Asn Gly Lys Lys Arg Arg Leu Asp Ser 20 25 30 Ala Leu Thr Ile Tyr Asp Leu Arg Lys Ile Ala Lys Arg Arg Thr Pro 35 40 45 Ala Ala Ala Phe Asp Tyr Thr Asp Gly Ala Ala Glu Ala Glu Leu Ser 50 55 60 Ile Thr Arg Ala Arg Glu Ala Phe Glu Asn Ile Glu Phe His Pro Asp 65 70 75 80 Ile Leu Lys Pro Ala Glu His Val Asp Thr Thr Thr Gln Ile Leu Gly 85 90 95 Gly Thr Ser Ser Met Pro Phe Gly Ile Ala Pro Thr Gly Phe Thr Arg 100 105 110 Leu Met Gln Thr Glu Gly Glu Ile Ala Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ala 115 120 125 Ala Gly Ile Pro Phe Thr Leu Ser Thr Leu Gly Thr Thr Ser Ile Glu 130 135 140 Asp Val Lys Ala Thr Asn Pro Asn Gly Arg Asn Trp Phe Gln Leu Tyr 145 150 155 160 Val Met Arg Asp Arg Glu Ile Ser Tyr Gly Leu Val Glu Arg Ala Ala 165 170 175 Lys Ala Gly Phe Asp Thr Leu Met Phe Thr Val Asp Thr Pro Ile Ala 180 185 190 Gly Tyr Arg Ile Arg Asp Ser Arg Asn Gly Phe Ser Ile Pro Pro Gln 195 200 205 Leu Thr Pro Ser Thr Val Leu Asn Ala Ile Pro Arg Pro Trp Trp Trp 210 215 220 Ile Asp Phe Leu Thr Thr Pro Thr Leu Glu Phe Ala Ser Leu Ser Ser 225 230 235 240 Thr Gly Gly Thr Val Gly Asp Leu Leu Asn Ser Ala Met Asp Pro Thr 245 250 255 Ile Ser Tyr Glu Asp Leu Lys Val Ile Arg Glu Met Trp Pro Gly Lys 260 265 270 Leu Val Val Lys Gly Val Gln Asn Val Glu Asp Ser Val Lys Leu Leu 275 280 285 Asp Gln Gly Val Asp Gly Leu Ile Leu Ser Asn His Gly Gly Arg Gln 290 295 300 Leu Asp Arg Ala Pro Val Pro Phe His Leu Leu Pro Gln Val Arg Lys 305 310 315 320 Glu Val Gly Ser Glu Pro Thr Ile Met Ile Asp Thr Gly Ile Met Asn 325 330 335 Gly Ala Asp Ile Val Ala Ala Val Ala Met Gly Ala Asp Phe Thr Leu 340 345 350 Ile Gly Arg Ala Tyr Leu Tyr Gly Leu Met Ala Gly Gly Arg Glu Gly 355 360 365 Val Asp Arg Thr Ile Ala Ile Leu Arg Ser Glu Ile Thr Arg Thr Met 370 375 380 Ala Leu Leu Gly Val Ser Ser Leu Glu Glu Leu Glu Pro Arg His Val 385 390 395 400 Thr Gln Leu Ala Lys Met Val Pro Val Ser Asp Ala Thr Arg Ser Ala 405 410 415 Ala Ala Glu Ile 420 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 3 gagagagaga cgcgtcccag tggctgagac gcatc 35 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 4 ctctctctgt cgacgaattc aatcttacgg cctg 34 <210> 5 <211> 4323 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 5 tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtacca cgcgtcatat gactagttcg gacctaggga 60 tatcgtcgac atcgatgctc ttctgcgtta attaacaatt gggatcctct agacccggga 120 tttaaatcgc tagcgggctg ctaaaggaag cggaacacgt agaaagccag tccgcagaaa 180 cggtgctgac cccggatgaa tgtcagctac tgggctatct ggacaaggga aaacgcaagc 240 gcaaagagaa agcaggtagc ttgcagtggg cttacatggc gatagctaga ctgggcggtt 300 ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag 360 ccctgcaaag taaactggat ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg caggggatca 420 agatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac 480 gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca 540 atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt 600 gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg 660 tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga 720 agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct 780 cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg 840 gctacctgcc 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ctttccagtc gggaaacctg 4080 tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg 4140 cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 4200 gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 4260 aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 4320 gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 4380 aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 4440 gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 4500 ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 4560 cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 4620 ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 4680 actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 4740 tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 4800 gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 4860 ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 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agcagcgctt ttccgctgca 5760 taaccctgct tcggggtcat tatagcgatt ttttcggtat atccatcctt tttcgcacga 5820 tatacaggat tttgccaaag ggttcgtgta gactttcctt ggtgtatcca acggcgtcag 5880 ccgggcagga taggtgaagt aggcccaccc gcgagcgggt gttccttctt cactgtccct 5940 tattcgcacc tggcggtgct caacgggaat cctgctctgc gaggctggcc ggctaccgcc 6000 ggcgtaacag atgagggcaa gcggatggct gatgaaacca agccaaccag gaagggcagc 6060 ccacctatca aggtgtactg ccttccagac gaacgaagag cgattgagga aaaggcggcg 6120 gcggccggca tgagcctgtc ggcctacctg ctggccgtcg gccagggcta caaaatcacg 6180 ggcgtcgtgg actatgagca cgtccgcgag ggcgtcccgg aaaacgattc cgaagcccaa 6240 cctttcatag aaggcggcgg tggaatcgaa atctcgtgat ggcaggttgg gcgtcgcttg 6300 gtcggtcatt tcgctcggta cccatcggca ttttcttttg cgtttttatt tgttaactgt 6360 taattgtcct tgttcaagga tgctgtcttt gacaacagat gttttcttgc ctttgatgtt 6420 cagcargaag ctcggcgcaa acgttgattg tttgtctgcg tagaatcctc tgtttgtcat 6480 atagcttgta atcacgacat tgtttcctty tcgcttgagg tacagcgaag tgtgagtaag 6540 taaraggtta catcgttagg atcaagatcc attcttaaca caaggccagt tttgttcagc 6600 ggcttgtatg ggccagttaa agaattataa acataaccaa gcatgtaaat atcgttagac 6660 gtaatgccgt caatcgtcat tattgatccg cgg 6693 <210> 15 <211> 7561 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 15 accatttccg ttcatttaaa gacgttcgcg cgtcaatttc atctgtactg tgtagatgca 60 tcagcggttt catcactttt ttcagtgtga atcatcgttt agctcaatca taccgagagc 120 gccgtttgct aactcaaccg tgcgtttttt atcgctttgc agaagttttt gactttcttg 180 acggaagaat gatgtgcttt tgccatagta tgctttgtta aataaagatt cttcgccttg 240 gtagccatct tcagttccag tgtttgcttc aaatactaag tatttgtggc ctttatcttc 300 tacgtagtga ggatctctca gcgtatggtt gtcgcctgag ctgtagttgc cttcatcgat 360 gaactgctgt acattttgat acgtttttcc gtcaccgtca aagattgatt tataatcctc 420 tacaccgttg atgttcaaag agctgtctga tgctgatacg ttaacttgtg cagttgtcag 480 tgtttgtttg ccgtaatgtt taccggagaa atcagtgtag aataaacgga tttttccgtc 540 agatgtaaat gtggctgaac ctgaccattc ttgtgtttgg tcttttagga tagaatcatt 600 tgcatcgaat ttgtcgctgt ctttaaagac gcggccagcg tttttccagc tgtcaataga 660 agtttcgccg 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ctctagcgaa ccccagagtc ccgctcagaa gaactcgtca 1560 agaaggcgat agaaggcgat gcgctgcgaa tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg 1620 aagcggtcag cccattcgcc gccaagctct tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg 1680 tcctgatagc ggtccgccac acccagccgg ccacagtcga tgaatccaga aaagcggcca 1740 ttttccacca tgatattcgg caagcaggca tcgccatggg tcacgacgag atcctcgccg 1800 tcgggcatcc gcgccttgag cctggcgaac agttcggctg gcgcgagccc ctgatgctct 1860 tcgtccagat catcctgatc gacaagaccg gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg 1920 cgatgtttcg cttggtggtc gaatgggcag gtagccggat caagcgtatg cagccgccgc 1980 attgcatcag ccatgatgga tactttctcg gcaggagcaa ggtgagatga caggagatcc 2040 tgccccggca cttcgcccaa tagcagccag tcccttcccg cttcagtgac aacgtcgagc 2100 acagctgcgc aaggaacgcc cgtcgtggcc agccacgata gccgcgctgc ctcgtcttgg 2160 agttcattca gggcaccgga caggtcggtc ttgacaaaaa gaaccgggcg cccctgcgct 2220 gacagccgga acacggcggc atcagagcag ccgattgtct gttgtgccca gtcatagccg 2280 aatagcctct ccacccaagc ggccggagaa cctgcgtgca atccatcttg ttcaatcatg 2340 cgaaacgatc ctcatcctgt ctcttgatca gatcttgatc ccctgcgcca tcagatcctt 2400 ggcggcaaga aagccatcca gtttactttg cagggcttcc caaccttacc agagggcgcc 2460 ccagctggca attccggttc gcttgctgtc cataaaaccg cccagtctag ctatcgccat 2520 gtaagcccac tgcaagctac ctgctttctc tttgcgcttg cgttttccct tgtccagata 2580 gcccagtagc tgacattcat ccggggtcag caccgtttct gcggactggc tttctacgtg 2640 ttccgcttcc tttagcagcc cttgcgccct gagtgcttgc ggcagcgtga agctagccat 2700 tgtccttctg gcagttgctt gcgccgccct cgttgccacc atctggatgc cactgttcgg 2760 atccttctcc gaccgcgtca accgtgcagt gctctacagg atctgtgcat ccgcaaccat 2820 cgtgctgatt gtcccttact acttggtcct caacaccggc gaaatttggg cactgtttat 2880 cactaccgtg attggcttcg gcatcctctg gggtagcgtc aacgcaatcc tcggaaccgt 2940 catcgcagaa aacttcgcac ctgaggtccg ctacaccggc gctaccctgg gttaccaagt 3000 cggagcagca ctcttcggcg gtaccgcacc cattatcgca gcatggctgt tcgaaatctc 3060 cggcggacaa tggtggccaa tcgccgtcta cgtcgctgca tgttgccttc tctctgtgat 3120 cgcctcgttc ttcatccaac gcgtcgcgca ccaagagaac taaaatctaa gtaaaacccc 3180 tccgaaagga accacccatg gtgaaacgtc aactgcccaa ccccgcagaa ctactcgaac 3240 tcatgaagtt caaaaagcca gagctcaacg gcaagaaacg acgcctagac tccgcgctca 3300 ccatctacga cctgcgtaaa attgctaaac gacgcacccc agctgccgcg ttcgactaca 3360 ccgacggcgc agccgaggcc gaactctcaa tcacacgcgc acgtgaagca ttcgaaaaca 3420 tcgaattcca cccagacatc ctcaagcctg cagaacacgt agacaccacc acccaaatcc 3480 tgggcggaac ctcctccatg ccattcggca tcgcaccaac cggcttcacc cgcctcatgc 3540 agaccgaagg tgaaatcgca ggtgccggag ctgcaggcgc tgcaggaatt cctttcaccc 3600 tgtccaccct gggcactacc tccatcgaag acgtcaaggc caccaacccc aacggccgaa 3660 actggttcca gctctacgtc atgcgcgacc gcgaaatctc ctacggcctc gtcgaacgcg 3720 cagccaaagc aggattcgac accctgatgt tcaccgtgga tacccccatc gccggctacc 3780 gcatccgcga ttcccgcaac ggattctcca tcccgccaca gctgacccca tccaccgtgc 3840 tcaatgcaat cccacgccca tggtggtgga tcgacttcct gaccacccca acccttgagt 3900 tcgcatccct ttcctcgacc ggcggaaccg tgggcgacct cctcaactcc gcgatggatc 3960 ccaccatttc ttacgaagac ctcaaggtca tccgtgaaat gtggccaggc aagctcgtag 4020 tcaagggtgt ccagaacgtt gaagactccg tcaaactcct cgaccaaggc gtcgacggcc 4080 tcatcctctc caaccacggt ggccgtcaac tcgaccgcgc accagtccca ttccacctcc 4140 tgccacaggt acgcaaggaa gtcggatctg aaccaaccat catgatcgac accggcatca 4200 tgaacggcgc cgacatcgtc gcagccgtag ccatgggcgc tgacttcacc ctcatcggtc 4260 gtgcctacct ctacggactc atggccggag gccgcgaagg cgtcgaccgc accatcgcca 4320 ttctccgcag cgagatcacc cgcaccatgg ctctcctcgg tgtttcctcc ctcgaagaac 4380 tcgagccacg ccacgtcacc cagctggcca agatggttcc agtttctgac gcaactcgtt 4440 ctgcagcggc ggagatttaa aagtttctct ccttagctat taaaaggtgc ccatccgttt 4500 ggatgggcac cttctcgttt cttgcaatcg gcatattcag tcaaaaaatg ttgaaatcag 4560 cactttcaat ttgggacatc tactcttagg agaaaagcca caaacctttc ccaccccaca 4620 accgtgtgtt ctgcagtcga cccagtttag aggaaacatg agtgacttca cggaaaatac 4680 ttggactgtc cactacgacg aagatggtga tttcccaaaa ttcttcaact ctctaaagga 4740 acacgagcgt ctagagtcga cctgcaggca tgcaagcttg gcgtaatcat ggtcatagct 4800 gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat 4860 aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc 4920 actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg 4980 cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 5040 gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 5100 atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 5160 caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 5220 gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 5280 ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 5340 cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 5400 taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 5460 cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 5520 acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 5580 aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt 5640 atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 5700 atccggcaaa caaaccaccg 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tgcatttgcc tgtttccagt cggtagatat tccacaaaac 6600 agcagggaag cagcgctttt ccgctgcata accctgcttc ggggtcatta tagcgatttt 6660 ttcggtatat ccatcctttt tcgcacgata tacaggattt tgccaaaggg ttcgtgtaga 6720 ctttccttgg tgtatccaac ggcgtcagcc gggcaggata ggtgaagtag gcccacccgc 6780 gagcgggtgt tccttcttca ctgtccctta ttcgcacctg gcggtgctca acgggaatcc 6840 tgctctgcga ggctggccgg ctaccgccgg cgtaacagat gagggcaagc ggatggctga 6900 tgaaaccaag ccaaccagga agggcagccc acctatcaag gtgtactgcc ttccagacga 6960 acgaagagcg attgaggaaa aggcggcggc ggccggcatg agcctgtcgg cctacctgct 7020 ggccgtcggc cagggctaca aaatcacggg cgtcgtggac tatgagcacg tccgcgaggg 7080 cgtcccggaa aacgattccg aagcccaacc tttcatagaa ggcggcggtg gaatcgaaat 7140 ctcgtgatgg caggttgggc gtcgcttggt cggtcatttc gctcggtacc catcggcatt 7200 ttcttttgcg tttttatttg ttaactgtta attgtccttg ttcaaggatg ctgtctttga 7260 caacagatgt tttcttgcct ttgatgttca gcargaagct cggcgcaaac gttgattgtt 7320 tgtctgcgta gaatcctctg tttgtcatat agcttgtaat cacgacattg tttccttytc 7380 gcttgaggta cagcgaagtg tgagtaagta araggttaca tcgttaggat caagatccat 7440 tcttaacaca aggccagttt tgttcagcgg cttgtatggg ccagttaaag aattataaac 7500 ataaccaagc atgtaaatat cgttagacgt aatgccgtca atcgtcatta ttgatccgcg 7560 g 7561

Claims (54)

1. 펜토즈 포스페이트 경로를 통한 대사성 플럭스가 증가되도록 하는 조건 하에서 조절해제된 유전자를 포함하는 미생물을 배양하는 것을 포함하며, 미생물에서 펜토즈 포스페이트 경로를 통한 대사성 플럭스를 증가시키는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 프럭토즈 또는 슈크로즈가 탄소 공급원으로 사용되는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 프럭토즈가 탄소 공급원으로 사용되는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 유전자가 락테이트 데하이드로게나제인 방법.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 락테이트 데하이드로게나제 유전자가 코리네박테리움(Corynebacterium)으로부터 유도되는 방법.
6. 제 4 항에 있어서, 상기 락테이트 데하이드로게나제 유전자가 저발현되는 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 유전자가 락테이트 데하이드로게나제를 코딩하는 방 법.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 락테이트 데하이드로게나제가 감소된 활성을 갖는 방법.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 미생물이 그람 양성 미생물인 방법.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 미생물이 코리네박테리움 속에 속하는 방법.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 방법.
12. 제 1 항에 있어서, 상기 미생물이 발효되어 정밀화학 약품을 생산하는 방법.
13. 제 1 항에 있어서, 상기 미생물이 하나 이상의 추가의 조절해제된 유전자를 더 포함하는 방법.
14. 제 13 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 조절해제된 유전자가 ask 유전자, dapA 유전자, asd 유전자, dapB 유전자, ddh 유전자, lysA 유전자, lysE 유전자, pycA 유전자, zwf 유전자, pepCL 유전자, gap 유전자, zwa1 유전자, tkt 유전자, tad 유전자, mqo 유전자, tpi 유전자, pgk 유전자, 및 sigC 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
15. 제 14 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 조절해제된 유전자가 과발현되는 방법.
16. 제 13 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 조절해제된 유전자가 피드-백 저항성 아스파르토키나제, 디하이드로디피콜리네이트 신타제, 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제, 디아미노피멜레이트 데하이드로게나제, 디아미노피멜레이트 에피머라제, 라이신 엑스포터, 피루베이트 카복실라제, 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제, RPF 단백질 전구체, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 메나퀴닌 옥시도리덕타제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 키나제, 및 RNA-폴리머라제 시그마 인자 sigC로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 방법.
17. 제 16 항에 있어서, 상기 단백질이 증가된 활성을 갖는 방법.
18. 제 13 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 조절해제된 유전자가 pepCK 유전자, malE 유전자, glgA 유전자, pgi 유전자, dead 유전자, menE 유전자, citE 유전자, mikE17 유전자, poxB 유전자, zwa2 유전자, 및 sucC 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
19. 제 18 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 조절해제된 유전자가 약화되거나, 감소되거나, 억제되는 방법.
20. 제 13 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 조절해제된 유전자가 포스포에놀피루베이트 카복시키나제, 말릭 효소, 글리코젠 신타제, 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제, ATP 의존성 RNA 헬리카제, o-숙시닐벤조산-CoA 리가제, 시트레이트 리아제 베타 체인, 전사 조절자, 피루베이트 데하이드로게나제, RPF 단백질 전구체, 및 숙시닐-CoA-신테타제로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 방법.
21. 제 20 항에 있어서, 상기 단백질이 감소된 활성을 갖는 방법.
22. a) 락테이트 데하이드로게나제가 조절해제된 미생물을 배양하고;

    b) 배지 내에 또는 미생물의 세포 내에 정밀화학 약품을 축적시킴으로써 정밀화학 약품을 생성시키는 것을 포함하는, 정밀화학 약품을 생산하는 방법.
23. 하나 이상의 펜토즈 포스페이트 생합성 경로 유전자 또는 효소가 정밀화학 약품이 생산되도록 하는 조건 하에서 조절해제된 미생물을 배양하는 것을 포함하는 정밀화학 약품을 생산하는 방법.
24. 제 23 항에 있어서, 상기 생합성 유전자가 락테이트 데하이드로게나제인 방법.
25. 제 23 항에 있어서, 상기 생합성 효소가 락테이트 데하이드로게나제인 방법.
26. 제 22 항 또는 24 항에 있어서, 상기 락테이트 데하이드로게나제 발현이 감소되는 방법.
27. 제 22 항 또는 25 항에 있어서, 상기 락테이트 데하이드로게나제 활성이 감소되는 방법.
28. 제 22 항에 있어서, 추가로 정밀화학 약품을 회수하는 단계를 더 포함하는 방법.
29. 제 22 항 또는 23 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 유전자가 조절해제된 방법.
30. 제 29 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 조절해제된 유전자가 ask 유전자, dapA 유전자, asd 유전자, dapB 유전자, ddh 유전자, lysA 유전자, lysE 유전자, pycA 유전자, zwf 유전자, pepCL 유전자, gap 유전자, zwa1 유전자, tkt 유전자, tad 유전자, mqo 유전자, tpi 유전자, pgk 유전자, 및 sigC 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
31. 제 30 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 조절해제된 유전자가 과발현되는 방법.
32. 제 29 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 조절해제된 유전자가 피드-백 저항성 아스파르토키나제, 디하이드로디피콜리네이트 신타제, 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제, 디아미노피멜레이트 데하이드로게나제, 디아미노피멜레이트 에피머라제, 라이신 엑스포터, 피루베이트 카복실라제, 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제, RPF 단백질 전구체, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 메나퀴닌 옥시도리덕타제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 키나제, 및 RNA-폴리머라제 시그마 인자 sigC로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 방법.
33. 제 32 항에 있어서, 상기 단백질이 증가된 활성을 갖는 방법.
34. 제 29 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 조절해제된 유전자가 pepCK 유전자, malE 유전자, glgA 유전자, pgi 유전자, dead 유전자, menE 유전자, citE 유전자, mikE17 유전자, poxB 유전자, zwa2 유전자, 및 sucC 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
35. 제 34 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 조절해제된 유전자가 약화되거나, 감소되거나, 억제되는 방법.
36. 제 29 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 조절해제된 유전자가 포스포에놀피루베이트 카복시키나제, 말릭 효소, 글리코젠 신타제, 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제, ATP 의존성 RNA 헬리카제, o-숙시닐벤조산-CoA 리가제, 시트레이트 리아제 베타 체인, 전사 조절자, 피루베이트 데하이드로게나제, RPF 단백질 전구체, 및 숙시닐-CoA-신테타제로 구성된 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 방법.
37. 제 36 항에 있어서, 상기 단백질이 감소된 활성을 갖는 방법.
38. 제 22 항 또는 23 항에 있어서, 상기 미생물이 그람 양성 미생물인 방법.
39. 제 22 항 또는 23 항에 있어서, 상기 미생물이 코리네박테리움 속에 속하는 방법.
40. 제 39 항에 있어서, 상기 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰인 방법.
41. 제 22 항 또는 23 항에 있어서, 상기 정밀화학 약품이 라이신인 방법.
42. 제 41 항에 있어서, 라이신이 100 g/L 이상의 수율로 생산되는 방법.
43. 제 41 항에 있어서, 라이신이 150 g/L 이상의 수율로 생산되는 방법.
44. 제 22 항 또는 23 항에 있어서, 프럭토즈 또는 슈크로즈가 탄소 공급원으로 사용되는 방법.
45. 제 22 항 또는 23 항에 있어서, 프럭토즈가 탄소 공급원으로 사용되는 방법.
46. 제 22 항 또는 24 항에 있어서, 상기 락테이트 데하이드로게나제가 서열 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법.
47. 제 22 항 또는 24 항에 있어서, 상기 락테이트 데하이드로게나제가 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 방법.
48. 조절해제된 펜토즈 포스페이트 생합성 경로를 갖는 재조합 미생물.
49. 조절해제된 펜토즈 포스페이트 생합성 유전자를 갖는 재조합 미생물.
50. 제 49 항에 있어서, 조절해제된 유전자가 락테이트 데하이드로게나제인 재조합 미생물.
51. 제 50 항에 있어서, 상기 락테이트 데하이드로게나제 발현이 감소된 재조합 미생물.
52. 제 50 항에 있어서, 락테이트 데하이드로게나제 유전자가 감소된 활성을 갖는 락테이트 데하이드로게나제 단백질을 코딩하는 재조합 미생물.
53. 제 49 항에 있어서, 상기 미생물이 코리네박테리움 속에 속하는 재조합 미생물.
54. 제 53 항에 있어서, 상기 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰인 재조합 미생물.

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