KR101782666B1 - ＬｙｓＥ를 과다발현하는 박테리아를 사용하는 Ｌ―오르니틴의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 L-오르니틴 외수송의 증가를 특징으로 하는, 미생물을 사용하는 발효에 의한 L-오르니틴의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

ＬｙｓＥ를 과다발현하는 박테리아를 사용하는 Ｌ―오르니틴의 생산 방법{METHOD FOR THE PRODUCTION OF L-ORNITHINE USING BACTERIA THAT OVEREXPRESS LysE}

종래 기술

L-오르니틴은 간 기능에 관한 이의 자극 작용에 대해 공지되어 있고, 약제의 성분으로서, 그리고 스포츠 영양에서 빈번하게 이용된다.

현재 L-오르니틴은 다양한 방법에 의해 제조된다. 한 방법은 미생물을 사용하는 발효 제조이다. 또 다른 방법은 아르기닌의 알칼리성 가수분해, 예를 들어, 수산화바륨으로의 가수분해이다 (CN 1594282 A). 또 다른 방법은 아르기나제(arginase) 활성을 보유하는 고정된 미생물에 의한 아르기닌의 생물전환이다 (KR589121B1). L-오르니틴을 L-시트룰린으로부터 제조하는 방법이 특허 문헌에 또한 기술되어 있다 (JP 42007767 B4).

L-오르니틴을 배양 배지 내로 배출한다는 것을 특징으로 하는 미생물들이 문헌에서 기술되었다. 상기 미생물의 예는 코리네박테리움(Corynebacterium), 브레비박테리움(Brevibacterium), 바실루스(Bacillus) (JP 43010996 B4, JP 57041912 B), 에스케리키아(Escherichia) (US 3668072 A), 프로비덴시아(Providencia) (JP 03195494) 또는 아르트로박터(Arthrobacter) (US 3574061) 속의 박테리아이다.

L-오르니틴을 생산하는 미생물들은 종종 L-아르기닌 또는 L-시트룰린 아미노산에 대해 영양요구성(auxotrophic)인 것을 특징으로 한다 (브레비박테리움, 바실루스, 코리네박테리움에 대해 EP 392708 B1 및 KR 161147 B1에, 에스케리키아에 대해 US 366072 A에 기술됨). 또한, 2-티아졸-알라닌, 술파구아니딘 또는 2-플루오로피루베이트에 대해 저항성인 미생물들이 기술되어 있다 (일본 공개 공보 번호 61-119194). EP 0393708 B1은 오르니톨 및 미코페놀산에 대한 더 낮은 저항성을 특징으로 하는 L-오르니틴 생산자를 기술한다. 상기 성질들은 조합 형태로 또한 존재할 수 있다.

세포로부터의 수동 확산에 의한 염기성 아미노산 예컨대 L-리신, L-아르기닌 및 L-오르니틴의 방출은 매우 불량하다 (문헌 [Bellmann et al.. Microbiology 2001; 147: 1765-74]). 이는 예들 들어 리신에 대해 잘 기술되어 있다. 문헌 [Vrlijc et al., Journal of Bacteriology 1995; 177(14): 4021-7]에서, 다수의 외수송(export)-결핍 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 돌연변이체가 연구되었다. 한 돌연변이체에 대해, 174 mM의 세포내 L-리신 농도가 측정된 반면, 겨우 0.7 mM의 값이 세포외에서 측정되었다.

문헌 [Vrlijc et al., Molecular Microbiology 1996; 22(5): 815-26] 및 [Vrlijc et al., Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 1999; 1: 327-336] 및 EP 0868527 B1에서, 신규 외수송체(exporter)가 L-리신 외수송체로서 확인 및 기술되었다 (LysE). 정의된 LysE에 대한 무효(null) 돌연변이체는 더 이상 L-리신을 세포 밖으로 수송할 수 없었다. lysE 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 아미노산 또는 아미노산 잔기 233개의 길이이고, 서열 2로 표시된다. 리신 생산자에서의 lysE 유전자의 과다발현 후, L-리신 배출에서의 증가가 발견되었다.

문헌 [Bellmann et al., Microbiology 2001; 147: 1765-74]에서, 씨. 글루타미쿰에서의 다양한 염기성 아미노산의 수송과 관련하여 이러한 LysE 외수송체가 더욱 상세하게 특성화되었다. 저자들은 이러한 수송체가 세포 밖으로 L-리신 및 L-아르기닌 아미노산을 특이적으로 외수송한다는 것을 실연하였다. 저자들은 LysE가 L-오르니틴을 또한 세포 밖으로 외수송하는지 여부를 추가로 연구하였다. 이러한 목적으로, 먼저 ATCC13032::argF로 지칭되는 L-아르기닌-영양요구성 씨. 글루타미쿰 균주를 제조하였다.

이러한 균주를 40 g/ℓ 글루코스를 함유한, CGXII로 지칭되는 최소 배지 50 ㎖ (회분식(batch) 배양)에서 배양하였다. 24시간의 인큐베이션 기간 후, 60 mM L-오르니틴 (7.9 g/ℓ에 상응함)이 측정되었다. 세포 내에서, 약 70분의 인큐베이션 기간에 걸쳐 상기 균주의 세포 내에서 약 200 mM의 L-오르니틴 농도가 측정되었다. LysE가 L-오르니틴을 또한 세포 밖으로 수송하는지 여부를 명확히 하기 위해, 13032::argF 균주를 복제성 플라스미드 pEC7lysE로 형질전환시켰다. 이러한 수단은 균주에 증가된 LysE 활성을 제공함으로써 균주가 더 높은 외수송 속도로 L-오르니틴을 배지 내로 수송하게 하도록 의도되었다. 그러나, 상기 수단은 L-오르니틴 외수송 속도를 증가시키지 않았다. 대조군 균주 (13032::argF) 및 형질전환체 (pEC7lysE를 보유하는 13032::argF) 양쪽에서 동일한 외수송 속도 (0.6 nmol/분 /(건조 질량 mg))가 결정되었다. 이로부터, 저자들은 L-오르니틴이 LysE 외수송체에 의해 외수송되지 않는 것으로 결론지었다. 이들은 코리네박테리움 글루타미쿰 내에 L-오르니틴에 대한 또 다른 미지의 외수송 기능 (외수송 단백질)이 있어야 한다는 결론을 또한 얻었다 (문헌 [Bellmann et al., 2001]의 1771면의 도 5b 및 1772면 21-28행).

LysE 변이체 (서열 4 참조)가 씨. 글루타미쿰 R에서 확인되었고, 이는 아미노산 잔기 3개만큼 확장된 N 말단에 의해 서열 2에 제시된 균주 ATCC 13032로부터의 LysE 외수송체의 아미노산 서열과 상이하다. 상기 아미노산 잔기들의 서열은 메티오닌, 발린, 이소류신 (MVI)이다. 균주 R로부터의 이러한 LysE 폴리펩티드가 루프 영역의 형성에서 야생형 단백질과 상이하고, 더욱 구체적으로는 더 이상 상기 루프를 형성할 수 없으며, 따라서 L-리신 및 L-아르기닌의 개선된 외수송을 달성할 수 있는 변이체로서 EP 1266966 B1에서 기술되었다.

또 다른 LysE 변이체가 문헌 [Gunji and Yasueda, Journal of Biotechnology 127, 2006, 1-13]에서 기술되었다. 저자들은 의무적 메틸영양성(methylotrophic) 박테리아인 메틸로필루스 메틸로트로푸스(Methylophilus methylotrophus)에 의한 L-리신 형성에 관심이 있었다. 이들은 엠. 메틸로트로푸스에 의한 리신 형성을 개선하기 위해 엠. 메틸로트로푸스를 씨. 글루타미쿰 ATCC13869 lysE 유전자를 함유한, pSE로 지칭되는 플라스미드로 형질전환시켰다. 그러나, 저자들은 돌연변이된 형태의 lysE 유전자 (lysE24)만 엠. 메틸로트로푸스에서 안정적인 방식으로 확립시킬 수 있었음을 발견하였다. lysE 유전자의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)이 티민 잔기의 삽입으로 인해 lysE24 대립유전자에서 이동되어, 432 bp 뒤에서 리딩 프레임의 종결을 초래하였다. 말단절단된 리딩 프레임은 씨. 글루타미쿰 ATCC13869의 야생형 LysE 단백질보다 C 말단에서 아미노산 잔기 92개만큼 더 짧은 LysE 단백질을 코딩한다. 이는 아미노산 잔기 141개의 길이이다. 또한, 말단절단 단백질의 C-말단의 마지막 6개의 아미노산 (잔기 135-141)이 야생형 LysE 아미노산 서열의 아미노산과 상이하다. 플라스미드 (pSE24) 상의 변형된 LysE 대립유전자를 보유하는 엠. 메틸로트로푸스 균주를 리신 형성에 대해 시험하였다. 이를 위해, 균주를 유가식(fed-batch) 배양물 형태로 50시간 동안 0.3 ℓ의 SEIIc로 지칭되는 최소 배지에서 검정하였다. 저자들은 형질전환체가 0.55 mM L-리신 및 0.19 mM L-아르기닌에 더하여 소량 (11.8 mg/ℓ에 상응하는 0.07 mM)의 L-오르니틴을 또한 형성하였음을 발견하였다. 저자가 설명한 바와 같이, 이러한 관찰된 L-오르니틴 형성은 돌연변이된 수송체의 변경된 기질 특이성으로 인한 것이거나 또는 가능하게는 균주의 변경된 세포내 L-아르기닌 풀(pool)로 인한 것이다. EP 1266966 B1 (발명가: 군지(Gunji) 및 야수에다(Yasueda))은 L-리신 및 L-아르기닌의 배출에 대한 LysE24 수송체의 양성 작용을 기술한다.

발명의 목적

본 발명의 목적은 L-오르니틴의 발효 제조를 위한 신규 방법을 제공하는 것이다.

발명의 설명

본 발명은

a) L-오르니틴 외수송체의 활성이 있고 아미노산 서열이 서열 2의 아미노산 서열에 대해 최소 (≥) 35％, ≥ 40％, ≥ 50％, ≥ 55％, ≥ 60％, ≥ 65％, ≥ 70％, ≥ 75％, ≥ 80％, ≥ 85％, ≥ 90％, ≥ 92％, ≥ 94％, ≥ 96％, ≥ 97％, ≥ 98％, ≥ 99％ 또는 100％, 바람직하게는 ≥ 70％, 특히 바람직하게는 ≥ 90％, 매우 특히 바람직하게는 ≥ 96％, 가장 바람직하게는 100％ 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 과다발현하는, 코리네박테리움, 바실루스, 스트렙토미세스(Streptomyces), 아르트로박터 및 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae)로 이루어진 군으로부터 선택된 L-오르니틴-배출 박테리아를 배지에서 발효시키는 단계,

b) 상기 L-오르니틴을 상기 배지 내에 축적시키고, 이때 발효 브로쓰(broth)를 수득하는 단계

를 수행하고,

c) 이때, DSM23239로 기탁된 플라스미드 pEC7lysE가 과다발현을 위해 사용되지 않으며,

d) 코딩되는 폴리펩티드의 길이가, 적절한 경우, 아미노산 또는 아미노산 잔기 ≥ 146개 내지 ≤ 286개인

것을 특징으로 하는 L-오르니틴의 제조 방법에 관한 것이다.

아미노산 또는 아미노산 잔기 ≥ 171개 내지 ≤ 286개, ≥ 196개 내지 ≤ 261개, ≥ 203개 내지 ≤ 258개, ≥ 218개 내지 ≤ 243개, ≥ 228개 내지 ≤ 236개, 및 ≥ 228개 내지 ≤ 233개로 이루어진 군으로부터 길이 범위를 선택하는 것이 바람직하다.

≥ 203개 내지 ≤ 258개, ≥ 218개 내지 ≤ 243개, ≥ 228개 내지 ≤ 236개, 및 ≥ 228개 내지 ≤ 233개의 길이 범위가 특히 바람직하고, ≥ 228개 내지 ≤ 236개 및 ≥ 228개 내지 ≤ 233개의 길이 범위가 매우 특히 바람직하다.

하기에서 L-오르니틴이 언급되는 경우에, 이러한 용어는 이의 염, 예를 들어, 예를 들어, L-오르니틴 모노히드로클로라이드 또는 L-오르니틴 술페이트를 또한 포함한다.

본 발명에 따른 방법은 코리네박테리움 속, 바실루스 속, 스트렙토미세스 속, 아르트로박터 속 및 엔테로박테리아세아에 과로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아를 사용한다.

코리네박테리움 속에서, 하기의 종을 기초로 하는 균주들이 바람직하고:

코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens), 예를 들어 표준 균주(type strain) DSM44549,

코리네박테리움 글루타미쿰, 예를 들어 표준 균주 ATCC13032 또는 균주 R, 및

코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 예를 들어 균주 ATCC6871,

코리네박테리움 글루타미쿰 종이 매우 특히 바람직하다.

코리네박테리움 글루타미쿰 종의 일부 표본은 종래 기술에서 다른 명칭 하에 또한 공지되어 있다. 여기에는 하기의 것들이 예를 들어 포함된다:

코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum)으로 지칭되는 균주 ATCC13870,

코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium)으로 지칭되는 균주 DSM20137,

코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola)로 지칭되는 균주 ATCC17965,

브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)으로 지칭되는 균주 ATCC14067,

브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum)으로 지칭되는 균주 ATCC13869, 및

브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum)으로 지칭되는 균주 ATCC14020.

코리네박테리움 글루타미쿰에 대해 용어 "마이크로코쿠스 글루타미쿠스(Micrococcus glutamicus)"가 또한 사용되었다. 코리네박테리움 에피시엔스 종의 일부 표본, 예를 들어 균주 FERM BP-1539는 종래 기술에서 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes)로 또한 지칭되었다..

바실루스 속에서, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 종이 바람직하다.

아르트로박터 속에서, 아르트로박터 시트레우스(Arthrobacter citreus) 종이 바람직하다.

엔테로박테리아시아에 과에서, 에스케리키아, 에르위니아(Erwinia), 프로비덴시아(Providencia), 판토에아(Pantoea) 및 세라티아(Serratia) 속이 바람직하다. 에스케리키아 및 세라티아 속이 특히 바람직하다. 에스케리키아 속의 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 종, 세라티아 속의 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 종, 프로빈데시아 속의 프로비덴시아 레트게리(Providencia rettgeri) 종이 매우 특히 바람직하다.

바람직하게는, L-오르니틴 외수송체를 과다발현시키는 수단에 사용된 박테리아 또는 균주 (출발 균주)는 L-오르니틴을 이들 주위의 영양 배지 내로 배출하고 이를 배지에 축적시키는 능력을 이미 갖고 있다. 이에 대해, "생산한다"라는 표현이 하기에서 또한 사용된다. 더욱 구체적으로, 상기 과다발현 수단에 사용되는 균주는 영양 배지 내에 ≥ 0.1 g/ℓ, ≥ 0.3 g/ℓ, ≥ 1 g/ℓ, ≥ 3 g/ℓ, ≥ 10 g/ℓ의 L-오르니틴을 농축 또는 축적시키는 능력이 있다. 바람직하게는 이러한 출발 균주는 돌연변이유발 및 선택에 의해, 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 양쪽 방법의 조합에 의해 제조된 균주이다.

먼저, L-오르니틴 외수송체의 활성이 있고 아미노산 서열이 서열 2의 아미노산 서열에 대해 최소 (≥) 35％ 동일하며, 이때 코딩되는 폴리펩티드의 길이는, 적합한 경우에, 상기 기술된 길이 범위 내인 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 야생형 균주, 예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰 표준 균주 ATCC 13032 또는 균주 ATCC 14067에서 과다발현시키고, 이어서 종래 기술에 기술된 추가적인 유전학적 수단에 의해 상기 박테리아가 L-오르니틴을 생산하게 함으로써 본 발명의 수단에 적절한 박테리아를 또한 수득할 수 있다는 것이 명백하고, 이는 추가적인 설명을 필요로 하지 않는다. 야생형, 예를 들어 균주 ATCC13032, ATCC14067, ATCC13869 또는 ATCC17965를 언급된 폴리뉴클레오티드로만 형질전환시키는 것은 본 발명에 따른 방법을 초래하지 않는다.

L-오르니틴을 배출 또는 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 균주의 예는 US 5188947에 기술된 브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-BP 2344 및 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-BP 2345이다.

L-오르니틴을 배출 또는 생산하는 아르트로박터 시트레우스 종의 균주의 예는 US 5188947에 기술된 아르트로박터 시트레우스 FERM-BP 2342이다.

L-오르니틴을 배출 또는 생산하는 바실루스 서브틀리스 종의 균주의 예는 JP 57041912에 기술된 바실루스 서브틸리스 BOR-32 (FERM-P 3647)이다.

L-오르니틴을 배출 또는 생산하는 프로비덴시아 레트게리 종의 균주의 예는JP 03195494에 기술된 프로비덴시아 레트게리 ARGA6 (FERM P-11147)이다.

L-오르니틴을 배출 또는 생산하는 에스케리키아 콜라이 종의 균주의 예는 US 3668072에 기술된 에스케리키아 콜라이 B-19-19 (ATCC 21104)이다.

L-오르니틴-생산 박테리아는 전형적으로 L-시트룰린 또는 L-아르기닌 아미노산에 대해 영양요구성이다. 별법적으로, L-시트룰린 또는 L-아르기닌에 대해 영양완서성(bradytrophic)인 L-오르니틴-생산 박테리아가 또한 고려될 수 있다. 영양요구성 및 영양완서성의 정의는, 예를 들어, WO 01/09286의 9면에서 확인할 수 있다. 영양완서체는 업계에서 약한 돌연변이체로 또한 지칭된다. 사용되는 영양완서성 박테리아는, 특히, 유전자 생성물인 ArgF (오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라제), ArgG (아르기니노숙시네이트 신타제) 또는 ArgH (아르기니노숙시네이트 리아제(lyase))의 활성이 야생형에서의 활성에 비교하여 0％ 초과 (>)이지만 10％ 이하(≤)이고, 바람직하게는 > 0％ 및 ≤ 1％인 것들이다

lysE 유전자로 지칭되고, L-리신 외수송체의 활성이 있는 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 종래 기술에서 개시되었다. 이러한 폴리펩티드는 약자 LysE로 또한 지칭된다.

외수송체는 세포의 세포막 내에 존재하고 대사물, 예를 들어 L-리신 또는 L-오르니틴을 상기 세포의 세포질에서 주위의 배지 내로 수송하는 단백질이다. 이에 필요한 에너지가 아데노신 트리포스페이트 (ATP)의 형태로 제공되면, 이는 1차 능동 수송 또는 외수송으로 지칭된다. 상기 에너지가 이온 구배, 예를 들어, 나트륨 이온의 구배 형태로 제공되면, 이는 2차 능동 수송 또는 외수송으로 지칭된다 (문헌 [Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko and L. Stryer; Biochemie [Biochemistry], 5th edition, pages 378-384, Spektrum Akademischer Verlag [publisher], Heidelberg, Germany, 2003]). L-오르니틴 외수송 활성을 결정하기 위한 지침을 문헌 [Bellmann et al., Microbiology 2001; 147: 1765-74]에서 확인할 수 있다.

본 발명에 이르는 연구 과정에서, 코리네박테리움 속, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰, 및 마이크로코쿠스, 바람직하게는 마이크로코쿠스 루테우스의 리신 외수송체가 L-리신 외수송 활성에 더하여 L-오르니틴 외수송체의 활성이 있는 것으로 발견되었다.

본 발명의 수단은 L-오르니틴에 대한 외수송 활성이 있고, 아미노산 서열이 서열 2의 아미노산 서열에 대해 최소 (≥) 35％, ≥ 40％, ≥ 50％, ≥ 55％, ≥ 60％, ≥ 65％, ≥ 70％, ≥ 75％, ≥ 80％, ≥ 85％, ≥ 90％, ≥ 92％, ≥ 94％, ≥ 96％, ≥ 97％, ≥ 98％, ≥ 99％ 또는 100％, 바람직하게는 ≥ 70％, 특히 바람직하게는 ≥ 90％, 매우 특히 바람직하게는 ≥ 96％, 가장 바람직하게는 100％ 동일하며, 이때 코딩되는 폴리펩티드의 길이는, 적합한 경우에, 상기 기술된 길이 범위 내인 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 이용한다.

적절한 L-오르니틴 외수송체의 예는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 (서열 2), 코리네박테리움 글루타미쿰 R (서열 4), 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 (서열 5), 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 (서열 7), 코리네박테리움 에피시엔스 YS-314 (서열 9), 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphteriae) NCTC 13129 (서열 10), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum) ATCC6940 (서열 11), 코리네박테리움 오리무코숨(Corynebacterium aurimucosum) ATCC700975 (서열 12), 코리네박테리움 마트루코티이(Corynebacterium matruchotii) ATCC33806 (서열 13), 코리네박테리움 슈도제니탈리움(Corynebacterium pseudogenitalium) ATCC33035 (서열 14), 코리네박테리움 아콜렌스(Corynebacterium accolens) ATCC49725 (서열 15), 코리네박테리움 글루쿠로날리티쿰(Corynebacterium glucuronalyticum) ATCC 51867 (서열 16), 마이크로코쿠스 루테우스(Micrococcus luteus) NCTC2665 (서열 17), 코리네박테리움 투부쿨로스테아리쿰(Corynebacterium tubuculostearicum) SK141 (서열 18) 및 코리네박테리움 마트루코티이 ATCC14266 (서열 19)의 리신 외수송체 또는 LysE 폴리펩티드이다. 서열 18 및 서열 19는 업계에서 ArgO 폴리펩티드로 또한 지칭된다.

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869의 lysE 유전자의 뉴클레오티드 서열이 본 연구에서 결정되었다 (서열 6 및 서열 8). 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869의 LysE 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열 5 및 7에 제시된다. 이들은 서열 2에 제시된 씨. 글루타미쿰 ATCC13032 LysE의 아미노산 서열과 동일하다.

표 1은 코리네박테리움 속 및 마이크로코쿠스 루테우스의 다양한 표본의 LysE 폴리펩티드의 접속 번호를 열거하고, 이는 미국 국립 생물공학 정보 센터 (NCBI, 미국 메릴랜드주 베데스다)의 데이터베이스로부터 취득되었다. 또한, 표 1은 서열 목록에 제시된 LysE 폴리펩티드의 아미노산 서열들을 언급한다. 마지막으로, 표 1은 코딩되는 LysE 폴리펩티드의 길이 (아미노산 개수)를 나타낸다.

<표 1>

도 1a 및 1b는 표 1에 열거된 LysE 폴리펩티드의 아미노산 서열들의 다중 서열 정렬을 제시한다. 도 1a 및 1b에 제시된 아미노산 서열들의 정렬은 클론 매니저 9 프로페셔널 에디션(Clone Manager 9 Professional Edition) 프로그램 (사이언티픽 & 에듀케니셔널 소프트웨어(Scientific & Educational Software), 미국 27513 노스캐롤라이나주 캐리 피너 윌드 600 스위트 202)에 의해 산출되었다. 정렬에 사용된 기준 분자는 ATCC13032의 LysE 폴리펩티드 (LysE)였다. 채점 매트릭스를 위해, "블로섬(Blosum) 62" 설정 (문헌 [Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko and L. Stryer; Biochemie, 5th edition, pages 194-197, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 2003] 참조)이 선택되었다.

적절한 경우, 종래 기술에 기술된 프로그램, 예를 들어, ClustalX 프로그램 (문헌 [Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F., Jeanmougin, F. and Higgins, D.G. (1997), The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research, 25: 4876-4882])을 사용하는 것이 또한 가능하다.

코리네박테리움 글루타미쿰 R의 LysE 폴리펩티드 (서열 4 참조)의 아미노산 잔기 4-236은 서열 2에 제시된 씨. 글루타미쿰 ATCC13032 LysE 아미노산 서열에 상응한다. 씨. 글루타미쿰 R 폴리펩티드에는 N-말단에 아미노산 잔기 3개 (메티오닌-발린-이소류신)의 추가적인 서열이 있다. 이러한 추가적인 잔기들은 lysE 유전자로부터 염기쌍 9개 더 상류에 위치하는 시작 코돈이 씨. 글루타미쿰 ATCC13032에서의 lysE 유전자 (서열 1 참조)의 시작 코돈 대신 사용되는 경우에 생산된다.

서열 2에 제시된 씨. 글루타미쿰 ATCC13032 LysE 아미노산 서열에 대해, 씨. 에피시엔시스 YS-314의 LysE 폴리펩티드의 아미노산 서열은 71％, 씨. 디프테리아에 NCTC 13129의 것은 44％, 코리네박테리움 스트리아툼 ATCC6940의 것은 44％, 코리네박테리움 오리무코숨 ATCC700975의 것은 42％, 코리네박테리움 마트루코티이 ATCC33806의 것은 43％, 코리네박테리움 슈도제니탈리움 ATCC33035의 것은 43％, 코리네박테리움 아콜렌스 ATCC49725의 것은 43％, 코리네박테리움 글루쿠로날리티쿰 ATCC 51867의 것은 36％, 마이크로코쿠스 루테우스 NCTC2665의 것은 40％ 동일하다. 또한, 씨. 투부쿨로스테아리쿰 SK141의 ArgO 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 2의 아미노산 서열에 대해 43％ 동일하다. 또한, 씨. 마트루코티이 ATCC14266의 ArgO 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 2의 아미노산 서열에 대해 44％ 동일하다. 동일성 백분율은 블로섬 62 설정을 사용하여 클론 매니저 9 프로그램에 의해 전체적인 서열 정렬을 생성시킴으로써 산출되었다 (도 2 참조).

lysE 유전자, 즉, L-오르니틴 외수송체의 활성이 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적절한 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 생물로부터 단리할 수 있다. 특히 실험 지침서 ["PCR", Newton and Graham, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994], 및 WO 2006/100211의 14-17면에서 지침을 확인할 수 있다.

L-오르니틴 외수송 활성이 있고 아미노산 서열이 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 특색을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 본 발명에 따른 방법을 위해 사용하는 것이 특히 바람직하다:

a) 서열 2 또는 서열 4에 따른 아미노산 서열,

b) 하나 이상, 최대 25개, 20개, 15개, 10개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 결실(들)을 포함하는, 서열 2에 따른 아미노산 서열,

c) 하나 이상, 최대 25개, 20개, 15개, 10개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 삽입(들)을 포함하는, 서열 2에 따른 아미노산 서열,

d) 하나 이상, 최대 140개, 130개, 120개, 110개, 100개, 90개, 80개, 70개, 60개, 50개, 40개, 30개, 25개, 20개, 15개, 10개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개, 바람직하게는 최대 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 교체(들) (치환(들))을 포함하는, 서열 2에 따른 아미노산 서열, 및

e) N 말단 및/또는 C 말단 상에 하나 이상, 최대 25개, 20개, 15개, 10개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개, 바람직하게는 최대 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 부가(들)을 포함하는, 서열 2에 따른 아미노산 서열.

적절한 경우, 보존적 아미노산 치환이 바람직하다. 방향족 아미노산의 경우, 보존적 치환은 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신이 서로 치환되는 것이다. 소수성 아미노산의 경우, 보존적 치환은 류신, 이소류신 및 발린이 서로 치환되는 것이다. 극성 아미노산의 경우, 보존적 치환은 글루타민 및 아스파라긴이 서로 치환되는 것이다. 염기성 아미노산의 경우, 보존적 치환은 아르기닌, 리신 및 히스티딘이 서로 치환되는 것이다. 산성 아미노산의 경우, 보존적 치환은 아스파르트산 및 글루탐산이 서로 치환되는 것이다. 히드록실 기를 함유하는 아미노산의 경우, 보존적 치환은 세린 및 트레오닌이 서로 치환되는 것이다.

엄격한 조건 하에 서열 1, 바람직하게는 서열 1의 코딩 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열과 혼성화하고, L-오르니틴 외수송 활성이 있는 폴리펩티드를 코딩하며, 이때 코딩되는 단백질의 아미노산 서열이 서열 2의 아미노산 서열과 ≥ 70％ 동일하며 코딩되는 폴리펩티드의 길이가, 적절한 경우, 상기 기술된 길이 범위 내인 폴리뉴클레오티드를 사용하는 것이 또한 가능하다.

당업자는 핵산 및 폴리뉴클레오티드 각각의 혼성화에 관한 지침을 특히 지침서 ["The DIG System Users Guide for Filter Hybridization", Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993]) 및 문헌 [Liebl et al., International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)]에서 확인할 수 있다. 엄격한 조건 하에 혼성화가 일어나고, 바꿔 말하면, 프로브, 즉 서열 1, 바람직하게는 서열 1의 코딩 영역에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드과 표적 서열, 즉 상기 프로브로 처리되거나 이에 의해 확인되는 폴리뉴클레오티드가 70％ 이상 동일한 경우에만 하이브리드가 형성된다. 혼성화 (세정 단계 포함)의 엄격성은 완충제 조성, 온도 및 염 농도를 변화시키는 것에 의해 영향을 받거나 결정되는 것으로 공지되어 있다. 혼성화 반응은 일반적으로 세정 단계와 비교하여 비교적 낮은 엄격성으로 수행된다 (문헌 [Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996]).

예를 들어, 약 50℃-68℃ 온도에서 5× SSC 완충제를 혼성화 반응에 사용할 수 있다. 이때, 프로브가 사용된 프로브의 뉴클레오티드 서열에 대해 70％ 미만으로 동일한 폴리뉴클레오티드와 또한 혼성화할 수 있다. 이같은 하이브리드는 덜 안정적이고, 엄격한 조건 하에서의 세정에 의해 제거된다. 이는, 예를 들어, 염 농도를 2× SSC 또는 1× SSC로, 적합한 경우에는, 이어서 0.5× SSC로 낮춤으로써 달성될 수 있고 (문헌 [The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany, 1995]), 이때 온도는 약 50℃-68℃, 약 52℃-68℃, 약 54℃-68℃, 약 56℃-68℃, 약 58℃-68℃, 약 60℃-68℃, 약 62℃-68℃, 약 64℃-68℃, 약 66℃-68℃로 설정된다. 약 64℃-68℃ 또는 약 66℃-68℃의 온도 범위가 바람직하다. 염 농도를 0.2× SSC 또는 0.1× SSC에 상응하는 농도로 낮추는 것이 선택적으로 가능하다. SSC 완충제는 0.1％ 농도의 나트륨 도데실 술페이트 (SDS)를 선택적으로 함유한다. 혼성화 온도를 약 1-2℃의 단계로 50℃에서 68℃로 점진적으로 증가시킴으로써, 사용된 프로브의 서열 또는 상보적인 서열에 대해 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 92％ 이상, 94％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상, 적합한 경우에는 100％ 동일하고, L-오르니틴 외수송 활성이 있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 단리할 수 있다. 혼성화에 관한 추가적인 지침을 "키트"의 형태로 시장에서 수득할 수 있다 (예를 들어, 로슈 디아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH) (독일 만하임)의 DIG 이지 하이브(DIG Easy Hyb), 카탈로그 번호 1603558).

본 발명의 수단을 위해, L-오르니틴 외수송 활성이 있는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 L-오르니틴을 생산하는 박테리아 또는 출발 또는 모 균주에서 과다발현되고, 이때 코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 서열 2의 아미노산 서열에 대해 ≥ 35％ 동일하고, 코딩되는 폴리펩티드의 길이는, 적합한 경우에, 상기 기술된 범위 내이다.

일반적으로 과다발현은 출발 균주 (모 균주) 또는 야생형 균주 (야생형 균주가 출발 균주인 경우)와 비교하여 리보핵산, 단백질 (폴리펩티드) 또는 효소의 세포내 농도 또는 활성이 증가하는 것을 의미한다. 출발 균주 (모 균주)는 과다발현에 이르는 수단이 수행된 균주를 의미한다.

용어 단백질 및 폴리펩티드는 상호교환가능한 것으로 간주된다.

과다발현을 위해, 재조합 과다발현 방법이 바람직하다. 이는 시험관 내에서 제공되는 DNA 분자를 사용하여 미생물이 제조되는 임의의 방법을 포함한다. 이같은 DNA 분자의 예로는 프로모터, 발현 카세트, 유전자, 대립유전자, 코딩 영역 등이 포함된다. 이들은 형질전환 방법, 접합 방법, 형질도입 방법, 또는 유사한 방법에 의해 원하는 미생물 내로 전달된다.

과다발현 수단은 상응하는 폴리펩티드의 활성 또는 농도를 과다발현을 초래하는 수단 이전의 균주 내의 상기 폴리펩티드의 활성 또는 농도 수준을 기초로 일반적으로 최소 10％, 25％, 50％, 75％, 100％, 150％, 200％, 300％, 400％ 또는 500％만큼, 바람직하게는 최대 1000％, 2000％, 4000％, 10000％ 또는 20000％만큼 증가시킨다.

코리네박테리움 글루타미쿰 종의 균주를 사용하는 경우, 균주 ATCC13032 또는 ATCC14067 또는 ATCC13869 또는 ATCC17965에서의 L-오르니틴 외수송 활성이, 적합한 경우에, 과다발현을 결정하기 위한 적절한 기준점이다. ATCC13032을 기초로 하거나 이로부터 유래된 균주를 사용하는 경우, 상기 균주 ATCC13032가 적절한 기준점이다. 이의 예는 균주 ATCC13032를 기초로 하는, 본 발명에 이르는 연구 과정에서 제조된 균주인 ATCC13032_델타_argFRGH/pVWEx1_lysE이다. ATCC14067을 기초로 하거나 이로부터 제조된 균주를 사용하는 경우, 상기 균주 ATCC14067이 적절한 기준점이다. ATCC13869를 기초로 하거나 이로부터 제조된 균주를 사용하는 경우, 상기 균주 ATCC13869가 적절한 기준점이다. 추가적인 적절한 기준점들이 이에 따라 산출된다.

에스케리키아 콜라이 종의 균주, 바람직하게는 에스케리키아 콜라이 균주 K12를 사용하는 경우, 균주 MG1655에서의 L-오르니틴 외수송 활성이, 적합한 경우에, 과다발현을 결정하기 위한 적절한 기준점이다.

과다발현은 종래 기술에서 이용가능한 다수의 방법에 의해 달성된다.

여기에는 카피수를 증가시키는 것 및 유전자의 발현을 지시하거나 제어하는 뉴클레오티드 서열을 변형시키는 것이 포함된다. 유전자의 전사는 특히 프로모터에 의해, 그리고 선택적으로는 전사를 억제하는 단백질 (리프레서 단백질) 또는 전사를 촉진하는 단백질 (활성화 단백질)에 의해 제어된다. 형성된 RNA의 번역은 특히 리보솜 결합 부위 및 시작 코돈에 의해 제어된다. 프로모터 및 리보솜 결합 부위, 및 선택적인 시작 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 DNA 분자는 발현 카세트로 또한 지칭된다.

상기 방법은 촉매 활성이 증가된, 폴리펩티드 또는 효소의 변이체의 사용을 또한 포함한다.

박테리아 세포질에서 복제되는 플라스미드에 의해 카피수가 증가될 수 있다. 이를 위해, 유전자 카피수에서의 원하는 증가를 설정하기 위해 사용될 수 있는 다수의 플라스미드가 매우 다양한 미생물 군들에 대해 종래 기술에 기술되어 있다. 에스케리키아 속에 적절한 플라스미드가, 예를 들어, 지침서 [Molecular Biology, Labfax (Ed.: T.A. Brown, Bios Scientific, Oxford, UK, 1991)]에 기술되어 있다. 코리네박테리움 속에 적절한 플라스미드가, 예를 들어, 문헌 [Tauch et al., Journal of Biotechnology 104 (1-3), 27-40, (2003)] 또는 [Stansen et al., Applied and Environmental Microbiology 71, 5920-5928 (2005)]에 기술되어 있다.

코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 카피수를 증가시키기 위해, DSM 23239에 기탁된 플라스미드 pEC7lysE를 사용하는 것이 본 발명에 이르는 수단에서 배제된다. pEC7lysE 플라스미드의 뉴클레오티드 서열이 결정되어 있고, 서열 29에서 제시된다.

추가적인 카피를 박테리아 염색체 내로 도입함으로써 하나 (1개) 이상의 카피만큼 카피수가 더 증가될 수 있다. 코리네박테리움 속, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰에 적절한 방법이, 예를 들어, 특허 WO 03/014330, WO 03/040373 및 WO 04/069996에 기술되어 있다. WO 03/014330은 천연 유전자좌에서의 유전자의 직렬(tandem) 배가를 위한 방법을 기술한다. WO 03/040373은 추가적인 유전자좌에서 유전자의 제2 또는 제3 카피를 혼입하는 방법을 기술하고, 이때 이러한 특정 유전자좌는 성장 또는 특정 아미노산 (본 발명의 경우에는 L-오르니틴)의 생산에 필수적이지 않다. 본 발명에 따른 방법에서 lysE 유전자의 제2 카피 또는 추가적인 카피를 혼입하기 위한 적절한 유전자좌의 예는 odh, sucA, dapA, dapB, ddh, lysA, argR, argF, argG 및 argH 유전자이다. WO 04/069996 (표 12 및 13 참조)은 lysE 유전자의 추가적인 카피를 혼입하는데 적절한, 씨. 글루타미쿰의 유전자간(intergenic) 영역 및 파지 또는 파지 성분을 코딩하는 유전자를 기술한다.

에스케리키아 속에 적절한 방법의 예는 파지의 att 부위 내로의 유전자 카피의 혼입 (문헌 [Yu and Court, Gene 223, 77-81 (1998)]), EP 0 332 448에 기술된 바와 같은, 파지 뮤를 사용하는 염색체 증폭, 또는 문헌 [Hamilton et al., Journal of Bacteriology 174, 4617-4622 (1989)] 또는 [Link et al., Journal of Bacteriology 179, 6228-6237 (1997)]에 기술된 바와 같은, 조건부로 복제되는 플라스미드를 사용하는 유전자 교체 방법이다.

발현시킬 유전자에 기능적으로 연결된 강력한 프로모터를 사용함으로써 유전자 발현이 추가로 증가될 수 있다. 천연 프로모터, 즉 야생형 또는 모 균주 내에 존재하는 것보다 강력한 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. 이를 위해, 종래 기술에서 다수의 이용가능한 방법이 있다.

코리네박테리움 속에 대한 적절한 프로모터 및 발현 시스템을 특히 특허 EP 0 629 699 A2, US 2007/0259408 A1 (gap 프로모터), WO 2006/069711, EP 1 881 076 A1, WO 2008/088158, WO 2009/025470 (butA 프로모터, pyk 프로모터), US 6,861,246 (dapA 프로모터의 MC20 및 MA16 변이체), 및 EP 1 918 378 A1 (sod 프로모터), 및 개요서 예컨대 문헌 ["Handbook of Corynebacterium glutamicum" (Eds.: Lothar Eggeling and Michael Bott, CRC Press, Boca Raton, US (2005))], 또는 서적 ["Corynebacteria, Genomics and Molecular Biology" (Ed.: Andreas Burkovski, Caister Academic Press, Norfolk, UK (2008))]에서 확인할 수 있다. 제어된 발현, 즉 유도가능하거나 억제가능한 발현을 허용하는 프로모터의 예가, 예를 들어, 문헌 [Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988))]에 기술되어 있다.

에스케리키아 속에 적절한 프로모터는 오랫동안 공지되어 있었다. 이러한 프로모터에는, 특히, 고전적 프로모터인 lac 프로모터, trp 프로모터, 하이브리드 프로모터인 tac 및 trc, 파지 λ의 PL 및 PR 프로모터가 포함된다. 유사하게, T7 파지의 프로모터, 기어-박스(gear-box) 프로모터, nar 프로모터, 또는 rrsG, rnpB, csrA, csrB, ompA, fusA, pepQ, rplX 또는 rpsG 유전자의 프로모터를 사용할 수 있다. 예를 들어, λ 파지의 cI857-PR 또는 cI857-PL 시스템에 의해, 제어된 발현이 허용된다 (문헌 [Goetting et al., BioTechniques 24, 362-366 (1998)]). 문헌 [Makrides, Microbiological Reviews 60(3), 512-538 (1996)] 또는 지침서 ["Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology", F.C. Neidhardt (Editor in Chief), ASM Press, Washington, US (1996)]에서 개요를 확인할 수 있다.

이같은 프로모터 또는 발현 카세트는 유전자의 코딩 영역의 시작 코돈의 첫 번째 뉴클레오티드로부터 뉴클레오티드 1개 내지 1000개, 바람직하게는 1개 내지 500개 상류의 거리에서 전형적으로 사용된다. 거리 1은 프로모터 또는 발현 카세트가 코딩 영역의 시작 코돈의 첫 번째 염기 바로 앞에 위치한다는 것을 의미한다.

씨. 글루타미쿰에서의 lysE 유전자의 발현을 증가시키기 위해, 적절한 프로모터, 예를 들어, 씨. 글루타미쿰 sod 프로모터 (EP 1918 378 A1의 서열 1 참조) 또는 씨. 글루타미쿰 gap 프로모터 (US 2007/0259408의 서열 3 참조)를 서열 1의 위치 930과 990 사이에 삽입하는 것이 바람직하다.

프로모터 및 리보솜 결합 부위 (RBS)를 함유하는 발현 카세트, 예를 들어, 씨. 글루타미쿰 sod 유전자의 발현 단위 (EP 1918 378 A1의 서열 2 참조) 또는 US 2007/0259408에 기술되고 서열 28 (이러한 서열에서 PgapRBS로 또한 지칭됨)에 제시된 씨. 글루타미쿰 gap 유전자의 발현 단위를 사용할 때, 이들은 씨. 글루타미쿰의 경우에 바람직하게는 서열 1의 위치 930과 1001 사이에, 특히 바람직하게는 위치 1000과 1001 사이에 삽입된다. 이같은 발현 카세트 내의 적절한 리보솜 결합 부위의 예는 문헌 [Amador, Microbiology 145, 915-924 (1999)]에 상술되어 있는 뉴클레오티드 서열 5'-agaaaggagg-3'이다.

다수의 프로모터를 원하는 유전자의 상류에 놓거나 또는 이들을 발현시킬 유전자에 기능적으로 연결하고, 이러한 방식으로 증가된 발현을 달성하는 것이 또한 가능하다. 이는, 예를 들어, WO 2006/069711에 기술되어 있다.

코리네박테리움 글루타미쿰 및 에스케리키아 콜라이 프로모터의 구조는 잘 알려져 있다. 따라서, 뉴클레오티드들의 하나 이상의 치환(들) 및/또는 하나 이상의 삽입(들) 및/또는 하나 이상의 결실(들)에 의해 프로모터의 서열을 변형시킴으로써 프로모터의 강도를 증가시키는 것이 가능하다. 이의 예를 특히 문헌 ["Herder Lexikon der Biologie" [Herder's Encyclopaedia of Biology] (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany (1994))]에서 확인할 수 있다.

따라서, lysE 유전자를 과다발현시키기 위한 적절한 수단은 상기 lysE 유전자의 프로모터를 변형 또는 돌연변이시키는 것이다.

코리네박테리움 글루타미쿰 및 에스케리키아 콜라이 리보솜 결합 부위의 구조 또한 잘 알려져 있고, 예를 들어, 문헌 [Amador, Microbiology 145, 915-924 (1999)], 및 유전학 지침서 및 교재, 예를 들어 ["Gene und Klone" [Genes and Clones] (Winnacker, Verlag Chemie, Weinheim, Germany (1990))] 또는 ["Molecular Genetics of Bacteria" (Dale and Park, Wiley and Sons Ltd., Chichester, UK (2004))]에 기술되어 있다. 잘 발현되는 유전자들, 즉, 생물에서의 가장 중요한 구조적 유전자들에는 양호한 리보솜 결합 부위가 있고 (문헌 [Amador, Microbiology 145, 915-924 (1999)]), 즉 리보솜 결합 부위가 컨센서스(consensus) 서열과 매우 유사하거나 이에 상응한다. 고도로 발현되는 유전자들에는 강한 리보솜 결합 부위가 있다는 것이 문헌에서 실연되었다 (문헌 [Karlin and Mrazek, Journal of Bacteriology 2000; 182(18): 5238-50]). 결과적으로, 리보솜 결합 부위를 조정하는 것에 의해 유전자 또는 mRNA의 번역 효율이 달성될 수 있다.

발현시킬 유전자의 코돈 용법을 조정하는 것에 의해 번역 효율을 증가시키는 것이 또한 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Najafabiad et al., Nucleic Acids Research 2009, 37 (21): 7014-7023]).

활성화 단백질의 발현을 증가시키는 것 또는 리프레서 단백질의 발현을 감소시키거나 이의 스위치를 끄는 것에 의해 과다발현이 또한 달성될 수 있다.

lysE를 발현시키기 위한 활성화 단백질 LysG가 문헌 [Bellmann et al., Microbiology 2001; 147: 1765-74]에서 기술되었고, 이러한 문헌에서 "양성 조절인자"로 지칭된다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 LysG의 아미노산 서열이 서열 30에서 제시된다. 전체적인 서열 정렬에서, 서열 30의 아미노산 서열에 대해 코리네박테리움 디프테리아에 NCTC13129의 LysG 폴리펩티드의 아미노산 서열은 62％, 코리네박테리움 에피시엔스 YS-314의 LysG 폴리펩티드의 아미노산 서열은 81％, 코리네박테리움 글루타미쿰 R의 LysG 폴리펩티드의 아미노산 서열은 94％ 동일하다.

활성화 단백질에 대해, 서열 30에 제시된 아미노산 서열에 대해 ≥ (최소) 55％, 바람직하게는 ≥ 80％, 특히 바람직하게는 ≥ 90％, ≥ 92％ 또는 ≥ 94％, 매우 특히 바람직하게는 ≥ 99％, 가장 바람직하게는 100％ 동일한 폴리펩티드가 바람직하다.

바람직하게는 카피수를 증가시키는 것, 강력한 프로모터를 사용하는 것, 프로모터를 돌연변이시키는 것, 적절한 발현 카세트를 사용하는 것 및 활성화 단백질을 과다발현시키는 것으로 이루어진 군으로부터 선택된, 언급된 과다발현 수단들이 적절한 방식으로 조합될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 적절한 프로모터를 사용하는 것을 카피수를 증가시키는 것과 조합하는 것, 또는 활성화 단백질을 과다발현시키는 것을 적절한 프로모터 또는 적절한 발현 카세트를 사용하는 것과 조합하는 것이 가능하다.

L-오르니틴 외수송 활성이 있는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관련된 수단에 더하여, 개별적인 생합성 유전자들의 발현을 감소시키는 것이 또한 가능하다.

따라서, L-오르니틴 생산을 개선하기 위해, 적합한 경우에, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 추가적으로 감소시키는 것이 적절하다:

a) 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 (EC 1.2.4.2)의 E1 서브유닛을 코딩하는 odhA 유전자,

b) 디히드로리포아미드 숙시닐 트랜스퍼라제 (EC 2.3.1.61)를 코딩하는 sucA 유전자,

c) 디히드로디피콜리네이트 신타제 (DapA, EC 4.2.1.52)를 코딩하는 dapA 유전자,

d) 디히드로디피콜리네이트 신타제 (DapB, EC 1.3.1.26)를 코딩하는 dapB 유전자,

e) 메소-디아미노피멜레이트 데히드로게나제 (Ddh, EC 1.4.1.16)를 코딩하는 ddh 유전자,

f) 디아미노피멜레이트 데카르복실라제 (LysA, EC 4.1.1.20)를 코딩하는 lysA 유전자,

g) L-아르기닌 생합성의 리프레서 (ArgR)를 코딩하는 argR 유전자,

h) 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라제 (ArgF, EC 2.1.3.3)를 코딩하는 argF 유전자,

i) 아르기니노숙시네이트 신타제 (ArgG, EC 6.3.4.5)를 코딩하는 argG 유전자,

j) 아르기니노숙시네이트 리아제 (ASAL) (ArgH, EC 4.3.2.1)를 코딩하는 argH 유전자,

k) 아스파르테이트 키나제 (LysC, EC 2.7.2.4)를 코딩하는 lysC 유전자, 및

l) 아스파르테이트 세미알데히드 데히드로게나제 (Asd, EC 1.2.1.11)를 코딩하는 asd 유전자.

lysA, odhA, argR, argF, argG 및 argH로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 것이 바람직하다. lysA, odhA 및 argF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 것이 특히 바람직하다. lysA 및/또는 argF 유전자의 발현을 감소시키는 것이 매우 특히 바람직하다.

이러한 맥락에서의 용어 "발현의 감소"는 예를 들어, 약한 프로모터 또는 활성이 낮은 상응하는 효소를 코딩하는 유전자 또는 대립유전자를 사용함으로써, 또는 상응하는 유전자 또는 효소 (단백질)을 불활성화시킴으로써, 그리고 임의적으로는 이러한 수단들을 조합함으로써, 상응하는 DNA에 의해 코딩되는 박테리아 내의 하나 이상의 효소 (단백질)의 세포내 활성을 감소시키거나 이의 스위치를 끄는 것을 기술한다.

코리네박테리움 글루타미쿰에서의 다양한 강도의 공지된 프로모터들의 개요를 문헌 [Patek et al., Journal of Biotechnology 104, 311-323 (2003)]에서 확인할 수 있다. 또 다른 약한 프로모터들이 저널 [Research Disclosure, December 2006, pp 1616-1618]의 보도 512057에 기술되어 있다.

발현의 감소를 생성시키는 것에 고려될 수 있는 돌연변이는 당해 유전자의 코딩 영역 내의 하나 (1개) 이상의 염기쌍 또는 뉴클레오티드의 전이, 변위, 삽입 및 결실이다. 돌연변이에 의해 야기되는 아미노산 치환의 단백질 또는 효소의 활성에 대한 효과에 따라, 돌연변이는 미스센스(missense) 돌연변이 또는 난센스(nonsense) 돌연변이로 지칭된다.

미스센스 돌연변이는 단백질 내의 소정의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 교체되는 것을 초래하고, 이때 상기 교체는 특히 비-보존적 아미노산 치환이다. 이는 단백질의 기능성 또는 활성을 손상시키고, 이를 ≥ 0 내지 75％, ≥ 0 내지 50％, ≥ 0 내지 25％, ≥ 0 내지 10％ 또는 ≥ 0 내지 5％의 값으로 감소시킨다.

난센스 돌연변이는 유전자의 코딩 영역에서 정지 코돈을 초래하고, 따라서 번역의 조기 종결을 초래하며, 결과적으로 이의 스위치를 끈다. 유전자에서의 하나 이상의 염기쌍의 삽입 또는 결실이 프레임 이동 돌연변이에 이르러, 잘못된 아미노산이 혼입되거나 번역이 조기에 종결되는 것을 초래한다. 돌연변이가 코딩 영역에서 정지 코돈을 초래하면, 이 또한 번역의 조기 종결에 이를 것이다. 난센스 돌연변이를 생성시키는 수단들은 바람직하게는 코딩 영역의 5'-말단 부분 (폴리펩티드의 N 말단을 코딩함)에서 수행된다. 폴리펩티드의 총 길이 (화학적으로 연결된 L-아미노산의 개수에 의해 측정됨)을 100％로 하면, 본 발명의 범주 내에서, 폴리펩티드의 N 말단은 출발 아미노산인 L-포르밀-메티오닌으로부터 계산하여, 전방으로, 80％의 하류 L-아미노산을 함유하는 아미노산 서열의 일부분을 포함한다.

생체내 돌연변이유발 방법이, 예를 들어, 문헌 [Manual of Methods for General Bacteriology (Gerhard et al. (Eds.), American Society for Microbiology, Washington, DC, USA, 1981] 또는 [Tosaka et al., Agricultural and Biological Chemistry 42(4), 745-752 (1978)] 또는 [Konicek et al., Folia Microbiologica 33, 337-343 (1988)]에 기술되어 있다.

적절한 시험관내 돌연변이유발 방법은, 특히, 밀러(Miller)에 따른 히드록시아민으로의 처리 (문헌 [Miller, J.H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and OxyRated Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992]), 돌연변이유발성 올리고뉴클레오티드의 사용 (문헌 [T.A. Brown: Gentechnologie fuer Einsteiger [Genetic Engineering for Beginners], Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993] 및 [R.M. Horton: PCR-Mediated Recombination and Mutagenesis, Molecular Biotechnology 3, 93-99 (1995)]), 및 오차율이 높은 DNA 폴리머라제를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응의 사용이다. 이같은 DNA 폴리머라제의 예는 스트라타진(Stratagene) (미국 캘리포니아주 라 호야)의 뮤타자임(Mutazyme) DNA 폴리머라제 (진모르프 PCR 돌연변이유발 키트(GeneMorph PCR Mutagenesis Kit), # 600550)이다.

생체 내 또는 시험관 내에서의 돌연변이 생성에 대한 추가적인 지침 및 개요를 종래 기술 및 공지된 유전학 및 분자 생물학 교재, 예를 들어 교재 [Knippers, "Molekulare Genetik", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995], [Winnacker, "Gene and Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990] 또는 [Hagemann, "Allgemeine Genetik" [General Genetics], Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986]에서 확인할 수 있다.

공지된 유전자 또는 대립유전자 교체 방법 (문헌 [Schwarzer and Puehler, Bio/Technology 9, 84-87 (1991)]에 원리가 기술되어 있음)을 사용하여, 시험관 내에서 제조된 돌연변이, 또는 원하는 돌연변이를 함유하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 전달하는 것이 가능하다. 문헌 [Schaefer et al., Gene 145, 69-73 (1994)]에서, 씨. 글루타미쿰 hom-thrB 오페론 내로 결실을 혼입하기 위해 이러한 방법이 사용되었다. 나카가와(Nakagawa) 등의 EP 1108790 및 문헌 [Ohnishi et al., Applied Microbiology and Biotechnology 58(2), 217-223 (2002)]에서, 단리된 대립유전자로부터 출발하여 다양한 돌연변이를 씨. 글루타미쿰 염색체 내로 혼입하기 위하여 이러한 방법이 사용되었다.

유전자 발현의 표적화된 감소를 위한 한 방법은 발현을 감소시킬 유전자를 계량된 양의 IPTG (이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드)의 첨가에 의해 유도될 수 있는 프로모터, 예를 들어, trc 프로모터 또는 tac 프로모터의 제어 하에 놓는 것으로 이루어진다. 예를 들어 에스케리키아 콜라이 발현 벡터 pXK99E (WO 0226787; 부다페스트 조약에 따라 2001년 7월 31일에 DSMZ (Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen) (독일 브라운슈바이크)에 DH5알파/pXK99E 내에서 DSM14440으로 기탁됨), pEKEx2 (NCBI 접속 번호 AY585307) 또는 pVWEx2 (문헌 [Wendisch, Ph. D. thesis, Berichte des Forschungszentrums Juelich, Juel-3397, ISSN 0994-2952, Juelich, Germany (1997)])와 같은 벡터들이 이러한 목적에 적절하고, 이들은 클로닝된 유전자가 IPTG-의존적 방식으로 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 발현될 수 있게 한다.

이러한 방법은, 예를 들어, 특허 WO 02266787에서 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈 내로의 벡터 pXK99EdeaD의 통합에 의한 deaD 유전자의 조절된 발현을 위해, 그리고 문헌 [Simic et al., Applied and Environmental Microbiology 68: 3321-3327 (2002)]에서 코리네박테리움 글루타미쿰 내로의 벡터 pK18mobglyA'의 통합에 의한 glyA 유전자의 조절된 발현을 위해 사용되었다.

유전자 발현을 특이적으로 감소시키는 또 다른 방법은 더 긴 안티센스 RNA의 합성을 위해 짧은 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 벡터를 표적 세포 내로 전달하는 것을 수반하는 안티센스 기술이다. 세포 내에서, 안티센스 RNA는 특정 mRNA의 상보적인 구역에 결합할 수 있고, 이의 안정성을 감소시키거나 번역가능성을 차단할 수 있다. 당업자는 이의 예를 문헌 [Srivastava et al., Applied Environmental Microbiology 2000 Oct.; 66 (10): 4366-4371]에서 확인할 수 있다.

코돈 용법이 신장 속도에 영향을 미친다. 모 균주에서 희귀한 t-RNA에 대한 코돈을 사용함으로써 유전자 발현을 감소시킬 수 있다. 이는 WO 2008049781 및 WO 2009133063에 상세하게 기술되어 있다. 예를 들어, ATG 시작 코돈을 덜 통상적인 코돈인 GTG 또는 TTG로 교체하는 것이 번역을 손상시킬 수 있는데, 이는 AUG 코돈이 예를 들어 GUG 및 UUG 코돈보다 2배 내지 3배 더 효과적이기 때문이다 (문헌 [Khudyakov et al., FEBS Letters 232(2): 369-71 (1988)]; [Reddy et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 82(17): 5656-60 (1985)]).

L-오르니틴 외수송 활성이 있는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관련된 수단에 더하여, 개별적인 생합성 유전자들을 강화시키는 것이 또한 가능하다.

따라서, L-오르니틴 생산을 개선하기 위해, 적합한 경우에, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 효소 활성을 추가적으로 강화시키는 것이 적절하다:

a) gdh 유전자에 의해 코딩되는 글루타메이트 데히드로게나제 (EC 1.4.1.3),

b) argJ 유전자에 의해 코딩되는 글루타메이트 N-아세틸트랜스퍼라제 (EC 2.3.1.35 및 EC 2.3.1.1),

c) argB 유전자에 의해 코딩되는 아세틸글루타메이트 키나제 (EC 2.7.2.8),

d) argC 유전자에 의해 코딩되는 N-아세틸-감마-글루타밀-포스페이트 리덕타제 (EC 1.2.1.38),

e) argD 유전자에 의해 코딩되는 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.11),

f) ptsG 유전자에 의해 코딩되는, 글루코스 흡수 시스템의 글루코스-특이적 성분 EIIB (PtsG) (EC 2.7.1.69),

g) ptsS 유전자에 의해 코딩되는, 수크로스 흡수 시스템의 수크로스-특이적 성분 EIIB (PtsS) (EC 2.7.1.69),

h) zwf 유전자에 의해 코딩되는 글루코스-6-포스페이트 1-데히드로게나제 (EC 1.1.1.49),

i) pgi 유전자에 의해 코딩되는 글루코스-6-포스페이트 이소머라제(isomerase) (EC 5.3.1.9),

j) pfkA 유전자에 의해 코딩되는 포스포프룩토키나제 (EC 2.7.1.11),

k) fda 유전자에 의해 코딩되는 프룩토스-비스포스페이트 알돌라제(aldolase) (EC 4.1.2.13),

l) gap 유전자에 의해 코딩되는 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (EC 1.2.1.59),

m) pgk 유전자에 의해 코딩되는 포스포글리세레이트 키나제 (EC 2.7.2.3),

n) pyk 유전자에 의해 코딩되는 피루베이트 키나제 (EC 2.7.1.40),

o) aceE 유전자에 의해 코딩되는, 피루베이트 데히드로게나제 (EC 1.2.4.1)의 E1 서브유닛,

p) ppc 유전자에 의해 코딩되는 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 (EC 4.1.1.31),

q) pyc 유전자에 의해 코딩되는 피루베이트 카르복실라제 (EC 6.4.1.1),

r) acn 유전자에 의해 코딩되는 아코니타제(aconitase) (EC 4.2.1.3), 및

s) icd 유전자에 의해 코딩되는 이소시트레이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.42).

용어 강화는 과다발현 수단, 및 야생형 단백질에 비교하여 촉매 활성이 증가된 변이체의 사용을 포함한다.

글루타메이트 데히드로게나제, 글루타메이트 N-아세틸트랜스퍼라제 및 아세틸글루타메이트 키나제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 강화시키는 것이 특히 바람직하다.

열거된 추가적인 약화 수단이 추가적인 강화 수단과 조합될 수 있다.

DNA의 취급, DNA의 소화 및 결찰, 형질전환, 및 형질전환체의 선택을 위한 지침을, 특히, 공지된 지침서인 [Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에서 확인할 수 있다.

유전자로부터 전사된 mRNA의 양 또는 농도를 측정하는 것, 폴리펩티드의 양 또는 농도를 결정하는 것, 및 효소 활성 수준을 결정하는 것에 의해 발현 또는 과다발현 정도를 결정할 수 있다.

mRNA의 양은, 특히, "노던 블롯팅(Northern blotting)" 및 정량적 RT-PCR 방법을 사용함으로써 결정될 수 있다. 정량적 RT-PCR에서, 역전사가 폴리머라제 연쇄 반응에 선행한다. 이러한 목적을 위해, 예를 들어, 문헌 [Jungwirth et al., FEMS Microbiology Letters 281, 190-197 (2008)]에 기술된 바와 같이, 로슈 디아그노스틱스(Roche Diagnostics) (베링거 만하임 게엠베하(Boehringer Mannheim GmbH), 로슈 몰레큘러 바이오케미컬즈(Roche Molecular Biochemicals), 독일 만하임)으로부터의 라이트사이클러(LightCycler)™ 시스템을 사용할 수 있다. 단백질의 농도는 1차원 및 2차원 단백질 겔 분획화에 이어서 적합한 평가 소프트웨어를 사용하여 겔 내의 단백질 농도를 광학적으로 확인하는 것에 의해 결정될 수 있다. 코리네형(coryneform) 박테리아를 위한 단백질 겔을 제조하고, 이러한 단백질을 확인하는 통상적인 방법은 문헌 [Hermann et al., Electrophoresis, 22: 1712-23 (2001)]에 기술된 절차이다. 검출할 단백질에 대해 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴-블롯 혼성화 (문헌 [Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]) 및 이어지는 적합한 농도 결정 소프트웨어를 사용하는 광학적 평가 (문헌 [Lohaus and Meyer (1998) Biospektrum 5: 32-39]; [Lottspeich, Angewandte Chemie 321: 2630-2647 (1999)])에 의해 단백질 농도를 또한 결정할 수 있다.

생산된 박테리아를 L-오르니틴을 생산하기 위한 목적으로 연속적으로, 예를 들어, WO 05/021772에 기술된 바와 같이, 또는 비연속적으로 회분식 방법 (회분식 배양)으로 또는 유가식 또는 반복 유가식 방법 (예를 들어 US 6,562,601에 기술됨)으로 배양할 수 있다. 공지된 배양 방법에 관한 일반적인 성질의 개요를 교재 [Chmiel, Bioprozesstecknik [Bioprocess Technology] 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik [Introduction to Bioprocess Engineering] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)], 또는 교재 [Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Equipment] (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, Germany 1994)]에서 입수할 수 있다.

사용할 배양 배지 또는 발효 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요구사항을 충족시켜야 한다. 미국 세균학 협회(American Society for Bacteriology) (미국 워싱턴 D.C.)의 문헌 ["Manual of Methods for General Bacteriology" (1981)]에 다양한 미생물에 대한 배양 배지가 설명되어 있다. 용어 성장 배지, 배양 배지 및 발효 배지 또는 배지는 서로 교환될 수 있다.

탄소 공급원으로서, 당 및 탄수화물, 예를 들어, 글루코스, 수크로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 당밀, 사탕무 또는 사탕수수 가공으로부터의 수크로스 함유 용액, 전분, 전분 가수분해물 및 셀룰로스, 오일 및 지방, 예를 들어, 대두 오일, 해바라기 오일, 땅콩 오일 및 코코넛 지방, 지방산, 예를 들어, 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레인산, 알콜, 예를 들어, 글리세롤, 메탄올 및 에탄올, 및 유기산, 예를 들어, 아세트산 또는 락트산을 사용할 수 있다.

당에서는, 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 글루코스 및 프룩토스의 혼합물, 및 글루코스, 프룩토스 및 수크로스의 혼합물이 바람직하다. 적절한 경우, 수크로스가 특히 바람직하다.

알콜에서는, 글리세롤이 바람직하다.

질소 공급원으로서, 유기 질소를 함유하는 화합물 예컨대 펩톤, 효모 추출물, 육류 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두분 및 요소, 또는 무기 화합물 예컨대 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄을 사용할 수 있다. 질소 공급원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다

인 공급원으로서, 인산, 인산2수소칼륨, 또는 인산수소2칼륨 또는 상응하는 나트륨 함유 염을 사용할 수 있다.

배양 배지는 예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 및 철과 같은 금속의 염, 예를 들어, 클로라이드 또는 술페이트 형태의 염, 예컨대 황산마그네슘 또는 황산철을 추가로 포함하여야 하고, 이들은 성장에 필요하다. 마지막으로, 상기 언급된 물질들에 더하여, 아미노산, 예를 들어 호모세린, 및 비타민, 예를 들어 티아민, 비오틴 또는 판토텐산과 같은 필수 성장 인자가 사용될 수 있다.

언급된 출발 물질들은 단일 회분식 형태로 배양물에 첨가될 수 있거나, 또는 배양 동안 적절한 방식으로 공급될 수 있다.

배양물의 pH는 염기성 화합물 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 수성 암모니아, 또는 산성 화합물 예컨대 인산 또는 황산을 적절한 방식으로 사용함으로서 제어할 수 있다. 일반적으로 pH는 6.0 내지 8.5, 바람직하게는 6.5 내지 8의 값으로 조정된다. 발포를 제어하기 위해, 소포제, 예를 들어, 지방산 폴리글리세롤 에스테르를 사용할 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위해, 적절한 선택적 물질, 예를 들어, 항생제를 배지에 첨가할 수 있다. 발효는 바람직하게는 호기성 조건 하에 수행된다. 이러한 조건을 유지하기 위해, 산소 또는 산소를 함유하는 기체 혼합물, 예를 들어, 공기가 배양물에 도입된다. 과산화수소가 강화된 액체를 사용하는 것이 또한 가능하다. 발효는, 적합한 경우에, 가압 하에, 예를 들어, 0.03 내지 0.2 MPa의 가압에서 수행된다. 배양물의 온도는 일반적으로 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃, 특히 바람직하게는 30℃ 내지 37℃이다. 회분식 방법에서, 회수되기에 충분한 양의 원하는 L-오르니틴이 형성될 때까지 계속 배양하는 것이 바람직하다. 이러한 목표는 일반적으로 10시간 내지 160시간 이내에 달성된다. 연속 방법으로는, 더 긴 배양 시간이 가능하다. 박테리아 활성에 의해, 발효 배지 내의 L-오르니틴의 농축 또는 L-오르니틴의 농도 증가 (축적)가 초래된다.

적절한 발효 배지의 예를 특히 특허 JP 43010996 B4 (비. 서브틸리스용), US 3668072 A (이. 콜라이용) 및 JP 57041912 B (비. 플라붐용)에서 확인할 수 있다.

적절한 경우, 본 발명에 따른 방법에서의 발효 배지의 부피는 ≥ 0.5 ℓ, ≥ 1 ℓ, ≥ 5 ℓ, ≥ 10 ℓ, ≥ 50 ℓ, ≥ 100 ℓ, ≥ 500 ℓ, ≥ 1000 ℓ, 바람직하게는 ≥ 1 ℓ, 특히 바람직하게는 ≥ 10 ℓ, 매우 특히 바람직하게는 ≥ 100 ℓ, 가장 바람직하게는 ≥ 1000 ℓ이다.

발효 과정 중에 하나 이상의 시점(들)에 농도를 결정하기 위해, 문헌 [Spackman et al., Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)]에 기술된 바와 같이, 이온 교환 크로마토그래피, 바람직하게는 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 L-아미노산들을 분리하는 것에 이어지는 닌히드린을 사용한 칼럼-후 유도체화에 의해 L-오르니틴을 분석할 수 있다. 칼럼-후 유도체화를 위해 닌히드린 대신 오르토-프탈디알데히드를 사용하는 것이 또한 가능하다. 이온 교환 크로마토그래피에 대한 개관 논문을 문헌 [Pickering, LC.GC (Magazine of Chromatographic Science) 7(6), 484-487 (1989)]에서 확인할 수 있다.

칼럼-전 유도체화를, 예를 들어 오르토-프탈디알데히드 또는 페닐 이소티오시아네이트를 사용하여, 수행하고, 생성된 아미노산 유도체들을 역상 크로마토그래피 (RP), 바람직하게는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 형태의 RP에 의해 분획화하는 것이 또한 가능하다. 이러한 유형의 방법이, 예를 들어, 문헌 [Lindroth et al., Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)]에 기술되어 있다. 검출은 광도계 (흡광, 형광)에 의해 수행된다.

아미노산 분석에 관한 개관을 특히 교재 ["Bioanalytik", Lottspeich and Zorbas (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany 1998)]에서 확인할 수 있다.

L-오르니틴 농도 (부피 당 형성된 L-오르니틴), L-오르니틴 수율 (소비된 탄소 공급원 당 형성된 L-오르니틴), L-오르니틴 형성 (부피 및 시간 당 형성된 L-오르니틴), 및 L-오르니틴의 비 형성(specific formation) (건조 세포 중량 또는 건조 바이오매스(biomass) 및 시간 당 형성된 L-오르니틴, 또는 세포 단백질 및 시간 당 형성된 L-오르니틴), 또는 기타 공정 파라미터, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 파라미터에 관하여, 본 발명에 따른 방법 또는 발효 공정의 성능이 과다발현되지 않은 L-오르니틴 외수송 활성이 있는 단백질을 함유하거나 또는 과다발현 수단에 적용되지 않은 박테리아를 사용한 방법 또는 발효 공정을 기초로 0.5％ 이상, 1％ 이상, 1.5％ 이상 또는 2％ 이상 증가된다.

이러한 발효 수단에 의해, 원하는 L-오르니틴을 함유하는 발효 브로쓰가 초래된다.

그 후, L-오르니틴을 함유하는 생성물이 액체 또는 고체 형태로 제공되거나 생산되거나 또는 회수된다.

발효 브로쓰는 미생물이 특정 시간 동안 특정 온도에서 배양된 발효 배지 또는 성장 배지를 의미한다. 발효 배지 또는 발효 동안 사용된 배지는 상기 L-오르니틴의 생산 및 전형적으로는 증식 및 생육성을 확실하게 하는 모든 물질 또는 성분을 포함한다.

발효가 완료되었을 때, 생성된 발효 브로쓰는 따라서 하기를 포함한다:

a) 박테리아 세포의 증식으로 인해 생산된 바이오매스 (세포 덩어리),

b) 발효 과정에서 형성된 L-오르니틴,

c) 발효 과정에서 형성된 유기 부산물, 및

d) 발효에서 소비되지 않은, 사용된 발효 배지 또는 출발 물질의 구성물, 예를 들어 비타민 예컨대 비오틴 또는 염 예컨대 황산마그네슘.

유기 부산물에는 L-오르니틴에 더하여 발효에서 사용된 박테리아에 의해 생산되고, 임의적으로는 배출되는 물질이 포함된다. 이는 예를 들어 트레할로스와 같은 당을 또한 포함한다.

발효 브로쓰를 배양 용기 또는 발효 탱크로부터 제거하고, 임의적으로는 수집하여, 액체 또는 고체 형태의 L-오르니틴-함유 생성물을 제공하는데 사용한다. 이에 대해 "L-오르니틴-함유 생성물을 회수한다"라는 표현이 또한 사용된다. 가장 단순한 경우에, 발효 탱크로부터 제거된 L-오르니틴-함유 발효 브로쓰 자체가 회수된 생성물을 구성한다.

발효 브로쓰로부터의

a) 물의 부분적 (> 0％ 내지 < 80％) 내지 완전한 (100％) 또는 거의 완전한 (≥ 80％, ≥ 90％, ≥ 95％, ≥ 96％, ≥ 97％, ≥ 98％ 또는 ≥ 99％ 내지 < 100％) 제거,

b) 바이오매스 (임의적으로는, 제거 전에 불활성화됨)의 부분적 (> 0％ 내지 < 80％) 내지 완전한 (100％) 또는 거의 완전한 (≥ 80％, ≥ 90％, ≥ 95％, ≥ 96％, ≥ 97％, ≥ 98％ 또는 ≥ 99％ 내지 < 100％) 제거,

c) 발효 과정에서 형성된 유기 부산물의 부분적 (> 0％ 내지 < 80％) 내지 완전한 (100％) 또는 거의 완전한 (≥ 80％, ≥ 90％, ≥ 95％, ≥ 96％, ≥ 97％, ≥ 98％, ≥ 99％, ≥ 99.3％ 또는 ≥ 99.7％ 내지 < 100％) 제거, 및

d) 발효에서 소비되지 않은 사용된 발효 배지 또는 출발 물질의 구성물의 부분적 (> 0％) 내지 완전한 (100％) 또는 거의 완전한 (≥ 80％, ≥ 90％, ≥ 95％, ≥ 96％, ≥ 97％, ≥ 98％, ≥ 99％, ≥ 99.3％ 또는 ≥ 99.7％ 내지 < 100％) 제거,

로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 수단에 의해 L-오르니틴의 농축 또는 정제가 달성된다. 원하는 L-오르니틴 함량의 생성물이 이러한 방식으로 단리된다.

물의 부분적 (> 0％ 내지 < 80％) 내지 완전한 (100％) 또는 거의 완전한 (≥ 80％ 내지 < 100％) 제거(수단 a))는 건조로 또한 지칭된다.

방법의 한 변형에서, 물, 바이오매스, 유기 부산물, 및 사용된 발효 배지의 소비되지 않은 구성물의 완전한 또는 거의 완전한 제거에 의해 순수한 ((≥ 80 중량％ 또는 ≥ 90 중량％) 또는 고순도 (≥ 95 중량％, ≥ 97 중량％ 또는 ≥ 99 중량％) L-오르니틴 생성물 형태가 초래된다. a), b), c) 또는 d)에 따른 수단에 대한 다수의 기술 지침이 당업계에서 이용가능하다.

아미노산 L-오르니틴 또는 이의 염의 경우에, 본질적으로 3가지 상이한 생성물이 종래 기술에서 기술되었다.

한 군에서는 L-오르니틴 HCl이 기술되고, 이때 L-오르니틴이 이온 교환기에 의한 세포의 제거 후에 발효 용액으로부터 정제되고 나서, L-오르니틴 모노클로라이드로서의 결정화 및 L-오르니틴 모노클로라이드로서의 재결정화를 통해 결정화된다 (US 2988489). 이러한 경우에 수득된 L-오르니틴 HCl은 순도가 > 90％ 초과, 바람직하게는 95％ 초과, 특히 바람직하게는 98％ 초과, 가장 특히 바람직하게는 99％ 초과이다.

추가적인 방법이 특허 출원 EP 1995322에 기술되어 있다. 이는 바이오매스-함유 발효 용액을 입자 직경이 > 300 ㎛인 약한 산성 이온 교환기의 상부에 적용하고, 이러한 단계에 의해 L-오르니틴을 정제하는 것을 수반한다. 적합한 입자 직경의 선택은 바이오매스가 수지를 차단하는 것을 방지한다. 세포 제거 효율은 99％였다.

그 후, 정제된 L-오르니틴을 다양한 L-오르니틴 염, 예를 들어, 모노- 또는 디-L-오르니틴 α-케토글루타레이트, L-오르니틴 L-아스파르테이트 등을 제조하는데 사용할 수 있다.

L-오르니틴 L-아스파르테이트를 제조하는 방법이 예를 들어 EP 0477 991에 기술되어 있다. 이는 90％ 이상 포화되었거나 과포화된 용액에 도달하기 위해 L-오르니틴 및 L-아스파르테이트의 수용액에 수용성 용매를 첨가하는 것을 수반한다. 상기 용액을 결정 형성이 종결될 때까지 환류 하에 가열한다. 그 후, 염 결정이 형성될 때까지 수-혼화성 용매를 환류 하에 계속 첨가한다. 결정은, 예를 들어, 원심분리에 의해 제거할 수 있고, 이어서 진공 하에 건조시킨다. 생성물 순도는 전형적으로 98.5％를 초과한다.

JP 46003194는 L-오르니틴 L-케토글루타레이트를 제조하는 방법을 기술한다. 이는, 예를 들어, 오르니틴 HCl을 산성 이온 교환기로의 흡착 및 수성 암모니아로의 용출에 의해 유리 염기로 전환시키는 단계, α-케토글루타레이트를 첨가하는 단계 및 생성물이 결정화될 때까지 용액을 진공 하에 증발시키는 단계를 수반한다.

플라스미드 pEC7lysE는 부다페스트 조약에 따라 2010년 1월 15일에 접속 번호 DSM 23239 하에 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) (독일 브라운슈바이크)에 균주 에스케리키아 콜라이 DH5알파/pEC7lysE (DM2204)의 형태로 기탁되었다.

실시예

실시예 1:

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터의 lysE 유전자의 클로닝 및 서열분석

균주 ATCC13032의 lysE 유전자를 이. 콜라이/씨. 글루타미쿰 셔틀 및 발현 벡터 pVWEx1 (문헌 [Peters-Wendisch et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (2001) 3(2): 295-300]) 내로 클로닝하였다.

클로닝은 2단계로 수행되었다. 먼저, 서열 1로부터 유래된 하기의 올리고뉴클레오티드 프라이머들에 의해 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032으로부터의 이러한 유전자를 증폭시켰다. 상기 올리고뉴클레오티드들은 이들의 5' 끝부분에 추가적인 제한 절단 부위를 함유하였다 (밑줄이 그어짐: lysE_1.p는 EcoRV, lysE_2.p는 AvrII 또는 SspI).

lysE_1.p: 5'-[TCGATATCATGGAAATCTTCATTACAGG]-3'

(서열 22 참조)

lysE_2.p: 5'-[TGCCTAGGTCAATATTTGGGCGAAGGCCACCG]-3'

(서열 23 참조)

PCR 반응을 200 μM의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0.5 μM의 각각의 상응하는 올리고뉴클레오티드, 100 ng의 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 염색체 DNA, 1/5 부피의 5× 반응 완충제 HF 및 0.02 U/㎕ 퓨젼® 핫 스타트(Phusion® Hot Start) DNA 폴리머라제 (바이오자임 사이언티픽 게엠베하(Biozym Scientific GmbH), D-31840 헤시슈 올덴도르프)의 존재 하에 써모사이클러(thermocycler) (마스터사이클러(Mastercycler), 에펜도르프 아게(Eppendorf AG) (함부르크))에서 하기의 조건 하에 수행하였다: 1분 동안 98℃; 30 사이클 × (98℃, 20초; 63℃, 20초; 72℃, 40초); 6분 동안 72℃.

761 bp lysE PCR 단편 (서열 3 참조)을 하기 기술된 바와 같이 pVWEx1 내로 클로닝하였다:

벡터 제조: 1 ㎍의 pVWEx1 플라스미드 DNA를 37℃에서 1시간 동안의 인큐베이션에 의해 10 유닛의 효소 PstI을 함유하는 효소-특이적 완충제 시스템에서 절단하였다. 그 후 즉시, 절단 혼합물을 제조사의 설명서에 따라 퀵 블런팅 키트(Quick Blunting Kit) (뉴 잉글랜드 바이오랩스 게엠베하(New England Biolabs GmbH), 프랑크푸르트 암 마인)으로 처리하고 나서, 제조사의 설명서에 따라 QiaExII 정제 키트 (퀴아젠 아게(Qiagen AG), 독일 힐덴)를 사용하여 정제하였다. 그 후, 이러한 방식으로 예비 처리된 벡터를 37℃에서 1시간 동안 효소-특이적 완충제 시스템 내의 10 유닛의 XbaI로 절단하고 나서, 다시 QiaExII 정제 키트를 사용하여 정제하였다.

삽입물 제조: lysE PCR 단편을 각각 10 유닛의 효소 AvrII 및 EcoRV로 절단한 후, 제조사의 설명서에 따라 QiaExII 정제 키트를 사용하여 정제하였다.

결찰: 벡터 및 삽입물을 1:5 몰비로 혼합하고, T4 DNA 리가제(ligase)를 사용하여 16℃에서 1시간 동안 결찰시켰다. 화학적 적격 이. 콜라이 DH5알파 세포 (서브클로닝 효율, 인비트로젠 게엠베하(Invitrogen GmbH) (독일 카를스루에))를 3 ㎕의 이러한 결찰 혼합물로 형질전환시켰다.

형질전환체를 이의 카나마이신 저항성을 기초로 50 ㎍/㎖ 카나마이신 술페이트를 함유하는 LB-한천 플레이트 상에서 확인하였다. 플라스미드 DNA를 상기 형질전환체 중 4개로부터 단리하고, 이러한 플라스미드를 삽입물로서의 0.75 kb 단편의 존재에 대해 제한 분석에 의해 검정하였다. 이러한 방식으로 생산된 재조합 플라스미드를 pVWEx1_lysE로 지칭하였다.

플라스미드 pVWEx1-lysE 내의 0.75 kb 단편의 뉴클레오티드 서열을 문헌 [Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1977) 74: 5463-5467]에 따른 디데옥시 사슬 종결 방법에 의해 결정하였다. 이를 위해, 유로핀스 MWG 오페론 게엠베하(Eurofins MWG Operon GmbH) (독일 에베르스베르그)에서 올리고뉴클레오티드 프라이머 pVW_1.p (5'-TGA GCG GAT AAC AAT TTC ACA C-3') 및 pVW_2.p (5'-CGA CGG CCA GTG AAT TCG AG-3')를 사용하여 pVWEx1_lysE 플라스미드의 완전한 삽입물을 서열분석하였다.

수득된 뉴클레오티드 서열을 클론 매니저 9 프로그램을 사용하여 분석하였고, 이는 서열 20으로 제시된다.

실시예 2:

코리네박테리움 글루타미쿰 내의 argFRGH 영역의 결실을 위한 벡터 pK18mobsacB_DargFRGH의 구축

이를 위해, 먼저 염색체 DNA를 문헌 [Tauch et al., 1995, Plasmid 33: 168-179]의 방법에 의해 씨. 글루타미쿰 ATCC13032으로부터 단리하였다. argFRGH 결실 구축물을 제조하기 위해 씨. 글루타미쿰 argFRGH 유전자의 서열을 기초로 하기 열거된 올리고뉴클레오티드들을 선택하였다. 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여, 더욱 구체적으로는 유전자 SOEing 방법 (중첩 확장에 의한 유전자 스플라이싱(Gene Splicing by Overlap Extension), 문헌 [Horton, Molecular Biotechnology 3: 93-98 (1995)])에 의해 상기 결실 구축물을 생성시켰다.

argFRGH_d1:

5'-GGT GGT GCT AGC CCG GCG ATT TCT TTG CAC AT-3'

(서열 24 참조)

argFRGH_d2:

5'-AAT GCT TAT CGA CGT ACC CCC CTG TGG TTG TGA AGT CAT A-3'

(서열 25 참조)

argFRGH_d3:

5'-GGG GTA CGT CGA TAA GCA TT-3'

(서열 26 참조)

argFRGH_d4:

5'-GGT GGT ATG CAT GGT GAT GGT TCC GAA TGT TG-3'

(서열 27 참조)

제시된 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 유로핀스 MWG 오페론 게엠베하 (독일 에베르스베르그)에서 구입하였다. PCR 반응을 퓨전® 핫 스타트 DNA 폴리머라제 (바이오자임 사이언티픽 게엠베하, D-31840 헤시슈 올덴도르프)를 사용하여 써모사이클러 (마스터사이클러, 에펜도르프 아게 (함부르크))에서 수행하였다.

argFRGH_d2 프라이머는 2개의 영역으로 구성된다. 뉴클레오티드 서열의 한 부분은 argF 유전자의 시작 코돈의 1 bp 상류부터 19 bp 하류까지의 영역에 대해 상보적이다. 뉴클레오티드 서열의 다른 부분은 argH 유전자의 뉴클레오티드 1419부터 argH 유전자의 뉴클레오티드 5개 하류까지의 영역에 대해 상보적이다.

폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여, 프라이머 argFRGH_1 및 argFRGH_2는 543 bp DNA 단편이, 프라이머 argFRGH_3 및 argFRGH_4는 513 bp DNA 단편이 증폭될 수 있게 한다. 이러한 앰플리콘들을 PCR에 의해 생산하고, 0.8％ 강도 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 검정하고, 상기 아가로스 겔로부터 고순도 PCR 생성물 정제 키트(High Pure PCR Product Purification Kit) (제품 # 1732676, 로슈 디아그노스틱스 게엠베하 (독일 만하임))를 사용하여 정제하고, 프라이머 argFRGH_1 및 argFRGH_4를 사용하는 또 다른 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. 이러한 방식으로, 1036 bp의 DargFRGH 결실 유도체가 생성되었다 (서열 21을 또한 참조한다). 이는 argD 유전자의 3' 끝부분의 477 bp, argF 유전자의 5' 끝부분의 19 bp, argH 유전자의 3' 끝부분의 15 bp, 및 cg1589 리딩 프레임의 5' 끝부분의 420 bp를 포함한다. 이러한 방식으로 증폭된 생성물을 0.8％ 강도 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 검정하였다.

1.04 kb DargFRGH PCR 생성물 (서열 21)을 NdeI 및 NsiI 효소에 의해 완전히 절단하였다. 이어서 단편을 PCR 정제 키트 (퀴아젠, 독일 힐덴)를 사용하여 정제하였다. 이러한 방식으로 예비 처리된 DargFRGH 결실 유도체를 결찰을 위해 이동성 클로닝 벡터 pK18mobsacB (문헌 [Schaefer et al. (1994), Gene 14: 69-73])와 함께 사용하였다. 상기 클로닝 벡터를 미리 XbaI 및 PstI 제한 엔도뉴클레아제에 의해 완전히 절단하였다. 이에 의해, NdeI 및 NsiI 절단에 의해 생성된 삽입물의 끝부분들과 혼화성인 DNA 끝부분들이 생산되었다. 이러한 방식으로 제조된 벡터를 DargFRGH 단편과 1:5 몰비로 혼합하고, T4 DNA 리가제 (아머샴-파마시아(Amersham- Pharmacia), 독일 프라이부르크)를 사용하여 16℃에서 1시간 동안 결찰시켰다. 화학적 적격 이. 콜라이 DH5알파 세포 (서브클로닝 효율, 인비트로젠 게엠베하 (독일 카를스루에))를 3 ㎕의 이러한 결찰 혼합물로 형질전환시켰다. 형질전환체를 이의 카나마이신 저항성을 기초로 50 ㎍/㎖ 카나마이신 술페이트를 함유하는 LB-한천 플레이트 상에서 확인하였다. 플라스미드 DNA를 상기 형질전환체 중 4개로부터 단리하고 (퀴아젠 (힐덴)으로부터의 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(QIAprep Spin Miniprep Kit)), 이러한 플라스미드를 삽입물로서의 1.04 kb 단편의 존재에 대해 제한 분석에 의해 검정하였다. 이러한 방식으로 생산된 재조합 플라스미드를 pK18mobsacB_DargFRGH로 지칭하였다. 균주는 이. 콜라이_DH5알파/pK18mobsacB_DargFRGH로 지칭하였다.

pK18mobsacB_DargFRGH 플라스미드 내의 1.04 kb 단편의 뉴클레오티드 서열 (서열 21)을 문헌 [Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1977) 74: 5463-5467]에 따른 디데옥시 사슬 종결 방법에 의해 결정하였다. 이를 위해, 유로핀스 MWG 오페론 게엠베하 (독일 에베르스베르그)에서 올리고뉴클레오티드 프라이머 M13 uni (-21) (5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3') 및 M13 rev (-49) (5'-GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG-3')를 사용하여 pK18mobsacB_DargFRGH 플라스미드의 완전한 삽입물을 서열분석하고, 따라서 정확성에 대해 검정하였다.

실시예 3:

균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032_DargFRGH의 제조

실시예 2에서 언급된 벡터인 pK18mobsacB_DargFRGH를 문헌 [Schaefer et al., Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990)]의 프로토콜에 따른 접합에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC13032 내로 전달하였다. 이러한 목적으로, 벡터를 미리 이. 콜라이 균주 S17-1 (문헌 [Simon et al., Biotechnology 1: 784-791]) 내로 형질전환시켰다. S17-1 내의 벡터를 이. 콜라이 DH5알파에서의 검출과 유사하게 신원에 대해 검정하였다 (실시예 2 참조).

pK18mobsacB 및 pK18mobsacB_DargFRGH 벡터는 씨. 글루타미쿰 ATCC13032 내에서 자가 복제할 수 없고, 재조합 이벤트 후에 염색체 내로 통합된 경우에만 세포 내에 잔존한다. pK18mobsacB_DargFRGH가 통합된 클론을 15 mg/ℓ 카나마이신 및 50 ㎎/㎖ 날리딕스산이 보충된 LB 한천 (문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989]) 상에 접합 혼합물을 플레이팅함으로써 선택하였다. 확립된 클론을 25 mg/ℓ 카나마이신을 함유하는 LB-한천 플레이트 상에 스트리킹하고, 33℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 클론을 선택 없이 20시간 동안 LB 액체 배지에서 배양한 후, 이를 10％ 수크로스를 함유하는 LB 한천 상에 스트리킹하고, 이어서 24시간 동안 인큐베이션함으로써, 2차 재조합 이벤트로 인해 플라스미드가 절제된 돌연변이체를 선택하였다.

pK18mobsacB_DargFRGH 플라스미드는, 출발 플라스미드인 pK18mobsacB와 마찬가지로, 카나마이신 저항성 유전자에 더하여 바실루스 서브틸리스 레반수크라제(levansucrase)를 코딩하는 sacB 유전자의 카피를 함유한다. 수크로스-유도성 발현은 씨. 글루타미쿰에 독성인 레반 생성물의 합성을 촉매하는 레반수크라제의 형성에 이른다. 결과적으로, 통합된 pK18mobsacB_DargFRGH가 다시 절제된 클론만 수크로스를 함유하는 LB 한천 상에서 성장이 확립된다. 절제는 argFRGH의 완전한 염색체 카피 또는 내부 argFRGH 결실이 있는 불완전한 카피와 함께 플라스미드가 절제되는 것을 포함할 수 있다.

약 40개 내지 50개의 콜로니를 "수크로스 존재 하에 성장함" 및 "카나마이신 존재 하에 성장하지 않음" 표현형에 대해 시험하였다. 결실된 argFRGH 대립유전자가 염색체 내에 잔존하였음을 증명하기 위해, "수크로스 존재 하에 성장함" 및 "카나마이신 존재 하에 성장하지 않음" 표현형을 갖는 약 20개의 콜로니를 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 문헌 [Innis et al., PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press]의 표준 PCR 방법에 의해 연구하였다. 이는 결실된 argFRGH 영역 주변의 영역을 보유하는 DNA 단편을 콜로니의 염색체 DNA로부터 증폭시키는 것을 수반한다. 하기의 프라이머 올리고뉴클레오티드들이 PCR용으로 선택되었다.

argFRGH_d1 (서열 24):

5'-GGT GGT GCT AGC CCG GCG ATT TCT TTG CAC AT-3'

argFRGH_d4 (서열 27):

5'-GGT GGT ATG CAT GGT GAT GGT TCC GAA TGT TG-3'

완전한 argFRGH 유전자좌를 함유하는 대조군 클론에서, 이러한 프라이머들은 약 5.35 kb DNA 단편이 증폭되게 할 수 있다. argFRGH 유전자좌가 결실된 클론에서는, 약 1.04 kb 크기의 DNA 단편이 증폭된다.

증폭된 DNA 단편들을 0.8％ 강도 아가로스 겔에서의 전기영동에 의해 확인하였다. 이에 의해, 균주가 염색체 상에 결실된 argFRGH 대립유전자를 보유하는 것으로 나타났다. 이러한 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 델타_argFRGH로 지칭하였다.

실시예 4:

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032_델타_argFRGH에서의 lysE 유전자의 발현

플라스미드 pVWEx1_LysE 및 빈 플라스미드 pVWEx1을 L-오르니틴-형성 균주인 ATCC 13032_델타_argFGH 내로 전기 천공 (문헌 [Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334])에 의해 도입하였다. 형질전환체를 이의 카나마이신 저항성을 기초로 25 ㎍/㎖ 카나마이신 술페이트를 함유하는 카소(Caso) 한천 플레이트 상에서 확인하였다. 이어서 5개의 단일 클론을 형질전환된 플라스미드의 정확성에 대해 시험하였다. 이러한 목적으로, 플라스미드 DNA를 단리하고 (퀴아젠의 플라스미드 단리 키트), 이러한 DNA를 정확한 절단 패턴에 대해 제한 분석에 의해 검정하였다. 씨. 글루타미쿰 균주 ATCC 13032_델타_argFRGH/pVWEx1_lysE 및 ATCC 13032_델타_argFRGH/pVWEx1가 이러한 방식으로 생산되었다.

실시예 5:

코리네박테리움 글루타미쿰을 사용한 L-오르니틴의 제조

L-오르니틴을 생산하는 능력을 연구하기 위해, 각각의 경우에, 균주 ATCC 13032_델타_argFRGH/pVWEx1_lysE의 클론 3개 및 균주 ATCC 13032_델타_argFRGH/pVWEx1의 클론 3개를 33℃에서 16시간 동안 각각 10 ㎖의 시험 배지에서 예비 배양하였다. 생산 검정을 위해, 각각의 경우에, 수득된 예비 배양물을 출발 시의 OD₆₀₀ (600 nm에서의 광학 밀도)가 0.1인 방식으로 10 ㎖의 시험 배지에 접종하였다. 각각의 균주가 각각의 수확 시점에 총 9개의 진탕 플라스크에 의해 표시되도록, 각각의 클론을 3개의 진탕 플라스크에서 시험하였다. 시험 배지는 문헌 [Keilhauer et al., Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603]에 기술된 CgXII 배지와 동일하였지만, 7.5 g/ℓ 효모 추출물 (디프코(Difco)), 25 ㎍/㎖ 카나마이신, 1 mM IPTG (이소프로필 베타-D-티오갈락토피라노시드) 및 40 g/ℓ 수크로스 (글루코스 대신)을 추가적으로 함유하였다. 평이성을 위해, 시험 배지의 조성이 하기 표 2에서 요약된다.

<표 2>

33℃ 및 200 rpm으로 100 ㎖ 진탕 플라스크에서 배양을 수행하였다. 진탕기의 편위는 5 cm였다. 24시간 및 48시간 후 3개의 클론 배양물을 수확하였다. 이를 위해, 배양물로부터 샘플을 취하고, 광학 밀도, 수크로스 함량 및 L-오르니틴 함량을 결정하였다. 수크로스 및 L-오르니틴 함량을 결정하기 위해, 세포를 간략한 원심분리 (5415D형 탁상용 원심분리 (에펜도르프), 13 000 rpm, 10분, 실온)에 의해 제거하였다.

광학 밀도는 660 nm의 파장에서 GENios 마이크로타이터 플레이트 광도계 (테칸(Tecan), 영국 리딩)를 사용하여 결정하였다. 측정 전에 샘플을 탈염수로 1:100 희석하였다.

수크로스는 R-바이오팜 아게(R-Biopharm AG) (독일 다름슈타트)로부터의 시험 시스템 (카탈로그 번호 10 716 251 035) 을 사용하여 결정하였다. 이는 수크로스의 전환, 및 형성된 글루코스를 NADH 형성을 통해 커플링된 효소 검정 (헥소키나제/글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제)을 사용하여 검출하는 것을 수반한다.

배양 상청액으로부터의 세포외 아미노산 농도의 정량적인 결정은 형광 검출기 (G1321A)가 연결된 HP1100 시리즈 HPLC 기기 (휴렛-패커드(Hewlett-Packard), 독일 발드브론)를 사용하여 역상 HPLC (문헌 [Lindroth et al., Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174])에 의해 수행하였다: HP 켐스테이션(HP ChemStation) (휴렛-패커드)를 사용하여 시스템 제어 및 데이터 평가를 수행하였다. 분석할 아미노산 용액 1 ㎕를 자동 칼럼-전 유도체화에서 20 ㎕의 즉석 사용 오르토-프탈알데히드/2-메르캅토에탄올 시약 (피어스 유럽 베베(Pierce Europe BV), 네덜란드 오우트-베이어란트)와 혼합하였다. 생성된 형광성 티오-치환 이소인돌 (문헌 [Jones et al., Journal of Chromatography (1983) 266: 471-482])을 점점 더 비극성인 상 (메탄올)으로의 구배 프로그램을 사용하여 전-칼럼 (40×4 ㎜ 하이퍼실(Hypersil) ODS 5) 및 주 칼럼 (하이퍼실 ODS 5, 양쪽 칼럼 모두 CS-크로마토그래피 서비스 게엠베하(CS-Chromatographie Service GmbH) (독일 란게르베헤)) 조합에서 분획화하였다. 극성 용리액은 아세트산나트륨 (0.1 M; pH 7.2)였고, 유량은 0.8 ㎖/분이었다. 유도체화된 아미노산의 형광을 230 nm의 여기 파장 및 450 nm의 방출 파장에서 검출하였다. L-오르니틴 및/또는 L-오르니틴 히드로클로라이드 농도를 외부 기준물 및 추가적인 내부 기준물로서의 L-아스파라긴과의 비교에 의해 계산하였다.

L-오르니틴 히드로클로라이드의 분자량은 168.6 g/몰이고, L-오르니틴의 분자량은 132.1 g/몰이다.

형성된 L-오르니틴의 양 (L-오르니틴 히드로클로라이드로서 측정됨)을 소비된 수크로스의 양으로 나눔으로써 수율을 계산하였다.

결과가 표 3에서 열거된다.

표 3: 24시간 (표 3A) 및 48시간 (표 3B)의 인큐베이션 후의 L-오르니틴 형성. 약자: *: ATCC 13032_델타_argFRGH; Orn-HCl: L-오르니틴 히드로클로라이드.

<표 3A>

<표 3B>

실시예 6: 플라스미드 pEC7lysE의 서열분석 및 기탁

간행물 [Bellmann et al., Microbiology (2001) 147, 1765-1774]의 교신 저자인 로타르 에겔링(Lothar Eggeling) 박사 (포르슝스젠트룸 율리히 게엠베하(Forschungszentrum Juelich GmbH), D-52425 율리히)에 의해 플라스미드 pEC7lysE가 수용액 형태로 이용가능하게 되었다.

수득된 DNA 용액의 분취량을 제조사의 설명서에 따라 인비트로젠 게엠베하 (영국 파이슬리)로부터의 DH5알파 균주인 적격 에스케리키아 콜라이 세포 (서브클로닝 효율, 유전자형: F-Φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rK-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1)를 형질전환시키는데 사용하였다. 형질전환체를 50 ㎍/㎖ 카나마이신이 보충된 루리아-베르타니(Luria-Bertani) 한천 상에서 선택하였다.

에스케리키아 콜라이 DH5알파/pEC7lysE (DM2204)로 지칭되는 1개의 형질전환체가 부다페스트 조약에 따라 2010년 1월 15일에 기탁 번호 DSM 23239 하에 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) (독일 브라운슈바이크)에 기탁되었다.

DSM 23239 균주로부터의 이러한 pEC7lysE 플라스미드가 유로핀스 MWG 오페론 게엠베하 (독일 마르틴스리트)에서 통상적인 DNA 서열분석 (워킹 서비스(Walking Service))에 의해 완전히 서열분석되었다. pEC7lysE의 서열은 서열 29에서 열거된다.

DSMZ DSMZ23239 20100115

SEQUENCE LISTING <110> Evonik Degussa GmbH <120> Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Ornithin <130> 200900319 <160> 30 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1901 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <220> <221> misc_feature <222> (930)..(61) <223> Komplement?er Strang der Kodierregion des Regulatorgens lysG kodierend f? das Aktivatorprotein LysG <220> <221> misc_feature <222> (1000)..(1000) <223> Transkriptionsstart des lysE-Gens <220> <221> CDS <222> (1001)..(1702) <223> Kodierregion des lysE-Gens <400> 1 cctggcccaa ttcctgcggg cgaagaagtg aaaaaccctg aaccttttca gaagtaacta 60 aggccgcaat ccctcgattg ctgcatcaac gacggcgtct gtgagtctag ctagagatct 120 agattccagg cgccatcgtt gccaatacat cggtgtgtca atgggtatct catcgaggag 180 gatcacttct cctgctttta gcatgggagc agcttgggtt tcgggaagaa gtccccaacc 240 aaggcctcgg cgaattgcct caccaaaacc ttccgccgac gggacaatgg atacgcgcct 300 gcgccccaca ggaccatcga cgcgcccgtc caggtcacgg tcttgaagca catctttggg 360 accgaagcgt aagacgggca tcgcagccca atctagtttc ccatcaacca tgtaggcatc 420 ccgcaatgag ggggttgcaa tggccaagtg gcgcatggtt ccaagttcta ctacttcaca 480 tcccgccacg ggattagctt cacgggttac cgctcctaaa acatctccac gccgcagcaa 540 ggataatgtg tgcgcttcat cttccaagcg cagcgtgagc gttgctccac cccaagaagc 600 tacctcgttg aacacgggag gaaaccatgt ggatagcgaa tctgcgttga tggcgatggt 660 taacgggatt tcagcaaggc gtccagatag ttgcgcttta gtttctgctt gcagcaacac 720 cattttccgc gctgcttgca caaggacttc acccgcttcg gttgctttgg ccggttgggt 780 gcgcgatacc aacactcgac ccacgtgatg ctcgagagct ttaacgcgct gactcaccgc 840 cgagggggaa atggaaaggg ctaaggaggc gccttcgaag ctgccttcat caatgattga 900 gagcaaagtg tccagttgaa tggggttcat gaagctatat taaaccatgt taagaaccaa 960 tcattttact taagtacttc cataggtcac gatggtgatc atg gaa atc ttc att 1015 Met Glu Ile Phe Ile 1 5 aca ggt ctg ctt ttg ggg gcc agt ctt tta ctg tcc atc gga ccg cag 1063 Thr Gly Leu Leu Leu Gly Ala Ser Leu Leu Leu Ser Ile Gly Pro Gln 10 15 20 aat gta ctg gtg att aaa caa gga att aag cgc gaa gga ctc att gcg 1111 Asn Val Leu Val Ile Lys Gln Gly Ile Lys Arg Glu Gly Leu Ile Ala 25 30 35 gtt ctt ctc gtg tgt tta att tct gac gtc ttt ttg ttc atc gcc ggc 1159 Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Val Phe Leu Phe Ile Ala Gly 40 45 50 acc ttg ggc gtt gat ctt ttg tcc aat gcc gcg ccg atc gtg ctc gat 1207 Thr Leu Gly Val Asp Leu Leu Ser Asn Ala Ala Pro Ile Val Leu Asp 55 60 65 att atg cgc tgg ggt ggc atc gct tac ctg tta tgg ttt gcc gtc atg 1255 Ile Met Arg Trp Gly Gly Ile Ala Tyr Leu Leu Trp Phe Ala Val Met 70 75 80 85 gca gcg aaa gac gcc atg aca aac aag gtg gaa gcg cca cag atc att 1303 Ala Ala Lys Asp Ala Met Thr Asn Lys Val Glu Ala Pro Gln Ile Ile 90 95 100 gaa gaa aca gaa cca acc gtg ccc gat gac acg cct ttg ggc ggt tcg 1351 Glu Glu Thr Glu Pro Thr Val Pro Asp Asp Thr Pro Leu Gly Gly Ser 105 110 115 gcg gtg gcc act gac acg cgc aac cgg gtg cgg gtg gag gtg agc gtc 1399 Ala Val Ala Thr Asp Thr Arg Asn Arg Val Arg Val Glu Val Ser Val 120 125 130 gat aag cag cgg gtt tgg gta aag ccc atg ttg atg gca atc gtg ctg 1447 Asp Lys Gln Arg Val Trp Val Lys Pro Met Leu Met Ala Ile Val Leu 135 140 145 acc tgg ttg aac ccg aat gcg tat ttg gac gcg ttt gtg ttt atc ggc 1495 Thr Trp Leu Asn Pro Asn Ala Tyr Leu Asp Ala Phe Val Phe Ile Gly 150 155 160 165 ggc gtc ggc gcg caa tac ggc gac acc gga cgg tgg att ttc gcc gct 1543 Gly Val Gly Ala Gln Tyr Gly Asp Thr Gly Arg Trp Ile Phe Ala Ala 170 175 180 ggc gcg ttc gcg gca agc ctg atc tgg ttc ccg ctg gtg ggt ttc ggc 1591 Gly Ala Phe Ala Ala Ser Leu Ile Trp Phe Pro Leu Val Gly Phe Gly 185 190 195 gca gca gca ttg tca cgc ccg ctg tcc agc ccc aag gtg tgg cgc tgg 1639 Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Leu Ser Ser Pro Lys Val Trp Arg Trp 200 205 210 atc aac gtc gtc gtg gca gtt gtg atg acc gca ttg gcc atc aaa ctg 1687 Ile Asn Val Val Val Ala Val Val Met Thr Ala Leu Ala Ile Lys Leu 215 220 225 atg ttg atg ggt tag ttttcgcggg ttttggaatc ggtggccttc gcccaaatgt 1742 Met Leu Met Gly 230 tgatgccggc gtcgtgggaa atctcatcga tcgcctccaa ctcggcgtca gaaaactcca 1802 agttgttgag tgaatcaagg ctgttgtcca gctgctcaac tgacgaagca ccaatcaatg 1862 cactggtcac ggtatccgcg ccgtactctc cttgctcgc 1901 <210> 2 <211> 233 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <400> 2 Met Glu Ile Phe Ile Thr Gly Leu Leu Leu Gly Ala Ser Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Ile Gly Pro Gln Asn Val Leu Val Ile Lys Gln Gly Ile Lys Arg 20 25 30 Glu Gly Leu Ile Ala Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Val Phe 35 40 45 Leu Phe Ile Ala Gly Thr Leu Gly Val Asp Leu Leu Ser Asn Ala Ala 50 55 60 Pro Ile Val Leu Asp Ile Met Arg Trp Gly Gly Ile Ala Tyr Leu Leu 65 70 75 80 Trp Phe Ala Val Met Ala Ala Lys Asp Ala Met Thr Asn Lys Val Glu 85 90 95 Ala Pro Gln Ile Ile Glu Glu Thr Glu Pro Thr Val Pro Asp Asp Thr 100 105 110 Pro Leu Gly Gly Ser Ala Val Ala Thr Asp Thr Arg Asn Arg Val Arg 115 120 125 Val Glu Val Ser Val Asp Lys Gln Arg Val Trp Val Lys Pro Met Leu 130 135 140 Met Ala Ile Val Leu Thr Trp Leu Asn Pro Asn Ala Tyr Leu Asp Ala 145 150 155 160 Phe Val Phe Ile Gly Gly Val Gly Ala Gln Tyr Gly Asp Thr Gly Arg 165 170 175 Trp Ile Phe Ala Ala Gly Ala Phe Ala Ala Ser Leu Ile Trp Phe Pro 180 185 190 Leu Val Gly Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Lys Val Trp Arg Trp Ile Asn Val Val Val Ala Val Val Met Thr Ala 210 215 220 Leu Ala Ile Lys Leu Met Leu Met Gly 225 230 <210> 3 <211> 761 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <220> <221> PCR-lysE-Fragment <222> (1)..(761) <400> 3 tcgatatcat ggaaatcttc attacaggtc tgcttttggg ggccagtctt ttactgtcca 60 tcggaccgca gaatgtactg gtgattaaac aaggaattaa gcgcgaagga ctcattgcgg 120 ttcttctcgt gtgtttaatt tctgacgtct ttttgttcat cgccggcacc ttgggcgttg 180 atcttttgtc caatgccgcg ccgatcgtgc tcgatattat gcgctggggt ggcatcgctt 240 acctgttatg gtttgccgtc atggcagcga aagacgccat gacaaacaag gtggaagcgc 300 cacagatcat tgaagaaaca gaaccaaccg tgcccgatga cacgcctttg ggcggttcgg 360 cggtggccac tgacacgcgc aaccgggtgc gggtggaggt gagcgtcgat aagcagcggg 420 tttgggtaaa gcccatgttg atggcaatcg tgctgacctg gttgaacccg aatgcgtatt 480 tggacgcgtt tgtgtttatc ggcggcgtcg gcgcgcaata cggcgacacc ggacggtgga 540 ttttcgccgc tggcgcgttc gcggcaagcc tgatctggtt cccgctggtg ggtttcggcg 600 cagcagcatt gtcacgcccg ctgtccagcc ccaaggtgtg gcgctggatc aacgtcgtcg 660 tggcagttgt gatgaccgca ttggccatca aactgatgtt gatgggttag ttttcgcggg 720 ttttggaatc ggtggccttc gcccaaatat tgacctaggc a 761 <210> 4 <211> 236 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum R <220> <221> LysE <222> (1)..(236) <400> 4 Met Val Ile Met Glu Ile Phe Ile Thr Gly Leu Leu Leu Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ser Ile Gly Pro Gln Asn Val Leu Val Ile Lys Gln Gly 20 25 30 Ile Lys Arg Glu Gly Leu Ile Ala Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Ser 35 40 45 Asp Val Phe Leu Phe Ile Ala Gly Thr Leu Gly Val Asp Leu Leu Ser 50 55 60 Asn Ala Ala Pro Ile Val Leu Asp Ile Met Arg Trp Gly Gly Ile Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Leu Trp Phe Ala Val Met Ala Ala Lys Asp Ala Met Thr Asn 85 90 95 Lys Val Glu Ala Pro Gln Ile Ile Glu Glu Thr Glu Pro Thr Val Pro 100 105 110 Asp Asp Thr Pro Leu Gly Gly Ser Ala Val Ala Thr Asp Thr Arg Asn 115 120 125 Arg Val Arg Val Glu Val Ser Val Asp Lys Gln Arg Val Trp Val Lys 130 135 140 Pro Met Leu Met Ala Ile Val Leu Thr Trp Leu Asn Pro Asn Ala Tyr 145 150 155 160 Leu Asp Ala Phe Val Phe Ile Gly Gly Val Gly Ala Gln Tyr Gly Asp 165 170 175 Thr Gly Arg Trp Ile Phe Ala Ala Gly Ala Phe Ala Ala Ser Leu Ile 180 185 190 Trp Phe Pro Leu Val Gly Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Leu 195 200 205 Ser Ser Pro Lys Val Trp Arg Trp Ile Asn Val Val Val Ala Val Val 210 215 220 Met Thr Ala Leu Ala Ile Lys Leu Met Leu Met Gly 225 230 235 <210> 5 <211> 233 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum ATCC14067 <220> <221> LysE <222> (1)..(233) <400> 5 Met Glu Ile Phe Ile Thr Gly Leu Leu Leu Gly Ala Ser Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Ile Gly Pro Gln Asn Val Leu Val Ile Lys Gln Gly Ile Lys Arg 20 25 30 Glu Gly Leu Ile Ala Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Val Phe 35 40 45 Leu Phe Ile Ala Gly Thr Leu Gly Val Asp Leu Leu Ser Asn Ala Ala 50 55 60 Pro Ile Val Leu Asp Ile Met Arg Trp Gly Gly Ile Ala Tyr Leu Leu 65 70 75 80 Trp Phe Ala Val Met Ala Ala Lys Asp Ala Met Thr Asn Lys Val Glu 85 90 95 Ala Pro Gln Ile Ile Glu Glu Thr Glu Pro Thr Val Pro Asp Asp Thr 100 105 110 Pro Leu Gly Gly Ser Ala Val Ala Thr Asp Thr Arg Asn Arg Val Arg 115 120 125 Val Glu Val Ser Val Asp Lys Gln Arg Val Trp Val Lys Pro Met Leu 130 135 140 Met Ala Ile Val Leu Thr Trp Leu Asn Pro Asn Ala Tyr Leu Asp Ala 145 150 155 160 Phe Val Phe Ile Gly Gly Val Gly Ala Gln Tyr Gly Asp Thr Gly Arg 165 170 175 Trp Ile Phe Ala Ala Gly Ala Phe Ala Ala Ser Leu Ile Trp Phe Pro 180 185 190 Leu Val Gly Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Lys Val Trp Arg Trp Ile Asn Val Val Val Ala Val Val Met Thr Ala 210 215 220 Leu Ala Ile Lys Leu Met Leu Met Gly 225 230 <210> 6 <211> 702 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum ATCC14067 <220> <221> lysE-CDS <222> (1)..(702) <400> 6 atggaaatct tcattacagg tctgcttttg ggggccagtc ttttgctgtc catcggaccg 60 cagaatgtac tggtgattaa acaaggaatt aagcgcgaag gactcattgc ggttcttctc 120 gtgtgtttaa tttctgacgt ctttttgttc atcgccggca ccttgggcgt tgatcttttg 180 tccaatgccg cgccgatcgt gctcgatatt atgcgctggg gtggtatcgc ttacctgtta 240 tggtttgccg tcatggcagc gaaagacgcc atgacaaaca aggtggaagc gccacagatc 300 attgaagaaa cagaaccaac cgtgcccgat gacacgcctt tgggcggttc ggcggtggcc 360 actgacacgc gcaaccgggt gcgggtggag gtgagcgtcg ataagcagcg ggtttgggta 420 aagcccatgt tgatggcaat cgtgctgacc tggttgaacc cgaatgcgta tttggacgcg 480 tttgtgttta tcggcggcgt cggcgcgcaa tacggcgaca ccggacggtg gattttcgcc 540 gctggcgcgt tcgcggcaag cctgatctgg ttcccgctgg tgggtttcgg cgcagcagca 600 ttgtcacgcc cgctgtccag ccccaaggtg tggcgctgga tcaacgtcgt cgtggcagtt 660 gtgatgaccg cattggccat caaactgatg ttgatgggtt ag 702 <210> 7 <211> 233 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 <220> <221> LysE <222> (1)..(233) <400> 7 Met Glu Ile Phe Ile Thr Gly Leu Leu Leu Gly Ala Ser Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Ile Gly Pro Gln Asn Val Leu Val Ile Lys Gln Gly Ile Lys Arg 20 25 30 Glu Gly Leu Ile Ala Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Val Phe 35 40 45 Leu Phe Ile Ala Gly Thr Leu Gly Val Asp Leu Leu Ser Asn Ala Ala 50 55 60 Pro Ile Val Leu Asp Ile Met Arg Trp Gly Gly Ile Ala Tyr Leu Leu 65 70 75 80 Trp Phe Ala Val Met Ala Ala Lys Asp Ala Met Thr Asn Lys Val Glu 85 90 95 Ala Pro Gln Ile Ile Glu Glu Thr Glu Pro Thr Val Pro Asp Asp Thr 100 105 110 Pro Leu Gly Gly Ser Ala Val Ala Thr Asp Thr Arg Asn Arg Val Arg 115 120 125 Val Glu Val Ser Val Asp Lys Gln Arg Val Trp Val Lys Pro Met Leu 130 135 140 Met Ala Ile Val Leu Thr Trp Leu Asn Pro Asn Ala Tyr Leu Asp Ala 145 150 155 160 Phe Val Phe Ile Gly Gly Val Gly Ala Gln Tyr Gly Asp Thr Gly Arg 165 170 175 Trp Ile Phe Ala Ala Gly Ala Phe Ala Ala Ser Leu Ile Trp Phe Pro 180 185 190 Leu Val Gly Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Lys Val Trp Arg Trp Ile Asn Val Val Val Ala Val Val Met Thr Ala 210 215 220 Leu Ala Ile Lys Leu Met Leu Met Gly 225 230 <210> 8 <211> 702 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 <220> <221> lysE-CDS <222> (1)..(702) <400> 8 atggaaatct tcattacagg tctgcttttg ggggccagtc ttttgctgtc catcggaccg 60 cagaatgtac tggtgattaa acaaggaatt aagcgcgaag gactcattgc ggttcttctc 120 gtgtgtttaa tttctgacgt ctttttgttc atcgccggca ccttgggcgt tgatcttttg 180 tccaatgccg cgccgatcgt gctcgatatt atgcgctggg gtggcatcgc ttacctgtta 240 tggtttgccg tcatggcagc gaaagacgcc atgacaaaca aggtggaagc gccacagatc 300 attgaagaaa cagaaccaac cgtgcccgat gacacgcctt tgggcggttc ggcggtggcc 360 actgacacgc gcaaccgggt gcgggtggag gtgagcgtcg ataagcagcg ggtttgggtg 420 aagcccatgt tgatggcaat cgtgctgacc tggttgaacc cgaatgcgta tttggacgcg 480 tttgtgttta tcggcggcgt cggcgcgcaa tacggcgaca ccggacggtg gattttcgcc 540 gctggcgcgt tcgcggcaag cctgatctgg ttcccgctgg tgggtttcgg cgcagcagca 600 ttgtcacgcc cgctgtccag ccccaaggtg tggcgctgga tcaacgtcgt cgtggcagtt 660 gtgatgaccg cattggccat caaactgatg ttgatgggtt ag 702 <210> 9 <211> 228 <212> PRT <213> Corynebacterium efficiens YS-314 <220> <221> LysE <222> (1)..(228) <400> 9 Met Glu Ile Phe Val Thr Gly Leu Leu Leu Gly Ala Ser Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Ile Gly Pro Gln Asn Val Leu Val Ile Lys Gln Gly Ile Lys Arg 20 25 30 Glu Gly Ile Thr Ala Val Ile Ile Val Cys Leu Leu Ser Asp Val Val 35 40 45 Leu Phe Thr Leu Gly Thr Leu Gly Val Gly Leu Ile Ser Asp Thr Ala 50 55 60 Pro Ile Ile Leu Asp Ile Leu Arg Trp Cys Gly Ile Ala Tyr Leu Leu 65 70 75 80 Trp Phe Ala Val Met Ala Ala Arg Asp Ala Leu Arg Ala Arg Thr Glu 85 90 95 Val Thr Phe Val Glu His Ser Glu Pro Val Ala Ala Ala Ser Ala Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Val Thr Thr Lys Gln Arg Pro Arg Leu Arg Ile Thr Ser 115 120 125 Gly Thr Arg Gln Val Trp Val Arg Pro Met Leu Met Ala Ile Val Leu 130 135 140 Thr Trp Leu Asn Pro Asn Ala Tyr Leu Asp Ala Phe Val Phe Ile Gly 145 150 155 160 Gly Val Gly Ala Gln Tyr Gly Glu Thr Gly Arg Trp Ile Phe Ala Ala 165 170 175 Gly Ala Phe Ala Ala Ser Leu Val Trp Phe Pro Leu Val Gly Tyr Gly 180 185 190 Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Leu Ser Ser Pro Arg Val Trp Arg Trp 195 200 205 Ile Asn Ile Gly Val Ala Val Val Leu Thr Gly Leu Ala Val Lys Leu 210 215 220 Ile Leu Met Gly 225 <210> 10 <211> 228 <212> PRT <213> Corynebacterium diphteriae NCTC13129 <220> <221> LysE <222> (1)..(228) <400> 10 Met Ser Ile Ala Ile Ala Gly Phe Leu Met Gly Leu Ser Leu Ile Val 1 5 10 15 Ala Ile Gly Pro Gln Asn Ala Leu Ile Ile Arg Gln Gly Ile Lys Arg 20 25 30 Glu Gly Leu Ile Pro Ile Leu Val Val Cys Ile Leu Ser Asp Val Ile 35 40 45 Leu Ile Phe Gly Gly Thr Ala Gly Val Gly Ala Leu Val Asp Arg Ala 50 55 60 Pro Ile Ala Leu Val Val Leu Lys Trp Leu Gly Val Ala Tyr Leu Leu 65 70 75 80 Tyr Phe Gly Phe Thr Cys Phe Lys Glu Ala Phe Lys Arg His Gly Gln 85 90 95 Ala Leu Ala Val Glu Gln Ser Glu Pro Val Ala Tyr Glu Pro Val Ala 100 105 110 Asp Ala Ser Ser Gly Val Ile Thr Lys Thr Arg Thr Lys Ala Gln Pro 115 120 125 Lys Ser Ala Gln Arg Thr Trp Val Lys Pro Val Leu Ala Ala Leu Ala 130 135 140 Phe Thr Trp Leu Asn Pro Ala Ala Tyr Ile Asp Val Leu Val Met Leu 145 150 155 160 Gly Gly Ile Ala Asn Gln His Gly Pro Asp Gly Arg Trp Val Phe Ala 165 170 175 Leu Gly Ala Leu Cys Ala Ser Leu Thr Trp Phe Pro Phe Ile Gly Tyr 180 185 190 Thr Ser Thr Arg Phe Ser Thr Val Leu Ser Arg Pro Ala Val Trp Arg 195 200 205 Tyr Ile Asn Ile Ala Ile Gly Ile Ile Met Met Ile Met Cys Ala Arg 210 215 220 Leu Ile Met His 225 <210> 11 <211> 222 <212> PRT <213> Corynebacterium striatum ATCC6940 <220> <221> LysE <222> (1)..(222) <400> 11 Met Ser Val Leu Leu Ala Gly Phe Leu Leu Gly Leu Ser Leu Ile Val 1 5 10 15 Ala Ile Gly Pro Gln Asn Ala Tyr Ile Ile Lys Met Gly Val Lys Arg 20 25 30 Asp His Ile Gly Ala Ile Ile Leu Ala Cys Leu Leu Ser Asp Val Ile 35 40 45 Leu Ile Asn Ala Gly Val Gly Gly Met Gly Val Leu Val Glu Lys Phe 50 55 60 Pro Thr Gly Leu Ile Ile Met Lys Tyr Leu Gly Ala Ala Tyr Leu Ile 65 70 75 80 Tyr Phe Gly Phe Thr Cys Phe Arg Asp Ala Phe Lys Lys Glu Gln Glu 85 90 95 Ala Leu Val Val Ser Ser Thr Pro Pro Ser Ala Pro Asn Glu Thr Glu 100 105 110 Leu Gly Gly Ala Thr Thr Val Met Thr Lys Gln Arg Thr Lys Ser Arg 115 120 125 Thr Trp Val Lys Pro Val Met Gly Ala Met Ala Leu Thr Trp Leu Asn 130 135 140 Pro Leu Ala Tyr Val Asp Val Leu Val Met Leu Gly Gly Ile Ala Gln 145 150 155 160 His Tyr Gly Asp Gln Arg Trp Val Phe Ala Ala Gly Ala Ile Met Ala 165 170 175 Ser Ala Val Trp Phe Pro Thr Val Gly Tyr Gly Ala Phe Lys Leu Ser 180 185 190 His Val Leu Ala Lys Pro Thr Thr Trp Arg Tyr Val Asn Phe Ala Ile 195 200 205 Gly Cys Val Met Met Leu Leu Thr Ala Lys Leu Leu Leu His 210 215 220 <210> 12 <211> 235 <212> PRT <213> Corynebacterium aurimucosum ATCC700975 <220> <221> LysE <222> (1)..(235) <400> 12 Met Arg Arg Leu Glu Ala Met Ser Val Leu Leu Ala Gly Phe Ala Leu 1 5 10 15 Gly Leu Ser Leu Ile Ile Ala Ile Gly Pro Gln Asn Ala Tyr Ile Ile 20 25 30 Lys Met Gly Ile Lys Arg Asp His Val Gly Pro Ile Leu Leu Ala Cys 35 40 45 Leu Leu Ser Asp Val Ile Leu Ile Thr Gly Gly Thr Ala Gly Val Gly 50 55 60 Val Leu Val Glu Arg Phe Pro Thr Ala Leu Val Val Val Lys Tyr Leu 65 70 75 80 Gly Ala Ala Tyr Leu Ile Tyr Phe Gly Phe Thr Cys Phe Arg Asp Ala 85 90 95 Phe Lys Lys Gln Gln Asp Ala Leu Val Ile Glu Glu Thr Thr Pro Val 100 105 110 Ala Gln Val Val Asp Glu Asn Ser Gly Asn Ala Gly Ala Pro Gly Thr 115 120 125 Ser Val Leu Thr Lys Ile Arg Pro Arg Val Arg Ser Lys Ser Trp Val 130 135 140 Lys Pro Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Thr Trp Leu Asn Pro Leu Ala 145 150 155 160 Tyr Val Asp Ala Leu Val Met Leu Gly Ser Ile Ala Asn Gln Tyr Gly 165 170 175 Asp Gln Arg Trp Val Phe Ala Gly Gly Ala Ile Leu Ala Ser Ala Val 180 185 190 Trp Phe Pro Ser Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Lys Leu Ser His Val Leu 195 200 205 Ala Lys Pro Thr Thr Trp Arg Val Val Asn Ile Val Ile Gly Cys Val 210 215 220 Met Leu Ala Leu Thr Ala Lys Leu Leu Phe Leu 225 230 235 <210> 13 <211> 244 <212> PRT <213> Corynebacterium matruchotii ATCC33806 <220> <221> LysE <222> (1)..(244) <400> 13 Met Ser Ile Ala Val Ala Gly Phe Leu Leu Gly Leu Ser Leu Ile Val 1 5 10 15 Ala Ile Gly Pro Gln Asn Ala Leu Val Ile Arg Gln Gly Val Lys Arg 20 25 30 Glu Gly Leu Ile Val Val Leu Ala Ile Cys Ile Leu Ser Asp Ile Phe 35 40 45 Leu Ile Phe Gly Gly Thr Ala Gly Val Gly Val Ile Ile Glu Lys Ala 50 55 60 Pro Leu Ala Leu Val Ala Leu Lys Trp Phe Gly Ala Ala Tyr Leu Ala 65 70 75 80 Trp Phe Ala Val Ser Cys Phe Arg Asp Met Val Lys Pro Arg Ala Leu 85 90 95 Asp Ser Ser Ala Thr Asp Asp Gly Thr Ser Leu Asp Asp Ala Pro Thr 100 105 110 Ala Ala His Val Ser Asn Val Asp Thr Thr Ser Gly Asn Gly Gly Gln 115 120 125 Val Gln Thr Lys Thr Arg Pro Ile Thr Thr Thr Ala Pro Thr Arg Gln 130 135 140 Ala His Pro Ala Arg Pro Trp Val Lys Pro Ala Leu Ala Ala Leu Ala 145 150 155 160 Phe Thr Trp Leu Asn Pro Ser Ala Tyr Ile Asp Thr Leu Val Met Leu 165 170 175 Gly Gly Ile Ala Asn Gln His Gly Glu Ser Gly Arg Trp Val Phe Ala 180 185 190 Ala Gly Ala Leu Met Ala Ser Ala Val Trp Phe Pro Leu Leu Gly Phe 195 200 205 Phe Ser Thr Arg Phe Ser Arg Val Leu Ser Arg Pro Gln Ala Trp Arg 210 215 220 Val Ile Asn Gly Val Ile Gly Cys Ile Met Val Val Met Cys Ile Arg 225 230 235 240 Leu Val Met His <210> 14 <211> 230 <212> PRT <213> Corynebacterium pseudogenitalium ATCC33035 <220> <221> LysE <222> (1)..(230) <400> 14 Met Ser Ile Val Leu Ala Gly Phe Phe Leu Gly Leu Ser Leu Ile Val 1 5 10 15 Ala Val Gly Pro Gln Asn Ala Met Leu Leu Lys Tyr Gly Ile Arg Arg 20 25 30 Asp His Ile Gly Leu Ile Ile Val Val Cys Ala Leu Ser Asp Val Ile 35 40 45 Leu Ile Thr Ser Gly Thr Ala Gly Val Gly Tyr Leu Val Glu Lys Phe 50 55 60 Pro Asn Ala Leu Gln Val Leu Lys Tyr Val Gly Ala Ala Tyr Leu Ala 65 70 75 80 Tyr Phe Thr Phe Thr Cys Phe Arg Asp Ala Phe Lys Thr Lys Gly Glu 85 90 95 Ala Ile Glu Val Glu Ser Thr Gln Pro Lys Ala Pro Gln Glu Val Ala 100 105 110 Ser Phe Asp Gly Ser Gln Ala Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ala Ala Arg 115 120 125 Val Glu Ile Lys Arg Ser Pro Ser Trp Val Lys Pro Leu Leu Thr Ala 130 135 140 Leu Ala Leu Thr Trp Leu Asn Pro Gly Ala Tyr Val Asp Val Val Val 145 150 155 160 Met Leu Gly Ser Ile Ala Asn Gln Tyr Gly Glu Ser Gly Arg Trp Leu 165 170 175 Phe Ala Val Gly Ala Ile Cys Ala Ser Phe Thr Trp Phe Pro Phe Ile 180 185 190 Gly Phe Gly Ala Ala Arg Phe Ser His Val Leu Ser Arg Pro Thr Val 195 200 205 Trp Arg Trp Ile Asn Phe Gly Ile Gly Val Ile Met Ile Gly Leu Thr 210 215 220 Leu Lys Leu Leu Leu Leu 225 230 <210> 15 <211> 241 <212> PRT <213> Corynebacterium accolens ATCC49725 <220> <221> LysE <222> (1)..(241) <400> 15 Met Ser Ile Val Leu Ala Gly Phe Val Leu Gly Leu Ser Leu Ile Val 1 5 10 15 Ala Val Gly Pro Gln Asn Ala Met Leu Leu Lys Tyr Gly Ile Arg Arg 20 25 30 Asp His Ile Gly Leu Ile Ile Val Val Cys Ala Leu Ser Asp Val Ile 35 40 45 Leu Ile Thr Ser Gly Thr Ala Gly Val Gly Tyr Leu Val Glu Arg Phe 50 55 60 Pro Asn Ala Leu Glu Ala Leu Lys Tyr Ile Gly Ala Ala Tyr Leu Ala 65 70 75 80 Phe Phe Thr Phe Thr Cys Phe Arg Asp Ala Phe Lys Thr Lys Gly Glu 85 90 95 Ala Ile Asp Val Glu Ser Thr Ser Pro Asn Ser Thr Glu Glu Val Ala 100 105 110 Thr Phe Asp Gly Asp Gly Asp Ser Thr Gly Gly Val Gly Thr Glu His 115 120 125 Gly Ser Val Ala Thr Ala Thr Ala Thr Gln Arg Gln Glu Ile Lys Arg 130 135 140 Ser Pro Ser Trp Val Lys Pro Leu Leu Thr Ala Leu Ala Leu Thr Trp 145 150 155 160 Leu Asn Pro Gly Ala Tyr Val Asp Val Leu Val Met Leu Gly Gly Ile 165 170 175 Ala Asn Gln Tyr Gly Asp Pro Gly Arg Trp Leu Phe Ala Gly Gly Ala 180 185 190 Ile Ala Ala Ser Phe Thr Trp Phe Pro Val Ile Gly Phe Gly Ala Ala 195 200 205 Arg Phe Ser His Val Leu Ser Arg Pro Glu Val Trp Arg Trp Ile Asn 210 215 220 Val Gly Ile Gly Val Ile Met Ile Gly Leu Thr Leu Lys Leu Leu Leu 225 230 235 240 Leu <210> 16 <211> 261 <212> PRT <213> Corynebacterium glucuronalyticum ATCC51867 <400> 16 Met Val Pro Glu Asn Leu Ser Phe Tyr Leu Cys Val Leu Leu Thr His 1 5 10 15 Asn Lys Tyr Val Asn Val Phe Phe Ala Gly Leu Leu Phe Asn Leu Ser 20 25 30 Leu Ile Leu Ala Leu Gly Pro Gln Asn Ala Leu Ile Leu Lys Tyr Gly 35 40 45 Leu Arg Arg Gln Ala Ile Thr Leu Val Ile Ser Val Cys Ala Leu Cys 50 55 60 Asp Ile Thr Leu Ile Ala Leu Ser Gly Val Gly Val Gly Val Ile Leu 65 70 75 80 Gln Lys Ala Pro Ile Val Leu Glu Ile Leu Arg Tyr Ala Gly Phe Leu 85 90 95 Tyr Leu Leu Trp Phe Ala Tyr Thr Cys Phe Arg Asp Ala Ile His Pro 100 105 110 Lys Thr Leu Ala Thr Glu Thr Val Ser Glu Thr Lys Pro His Glu Glu 115 120 125 Glu Leu Pro Asp Val Ser Ser Thr Thr Ala Gly Thr Thr Met Ala Thr 130 135 140 Ala Thr Val Met Glu Thr Ala Thr Thr Val Lys Glu Lys Thr His Arg 145 150 155 160 Arg Thr Phe His Ile Pro Gln Glu Ile Lys Gly Pro Ala Val Ala Ala 165 170 175 Phe Val Val Ser Val Ile Asn Pro Ala Ala Trp Val Asp Leu Phe Val 180 185 190 Val Ile Gly Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Gly Pro Asp Lys Trp Ala Phe 195 200 205 Leu Leu Gly Thr Met Ala Ala Ser Leu Val Trp Phe Pro Ala Phe Gly 210 215 220 Tyr Gly Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Leu Ser Ser Pro Lys Val Trp 225 230 235 240 Arg Cys Ile Asn Thr Gly Ile Gly Leu Phe Met Val Phe Met Ala Phe 245 250 255 Arg Val Leu Phe Met 260 <210> 17 <211> 204 <212> PRT <213> Micrococcus luteus NCTC2665 <400> 17 Met Trp Thr Leu Ala Gly Thr Gly Leu Leu Thr Gly Leu Ala Leu Ile 1 5 10 15 Val Ala Ile Gly Ala Gln Asn Ala Phe Val Leu Arg Gln Gly Val Arg 20 25 30 Arg Glu His Val Gly Ala Val Val Leu Val Cys Met Ala Ser Asp Ala 35 40 45 Val Leu Ile Leu Ala Gly Thr Ala Gly Val Gly Ala Leu Val Gln Ala 50 55 60 Val Pro Trp Leu Leu Glu Val Leu Arg Trp Gly Gly Ala Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Leu Trp Phe Ala Val Ser Ser Leu Arg Ala Ala Leu Arg Pro Gln Gly 85 90 95 Leu Met Ala Glu Gln Ala Pro Arg Thr Ala Gly Ser Val Ile Ala Thr 100 105 110 Thr Leu Ala Leu Thr Trp Leu Asn Pro His Val Tyr Leu Asp Thr Val 115 120 125 Val Leu Leu Gly Ser Leu Ala Asn Gln His Gly Pro Asp Ala Arg Trp 130 135 140 Val Phe Ala Ala Gly Ala Val Ala Ala Ser Val Leu Trp Phe Thr Ala 145 150 155 160 Leu Gly Tyr Gly Ala Arg Leu Leu Ala Arg Val Leu Ala Asp Pro Lys 165 170 175 Ala Trp Arg Val Val Asp Val Val Ile Ala Val Val Met Ala Val Leu 180 185 190 Ala Val Arg Leu Ile Ala Gly Ser Asp Val Trp Gly 195 200 <210> 18 <211> 230 <212> PRT <213> Corynebacterium tubuculostearicum SK141 <220> <221> ArgO(LysE) <222> (1)..(230) <400> 18 Met Ser Ile Val Leu Ala Gly Phe Phe Leu Gly Leu Ser Leu Ile Val 1 5 10 15 Ala Val Gly Pro Gln Asn Ala Met Leu Leu Lys Tyr Gly Ile Arg Arg 20 25 30 Asp His Ile Gly Leu Ile Ile Val Val Cys Ala Leu Ser Asp Val Ile 35 40 45 Leu Ile Thr Ser Gly Thr Ala Gly Val Gly Tyr Leu Val Glu Lys Phe 50 55 60 Pro Asn Ala Leu Gln Val Leu Lys Tyr Val Gly Ala Ala Tyr Leu Ala 65 70 75 80 Tyr Phe Thr Phe Thr Cys Phe Arg Asp Ala Leu Lys Thr Lys Gly Glu 85 90 95 Ala Ile Glu Val Glu Ser Thr Gln Pro Lys Val Pro Gln Glu Val Ala 100 105 110 Ser Phe Asp Gly Ser Gln Ala Arg Asn Thr Thr Lys Thr Ala Thr Arg 115 120 125 Val Glu Ile Lys Arg Ser Pro Ser Trp Val Lys Pro Leu Leu Thr Ala 130 135 140 Leu Ala Leu Thr Trp Leu Asn Pro Gly Ala Tyr Val Asp Val Val Val 145 150 155 160 Met Leu Gly Ser Ile Ala Asn Gln Tyr Gly Glu Ser Gly Arg Trp Leu 165 170 175 Phe Ala Val Gly Ala Ile Cys Ala Ser Phe Thr Trp Phe Pro Phe Ile 180 185 190 Gly Phe Gly Ala Ala Arg Phe Ser His Val Leu Ser Arg Pro Thr Val 195 200 205 Trp Arg Trp Ile Asn Phe Gly Ile Gly Val Ile Met Ile Gly Leu Thr 210 215 220 Leu Lys Leu Leu Leu Leu 225 230 <210> 19 <211> 244 <212> PRT <213> Corynebacterium matruchotii ATCC14266 <220> <221> ArgO(LysE) <222> (1)..(244) <400> 19 Met Ser Ile Ala Val Ala Gly Phe Leu Leu Gly Leu Ser Leu Ile Val 1 5 10 15 Ala Ile Gly Pro Gln Asn Ala Leu Val Ile Arg Gln Gly Val Lys Arg 20 25 30 Glu Gly Leu Ile Val Val Leu Ala Ile Cys Met Leu Ser Asp Ile Phe 35 40 45 Leu Ile Phe Gly Gly Thr Ala Gly Val Gly Val Ile Ile Glu Lys Ala 50 55 60 Pro Leu Ala Leu Val Ala Leu Lys Trp Phe Gly Ala Ala Tyr Leu Ala 65 70 75 80 Trp Phe Ala Val Ser Cys Phe Lys Asp Met Val Lys Pro Arg Ala Leu 85 90 95 Asp Ser Ser Ala Thr Asp Asn Gly Thr Ser Leu Asp Asp Ala Pro Thr 100 105 110 Val Ala His Ile Ser Asn Val Asp Ser Thr Ser Gly Asn Gly Gly Gln 115 120 125 Val Gln Thr Lys Thr Arg Pro Ile Thr Thr Thr Ala Pro Thr Arg Gln 130 135 140 Ala His Pro Ala Arg Pro Trp Val Lys Pro Ala Leu Ala Ala Leu Ala 145 150 155 160 Phe Thr Trp Leu Asn Pro Ser Ala Tyr Ile Asp Thr Leu Val Met Leu 165 170 175 Gly Gly Ile Ala Asn Gln His Gly Glu Ser Gly Arg Trp Val Phe Ala 180 185 190 Ala Gly Ala Leu Met Ala Ser Ala Val Trp Phe Pro Leu Leu Gly Phe 195 200 205 Phe Ser Thr Arg Phe Ser Arg Val Leu Ser Arg Pro Gln Ala Trp Arg 210 215 220 Val Ile Asn Gly Val Ile Gly Cys Ile Met Val Val Met Cys Ile Arg 225 230 235 240 Leu Ile Met His <210> 20 <211> 864 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <220> <221> lysE <222> (76)..(777) <223> pVWEx1- Insert <400> 20 tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gaattaaaag atatgaccat gattacgcca 60 agcttgcatg ccatcatgga aatcttcatt acaggtctgc ttttgggggc cagtctttta 120 ctgtccatcg gaccgcagaa tgtactggtg attaaacaag gaattaagcg cgaaggactc 180 attgcggttc ttctcgtgtg tttaatttct gacgtctttt tgttcatcgc cggcaccttg 240 ggcgttgatc ttttgtccaa tgccgcgccg atcgtgctcg atattatgcg ctggggtggc 300 atcgcttacc tgttatggtt tgccgtcatg gcagcgaaag acgccatgac aaacaaggtg 360 gaagcgccac agatcattga agaaacagaa ccaaccgtgc ccgatgacac gcctttgggc 420 ggttcggcgg tggccactga cacgcgcaac cgggtgcggg tggaggtgag cgtcgataag 480 cagcgggttt gggtaaagcc catgttgatg gcaatcgtgc tgacctggtt gaacccgaat 540 gcgtatttgg acgcgtttgt gtttatcggc ggcgtcggcg cgcaatacgg cgacaccgga 600 cggtggattt tcgccgctgg cgcgttcgcg gcaagcctga tctggttccc gctggtgggt 660 ttcggcgcag cagcattgtc acgcccgctg tccagcccca aggtgtggcg ctggatcaac 720 gtcgtcgtgg cagttgtgat gaccgcattg gccatcaaac tgatgttgat gggttagttt 780 tcgcgggttt tggaatcggt ggccttcgcc caaatattga cctagaggat ccccgggtac 840 cgagctcgaa ttcactggcc gtcg 864 <210> 21 <211> 1036 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <220> <221> 'argD <222> (15)..(491) <223> 3'-Ende des argD-Gens <220> <221> argF' <222> (505)..(523) <223> 5'-Ende des argF-Gens <220> <221> 'argH <222> (524)..(538) <223> 3'-Ende des argH-Gens <220> <221> cg1589' <222> (605)..(1024) <223> 5'-Ende des cg1589-Leserasters <400> 21 ggtggtgcta gcccggcgat ttctttgcac atcagcacga tggcgttgtt cccgatgtgg 60 tgaccatggc caagggactt ggcggcggtc ttcccatcgg tgcttgtttg gccactggcc 120 gtgcagctga attgatgacc ccaggcaagc acggcaccac tttcggtggc aacccagttg 180 cttgtgcagc tgccaaggca gtgctgtctg ttgtcgatga cgctttctgc gcagaagttg 240 cccgcaaggg cgagctgttc aaggaacttc ttgccaaggt tgacggcgtt gtagacgtcc 300 gtggcagggg cttgatgttg ggcgtggtgc tggagcgcga cgtcgcaaag caagctgttc 360 ttgatggttt taagcacggc gttattttga atgcaccggc ggacaacatt atccgtttga 420 ccccgccgct ggtgatcacc gacgaagaaa tcgcagacgc agtcaaggct attgccgaga 480 caatcgcata aaggactcaa acttatgact tcacaaccac aggggggtac gtcgataagc 540 attagtttat ggcctgtgct gctttccgat tgcgggagtt gcacaggcca tttattatca 600 attcatgaat ggttcccctg attactcaag aaaatctcga ggcaggggat tttccgtatt 660 tttaggcatc atcctgctgg tcatcgcggt attagcggtc ttggtgggcc gcggaaccat 720 cgccatgcca aagctcttcg gatcaagtaa cttgaccgag gtcagagcag taattggctc 780 ggaaaagaag gaattcttcg aagatccaga agtcgttgaa gccttcgccg accacggctt 840 tgaagttaac gtggacaccg caggatctcg tcggatcgcc actgatgtgg acttgagccc 900 gtacgatttc gcgttcccat cctctgcacc agctgcgcag aagatctccg aagccaacac 960 cacgacgggc cgattcaccc cattctattc gcctatggcg gtagcaacat tcggaaccat 1020 caccatgcat accacc 1036 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Oligonukleotid <220> <221> lysE_1.p <222> (1)..(28) <400> 22 tcgatatcat ggaaatcttc attacagg 28 <210> 23 <211> 32 <212> DNA <213> Oligonukleotid <220> <221> lysE_2.p <222> (1)..(32) <400> 23 tgcctaggtc aatatttggg cgaaggccac cg 32 <210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> Oligonukleotid <220> <221> argFRGH_d1 <222> (1)..(32) <400> 24 ggtggtgcta gcccggcgat ttctttgcac at 32 <210> 25 <211> 40 <212> DNA <213> Oligonukleotid <220> <221> argFRGH_d2 <222> (1)..(40) <400> 25 aatgcttatc gacgtacccc cctgtggttg tgaagtcata 40 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Oligonukleotid <220> <221> argFRGH_d3 <222> (1)..(20) <400> 26 ggggtacgtc gataagcatt 20 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Oligonukleotid <220> <221> argFRGH_d4 <222> (1)..(32) <400> 27 ggtggtatgc atggtgatgg ttccgaatgt tg 32 <210> 28 <211> 238 <212> DNA <213> PgapRBS Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <220> <221> RBS <222> (225)..(232) <400> 28 ctgtatgatt ttgcatctgc tgcgaaatct ttgtttcccc gctaaagttg aggacaggtt 60 gacacggagt tgactcgacg aattatccaa tgtgagtagg tttggtgcgt gagttggaaa 120 aattcgccat actcgccctt gggttctgtc agctcaagaa ttcttgagtg accgatgctc 180 tgattgacct aactgcttga cacattgcat ttcctacaat ctttagagga gacacaac 238 <210> 29 <211> 8281 <212> DNA <213> pEC7lysE <400> 29 tcccagaggc agcgtcggcg gctcctgcct cccccgcccg gcgccgaccg ggacccgcaa 60 accccttgat ccgctgtcgg gggtgatcct gcaagcctcg tcgtcctggc cggaccacgc 120 tatctgtgca aggtccccgg ccccggacgc gcgctccatg agcagagcgc ccgccgggga 180 tcgatccggg cttatcgact gcacggtgca ccaatgcttc tggcgtcagg cagccatcgg 240 aagctgtggt atggctgtgc aggtcgtaaa tcactgcata attcgtgtcg ctcaaggcgc 300 actcccgttc tggataatgt tttttgcgcc gacatcataa cggttctggc aaatattctg 360 aaatgagctg ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa 420 caatttcaca caggaaacag aattcccagc ttgagtagga caaatccgcc gagcttcgac 480 gagattttca ggagctaagg aagctaaaat ggagaaaaaa atcactggat ataccaccgt 540 tgatatatcc caatggcatc gtaaagaaca ttttgaggca tttcagtcag ttgctcaatg 600 tacctataac cagaccgttc agctggatat tacggccttt ttaaagaccg taaagaaaaa 660 taagcacaag ttttatccgg cctttattca cattcttgcc cgcctgatga atgctcatcc 720 ggaattccgt atggcaatga aagacggtga gctggtgata tgggatagtg ttcacccttg 780 ttacaccgtt ttccatgagc aaactgaaac gttttcatcg ctctggagtg aataccacga 840 cgatttccgg cagtttctac acatatattc gcaagatgtg gcgtgttacg gtgaaaacct 900 ggcctatttc cctaaagggt ttattgagaa tatgtttttc gtctcagcca atccctgggt 960 gagtttcacc agttttgatt taaacgtggc caatatggac aacttcttcg cccccgtttt 1020 caccatgggc aaatattata cgcaaggcga caaggtgctg atgccgctgg cgattcaggt 1080 tcatcatgcc gtttgtgatg gcttccatgt cggcagaatg cttaatgaat tacaacagta 1140 ctgcgatgag tggcagggcg gggcgtaatt tttttaaggc agttattggt gcccttaaac 1200 gcctggttgc tacgcctgaa taagtgataa taagcggatg aatggcagaa attcgtcgag 1260 gcggcacctc gctaacggat tcaccactcc aagaattgga gccaatcaat tcttgcggag 1320 aactgtgaat gcgcaaacca acccttggca gaacatatcc atcgcgtccg ccatctccag 1380 cagccgcacg cggcgcatct cggctgtttt ggcggatgag agaagatttt cagcctgata 1440 cagattaaat cagaacgcag aagcggtctg ataaaacaga atttgcctgg cggcagtagc 1500 gcggtggtcc cacctgaccc catgccgaac tcagaagtga aacgccgtag cgccgatggt 1560 agtgtggggt ctccccatgc gagagtaggg aactgccagg catcaaataa aacgaaaggc 1620 tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag 1680 taggacaaat ccgccgggag cggatttgaa cgttgcgaag caacggcccg gagggtggcg 1740 ggcaggacgc ccgccataaa ctgccaggca tcaaattaag cagaaggcca tcctgacgga 1800 tggccttttt gcgtttctac aaactcttcc tgtcgtcata tctacaagcc atccccccac 1860 agatacggta aactagcctc gtttttgcat caggaaagca gaattcgtaa tcatgtcata 1920 gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag 1980 cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg 2040 ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca 2100 acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 2160 gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 2220 gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 2280 ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 2340 cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 2400 ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 2460 taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg 2520 ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 2580 ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 2640 aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 2700 tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac 2760 agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 2820 ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 2880 tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 2940 tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt 3000 cacctagatc cttttggggg gggggggaaa gccacgttgt gtctcaaaat ctctgatgtt 3060 acattgcaca agataaaaat atatcatcat gaacaataaa actgtctgct tacataaaca 3120 gtaatacaag gggtgttatg agccatattc aacgggaaac gtcttgctcg aagcccgcct 3180 aatgagcggg ctttttttta aaaaaaagcc cgctcattag gcgggctagc ccgcctaatg 3240 agcgggcttt ttttttcgag gccgcgatta aattccaaca tggatgctga tttatatggg 3300 tataaatggg ctcgaaaaga tatgaccatg attacgccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg 3360 actctagagg atccaccgtg accagtgcat tgattggtgc ttcgtcagtt gagcagctgg 3420 acaacagcct tgattcactc aacaacttgg agttttctga cgccgagttg gaggcgatcg 3480 atgagatttc ccacgacgcc ggcatcaaca tttgggcgaa ggccaccgat tccaaaaccc 3540 gcgaaaacta acccatcaac atcagtttga tggccaatgc ggtcatcaca actgccacga 3600 cgacgttgat ccagcgccac accttggggc tggacagcgg gcgtgacaat gctgctgcgc 3660 cgaaacccac cagcgggaac cagatcaggc ttgccgcgaa cgcgccagcg gcgaaaatcc 3720 accgtccggt gtcgccgtat tgcgcgccga cgccgccgat aaacacaaac gcgtccaaat 3780 acgcattcgg gttcaaccag gtcagcacga ttgccatcaa catgggcttt acccaaaccc 3840 gctgcttatc gacgctcacc tccacccgca cccggttgcg cgtgtcagtg gccaccgccg 3900 aaccgcccaa aggcgtgtca tcgggcacgg ttggttctgt ttcttcaatg atctgtggcg 3960 cttccacctt gtttgtcatg gcgtctttcg ctgccatgac ggcaaaccat aacaggtaag 4020 cgatgccacc ccagcgcata atatcgagca cgatcggcgc ggcattggac aaaagatcaa 4080 cgcccaaggt gccggcgatg aacaaaaaga cgtcagaaat taaacacacg agaagaaccg 4140 caatgagtcc ttcgcgctta attccttgtt taatcaccag tacattctgc ggtccgatgg 4200 acagtaaaag actggccccc aaaagcagac ctgtaatgaa gatttccatg atcaccatcg 4260 tgacctatgg aagtacttaa gtaaaatgat tggttcttaa catggtttaa tatagcttca 4320 tgaaccccat tcaactggac actttgctct caatcattga tgaaggcagc ttcgaaggcg 4380 cctccttagc cctttccatt tccccctcgg cggtgagtca gcgcggatcc ccgggtaccg 4440 agctcgaatt cactggccgt cgttttaccg ataatgtcgg gcaatcaggt gcgacaatct 4500 atcgagcttt tgccattctc accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat 4560 aaccttattt ttgacgaggg gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc 4620 gcagaccgat accaggatct tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca 4680 ttacagaaac ggctttttca aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag 4740 tttcatttga tgctcgatga gtttttctaa tcagaattgg ttaattggtt gtaacactgg 4800 cagagcatta cgctgacttg acgggacggc ggctttgttg aataaatcga acttttgctg 4860 agttgaagga tcagatcacg catcttcccg acaacgcaga ccgttccgtg gcaaagcaaa 4920 agttcaaaat caccaactgg tccacctaca acaaagctct catcaaccgt ggctccctca 4980 ctttctggct ggatgatggg gcgattcagg cctggtatga gtcagcaaca ccttcttcac 5040 gaggcagacc tcagcgcccc ccccccccta gcttgtctac gtctgatgct ttgaatcgga 5100 cggacttgcc gatcttgtat gcggtgattt ttccctcgtt tgcccacttt ttaatggtgg 5160 ccggggtgag agctacgcgg gcggcgacct gctgcgctgt gatccaatat tcggggtcgt 5220 tcactggttc ccctttctga tttctggcat agaagaaccc ccgtgaactg tgtggttccg 5280 ggggttgctg atttttgcga gacttctcgc gcaattccct agcttaggtg aaaacaccat 5340 gaaacactag ggaaacaccc atgaaacacc cattagggca gtagggcggc ttcttcgtct 5400 agggcttgca tttgggcggt gatctggtct ttagcgtgtg aaagtgtgtc gtaggtggcg 5460 tgctcaatgc actcgaacgt cacgtcattt accgggtcac ggtgggcaaa gagaactagt 5520 gggttagaca ttgttttcct cgttgtcggt ggtggtgagc ttttctagcc gctcggtaaa 5580 cgcggcgatc atgaactctt ggaggttttc accgttctgc atgcctgcgc gcttcatgtc 5640 ctcacgtagt gccaaaggaa cgcgtgcggt gaccacgacg ggcttagcct ttgcctgcgc 5700 ttctagtgct tcgatggtgg cttgtgcctg cgcttgctgc gcctgtagtg cctgttgagc 5760 ttcttgtagt tgctgttcta gctgtgcctt ggttgccatg ctttaagact ctagtagctt 5820 tcctgcgata tgtcatgcgc atgcgtagca aacattgtcc tgcaactcat tcattatgtg 5880 cagtgctcct gttactagtc gtacatactc atatttacct agtctgcatg cagtgcatgc 5940 acatgcagtc atgtcgtgct aatgtgtaaa acatgtacat gcagattgct gggggtgcag 6000 ggggcggagc caccctgtcc atgcggggtg tggggcttgc cccgccggta cagacagtga 6060 gcaccggggc acctagtcgc ggataccccc cctaggtatc ggacacgtaa ccctcccatg 6120 tcgatgcaaa tctttaacat tgagtacggg taagctggca cgcatagcca agctaggcgg 6180 ccaccaaaca ccactaaaaa ttaatagttc ctagacaaga caaacccccg tgcgagctac 6240 caactcatat gcacgggggc cacataaccc gaaggggttt caattgacaa ccatagcact 6300 agctaagaca acgggcacaa cacccgcaca aactcgcact gcgcaacccc gcacaacatc 6360 gggtctaggt aacactgaaa tagaagtgaa cacctctaag gaaccgcagg tcaatgaggg 6420 ttctaaggtc actcgcgcta gggcgtggcg taggcaaaac gtcatgtaca agatcaccaa 6480 tagtaaggct ctggcggggt gccataggtg gcgcagggac gaagctgttg cggtgtcctg 6540 gtcgtctaac ggtgcttcgc agtttgaggg tctgcaaaac tctcactctc gctgggggtc 6600 acctctggct gaattggaag tcatgggcga acgccgcatt gagctggcta ttgctactaa 6660 gaatcacttg gcggcgggtg gcgcgctcat gatgtttgtg ggcactgttc gacacaaccg 6720 ctcacagtca tttgcgcagg ttgaagcggg tattaagact gcgtactctt cgatggtgaa 6780 aacatctcag tggaagaaag aacgtgcacg gtacggggtg gagcacacct atagtgacta 6840 tgaggtcaca gactcttggg cgaacggttg gcacttgcac cgcaacatgc tgttgttctt 6900 ggatcgtcca ctgtctgacg atgaactcaa ggcgtttgag gattccatgt tttcccgctg 6960 gtctgctggt gtggttaagg ccggtatgga cgcgccactg cgtgagcacg gggtcaaact 7020 tgatcaggtg tctacctggg gtggagacgc tgcgaaaatg gcaacctacc tcgctaaggg 7080 catgtctcag gaactgactg gctccgctac taaaaccgcg tctaaggggt cgtacacgcc 7140 gtttcagatg ttggatatgt tggccgatca aagcgacgcc ggcgaggata tggacgctgt 7200 tttggtggct cggtggcgtg agtatgaggt tggttctaaa aacctgcgtt cgtcctggtc 7260 acgtggggct aagcgtgctt tgggcattga ttacatagac gctgatgtac gtcgtgaaat 7320 ggaagaagaa ctgtacaagc tcgccggtct ggaagcaccg gaacgggtcg aatcaacccg 7380 cgttgctgtt gctttggtga agcccgatga ttggaaactg attcagtctg atttcgcggt 7440 taggcagtac gttctagatt gcgtggataa ggctaaggac gtggccgctg cgcaacgtgt 7500 cgctaatgag gtgctggcaa gtctgggtgt ggattccacc ccgtgcatga tcgttatgga 7560 tgatgtggac ttggacgcgg ttctgcctac tcatggggac gctactaagc gtgatctgaa 7620 tgcggcggtg ttcgcgggta atgagcagac tattcttcgc acccactaaa agcggcataa 7680 accccgttcg atattttgtg cgatgaattt atggtcaatg tcgcgggggc aaactatgat 7740 gggtcttgtt gttgacaatg gctgatttca tcaggaatgg aactgtcatg ctgttatgtg 7800 cctggctcct aatcaaagct ggggacaatg ggttgccccg ttgatctgat ctagttcgga 7860 ttggcggggc ttcactgtat ctgggggtgg catcgtgaat agattgcaca ccgtagtggg 7920 cagtgtgcac accatagtgg ccatgagcac caccaccccc agggacgccg acggcgcgaa 7980 gctctgcgcc tggtgcggct cggagatcaa gcaatccggc gtcggccgga gccgggacta 8040 ctgccgccgc tcctgccgcc agcgggcgta cgaggcccgg cgccagcgcg aggcgatcgt 8100 gtccgccgtg gcgtcggcag tcgctcgccg agatacgtca cgtgacgaaa tgcagcagcc 8160 ttccattccg tcacgtgacg aaactcgggc cgcaggtcag agcacggttc cgcccgctcc 8220 ggccctgccg gacccccggc tgcagctcgc ccggccgccg gtccccctgc cgtccggccc 8280 g 8281 <210> 30 <211> 290 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(290) <223> Aminos?resequenz des Aktivatorproteins LysG von Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <400> 30 Met Asn Pro Ile Gln Leu Asp Thr Leu Leu Ser Ile Ile Asp Glu Gly 1 5 10 15 Ser Phe Glu Gly Ala Ser Leu Ala Leu Ser Ile Ser Pro Ser Ala Val 20 25 30 Ser Gln Arg Val Lys Ala Leu Glu His His Val Gly Arg Val Leu Val 35 40 45 Ser Arg Thr Gln Pro Ala Lys Ala Thr Glu Ala Gly Glu Val Leu Val 50 55 60 Gln Ala Ala Arg Lys Met Val Leu Leu Gln Ala Glu Thr Lys Ala Gln 65 70 75 80 Leu Ser Gly Arg Leu Ala Glu Ile Pro Leu Thr Ile Ala Ile Asn Ala 85 90 95 Asp Ser Leu Ser Thr Trp Phe Pro Pro Val Phe Asn Glu Val Ala Ser 100 105 110 Trp Gly Gly Ala Thr Leu Thr Leu Arg Leu Glu Asp Glu Ala His Thr 115 120 125 Leu Ser Leu Leu Arg Arg Gly Asp Val Leu Gly Ala Val Thr Arg Glu 130 135 140 Ala Asn Pro Val Ala Gly Cys Glu Val Val Glu Leu Gly Thr Met Arg 145 150 155 160 His Leu Ala Ile Ala Thr Pro Ser Leu Arg Asp Ala Tyr Met Val Asp 165 170 175 Gly Lys Leu Asp Trp Ala Ala Met Pro Val Leu Arg Phe Gly Pro Lys 180 185 190 Asp Val Leu Gln Asp Arg Asp Leu Asp Gly Arg Val Asp Gly Pro Val 195 200 205 Gly Arg Arg Arg Val Ser Ile Val Pro Ser Ala Glu Gly Phe Gly Glu 210 215 220 Ala Ile Arg Arg Gly Leu Gly Trp Gly Leu Leu Pro Glu Thr Gln Ala 225 230 235 240 Ala Pro Met Leu Lys Ala Gly Glu Val Ile Leu Leu Asp Glu Ile Pro 245 250 255 Ile Asp Thr Pro Met Tyr Trp Gln Arg Trp Arg Leu Glu Ser Arg Ser 260 265 270 Leu Ala Arg Leu Thr Asp Ala Val Val Asp Ala Ala Ile Glu Gly Leu 275 280 285 Arg Pro 290 1 200900319 Ausland 92

Claims (9)

1. a) L-오르니틴 외수송체의 활성이 있고, 아미노산 서열이 서열번호 2, 4, 5, 7, 및 9 내지 19로부터 선택되는 아미노산 서열과 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 과다발현하는, 코리네박테리움(Corynebacterium), 바실루스(Bacillus), 스트렙토미세스(Streptomyces), 아르트로박터(Arthrobacter) 및 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae)로 이루어진 군으로부터 선택된 L-오르니틴-배출 박테리아를 배지에서 발효시키는 단계, 및
   b) 상기 L-오르니틴을 상기 배지 내에 축적시키고, 이때 발효 브로쓰(broth)를 수득하는 단계
   를 수행하고,
   c) 이때, DSM23239로 기탁된 플라스미드 pEC7lysE가 과다발현에 있어 배제되는 것
   을 특징으로 하는 L-오르니틴의 제조 방법.
2. 제1항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 경우에, 과다발현이 L-오르니틴 외수송 활성의 수준을 ATCC13032 또는 ATCC14067 또는 ATCC13869와 비교하여 10％ 이상 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 과다발현이
   a) 카피수를 증가시킴,
   b) 강력한 프로모터를 사용함,
   c) 프로모터를 돌연변이시킴, 및
   d) 활성화 단백질을 과다발현시킴
   으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 수단에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 박테리아가 코리네박테리움인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 추가적으로
   a) 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 (EC 1.2.4.2)의 E1 서브유닛을 코딩하는 odhA 유전자,
   b) 디히드로리포아미드 숙시닐 트랜스퍼라제 (EC 2.3.1.61)를 코딩하는 sucA 유전자,
   c) 디히드로디피콜리네이트 신타제 (DapA, EC 4.2.1.52)를 코딩하는 dapA 유전자,
   d) 디히드로디피콜리네이트 신타제 (DapB, EC 1.3.1.26)를 코딩하는 dapB 유전자,
   e) 메소-디아미노피멜레이트 데히드로게나제 (Ddh, EC 1.4.1.16)를 코딩하는 ddh 유전자,
   f) 디아미노피멜레이트 데카르복실라제 (LysA, EC 4.1.1.20)를 코딩하는 lysA 유전자,
   g) L-아르기닌 생합성의 리프레서 (ArgR)를 코딩하는 argR 유전자,
   h) 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라제 (ArgF, EC 2.1.3.3)를 코딩하는 argF 유전자,
   i) 아르기니노숙시네이트 신타제 (ArgG, EC 6.3.4.5)를 코딩하는 argG 유전자,
   j) 아르기니노숙시네이트 리아제 (ASAL) (ArgH, EC 4.3.2.1)를 코딩하는 argH 유전자,
   k) 아스파르테이트 키나제 (LysC, EC 2.7.2.4)를 코딩하는 lysC 유전자, 및
   l) 아스파르테이트 세미알데히드 데히드로게나제 (Asd, EC 1.2.1.11)를 코딩하는 asd 유전자
   로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 발현이 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 추가적으로
   a) gdh 유전자에 의해 코딩되는 글루타메이트 데히드로게나제 (EC 1.4.1.3),
   b) argJ 유전자에 의해 코딩되는 글루타메이트 N-아세틸트랜스퍼라제 (EC 2.3.1.35 및 EC 2.3.1.1),
   c) argB 유전자에 의해 코딩되는 아세틸글루타메이트 키나제 (EC 2.7.2.8),
   d) argC 유전자에 의해 코딩되는 N-아세틸-감마-글루타밀-포스페이트 리덕타제 (EC 1.2.1.38),
   e) argD 유전자에 의해 코딩되는 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제 (EC 2.6.1.11),
   f) ptsG 유전자에 의해 코딩되는, 글루코스 흡수 시스템의 글루코스-특이적 성분 EIIB (PtsG) (EC 2.7.1.69),
   g) ptsS 유전자에 의해 코딩되는, 수크로스 흡수 시스템의 수크로스-특이적 성분 EIIB (PtsS) (EC 2.7.1.69),
   h) zwf 유전자에 의해 코딩되는 글루코스-6-포스페이트 1-데히드로게나제 (EC 1.1.1.49),
   i) pgi 유전자에 의해 코딩되는 글루코스-6-포스페이트 이소머라제 (EC 5.3.1.9),
   j) pfkA 유전자에 의해 코딩되는 포스포프룩토키나제 (EC 2.7.1.11),
   k) fda 유전자에 의해 코딩되는 프룩토스-비스포스페이트 알돌라제 (EC 4.1.2.13),
   l) gap 유전자에 의해 코딩되는 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (EC 1.2.1.59),
   m) pgk 유전자에 의해 코딩되는 포스포글리세레이트 키나제 (EC 2.7.2.3),
   n) pyk 유전자에 의해 코딩되는 피루베이트 키나제 (EC 2.7.1.40),
   o) aceE 유전자에 의해 코딩되는, 피루베이트 데히드로게나제 (EC 1.2.4.1)의 E1 서브유닛,
   p) ppc 유전자에 의해 코딩되는 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 (EC 4.1.1.31),
   q) pyc 유전자에 의해 코딩되는 피루베이트 카르복실라제 (EC 6.4.1.1),
   r) acn 유전자에 의해 코딩되는 아코니타제 (EC 4.2.1.3), 및
   s) icd 유전자에 의해 코딩되는 이소시트레이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.42)
   로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 효소 활성이 강화되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 회분식(batch) 방법, 유가식(fed-batch) 방법, 반복 유가식 방법 및 연속 방법으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, L-오르니틴, 또는 L-오르니틴을 함유하는 액체 또는 고체 생성물이 L-오르니틴을 함유하는 발효 브로쓰로부터 회수되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 박테리아가 코리네박테리움 글루타미쿰인 것을 특징으로 하는 방법.
   
   

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