CN111334535B - 生产l-氨基酸的重组菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，特别涉及生产L‑氨基酸的重组菌株及其应用。本发明提供了重组菌株及其用于发酵生产谷氨酸的用途。实验结果表明，相比于对照菌ATCC 13869，acnR基因失活修饰的菌株ATCC 13869ΔacnR显著(P＜0.05)提高了谷氨酸的发酵产量，产量为27.31g/L。

Description

生产L-氨基酸的重组菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别涉及生产L-氨基酸的重组菌株及其应用。

背景技术

谷氨酸(Glutamic acid)作为全球产量最大的氨基酸品种，其需求量高达2500万吨。L-谷氨酸钠和聚谷氨酸等下游产品被广泛应用于食品、医药、化妆品以及农业等行业。因此，如何提高L-谷氨酸的产量是目前面临的重要课题。

工业上，通常使用短杆菌属(Brevibacterium)或棒杆菌属(Corynebacterium)等的棒状杆菌型细菌来发酵生产L-谷氨酸。为了改善这些细菌的生产能力，通常使用从自然界分离的菌株，或人工突变的菌株或基因重组的菌株。

谷氨酸棒杆菌为生物素缺陷型，当生物素被限量添加时，菌体则大量分泌产生谷氨酸，因而野生型的谷氨酸棒杆菌可通过生物素限量添加来诱导分泌产生谷氨酸。此外，在生物素过量的情况下通过添加某种表面活性剂如Twee40或Tween60也能诱导谷氨酸棒杆菌过量合成谷氨酸。但是上述方案对产量的增加效果不显著，无法满足日益增长的需求。

发明内容

有鉴于此，用于生产L-氨基酸的重组菌及其应用。实验结果表明，通过失活顺乌头酸酶转录抑制因子编码基因acnR，使得棒状杆菌型细菌在培养基或细胞中产生和积累L-氨基酸特别是L-谷氨酸，并从所述的培养基或细胞中收集L-氨基酸。与野生菌株相比，本发明提供的菌株显著(P＜0.05)提高了谷氨酸的发酵产量。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明实验结果表明，失活acnR基因或抑制acnR基因的表达在生产L-谷氨酸中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述失活acnR基因包括敲除acnR基因或敲低acnR基因。

在本发明的一些具体实施方案中，所述抑制acnR基因的表达包括不产生AcnR蛋白、由acnR基因编码的蛋白量降低或对蛋白结构进行修饰产生不正常的AcnR蛋白。

在上述研究的基础上，本发明提供了菌株，失活acnR基因或抑制acnR基因的表达。

在本发明的一些具体实施方案中，所述失活acnR基因包括敲除acnR基因或敲低acnR基因。

在本发明的一些具体实施方案中，所述抑制acnR基因的表达包括不产生AcnR蛋白、由acnR基因编码的蛋白量降低或对蛋白结构进行修饰产生不正常的AcnR蛋白。

在本发明的一些具体实施方案中，出发菌株为谷氨酸棒杆菌ATCC 13869或ATCC13032。

在本发明的一些具体实施方案中，其保藏编号为CGMCC No.16928。

在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的菌株在生产L-谷氨酸中的应用。

本发明还提供了生产L-谷氨酸的方法，以本发明所述的菌株为发酵菌株。

本发明提供了重组菌株及其用于发酵生产谷氨酸的用途。实验结果表明，相比于对照菌ATCC 13869，acnR基因失活修饰的菌株ATCC 13869ΔacnR显著(P＜0.05)提高了谷氨酸的发酵产量，产量为27.31g/L。

生物保藏说明

生物材料MHZ-0114-1，分类命名：谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum于2018年12月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.16928。

具体实施方式

本发明公开了生产L-氨基酸的重组菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供将生产L-氨基酸的能力改进的棒状杆菌型重组菌株和提供这种细菌有效生产L-氨基酸的方法。与野生菌株相比，本发明提供的菌株显著(P＜0.05)提高了谷氨酸的发酵产量。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种重组菌株，通过在染色体上的acnR基因或其表达调控区引入突变来修饰所述的棒状杆菌型细菌，来达到降低acnR基因的表达量，从而间接增加acn基因表达量。

本发明所述的棒状杆菌型细菌是生产L-氨基酸能力的棒状杆菌型细菌，并通过修饰失活acnR基因。表述“失活acnR基因”意指与未修饰的菌株或野生型菌株相比，acnR基因的表达量降低；由acnR基因编码的蛋白质的量降低；或对蛋白结构进行修饰产生不正常的AcnR蛋白；或完全不能产生由未修饰的菌株或野生型菌株能够产生的AcnR蛋白。作为对照比较的细菌是谷氨酸棒杆菌ATCC 13869或ATCC13032。

通过与未修饰的菌株或野生型菌株比较acnR的mRNA量来确认acnR基因的表达量降低，相应方法包括Northern杂交和RT-PCR。也可以通过Western印记来确认AcnR蛋白量降低。也可以通过测定顺乌头酸酶的活性确定acnR的失活增强了顺乌头酸酶编码基因acn的表达。

在本发明的具体实施方案中，所述重组菌株中acnR基因修饰是指基因或其表达调控区引入突变被失活，由此获得的菌株命名为ATCC13869ΔacnR，制备方法如下：

在NCBI GenBank数据库中获得谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicumATCC 13869)acnR基因的核苷酸序列(SEQ ID No.1)，由此核苷酸序列设计在基因阅读框设计缺失突变，基于碱基序列和缺失突变的位置合成了4条引物(如SEQ ID NO.2-5所示)。利用Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)，以B1/B2，B3/B4作为引物对，以谷氨酸棒杆菌ATCC 13869的基因组DNA作为模板制备缺失片段。PCR程序为，98℃变性10s，50℃复性20s，72℃延伸20s，循环30次后。所得2个片段经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化后，利用引物对B1/B4进行overlap PCR扩增得到产物，经琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根)纯化后利用XbaI/HindIII进行消化，同时将pK18-mobsacB利用XbaI/HindIII进行消化，并用T4DNA连接酶(TransGen Biotech)将片段与载体进行连接，转化Trans1T1感受态细胞(TransGenBiotech)，挑取卡那抗性克隆，XbaI/HindIII酶切鉴定得到overlap PCR片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，进一步通过测序(Invitrogen公司)鉴定插入的片段确实为acnR基因缺失突变片段。

将所得到的质粒命名为pK18-ΔacnR。将pK18-ΔacnR转入谷氨酸棒杆菌ATCC13869中。在含有15mg/L的卡那霉素的选择培养基上选择交换重组子。利用Fast Taq DNA聚合酶(TransGen Biotech)，以B1/T2，T1/B4引物对进行菌落PCR鉴定KanR克隆，PCR参数为：94℃30s，50℃30s，72℃40s，共30个循环，两个引物对扩增出大小不一的目的片段的克隆为阳性克隆。将挑选出的阳性克隆接种入无抗BHI培养基中培养12～14h，将菌液稀释100-1000倍后涂布在含有10％蔗糖的固体BHI培养基上培养36h，将所筛选出的菌株进一步进行卡那抗性表型验证，挑选KanS的重组子利用验证引物对Y1/Y2验证重组子，阳性重组子不能扩增出片段，而阴性重组子能，将得到的阳性重组子命名为ATCC 13869ΔacnR。

谷氨酸棒杆菌感受态的制备：-80℃冰箱中划线转接出谷氨酸棒杆菌种至BHI平板上，30℃培养；挑取单菌落，转接到5ml BHI液体培养基(3.7％脑心浸粉)试管中，200rpm，30℃培养12h；按1％接种量接种至100ml BHIS液体培养基(3.7％脑心浸粉，9.1％山梨醇)中，200rpm，30℃培养至OD600达到1.5；4℃，6000rpm离心20min，收集菌体，弃上清液；用TGBuffer(1mM Tris，10％甘油(v/v)，pH 7.5)悬浮后于4℃，6000rpm离心20min，弃上清液，并重复一遍；用10％的甘油悬浮后于4℃，6000rpm离心20min，弃上清液，并重复一遍；加入1ml10％甘油悬浮菌体后分装。将感受态细胞放于-70℃冰箱保存或直接用于电击转化。

电转化：将感受态细胞从冰箱中拿出并于冰水中融化，添加10-15μl重组质粒DNA到溶化的感受态细胞中，吹吸混匀后将其转移至1mm电击杯(BioRad公司产品)中，于1.8kv，5ms条件下在电击仪(BioRad公司产品)上电击，然后立即加入46℃预热的BHI培养液，轻轻混匀，将混合液转入15ml离心管中，46℃水浴6分钟，30℃活化培养2h，离心收集菌体，将菌体涂布于含有25mg/L的BHI固体培养基上，30℃于恒温箱中培养36h。

菌株筛选：将电转后的菌体涂布在含卡那抗性的固体BHI培养基上，挑选抗性克隆。利用Fast Taq DNA聚合酶(全式金公司)，以B1/T2，T1/B4引物对进行菌落PCR鉴定KanR克隆，两个引物对分别扩增出约1100bp和1500bp片段的克隆为阳性克隆。将挑选出的阳性克隆接种入无抗BHI培养基中培养12-14h，让菌体在培养的过程中发生同源重组。将菌液稀释100-1000倍后涂布在含有10％蔗糖的固体BHI培养基上培养36h，在蔗糖存在的情况下，未发生第二次同源重组的菌株因带有sacB基因而不能存活。由于蔗糖筛选存在约20％的假阳性，需将所筛选出的菌株进一步进行卡那抗性表型验证。根据失活位点设计出鉴定引物，挑选KanS的重组子利用Y1/Y2进行验证，阳性重组子不能扩增出片段，而阴性重组子能。

发酵验证谷氨酸产量的方法：将冻存于-80℃甘油管中的菌株接种于上述斜面培养基中进行活化，于31.5℃下培养24h后长出菌苔；从新鲜活化的斜面上挑取菌苔，接种于上述种子培养基中，于31.5℃，220rpm下振荡培养至对数生长中后期(12h左右)，制得种子液；以10％的接种量将上述种子液接种至装有20ml发酵培养基的500ml摇瓶中，在31.5℃，振荡培养。在糖被完全消耗之后，测定培养基中积累的L-谷氨酸的浓度。结果如表2所示(OD600是稀释100倍的培养液在600nm的浊度并表示细胞量，Glu(g/L)表示积累的L-谷氨酸的量)。

Acn酶活测定方法：将培养后的细菌在4℃下以10000rpm离心5min，收集菌体，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)洗一次，再重悬于1/10原菌液体积的PBS中，冰浴，超声破菌(350W，持续5s，间隔10s，共20次)后，10000rpm离心10min，去沉淀，得到粗酶。反应在20℃下进行，反应体系为：5-50μL粗酶液，950-995μL 90mM Tris-HCl(pH 8.0)含有20mMDL-异柠檬酸三钠，反应最终体积为1mL。生成的顺乌头酸在240nm波长下检测吸光值，根据标准曲线计算浓度。每分钟生成1μmol顺乌头酸所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。单位酶活＝酶活/蛋白浓度，以Protein Assay(Bio-Rad)测定粗酶液中的蛋白质浓度，使用牛血清蛋白为标准蛋白。

本发明还提供了一种发酵生产谷氨酸的方法，以所述的重组菌株为发酵菌株。

本发明提供了重组菌株及其用于发酵生产谷氨酸的用途。实验结果表明，相比于对照菌ATCC 13869，acnR基因失活修饰的菌株ATCC 13869ΔacnR显著(P＜0.05)提高了谷氨酸的发酵产量，产量为27.31g/L。

本发明提供的重组菌株及其用于发酵生产谷氨酸的用途中所涉及的菌株、载体、启动子、制剂均可由市场购得。

术语解释：

PCR：聚合酶链式反应

KanR：卡那霉素抗性

KanS：卡那霉素敏感。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 acnR失活突变的引入

(1)acnR失活载体构建

根据谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC13869)acnR基因的DNA序列(SEQ NO.1)设计引物进行PCR扩增，引物序列如表1所示。

表1实例应用引物

用基因组DNA提取试剂盒(天根公司)提取谷氨酸棒杆菌C.glutamicum ATCC13869基因组。以抽提的基因组为模板，B1/B2，B3/B4作为引物对，Phusion超保真聚合酶(New England BioLabs)的作用下PCR扩增获得包含acnR基因失活突变的2个片段。PCR参数为98℃10s，50℃20s，72℃20s，共30个循环。PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根公司)进行割胶回收。以上述所得2个片段等摩尔混合作为模板，以B1/B4引物对进行overlap PCR扩增，并割胶回收，产物用XbaI和HindIII双酶切，pK18mobsacB用同样的酶进行切割，利用T4 DNA连接酶(全式金公司)22℃下连接1-2h，转化Trans1T1感受态细胞(全式金公司)，挑取卡那抗性克隆，XbaI/HindIII酶切鉴定得到overlap PCR片段插入pK18mobsacB的阳性克隆，进一步通过测序(Invitrogen公司)鉴定插入的片段，所得到的质粒命名为pK18-ΔacnR。

测序结果如SEQ ID No.10所示。

(2)acnR失活突变菌株ATCC 13869ΔacnR的制备

菌株筛选：将质粒pK18-ΔacnR电转到ATCC 13869菌株后，菌体涂布在含卡那抗性的固体BHI培养基上，挑选抗性克隆。根据pK18mobsacB质粒MCS两端的序列设计验证引物T1/T2(序列见表1)，以B1/T2，T1/B4引物对进行菌落PCR鉴定KanR克隆，PCR参数为：94℃30s，50℃30s，72℃40s，共30个循环，两个引物对分别扩增出约1100bp和1500bp片段的克隆为阳性克隆。将挑选出的阳性克隆接种到无抗BHI培养基中培养12-14h，让菌体在培养的过程中发生同源重组。将菌液稀释100-1000倍后涂布在含有10％蔗糖的固体BHI培养基上培养36h，在蔗糖存在的情况下，未发生第二次同源重组的菌株因带有sacB基因而不能存活。将所筛选出的菌株进一步进行卡那抗性表型验证。根据失活位点设计出鉴定引物Y1/Y2(序列见表1)，挑选KanS的重组子利用Y1/Y2进行验证，参数同上。阳性重组子不能扩增出片段，而阴性重组子能，得到的菌株命名为MHZ-0114-1。

实施例2：MHZ-0114-1谷氨酸生产性能和酶活性检测

培养基配方如下：

斜面培养基：酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉2.5g/L，pH 7.0-7.2，121℃0.1MPa灭菌30min；

种子培养基：葡萄糖25g/L，尿素3g/L，K2HPO4·3H2O 2.2g/L，MgSO4·7H2O 0.9g/L，玉米浆33mL/L，豆饼水解液22mL/L，pH 7.0-7.2，121℃0.1MPa灭菌15min；

发酵培养基：葡萄糖60g/L，硫酸铵15g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，FeSO4·7H2O 1mg/L，MnSO4·H2O 1mg/L，VB1 200μg/L，生物素300μg/L，0.48g/L大豆水解液，用NaOH调节至pH 7.2-7.5，121℃0.1MPa灭菌15min，后添加1.0g热灭菌的碳酸钙。

将冻存于-80℃甘油管中的菌株接种于上述斜面培养基中进行活化，于31.5℃下培养24h后长出菌苔；从新鲜活化的斜面上挑取菌苔，接种于上述种子培养基中，于31.5℃，220rpm下振荡培养至对数生长中后期(12h左右)，制得种子液；以10％的接种量将种子液接种至装有20ml发酵培养基的500ml摇瓶中，在31.5℃，振荡培养。在糖被完全消耗之后，测定培养基中积累的L-谷氨酸的浓度。结果如表2所示(OD600是稀释100倍的培养液在600nm的浊度并表示细胞量，Glu(g/L)表示积累的L-谷氨酸的量)。

Acn酶活测定方法：将培养后的细菌在4℃下以10000rpm离心5min，收集菌体，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)洗一次，再重悬于1/10原菌液体积的PBS中，冰浴，超声破菌(350W，持续5s，间隔10s，共20次)后，10000rpm离心10min，去沉淀，得到粗酶。反应体系为：5-50μL粗酶液，950-995μL 90mM Tris-HCl(pH 8.0)含有20mM DL-异柠檬酸三钠，反应最终体积为1mL，反应在20℃下进行。利用分光光度计在240nm波长下检测生成的顺乌头酸的吸光值，根据标准曲线计算浓度。定义每分钟生成1μmol顺乌头酸所需的酶量为一个酶活力单位(U)。单位酶活＝酶活/蛋白浓度，以Protein Assay(Bio-Rad)测定粗酶液中的蛋白质浓度，使用牛血清蛋白为标准蛋白。

表2谷氨酸的生产能力和酶活性检测

结果表明，相比于ATCC 13869菌株，在其基础上acnR基因失活突变的菌株显著(P＜0.05)提高了谷氨酸的发酵产量，同时顺乌头酸酶表达量提高了4.9倍。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 廊坊梅花生物技术开发有限公司

<120> 生产L-氨基酸的重组菌株及其应用

<130> MP1932872

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1503

<212> DNA

<213> acnR

<400> 1

cgcagttatc accgagtcct tcgagcgtat tcaccgctcc aacctcatcg gtatgggcgt 60

tgtcccactg cagttccctg caggcgaatc ccacgagtcc ctgggccttg acggcaccga 120

gaccttcgac atcaccggac tgaccgcact caacgagggc gagattccta agactgtcaa 180

ggtcaccgca accaaggaga acggcgacgt cgtcgagttc gacgcagttg tccgcatcga 240

caccccaggt gaggctgact actaccgcca cggcggcatc ctgcagtacg tgctgcgtca 300

gatggctgct tcttctaagt aattagaaga cttttgatgt ggagtttcct ccacatcaaa 360

aaacgtaggt agcgaagggc cccatcaact aattggccat gaataacctt tcatggccaa 420

tgtggtgggg tcctttctaa tacgccaaat ttttcaaacc catcctcttc catgcgtgtt 480

ttcaccgcta ttttccatag gagtacattg tgtccgtagc ggcaggcgac aaaccaacaa 540

atagccgtca agaaatcctc gaaggtgccc gacggtgctt cgctgagcac ggctatgaag 600

gcgcaaccgt acgccgactg gaagaagcaa caggtaaatc acgcggagcg atctttcatc 660

acttcggtga caaagaaaac ctgttcctag ccctcgcgcg ggaagatgca gcccgcatgg 720

cggaggtggt gtctgaaaat ggcctcgttg aagtgatgcg aggaatgctg gaagatcctg 780

aacgatatga ctggatgtca gtacgcctgg agatctccaa gcagctgcgc accgacccgg 840

tattccgcgc aaaatggatt gatcaccaaa gtgttctaga cgaagctgtc cgcgtgcgtt 900

tgtcccgcaa cgtggataag ggacaaatgc gcactgacgt cccgatcgaa gtgctgcaca 960

ccttcttaga gactgttctc gacggtttca tctcccgtct tgccaccggc gcatccacag 1020

aaggactgtc cgaagtattg gatctggtcg agggaactgt ccgtaaacgc gactaaacga 1080

cccctgattc acactttcag actacaagaa ctagactaag cggtatggtt tcagttcttt 1140

tagttcagcc ccgtcaggga gaagcagtcg ccgcagctga gcgacgtgac tttttgcagg 1200

ccaccggcct taagcctcaa gaactgacct cccgaatgtt ggataccacc acttctcgaa 1260

ttggcagtct ggaaggtttc gacggcgtga ttgtgggcgg aagcccactg aatgccacca 1320

actttgagta cagcgattgg caacgccacg tccaccgcga attgtccctg ctgatcaatc 1380

acccactgcc aacaatcttt gtctgctacg gcaatacctt tttgaccttc ttctctggcg 1440

gacagattgg tcgcacacac cccgaagatt ccggcgccac cacagtgttg ctaactgacg 1500

ccg 1503

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gctctagacg cagttatcac cgagtcct 28

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

tctaagaagg tgtgctgacg gctatttgtt ggtttgt 37

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

aacaaatagc cgtcagcaca ccttcttaga gactgttc 38

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

cccaagcttc ggcgtcagtt agcaacac 28

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ctcgtatgtt gtgtggaatt gtg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

aggctgcgca actgttggga agg 23

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

cgctgagcac ggctatgaa 19

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

cgcatttgtc ccttatccac g 21

<210> 10

<211> 1098

<212> DNA

<213> pK18-∆acnR

<400> 10

cgcagttatc accgagtcct tcgagcgtat tcaccgctcc aacctcatcg gtatgggcgt 60

tgtcccactg cagttccctg caggcgaatc ccacgagtcc ctgggccttg acggcaccga 120

gaccttcgac atcaccggac tgaccgcact caacgagggc gagattccta agactgtcaa 180

ggtcaccgca accaaggaga acggcgacgt cgtcgagttc gacgcagttg tccgcatcga 240

caccccaggt gaggctgact actaccgcca cggcggcatc ctgcagtacg tgctgcgtca 300

gatggctgct tcttctaagt aattagaaga cttttgatgt ggagtttcct ccacatcaaa 360

aaacgtaggt agcgaagggc cccatcaact aattggccat gaataacctt tcatggccaa 420

tgtggtgggg tcctttctaa tacgccaaat ttttcaaacc catcctcttc catgcgtgtt 480

ttcaccgcta ttttccatag gagtacattg tgtccgtagc ggcaggcgac aaaccaacaa 540

atagccgtca gcacaccttc ttagagactg ttctcgacgg tttcatctcc cgtcttgcca 600

ccggcgcatc cacagaagga ctgtccgaag tattggatct ggtcgaggga actgtccgta 660

aacgcgacta aacgacccct gattcacact ttcagactac aagaactaga ctaagcggta 720

tggtttcagt tcttttagtt cagccccgtc agggagaagc agtcgccgca gctgagcgac 780

gtgacttttt gcaggccacc ggccttaagc ctcaagaact gacctcccga atgttggata 840

ccaccacttc tcgaattggc agtctggaag gtttcgacgg cgtgattgtg ggcggaagcc 900

cactgaatgc caccaacttt gagtacagcg attggcaacg ccacgtccac cgcgaattgt 960

ccctgctgat caatcaccca ctgccaacaa tctttgtctg ctacggcaat acctttttga 1020

ccttcttctc tggcggacag attggtcgca cacaccccga agattccggc gccaccacag 1080

tgttgctaac tgacgccg 1098

Claims (9)

1.失活谷氨酸棒杆菌ATCC 13869的acnR基因或抑制谷氨酸棒杆菌ATCC 13869的acnR基因的表达在生产L-谷氨酸中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述失活acnR基因包括敲除acnR基因或敲低acnR基因。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制acnR基因的表达包括不产生AcnR蛋白、由acnR基因编码的蛋白量降低或对蛋白结构进行修饰产生不正常的AcnR蛋白。

4.以谷氨酸棒杆菌ATCC 13869为出发菌株的菌株（Corynebacterium glutamicum），其特征在于，失活acnR基因或抑制acnR基因的表达。

5.如权利要求4所述的菌株，其特征在于，所述失活acnR基因包括敲除acnR基因或敲低acnR基因。

6.如权利要求5所述的菌株，其特征在于，所述抑制acnR基因的表达包括不产生AcnR蛋白、由acnR基因编码的蛋白量降低或对蛋白结构进行修饰产生不正常的AcnR蛋白。

7.如权利要求6所述的菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.16928。

8.如权利要求4至7任一项所述的菌株在生产L-谷氨酸中的应用。

9.生产L-谷氨酸的方法，其特征在于，以如权利要求4至7任一项所述的菌株为发酵菌株。