CN102947460A

CN102947460A - 通过发酵生产l-鸟氨酸的方法

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Publication number: CN102947460A
Application number: CN2011800174309A
Authority: CN
Inventors: W·克莱斯; R·格斯特迈尔
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2010-03-30
Filing date: 2011-03-24
Publication date: 2013-02-27
Anticipated expiration: 2031-03-24
Also published as: KR101782666B1; US8951759B2; US20140206068A1; CN102947460B; RU2012145953A; DE102010003419B4; PL2553113T3; WO2011124477A3; CA2794974C; EP2553113A2; BR112012024799B1; JP5855084B2; US8741608B2; SG183922A1; RU2571932C2; DE102010003419A1; BR112012024799A2; UA109898C2; US20110244529A1; WO2011124477A2

Abstract

本发明涉及使用微生物通过发酵生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于增加所述氨基酸的输出。

Description

通过发酵生产L-鸟氨酸的方法

背景技术

已知L-鸟氨酸有关于肝功能的刺激作用并经常用作药剂配料和在运动营养中使用。

目前通过多种方法制备L-鸟氨酸。一种方法是借助微生物的发酵制备。另一种方法是精氨酸的碱水解，例如用氢氧化钡(CN 1594282A)。另一种方法是通过固定具有精氨酸酶活性的微生物的精氨酸生物转化(KR589121B1)。从L-瓜氨酸制备L-鸟氨酸的方法在专利文献(JP 42007767B4)中也已有所描述。

特征在于分泌L-鸟氨酸至培养基中的微生物在该文献中已有所描述。所述微生物的实例是棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus，JP 43010996B4、JP 57041912B)、埃希氏菌属(Escherichia，US 3668072A)、普罗威登斯菌属(Providencia，JP 03195494)或节杆菌属(Arthrobacter，US 3574061)的细菌。

生产L-鸟氨酸的微生物特征常常在于对氨基酸L-精氨酸或L-瓜氨酸的营养缺陷(短杆菌、芽孢杆菌、棒状杆菌在EP 392708B1和KR 161147B1中有所描述，而埃希氏菌在US 366072A中有所描述)。另外，对2-噻唑-丙氨酸、磺胺脒或2-氟丙酮酸有抗性的微生物已有描述(日本开放出版号61119194)。EP 0393708B1描述了L-鸟氨酸生产者特征在于对ornithole和霉酚酸的更低的抗性。所述特性也可以是组合的形式。

通过从细胞被动扩散的方式的碱性氨基酸(例如L-赖氨酸、L-精氨酸和L-鸟氨酸)的释放是非常差的(Bellmann等人(Microbiology 2001;147:1765-74))。对赖氨酸已通过实例的方式有很好的描述。Vrlijc等人(Journalof Bacteriology 1995;177(14):4021-7)已研究多种输出缺乏的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)突变体。对于一个突变体，测量到174mML-赖氨酸的细胞内浓度，而在细胞外测量到只有0.7mM的数值。

Vrlijc等人(Molecular Microbiology 1996;22(5):815-26和Journal ofMolecular Microbiology and Biotechnology 1999;1:327-336)和EP 0868527B1鉴定并描述了作为L-赖氨酸输出蛋白(LysE)的新型(exporter)。一个确定的LysE无义突变体不再能运送L-赖氨酸至细胞外。该LysE基因所编码的多肽是长233个氨基酸或氨基酸残基并示于SEQ ID No.2。在赖氨酸生产者中过表达LysE基因，发现L-赖氨酸的分泌增加。

Von Bellmann等人(Microbiology 2001;147:1765-74)已就谷氨酸棒状杆菌中的多种碱性氨基酸的运送更详细地表征了LysE输出蛋白。作者说明所述转运子特异地输出氨基酸L-赖氨酸和L-精氨酸至细胞外。作者还调查了LysE是否也输出L-鸟氨酸至细胞外。为此目的，首先制备称作ATCC13032::argF的L-精氨酸营养缺陷的谷氨酸棒状杆菌菌株。

在包含40g/l葡萄糖的50ml称为CGXII的基本培养基中培养该菌株(分批培养)。在24小时的孵育期后测量到60mM L-鸟氨酸，对应7.9g/l。在细胞内，经过大约70分钟的孵育期在所述菌株的细胞中测量到大约200mM的L-鸟氨酸浓度。为了澄清是否LysE也输出L-鸟氨酸至细胞外，用复制质粒pEC7lysE转化所述菌株13032::argF。此措施旨在为所述菌株提供增加的LysE活性，从而使得该菌株可以以更高的输出速率转运L-鸟氨酸至培养基中。然而，所述措施没有增加L-鸟氨酸的输出速率。对对照菌株(13032::argF)和在所述转化子(带有pEC7lysE的13032::argF)中测定到同样的输出速率(每分钟0.6nmol(mg干重))。由此该作者下结论L-鸟氨酸不被LysE输出蛋白所转运。他们还得出在谷氨酸棒状杆菌中一定有另一个未知的对L-鸟氨酸的输出功能(输出蛋白)的结论(Bellmann等人，2001，1771页的图5b)和1772页的21-28行)。

在谷氨酸棒状杆菌R中鉴定到一变体LysE(见SEQ ID No.4)，其与如SEQ ID No.2所示的来自菌株ATCC 13032的LysE输出蛋白的氨基酸序列不同在于N末端延伸三个氨基酸残基。所述氨基酸残基的序列是：甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸(MVI)。来自菌株R的该LysE多肽在EP 1266966B1已描述为在环区域形成上不同于野生型蛋白(或者更具体地不能再形成所述环)，因此能够实现改进的L-赖氨酸和L-精氨酸的输出的变体。

另一LysE变体已由Gunji和Yasueda所描述(Journal of Biotechnology127,2006,1-13)。此作者对专性甲基营养型细菌甲基营养嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)的L-赖氨酸的形成有兴趣。他们用称为pSE的含有谷氨酸棒状杆菌ATCC13869LysE基因的质粒转化甲基营养嗜甲基菌以改进甲基营养嗜甲基菌的赖氨酸的形成。然而，此作者发现他们在甲基营养嗜甲基菌中能够以稳定方式建立的只有突变形式的LysE基因(lysE24)。由于插入一个胸腺嘧啶残基，在所述lysE24等位基因中LysE基因的开放读框已被移位，导致在432bp后该读框的终止。截短的读框编码在C端比谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的野生型LysE蛋白质短92个氨基酸残基的LysE蛋白质。它的长度是141个氨基酸残基。另外，该截短蛋白质的最后6个C端氨基酸(残基135-141)不同于所述野生型LysE氨基酸序列的氨基酸。测试了携带在质粒上(pSE24)的所述修饰的LysE等位基因的甲基营养嗜甲基菌菌株的赖氨酸形成。为此，以分批补料的形式培养50小时在0.3l称作SEIIc的基本培养基中测定该菌株。此作者发现转化子也形成了少量的(0.07mM，对应11.8mg/l)L-鸟氨酸，以及0.55mM L-赖氨酸和0.19mM L-精氨酸。如作者所解释，这一观察到的L-鸟氨酸的形成是由于该突变转运子的底物特异性的改变或者可能地该菌株的细胞内L-精氨酸库的改变。EP 1266966B1(发明人：Gunji和Yasueda)描述了LysE24转运子在分泌L-赖氨酸和L-精氨酸上的积极作用。

发明目的

本发明的目的是提供用于发酵制备L-鸟氨酸的新方法。

发明详述

本发明涉及制备L-鸟氨酸的方法，其特征在于进行以下步骤：

a)在培养基中发酵分泌L-鸟氨酸的细菌，所述细菌选自棒状杆菌、芽孢杆菌、链霉菌、节杆菌和肠杆菌，其过表达编码具有L-鸟氨酸输出蛋白活性的多肽的多核苷酸，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID No.2的氨基酸序列具有至少(≥)35%、≥40%、≥50%、≥55%、≥60%、≥65%、≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥90%、≥92%、≥94%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99%或100%，优选地≥70%，特别优选地≥90%，非常特别优选地≥96%和最优选地100%的相同性，

b)在所述培养基中积累所述L-鸟氨酸，其中获得发酵液，

c)其中排除以DSM23239保藏的质粒pEC71ysE的过表达，

d)其中所编码的多肽的长度，适当地是≥146至≤286个氨基酸或氨基酸残基。

优选选择选自≥171至≤286、≥196至≤261、≥203至≤258、≥218至≤243、≥228至≤236和≥228至≤233个氨基酸或氨基酸残基的范围内的长度。

特别优选在≥203至≤258、≥218至≤243、≥228至≤236和≥228至≤233的范围内的长度，非常特别的优选在≥228至≤236和≥228至≤233的范围内的长度。

在本文以下提及的L-鸟氨酸，该术语也包含其盐，例如L-鸟氨酸盐酸盐或L-鸟氨酸硫酸盐。

根据本发明的方法使用选自棒状杆菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、节杆菌属和肠杆菌属的细菌。

在棒状杆菌属中，优选基于以下物种的菌株：

Corynebacterium efficiens，例如模式菌株DSM44549，

谷氨酸棒状杆菌，例如模式菌株ATCC13032或R菌株，和

产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)，例如ATCC6871菌株，

非常特别优选谷氨酸棒状杆菌物种。

某些谷氨酸棒状杆菌物种的代表在现有技术中也以其它名称为人所知。这些包括例如：

菌株ATCC13870，被称为嗜醋酸棒状杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)，

菌株DSM20137，被称为百合棒状杆菌(Corynebacterium lilium)，

菌株ATCC17965，被称为栖糖蜜棒状杆菌(Corynebacteriummelassecola),

菌株ATCC14067，被称为黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)，

菌株ATCC13869，被称为乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)，和

菌株ATCC14020，被称为散枝短杆菌(Brevibacterium divaricatum)。

术语“产谷氨酸小球菌(Micrococcus glutamicus)”已同样用于谷氨酸棒状杆菌。某些Corynebacterium efficiens物种的代表在现有技术中也已称为热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)，例如菌株FERM BP-1539。

在芽孢杆菌属中，优选枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)物种。

在节杆菌属中，优选柠檬节杆菌(Arthrobacter citreus)物种。

在肠杆菌科中，优选埃希氏菌属、欧文菌属(Erwinia)、普罗威登斯菌属、泛菌属(Pantoea)和沙雷氏菌属(Serratia)。特别优选埃希氏菌属和沙雷氏菌属。非常特别优选埃希氏菌属的大肠杆菌物种(Escherichia coli)、沙雷氏菌属的粘质沙雷氏菌物种(Serratia marcescens)和普罗威登雷斯菌属的雷氏普罗威登斯菌物种(Providencia rettgeri)。

用于过表达L-鸟氨酸输出蛋白的方法的细菌或菌株(起始菌株)，优选具有分泌L-鸟氨酸至周围的营养培养基并在其中积累L-鸟氨酸的能力。该表述“生产”在本文如下也用于此意。更具体地，用于所述过表达方法的菌株具有在营养培养基中浓缩或积累≥0.1g/l、0.3g/l、≥1g/l、≥3g/l、≥10g/l L-鸟氨酸的能力。起始菌株优选通过诱变和选择、通过重组DNA技术或通过两种方法的组合制备的菌株。

显而易见且不需要进一步解释，适用于本发明的方法的细菌也可以通过首先在野生型菌株(例如在谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC 13032或在菌株ATCC 14067)中过表达编码具有L-鸟氨酸输出蛋白活性的多肽的多核苷酸，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID No.2具有至少(≥)35%相同性，适当地所编码的多肽的长度位于如上所述的长度范围内，接下来再通过在现有技术中所描述的进一步的遗传方法使所述细菌生产L-鸟氨酸。只用所提及的多核苷酸转化野生型(例如菌株ATCC13032、ATCC14067、ATCC13869或ATCC17965)不会导致根据本发明的方法。

分泌或产生L-鸟氨酸的谷氨酸棒状杆菌物种的菌株的实例是：

在US 5188947中所描述的乳发酵短杆菌FERMBP 2344和谷氨酸棒状杆菌FERMBP 2345。

分泌或产生L-鸟氨酸的柠檬节杆菌物种的菌株的实例是：

在US 5188947中所描述的柠檬节杆菌FERMBP 2342。

分泌或产生L-鸟氨酸的枯草芽孢杆菌物种的菌株的实例是：

在JP 57041912中所描述的枯草芽孢杆菌BOR32(FERMP 3647)。

分泌或产生L-鸟氨酸的雷氏普罗威登斯菌物种的菌株的实例是：

在JP 03195494所描述的雷氏普罗威登斯菌ARGA6(FERM P11147)。

分泌或产生L-鸟氨酸的大肠杆菌物种的菌株的实例是：

在US 3668072中所描述的大肠杆菌B1919(ATCC 21104)。

L-鸟氨酸生产细菌通常对氨基酸L-瓜氨酸或L-精氨酸是营养缺陷的。作为替代，也可以考虑对L-瓜氨酸或L-精氨酸是营养延缓(bradytrophic)的L-鸟氨酸生产细菌。术语营养缺陷和营养延缓的定义可以在例如WO01/09286的第9页上找到。在本领域营养延缓型也称为渗漏突变体。所用的营养延缓细菌具体是其中的基因产物ArgF(鸟氨酸氨基甲酰转移酶)、ArgG(精氨琥珀酸合酶)或ArgH(精氨琥珀酸裂解酶)的活性与野生型中的活性相比大于(>)零但等于或小于(≤)10%，优选>零并≤1%的细菌。

现有技术已公开称为LysE基因并编码具有L-赖氨酸输出蛋白活性的蛋白质或多肽的多核苷酸。所述多肽也称为缩写LysE。

输出蛋白是位于细胞的细胞膜上并从所述细胞的细胞质中向输出代谢物(例如L-赖氨酸或L-鸟氨酸)进入周围的培养基的蛋白。如果为此所需的能量以三磷酸腺苷(ATP)的形式提供，这被称为初级主动运输或初级输出。如果所述能量以离子梯度的形式，例如钠离子，提供，称之为次级主动运输或次级输出(Jeremy M.Berg,John L.Tymoczko and L.Stryer；Biochemie[生物化学]第五版，378-384页，Spektrum Akademischer Verlag[出版商],Heidelberg,Germany,2003)。测定L-鸟氨酸输出蛋白活性的操作说明可以在Bellmann等人(Microbiology 2001;147:1765-74)中找到。

在本发明的研究过程中，发现棒状杆菌属(优选谷氨酸棒状杆菌)和微球菌属(优选藤黄微球菌(Micrococcus luteus))的赖氨酸输出蛋白具有除L-赖氨酸输出蛋白活性外的L-鸟氨酸输出活性。

本发明的方法利用编码对L-鸟氨酸具有输出活性的多肽的基因，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID No.2的氨基酸序列具有至少(≥)35%、≥40%、≥50%、≥55%、≥60%、≥65%、≥70%、≥75%、≥80%、≥85%、≥90%、≥92%、≥94%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99%或100%，优选地≥70%，特别优选地≥90%，非常特别优选地≥96%，最优选地≥100%的相同性，所编码的多肽的长度适当地位于上述的长度范围内。

适合的L-鸟氨酸输出蛋白的实例是谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032(SEQID No.2)、谷氨酸棒状杆菌R(SEQ ID No.4)、谷氨酸棒状杆菌ATCC14067(EQ ID No.5)，谷氨酸棒状杆菌ATCC13869(EQ ID No.7)、Corynebacterium efficiens YS314(EQ ID No.9)、溶血棒状杆菌(Corynebacterium diphteriae)NCTC 13129(SEQ ID No.10)、纹带棒状杆菌(Corynebacterium striatum)ATCC6940(SEQ ID No.11)、Corynebacteriumaurimucosum ATCC700975(SEQ ID No.12)、马氏棒状杆菌(Corynebacterium matruchotii)ATCC33806(SEQ ID No.13)、Corynebacterium pseudogenitalium ATCC33035(SEQ ID No.14)、拥挤棒状杆菌(Corynebacterium accolens)ATCC49725(SEQ ID No.15)、Corynebacterium glucuronalyticum ATCC51867(SEQ ID No.16)、藤黄微球菌NCTC2665(SEQ ID No.17)、Corynebacterium tubuculostearicum SK141(SEQ ID No.18)和马氏棒状杆菌ATCC14266(SEQ ID No.19)的赖氨酸输出蛋白或LysE多肽。SEQ ID No.18和SEQ ID No.19在本领域中也称为ArgO多肽。

在本研究中，测定了谷氨酸棒状杆菌ATCC14067和谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的LysE基因的核苷酸序列(SEQ ID No.6和SEQ ID No.8)。谷氨酸棒状杆菌ATCC14067和谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的LysE多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.5和7中所示。它们与如SEQ ID No.2所示的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032LysE的氨基酸序列相同。

表1列出来自国家生物技术信息中心(NCBI,Bethesda,MD,US)的数据库采集的棒状杆菌属的各种代表菌和藤黄微球菌的LysE多肽的录入号。另外，表1对序列列表中所示的LysE多肽的氨基酸序列作出引用。最后，表1显示所编码的LysE多肽的长度(氨基酸的数目)。

表1:

细菌	SEQ ID No.	登录号	多肽长度
				谷氨酸棒状杆菌	2	YP_225551.1	233
C.efficiens	9	ZP_05749209.1	228
				溶血棒状杆菌	10	NP_939452.1	228
纹带棒状杆菌	11	ZP_03933958.1	222
				C.aurimucosum	12	YP_002834652.1	235

马氏棒状杆菌	13	ZP_03711883.1	244
				C.pseudogenitalium	14	ZP_03922319.1	230
拥挤棒状杆菌	15	ZP_03931790.1	241
				C.glucuronolyticum	16	ZP_03918361.1	261
藤黄微球菌	17	YP_002958101.1	204
				C.tubuculostearicum	18	ZP_05365683.1	230
马氏棒状杆菌	19	ZP_04835056.1	244

图1表示如表1中所列出的细菌的LysE多肽的氨基酸序列的多序列比对。通过程序Clone Manager 9 Professional Edition(Scientific &Educational Software 600 Pinner Weald Way Ste 202 Cary NC 27513USA)进行图1所示的氨基酸序列的比对。用于所述比对的参考分子是ATCC13032的LysE多肽(LysE)。对于打分矩阵，选择“Blosum 62”设置(见Jeremy M.Berg,John L.Tymoczko and L.Stryer；生物化学第五版，194-197页，Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg,Germany,2003)。

适当时也可以应用在现有技术中所描述的程序，例如ClustalX程序(Thompson,J.D.,Gibson,T.J.,Plewniak,F.,Jeanmougin,F.and Higgins,D.G.(1997).ClustalX window interface：flexible strategies for multiple sequencealignment aided by quality analysis tools.Nucleic Acids Research,25:4876-4882)。

谷氨酸棒状杆菌R的LysE多肽(见SEQ ID No.4)的4-236位氨基酸残基对应SEQ ID No.2所示的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032LysE氨基酸序列。所述谷氨酸棒状杆菌R多肽具有三个氨基酸残基(甲硫氨酸-缬氨酸-异亮氨酸)的N末端额外序列。当在谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中使用位于LysE基因更上游9个碱基对的起始密码子作为LysE基因(见SEQ ID No.1)起始密码子的替代物时，产生这些额外的残基。

相对于SEQ ID No.2所示的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032LysE氨基酸序列，C.efficiens YS314的LysE多肽的氨基酸序列具有71%相同性，溶血棒状杆菌NCTC 13129具有44%相同性，纹带棒状杆菌ATCC6940具有44%相同性，Corynebacterium aurimucosum ATCC700975具有42%相同性，马氏棒状杆菌ATCC33806具有43%相同性，Corynebacteriumpseudogenitalium ATCC33035具有43%相同性，拥挤棒状杆菌ATCC49725具有43%相同性，Corynebacterium glucuronalyticum ATCC 51867具有36%相同性，藤黄微球菌NCTC2665具有40%相同性。另外，C.tubuculostearicum SK141的ArgO多肽的氨基酸序列与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有43%相同性。另外，马氏棒状杆菌ATCC14266的ArgO多肽的氨基酸序列与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有44%相同性。借助使用Blosum 62设置的Clone Manager 9程序进行全序列比对产生相同性百分比(见图2)。

可以使用合适的引物借助聚合酶链式反应(PCR)从生物体分离所述LysE基因，即编码具有L-鸟氨酸输出蛋白活性的多肽的多核苷酸。操作说明尤其可以在由Newton和Graham所著的“PCR”实验室手册中(Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg,Germany,1994)和在WO2006/100211的14-17页上找到。

对根据本发明的方法，特别优选应用编码具有L-鸟氨酸输出蛋白活性的多肽的基因，所述多肽的氨基酸序列包括一或多个选自以下的特征

a)根据SEQ ID No.2或SEQ ID No.4的氨基酸序列，

b)根据SEQ ID No.2的氨基酸序列，包括一或多个，最多达25、20、15、10、5、4、3、2或1个氨基酸的缺失，

c)根据SEQ ID No.2的氨基酸序列，包括一或多个，最多达25、20、15、10、5、4、3、2或1个氨基酸的插入，

d)根据SEQ ID No.2的氨基酸序列，包括一或多个，最多达140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、25、20、15、10、5、4、3、2或1个氨基酸的替换(取代)，优选最多达5、4、3、2或1个氨基酸的替换(取代)，

e)根据SEQ ID No.2的氨基酸序列，包括一或多个，最多达25、20、15、10、5、4、3、2或1个在N末端和/或C末端的氨基酸的添加，优选地最多达5、4、3、2或1个在N末端和/或C末端的氨基酸的添加。

适当时，优选保守性氨基酸取代。在芳香氨基酸的情况下，保守性取代是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸彼此之间的取代。在疏水氨基酸的情况下，保守性取代是亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸彼此之间的取代。在极性氨基酸的情况下，保守性取代是谷氨酰胺和天冬酰胺彼此之间的取代。在碱性氨基酸的情况下，保守性取代是精氨酸、赖氨酸和组氨酸彼此之间的取代。在酸性氨基酸的情况下，保守性取代是天冬氨酸和谷氨酸彼此之间的取代。在含羟基氨基酸的情况下，保守性取代是丝氨酸和苏氨酸彼此之间的取代。

还可以使用在严格条件下与SEQ ID No.1(优选SEQ ID No.1的编码区)互补核苷酸序列杂交的并编码具有L-鸟氨酸输出蛋白活性的多肽的多核苷酸，其所编码蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID No.2的氨基酸序列具有≥70%相同性并且在适合时所编码多肽的长度位于上述的长度范围内。

有关核酸和多核苷酸杂交的说明书，可以分别由本领域技术人员尤其在Boehringer Mannheim GmbH的“The DIG System Users Guide for FilterHybridization”手册(Mannheim,Germany,1993)和在Liebl等人中(International Journal of Systematic Bacteriology 41:255-260(1991))找到。在严格条件下进行杂交，也就是说仅在所述探针(即包含与SEQ ID No.1，优选地SEQ ID No.1的编码区互补的核苷酸序列的多核苷酸)与靶序列(即用所述探针鉴定或处理的多核苷酸)具有至少70%相同性时形成杂交。已知所述杂交的严格性(包括清洗步骤)受不同的缓冲液组成、温度和盐浓度影响或决定。通常用比所述清洗步骤相对低的严格性进行杂交反应(HybaidHybridisation Guide,Hybaid Limited,Teddington,UK,1996)。

例如，在大约50℃-68℃的温度下的5xSSC缓冲液可以用于所述杂交反应。这里，探针也可以与和所用探针核苷酸序列的相同性小于70%的多核苷酸杂交。这种杂交较不稳定并通过在严格条件下的清洗去除。例如通过在所设置的大约50℃-68℃、大约52℃-68℃、大约54℃-68℃、大约56℃-68℃、大约58℃-68℃、大约60℃-68℃、大约62℃-68℃、大约64℃-68℃、大约66℃-68℃的温度下，降低盐浓度至2xSSC或1xSSC和适当地随后0.5xSSC可以实现(The DIG System User’s Guide for FilterHybridisation,Boehringer Mannheim,Mannheim,Germany,1995)。优选大约64℃-68℃或大约66℃-68℃的温度范围。任选地可以降低盐浓度至对应于0.2xSSC或0.1xSSC的浓度。SSC缓冲液任选地含有0.1%浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)。通过从50℃至68℃以大约1-2℃的步骤逐渐增加杂交温度，可以分离多核苷酸片段，其与所用探针的序列或互补序列具有至少70%、至少80%、至少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%、适当时100%相同性并编码具有L-鸟氨酸输出蛋白活性的多肽。有关杂交的说明还可以在市场上以“试剂盒”的形式获得(例如DIG Easy Hyb from Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany,Catalogue No.1603558)。

对于本发明的方法，编码具有L-鸟氨酸输出蛋白活性的蛋白质的核苷酸在产生L-鸟氨酸的细菌或起始菌株或亲本菌株中过表达，所述编码的蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID No.2的氨基酸序列具有≥35%相同性，并且所述编码多肽的长度适当时位于上述范围内。

过表达通常是指与起始菌株(亲本菌株)或野生型菌株(如果后者是起始菌株)相比，核糖核酸、蛋白质(多肽)或酶的细胞内浓度或活性的增加。起始菌株(亲本菌株)是指已经进行导致过表达的措施的菌株。

术语蛋白质和多肽被认为是可以互换的。

对于过表达，优选重组过表达的方法。这些包括使用体外提供的DNA分子制备微生物的任何方法。这种DNA分子的实例包括启动子、表达盒、基因、等位基因、编码区等。通过转化、接合、转导或类似方法转移它们进入所需的微生物中。

过表达的措施增加相应的多肽的活性或浓度，通常以所述措施导致过表达前的菌株中的所述多肽的活性或浓度水平为基础增加至少10%、25%、50%、75%、100%、150%、200%、300%、400%或500%，优选高达1000%、2000%、4000%、10000%或20000%。

当使用谷氨酸棒状杆菌物种的菌株时，在菌株ATCC13032或ATCC14067或ATCC13869或ATCC17965中的L-鸟氨酸输出蛋白的活性适当地是测定过表达的适合的参考点。当使用基于或源于ATCC13032的菌株时，所述菌株ATCC13032是适合的参考点。这样的实例是在导致本发明的工作过程中制备的菌株，ATCC13032_Delta_argFRGH/pVWEx1_lysE，其基于菌株ATCC13032。当使用基于或源于ATCC14067的菌株时，所述菌株ATCC14067是适合的参考点。当使用基于或源于ATCC13869的菌株时，所述菌株ATCC13869是适合的参考点。照此产生另外的适合的参考点。

当使用大肠杆菌物种的菌株(优选大肠杆菌菌株K12)时，在菌株MG1655中的L-鸟氨酸输出活性适当地是测定过表达的适合的参考点。

通过在现有技术中可获得的多种方法来实现过表达。

这些包括增加拷贝数和修饰指导或控制所述基因表达的核苷酸序列。基因的转录尤其通过启动子以及任选的抑制(阻抑蛋白)或促进(激活蛋白)转录的蛋白质进行控制。所形成的RNA的翻译尤其通过核糖体结合位点和起始密码子控制。包括启动子和核糖体结合位点和任选存在的起始密码子的多核苷酸或DNA分子也称为表达盒。

所述方法还包括使用多种具有增加的催化活性的多肽或酶的变体。

可以通过在细菌细胞质中复制的质粒的方式增加拷贝数。为此，用于非常不同群体的微生物的质粒在现有技术中有所描述，所述质粒可以用于设置基因拷贝数所期望的增加。适合于埃希氏菌属的质粒在例如分子生物学，Labfax手册中(Ed.：T.A.Brown,Bios Scientific,Oxford,UK,1991)有所描述。适合于棒状杆菌属的质粒在例如Tauch等人(Journal ofBiotechnology 104(1-3),27-40,(2003))或在Stansen等人的文献中(Appliedand Environmental Microbiology 71,5920-5928(2005))有所描述。

从导致本发明的措施中排除使用质粒pEC7lysE(以DSM 23239保藏)来增加在谷氨酸棒状杆菌菌株中的拷贝数。所述pEC7lysE质粒的核苷酸序列被测定并示于SEQ ID No.29。

通过导入更多的拷贝进入细菌染色体可以进一步使拷贝数增加至少一个(1)拷贝。适合于棒状杆菌属，优选谷氨酸棒状杆菌的方法在例如专利WO 03/014330、WO 03/040373和WO 04/069996中有所描述。WO03/014330描述在天然基因座上串联倍增基因的方法。WO 03/040373描述在另外的基因座并入基因的第二或第三个拷贝的方法，而特定的基因座对生长或特定的氨基酸的产生是非必要的，在本发明的情况下所述氨基酸是L-鸟氨酸。在根据本发明的方法中，适合于并入LysE基因的第二或另外的拷贝的基因座的实例是基因odh、sucA、dapA、dapB、ddh、lysA、argR、argF、argG和argH。WO 04/069996(见表12和13)描述谷氨酸棒状杆菌的基因间区域和编码噬菌体或噬菌体组分的基因，其适合于并入另外的LysE基因拷贝。

适用于大肠杆菌属的方法的实例是并入基因拷贝到噬菌体的att位点(Yu and Court,Gene 223,77-81(1998))、借助噬菌体Mu的染色体扩增(如EP 0332448中所描述的)或Hamilton等人(Journal of Bacteriology 174,4617-4622(1989))或Link等人(Journal of Bacteriology 179,6228-6237(1997))所描述的借助条件性复制质粒的基因置换的方法。

通过使用功能性连接到所要表达的基因的强启动子可以进一步增加基因的表达。优选使用比天然启动子(即存在于野生型或亲本菌株中的启动子)更强的启动子。为此，现有技术具有大量的可用方法。

对棒状杆菌属适合的启动子和表达系统尤其可以在专利EP 0629699A2、US 2007/0259408A1(gap启动子)、WO 2006/069711、EP 1881076A1、WO 2008/088158、WO 2009/025470(butA启动子、pyk启动子)、US6861246(dapA启动子的MC20和MA16变体)和EP 1918378A1(sod启动子)中和例如“Handbook of Corynebacterium glutamicum”(Eds.:LotharEggeling and Michael Bott,CRC Press,Boca Raton,US(2005))或“Corynebacteria,Genomics and Molecular Biology”(Ed.:AndreasBurkovski,Caister Academic Press,Norfolk,UK(2008))的综述中找到。允许控制(即可诱导的或可阻遏的)表达的启动子的实例在例如Tsuchiya和Morinaga中(Bio/Technology 6,428-430(1988))有所描述。

适合于大肠杆菌属的启动子已长期为人所知。它们尤其包括经典的启动子lac启动子、trp启动子、tac和trc的杂合启动子、噬菌体的PL和PR启动子。类似地，也可以使用T7噬菌体的启动子、变速箱(gear-box)启动子、nar启动子或基因rrsG、rnpB、csrA、csrB、ompA、fusA、pepQ、rplX或rpsG的启动子。通过例如λ噬菌体的cI857PR或cI857PL系统可以容许控制表达(

等人，BioTechniques 24,362-366(1998))。可以在Makrides(Microbiological Reviews 60(3),512-538(1996))或手册“Escherichia coli and Salmonella,Cellular and Molecular Biology”中(F.C.Neidhardt(Editor in Chief),ASM Press,Washington,US(1996))找到综述。

这样的启动子或表达盒一般在所述基因的编码区起始密码子的首位核苷酸的核苷酸上游的1-1000，优选1-500的距离使用。在距离1是指所述启动子或表达盒紧接地位于所述编码区的起始密码子的第一个碱基的前面。

为了提高谷氨酸棒状杆菌中LysE基因的表达，优选在SEQ ID No.1的930-990位插入适合的启动子，例如谷氨酸棒状杆菌sod启动子(见EP1918378A1的SEQ ID No.1)或谷氨酸棒状杆菌gap启动子(见US2007/0259408的SEQ ID No.3)。

当使用含有启动子和核糖体结合位点(RBS)的表达盒，例如谷氨酸棒状杆菌sod基因的表达单元(见EP 1918378A1的SEQ ID No.2)或谷氨酸棒状杆菌gap基因的表达单元(在US 2007/0259408中有所描述并如SEQID No.28所示(并在其中被称为PgapRBS)时，在谷氨酸棒状杆菌的情况下将其优选地插入SEQ ID No.1的930-1001位，特别优选地插入1000-1001位。在这样表达盒中的适合的核糖体结合位点的实例是Amador鉴定的5'agaaaggagg3'的核苷酸序列(Microbiology 145,915-924(1999))。

同样可以在所需的基因的上游放置多个启动子或功能性地将它们连接到所要表达的基因并以这种方式实现表达的增加。这在例如WO2006/069711中有所描述。

谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌的启动子的结构是众所周知的。因此通过核苷酸的一或多个替代和/或一或多个插入和/或一或多个缺失的方法来修饰其序列可以增加启动子的效力。这个的例子可以在“Herder Lexikon derBiologie”[Herder生物百科全书](Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg,Germany(1994))中找到。

因此，过表达LysE基因的适合的措施是修饰或突变所述LysE基因的启动子。

谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌的核糖体结合位点的结构同样也是众所周知的，例如在Amador(Microbiology 145,915-924(1999))和遗传学的手册和课本(例如“Gene und Klone”[基因与克隆](Winnacker,Verlag Chemie,Weinheim,Germany(1990))或“Molecular Genetics of Bacteria”(Dale andPark,Wiley and Sons Ltd.,Chichester,UK(2004))中有所描述。表达良好的基因，即在生物体中最重要的结构性基因，具有好的核糖体结合位点(Amador,Microbiology 145,915-924(1999))，即后者非常类似于或对应于共有序列。在文献中已被证明高表达的基因具有强的核糖体结合位点(Karlin and Mrázek,Journal of Bacteriology 2000;182(18):5238-50)。因此，通过调整核糖体结合位点可以达到基因或其mRNA的翻译效率。

通过调整所要表达的基因的密码子使用也可以增加翻译效率(例如Najafabiad等人，Nucleic Acids Research 2009,37(21):7014-7023)。

通过增加激活蛋白的表达或通过减少或关闭阻抑蛋白的表达同样可以实现过表达。

表达LysE的激活蛋白LysG已由Bellmann等人(Microbiology 2001;147:1765-74)所描述，并在其中被称作“正调节物”。谷氨酸棒状杆菌ATCC13032LysG的氨基酸序列如SEQ ID No.30中所示。在全序列比对中，与SEQ ID No.30的氨基酸序列相比，溶血棒状杆菌NCTC13129的LysG多肽的氨基酸序列具有62%相同性，Corynebacterium efficiens YS314的LysG多肽的氨基酸序列具有81%相同性，而谷氨酸棒状杆菌R的LysG多肽的氨基酸序列具有94%相同性。

对于激活蛋白，优选与SEQ ID No.30中所示的氨基酸序列具有≥(至少)55%、优选≥80%、特别优选≥90%、≥92%或≥94%、非常特别优选≥99%、最优选100%相同性的多肽。

所提到的过表达措施可以以适合的方式组合，优选选自增加拷贝数、使用强启动子、突变启动子、使用适合的表达盒和过表达激活蛋白的措施。因此，例如可以组合使用适合的启动子和增加拷贝数，或者使用过表达激活蛋白和使用适合的启动子或适合的表达盒。

除了涉及编码具有L-鸟氨酸输出蛋白活性的蛋白质的多核苷酸的措施，同样可以弱化单个生物合成基因。

因此，为了提高L-鸟氨酸的产生，适当地额外弱化一或多个基因是方便的，所述基因选自

a)编码α-酮戊二酸脱氢酶(EC 1.2.4.2)E1亚基的odhA基因，

b)编码二氢硫辛酰胺琥珀酰转移酶(EC 2.3.1.61)的sucA基因，

c)编码二氢吡啶二羧酸合酶(DapA，EC 4.2.1.52)的dapA基因，

d)编码二氢吡啶二羧酸合酶(DapB，EC 1.3.1.26)的dapB基因，

e)编码内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(Ddh，EC 1.4.1.16)的ddh基因，

f)编码二氨基庚二酸脱羧酶(LysA,EC 4.1.1.20)的lysA基因,

g)编码L-精氨酸生物合成的阻抑蛋白(ArgR)的argR基因，

h)编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF，EC 2.1.3.3)的argF基因，

i)编码精氨琥珀酸合酶(ArgG，EC 6.3.4.5)的argG基因，

j)编码精氨琥珀酸裂解酶(ASAL)(ArgH，EC 4.3.2.1)的argH基因，

k)编码天冬氨酸激酶(LysC，EC 2.7.2.4)的lysC基因，和

l)编码天冬氨酸半醛脱氢酶(Asd，EC 1.2.1.11)的asd基因。

优选弱化选自lysA、odhA、argR、argF、argG和argH的一或多个基因。特别优选弱化选自lysA、odhA和argF的一或多个基因。非常特别优选弱化lysA和/或argF基因。

在本上下文中的术语“弱化”描述通过使用例如弱的启动子或编码具有低活性的相应酶的基因或等位基因，或者通过失活相应基因或酶(蛋白质)以及任选地组合这些措施来减少或关闭细菌中的由相应的DNA所编码的一或多种酶(蛋白质)的细胞内活性。

谷氨酸棒状杆菌中的不同强度的已知的启动子的综述可以在Pátek等人(Journal of Biotechnology 104,311-323(2003))中找到。其他弱启动子在期刊Research Disclosure 2006年12月的通讯512057中(1616-1618页)有所描述。

可以考虑用来产生弱化的突变是在所考虑的基因的编码区中转换、颠换、插入和缺失至少一(1)个碱基对或核苷酸。根据由突变引起的氨基酸取代在蛋白质或酶的活性上的作用，突变被称为错义突变或无义突变。

错义突变导致在蛋白质中的一个给定氨基酸由另一个氨基酸替换，所述替换尤其是非保守性氨基酸取代。这损害所述蛋白质的功能性或活性并将其降低至≥0至75%、≥0至50%、≥0至25%、≥0至10%或≥0至5%的数值。

无义突变在所述基因的编码区中导致终止密码子从而导致翻译的提前终止并因此关闭。在基因中插入或缺失至少一个碱基对导致移码突变，其导致并入错误的氨基酸或翻译被提前终止。如果所述突变导致在编码区中的终止密码子，这同样导致翻译的提前终止。优选在编码多肽N末端的编码区的5'端部分进行产生无义突变的措施。如果多肽的全长(以化学连接的L-氨基酸的数量的方式测量)被称为100%，那么在本发明的范围内，多肽的N末端包括从起始氨基酸L-甲酰基-甲硫氨酸向前计算，包含80%下游的L-氨基酸的氨基酸序列的部分。

体内突变方法例如在Manual of Methods for General Bacteriology中(Gerhard等人(Eds.),American Society for Microbiology,Washington,DC,USA,1981)或在Tosaka等人中(Agricultural and Biological Chemistry 42(4),745-752(1978))或在Konicek等人中(Folia Microbiologica 33,337-343(1988))有所描述。

体外诱变的适合的方法尤其是根据Miller的使用羟胺的处理(Miller,J.H.:A Short Course in Bacterial Genetics.A Laboratory Manual and Handbookfor Escherichia coli and OxyRated Bacteria,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,1992)、使用致突变的寡核苷酸(T.A.Brown:Gentechnologie für Einsteiger[Genetic Engineering for Beginners],SpektrumAkademischer Verlag,Heidelberg,1993 and R.M.Horton:PCR-MediatedRecombination and Mutagenesis,Molecular Biotechnology 3,93-99(1995))和使用高错误率的DNA聚合酶的聚合酶链式反应。这种DNA聚合酶的实例是Stratagene公司(LaJolla,CA,USA)的Mutazyme DNA聚合酶(GeneMorphPCR Mutagenesis Kit,No.600550)。

产生体内或体外突变的另外的操作说明和综述可以在现有技术中，和遗传学和分子生物学的已知的教科书，例如Knippers的教科书(分子遗传学第六版“Molekulare Genetik”,6^th edition,Georg Thieme Verlag,Stuttgart,Germany,1995)、Winnacker的教科书(基因与克隆“Gene and Klone”,VCH Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany,1990)或Hagemann的教科书中(“Allgemeine Genetik”[General Genetics],Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1986)找到。

借助基因或等位基因替换的已知方法(其基础在Schwarzer和Pühler(Bio/Technology 9,84-87(1991))中有所描述，可以转移在体外制备的突变或含有所需突变的核苷酸进入染色体。Von

等人(Gene 145,69-73(1994))采用该方法将缺失并入到谷氨酸棒状杆菌的homthrB操纵子。VonNakagawa等人(EP 1108790)和Ohnishi等人(Applied Microbiology andBiotechnology 58(2),217-223(2002))采用该方法将多种突变(从分离的等位基因开始)并入到谷氨酸棒状杆菌的染色体。

基因表达的靶向性减少的方法之一包括将要弱化的基因置于可以通过添加定量的IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)诱导的启动子的控制下，例如trc启动子或tac启动子。适用于此目的的载体例如大肠杆菌表达载体pXK99E(WO 0226787；按照布达佩斯条约于2001年7月31日以DH5α/pXK99E在德国微生物和细胞培养物保藏中心保藏为DSM14440(DSMZ,Brunswick,Germany))、pEKEx2(NCBI登录号AY585307)或pVWEx2(Wendisch，博士论文，Berichte des Forschungszentrums Jülich,Jül-3397,ISSN 0994-2952,Jülich,Germany(1997))，其使得克隆的基因可以在谷氨酸棒状杆菌中以IPTG依赖的方式表达。

这种方法已在例如专利WO 02266787中被应用，通过整合pXK99EdeaD载体至谷氨酸棒状杆菌的基因组中来调节deaD基因的表达，以及Simic等人(Applied and Environmental Microbiology 68:3321-3327(2002))通过整合pK18mobglyA’载体至谷氨酸棒状杆菌中来调节glyA基因的表达。

特异性地减少基因表达的另一种方法是反义技术，其中涉及运送短的寡脱氧核苷酸或用于合成更长的反义RNA的载体进入靶细胞。其中，反义RNA可以结合至特定mRNA的互补部分并降低其稳定性或阻断其翻译能力。技术人员可以在Srivastava等人(Applied Environmental Microbiology2000 Oct.;66(10):4366-4371)中找到这样的实例。

延伸的速率受密码子使用的影响。可以通过使用亲本菌株中罕见的tRNA密码子来弱化基因的表达。这在WO 2008049781和WO 2009133063中有所详细描述。例如，用不太常见的密码子GTG或TTG替代ATG起始密码子可以弱化翻译，因为AUG密码子比GUG和UUG密码子有效两至三倍，例如(Khudyakov等人，FEBS Letters 232(2):369-71(1988)；Reddy等人，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA82(17):5656-60(1985))。

除了涉及编码具有L-鸟氨酸输出蛋白活性的蛋白质的多核苷酸的措施，同样可以提高单独的生物合成基因。

所以为了提高L-鸟氨酸的产生，在适当时额外地增强一或多种蛋白质的酶活性是方便的，所述蛋白质选自

a)由gdh基因编码的谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.3)，

b)由argJ基因编码的谷氨酸N-乙酰转移酶(EC 2.3.1.35和EC2.3.1.1)，

c)由argB基因编码的乙酰谷氨酸激酶(EC 2.7.2.8)，

d)由argC基因编码的N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸还原酶(EC 1.2.1.38)，

e)由argD基因编码的乙酰鸟氨酸氨基转移酶(EC 2.6.1.11)，

f)由ptsG基因编码的葡萄糖摄取系统的葡萄糖特异性组分EIIB(PtsG)(EC 2.7.1.69)，

g)由ptsS基因编码的蔗糖摄取系统的蔗糖特异性组分EIIB(PtsS)(EC 2.7.1.69)，

h)由zwf基因编码的葡萄糖-6磷酸1-脱氢酶(EC 1.1.1.49)，

i)由pgi基因编码的葡萄糖-6磷酸异构酶(EC 5.3.1.9)，

j)由pfkA基因编码的磷酸果糖激酶(EC 2.7.1.11)，

k)由fda基因编码的果糖二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.13)，

l)由gap基因编码的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(EC 1.2.1.59)，

m)由pgk基因编码的磷酸甘油酸激酶(EC 2.7.2.3)，

n)由pyk基因编码的丙酮酸激酶(EC 2.7.1.40)，

o)由aceE基因编码的丙酮酸脱氢酶(EC 1.2.4.1)的E1亚基，

p)由ppc基因编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(EC 4.1.1.31)，

q)由pyc基因编码的丙酮酸羧化酶(EC 6.4.1.1)，

r)由acn基因编码的顺乌头酸酶(EC 4.2.1.3)，和

s)由icd基因编码的异柠檬酸脱氢酶(EC 1.1.1.42)。

术语增强包括过表达措施和使用具有与野生型蛋白质相比增加的催化活性的变体。

特别优选增强选自谷氨酸脱氢酶、谷氨酸N-乙酰转移酶和乙酰谷氨酸激酶的一或多种酶。

所列出的额外的弱化措施可以与额外的增强措施组合。

对操作DNA、消化和连接DNA、转化和选择转化子的操作说明尤其可以在由Sambrook等人的已知的手册“Molecular Cloning:A LaboratoryManual，Second Edition”(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中找到。

表达或过表达的程度可以通过测量从基因转录的mRNA的量或浓度来确定，通过测定多肽的量或浓度和通过测定酶活性的水平来确定。

mRNA的量尤其可以通过使用“Northern印迹”和定量RT-PCR的方法确定。在定量RT-PCR中，在聚合酶链式反应之前逆转录。来自RocheDiagnostics的LightCycler^TM系统(Boehringer Mannheim GmbH,RocheMolecular Biochemicals,Mannheim,Germany)可以用于此目的，例如在Jungwirth等人中(FEMS Microbiology Letters 281,190-197(2008))所描述的。通过1维和2维蛋白凝胶分级和随后的使用合适的评估软件的对凝胶中蛋白质浓度的光学鉴定可以测定所述蛋白质的浓度。为棒状细菌制备蛋白质凝胶和鉴定蛋白质的常用方法是由Hermman等人描述的步骤(Electrophoresis,22:1712-23(2001))。通过使用对被检测的蛋白质特异性的抗体的蛋白印迹(Sambrook等人，“Molecular Cloning:A LaboratoryManual，Second Edition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,1989)和随后的使用合适的浓度测定软件的光学评估(Lohaus and Meyer(1998)Biospektrum 5:32-39；Lottspeich,AngewandteChemie 321:2630-2647(1999))同样可以测定蛋白质的浓度。

为了产生L-鸟氨酸，所产生的细菌可以持续地培养(例如在WO05/021772中所描述的)或以分批(分批培养)或以分批补料的方法或以重复分批补料方法(例如在US 6562601中所描述的)间断地培养。关于已知培养方法的一般性质的概要在Chmiel的教科书中(Bioprozesstecknik[生物过程技术]1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik[生物过程工程简介](GustavFischer Verlag,Stuttgart,1991))或在Storhas的教科书中(Bioreaktoren undperiphere Einrichtungen[生物反应器及周边设备](Vieweg Verlag,Brunswick/Wiesbaden,Germany 1994))可以获得。

使用的培养基或发酵培养基必须以适合的方式满足特定菌株的需求。美国细菌学学会的“Manual of Methods for General Bacteriology”(Washington D.C.,USA,1981)含有对多种微生物的培养基的描述。术语生长培养基、培养培养基和发酵培养基或培养基是可以互换的。

作为碳源，可以使用糖和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖浆、来自甜菜或甘蔗加工的含有蔗糖的溶液、淀粉、淀粉水解物和纤维素；可以使用油和脂肪，例如大豆油、葵花籽油、花生油和椰子脂肪；可以使用脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸、亚油酸；可以使用醇，例如甘油、甲醇与乙醇；可以使用有机酸，例如醋酸或乳酸。

对糖类，优选葡萄糖、果糖、蔗糖、葡萄糖和果糖的混合物和葡萄糖、果糖和蔗糖的混合物。适当时，特别优选蔗糖。

使用醇时，优选甘油。

作为氮源，可以使用有机的含氮的化合物，例如蛋白胨、酵母提取物、肉类提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素；或使用无机的化合物，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。可以单独或以混合物的方式使用所述氮源。

作为磷源，可以使用磷酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或相应的含有钠的盐。

所述培养基还必须包含生长所必需的盐，例如以金属(例如钠、钾、镁、钙和铁)的氯化物或硫酸盐的形式，例如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质，可以使用基本的生长因子，例如氨基酸(例如高丝氨酸)和维生素(例如硫胺素、生物素或泛酸)。

所提及的起始材料可以单批次添加至所述培养物，或在培养过程中以适合的方式补料。

培养物的pH可以通过以适当的方式使用碱性化合物(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水)或酸性化合物(例如磷酸或硫酸)来控制。通常调整pH至6.0-8.5，优选6.5-8。为了控制起泡，可以使用止泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了保持质粒的稳定性，可以向培养基添加适合的选择性物质，例如抗生素。优选在有氧条件下进行发酵。为了保持这些条件，向培养物中导入氧气或含氧气体混合物，例如空气。同样可以使用富含过氧化氢的液体。适当时，在升高的压力进行发酵，例如在0.03-0.2MPa的升高的压力下。培养温度通常在20℃-45℃和优选地25℃-40℃，特别优选地30℃-37℃。在分批方法中，优选连续培养直至形成足够回收的所需的L-鸟氨酸的量。通常在10小时-160小时内达到此目标。在连续方法中，可能有更长的培养时间。所述细菌的活性导致发酵培养基中L-鸟氨酸的浓度或浓度的增加(积累)。

适合的发酵培养基的实例尤其可以在专利JP 43010996B4(针对枯草杆菌)、US 3668072A(针对大肠杆菌)和JP 57041912B中(针对黄色短杆菌)找到。

适当时，在根据本发明的方法中的发酵培养基的体积为≥0.5l、≥1l、≥5l、≥10l、≥50l、≥100l、≥500l、≥1000l、优选地≥1l，特别优选地≥10l，非常特别优选地≥100l和最优选地≥1000l。

为了测定在发酵过程中的一或多个时间点的浓度，可以通过用离子交换层析的方式分离L-氨基酸来分析L-鸟氨酸，优选阳离子交换层析与随后的使用茚三酮的柱后衍生化，如在Spackman等人中(Analytical Chemistry30:1190-1206(1958))所描述的。也可以应用邻苯二甲醛而非茚三酮用于柱后衍生化。离子交换层析的综述文章可以在Pickering中(LC.GC(Magazineof Chromatographic Science)7(6),484-487(1989))找到。

同样可以使用例如邻苯二甲醛或苯基异硫氰酸酯进行柱前衍生化，并通过反相层析(RP)优选地以高效液相色谱(HPLC)来分馏所得的氨基酸衍生物。该类型的方法在例如Lindroth等人中(Analytical Chemistry 51:1167-1174(1979))有所描述。进行光度学检测(吸光度、荧光)。

有关氨基酸分析的综述可以尤其在Lottspeich和Zorbas的“Bioanalytik”教科书中(Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg,Germany 1998)发现。

相对于使用含有具有L-鸟氨酸输出蛋白活性的非过表达的蛋白质或没有使用过表达措施的细菌的方法或发酵方法，对于一或多种选自L-鸟氨酸浓度(每容积形成的L-鸟氨酸)、L-鸟氨酸产量(每消耗碳源形成的L-鸟氨酸)、L-鸟氨酸形成(每容积和时间形成的L-鸟氨酸)和比L-鸟氨酸形成(每干细胞物质或干生物质(biomass)和时间形成的L-鸟氨酸，每细胞蛋白质和时间形成的L-鸟氨酸)的参数或者其他方法参数及其组合，根据本发明的方法或发酵方法的性能增加了至少0.5%、至少1%、至少1.5%或至少2%。

所述发酵措施产生包含所期望的L-鸟氨酸的发酵液。

然后以液体或固体的形式提供或生产或回收含有L-鸟氨酸的产物。

发酵液是指其中已在一定温度下培养微生物一定时间的发酵培养基或生长培养基。所述发酵培养基或在发酵过程中所采用的培养基包含所有确保产生所述L-鸟氨酸以及通常确保增殖和活力的物质或组分。

当发酵完成，获得的发酵液因而包含

a)因细菌细胞增殖所生产的细菌生物质(细胞团)，

b)在所述发酵过程中形成的L-鸟氨酸，

c)在所述发酵过程中形成的有机副产物，和

d)在所述发酵中未消耗的所用的发酵培养基或起始原料的成分，例如维生素，如生物素；或盐，如硫酸镁。

有机副产物包括所述发酵物中所用的细菌生产的除了L-鸟氨酸的以及任选地分泌的物质。这些还包括糖，例如海藻糖。

从培养容器或发酵罐中去除发酵液，任选地收集并用于以液体或固体的形式提供含有L-鸟氨酸的产物。表述“回收含有L-鸟氨酸的产物”也有此意。在最简单的情况中，从发酵罐中去除的含有L-鸟氨酸的发酵液本身构成了回收的产物。

选自以下的一或多种措施实现L-鸟氨酸的浓缩或纯化，所述措施为从发酵液中

a)部分(>0%至<80%)至完全(100%)或实质上完全(≥80%、≥90%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%或≥99%至<100%)去除水，

b)部分(>0%至<80%)至完全(100%)或实质上完全(≥80%、≥90%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%或≥99%至<100%)去除生物质，所述生物质在去除前任选地灭活，

c)部分(>0%至<80%)至完全(100%)或实质上完全(≥80%、≥90%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99%、≥99.3%或≥99.7%至<100%)去除在发酵过程中形成的有机副产物，和

d)部分(>0%至<80%)至完全(100%)或实质上完全(≥80%、≥90%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99%、≥99.3%或≥99.7%至<100%)去除所用的发酵培养基或起始材料中的成分，所述成分在发酵中未消耗。以这种方式分离具有所期望的L-鸟氨酸含量的产物。

部分(>0%至<80%)至完全(100%)或实质上完全(≥80%至<100%)去除水(措施a))也称作干燥。

在所述方法的变体中，完全或实质上完全去除水、生物质、有机副产物和所用的发酵培养基的未消耗组分获得纯的(≥80重量%重量或≥90重量%重量)或高纯度的(≥95重量%重量、≥97重量%重量或≥99重量%重量)L-鸟氨酸产物形式。大量的对a)、b)、c)或d)的措施的技术说明在现有技术中可获得。

在氨基酸L-鸟氨酸或其盐的情况下，现有技术中已描述了基本上三种不同的产物。

一组描述了L-鸟氨酸HCL，其中通过离子交换的方式去除细胞后从发酵液纯化L-鸟氨酸，然后通过作为L-鸟氨酸单氯化物结晶和作为L-鸟氨酸单氯化物重结晶来进行结晶(US 2988489)。在这种情况下获得的L-鸟氨酸HCL具有的纯度超过>90%，优选地大于95%，特别优选地大于98%，非常特别优选地大于99%。

另外的方法在专利申请EP 1995322中有所描述。这涉及将含有生物质(biomass)的发酵液施加至颗粒直径>300μm的弱酸性离子交换器的顶部并由该步骤纯化所述L-鸟氨酸。选择合适的颗粒直径防止所述生物质堵塞树脂。细胞去除的效率为99%。

纯化的L-鸟氨酸可以用于制备多种L-鸟氨酸盐，例如单L-鸟氨酸α-酮戊二酸或二L-鸟氨酸α-酮戊二酸、L-鸟氨酸L-天冬氨酸等。

例如，EP 0477991描述制备L-鸟氨酸L-天冬氨酸的方法。这涉及添加水溶性的溶剂至L-鸟氨酸和L-天冬氨酸的水溶液以达到至少90%饱和或过饱和的溶液。然后在回流下加热所述溶液直到晶体的形成已结束。然后在回流下继续添加水混溶的溶剂直到盐晶体形成。晶体可以通过例如离心去除并且随后在真空下干燥。产物的纯度通常在98.5%以上。

JP 46003194描述制备L-鸟氨酸L-酮戊二酸的方法。这涉及例如通过吸收至酸性离子交换器并用氨水洗脱将鸟氨酸HCL转换成为游离碱，添加α-酮戊二酸并在真空下蒸发所述溶液直至产物结晶。

质粒pEC7lysE已按照布达佩斯条约以菌种大肠杆菌DH5α/pEC7lysE(DM2204)的形式在2010年1月15日以保藏号DSM 23239保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ,Brunswick,Germany)。

实施例

实施例1：克隆和测序来自谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的LysE基因

将菌株ATCC 13032的LysE基因克隆进入大肠杆菌/谷氨酸棒状杆菌穿梭表达载体pVWEx1(Peters-Wendisch等人，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.(2001)3(2):295-300)。

克隆分两步骤进行。首先，用源自SEQ ID No.1的以下的寡核苷酸引物从谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中聚合酶链式反应(PCR)扩增所述基因。所述寡核苷酸在其5'端包括额外的限制性切割位点(下划线：lysE 1.p的EcoRV和lysE_2.p的AvrII或SspI)。

lysE_1.p:5'-[TCGATATCATGGAAATCTTCATTACAGG]-3'(见SEQ IDNo.22)

lysE_2.p:5'-[TGCCTAGGTCAATATTTGGGCGAAGGCCACCG]-3'(见SEQ ID No.23)

在存在200μM的三磷酸脱氧核苷(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、0.5μM每个相应的寡核苷酸、100ng谷氨酸棒状杆菌ATCC13032染色体DNA、1/5体积的5倍反应缓冲液HF和0.02U/μl热启动DNA聚合酶(Biozym Scientific GmbH,D-31840Hess.Oldendorf)下在热循环仪(Mastercycler,Eppendorf AG,Hamburg)中进行PCR反应，所述反应按如下条件：98℃下1min；30个循环(98℃下20s；63℃下20s；72℃下40s)；72℃下6min。

按如下将所述761bp的LysE PCR片段(见SEQ ID No.3)克隆进入pVWEx1：

制备载体：通过在含有10单位的PstI酶的酶特异性缓冲体系中在37℃孵育1小时切割1μg的pVWEx1质粒DNA。之后紧接着根据制造商的说明用Quick Blunting Kit(New England Biolabs GmbH,Frankfurt am Main)处理所述切割混合物，然后根据制造商的说明使用QiaExII纯化试剂盒(Qiagen AG,Hilden,Germany)纯化所述切割混合物。然后在酶特异性缓冲体系中在37C下1小时用10单位的XbaI切割以这种方式预处理的载体，然后再使用QiaExII纯化试剂盒纯化所述载体。

插入物的制备：用10单位的AvrII和EcoRV酶切割所述LysE PCR片段，然后根据制造商的说明使用QiaExII纯化试剂盒纯化所述片段。

连接：载体和插入物以1:5摩尔比混合并使用T4DNA连接酶在16℃下连接1小时。用3μl连接混合物转化化学感受态大肠杆菌DH5α细胞(Subcloning efficiency,Invitrogen GmbH,Karlsruhe,Germany)。

基于它们在含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB-琼脂板上的卡那霉素抗性来鉴定转化子。从4个所述转化子中分离质粒DNA，并通过限制性分析作为插入物的0.75kb片段的存在来测定所述质粒。以这种方法生产的重组质粒称为pVWEx1_lysE。

通过根据Sanger等人的脱氧链终止方法(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America(1977)74:5463-5467)测定质粒pVWEx1-lysE中的0.75kb片段的核苷酸序列。为此，借助寡核苷酸引物pVW 1.p(5'-TGA GCG GAT AAC AAT TTC ACA C-3′)和pVW_2.p(5'-CGA CGG CCA GTG AAT TCG AG-3')在Eurofins MWGOperon GmbH(Ebersberg,Germany)对所述pVWEx1_lysE质粒的完整插入物进行测序。

所获得的核苷酸序列使用Clone Manager 9 Program来分析并示于SEQID No.20。

实施例2：构建pK18mobsacB_DargFRGH载体用于缺失谷氨酸棒状杆菌中的argFRGH区域

为此，首先通过Tauch等人的方法(1995,Plasmid 33:168-179)从谷氨酸棒状杆菌ATCC13032分离染色体DNA。基于谷氨酸棒状杆菌argFRGH基因的序列选择下面列出的寡核苷酸以制备argFRGH缺失构建体。借助聚合酶链式反应(PCR)，更具体地通过基因SOEing的方法(重叠延伸的基因拼接，Horton,Molecular Biotechnology 3:93-98(1995))产生所述缺失构建体。

argFRGH_d1：5'-GGT GGT GCT AGC CCG GCG ATT TCT TTG CACAT-3'(见SEQ ID No.24)

argFRGH_d2：5'-AAT GCT TAT CGA CGT ACC CCC CTG TGG TTGTGA AGT CAT A-3'(见SEQ ID No.25)

argFRGH_d3：5'-GGG GTA CGT CGA TAA GCA TT-3'(见SEQ IDNo.26)

argFRGH_d4：5'-GGT GGT ATG CAT GGT GAT GGT TCC GAA TGTTG-3'(见SEQ ID No.27)

所示寡核苷酸引物购自Eurofins MWG Operon GmbH(Ebersberg,Germany)。使用

热启动DNA聚合酶(Biozym Scientific GmbH,D-31840Hess,Oldendorf)在热循环仪(Mastercycler,Eppendorf AG,Hamburg)中进行PCR反应。

argFRGH_d2引物由两个区域组成。核苷酸序列的一部分互补于argF基因起始密码子的从上游1bp至下游19bp的区域。核苷酸序列的另一部分互补于从argH基因的1419位核苷酸至argH基因下游的5个核苷酸的区域。

借助聚合酶链式反应，引物argFRGH_1和argFRGH_2使得可以扩增543bp DNA片段而引物argFRGH_3和argFRGH_4使得可以扩增513bpDNA片段。所述扩增子通过PCR生产，通过在0.8%强度的琼脂糖凝胶中电泳检测定，使用高纯PCR产物纯化试剂盒从所述琼脂糖凝胶分离(Product No.1732676,Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)并用作使用引物argFRGH_1和argFRGH_4的另一PCR反应的模板。以这种方式产生1036bp DargFRGH缺失衍生物(又见SEQ ID No.21)。它包括477bp的argD基因的3'末端、19bp的argF基因的5'末端，15bp的argH基因的3'末端和420bp的cg1589阅读框的5'末端。通过在0.8%强度的琼脂糖凝胶中的电泳测定以这种方式扩增的产物。

通过酶NdeI和NsiI完全地切割1.04kb DargFRGH PCR产物(SEQ IDNo.21)。随后使用PCR纯化试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)纯化所述片段。以这种方式预处理的DargFRGH缺失衍生物与可移动克隆载体pK18mobsacB(Schafer等人，(1994),Gene 14:69-73)一起用于连接。所述克隆载体之前已完全地被限制性核酸内切酶XbaI和PstI所切割。所生产的DNA末端与通过NdeI和NsiI切割产生的插入物的末端是相容的。以这种方式制备的载体与DargFRGH片段以1:5摩尔比混合并用T4DNA连接酶(Amersham-Pharmacia,Freiburg,Germany)在16℃连接1小时。用3μl连接混合物转化化学感受态大肠杆菌DH5α细胞(亚克隆效率,InvitrogenGmbH,Karlsruhe,Germany)。基于它们在含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB-琼脂板上的卡那霉素抗性来鉴定转化子。从4个所述转化子中分离质粒DNA(来自Qiagen(Hilden)的QIAprep Spin Miniprep Kit)并通过限制性分析作为插入物的1.04kb片段的存在来测定所述质粒。以这种方法生产的重组质粒称为pK18mobsacB_DargFRGH。该菌株称为E.coli_DH5α/pK18mobsacB_DargFRGH。

通过根据Sanger等人的脱氧链终止方法(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America(1977)74:5463-5467)测定所述pK18mobsacB_DargFRGH质粒中的1.04kb片段的核苷酸序列(SEQID No.21)。为此，在Eurofins MWG Operon(Ebersberg,Germany)借助寡核苷酸引物M13uni(-21)(5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3′)和M13rev(-49)(5'-GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG-3′)对pK18mobsacB_DargFRGH质粒的完整插入物进行测序从而对正确性进行测定。

实施例3：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032_DargFRGH菌株的制备

根据Schafer等人的方案(Journal of Microbiology 172:1663-1666(1990))通过接合的方式将实施例2中所提到的载体pK18mobsacB_DargFRGH转移至谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13032。为此目的，所述载体之前已转化入大肠杆菌菌株S171(Simon等人，Biotechnology 1:784-791)。与大肠杆菌DH5α中的检测类似地(见实施例2)测定S171中的载体的身份。

载体pK18mobsacB和pK18mobsacB_DargFRGH在谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中不能自我复制，并且只有当在重组事件后它们已整合到染色体中的情况下保持在细胞中。通过将接合混合物涂板在补充以15mg/l卡那霉素和50mg/ml萘啶酸的LB琼脂上(Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor,New York,1989)选择整合有pK18mobsacB_DargFRGH的克隆。挑出建立的克隆到含有25mg/l卡那霉素的LB-琼脂板上并在33℃孵育16小时。通过在无选择性的LB液体培养基中培养所述克隆，然后在含有10%蔗糖的LB琼脂培养，接着孵育24小时来选择其中由于第二次重组事件而质粒已被切除的突变体。

所述pK18mobsacB_DargFRGH质粒，与起始质粒pK18mobsacB一样，包含除卡那霉素抗性基因外的一个拷贝的编码枯草杆菌果聚糖蔗糖酶的sacB基因。蔗糖诱导的表达导致果聚糖蔗糖酶的形成，其催化对谷氨酸棒状杆菌有毒的产物果聚糖的合成。因此，只有那些其中整合的pK18mobsacB_DargFRGH已被切除的克隆在含有蔗糖的LB琼脂上再次建立生长。切除可以包含所述质粒与argFRGH的完整染色体拷贝或具有内部argFRGH缺失的不完整拷贝一起切除。

针对表型“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”测试了大约40-50个克隆。为了证明缺失的argFRGH等位基因已保留在染色体中，通过借助聚合酶链式反应的Innis等人的标准PCR方法(PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications,1990,Academic Press)测试具有表型“在蔗糖存在下生长”和“在卡那霉素存在下不生长”的大约20个克隆。这涉及从所述克隆的染色体DNA扩增携带缺失argFRGH区域周围的DNA片段。为所述PCR选择以下引物寡核苷酸。

argFRGH_d1(SEQ ID No.24)：5'-GGT GGT GCT AGC CCG GCG ATTTCT TTG CAC AT-3'

argFRGH_d4(SEQ ID No.27)：5'-GGT GGT ATG CAT GGT GAT GGTTCC GAA TGT TG-3'

在含有完整argFRGH基因座的对照克隆中，所述引物使得可以扩增大约5.35kbDNA片段。在具有缺失的argFRGH基因座的克隆中，扩增出大约1.04kb大小的DNA片段。

通过在0.8%强度的琼脂糖凝胶中电泳的方式鉴定所扩增的DNA片段。由此显示所述菌株在染色体上携带缺失的argFRGH等位基因。该菌株被称为谷氨酸棒状杆菌Delta_argFRGH。

实施例4：在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032_Delta_argFRGH中表达lysE基因

通过电穿孔将质粒pVWEx1_LysE和空质粒pVWEx1导入形成L-鸟氨酸的菌株ATCC 13032_Delta_argFGH (Haynes等人，FEMS MicrobiologyLetters(1989)61:329-334)。基于它们在含有25μg/ml卡那霉素的Caso琼脂板上的卡那霉素抗性来鉴定转化子。随后对5个单克隆测试转化质粒的正确性。为此目的，分离质粒DNA(质粒提取试剂盒，QIAGEN)并通过限制型分析对这种DNA测定其正确的切割模式。以这样的方式，产生谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC 13032_Delta_argFRGH/pVWEx1_lysE和ATCC13032_Delta_argFRGH/pVWEx1。

实施例5：使用谷氨酸棒状杆菌制备L-鸟氨酸

为了研究它们产生L-鸟氨酸的能力，菌株ATCC13032_Delta_argFRGH/pVWEx1_lysE的三个克隆和菌株ATCC13032_Delta_argFRGH/pVWEx1的三个克隆分别在10ml测试培养基中在33℃下预培养16小时。对于生产测定，用所获得的预培养物分别接种10ml测试培养基，使得起始时OD₆₀₀(在600nm下的光密度)为0.1。每个克隆在三个摇瓶中测试，这样每个菌株在各收获时间由总共九个摇瓶代表。所述测试培养基与在Keilhauer等人(Journal of Bacteriology(1993)175:5593-5603)所描述的CgXII培养剂是相同的，但额外地含有7.5g/l酵母提取物(Difco)、25μg/ml卡那霉素、1mM IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖苷)和40g/l蔗糖代替葡萄糖。为简单起见，在如下表2总结所述测试培养基的组成。

表2:

组分	每升的含量
		(NH₄)₂SO₄	20g
尿素	5g
		KH₂PO₄	1g
K₂HPO₄	1g
		MgSO₄×7H₂O	0.25g
3-吗啉丙磺酸(MOPS)	42g
		CaCl₂	0.01g
FeSO₄×7H₂O	0.01g
		MnSO₄×H₂O	0.01g
ZnSO₄×7H₂O	0.001g
		CuSO₄	0.0002g
NiCl₂×6H₂O	0.00002g
		生物素	0.0002g
原儿茶酸	0.03g
		蔗糖	40g
酵母提取物	7.5g
		Ph(用NaOH)	7

在33℃和200rpm在100ml振荡烧瓶中进行培养。振荡器的偏转(deflection)为5cm。在24和48小时后收获克隆的三个培养物。为此，从所述培养物取样品并且测定光密度、蔗糖含量和L-鸟氨酸含量。为了测定蔗糖和L-鸟氨酸含量，通过简短离心(桌上离心型5415D(Eppendorf)，13000rpm、10分钟、室温)去除所述细胞。

使用GENios微孔板光度计(Tecan,Reading,UK)在660nm的波长下测定光密度。在测量前用去离子水1:100稀释所述样品。

使用来自R-Biopharm AG(Darmstadt,Germany)的测试系统(Cat.No.10716251035)测定蔗糖。这涉及到蔗糖的转换以及使用偶联酶测定(己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)通过NADH形成检测所形成的葡萄糖。

通过反相HPLC(Lindroth等人，Analytical Chemistry(1979)51:1167-1174)进行来自培养物上清的细胞外的氨基酸含量的定量测定，其使用与荧光检测器(G1321A)连接的HP1100系列HPLC仪器(Hewlett-Packard,Waldbronn,Germany)；使用HP ChemStation(Hewlett-Packard)进行系统控制和数据评估。在自动柱前衍生化中将1μL的氨基酸溶液与20μl的直接可用的邻苯二甲醛/2-巯基乙醇试剂(Pierce Europe BV,Oud-Beijerland,Netherlands)混合。用渐增的非极性相(甲醇)的梯度程序在前柱(40x4mmHypersil ODS 5)和主要柱组合(Hypersil ODS 5，两种柱均来自CS-Chromatographie Service GmbH,Langerwehe,Germany)分馏所得的发光的、巯基取代的异吲哚(Jones等，ournal of Chromatography(1983)266:471-482)。极性洗脱液为醋酸钠(0.1M；pH 7.2)；流速为每分钟0.8mL。在230nm的激发波长和450nm的反射波长下检测所述衍生氨基酸的荧光。通过与外部标准比较而L-天冬氨酸作为额外的内部标准计算L-鸟氨酸和/或L-鸟氨酸盐酸盐的浓度。

L-鸟氨酸盐酸盐的分子量是168.6g mol^-1而L-鸟氨酸的分子量是132.1g mol^-1。

通过形成的L-鸟氨酸的量(L-鸟氨酸盐酸盐)除以所消耗的蔗糖的量计算产量。

结果列于表3。

表3:孵育24小时(表3A)和48小时(表3B)后的L-鸟氨酸形成。缩写：*：ATCC 13032_Delta_argFRGH；ORN-HCL：L-鸟氨酸盐酸盐。

表3A：

表3B：

实施例6：质粒pEC7lysE的测序和保藏

质粒pEC7lysE由Bellmann等人的出版物(Microbiology(2001)147,1765-1774)的通讯作者Dr.Lothar Eggeling(Forschungszentrum Jülich GmbH,D-52425Jülich)以水溶液的形式提供。

所述DNA溶液的液体用于根据制造商的说明转化来自InvitrogenGmbH(Paisley,UK)的DH5α菌株的感受态大肠杆菌细胞(亚克隆效率，基因型：F-Φ80lacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(rK-,mk+)phoA supE44λ-thi-1 gyrA96 relA1)1gyrA96 relA1)。在补充50μg/ml卡那霉素的Luria-Bertani琼脂上选择转化子。

称为转化大肠杆菌DH5α/pEC7lysE(DM2204)的转化子根据布达佩斯条约在2010年1月15日以保藏号DSM 23239保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心(Brunswick,Germany)。

来自DSM 23239菌株的pEC7lysE质粒通过定制DNA测序(WalkingService)在Eurofins MWG Operon GmbH(Martinsried,Germany)完全测序。pEC7lysE的序列示于SEQ ID No.29。

PCT

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