UA109898C2 - СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ L-ОРНІТИНУ З ВИКОРИСТАННЯМ БАКТЕРІЙ, НАДЕКСПРЕСУЮЧИХ LysE - Google Patents

Abstract

Винахід належить до способу ферментативного одержання L-орнітину з використанням мікроорганізмів, який характеризується підвищеним експортом амінокислоти.

Description

Передумови створення винаходу

Відомо, що І-орнітин здійснює стимулюючу дію на функцію печінки, і його часто застосовують як компонент у лікарських засобах і продуктах харчування для спортсменів.

Зараз І -орнітин одержують за допомогою різних методів. Одним з методів є одержання за допомогою ферментації з використанням мікроорганізмів. Іншим методом є лужний гідроліз аргініну, наприклад, із застосуванням гідроксиду барію (СМ 1594282 А). Ще одним методом є біотрансформація аргініну за допомогою іммобілізованих мікроорганізмів, які характеризуються аргіназною активністю (КК 589121 В1). У патентній літературі також описаний метод одержання

І -орнітину з І -цитруліну СР 42007767 В4).

У літературі описані мікроорганізми, які відрізняються тим, що вони вивільняють І -орнітин у культуральне середовище. Прикладами таких мікроорганізмів можуть служити бактерії р.

Согупебасієгішт, Вгемібасієпцт, Васійи5 (Р 43010996 84, ОР 57041912 В), ЕвсНегіспіа (005 3668072 А), Ргомідепсіа (УР 03195494) або Агіпгобасієгї (05 3574061).

Продукуючі І--орнітин мікроорганізми часто відрізняються тим, що вони є ауксотрофами по амінокислотам І -аргініну або І-цитруліну (що описано для Вгемірасіегішт, Васійи5,

Согуперасіегійт в ЕР 392708 ВІ їі КК 161147 В1 і для Еб5сПпегіспіа в О5 366072 А). Крім того, були описані мікроорганізми, які характеризуються стійкістю до /2-тіазол-аланіну, сульфагуанідину або 2-фторпірувату (публікація викладеної заявки на японський патент Мо б1- 119194). В ЕР 0393708 В1 описані продуценти І! -орнітину, які відрізняються зниженою стійкістю до орнітолу і мікофенолової кислоти. Зазначені властивості можуть бути присутніми також у поєднанні одна з одною.

Рівень вивільнення основних амінокислот, таких як І-лізин, І-аргінін і І-орнітин, за допомогою пасивної дифузії із клітини є дуже низьким (ВеПтапп та ін., Місгоріоіоду, 147, 2001, сс. 1765-1774). Це було докладно описано на прикладі лізину. Міс зі співавторами (Мгії|с та ін.,

УоитаїЇ! ої Васієегіоіоду, 17 7(14), 1995, сс. 4021-4027) вивчили цілий ряд мутантів Согуперасієгійт дішатісит, які характеризуються дефіцитом експорту. Для одного з мутантів було встановлено, що внутрішньоклітинна концентрація І -лізину становила 174мМ, у той час як його концентрація в позаклітинному середовищі становила тільки 0,7мММ.

У роботах, опублікованих Мгії|с зі співавторами (МоЇІесшіаг Місгобіоіоду, 22(5), 1996, сс. 815-

Зо 826 і доигпаї ої МоїІесшаг Місгоріоіоду апа Віотесппо!оду, 1, 1999, со. 327-336), і в ЕР 0868527 В1 представлені результати ідентифікації і поданий опис нового організму-експортера, який є експортером І-лізину (ГУ5Е). Виявлений нуль-мутант по гену ІЇу5хЕ не мав здатності транспортувати І -лізин із клітини. Поліпептид, який кодується геном ІуУбхЕ, складається з 233 амінокислот або амінокислотних залишків і має послідовність, представлену в 5ЕО ІЮО МО: 2.

Було встановлено, що в результаті здійснення надекспресії гена ІУ5Е у продуценті лізину відбувалося збільшення вивільнення І -лізину.

ВейПптапп зі співавторами (МісгобіоІоду, 147, 2001, сс. 1765-1774) охарактеризували більш докладно експортера ГузЕ з точки зору транспорту різних основних амінокислот в с. дішатісит. Автори продемонстрували, що транспортер має специфічну здатність експортувати амінокислоти І -лізин і І -аргінін із клітини. Крім того, автори вивчили питання про те, чи може

ГузЕ експортувати також і І-орнітин із клітини. Для цієї мети, насамперед, був створений ауксотрофний по Г -аргініну штам С. дішатісит, позначений як АТСС13032:агок.

Штам культивували в 50 мл (періодичний процес культивування) мінімального середовища, позначеного як СОХІЇ, яке містило глюкозу в концентрації 40 г/л. Після інкубації протягом 24 год. вимірювання показали, що концентрація І-орнітину становила бОМмМ, що відповідало 7,9 г/л.

Внутрішньоклітинна концентрація І-орнітину в клітинах зазначеного штаму, вимірювана після періоду інкубації, який складав приблизно 70 хв, становила приблизно 200мМ. Для вирішення питання про те, чи має ГубЕ здатність транспортувати також І! -орнітин із клітини, здійснювали трансформацію штаму 13032:агдає за допомогою реплікуючої плазміди рЕС7ІУб5Е. Це було зроблено для того, щоб надати штаму підвищену ГузЕ-активність і тим самим надати йому здатність із більшою швидкістю транспортувати І -орнітин у середовище. Однак вжиті заходи не привели до збільшення швидкості експорту І-орнітину. Було встановлено, що і контрольний штам (13032:аг9б) і трансформант (13032:агуоб, який несе рЕСЛІУ5ЗЕ) характеризувалися однаковою швидкістю експорту (0,6 нмольхв' (мг сухої маси)"). На основі отриманих результатів автори зробили висновок, що І-орнітин не експортується експортером ГІ У5Е. Крім того, вони прийшли до заключення про те, що в Согупебрасіегійт дішатісит повинна існувати інша ще невідома функція, яка забезпечує експорт І -орнітину (білок-експортер) (ВейПтапгп та ін., 2001, с. 1771, фіг. 56) і с. 1772, рядки 21-28).

Був ідентифікований варіант ГузЕ (див. 5ЕО ІЮ МО: 4) у штамі С. дішатісит К, який бо відрізнявся від амінокислотної послідовності ІГузЕ-експортера зі штаму АТСС 13032,

представленої в З5ЕБЕО І МО: 2, подовженим на три амінокислотних залишки М-кінцем.

Амінокислотні залишки розташовувалися в наступному порядку: метіонін, валін, ізолейцин (ММІ). Цей ГубзЕ-поліпептид зі штаму К описаний в ЕР 1266966 В1 як варіант, який відрізнявся від білка дикого типу з точки зору формування області петлі, більш конкретно, він не міг формувати зазначену петлю, і внаслідок цього мав здатність більш ефективно здійснювати експорт І -лізину і І -аргініну.

Інший варіант ГубЕ був описаний Сипії і Мазцеда (дошгпа! ої ВіоїесппоЇоду 127, 2006, сс. 1- 13). Автори вивчали питання виробництва І-лізину облігатною метилотрофною бактерією,

МеїШПпуїорпйи5 теїпуіоїгорпи5. Вони трансформували М. тейПуіоїгорпи5 плазмідою, позначеною як рОЕ, яка містила ген ІуУ5Е зі штаму С. дішатісит АТСС13869, з метою підвищення виробництва лізину М. теїпуіоїгорпих5. Однак автори виявили, що їм вдалося стабільно інтродукувати в М. теїпуіоїгорпи5 тільки мутантну форму гена ІУ5Е (1У5Е24). Відкрита рамка зчитування гена ІуУ5Е була зрушена в алелі ІуУ5Е24 внаслідок інсерції залишку тимідину, це обумовлювало те, що відкрита рамка зчитування закінчувалася після 432 пари основ.

Вкорочена рамка зчитування кодувала білок ГузЕ, який був коротше на 92 ак на С-кінці в порівнянні з білком ГубхЕ, присутнім у штамі С. дішатісншт АТСС13869 дикого типу. Він складався з 141 амінокислотного залишку. Крім того, останні б С-кінцевих амінокислот вкороченого білка (залишки 135-141) відрізнялися від амінокислот амінокислотної послідовності

ГУЗЕ дикого типу. Штам М. теїПпуіоїгорпи5, який несе на плазміді (рР5Е24) модифікований алель

ГузЕ, тестували відносно виробництва лізину. Для цієї мети штам аналізували в 0,3 л мінімального середовища, позначеного як ЗЕЇЇс, у режимі періодичного культивування з підживленням протягом 50 год. Автори встановили, що трансформант продукував наряду з 1- лізином (0,55мМ) і І -аргініном (0,19мММ) також у невеликих кількостях І-орнітин (0,07мММ, що відповідало концентрації 11,8 мг/л). Автори прийшли до висновку про те, що можливим поясненням виявленого утворення І -орнітину може бути або змінена специфічність мутантного транспортера відносно субстрату, або змінений внутрішньоклітинний пул І -аргініну в штамі. В

ЕР 1266966 ВІ1 (на ім'я Сипіі і Мазиеда) описаний позитивний вплив І узЕ24-транспортера на екскрецію І! -лізину і І -аргініну.

Завдання винаходу

Зо В основу даного винаходу було покладене завдання розробити новий спосіб ферментативного одержання І -орнітину.

Опис винаходу

Об'єктом винаходу є спосіб одержання І -орнітину, який відрізняється тим, що здійснюють наступні стадії, на яких: а) здійснюють ферментацію бактерії, яка вивільняє І -орнітин, обраної із групи, яка включає бактерії р. р. Согуперасіегішт, Васійи5, 5ігеріотусевз, Агіпгобасіег і род. Епіегобасіегіасеае, яка надекспресує у середовище полінуклеотид, який кодує поліпептид, який має активність експортера І -орнітину у має амінокислотну послідовність, ідентичну щонайменше на (2) 35 905, 2 95,2 50 95, 2 55 95, 2 60 95, 2 65 95,2 70 95,2 75 95, 2 80 95, 2 85 95, 2 90 95, 2 92 90, 2 94 95, 2 40 96 95,2 97 95, 2 98 95, 2 99 95 або 100 95, краще на 2 70 95, більш краще на 2 90 95, ще більш краще на 2 96 95, і найбільш краще на 100 95, амінокислотної послідовності, представленої в

ЗЕО ІЮ МО: 2, б) накопичують І -орнітин у середовищі, одержуючи в результаті ферментативний бульйон, в) при цьому для здійснення надекспресії не застосовують плазміду РЕС7У5Е, депоновану в рзмаг3239, г) і при цьому довжина кодованого поліпептиду становить при необхідності від 2 146 до х 286 амінокислот або амінокислотних залишків.

Краще діапазон довжин вибирають із групи, яка включає діапазони, які включають від 2 171 до х 286, від 2 196 до «х 261, від 2 203 до «х 258, від 2 218 до х 243, від 2 228 до х 236 і від 2 228 до х 233 амінокислот або амінокислотних залишків.

Особливо кращими діапазонами довжин є діапазони від 2 203 до «х 258, від 2 218 до х 243, від 2 228 до «х 236 і від 2 228 до «х 233, і найбільш кращими діапазонами довжин є діапазони від 2 228 до х 236 і від 2 228 до х 233.

Коли нижче в даному описі згадується І-орнітин, то варто мати на увазі, що це поняття включає також його солі, такі, наприклад, як моногідрохлорид І-орнітину або сульфат І- орнітину.

У способі, пропонованому у винаході, застосовують бактерії, обрані із групи, яка включає бактерії р. р. Согуперасіеєгішт, Васійи5, Бігеріотусе5, Агійгорасієг і бактерії род.

Епіегорасієїіасєавє. 60 У роді Согуперасіегішт, кращими є штами, виведені з наступних видів:

Согуперасіегіит ейісіеп5, наприклад, типовий штам О5М44549,

Согуперасіегішт дішатісит, наприклад, типовий штам АТСС13032 або штам Е, і

Согуперасіегіт аттопіадепе5, наприклад, штам АТССб6871, при цьому найбільш кращими є штами, виведені з Согуперасіегішт дішатісит.

Деякі представники виду Согуперасіегішт дішатісит відомі з існуючого рівня техніки під іншими назвами. До них відносяться, наприклад: штам АТСОС13870, який має назву Согупебасієегічт асеїоасідорпПйшт, штам О5М20137, який має назву Согупебасіегіит ІШит, штам АТСОС17965, який має назву Согуперасіегійт теїаззесоїа, штам АТОС14067, який має назву Вгемірбасієгічт Памит, штам АТОС13869, який має назву Вгемірбасіегічт Іасіотегтепит, і штам АТОС14020, який має назву Вгемірасієгічт адімагіса(шт.

Для Согупебрасіегішт дішатісит застосовують також назву "Місгососси5 дішатісив". Деякі представники виду Согупебасіегішт ейсієп5 відомі з існуючого рівня техніки також за назвою

Согуперасіегішт (пегтоатіподепех, наприклад, штам РЕМ ВР-1539.

Серед бактерій р. Васійи5 кращими є бактерії виду Васійи5 5иБійів5.

Серед бактерій р. Агіпгорасієг кращими є бактерії виду Агіпгобасіег сйгеив5.

Серед бактерій родини Епіегорасіегіасає кращими є бактерії родів Ев5сПегіспіа, Егміпіа,

Ргомідепсіа, Рапіовєа і Зеїітайа. Найбільш кращими є бактерії р. ЕхсПегіспіа і р. Зеїітайа. Найбільш кращими є: у р. Езспегіспіа вид ЕзсПегіспіа соїї, у р. Зегаца вид 5еїтайа тагсезсепв, і в р.

Ргомідепсіа вид Ргомідепсіа гейодеті.

Бактерії або штами (вихідні штами), застосовувані в способах забезпечення надекспресії експортера І-орнітину, краще вже повинні мати здатність вивільняти І-орнітин в оточуюче поживне середовище і накопичувати його в ньому. Для позначення цього нижче в даному описі використовують також вираз "продукувати". Більш конкретно, застосовувані в способах забезпечення надекспресії штами повинні мати здатність концентрувати або накопичувати |І - орнітин у поживному середовищі до рівня, який становить г 0,1 г/л, 2 0,3 г/л, 2 1 г/л, 2 З г/л, 2 10 г/л. Вихідні штами краще являють собою штами, які були одержані шляхом мутагенезу і селекції, за допомогою технологій рекомбінантної ДНК або за допомогою комбінації обох методів.

Є очевидним і не потребує додаткових пояснень те, що бактерію, придатну для застосування в способах (підходах), пропонованих у винаході, можна одержувати також, здійснюючи спочатку надекспресію полінуклеотиду, який кодує поліпептид, який має активність експортера І -орнітину і амінокислотна послідовність якого щонайменше на (2) 35 95 ідентична амінокислотній послідовності, представленій в 5ЕБЕО ІЮ МО: 2, де довжина кодованих поліпептидів при необхідності знаходиться в зазначених вище діапазонах довжин, в штамі дикого типу, такому, наприклад, як типовий штам Согупебасіегішт дішатіснт АТСС 13032 або штам АТСС 14067, і потім за допомогою додаткових відомих з існуючого рівня техніки генетичних методів забезпечувати здатність бактерії продукувати І -орнітин. Здійснення тільки лише трансформації штаму дикого типу, такого, наприклад, як штам АТСС13032, АТОС14067,

АТСС13869 або АТСОС17965, за допомогою зазначеного полінуклеотиду не являє собою спосіб, пропонований у винаході.

Прикладами штамів виду Согупебрасіегішт дішатісит, які мають здатність вивільняти або продукувати І -орнітин, є: штам Вгемірасіевегішт Іасіоїтегтепішт РЕКМ- ВР 2344 і штам Согуперасієгішт дішатісит

ЕЕВМ-ВР 2345, описані в 05 5188947.

Прикладом штаму виду Агіпгобасіег сйгеци5, який має здатність вивільняти або продукувати

І -орнітин, є: штам Агіпгорасіег сйігенє ЕЕКМ-ВР 2342, описаний в 05 5188947.

Прикладом штаму виду Васійи5 5и,иБіййб5, який має здатність вивільняти або продукувати І - орнітин, є: штам Васійи5 зиБійв5 ВОБ-32 (ЕЕВМ-Р 3647), описаний в УР 57041912.

Прикладом штаму виду Ргомідепсіа гендегі, який має здатність вивільняти або продукувати

І -орнітин, є: штам Ргомідепсіа гендегі АКОАб (РГЕКМ Р-11147), описаний в ОР 03195494.

Прикладом штаму виду Езспегіспіа соїї, який має здатність вивільняти або продукувати І - орнітин, є: штам Езспегіснпіа соїї В-9-19 (АТСС 21104), описаний в 5 3668072.

Продукуючі І -орнітин бактерії, як правило, є ауксотрофами по таким амінокислотах, як І- бо цитрулін або І-аргінін. В альтернативному варіанті можна розглядати продукуючі І -орнітин бактерії, які є брадитрофними по І -цитруліну або І -аргініні. Визначення понять "ауксотрофний" і "брадитрофний" дані, наприклад, на с. 9 в М/О 01/09286. Брадитрофів називають у даній області також мутантами "які просочуються" ("які протікають") (тобто мутантами з неповним вираженням мутаційного пошкодження). Серед брадитрофних бактерій застосовують насамперед таких, у яких активність продуктів генів АгзЕ (орнітинкарбамоїлтрансфераза), Агд9О (аргінінсукцинатсинтаза) або АгоН (аргінінсукцинатліаза) більше (») нуля, але дорівнює або менше (х) 10 95, краще » нуля і х 1 95 від зазначеної активності в бактерії дикого типу.

З існуючого рівня техніки відомі полінуклеотиди, яких позначають як ген ІУ5Е і які кодують білки або поліпептиди, які характеризуються активністю експортера Іі-лізину. Зазначені поліпептиди скорочено позначають також як ГузЕ.

Експортер являє собою білок, який локалізований у клітинній мембрані клітини і який транспортує метаболіт, наприклад, І-лізин або І-орнітин, із цитоплазми вказаної клітини в навколишнє середовище. Якщо необхідна для цього енергія присутня у формі аденозинтрифосфату (АТФ), то вказаний процес називають первинним активним транспортом або експортом. Якщо зазначена енергія надходить у формі іонного градієнта, наприклад, іонів натрію, то даний процес називають вторинним активним транспортом або експортом (Чегету М.

Вегод, Чопп ГО ТутослКо і Г. 5ігуег; Віоспетіє, 5-е вид, вид-во Зрекігит АКадетівспег Мегіад,

НеїдеІрегуд, Септапу, 2003, сс. 378-384). Іпвігисіоп5 ог деїептіпіпд І -огпйіп ехроїї асіїмпу сап ре

Тошипа іп ВеїІтапп еї а. (Місгобіоїоду 2001; 147: 1765-74).

При створенні даного винаходу було встановлено, що експортери лізину, які є представниками р. Согупебасіегішт, краще Согупебрасієегішт дішатісит, і р. Місгососси5, краще

Містососсиз Ішіеи5, характеризуються крім активності відносно експорту І-лізину також активністю, властивою експортерові І -орнітину.

Відповідно до винаходу застосовують гени, які кодують поліпептиди, які мають активність відносно експорту ГІ-орнітину і мають амінокислотну послідовність, ідентичну щонайменше на (2) 35 95, 240 95,2 50 95, 2 55 95, 2 60 95, 2 65 95,2 70 95,2 75 905, 2 80 95,2 85 95, 2 90 96, 2 92 95, 2 94 96, 2 96 95, 2 97 90, 2 98 905, 2 99 95 або на 100 95, краще 2 70 95, більш краще 2 90 95, ще більш краще 2 96 95, і найбільш краще 2 100 95, амінокислотної послідовності, представленої в 5ЕО ІЮ

МО: 2, при цьому довжина кодованого поліпептиду при необхідності знаходиться в зазначених вище діапазонах довжин.

Прикладами придатних експортерів І-орнітину є експортери лізину або І убЕ-поліпептиди штамів Согуперасієегічт дішатіснит АТОС13032 (5ЕО ІЮО МО: 2), Согуперасієгіит дішатісит К (ЗЕБЕО ІЮ МО: 4), Согупебасіегшт дішатісшт АТСС14067 (5БО ІО МО: 5), Согупебасієгійт дішатісит АТСС13869 (5БО ІО МО: 7), Согупебрасіегішт ейісіеп5 М5-314 (ЗЕБО ІЮ МО: 9),

Согуперасіегішт аірпегіае МСТС 13129 (5ЕБО ІЮ МО: 10), Согуперасієгішт 5ігіаашт АТОоСб6940 (ЗЕО ІЮО МО: 11), Согупебрасієгінт аийгітисозхит АТОС700975 (5ЕО ІЮ МО: 12), Согуперасієегійт тайгиспоїйї АТОС33806 (ЗЕО ІО МО: 13), Согупебасіегічт рзейдодепіайнт АТОС33035 (5ЕО 10

МО: 14), Согуперасіегішт ассоїєп5е АТСС49725 (5БО 10 МО: 15), Согуперасіегічт діисигопаіуйсит АТСС 51867 (5ЕО ІО МО: 16), Місгососси5 Іщеиз МСТОС2665 (5ЕБО ІО МО: 17),

Согуперасіегішт Іирисиіов5ієвагісит 5К141 (5БО ІЮО МО: 18) і Согуперасіегішт таїгиспоїї

АТСОСС14266 (5ЕО ІЮ МО: 19). Поліпептиди, послідовності яких представлені в ЗЕО ІЮО МО: 18 і

ЗЕО ІЮ МО: 19, позначають у даній області також як АгаО-поліпептиди.

При створенні даного винаходу була визначена нуклеотидна послідовність генів ІУ5Е штамів

Согуперасіегіит дішатіснит АТОС14067 і Согупебасієгічт дішатісит АТСС13869 (5ЕО ІЮО МО: б їі 5ЕБЕО ІО МО: 8). Амінокислотні послідовності ГузЕ-поліпептиду штамів Согупебасіегічт аішатісшт АТОС14067 і Согуперасієгішт дішатіснт АТОС13869 представлені в ЗЕО ІО МО: 5 і

ЗБО ІЮО МО: 7. Вони ідентичні амінокислотній послідовності ГузЕ штаму С. дішатісит

АТСОСС13032, представленій в ЗЕО ІЮО МО: 2.

У таблиці 1 наведені реєстраційні номери ІУузЕ-поліпептидів різних представників р.

Согупебасієгічт і р. Місгососсиз Ішщеив, взяті з баз даних Національного центра біотехнологічної інформації (МСВІ, Бетесда, шт. Меріленд, США). Крім того, у таблиці 1 дані посилання на амінокислотні послідовності ГубзЕ-поліпептиду, представлені в переліку послідовностей. І, нарешті, у таблиці 1 вказана довжина (кількість амінокислот) кодованого І узЕ-поліпептиду.

Таблиця 1

С.еййсівпе 7777/7779 11111111 1йиР0Б492091 | ...ЮюЮюЮюЮюрюр2а81ш

На фіг.1 представлене множинне порівняння амінокислотних послідовностей ІУзЕ- поліпептидів бактерій, перерахованих у таблиці 1. Вирівнювання амінокислотних послідовностей, представлених на фіг. 1, здійснювали за допомогою програми Сіопе Мападег 9

Ргоїтезвзіопа! Едйіоп (фірма 5сіепійіс 8 Едисайопа! 5оймаге, 600 Ріппег УУваїай Умау, 5(е 202, Сагу, шт. Північна Кароліна, 27513, США). Як еталонну молекулу при здійсненні вирівнювання використали І узЕ-поліпептид (ГУзЕ) штаму АТСС13032. Як матриця очок (матриці балів) була обрана матриця "Віозит 62" (див. ЧУегету М. Вего, допп І. ТутослкКо і І. Бігуег; Віоспетіеє, 5-е вид., вид-во 5рекігит АКадетізспег Мепіад, НеїдеІрегоу, сСегтапу, сс. 194-197, 2003) жав спозеп.

При необхідності можна використати також програми, відомі з існуючого рівня техніки, такі, наприклад, як програма Сіиеа!І (Тпотрзоп 9.0., сірзоп Т.9., Ріемпіак Е., Уеаптоцидіп Р. і Ніддіп5 р.а, Те Сіивіа! м/пдомув іпіепасе: Пехіріє 5зігаїедієз ог тийіріє зедоепсе аїїдптепі аіїдейа бу ачиаїйу апапувів 10015. Мисієїс Асіаз Кезеагсі, 25, 1997, сс. 4876-4882).

Амінокислотні залишки 4-236 ІГубзЕ-поліпептиду штаму Согуперасієегішт дішатісит К (див.

ЗБО ІО МО: 4) відповідають амінокислотній послідовності ГуУ5зЕ штаму С. дішатісит

АТСОС13032, представленій в 5ЕО ІЮО МО: 2. Поліпептид штаму С. дішатісит К має на М-кінці додаткову послідовність, яка складається із трьох амінокислотних залишків (метіонін-валін- ізолейцин). Зазначені додаткові залишки утворюються в тому випадку, коли замість стартового кодона гена ІуУ5Е у штамі С. дішатісит АТСС13032 (див. ЗЕО ІЮ МО: 1) використовують стартовий кодон, розташований на відстані 9 пар основ проти ходу транскрипції відносно гена

ІУ5Е.

Амінокислотна послідовність ГузхЕ-поліпептиду штаму С. еПісіеп5 У5- 314 ідентична на 71 95, штаму С. аірпіегіае МСТС 13129 ідентична 44 95, штаму Согуперасіегішт 5ігіавит АТОоС6940 ідентична на 44 95, штаму Согупебасіегічт айгітисозхит АТОС700975 ідентична на 42 95, штаму

Согуперасіегішт таїгиспоїї АТСС33806 ідентична на 4395, штаму Согупебасіегійт рзейдодепійарнйцт АТСС33035 ідентична на 43 95, штаму Согупебасіегічт ассоїеп5 АТОС49725 ідентична на 43 95, штаму Согуперасіегішт діисигопаіунйсит АТСС 51867 ідентична на 36 95, штаму Місгососси5 Ішеи5 МСТС2665 ідентична на 40 95 амінокислотній послідовності ГузЕ

Зо штаму С. дішатісит АТСС13032, представленій в 5ЗЕО ІЮ МО: 2. Крім того, амінокислотна послідовність АгдО-поліпептиду штаму С. шрисиіоб5івагісит ЗК141 ідентична на 4395 амінокислотній послідовності, представленій в 5ЕО ІЮО МО: 2. Крім того, амінокислотна послідовність АгдО-поліпептиду штаму С. таїгиспоїї АТСС14266 ідентична на 4495 амінокислотній послідовності, представленій в 95ЕБО ІЮ МО: 2. Відсотки ідентичності розраховували на основі глобального вирівнювання послідовностей за допомогою програми

Сіопе Мападег" 9 з використанням матриці Віозуит 62, яка задається (див. фіг. 2).

Гени ІУхЕ, тобто полінуклеотиди, які кодують поліпептиди, які характеризуються активністю експортера І-орнітину, можна виділяти з організмів за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з використанням відповідних праймерів. Відповідні інструкції можна знайти, зокрема, у лабораторній інструкції "РСК" під ред. МеуУмлоп і Сгапйат, вид-во Зрекігит

АКадетізспег Мепад, Неїдеїрего, септапу, 1994, і в УМО 2006/100211 на сс. 14-17.

Найбільш краще в способі, пропонованому у винаході, застосовують гени, які кодують поліпептиди, які характеризуються активністю відносно експорту І-орнітину і мають амінокислотну послідовність, яка відрізняється одною або декількома характерними рисами, обраними із групи особливостей, які мають наступні послідовності:

а) амінокислотна послідовність, представлена в 5ЕО ІЮ МО: 2 або 5ЕО ІЮО МО: 4, б) амінокислотна послідовність, представлена в ЗЕО ІЮО МО: 2, яка має одну або декілька, аж до 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 або 1, делецію(й) амінокислот, в) амінокислотна послідовність, представлена в ЗЕО ІЮО МО: 2, яка має одну або декілька, аж до 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 або 1, інсерцію(й) амінокислот, і г) амінокислотна послідовність, представлена в 5ЕО ІО МО: 2, яка має одну або декілька, аж до 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 або 1, краще аж до 5, 4, 3, 2 або 1, заміну/замін (заміщення/заміщень) амінокислот, д) амінокислотна послідовність, представлена в ЗЕО ІЮО МО: 2, яка має одне або декілька, аж до 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 або 1, краще аж до 5, 4, 3, 2 або 1, додаванняц(ь) амінокислот на М- кінці і/або на С-кінці.

Краще застосовують, якщо це необхідно, консервативні амінокислотні заміни. У випадку ароматичних амінокислот консервативні заміни являють собою заміни фенілаланіну, триптофану і тирозину один на одного. У випадку гідрофобних амінокислот консервативні заміни являють собою заміни лейцину, ізолейцину і валіну один на одного. У випадку полярних амінокислот консервативні заміни являють собою заміни глютаміну і аспарагіну один на одного.

У випадку основних амінокислот консервативні заміни являють собою заміни аргініну, лізину і гістидину один на одного. У випадку кислих амінокислот консервативні заміни являють собою заміни аспарагінової кислоти і глютамінової кислоти одна на одну. У випадку амінокислот, які містять гідроксильні групи, консервативні заміни являють собою заміни серину і треоніну один на одного.

Крім того, можна застосовувати полінуклеотиди, які гібридизуються в суворих умовах з нуклеотидною послідовністю, комплементарною послідовності, яка представлена в 5ЕО ІЮО МО: 1, краще з областю, яка кодує, послідовності, представленою в 5ЗЕО ІЮ МО: 1, і які кодують поліпептид, який характеризується активністю відносно експорту І-орнітину, де амінокислотна послідовність кодованого білка ідентична щонайменше на 2 70 95 амінокислотної послідовності, представленої в ЗЕО ІЮ МО: 2, і довжина кодованого поліпептиду при необхідності знаходиться в зазначених вище діапазонах довжин.

Фахівець у даній області може знайти інструкції відносно гібридизації нуклеїнових кислот і

Зо полінуклеотидів відповідно серед іншого в керівництві "(пе БІС БЗубзіет О5егв5 (зціде Тог Рійег

Нубгіаігайоп" фірми Воепгіпдег Мапппейт ЗтрН (Маннгейм, Німеччина, 1993) і в Гері та ін.,

Іптегпайопа! Ооцгпа! ої Бузіетаїйіс Васіегіоюду 41, 1991, сс. 255-260. Якщо гібридизацію здійснюють у суворих умовах, то це означає, що утворюються тільки такі гібриди, у яких зонд, тобто полінуклеотид, який містить нуклеотидну послідовність, комплементарну послідовності, представленій в 5ЕО ІЮО МО: 1, краще області, яка кодує, послідовності, представленій в ЗЕО ІЮ

МО: 1, і послідовність-мішень, тобто полінуклеотиди, які обробляють або ідентифікують за допомогою розглянутого зонда, ідентичні щонайменше на 7095. Відомо, що на суворість гібридизації, включаючи стадії відмивання, можна здійснювати вплив або задавати її за допомогою варіації складу буфера, температури і концентрації солі. Реакцію гібридизації, як правило, здійснюють в умовах відносно низкою строгості в порівнянні зі стадіями відмивання (керівництво Нубаїй НуБгідібєайоп (зціде, фірма Нубаїй Іітйеа, Теддінгтон, Великобританія, 1996).

Наприклад, для реакції гібридизації можна застосовувати 5х 55С-буфер при температурі приблизно 50-68 "С. У цьому випадку зонди можуть гібридизуватися також з полінуклеотидами, ідентичними менше ніж на 70 95 нуклеотидної послідовності застосовуваного зонда. Такі гібриди менш стабільні і їх видаляють шляхом відмивання в суворих умовах. Це можна здійснювати, наприклад, знижуючи концентрацію солі до 2х 555С2 або їх 555 і потім, при необхідності, до 0,5х

ЗЗС (керівництво Те ІС Зу«ет Овег5 (иціде їог Рійег Нурбгіаізайоп), фірма Воепгіпдег

Мапппеїт, Маннгейм, Німеччина, 1995), і встановлюючи температуру на рівні приблизно 50-

БО 68 С, приблизно 52-68 С, приблизно 54-68 С, приблизно 56-68 "С, приблизно 58-68 С, приблизно 60-68 "С, приблизно 62-68 "С, приблизно 64-68 "С, приблизно 66-68 "С. Кращими діапазонами температур являються приблизно 64-68 "С або приблизно 66-68 "С. Необов'язково можна понижати концентрацію солі до концентрації, яка відповідає 0,2х 55С або 0 їх 550.

ЗЗОС-буфер Необов'язково містить додецилсульфат натрію (ДСН) в концентрації 0,1 95. Шляхом поступового поетапного (приблизно на 1-2 "С) підвищення температури гібридизації від 50 "С до 68"С, можна виділяти полінуклеотидні фрагменти, ідентичні щонайменше на 70 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 90 956, щонайменше на 92 95, щонайменше на 94 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95, при необхідності на 10095, послідовності застосовного зонда або послідовності, 60 комплементарної послідовності застосовного зонда, і яка кодує поліпептид, який б характеризується активністю відносно експорту І-орнітину. Додаткові інструкції відносно гібридизації містяться в продуктах, які поступають в продаж і формі "наборів" (наприклад, набір

ОСІБ Еазу Нуб фірми Коспе Оіадпов5іїс5 (трН, Маннгейм, Німеччина, каталожний номер 1603558).

Відповідно до винаходу здійснюють надекспресію полінуклеотиду, який кодує білок, який характеризується активністю відносно експорту І-орнітину, у бактерії або вихідному або батьківському штамі, який продукує І -орнітин, де амінокислотна послідовність кодованого білка ідентична на 2 35 95 амінокислотній послідовності, представленій в 5Е2О ІЮО МО: 2, і довжина кодованого поліпептиду при необхідності знаходиться в зазначених вище діапазонах.

У цілому, надекспресія означає підвищення внутрішньоклітинної концентрації або активності рибонуклеїнової кислоти, білка (поліпептиду) або ферменту в порівнянні з вихідним штамом (батьківським штамом) або штамом дикого типу, якщо останній застосовують як вихідний штам.

Вихідний штам (батьківський штам) являє собою штам, який піддавали маніпуляції, яка приводить до надекспресії.

Поняття "білок" і "поліпептид" розглядаються як взаємозамінні.

Для забезпечення надекспресії краще застосовують методи рекомбінантної надекспресії.

Вони включають будь-які методи, у яких мікроорганізм створюють із використанням ДНК- молекули, одержаної іп міго. Прикладами таких ДНК-молекул є промотори, касети експресії, гени, алелі, області, які кодують і т.д. Їх можна переносити в необхідний мікроорганізм за допомогою методів трансформації, кон'югації, трансдукції або інших подібних методів.

Маніпуляції, здійснювані для забезпечення надекспресії, підвищують активність або концентрацію відповідного поліпептиду, як правило, щонайменше на 10 95, 25 95, 50 95, 75 Фо, 100 оо, 150 95, 200 95, 300 95, 400 95 або 500 95, краще аж до 1000 95, 2000 95, 4000 95, 10000 95 або 20000 95, відносно рівня активності або концентрації розглянутого поліпептиду в штамі до здійснення маніпуляції, яка приводить до надекспресії.

Коли застосовують штами виду Согуперасіегішт дішатісит, то при необхідності як придатний еталон (референс-точка) при оцінці надекспресії використовують активність відносно експорту І-орнітину в штамі АТСС13032 або АТСС14067, або АТСС13869, або АТОС17965.

Коли застосовують штами на основі штаму АТСС13032 або виведені з нього штами, то придатним еталоном є зазначений штам АТСС13032. Відповідним прикладом є штам, одержаний при створенні даного винаходу, а саме, АТСС13032 Река агдоекоН/руУмЕХ1 ІУ5зЕ, створений на основі штаму АТСС13032. Коли застосовують штами на основі штаму АТСС14067 або виведені з нього штами, то придатним еталоном є зазначений штам АТСС14067. Коли застосовують штами на основі штаму АТСС13869 або виведені з нього штами, то придатним еталоном є зазначений штам АТСС13869. Відповідним чином вибирають інші придатні еталони.

Коли застосовують штами виду ЕзсПегіспіа соїї, краще штам Ез5спегіспіа соїї К12, то при необхідності в якості придатного еталону при оцінці надекспресії використовують активність відносно експорту І -орнітину в штамі МО1655.

Для досягнення надекспресії застосовують численні методи, відомі з існуючого рівня техніки.

Вони включають збільшення кількості копій і модифікацію нуклеотидних послідовностей, які регулюють або контролюють експресію гена. Транскрипцію гена контролюють серед іншого за допомогою промотору і необов'язково за допомогою білків, які придушують (білки-репресори) або стимулюють (білки-активатори) транскрипцію. Трансляцію РНК, яка утворилася контролюють серед іншого за допомогою сайту зв'язування рибосом і стартового кодона.

Полінуклеотиди або ДНК-молекули, які включають промотор і сайт зв'язування рибосом, і необов'язково стартовий кодон, називають також касетою експресії.

Вказані методи включають також застосування варіантів поліпептидів або ферментів, які характеризуються підвищеною каталітичною активністю.

Кількість копій можна збільшувати з використанням плазмід, які реплікуються в цитоплазмі бактерії. Для цієї мети можна застосовувати цілий ряд плазмід, відомих з існуючого рівня техніки, які придатні для груп, які відрізняються великою розмаїтістю, мікроорганізмів, вказані плазміди можна використовувати для досягнення необхідного збільшення кількості копій гена.

Плазміди, які можна застосовувати для бактерій р. ЕбсПегіспіа, описані, наприклад, у посібнику з молекулярної біології Іабтах (під ред. Т.А. Вгом/п, вид-во Віо5 5сіепійіс, Охтога, ОК, 1991).

Плазміди, які можна застосовувати для бактерій р. Согупебасієгішт, описані, наприклад, в

Тацсні і ін., доигпаї ої Віоїесппоіоду, 104 (1-3), 2003, сс. 27-40 або в 5іапзеп і ін., Аррієйд апа

Епмігоптенпіа! Містобіоїоду 71, 2005, сс. 5920-5928.

Підхід, заснований на застосуванні плазміди рЕС7ІУ5Е, депонованої під реєстраційним бо номером О5М 23239, з метою збільшення кількості копій у штамах Согуперасієегічт дішатісит виключено із числа підходів, призначених для здійснення даного винаходу. Нуклеотидна послідовність плазміди РЕС7ІУ5зЕ була визначена і вона представлена в 5ЕО ІЮ МО: 29.

Кількість копій можна додатково збільшувати щонайменше на одну (1) копію шляхом інтродукції додаткових копій у хромосому бактерії. Відповідні методи, які можна застосовувати для бактерій р. Согупебасіегішт, краще Согупебасіегішт дішатісит, описані, наприклад, у міжнародних заявках на патент УМО 03/014330, УМО 03/040373 ії ММО 04/069996. В УМО 03/014330 описані методи тандемного подвоєння генів у нативному локусі генів. В УМО 03/040373 описані методи встроювання другої або третьої копії гена в інші локуси генів, при цьому конкретний локус генів не є істотним для росту або виробництва конкретної амінокислоти, якою у випадку даного винаходу є І-орнітин. Прикладами локусів генів, придатних для включення другої або наступної копії гена ІУ5Е відповідно до способу, пропонованому у винаході, є гени ой, 51сА, дарА, дарв, аадн, 1узА, агок, агов, агро і аган. В М/О 04/069996 (див. таблиці 12 і 13) описані міжгенні області і гени С. дішатісцт, які кодують фаги і компоненти фагів, які придатні для встроювання додаткових копій гена ІУ5Е.

Прикладами методів, які можна застосувати для бактерій р. Е5бспегіспіа, являються встроювання копії гена в сайт ай фага (ми ії Сошії, бепе 223, 1988, сс. 77-81), ампліфікація хромосомального гену за допомогою фага Ми, описана в ЕР 0332448, або методи заміни гену за допомогою плазміди, яка відносно реплікується, описані у Натійоп та ін., Уоигпаї! ої

Васіегіоіоду 174, 1989, сс. 4617-4622 або у І іпК та ін., доигпаї ої Васіегіоіоду 179, 1997, сс. 6228- 6237).

Експресію гена можна додатково підвищувати шляхом застосування сильного промотору, функціонально пов'язаного із призначеним для експресії геном. Краще варто застосовувати промотор, більш сильний, ніж промотор, який зустрічається в природних умовах, тобто промотор, який є присутнім у штамі дикого типу або в батьківському штамі. Для цієї мети можна застосовувати цілий ряд методів, відомих з існуючого рівня техніки.

Промотори і системи експресії, які можна застосовувати для представників р.

Согуперасіегішт, описані серед іншого в наступних патентах і заявках на патент: ЕР 0629699

Аг, 5 2007/0259408 А1 (промотор дар), УМО 2006/069711, ЕР 1881076 АТ, УМО 2008/088158,

УМО 2009/025470 (промотор ршША, промотор рук), 05 6861246 (варіанти МС20 ії МА16 промотору

Зо дарА) і ЕР 1918378 А1 (промотор 50а), а також оглядах, таких як "Напароок ої Согупебасіегійт дішатісит" (під ред. Гоїйаг Еддеїїпу і Міспає!ї Во, вид-во СКС Ргез5, Воса Каїоп, 05, 2005), або в книзі "Согупебасієгіа, сепотіс5 апа Моїесціаг Віоіоду" (під ред. Апагеа5 ВигкоубкКі, вид-во

Саїбзіег Асадетіс Ргеб5, МогпоїкК, ШК, 2008). Приклади промоторів, які забезпечують контрольовану, тобто індуцибельну або експресію, яку придушують, описані, наприклад, в

Твиспіуа і Могіпада, Віо/Гесппоіоду 6, 1988, сс. 428-430.

Промотори, які можна застосовувати для представників р. ЕхсПегіспіа, відомі вже протягом тривалого періоду часу. До них відносяться, серед іншого, класичні промотори, такі як промотор

Іас, промотор ігр, гібридні промотори ас і їгс, промотори РІ і РК фага А. Можна застосовувати також промотори фага 17, промотори деаг-рох, промотор паг або промотори генів іт5б, гпрВ, с5ГА, с5гВ, отрА, Ти5А, рерО, гріХ або греб. Контрольовану експресію можна забезпечувати, наприклад, за допомогою системи с857- РК або с857- РІ. фага АХ (сбціпо і ін., ВіоТесппіднев 24, 1988, сс. 362-366). Відповідні огляди наведені в МакКгіде5, Місгобіоіодіса! Кемієм/5 60(3), 1996, со. 512-538 або в керівництві "Ебспегіспіа соїї апа ЗаїЇтопеїа, СеїшШаг апа Моїіесшіаг Віоіоду" (головний редактор Е.С. Меїдпагаї, вид-во А5М Ргез5, Умазпіпдіоп, 05, 1996).

Такі промотори або касети експресії, як правило, поміщають на відстані від 1 до 1000, краще від 1 до 500, нуклеотидів проти ходу транскрипції від першого нуклеотиду стартового кодона області, яка кодує, гену. Відстань, рівна 1, означає, що промотор або касета експресії розташований/розташована безпосередньо перед першою основою стартового кодона області, яка кодує.

Для підвищення експресії гена ІуУзЕ в С. дІішатісит придатні промотори, такі, наприклад, як промотор 50й С. дішатісит (див. зЗЕО ІЮ МО: 1, представлену в ЕР 1918378 АТ) або промотор дар С. дішатісит (див. 5ЕО ІО МО: 3, представлену в 05 2007/0259408), краще встроюють між положеннями 930 і 990 5ЕО ІЮ МО: 1.

Коли застосовують касети експресії, які містять промотор і сайт зв'язування рибосом (КВ5), такі, наприклад, як експресійна конструкція гена 5зоа С. дішатісшт (див. ЕС ІЮО МО: 2, представлену в ЕР 1918378 АТ) або експресійна конструкція гена дар С. дішатісит, описаний в 05 2007/0259408 і представлений в 5ЕО ІО МО: 28 (позначений у зазначеному документі як

РдаркВ5), їх встроюють, наприклад, у випадку С. дішатісит краще між положеннями 930 і 1001, найбільш краще між положеннями 1000 і 1001 5ЕО ІО МО: 1. Прикладом придатного сайту 60 зв'язування рибосом у такій касеті експресії є нуклеотидна послідовність 5'- адаааддадод- З",

охарактеризована Атадог (МісгобіоІоду 145, 1999, сс. 915-924).

Можна також поміщати кілька промоторів проти ходу транскрипції відносно цільового гена або функціонально зв'язувати їх з геном, який підлягає експресії, і тим самим досягати підвищення рівня експресії. Цей підхід описаний, наприклад, в УМО 2006/069711.

Структура промоторів з Согуперасіегішт дішатісит і Езспегіспіа соїї добре відома. Тому можна підвищувати силу промотору шляхом модифікації його послідовності за допомогою однієї заміни або декількох замін, і/або однієї інсерції або декількох інсерцій, і/або однієї делеції або декількох делецій нуклеотидів. Приклади такого підходу описані серед іншого в "Негаег Гехікоп дег Віоіодіе" ІНегдег5 Епсусіораєдіа ої Віоіоду|, вид-во 5рекКігит АКадетібзспег Мепад,

НеїдеІбег9, Септапу, 1994.

Таким чином, придатний для досягнення надекспресії гена ІУ5Е підхід полягає в здійсненні модифікації або мутації промотору зазначеного гена ІУ5зЕ.

Структура сайтів зв'язування рибосоми Согупебасіегішт дішатісит і Е5спегіспіа соїї також добре відома, вона описана, наприклад, в Атадог, Місгобіоїоду 145, 1999, сс. 915-924, і в керівництвах і підручниках з генетики, таких, наприклад, як "сСепе ипа Кіопе" |Сепез апа Сіопеві, під ред. М/іппаскКег, вид-во Мегіад Спетіє, Ууеіппеїйт, Сегтапу, 1990 або "МоІесшаг Сепеїіс5 ої

Васієпйа", ЮОае і Рак, вид-во МУМмієу апа Зоп5 а., СпПіспезіеєгї, ШОК, 2004. Гени, які характеризуються високим рівнем експресії, тобто найбільш важливі структурні гени в організмі, мають ефективний сайт зв'язування рибосоми (Атадог, Місгобіоіоду 145, 1999, сс. 915-924), це означає, що він має більшу подібність із консенсусною послідовністю або відповідає їй. У літературі продемонстровано, що гени, які характеризуються високим рівнем експресії, мають сильний сайт зв'язування рибосоми (Кагіїп і Мга;ек, доигпаї! ої Васіегіоіоду; 182(18), 2000, сс. 5238-5250). Отже, ефективну трансляцію гена або мРНК можна забезпечувати шляхом регулювання сайту зв'язування рибосоми.

Ефективність трансляції можна підвищувати також шляхом регулювання кодонів, які найбільш часто зустрічаються у генах, які підлягають експресії (див., наприклад, Мадагаріайд та ін., Мисієїс Асіа5 Кезеагсі, 37 (21), 2009, сс. 7014-7023).

Надекспресію можна забезпечувати також шляхом підвищення рівня експресії білків- активаторів або шляхом зниження або "вимикання" експресії білків-репресорів.

Зо Білок Гуз, який є активатором експресії Іу5Е, був описаний в ВеїЇтапгп і ін., Місгоріоіоду; 147, 2001, сс. 1765-1774, і він був позначений вказаними авторами як "позитивний регулятор".

Амінокислотна послідовність ЇузО штаму Согуперасієгцт дішатісшт АТСС13032 представлена в 5ЕБО ІЮ МО: 30. При глобальному вирівнюванні послідовностей було встановлено, що амінокислотна послідовність поліпептиду Гуз штаму Согуперасіегійт дірпіегіае МСТС13129 ідентична на 62 95, амінокислотна послідовність поліпептиду Гуз штаму

Согупебасієгійт ейісієпе У5- 314 ідентична на 81 95, а амінокислотна послідовність поліпептиду

Гуз штаму Согупебрасіегішт дішатісит К ідентична на 94 95 послідовності, представленій в

ЗЕО ІЮ МО: 30.

Відносно білків-активаторів кращим є поліпептид, амінокислотна послідовність якого ідентична на 2 (щонайменше) 55 95, краще на 2 80 95, більш краще на 2 90 95, 2 92 95 або на » 94 95, ще більш краще на 2 99 95, і найбільш краще на 100 95, амінокислотній послідовності, представленій в ЗЕО ІЮ МО: 30.

Зазначені вище підходи, спрямовані на досягнення надекспресії, які краще вибирають із групи, яка включає збільшення кількості копій, застосування сильного промотору, здійснення мутації промотору, застосування відповідної касети експресії і здійснення надекспресії білка- активатора, можна поєднувати один з одним відповідним чином. Так, можна, наприклад, поєднувати застосування придатного промотору зі збільшенням кількості копій, або здійснювати надекспресію білка-активатора в поєднанні із застосуванням придатного промотору або придатної касети експресії.

Можна також окрім здійснення маніпуляцій, пов'язаних з полінуклеотидом, який кодує білок, який характеризується активністю відносно експорту І-орнітину, послабляти певні гени біосинтезу.

Так, для підвищення виробництва І-орнітину можна, якщо це є доцільним, додатково ослаблювати один або кілька генів, обраних із групи, яка включає: а) ген одпА, який кодує субодиницю ЕТ альфа-кетоглутарат-дегідрогенази (Кф 1.2.4.2), б) ген 5исА, який кодує дигідроліпоамід-сукцинілтрансферазу (КФ 2.3.1.61), в) ген дарА, який кодує дигідродипіколінатсинтазу (ОЮОарА, Кф 4.2.1.52), г) ген дарВ, який кодує дигідродипіколінатсинтазу (ЮарВ, КФ 1.3.1.26), д) ген аап, який кодує мезо-діамінопімелатдегідрогеназу (Пап, КФ 1.4.1.16), бо е) ген УЗА, який кодує діамінопімелатдекарбоксилазу (ГГ узА, КФ 4.1.1.20),

ж) ген аютЕ, який кодує будь-який/конкретний репресор (АгоК) біосинтезу І -аргініну, з) ген агоЕ, який кодує орнітинкарбомоїлтрансферазу (АгоР, Кф 2.1.3.3), ї) ген агдо, який кодує аргінінсукцинатсинтазу (Агдо, Кф 6.3.4.5), к) ген агон, який кодує аргінінсукцинатліазу (АБАГ) (АгоН, КФ 4.3.2.1), л) ген ІузС, який кодує аспартаткіназу (ГузС, КФ 2.7.2.4), і м) ген азіа, який кодує аспартат-полуальдегід-дегідрогеназу (Аза, Кф 1.2.1.11).

Краще ослаблюють один або кілька генів, обраних із групи, яка включає ІузА, сапА, агок, аг, агдо і агуН. Більш краще ослаблюють один або кілька генів, обраних із групи, яка включає

ІУ5А, одпА і агог. Найбільш краще ослаблюють гени) ІУ5Е і/або агог.

У контексті даного винаходу поняття "ослаблення" позначає зниження або "вимикання" внутрішньоклітинної активності одного або декількох ферментів (білків) у бактерії, які кодуються відповідною ДНК, шляхом застосування, наприклад, слабкого промотору або гена, або алеля, який кодує відповідний фермент, який характеризується низькою активністю, або шляхом інактивації відповідного гена або ферменту (білка), і необов'язково шляхом застосування комбінації вказаних підходів.

Огляд відомих промоторів різної сили в Согуперасієегічт дішатісит, наведений в Раїек та ін., Зхоигпаї ої ВіотесппоЇоду 104, 2003, сс. 311-323. Інші слабкі промотори описані в повідомленні 512057, опублікованому в журналі Кезеагсі різсіозиге, грудень 2006 р., сс. 1616-1618.

Мутації, які можна розглядати для досягнення ослаблення, являють собою транзиції, трансверсії, інсерції і делеції щонайменше однієї/одного (1) пари основ або нуклеотиду в області, яка кодує, гена, який представляє інтерес. Залежно від впливу, який здійснює обумовлена мутацією амінокислотна заміна на активність білка або ферменту, мутації позначають як місенс-мутації або нонсенси-мутації.

Місенс-мутація приводить до заміни розглянутої амінокислоти в білку на іншу, при цьому заміна, як правило, являє собою неконсервативну амінокислотну заміну. Така заміна ослаблює функціональну здатність або активність білка і знижує їхній рівень на величину, яка складає від 20 до 75 95, від 2 0 до 50 95, від 2 0 до 25 905, від 2. 0 до 10 95 або від 2 0 до 5 9.

Нонсенсів-мутації приводять до появи стоп-кодону в області, яка кодує, гена і, отже, до передчасного припинення трансляції і потім до її "вимикання". Інсерції або делеції щонайменше

Зо однієї пари основ у гені приводять до мутацій зі зрушенням рамки зчитування, у результаті чого відбувається встроювання неправильних амінокислот або передчасне припинення трансляції.

Якщо мутація приводить до появи стоп-кодону в області, яка кодує, то це також викликає передчасне припинення трансляції. Нонсенс-мутації краще створюють в 5'-кінцевій частині області, яка кодує, яка кодує М-кінець поліпептиду. Якщо загальну довжину поліпептиду (яку представляють у вигляді кількості хімічно зв'язаних І-амінокислот) прийняти за 100 95, то (у контексті даного винаходу) М-кінець поліпептиду включає частину амінокислотної послідовності, яка, якщо рахувати, починаючи з першої (стартової) амінокислоти, тобто І -форміл-метіоніну, по ходу транскрипції, містить 80 95 розташованих по ходу транскрипції І -амінокислот.

Методи мутагенезу іп мімо описані, наприклад, у керівництві "Мапиаї ої Меїйподз5 їог Сепегаї

Васіепоіоду" під ред. Зептага і ін., вид-во Атегісап Зосіеїу їог Місгобіоіоду, М/азпіпдіоп, ОС,

О5А, 1981 або в Тозака і ін., Адгісийигаї! апа Віоіодіса! Спетівігу 42(4), 1978, сс. 745-752, або в

Копісек і ін., РоЇїа Місгобіоіодіса 33, 1988, сс. 337-343.

Придатними методами мутагенезу іп мійго є, серед іншого, обробка гідроксиламіном відповідно до методу Міллера (МіШег У.Н., А Зпогі Соийгбе іп Васіегіа! Сепеїіс5. А І арогагу

Мапиа! апа НапароокК їТог Е5сПегіспіа соїї апа ОхуКаїей Васієгіа, вид-во Со 5ргіпд Нагброг

І арогайогу Ргезв5, Соїд 5ргіпд Нагбог, 1992), застосування мутагенних олігонуклеотидів (Т.А.

Вгомуп, Сепіесппоіодіе їиг Еїіпеіеідег |Сепеїйс Епдіпеегіпуд їТог Ведіппеге|, вид-во Зрекігит

АКадетізспег Мегіад, Неїдерегд, 1993 їі К.М. Ногпоп, РСК-Медіаїєд ВесотрбБіпайоп апа

Мшигадепевзіз, МоїІесціаг Віотесппооду 3, 1995, сс. 93-99), і застосування полімеразної ланцюгової реакції з використанням ДНК-полімерази з високою частотою помилок. Прикладом такої ДНК- полімерази є ДНК-полімераза Миїалуте (набір для ПЛР-мутагенезу СепеМогрі, Мо 600550) фірми 5ігаїадепе (Ла-Джолла, шт. Каліфорнія, США).

Додаткові інструкції і огляди методів створення мутацій іп мімо або іп міго можна почерпнути з існуючого рівня техніки, а також у відомих підручниках з генетики і молекулярної біології, таких, наприклад, як підручник Кпіррег, "МоІеКшіаге Сепеїік", б-е вид., вид-во беогд Тпіете

Мепад, еїшидаг, Септапу, 1995, підручник М/іппасКег, "Сепе апа Кіопе", вид-во. УСН

Мепадздезеїї5спай, Умеіппеійт, Сегтапу, 1990, або підручник Надетапп, "АІПдетеїіпе Сепеїйік"

ІСепега! Сепеїйсв5і, вид-во (зив(ам Різспег Мегіад, ЗішНоагі, 1986.

За допомогою відомих методів заміни гена або алеля, основи яких описані в Зспу/аглег апа 60 Рапіег, Віо/Гесппоіоду 9, 1991, сс. 84-87, можна переносити мутації, створені іп міго, або полінуклеотид, який містить необхідну мутацію, у хромосому. 5спагег зі співавторами (Сепе 145, 1994, сс. 69-73) застосовували вказаний метод для здійснення делеції в опероні пот-їйгВ С. оІшатісцт. Макадаула зі співавторами (ЕР 1108790) і ОПпібпі зі співавторами (Арріїєй

Місгоріоїоду апа Віоїесппоіоду 58(2), 2001, сс. 217-223) застосовували вказаний метод для включення різних мутацій, створених у виділених алелях, у хромосому С. дішатісит.

Один з методів спрямованого зниження рівня експресії гена полягає в тому, що ген, призначений для ослаблення, поміщають під контроль промотору, який можна індукувати шляхом додавання в певних кількостях ІПТГ (ізопропіл-В-ЮО-тіогалактопіранозід), такого, наприклад, як промотор їгс або промотор ас. Для цієї мети можна застосовувати, наприклад, такі вектори, як експресійний вектор рРХКУОУЕ для ЕзопПегіспіа соїї (УМО 0226787; депонований відповідно до Будапештського договору 31 липня 2001 р. в ОН5ЗаІрпа/рхХкКеОеЕ під реєстраційним номером 05М14440 у Німецькій колекції мікроорганізмів і клітинних культур (0542,

Брауншвейг, Німеччина)), рЕКЕхХ2 (реєстраційний номер АМ585307 в МСВІ) або рУМ/Ех2 (Мепаїізсн, РІИ.О.-дисертація, Вегіспте де5 Рог5спипд5лепігитв5 Уйісй, 9001-3397, ІБОМ 0994-2952,

Уаїс, Септапу, 1997), які дозволяють здійснювати залежну від ІПТГ експресію клонованого гена в Согупебасіегіит дішатісит.

Вказаний метод був застосований, наприклад, у заявці на патент УМО 02266787 для здійснення регульованої експресії гена деаО за допомогою встроювання вектора рХКО9Едеаб у геном Согуперасіегішт дішатісит, і Зітіс зі співавторами (Арріай апа ЕпмігоптепіаїЇ!

МісгоБіоїоду 68, 2002, сс. 3321-3327) для здійснення регульованої експресії гена діуА за допомогою встроювання вектора рК18ітораїуА" в Согупебасієегічт дішатісит.

Іншим методом специфічного зниження рівня експресії гена є антисмисловий метод, у якому застосовують введення в клітини-мішені коротких олігодезоксинуклеотидів або векторів для синтезу більш довгої антисмислової РНК. Після цього антисмислова РНК може зв'язуватися з комплементарними ділянками специфічних мРНК і зменшувати їхню стабільність або блокувати здатність до трансляції. Фахівець у даній області може знайти приклад такого застосування в огімазіама і ін., Арріїєа Епмгоптепіа! МісгобіоІоду, 66 (10), жовтень 2000 р., сс. 4366-4371.

Швидкість подовження залежить від частоти зустрічальності кодонів. Експресію гена можна ослаблювати шляхом застосування кодонів для тРНК, які рідко зустрічаються в батьківському штамі. Цей підхід докладно описаний в УМО 2008049781 і УМО 2009133063. Наприклад, заміняючи стартовий кодон АТО на кодони СТО або ТТ, які менш часто зустрічаються, можна послаблювати трансляцію, оскільки кодон АОС у два-три рази більш ефективний, ніж кодони сис іс (див., наприклад, Кпидуаком і ін., РЕВЗ І еЦег5 232(2), 1988, сс. 369-371; Кедау і ін.,

Ргосеєдіпд5 ої Те Майопаї! Асадету ої Зсіепсез ої Те О5А 82(17), 1985, сс. 5656-5660).

Можна також на додаток до маніпуляцій, яким піддають полінуклеотид, який кодує білок, який характеризується активністю відносно експорту І-орнітину, підсилювати певні гени біосинтезу.

Так, для збільшення виробництва І-орнітину може виявитися доцільним при необхідності додатково підвищувати ферментативну активність одного або декількох білків, обраних із групи, яка включає: а) глутаматдегідрогеназу (КФ 1.4.1.3), кодовану геном дай, б) глутамат-М-ацетилтрансферазу (Кф 2.3.1.35 і Кф 2.3.1.1), кодовану геном агду, в) ацетилглутаматкіназу (КФ 2.7.2.8), кодовану геном агов, г) М-ацетил-гамма-глутаміл-фосфатредуктазу (КФ 1.2.1.38), кодовану геном агс, д) ацетилорнітинумінотрансферазу (КФ 2.6.1.11), кодовану геном агдо, е) специфічний відносно глюкози компонент ЕЇІВ (Ріо) (КФ 2.7.1.69) системи поглинання глюкози, кодований геном різо, ж) специфічний відносно сахарози компонент ЕпІВ (Рів5) (КФ 2.7.1.69) системи поглинання сахарози, кодований геном рів, 3) глюкозо-6-фосфат-1-дегідрогеназу (КФ 1.1.1.49), кодовану геном 2мії, ї) глюкозо-6-фосфатізомеразу (КФ 5.3.1.9), кодовану геном раї, кю) фосфофруктокіназу (КФ 2.7.1.11), кодовану геном рікА, л) фруктозобіфосфатальдолазу (Кф 4.1.2.13), кодовану геном а, м) гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназу (Кф 1.2.1.59), кодовану геном дар, н) фосфогліцераткіназу (КФ 2.7.2.3), кодовану геном рак, о) піруваткіназу (КФ 2.7.1.40), кодовану геном рук, п) Е1-субодиницю піруватдегідрогенази (Кф 1.2.4.1), кодовану геном асеЕ, р) фосфоеєнолпіруваткарбоксилазу (Кф 4.1.1.31), кодовану геном ррс, с) піруваткарбоксилазу (Кф 6.4.1.1), кодовану геном рус, бо т) аконітазу (КФ 4.2.1.3), кодовану геном асиі, і у) ізоцитратдегідрогеназу (КФ 1.1.1.42), кодовану геном іса.

Поняття "посилення" ("підвищення") включає здійснення мір, які забезпечують надекспресію, і застосування варіантів, які мають збільшену каталітичну активність в порівнянні з білком дикого типу.

Найбільш краще посилюють один або кілька ферментів, обраних із групи, яка включає глутаматдегідрогеназу, глутамат-М-ацетилтрансферазу і ацетилглутаматкіназу.

Додаткові перераховані маніпуляції, спрямовані на ослаблення, можна поєднувати з додатковими маніпуляціями, спрямованими на посилення.

Інструкції із застосування ДНК, розщеплення і лігування ДНК, здійснення трансформації і відбору трансформантів можна знайти серед іншого у відомому керівництві Затьгоок і ін., "МоїІесшаг Сіопіпа: А І арогаїюгу Мапиа!", 2-е вид., вид-во Соїд Зргіпд Нагбог І арогаїогу Ргев5, 1989.

Рівень експресії або надекспресії можна оцінювати шляхом вимірювання кількості або концентрації мРНК, транскрибованої з гена, шляхом визначення кількості або концентрації поліпептиду і шляхом визначення рівня ферментативної активності.

Кількість МРНК можна визначати, серед іншого, за допомогою методів "Нозерн-блотингу" і кількісної ЗТ-ПЛР. При проведенні кількісної ЗТ-ПЛР перед полімеразною ланцюговою реакцією здійснюють зворотню транскрипцію. Для цієї мети можна застосовувати, наприклад, систему

ПопСусіе!"М фірми Коспе Оіадпозіїс5 (фірма Воейгіпдег Мапппеїйт стр, фірма Коспе МоїІесшаг

Віоспетіса!5, Маннгейм, Німеччина), як описано в Уипдулігй і ін., РЕМ5 Місгобіоіоду І ецЦег5 281, 2008, сс. 190-197. Концентрацію білка можна визначати шляхом фракціонування білка методом 1- ї 2-мірного гель-електрофорезу і наступною ідентифікацією концентрації білка в гелі оптичними методами з використанням відповідного програмного забезпечення для здійснення аналізу. В якості загального методу приготування гелів, які містять білок, у випадку застосування коринеформних бактерій і ідентифікації білків можна застосовувати процедуру, описану в Нептапп і ін., ЕІесігорпогевіб5, 22, 2001, сс. 1712-1723. Концентрацію білка можна визначати також за допомогою гібридизації по методу Вестерн-блотингу з використанням антитіла, специфічного у відношенні призначеного для виявлення білка (ЗатюогоокК і ін.,

Моїесшіаг сіопіпд: а Іарогаїогу тапиаї, 2-е вид., вид-во Соїй Зргіпу Нагбог І арогаїюгу Ргев5, Соїа

Зо зЗргіпд Нагрог, М.У., 1989), і наступного аналізу оптичними методами з використанням відповідного програмного забезпечення, призначеного для визначення концентрації (І опашцзх і

Меуєег, Віозрекігит 5, 1998, сс. 32-39; І оївреїсп, Апдемжапаге Спетіє 321, 1999, сс. 2630-2647).

Для одержання І-орнітину сконструйовані бактерії можна культивувати безупинно (як описано, наприклад, в УМО 05/021772) або з перервами за допомогою періодичного процесу (культивування партій) або періодичного процесу з підживленням або періодичного процесу з повторним підживленням (наприклад, як описано в 5 6562601). Огляд загальних принципів, на яких засновані відомі методи культивування, можна знайти в підручнику СПптієеї,

ВіоргогеввіескпіК ІВіоргосе55 Тесппоіоду|, 1. ЕіпіиНгипа іп аіє Віомепнантепвівснпік Питодисіоп о

Віоргосе55 Епдіпеегіпо|, вид-во сивзіам Різспег Мегіад, Зішйодагі, 1991, або в підручнику Біогпав,

Віогеакіогеп ипа регірпеге Еїіпгіспіипдеп (ІВіогеасіог5 апа Регірпега! Едиїртепі|, вид-во Мієу'ед

Мепад, Вгайпзспмеід/Мівезрадеп, Септапу, 1994.

Призначене для застосування культуральне середовище або ферментаційне середовище повинно задовольняти відповідним чином вимоги, які залежать від конкретних штамів. У керівництві "Мапа! ої МеїШйоО5 їог Сепега! Васіегіоїюду" Американського суспільства бактеріологів (Умазпіпдіоп 0.С., ОСОБА, 1981) наведений опис культуральних середовищ для різних мікроорганізмів. Поняття "середовище для росту", "культуральне середовище" і "ферментаційне середовище" або середовище використовуються взаємозамінно.

Як джерело вуглецю можна використати цукри і вуглеводи, такі, наприклад, як глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, меласса, розчини, які містять сахарозу, одержані в результаті обробки цукрового буряка або цукрового очерету, крохмаль, гідролізат крохмалю і целюлозу, олії і жири, такі, наприклад, як соєва олія, соняшникова олія, арахісова олія і кокосовий жир, жирні кислоти, такі, наприклад, як пальмітинова кислота, стеаринова кислота і лінолева кислота, спирти, такі, наприклад, як гліцерин, метанол і етанол, і органічні кислоти, такі, наприклад, як оцтова кислота або молочна кислота.

Серед цукрів кращими є глюкоза, фруктоза, сахароза, суміші глюкози і фруктози і суміші глюкози, фруктози і сахарози. Найбільш кращою є, якщо це можливо, сахароза.

Серед спиртів кращим є гліцерин.

Як джерело азоту можна використати органічні сполуки, які містять азот, такі як пептони, дріжджовий екстракт, м'ясний екстракт, солодовий екстракт, кукурудзяний екстракт, соєве бо борошно і сечовина, або неорганічні сполуки, такі як сульфат амонію, хлорид амонію, фосфат амонію, карбонат амонію і нітрат амонію. Джерела азоту можна застосовувати індивідуально або у вигляді суміші.

Як джерело фосфору можна використати фосфорну кислоту, первинний кислий фосфат калію або вторинний кислий фосфат калію, або відповідні солі, які містять натрій.

Крім того, культуральне середовище може містити солі, наприклад, у формі хлоридів або сульфатів металів, таких, наприклад, як натрій, калій, магній, кальцій і залізо, такі, наприклад, як сульфат магнію або сульфат заліза, які необхідні для росту. І, нарешті, крім вказаних вище субстанцій можна застосовувати незамінні фактори росту, такі як амінокислоти, наприклад, гомосерин, і вітаміни, наприклад, тіамін, біотин або пантотенову кислоту.

Вказані вихідні продукти можна додавати в культуру у вигляді однієї партії або здійснювати відповідним чином підживлення в процесі культивування.

Значення рН культури можна контролювати відповідним чином шляхом застосування основ, таких як гідроксид натрію, гідроксид калію, аміак або водний розчин аміаку, або кислот, таких як фосфорна кислота або сірчана кислота. Як правило, рН доводять до значення, яке становить від 6,0 до 8,5, краще від 6,5 до 8. Для контролю піноутворення можна застосовувати протипінні засоби, такі, наприклад, як ефіри жирної кислоти і полігліколю. Для підтримки стабільності плазмід можна додавати в середовище придатні субстанції, які мають виборчу дію, такі, наприклад, як антибіотики. Ферментацію краще здійснюють в аеробних умовах. Для підтримки таких умов у культуру вводять кисень або киснемісні газові суміші, такі, наприклад, як повітря.

Можна застосовувати також рідини, збагачені пероксидом водню. При необхідності ферментацію здійснюють при надлишковому тиску, наприклад, при надлишковому тиску, який становить від 0,03 до 0,2 МПа. Температура культури звичайно становить від 20 до 452С і краще від 25 до 40 "С, найбільш краще від 30 до 37"С. У випадку періодичних процесів культивування продовжують доти, поки не утвориться достатня для виділення кількість необхідного І-орнітину. Як правило, для досягнення цієї мети потрібно від 10 до 160 год. У випадку безперервних процесів може знадобитися здійснювати культивування протягом більш тривалих проміжків часу. У результаті активності бактерій відбувається збагачення або підвищення концентрації (нагромадження) І -орнітину у ферментаційному середовищі.

Приклади придатних ферментаційних середовищ описані, серед іншого, у патентах Р

Зо 43010996 ВА (для В. 5,ибБій5), О5 3668072 А (для Е. сої) і УР 57041912 В (для В. Памит).

Об'єм ферментаційного середовища в процесі, пропонованому у винаході, може становити при необхідності2 0,5 л, 21 л, 2 5 л, 210 л, 2 50 л, 2 100 л, 2 500 л, 2» 1000 л, краще 2 1 л, більш краще 2 10 л, ще більш краще 2 100 л і найбільш краще 2 1000 л.

Для визначення концентрації І-орнітину в один момент часу або кілька моментів часу в процесі ферментації можна аналізувати його вміст шляхом виділення І-амінокислот за допомогою іонообмінної хроматографії, краще катіонообмінної хроматографії, з наступною постколонковою дериватизацией з використанням нингидрина відповідно до методу, описаному в 5расКтангп і ін., Апаїуїсаї Спетівігу 30, 1958, сс. 1190-1206. Для постколонкової дериватизації можна застосовувати орто-фталдиальдегід замість нінгідрину. Огляд публікацій, у яких описана іонообмінна хроматографія, наведений в РісКегіпд, /С.С, Мадаліпе ої Спготаїйодгарпйіс зсіепсе, 7(6), 1989, сс. 484-487.

Можна здійснювати також передколонкову дериватизацію, наприклад, з використанням орто-фталдиальдегіду або фенілізотіоціанату, і здійснювати фракціонування одержаних похідних амінокислот за допомогою зворотно-фазової хроматографії (3Ф), краще у формі рідинної хроматографії високого розрішення (РХВР). Такий метод описаний, наприклад, в

І іпагоїй і ін., Апаіуїіса! Спетівігу 51, 1979, сс. 1167-1174. Виявлення здійснюють фотометричним методом (абсорбція, флуоресценція).

Огляд методів аналізу амінокислот представлений серед іншого в підручнику Гойз5реїсі і 2гограв, "Віоапа!унк", вид-во 5реКкігит АКадетізспег Мепад, Неїдеїбегу, сСегтапу 1998.

Продуктивність процесів або ферментаційних процесів, пропонованих у винаході, відносно одного або декількох параметрів, обраних із групи, яка включає концентрацію І -орнітину (кількість І -орнітину, яка утворилась на одиницю об'єму), вихід І -орнітину (кількість І -орнітину, яка утворилась на одиницю поглиненого джерела вуглецю), утворення І -орнітину (кількість І1- орнітину, яка утворилась на одиницю об'єму в одиницю часу) і питоме утворення І -орнітину кількість І-орнітину, яка утворилась на одиницю сухої клітинної речовини або сухої біомаси в одиницю часу, або кількість І -орнітину, яка утворилась на одиницю клітинного білка в одиницю часу), або інших параметрів процесу і їхніх комбінацій, підвищують щонайменше на 0,595, щонайменше на 1 95, щонайменше на 1,5 95 або щонайменше на 2 95, у порівнянні із процесами або ферментаційними процесами із застосуванням бактерій, у яких не відбувається 60 надекспресія білка, яка має активність відносно експорту І-орнітину, або які не піддавали маніпуляціям з метою забезпечення надекспресії.

За допомогою ферментації одержують ферментаційний бульйон, який містить необхідний І - орнітин.

Потім продукт, який містить І -орнітин, запасають або одержують, або виділяють у рідкій або твердій формі.

Ферментаційний бульйон являє собою ферментаційне середовище або середовище для росту, у якому здійснювали культивування мікроорганізму протягом певного періоду часу і при певній температурі. Ферментаційне середовище або середовища, застосовуване/застосовувані при ферментації, містить/містять усі субстанції або компоненти, які забезпечують виробництво

І -орнітину, і, як правило, розмноження і життєздатність мікроорганізму.

Після завершення ферментації одержаний ферментаційний бульйон містить відповідно: а) бактеріальну біомасу (клітинну масу), яка утворилася в результаті розмноження бактеріальних клітин, б) І -орнітин, який утворився в результаті ферментації, в) органічні побічні продукти, які утворилися в процесі ферментації, і г) компоненти ферментаційного середовища, яке застосовувалося, або вихідних продуктів, наприклад, вітаміни, такі як біотин, або солі, такі як сульфат магнію, які не були поглинені в процесі ферментації.

До органічних побічних продуктів відносяться субстанції, які були зроблені бактеріями, застосовуваними для ферментації, крім І-орнітину, і які необов'язково були вивільнені. Вони включають також цукри, такі, наприклад, як трегалоза.

Ферментаційний бульйон видаляють із резервуара для культивування або ферментаційного бака, необов'язково збирають і використовують для одержання продукту в рідкій або твердій формі, який містить І-орнітин. Для позначення цієї операції застосовують також вираз "виділяють продукт, який містить І -орнітин". У найпростішому випадку виділений продукт являє собою сам ферментаційний бульйон який містить І-орнітин, який був видалений з ферментаційного бака.

Концентрацію або очищення І-орнітину з ферментаційного бульйону здійснюють за допомогою однієї або декількох процедур, обраних із групи, яка включає:

Зо а) видалення від часткового (від » 0 до « 80 95) до повного (100 95) або практично повне видалення (2 80 95, 2 90 95, 2 95 96, 2 96 95, 2 97 905, 2 98 95 або від 2 99 до « 100 95) води, б) видалення від часткового (від » 0 до « 80 95) до повного (100 95) або практично повне видалення (2 80 95, 2 90 95, 2 95 96, 2 96 95, 2 97 905, 2 98 95 або від 2 99 до « 100 95) біомаси, яку необов'язково інактивують перед здійсненням видалення, в) видалення від часткового (від » 0 до « 80 95) до повного (100 95) або практично повне видалення (2 80 95, 2 90 95, 2 95 95, 2 96 95, 2 97 90, 2 98 95 або від 2 99 до « 100 95) органічних побічних продуктів, які утворилися в процесі ферментації, і г) видалення від часткового (від » 0 до « 80 95) до повного (100 95) або практично повне видалення (2 80 95, 2 90 95, 2 95 95, 2 96 95, 2 97 95, 2 98 95 або від 2 99 до « 100 95) компонентів ферментаційного середовища, яке застосовувалося, або вихідних продуктів, які не були поглинені при ферментації. Таким шляхом виділяють продукти, які мають необхідний вміст І - орнітину.

Видалення від часткового (від » 0 до « 80 95) до повного (100 95) або практично повне видалення (2 80 95, 2 90 95,2 9595, 2 96 95, 2 97 95, 2 98 95 або від 2 99 до « 100 95) води (процедура а)) називають також сушінням.

В одному з варіантів здійснення способу, повне або практично повне видалення води, біомаси, органічних побічних продуктів і непоглинених компонентів ферментаційного середовища приводить до одержання продукту, який містить І-орнітин, в чистій формі (2 80 мас. 9о або 2 90 мас. 95) або високоочищеній формі (2 95 мас. 95, 2 97 мас. 9о або 2 99 мас. 95). З існуючого рівня техніки відомі численні технічні інструкції відносно здійснення процедур, вказаних у підпунктах а), б), в) або г).

У випадку амінокислоти І -орнітину або її солей з існуючого рівня техніки відомі в основному три різних продукти.

До однієї із груп відноситься І-орнітин"НСІ, в цьому випадку ІГ-орнітин очищають з ферментаційного розчину після видалення клітин за допомогою іонообмінника і потім кристалізують за допомогою кристалізації у вигляді монохлориду І-орнітину (05 2988489).

Одержаний в такому випадку І -орнітин- НС. має ступінь чистоти більше ніж 90 95, краще більше ніж 95 95, ще більш краще більше ніж 98 95, і найбільш краще більше ніж 99 95.

Інший процес описаний у заявці на патент ЕР 1995322. У ньому ферментаційний бульйон, 60 який містить біомасу, вносять наверх слабкокислого іонообмінника з діаметром часток » 300 мкм ії на цій стадії роблять очищення І-орнітину. Вибираючи відповідний діаметр часток, попереджають блокування смоли біомасою. Ефективність видалення клітин становила 99 95.

Потім очищений І-орнітин можна використати для одержання різних солей І -орнітину, таких, наприклад, як моно- або ди-І -орнітин-(-кетоглутарат, І -орнітин-Ї -аспартат і т.д.

В ЕР 0477991 описаний, наприклад, процес одержання І -орнітин-І -аспартату. Відповідно до цього процесу додають до водного розчину І! -орнітину і І -аспартату водорозчинний розчинник до одержання розчину, насиченого щонайменше на 9095, або перенасиченого розчину.

Одержаний розчин витримують при температурі дефлегмації до завершення утворення кристалів. Потім продовжують додавати при температурі дефлегмації розчинник, який змішується з водою, до формування кристалів солі. Кристали можна видаляти, наприклад, шляхом центрифугування, і потім сушити у вакуумі. Чистота продукту, як правило, становить більше 98,5 95.

В УР 46003194 описаний процес одержання І -орнітин-і! -сетоглутарату. Відповідно до цього процесу орнітин І-орнітину"НСІ перетворюють у вільну основу шляхом адсорбції з використанням кислого іонообмінника іелюції з використанням водного розчину аміаку, додавання са-кетоглутарату і випарювання розчину у вакуумі до кристалізації продукта.

Плазміду РЕСЛУ5ЗЕ депонували у формі штаму Ез5спегіспіа соїї ОНЗаІрпа/рЕСЛУЗЕ (0М2204) відповідно до Будапештського договору в Німецькій колекції мікроорганізмів і клітинних культур (05М42, Брауншвейг, Німеччина) під реєстраційним номером Ю5М 23239 15 січня 2010 р.

Приклади

Приклад 1

Клонування і секвенування гена ІУуУзЕ зі штаму Согупебасієгічт дішатісит АТСС 13032

Ген ІуУ5Е зі штаму АТСС13032 клонували в біфункціональному (Е. соїЇ/С. дішатісит) і експресійному векторі РМУМЕХ1 (Реїтег5-УМепаїзсн і ін., У. Мої. Місгобіо!. Віотесппої., 3(2), 2001, сс. 295-300).

Процес клонування складався із двох стадій. Спочатку за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) ампліфікували ген зі штаму Согупебасієегічт дішатісит АТСС13032 з використанням представлених нижче олігонуклеотидних праймерів, створених на основі послідовності, яка представлена в 5ЕО ІО МО: 1. Вказані олігонуклеотиди включали додаткові

Зо сайти рестрикції на своєму 5'-кінці (підкреслені: ЕсоЕМ для ІуУ5зЕ 1.р і Амг або З5рі для

ІУ5Е 2.р).

ІУ5Е 1.р: У-ІПСаАТАТСАТИаСАААТСТТСАТТАСАСС|-3" (див. БЕО ІО МО: 22);

ІУ5Е 2.р: -БЇТИАССТАССТСААТАТТ ТасСИЯСО,ААСпассСАССсТІД|-3" (див. 5ЕО ІЮ МО: 23).

Реакцію ПЛР здійснювали в присутності 200мкМ дезоксинуклеозидтрифосфатів (дАтТФ, дЦтФ, дІТФ, дтТТФ), 0,5мкМ кожного відповідного олігонуклеотида, 100 нг хромосомальної ДНК штаму Согупебасієгічт дійшатіснт АТСС13032, 1/5 об'єму 5-кратного реакційного буфера НЕ і 0,02 од. /мкл ДНК-полімерази РпизіопФ Ної заг (фірма Віолут Зсіепіййс тр, 0-31840 Невз5,

Олдендорф) у термоосередку (Махзіегсусієг, фірма Еррепаогі АС, Гамбург) у наступних умовах: 982С протягом 1 хв; 30 циклів ((98 "С, 20 с; 63 С, 20 с; 72 "С, 40 с); 722С протягом 6 хв.

Одержаний у результаті ПЛР фрагмент ІуУбзЕ, який складається з 761 пари основ (див. зЕО

ІО МО: 3), клонували в РУУМЕХІ1 відповідно до описаного нижче методу:

Одержання вектора: 1 мкг плазмідної ДНК рРУМЕХІ розщеплювали у фермент-специфічній буферній системі, яка містить 10 одиниць ферменту Р5ї, за допомогою інкубації протягом 1 год. при 37 "С. Відразу після цього одержану в результаті розщеплення суміш обробляли з використанням набору Оціск Віспііпу (фірма Мем Епдіапа Віоїар5 СтЬН, Франкфурт-на Майні) відповідно до інструкцій виробника і потім очищали з використанням набору для очищення

Оіаєгхі! (фірма Оіадеп АС, Гільден, Німеччина) відповідно до інструкцій виробника. Потім попередньо оброблений таким шляхом вектор розщеплювали за допомогою 10 одиниць Хваї у вектор-специфічній буферній системі протягом 1 год. при 379С і після цього знову робили очищення з використанням набору для очищення Оіаєхії.

Одержання вставки: ПЛР;-фрагмент ІУзЕ розщеплювали за допомогою 10 одиниць кожного з ферментів АмгіЇ і ЕсоКМ і потім очищали з використанням набору для очищення Оіаєхії відповідно до інструкцій виробника.

Лігування: вектор і вставку змішували в молярному співвідношенні 1:5 і лігували з використанням ДНК-лігази ТА при 162С протягом 1 год. Хімічно компетентні клітини штаму Е. соїї

ОНвЗаїрна (Зибсіопіпд Ейісіепсу"М, |пмігодеп тб, Карлсруе, Німеччина) трансформували з використанням З мкл суміші для лігування. бо Ідентифікацію трансформантів здійснювали на основі їхньої стійкості до канаміцину на пластинах з І В-агаром, який містить 50 мкг/мл сульфату канаміцину. Плазмідну ДНК виділяли з 4 вказаних трансформантів і плазміди аналізували за допомогою рестрикційного аналізу відносно присутності вставки, яка представляє собою фрагмент довжиною 0,75 т.п.н.

Рекомбінантну плазміду, одержану таким шляхом, позначили як РУМУЕхХ1 ІУуУбЕ.

Нуклеотидну послідовність фрагмента довжиною 0,75 т.п.н., присутнього в плазміді рУМЕХ1-ІУ5Е, визначали методом термінації дидезокси-ланцюга, розробленого Заподег і ін.,

Ргосеєдіпд5 ої Ше Маїйопа! Асадету ої Зсіепсе5 ої Ше Опіей 5іасез ої Атегіса, 74, 1977, сс. 5463-5467. Для цієї мети здійснювали секвенування повної вставки плазміди рУУМУЕХхХ1 ІУзЕ з використанням олігонуклеотидних праймерів рУМ/ 1.р (5'-ТаА п4бОа САТ ААС ААТ ТТО АСА б- 3) і рУМ 2.р (3-СА бас СбСА ста! ААТ ТбОа АС-3) на фірмі Еигоїйп5 МУУС Орегоп Стр (Еберсберг, Німеччина).

Одержану нуклеотидну послідовність аналізували за допомогою програми Сіопе Мападег 9, і вона представлена в ЗЕО ІЮ МО: 20.

Приклад 2

Конструювання вектора рКівторзасвВ рагЕКСснН для здійснення делеції області аюеЕксн в

Согупебасієгійт ділшатісит

Для вказаної мети спочатку виділяли хромосомальну ДНК зі штаму С. дішатісит

АТСОСС13032 відповідно до методу, описаному в Таисі і ін., Ріаєтіа 33, 1995, сс. 168-179. Для одержання конструкції, яка містить делецію аг9ЕесН, були обрані представлені нижче олігонуклеотиди на основі послідовності гена агдеЕксонН С. дішатісит. Вказану конструкцію, яка містить делецію, створювали за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), більш конкретно, за допомогою методу Сепе 5ОБіпд (сплайсинг генів шляхом подовження з перекриванням (Сепе Зріїсіпд Бу Омегпіар Ехіепзіоп), Нопоп, МоїІесшаг Віотесппоіоду 3, 1995, сс. 93-98). адчеЕван а: 5-саатаватастдАассса аа АТ ТСТ Та САС АТ-3" (див. 5ЕО ІЮ МО: 24) а«чЕВан а2: 5-ААТ СТ ТАТ СаА бат Або Со Ста тас тта ТаА АСТ САТ А-3'

Зо (див. 5ЕО ІЮ МО: 25) а«чЕВан аз: 5-асеа ТА бат СОСА ТАА СА ТТ-3' (див. 5ЕО ІЮ МО: 26) а«чЕВан ад: 5-4дат пат АТ, САТ пат САТ сОаТ тоб пАА тат Та-3" (див. 5ЕО ІЮ МО: 27).

Вказані олігонуклеотидні праймери одержували від фірми Еигоїйп5 МУ Орегоп стрн (Еберсберг, Німеччина). ПЛР здійснювали з використанням ДНК-полімерази Рпи5іоп? Ної Загі (фірма Віогут Зсіепійс Стр, 0-31840 Нез5, Олдендорф) у термоосередку (Мазіегсусіег, фірма

Еррепадогі АС, Гамбург).

Праймер агЕкоОНн й2 складався із двох областей. Одна частина нуклеотидної послідовності комплементарна області, яка простирається від 1-ї пари основ, яка знаходиться проти ходу транскрипції, до 19-ї пари основ, яка знаходиться по ходу транскрипції, відносно стартового кодона гена агон. Інша частина нуклеотидної послідовності комплементарна області, яка простирається від нуклеотида 1419 гена агдН до нуклеотида 5, розташованого по ходу транскрипції відносно гена аган.

За допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з використанням праймерів аднЕкон 1 ї аюЕконН 2 можна ампліфікувати фрагмент ДНК довжиною 543 пар основ, а з використанням праймерів агюЕконН 3 ії аюЕкоОН 4 можна ампліфікувати фрагмент ДНК довжиною 513 пар основ. Амплікони одержували за допомогою ПЛР, аналізували методом електрофорезу в 0,8 У5-ому агарозному гелі, виділяли з агарозного гелю з використанням набору для очищення ПЛР-продуктів Нічпй Риге РСК Ргодисі Ригійсайоп Кіїї (номер продукту 1732676, фірма Коспе Оіадповіїс5 (зЗтрнН, Маннгейм, Німеччина), і застосовували як матрицю для наступної ПЛР із використанням праймерів агоекоНн 1 і агоЕкоН 4. Таким шляхом створювали похідну довжиною 1036 пар основ, яка має делецію багоЕКснН (див. також 5ЕО 10

МО: 21). Вказана конструкція включала 477 пар основ 3'-кінцеві області гена аго, 19 пара основ

Б-кінцевої області гена агуд, 15 пара основ 3'-кінцевої області гена агдО і 420 пар основ 5'- кінцевої області рамки зчитування с91589. Ампліфікований таким шляхом продукт аналізували методом електрофорезу в 0,8 Уо-ному агарозному гелі. 60 ПЛР-продукт багдаекоОН довжиною 1,04 т.п.н. (ЗЕ ІЮ МО: 21) повністю розщеплювали ферментами Маеї ії М5іЇ. Потім фрагмент очищали за допомогою набору для очищення ПЛР- продукту (фірма Оіадеп, Гільден, Німеччина).Похідна, яка має делецію багдеЕкснН, попередньо оброблена таким шляхом, застосовували в поєднанні з мобілізованим клонуючим вектором рК1ТвіторзасвВ (5спагег і ін., Сепе 14, 1994, сс. 69-73) для лігування. Вказаний клонуючий вектор попередньо повністю розщеплювали за допомогою рестриктаз Хбра! і Р5іИ. У результаті одержували кінці ДНК, сумісні з кінцями вставки, створеної шляхом розщеплення за допомогою мае! ї М5зії. Одержаний таким шляхом вектор змішували із фрагментом багдаЕксонН у молярному співвідношенні 1:5 і здійснювали лігування з використанням ДНК-лігази Т4 (фірма Атегепат-

РІпагтасіа, Фрейбург, Німеччина) при 162С протягом 1 год. Хімічно компетентні клітини штаму Е. сої ОНбаїрпа (Зирсіопіпуд ЕйПісівєпсу"м, фірма Іпмігодеп тр, Карлсрує, Німеччина) трансформували з використанням 3 мкл суміші для лігування. Трансформанти ідентифікували на основі їхньої стійкості до канаміцину на пластинах з І В-агаром, які містять сульфат канаміцину в концентрації 50 мкг/мл. Плазмідну ДНК виділяли з 4 трансформантів (набір

ОІАргер Зріп Міпіргер фірми Оіадеп (Гільден)), і плазміди аналізували за допомогою рестрикційного аналізу відносно присутності вставки, яка представляє собою фрагмент довжиною 1,04 т.п.н. Одержану таким шляхом рекомбінантну плазміду позначили як рК1т8торзасв раг9ЕконН. Штам був позначений як Е.соїї ОНбаІрпа/рК1вторзхас БагчоЕкон.

Нуклеотидну послідовність фрагмента довжиною 1,04 т.п.н. (ЗЕО ІЮО МО: 21) у плазміді рК1т8торзхасвВ БагЕкоОН визначали методом термінації дидезокси-ланцюга, розробленого заподег і ін., Ргосеєдіпд5 ої Ше Маїопа! Асадету ої Зсіепсе5 ої їе Опйеа 5(агез ої Атегіса, 74, 1977, сс. 5463-5467. Для цієї мети секвенували повну ставку плазміди рКівторзасв БбагдЕкон з використанням праймерів М13 ипі (-21) (5'- ТАТ АДА Або Аба по АСТтТ-3") і М13 гем (-49) (5- ада бас АТА АСА АТТ ТСА САС АО(-3") на фірмі Еигоїйп5 МУ Орегоп (Еберсберг,

Німеччина) і тим самим пеервіряли її правильність.

Приклад З

Одержання штаму Согупебрасіегішт дішатісит АТСС 13032 БбагсФЕкон

Вектор, вказаний у прикладі 2, а саме рКівторзхасвВ рагЕксоН, встроювали шляхом кон'югації відповідно до протоколу, розробленого Зспагег і ін., дхоигпаї ої Місгобіоіоду 172, 1990, сс. 1663-1666, у штам Согупебрасіегішт дішатісит АТСС13032. Для цієї мети вектором

Зо попередньо трансформували штам БЕ. соїї 517- 1 (5ітоп і ін., ВіоїесппоЇоду 1, сс. 784-791).

Вектор, який присутній в 517- 1, аналізували відносно його ідентичності аналогічно тому, як це здійснювали при виявленні в штамі Е. соїї ОНзаїрнпа (див. приклад 2).

Вектори рК1твторзасВв і рКтІвторзасвВ Баг9ЕксонН не можуть самореплікуватися в штамі С. дішатісшт АТСС13032 і залишаються в клітині тільки в тому випадку, коли вони інтегровані в хромосому за допомогою рекомбінації. Клони з інтегрованою рК1івторзасВ рагдчЕкоен відбирали шляхом висівання кон югованої суміші на І В-агар (Затьгоок і ін., Моїесшціаг Сіопіпд: А

І арогаїогу Мапиаї, 2-е вид., вид-во Соїй 5ргіпд Нагрог, Мем/ МогК, 1989), доповнений 15 мг/мл канаміцину і 50 мг/мл налідиксової кислоти. Одержані клони стряхували на І В-агарові пластини, які містять 25 мг/мл канаміцину і інкубували при 332С протягом 16 год. Мутанти, з яких плазміда була вирізана в результаті другого етапу рекомбінації, відбирали шляхом культивування клонів у рідкому І В-середовищі без здійснення селекції протягом 20 год., потім їх стряхували на І В- агар, який містить 10 95 сахарози, після чого інкубували протягом 24 год.

Плазміда рКі'вторзасвВ БагдЕкКеснН містила аналогічно вихідній плазміді РК1Т8тобБзасВ крім гена, який обумовлює стійкість до канаміцину, копію гена 5асВв, який кодує левансахарозу

Васіїйи5 зи!ибБій5. Індукована сахарозою експресія приводила до утворення левансахарози, яка каталізує синтез продукту левану, токсичного для С. дішатісит. Внаслідок цього тільки ті клони, з яких вирізана інтегрована плазміда рК1ів8тобзасвВ БагуЕксН, знову здобували здатність рости на І В-агарі, який містить сахарозу. Вирізання може полягати у вирізанні плазміди разом з повною хромосомальною копією агдеКснН або з неповною копією, яка має внутрішню делецію а«чЕВван.

Приблизно 40-50 колоній піддавали тестуванню відносно фенотипу "ріст у присутності сахарози" і "відсутність росту в присутності канаміцину". Для доказу того, що підданий делеції алель агдЕнксН зберігся в хромосомі, приблизно 20 колоній, які мають фенотип "ріст у присутності сахарози" і "відсутність росту в присутності канаміцину", аналізували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції відповідно до стандартного ПЛР-методу (див. Іппів і ін., РОК

РгоїосоІ5. А (зціде то Меїйтоай5 апа Арріїсайоп5, вид-во Асадетіс Ргев55, 1990). Для цього ампліфікували із хромосомальної ДНК колоній ДНК-фрагмент, який містить області, які оточують вилучену в результаті делеції агдЕРвсН-область. Для ПЛР обрані наступні олігонуклеотидні праймери: (510) адексон ат (ЗЕО ІЮ МО: 24):

5-сат аст асСст да со асо АТТ ТСТ Та САС АТ-3" адеЕкон а4(5ЕО ІЮ МО: 27): 5-4дат пат АТО, САТ ОТ САТ ат ТО САА тат Та-3".

У контрольних клонах, які містять повний локус агЕкоОН, праймери дозволяли ампліфікувати ДНК-фрагмент довжиною приблизно 5,35 т.п.н. У клонах, в яких локус адекон був вилучений шляхом делеції, у результаті ампліфікації одержували ДНК-фрагменти довжиною приблизно 1,04 т.п.н.

Ампліфіковані ДНК-фрагменти ідентифікували за допомогою електрофорезу в 0,8 9У5-ому агарозному гелі. За допомогою цього методу було продемонстровано, що штам мав хромосому, з якої був вилучений шляхом делеції алель агоєОН. Вказаний штам позначили як штам

Согупебасієгійт дішатісит Оейа асдФЕван.

Приклад 4

Експресія гена ІуУ5Е у штамі Согупебасіегічт дішатісит АТС 13032 Рейка агаєгван

Плазміду РУУУЕХ!Т ГУ5зЕ і "порожню" плазміду РМУМЕХІ встроювали шляхом електропорації (Наупез і ін., РЕМ5 Місгоріоіоду Гекнегв5, 61, 1989, сс. 329-334) у продукуючий І-орнітин штам

АТСС 13032 Оепйа агоеоН. Трансформанти ідентифікували на основі їхньої стійкості до канаміцину на пластинах з Сабто-агаром, який містить 25 мкг/мл канаміцину. Потім 5 індивідуальних клонів аналізували відносно правильності трансформованої плазміди. Для цієї мети виділяли плазмідну ДНК (набір для виділення плазмід, фірма Оіадеп) і одержану ДНК аналізували за допомогою рестрикційного аналізу відносно правильності схеми розщеплення.

Таким шляхом одержували штами С. дішатіснит АТСС 13032 Оепйа аг9ЕксНн/руУмЕХ1 У5Е і

АТСОСС 13032 Оейа адтЕван/руУмЕх1.

Приклад 5

Одержання І! -орнітину з використанням Согупебасієгішт діІшатісит

Для вивчення здатності продукувати І-орнітин здійснювали попереднє культивування в кожному випадку трьох клонів штаму АТСС 13032 Оейа адеЕкон/руУмЕХІ1 У5Е їі трьох клонів штаму АТС 13032 бейа аг9ЕкоНн/руУмЕХ!1 у кожному випадку в 10 мл тест-середовища при 332С протягом 16 год. Для аналізу продуктивності в кожному випадку інокулювали 10 мл тест- середовища одержаного попередньою культурою таким чином, що величина ОЩевоо (оптична

Зо щільність при 600 нм) на початку експерименту становила 0,1. Кожний клон тестували в трьох колбах, які струшували, таким чином, у відповідний момент часу збору для кожного штаму аналізували вміст у цілому дев'яти колб, які струшували. Тест-середовище було ідентичне середовищу СЯОХІЇ, описаному в Кеїйпацег і ін., Уоигпаї ої Васіегіоіоду, 175, 1993, сс. 5593-5603, але додатково містило 7,5 г/л дріжджового екстракту (фірма Оіїсо), 25 мкг/мл канаміцину, їмММ

ІПТГ (ізопропіл-бета-О-тіогалактопіранозид) і 40 г/л сахарози замість глюкози. Для наочності склад тест-середовища узагальнений в наведеній нижче таблиці 2.

Таблиця 2 кислота (МОР5Б) допомогою Маон)

Культивування здійснювали в колбах, які струшували, місткістю 100 мл при 339С і 200 об/хв.

Відхилення шейкера становило 5 см. Через 24 і 48 год. збирали по три культури клону. Для цієї мети з культур брали зразки і визначали оптичну щільність, вміст сахарози і вміст І -орнітину.

Для визначення вмісту сахарози і вмісту І-орнітину клітини видаляли шляхом короткочасного центрифугування (настільна центрифуга типу 54150 (фірма Еррепдог) при 13000 об/хв протягом 10 хв при кімнатній температурі).

Оптичну щільність визначали при довжині хвилі 660 нм за допомогою фотометра для титраційних мікропланшетів СЕМіов5 (фірма Тесап, Рідинг, Великобританія). Зразки розводили в співвідношенні 1:100 демінералізованою водою перед здійсненням вимірювання.

Вміст сахарози визначали за допомогою системи аналізу (каталожний Мо 10 716 251 035) фірми К-Віорпагтт АС (Дармштадт, Німеччина). При використанні вказаного підходу здійснюють інверсію сахарози і глюкозу, яка утворилася, виявляють за допомогою аналізу з використанням спільно іммобілізованих ферментів (гексокіназа/гллюкозо-6-фосфатдегідрогеназа) по утворенню

НАД'Н.

Кількісне визначення концентрації амінокислоти поза клітиною, а саме в супернатанті культури, здійснювали за допомогою РХВР зі зворотною фазою (ІГіпагоїй їі ін., Апаїуїісаї

Спетівзігу 51, 1979, сс. 1167-1174) з використанням пристрою для РХВР серії НР1100 (фірма

Немлейн-РаскКага, Вальдбронн, Німеччина) із приєднаним флуоресцентним детектором (51321А); керування системою і аналіз даних здійснювали за допомогою станції НР Спетеїайоп (фірма

Неулей-РаскКага). 1 мкл розчину амінокислоти, яка підлягає аналізу, змішували в автоматичному пристрої для передколонкової дериватизації з 20 мкл готового для застосування реагенту орто- фталальдегід/2-меркаптованолу (фірма Ріегсе Еигоре ВУ, Оуд-Бейерланд, Нідерланди).

Утворені флуоресцентні тіо-заміщені ізоїндоли (опевз і ін., Уоигпаї ої Спготаїйодгарвпу, 266, 1983, сс. 471-482) піддавали фракціонуванню на комбінації передколонки (40 х 4 мм НурегзіїЇ ОО5 5) і основної колонки (Нурегхі 005 5, обидві колонки одержували від фірми С5-Спготаїйодгарніє

Зегмісе зтрН, Лангерве, Німеччина) з використанням градієнтної програми зі зростанням неполярної фази (метанол). У якості полярного елюєнта застосовували ацетат натрію (0,1М; рн 7,2); швидкість потоку становила 0,8 мл/хв. Флуоресценцію дериватизованих амінокислот

Зо виявляли при довжині хвилі збудження 230 нм і довжині хвилі випущення 450 нм. Концентрації

І-орнітину і/або гідрохлориду І-орнітину розраховували на основі порівняння із зовнішнім стандартом і І -аспарагіном, який служить у якості додаткового внутрішнього стандарту.

Молекулярна маса гідрохлориду І -орнітину становить 168,6 г х моль", молекулярна маса І - орнітину становить 132,1 г х моль".

Вихід розраховували шляхом розділення кількості І -орнітину, яка утворилась, (виміряної по кількості гідрохлориду І -орнітину) на кількість поглиненої сахарози.

Результати представлені в таблиці 3.

Таблиця 3: Утворення І -орнітину після інкубації протягом 24 год (таблиця ЗА) і 48 год (таблиця ЗБ).

Таблиця ЗА

Утворення І -орнітину після інкубації протягом 24 год

Скорочення: символ " позначає АТОС 13032 Река аг9оЕксон; Огп-НСІ позначає гідрохлорид

І -орнітину

Таблиця ЗБ

Утворення І -орнітину після інкубації протягом 48 год

Штам От-НОЇ Вихід оп г/л г/г "ТММ ЕХ 15,5020,74 0,365-0,01 11,69:-1,40 "ЮМУМЕХ1, 1УЗЕ 18,48:-0,51 0,425-0,01 9,18:0,48

Скорочення: символ " позначає АТОС 13032 Река аг9оЕксон; Огп-НСІ позначає гідрохлорид

І -орнітину

Приклад 6: Секвенування і депонування плазміди РЕС7ІУЗЕ

Плазміду РЕС7УЗЕ одержували у формі водного розчину від д-ра І оїйаг Еддеїїпуд (фірма

Еогзспипд5гепігит шїсй сітЬН, 0-52425, Юліх), автора-кореспондента публікації ВейПтапп і ін.,

МісгобіоІоду, 147, 2001, сс. 1765-1774.

Аліквоту одержаного розчину ДНК використали для трансформації компетентних клітин штаму ОНбаїрпа ЕзспПегіспіа соїї (Зибсіопіпд Ейпісіепсу"М, генотип: Е-Ф80іасгАМ15 Д(ІасимА- ан) 0169 гесАї епад1 пзан1т (иК-, тки) рпоА 5,ирЕ44 А- іпі-1 дугА9б геіАт), одержаного від фірми Іпийгодеп Стр (Пейслі, Великобританія) відповідно до інструкцій виробника. Відбір трансформантів здійснювали на Луріа-Бертані-агаре, доповненому 50 мкг/мол канаміцину.

Один трансформант, позначений як штам Езспегіспіа соїї ОНБ5аірпа/рЕС7УЗ Е(ОМ2204), був депонований відповідно до Будапештського договору в Німецькій колекції мікроорганізмів і клітинних культур (Оєеці5спе Заттіипд моп Мікгоогдапізтеп ипа 2еїКийигеп тб, Брауншвейг,

Німеччина) 15 січня 2010 р. під реєстраційним номером О5М 23239.

Послідовність плазміди рЕСЛУуУзЕ зі штаму О5М 23239 була повністю секвенована відповідно до договору на проведення секвенування (УмаїЇКіпд Зегмісе) на фірмі Еигоїп5 МУУС

Орегоп ОтрН (Мартінсрід, Німеччина). Послідовність РЕС7У5ЗЕ представлена в 5ЕО ІЮ МО: 29.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ хАїО ЕБвонік Пейусса ГмОоХ «І80» СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ Б-ОБНІТИНУ З ВИКОРИСТАННЯМ БАКТЕРІВ,

НАБЕКСПВЕСУЮЧИХ: «З30» 2бпз0031а «1Б5п о ськ раїепсІій Ууєквісні З. «іа» 1 «їх Та «гій «ДНЕ І «Рі Штаюш Сокуперассекіст інеатіснт АЕСОТ3032 «ех «веж стійс ЕФаките: китЕм 130)... (61 «ий комплементарний лавр збласті, яка кодує, регулиторного вена тузбу яка кодує СБідок- активатор пута «ВИХ «варі» лівзс беавбитяе я«еижУ 10203, 1800) чива» початок транежрийпції гека ту хивОх «жоїх сре «й МК: .11309) «ВИЗ область, яка кодме, рена іувЕ кап» Х сеспоусесав сЕсскасоЯоа сочаачачсо зававсесо авсстУсссв дЗайдевастая о аплесасваї споссочасва сеасаховас засздесцсве зедазсевав сстечадасих Та адахесевоп сдссассо: зесаатасве соасасеса всовекаксо сасствцая 15о чатсастспо себаесеста зсасуозоаче вустах ксооудпаадаа Фоссосавоє 240 васастксеч созааседсс свссвнавала пЕссочсочас засасавсоч вівсозсаОся БУ щовссосвов повссассоа сдедоссаїє саяавсвсоЯ соссссавася себто зво аспоегвчсть аздасзоадся шсдсадсосов воспадовес псаебравсса сдбвоцсата 25 спасвасоа Зачдавсасвза пОаЧссвасса спедевішиЕ сбсавоссеса стае вев яп ісоссчуссваса ацакевасть сесаЯЗаскасй счсхсссава: асабссссас псспасацева 585 йдасаажчея сопсчесепах серссавуцсЗ пазделеоадс ска сесвбас ссопацааде. БОС тасстсЯсза азсвсубуао далвассаєує дапакечстав ЕсеосоСков водсоавсате веб тТаасотачакт гсосвосавчов пессвевова воцсоссесЕа ЯсЕЕсЕЧсоКо Чевоасванає зо саснекссаст сохосЕкоса свазевоссве асосусктст цБЕЧевЕкац сепствазах тяО шслозасасо азгастссас сстасоссвся стсчазчассє Сбзасасоасу здастовосоє вк кчнсеачасаа зкадевазчх спавацечає Зсоткспавну сбассессяв сазечаєсов збо дадсвааціє сессвуєтоза содацессас дзадстатає сазасовеяє Бадзузаєста засо псахікеаст павчсесесс савауаувсаєс чабадсдаво ве дав аве сво я 1015

Мек 51: ТІїе РБе те 1 У аса зас да сто сту 935 чес ваг свв ков сво ес абс був сс Сад ХОБІ

ТЕ іч ех їєй пед сь вза бек без без ей бе її зі ко іп о зватї фра пбя пл ато заз свя зда ак сво со чна да скоса сс 115

Аза оУаї жмез Уаї їЗе Буз біл су тХе Пув Акч сіз Сіу Пен о їїв ДІЗ зах 35 я ост сс озера ба свт ев час ву БЕБ ех СЕС абс чес 9 усу чаї Цей бен оуаї Су без Ії деко Аво Маї впжЖ о пей Ре Іїв бїа Ху

СТ 4 Зх) асо с пе ЧЕ Яд бр ост сс ав сс Чоп сб абс дхф сс Чак 22

Так обейз бі ді Бас фей це Чек Ап ові Аза БЕа Кі Уві Пе Авр за БО 55 ахї атя бас За да че ас док Бас сб жта ел С дев зе ЗЕ ї255 тів Мес Аго Тгрозіу зіу Ії діа тую гео Бен; тер Бе Аїа Уаї Ме

ТО т ва ке пгвз' деп зва Час дет зіб впа айас авФб оче све пед сса сва вс вії 15395

Аїа вза Був Авройта меш тиж АБИ Зуб Узі 51 Алла Вхо бі її6е 116 ч з5 1095 чаа баз зга чаа соа асезчбя ссб чає дай збу сої ї5у бас дак все 135 зі: біс тТвЕ о Бви РКО ТЕ Уві РО АВ ОоАВротнк БУЄ Бех 03Уу ху це 1605 ТІО 115 зс3 зга се асо зас абсе сяЯс ав ся дез суд пся пай су свує ще. 1359

Віа ув Аїа Тих во тат Ату Ави дт Ухі Дта Уаї сьа Уві ет уд

Та М. 3 час вад свт сча ЗЕ зу чсба вач сте ва гта аа яса вес оЯ ше 1447

Авромув 51поАха Уа Ткро Мах ув Бгш Меб бепоМеб Аїа Іде тУаї їехм 125 ї4о 45 сш вза поз айс боб вас осо се сло дес деп БЕ фо бе оако ах Мао

Жлк отжроБес Ав вро дяп о АТа Тук сей Аве діа ББе Мак о вде Те ПТУ

М ї55 ї56 ІВ част Ес ЗЧос ЧОоб сва їве пас цає асо да сад сп зо бтс дубе до 543 сім та б1у діа іп орут ЗЕ» Ач ТНЕосіу Ак ТЕР ої1іе пе Аїа ді

ТО щт5 Інно дат озсту ко зсу зса або свя абс ка Є соб б За й яко допо 1551

Ф1у діа Ре Аїза Ала бвт бе) тів тТкровВБе веб цец чаї піу ББе обію їії5 130 195 са дов ча хе са сяє соч ска ше вле ссо заз 55 С сус ав ї639 вза іа дій том обек Ле о Бжо пев Бах Бак о Ртго мув Тай тео АК тТко а ри 210: йвс авае збе чес обр пса ЧК Ба во о нес за жо соб саке аай што т5Я7

Ті двпсуді гаї Уаї Дів УЮ УМ Ме тнх іа це дій щіє Буз'сьви

ЕЕ ко 225 аа Скот ака чес сво Кссссусадаа Сесеуачаєя чукедусесвс дсссавахає ше

Меї пей Меб сіу вл «сдесзссоце прсолтпцлавх акстсовісда ссасобосва сісзпсчеса щеаавсусся їн «Фест чЧаст ссавссвядч СсЕускокетпа чесстсвяс сувславооа ссаассваєо ІНЕ»

свскоЗеісас уатассеусою ссатаскевс Еасесде т901 ке В «11» 813 кій? ВВЕ «йіз» Шкам сокупевзастекійл зійсащісви ДРОСІЗаЗЕ кап й

Ме ім ЇІе ре тЇфе Тк обіу Бепі Без іше бСІіу Аза леж ред Пи гей

Її 5 їй Н зежх її8 -іу Его Зп АБ: Уві Гб Ууаї Ії Був ій у її Буш йХа

Р В КІ

Зіш Бі» ве їі1іж біз Уаї Пез оїеб Маї Сує Бе ї116 бек одяротаї РЕФ їєз ВБе її бів бу Тйх зе) бу Маі бар їею мезо Зет Дзп Дів Ата во 55 50 вто ї1їе Уаї Гемоаяр іМе Меб Аку ТЕР осіу БІу їі Аїа Тук Бені фенх а та 78 йо

Тр ре дій Уаї Мет Аза Дта- був взводів Мейб тТптх Двпомуз Маї БІ 85 зо Зх

Віа веб сій Ті Іїіе бій біб Тв біз реко Твх Маі Ро Азродве Тв 106 155 115

Бто ев біу бу Бех Аїв ам Аіа Тр вв Те бхч Ват Вже чаї вк 115 120 125

Часові) Уві бек уві Азроїмв бЗ1з Ах Уві Тк о Уаі ПУБ Бк Мековаец 138 55 та

Меї лів сів Маї це) ТЕ Тур орви Вп окко вази іа тує ї-а АБО ОВТ 14 150 БУХ То

Ре маї ВМе хів сту ші Уві Б31у Вів біз тує біу Аво рю сту Ага їх ла ї175 те Тів Ра дів АТ су вій Кре Аіз вій Бах їх Іі ТкроВве ра 180 185 т5 ем Уві БМу Впе Фбіу Азія Аа йМіа їзб МегоАку Бко ям Зек бек Его 155 о 205 ув МВ) Тор о Акоа Ттроїїз АвБлоУаї Уаї Уві Аїз Уві Маї Меб ТтвК Ата 16 215 ЕЙ ва о АТа т Бу зва оМмекК їв Ме с1У вв 788

«-2105 3 «ВТ 76у чиї» ДНЕ «83 «там Сетуперасєтсекійв Ффіотамісо тосту «ее чвеї» рРО-Фрагмент певно ТИВ «ай Я: 176 «ох З гслаєвісає цуазатосткє астасабасс Жестустоза зпссвауєсвк кеаскуснев 50 геучЧасстса дзассттаєто чочассанеас засопваксаа додосваччв сьсасодосу 195 хесттетсЯв ке савее ссссасотов же тотксат оурсодсвлое бедоавсевко 150 фЕесттссусєс саассесосс соочаксзсос єсдараєтає печессодчоє ддсатеасье 240 ассогастнка зер ссасє ЗзбоазсаЯесе звадасассвї засввесває чада З сатпезакизЕ сзавазався чвассоваєсу сбрссзаков саєчоссоба сосяцесед ї5О содобовсас гузсасасцє зассоддебує дочсозачає чадсдесяас ваздсвуєсоще ї2а сессдедаєа десспучска акчзсваєса сосбкавсста дектаасссу зажосатакх 18о сдоесасясу Бокекткакс бпесзсосся вдосусасзаєа садсоасасо сочасячетоа за сгсссошове гуссясЯсЕе депусавуєє сзуаксвачес сссессечеа часебедеся 05 падсассвих дусасдсоса стусссазсо ссвазутасч ассоточакс аасугодчсоя во саасваьчЕ чапозсста сСртосссасса авсбазезеє Загозаствя БеБесасоЗе 799 шжЕжЕксоваст чоатулесксс усесвавтак Єфасстафас в зх «дій» й «и 235 вій РЕЖ «кіл» Цжем Сотупебзастетіше зБоБатісстт В «ой крім Туз хаваз у. о

Я. в

Мет Уві Хі Меб 015 ї3в Еде фе ТБ бі Ппей Без с бва СІ Аза свех їх 5 То Що їеч Тен вБеи бег Іі ЄСту ЕКО бій Аві Уві Пец іаії тів бух біт Бі р 25 0

ТІ пУ5 Акч сій БІ ба ї1іе авіа Уа пе) ред баї Сує Пец їз1е З8вЕ та йгх

Авроуаї Ре Пец Ре 11 Аза бу Тех Бей бтіу Маї. Дар пе інцоЗех

БЕ 5 о двподія АТа Кто Ті Уаї Чез Азроїзе Меб Агу Ттр 0іу піу їЇїє вла

БА Та л5 3

Тут (ба сей ТкроБне діа Маї Меї діа Аа Тев АвроАїя Меб твЕ Ав 95 зх цтво ні сій дів св бій: тін їв бій сі5 твхошпхи го ТвЕ Уа оре 158 г 120

Авровар То Рго с цец б1у 51У бек Аа Узі Віа Тих Авр. Твк о Аку яп ї2и 125 пхз Уві Всо чаї БМі уа1 бек Майї Ар обу сіб йха Узі Ткроуаь КУ

І3О 133 185

Руб ет їм Мековіз ті Уаї їни тве Тер обем оАви БІО дао Ата тТух

Не ІЗО хх 159 пе АзроАзіа ве Уа вле її зі йіу чаї сіу Аха мій Тих О1у сао їх УК ї75

Тох біу дра Ткро її Бе діа Аза бі Аза Хе Аіа Аа ві беж 116

Ва 185 196 те ББе Бо пен уві БЕт не сі Аза АхХа й1із цем Вес АжЯ бро Бех ках 200 205

Шет БЕК РЕЖ тв чі тТсровкоа ТКЕе Ті Аа Уві Уві Чаї Ата та ма)

БЕН ре: йо

Меє ТВвж Ата цецп дія КТІіЄ ув Бе Меє св» МЕС буж оч ла 585 «Ох в «2115 3 прі СКАТ «ої Штам Сороперастевкізи йзісбзшщісйи ВТО сив «1 ЛЕ крах (1у5,.. 233 «ВО»

Мехс Б: Їіїя бає їі ТБ сіу їбш бем Іви біб віз Зах бей Бе Бех ї У 10 15

Зевк ті бьУ Бхо пібй Аа ав ем Уді зе Бу СІ БУ тів Му АХУ го 25 30 сті віу без їі дта Уві тей тей» Уві Су Бех їіе Зек Азр Уві вве ав

Іви рРБВе ів 213 бІУ Тих бец біу уУаї Авр цем рей бак Аза діа дів зи в Бо

Ехо Ії Маї реп Аврої18Ф Мех Ах Тхробіу бі І1їе Аза Тук Цевх шез

Та 75 ВО

Ттр вве Біа Чаї Мес Аіз Ага бує дя Віа Меї ТпЕ дей дув маж 5ів 85 За як віз жо бів ІТ ІТ Чій біо ТЕ біл РЕО ХВх Уві ро Авроваротне 166 їб5 то

РКО теп біу біУ бек о Аїа Маї Азія Тьт йзротнг ака Аво Ага уві Вид

ТБ зо 125

Зах ій Уа Зевс Ууаї Вер обу ЩА Ака УвМоТхе Збаї їд)ів Бу Меї це 139 135 455 мех Аїа ті Уа цем тих Тер оішц Ап о Бро Авл АтТа Тут о Пей АвроАТи 145 и 155 Ії Бо

Впе ма1ї Еце Бує щі бБіу маї! О1уУу Ата біз Бук сіб Ар отТнх БіУу Аа 155 175 5 їхв Її Бе Ді Аза віу Віа Бне Аїа Аїа Бех Пец Ії ТхроРБе Вга 180 185 ї9о іва таї біу кне діу ЛІ да Ата без беї АкЗ Рг ем бат век вха

ТУ опо У ув Уаї тре АКЯ Тр її ав омМаї чаї Маї діа Маї Уггі Ме оте Аїд 210 215 та бас АТа її був бе) о Меж рем мес. біт ха 280 «10» об «1» ТО єЄтуй МВК «2132 Штам сСотуперастекіст зінбавшіств ВТССТабЕТ

СЕ: стажі дув «вив 17. 08) «ай» 6 асодаваєсе ссаксбсасадчо кстастевка запдпосацес сет овероавс саєсодасод 5О безаавлсєвс базове сваа всааазааєо зачсасчаво частсаскас зач сотеве 170 чкстястква пектстдасає стека Єво аксосодасв сстваЗусеє сдатевскка їяй їеспахсчєсв сассаасесчу псоссдчасаєс втзспсхвоч згсасатече срасосасеа чо жоЧЕЕсцсоц жсабоусвас сеаввуаснос зкдасавзса асабадаває дссасечаєє 505 аскогсвасваї садавослає сссасссуає дасатуєськ вабусочевс досочедаєс ва вссззсвсчс фовассязої дсзчочсачаЗ чссаосовся асавосачсо пев. хо егеззасссаках сСчакччєсває савчскзасс Буде совасси сязаксотев ксбучасася 4во ккедиаЧкжка ссозсЗачЕ сазодозсав сассусовсав ссзузсзуєе час ай че заг ї9 З вс чувсадЕФф у З

Зсклоасасок безсудевач сссчуатосся ссесусбоє чу ссооа сусаоссваса. 502 етчЧісасдес соастчуссна сссоазеУча сусеуссЯда Беласассове сабуцевуве що зказсцасся сазбЯусєсяє савасечаєо Євлавоуч а то «вір 7 її» й33 «вір РАТ «213» Штам о сСогуперастекіса чмквтіси АТССІЗВЕВ «пох «Ей» Був «враз 11,3 хх 7

Меса» її вве Іі тТБЕоОСбвУ Ве Бо Бе біу Аза дек цей Твй їй ї к їб 5 дет Тіе бІу РЕо бі дв чаї фей Уві Те Був біп біу І1е їв АКе 25 Фо Зо ті сту ей Ї1їе АтТя Уаї їз Тєв таїо сув їєнх Іі Беж Авороуаї Зп пеп бле Її Аза 53У Р це; ші Чаї Арон о бе) бак дай Лів Ата

ВВ: 5 «0

РЕ її Уві Пе дво 112 Меїс Ака Тхросб1іУу бі 16 Ма БТух бей о тбец

Ед 75 но

Тхв ра діа Уві меж Діта вівоіїуа Авроаїа Меб ТВЖоАво ув Уві БІ

Я | зо Ко ака рхо бі її її БМК спа тТвх сій вЕБ ТВЖ Уаії Рто БовБ дер оту тоо ї10п5 116

БкОо пемобьу ому бек Діва туах Аїв ТП АзО Тве дк Аеб бар чаї сао 118 1-50 25

Маї Бра уві Бех ув Ав; о Буз піп Агу За) Тероуаї Бу Бко Меж ей

Мо 135 чо мес вія тів чаї цеа ТаЄєсСЕкробео Аяпо во Ави діастих їни Аз дів 155 15 155 ії6б0

Бпе мак Бе ї1е бфу ру Маї іу дів бІй Ту бтіу вро тик піу ВІ 18 ик ї75

ТЕБ ТА КИ Віа іа сіу дія вйе дів вів Зх Бей Щд3е ТЕЮроРНа Бсо ї8о То 80 їі маї бі це біу Аїш діа Аів йве бек ха Во ївю Зекобех го 135 ил) ВО

Був Уа1 Те АтЯ Тгв одів АЗб о Уа1ї Уаї Маї АТ Маї чаї Мес ті сАТа 210 215 285

Мет Аза їТїе Був їшй Ме Пе) Мек оту а 230 киїйМ я «1 бе «ріг ДНК -83132 Втам Ссохулеввстехуша пінсатісшв АТОССУВОСВ. «из «ак» зу сви (1..(705 «4005 В зІЧсавзаксь бсаттасвяЗ КеЄсуєтевся ЯЗасосачес ТЕСтаскуєс саксудаєса У сазавісссвс сич опасав ас«вчдавио аасопусуаего засксаксає зЗакесепике 120 стасуєєтав сіБстдасдт СсТтВЄсерЕс аїодеосацев сстсодасЯв таакосЕЕтУ ї80 ессазесасоч сусечаєсяє дсгсзавкаке вкусусєтачеа зсзусавече ссвессеаюя хай кадквкдсся гсазбодсаодо Чавадасцос абцасвеасй вадесяваче зуспсасачате БІВ асчазазав сеуазссаво себасоспво пасвсчессЕ пасаусзасіо чес 35 зекуасавус совасосцаае чсзоусшовго пбчадеався агаяпевасу зЗабебоцЧеви 420 вадесовеої буатозсває себпсодвос гугл авсс сдвасуєсева екодцапасо «в тгтатцвстя ксоаспзсЗ Сопсссвсва басодсзаса ссчоасезеа засво 51 чесазчессЯє бсоссодсвач себласству тессзстов Барі ксоЯ сосацевцев ей

Едбсасоюс спосдбссад ссосяацеєх єзоасзссузта бсаасльсоє сободсачнх Би чЕсасзЗасеся светцассав саавосаасо косвкочЧчате зу 702 ще я «21ї2 298 «Ек РЕ «Віз3» Штам сСеокупераєтекійт естісівца ТЯ» кет» кхасгТ2 БуБЕ «ВИМ СР. ИвВ) «аб» 8

Мек біз І16 Вде чаї ТЕ Б5ІУ Мей ес їй ЗіУ Аза бек беш певі Би ї 5 19 ї5 діа тіє Бі БкО пій Авв о Маї без уві ї1е зу БІБ БІ» 3їе ПУ АК я) 5 З ім біу їзїе ЖЕ Аа Уа їїе її Чаї Севобей реу ВЗег Азо Уві Маї 35 4 45 цей Рскзотву ре; сі ТВ гео спіу УВії бу їеч ї1а Веї Аво Жнхт Вів

За 55 І 5

РЕО 118 її і Аве ТІ16 рез: дко Тр Сук біт Зв Віа тТук ба Бевз 35 о 75 о

Ткр Вре Ата Узі Мек Аза Аза Аку Дер Ада ке Акгач Аза Аха ТВк ові ик. 86 З5

Уві ТЕХ це уаї змо Ні хе біз Ро Хв: Ата йіз лія Бегб вт зве та ї05 18 сі Бій Ту УВУ тТвх отТрх пу бій ве ро АхЯ еп Ах Жів ТИХ йеЖ 125 155

Сіу ук Ах сій Узі Тв Маї Ака рхо Меє Те) Мек Ала тів Уді Гей що 135 146

ТнЕж Тр о Ген овзі Бо Ав о Атеа Тує Бе; о АзроАїя РБе уві РБе ТТ б1у 145 о 155 їБО піт чаї пу вка ші Тур спіфу Бій тТвт біб дя Тко Ті рее Аза Дів

І 65 170 17а сіт вла ЕНе Аіяз Ата цех їз Майї Терогце вко печ Уві сіу Тух Ту їн 185 їз

Аза Аза віз ей ех Аха РЕо Бей ойдех чек рЕО Ах Уа1ї Тор Акч тер 155 ап го

Ії8е Ач ї3е бі уаї Аїа баї уаР о їва тиж біу без» дів Уві уз ев я 25 229 тт оївш МеКОоБуу ве «210» 19 кетіз птБ «12» КВТ «1» Шеваюм Согуперастехкіст сгрвсєківе МСКСІЗ31295 «Вр х «ей15 Був

«та» УР... ИЯВ) «абох. їй

Ме дек їх із ї11ів бів су ра їй Ме сбіу її беж їж І16 баї

І й 16 15

Віа Те бІ1у хо бібовбвле АТ Бей тів Ії6 Вхя ЗМ Бі 116 Пув Ак 23 хь 0 зіш шу ев Ї1їе РКО їз 0еви Уві Уві Суп їіє паз бах вяр чаї Пе 35 «а У цей тів Ре біу зіу трж діа піу Уві біу вів рем таї зв Ат АВ.

З 55 С вх ле діа сеч Зах час мех муз ТетроБен Зіу узі Лів Тух рейопцец та Тт5 БО

Тух Ве піу Рце Тр Су Вря Був с сг Аїв рРапе пуво Ах Нія б5іу а 82 зо 5 їв їв» Дів туя біз б1іп бас біз орто чаї Аза тук бі вхо Чаї д1х

І Т05 1 во іа бек бек бі Уаї тів ТЕЖ їв Тну АкУу ТвЕ Був АТ ОТО. Кто 115 КО 125

Було зЗек Ві Зі АгУу ТБ о Тхр Уа) бу Бко Уаї ем оАза вія ей Акта 139 їі35 1їо

Ме Тв о Тжр Гео Веп о Бгто Аїд Аіа тує Ті Азр о уаі демо чаї Мебо бе). 155 159 155 ТБ с-1іу б1у ті Аза зп біо Низ сі ро двроб1іу Ах Ттвр оуаї Бпе дів 1655 Мо 175

Бево'зіу А1я їж сув ваз Зеє рем Тв ТЕровпе Без Ре осів ші Тут ля 185 та

Тих пес Твж дха впе Веб о твнЕ Ма1ї їжі ще Аг Ро Авіа Уві Ткр о Аху ї55 о вка

Туж Їре Авв ої2е Аза ї1є Б1іУ 118 їзєе Меб Мах 11 Меб без Аїв Ак

Іо 5 га без ІтТе МмавеснІія оз «2105 11 «Ті» 299 «діа ВЕТ «тІіях Штам Согупевастетісцт зкідвиш АТСЄСВОВИ кого «шві» срувЕ «ва 11. ливі «005 31

Ме Зеш Уа ей єм бів обі рве іа їм БіуУ Цей бек йеч ї18 Уді 1 й | 10 І5

Аіа їсте бі Бус балі Ап оліа ТК 18 Пе був КЕ БІ Уаї Був Авар азрвонаж їів б1іу Віа їі 11) їв); Афіа Су ТвшоГец бек Азю Уві їїє 35 щі 5

М- їТе АвпоАіа Сіу МБ) 0515 бів Меб сіу аз йцеш Заї сім пул БВБе су І во

Бгто ТВжх бу Шейп їМе їзїе Меб мує Тук Бен ШУ Аза Віа Тук Пею ЇХе ах 7а 75 во тУК ОР сту ве о твЕ Суд вве дет дю АТа рів Був пу біз бІ1й 515. 8а Зо з

Аїа іа Уаі Уві) Щек бек Тпх Юко рко Бех А1а Его Авт бій тп бі 143 ї05 19 їєв зіу віу Амта Те Тр Уві Ме ТИХ Був сій дта Твх був 'сєх АкФ

ЗІЗ 125 188:

ТМ тв Маї Був Рг І Мет спру Аза Мет діа па Жак тТхробБей Ав 135 135 зо вк Бе; діа ту Уаї Аввоуви ле УАІ Ме безпо Б1У БІ» ї1в Атїа біп

І145 1595 153 185

НІ Тук щіу Аврозів Ак Тхв Маї вве Аз Аза бу АХ ТТ Мех лій 5 їТто 1775 ет АрРа баї ТЕО вне бко тТвВк уві сі» тех біу Аїд Біо Був ред Зак їй 185 90 нь Уві їз діа груз ро Твх о тТВх о Ткр о Ака Тух Усі АБИ Рае вія ІТ 250 5

Зіу суз Маї Меї Ме Бей Бецп Так АТа 1ув їх їжу ем Нів 210 Ії го «рій» 15 «сеї 35 «аве ЕКТ «Різ Щетам Согупеввсотетічш ачтійсесвиою АТС лвато

«арх єйї» Би «вив» (13... «епох 8

Мет одса Дхоа їні Зі: діа Мех бет Уаї ел ва Віа БІУ ван дів Гей 4 5 та В іт Пец ек ев тів І18 Аза ТІВ сфу Віто сів ДБ Аза Тукотів їїа йо 25 30. пев Ми сїУ ї16 Був Ато дар оНнів Уаї 519 ро ті це) їв Віз був 3 о 4: їв пен Зех Авротаї Т18 Тез ія Тк З1У бі тк Аз біу Уз1ї З1У з 60 чаї се Уві Бін Ажа Вре ркб ТНК о Ага їй Узі УВ1 Уві Був Тук Мей а то т5 б пу Аза Аїя тТуг іо Бі Тук Рпе сіу рве ТБ Су Бпе Ахо Аво 5ів а 29 55

Ре туз Вуз БІ біз Ар АтїТа поп оМаї сїе б 530 ТБх ТАЖ рКо. Уа 199 то ії0 діз дій уз чаї Аве сім ва-п бет 01у Аза діа б1у Аа вро біу ТНх 315. вив) 155 дек уаї рез Тв обу її До РЕо- АКЯ Узі Аг Чек тва бБет ТЖЕр Уді

ТЗ ІЗ5 145 ув вто чаю рейх вішж Аза пе віа їв ТЕ Тжровви Ав Рко свй дта та 150 155 150 ту чаї ЯзроАла Бен мат Мес гей біб дес 118 Аза Аза отв отук еру 15У 15 175 дво обіп Ахоеа тр Уді ЕБе лЛіа сіу бі Аза Хе цезч Афа Бек АтТа Уваї їв 185 ї50

ТЕО ЕЛеЕ Бжа леж Бей сій рне обі вка тук Був Бей бер Мів Увх Пец 135 Ой 295

Вів пуз БВто Тих Тр Ткродуч Уаї Уві дет тів Ууді Іїе бі; бул уд1 218 215 Ти

Меб їй Аза їви Те Ала пу їей їеїу Ейе Гец бий вже 235

«в» 15 «21і» газ кхаки» ВЕУ «гії» Штам Сокуперастеткісна шесечевовії АТЗ В. «пр «рі» БузЕ

Фор (1ри Я х «ал їз

Мет Єви їІв о лів та1 вів ЗУ вве цей одец Ху дей шШех пйеа їхХе уак 1 5 їй їх діа ті 5ІУ Его піїп Ало Аза теп Заї ТІЄ Ак сь опіУу Уві був АХ 2 АХ ЗО їі; обіч лез Лів Заї чаї їжа Аза Ї16 Су бі пев бек бер 116 Ре

З я 15 їжи Ті Бе піу Сіу Лвх Аїа біу Маї піу Уаз Ті Іїіе Сі Буя дія во вій вхо рен АТ Бей тв АТа пес був Тр обве сту А1їа АТЇв ТУТ рей А1а яко ти 5 І но

ТЕО ЕЕ дів Ууаї Бех Суд рпе Акч пяр о мМеїб Маї Буз Бтє вто вія їву

Зх 0 ЗБ.

Да дес дев Аіа ТБ дар Авробіу Тих бек Тем Авродор Аза Рхз Лех їца їх мі

Міз Аїз нів Маї бек Авп о уві Дер ЖВХ ТвтІ Бех біу депо біу Суу біт

Ід 19 ї95 чуаї бів вк був Так АкЕЧ Рко їз Те Тк Так вта Кто ТЕ Втя бій

З 135 їя4о

Віа НіЗз Ру Ата Ач ех ТК Чаї па рев сАїа ОвисаАза Аза печ АТа 155 АБО 155 18565

Клео тТвх Ттромецй Анп шко Шет Ата Тут 1 АБр Тис Пец Уві Меб гей те5 ї7о І75 зіу біу лів АТЗ Ав ЗІій Нів сІ1у бій бет бі БЕЯ Бір обд1ї Впе Аїа 185 185 195 дід біу діа пем Мек вла бек Афа чаї ТЕб р РТО ла Тем обі де 15А по 295

Рре чех Трх дк Рце пає Аха уві реп бех ойку Кго біп Вів Ткр. ба о Ух ви

Уві Ме АБИ сІУ Уві ї16 б1уУ пуз тів Меб ба тат Меб Суб тів Ах

ВЗ 230 235 240 їі Уа1 Ме нев яко Та її 236 ки БЕК хау3» Штам Сохулерастєхкійе ряємасзепісв1іїст АТОСУЗКА тЛюТІ тка ау МАИк прі БувЕ «шій 11рР..1 ЗО «об» 18

Мет Мек 116 аж Бех Аза ау впе ЕНе вн біу де бек беа Зі1в Уві ї Е І 430 15 діа чаї 5195 Вхб УМ Ав Аз Мекоцем Ббей Буб Тук 515 І1ї8в йга Акб хо 25 Зо

Аво нів Ме 1 цем їїю Хув чаї Чаї Се5 Аза зва йех Авю Уві Х3іе пезч Хе тах обаек оку ТЕ Кіа біу ЧАЖОО1У Тук рем Ма1ї 51) Бу РПпа

Б За Ж хо зп АтТа бен бо Маї їн гу Тук Маї піУу Аза Ата тТук овен АТа

Б ла 5 чо тую вне Тпх Рі ТП обов ЕЛЕ вхо Ав оОАТа Рпе пув ТЯ Був о ОТуУ Б 85 е З

Аіз ті бі мМаї ззб Бех ТЕ Сі рус Був діа Бко сіб са Хаї дід. 100 105 1Т8 деко ріж дар сіу Зв Біб Аїа Дт бек ТБЕ Теу Бруз тв Віа вія го 115 ТЕО їй

Уві ста х1ї- Був ' де Бех КЕКОо дет Тхв УВ) Буш рІо ем без ТД від 135 ко

Бевз Втїа їез тах ТЕВ Тео Ап Ру біу Аза Тук Чаї Вев Маї чаї хві 145 ї50 А 1855

Меб пед ру дег ї1ї6е Афа Авп бій Тук С1у бім бек Сіу ва Тер обед їй т 75 тце Аза Заг озву й1З Тіє сСуз Вл бек Ре тик Ттор о Бця рЕо БНе т1Є їі ІБ Мао б1У Ре бі Аіїа А1а Ату Ббе ЯЗеї Бів Узі Гей Бек Ага бро Те Уві 155 29. 205 тТІроАХхЯа тЕротів бо Бре сіу 116 суб маї їТїа Меб їі обі еп тье ях 15 ТУ їм Був о рем ем без цед 225 53о -15 ОТЬ тії «г10з РЕТ «ії» Штам сохуцдеврастсум ассозепае ВТОС4 УЗ «ее «регі» Бузе «ва 3.51 «ай» 15

Ме дек зів Ма) вази ві о бІУ вве Уві тей біб Бео Зек Бей тів Ув1 ї 5 19 МЕ

Аіа уаї 31Уу Бхо с оій ВапоАтТа Мей їхні Гея бує Тук о біУ ї1е Ара Ако

ТО й за

Агоо піз Їіе біу їжи; Ті їїе Маї Маї буз Віа її Шдех Авромаї 16 ву «о 35 тївя 16 ЖНе пек опілу ТЬх Аза бБіу Увї сіУ Тує їви ма! Зів Аке Ре 5О За о ко Аа Аза їжи сів Ата бейп був Тух Тіе З1Уу АХ Аза тТук Тви дів 7О 75 до

Ра овде ТА Вйє тах су Бе дк дво о Аїа ве був Тв Був о біу БИ діа їїе Авроуаі ЗМи бек Тнпх Беж ко Ав бебс ТВк бр) бі: Чаї дія

МО 155 Іа

Тис ие дво ПІ др БУ лвроБехю Тк піт сіу ві бі Тек бій НУЗ

Тха 1755 1285 цпМУу Зех Ууаї бі ТЕ А)За Те Аза ТВ сів до 5Біпоб8іш ї12 їуз ДЕщ 135 149

Зак бо Бех жо Чаї їУВ Еко фри ПемоТВБх Атлаж беж йза без ТЕ Тер 145 50. 155 10 те Адло рІє 21У Аза бук Маї АБО о Уа цва Уас меж реа О1У віу її 165 17 175 вів зав се тую БІУ Вар орто шіу Аа ткр два вів дгяй ту ЗІ1у Ада

Ва 155 хо

Ії2 Аїа ліз бех Ре тре ТхроВре Вхо Уаї Іі біу Рре біу дів дів ї55 296 205

Ак Бйе ЗеЄх Ні Мах ша беж Акаорко бів Узі Ткр ойке Таро тіє деп 210 215 гг чаї чу ті ке Ма її Меб Ті бі пе» тпЕ без о Був пає Бей бе 725 жо 235 а

Бец «кій» б сеї» ВІ «геї РЕЖ «213» Штам Согуперастекіцт ФіцшенксопаїуУукісст АТОСЯМНеЇ каб 6

Мяг уаф реко сі; Авиа би бах ва Тук рей бух уві ей овен ТБЕСОНіВ дяй о мМув тУк Уві АБ УаЮ вне ЕКе сАлЛа сі Бей овен ве Азлобец лек жо 28 ЗО

Бей ТІ гей вія беб ші го бій ДЕ Ліза Пес хіє Бем був тТУуК ОЗЕу

За що 5

ВВо5 Акту дха сіл йза (16 тло їєа УВЬ т11е шет УВА Су АтТа пев сув щі 5 БО

Азр (Те ТВх Пец Те 5ів рей Бе» пьу Маїі сі» Хаї 05 хаї ТЕ ій ах 7о ту ве сія був діа бто її» Маї цейосів є Бей Ах тує діа Біу Ве цей 85 во 85

Ту Кеш їн обов Рне ліз Тук Те Єте Бе о дуу дао Аїв ї1їев нНід рт їпо ї05 т уз ТВ реп оАїа тп» б ТтБЕ Маї Зек біз тик Був ВО Нім дом зів 115 Її ІТ бій Бей вто Вяр чаї чес бЧає тре Трт а1а бу тТнЕ Тдх Мес вта ТвЕ 439 145 142

Віа Тл Уві Мет біз Тах йіЖ Тни тТр»Ех Уа пух Бім Бу тТвю Нв ка 148 І5 155 ї5О

Ака ТВ о вре Ні Їїе вхо Бій ЗМ Ті Цув БІіУ вКОо Аїа Уві діа АТ.

65 170 ї75 пе уаї Уаї йдеш Уа Тіє Авт Ро Ака Аїв ТЕр о баї Дяр Цей Ре тах тво ї85 155

Чаї їїв осі» БЖ кі беж Зег о Зек Ту 01у Рто Ав; о був Тегродів Вре ї85 Я ЗО. лено грец їв таж Ме лів Аба бСбет Пе; Чаї ТЕЮ овБпе Бгто Аз1з Бе бі ин 5 о

Тук біж Аза Віа йіа дес обех Акад Бко Бей бет беж рео ук Уві тр жа ЗУ 25 Ж пе сСузв ТР два таж ту їїе с сіу БецокВо Ме Уа) ре Меблів вНа 25 а 235 дкс цуалоїну Впеа сМву 20 «1 17 «1їх 234 «ої12» ВАТ «гі3» Штам МіскоОсосеря мене пОоТсеабх «Що

Мебс ТЕО Та бер» Ата шу ТБЕ о біу Тед обей тю б3у ей Вт Пен Тіє ї 5 ІВ їх

Ма1 Аза її шіу Аїа сій Ай Аза Раб Уаї їх ку бій бїу Маї Аа ех 28 33) дкЯ бі Ні Уаї1 51 Аа чалоуаї би Уві Сбуз Меї Аза бек Авровха 35 4 45 чат ви ів їни Аїв СІуУ ТАК оАТа іу Маї ТУ Аїп во Уві іп дує

БТ ке в май Бе тЕр ОЗ їз) Бій ов! Бе) втеча Жир бБіу бі Аа Бей Тукоей 55 ще: та в

Бей те) ЕБе ліз Чаї вас бек реє АгЯ Віз дів ес Ара ВО сів сІу ве за з5 їєм Ммеє А15 53: сів Ас рус Ах вх Віа Зіу бек Уві ІТе АБаотвЕ їз 105 т1б тик без дія ей отв оїжр о рем Ази Руз Вів Хаї Жук Гез дер ТМк таї їхо 125 уаї йеш Пен о Оїу Зв пей дій Азповіпй із С1у Еко Азр дів ка тер і 138 340 тах Ре діа вія бі дів Уві дьа о віа ву туаї Бей тТкр рРНе ТНх о АТта 145 ТУ 155 160 та ім Тут 20ІіУ АТа Ахщ пе оїви із дк Уві Бе Аів Ар вро Шев 165 17 їТ5 вів ттро'Ажуа Уві ах Аа Уві ма ї3зєе Атїаз Уаї баї Мев Дів Узі бер ї8о і85 Та діва маї йтя пеш тів Аїа бСІУ беж дО Маї То 015 195 ва

ЕМ 18 «11 30 «вір Кат -вІ3» Штам сокувенастатав Завосчіснсвакісс ЗКІУ тав «рої дкеОЇБувЕї копи 4:80 «ау 18

Мак баж їз Уві Бей діа піу Бве ре ви о БІіуУ їм Зв ви ї1е Уяї ї Гя 18 15 діва Ущаі віт ркз бій ве дів Мак ред пепопуз тух Бі» Ті АкФ Ах о 25 Зо

Звр Ні тів піу їжа ТІ Ті Уві Уві Сув'Ала Сей Зекї аз» о Уа1 Х18 35. а 4 їву ї12 ТБ беж сіу Тк Аїз ЗТу Чаї сту Тук їепі Уаї бім Був ее 6 5 БО

Вко дп олій цей піп Уа Без був Тук УВІ зі Вів іа ТУю Пен дій

БУ та т5 во ту вв таж БгБе о тьк о Суйл Ре дя Ар о АТО Кеб) му тех Хуж слу сі

З5 Фо За

Ажїа їїе іп Маї бій бах Тк біло реео пуз Заї кКте сій сій Уаї дій їпо т05 лів

ББЖ Бпе АврошіуУ беж бів Аза Ага Аза ТВЕРДЕ Був Тл АТ тиж АК 315 185 155 чаї січ ї1Зе Був да бес Ркє чає тТхв Уа! Ппуз ру їм пев отлє Аз. 135 18 140 вза діа їес Тв Теробез дви Ро біу Віа тТук чаї Азб Чаї Уві Заї 155 Бо 125 186

Меє бец бу зак із Ада Авп обід Ту Олу БІ беж 01 Аква тео ЗИ 155 У ї5 це Ава тУаї сіу АТ тів Сув Аза Бех Рвє ТВг Тгровів вто Рпе тТ1є

Ко їЯ5 158 пі Ре сі Аза А1а йхуа Рез Зах Нів Маї ец беї Аку Вго Твє Уві 155 Ос що

ТЕвоАку Ткр оїзе АБи ав обіу зе пту чаї їз» Ме тів щіу Мей тат 210 щі ра: ей о буБ цеб пи рем огеа оз 20 «Іо 19 «шві 54 сещих РЕ «13» Штам сохупевастекійе шаткуснавії АТОСЗАвВб «ах читІіЗ вка пувкі «атав 11..4244) «апом а мем Бест і1зе АтТа Мах Віз Фіу ВИ Твій бе сІу тей бекопев Іїв о Уах ї З 19 15 дій ші С1іУ Ркб біп дяп ВТа ез чаї тів Ако сій Бім оуаї Бук Ахо 26 25 3о пі біу пез їіе ді тав рей іа їіє Сув оМек Пец бек Двр 1125 Рош

Зх 40 15

Бей Її Ббє 0іу С1у Тако діє біу уаї Шіу Чаї Її ті Фіз був Аза 5О па Ба вко бец Аза сіє) Уві вія Бей буз Ттроббе сі» Ахя Аля Тех Пешо вла

С то у Ж

Жжр оБцЦе Вів Уаї бек Сув РБе вув Аво Мек уаї Був Его бто йіа ей ча ЗІ з дво Зак бек діа тйпкК оАзо Ази о С1у ТВІ беї Бей одвзровав Вів вхо ТИЖ ї100 тах м

Миї дів Мів Тіз веб йвй УВУ Азб о Зех Тйх Бех су Аа осБіу б1Уу б15 155 125 155 чаї біз ТВ Був ТВ Ач РЕб о т1зе Тк о тТвх ТВ о Аіа рго ТЕ Ах 015

У ї35 ще дів Вів Ро дів Вуд Вго Теробаї Був Рко Аїв Гвни Ліз Аіа рей діа

Т55 ІМ 155 оо

Ене ТйкотТкюр о беєп АБ Бхо бек Атіа тТук їі Авротак Тез Уаї Ме грец 155 т її зіУу ВУЄ їз дів деп СІ ни СгІФ січ бек біу ду був Маг Бле- Аїа. ї88 185 їв

Вів біу Аїв Бен Меї Атїа Як А1а увІ Тр РНа Рко Бем лей біу ре 185 295 295 їпе бек Тйтг Ах РБе Зек АкФф Уа їй бех Акт Рро біп діа тТтв Ак 218 КА 228 уакї їі Авй СТУ ВХ І1ТнН ту Сув ТІ Мет Уаї Уаї Мас Су о Тле Ак пе За 235 240 цей тів Ме Ні хийх о «Ії БЕ «КИМ ДНК явЕЗ» Штам сСохупернстахіви дівентасит АТОССЕЗОЗА

Ки «0» ув «ов ОСТ. СКУ кхииЗж свУхЕит- вставка «4308 20 койасоацава абсазссссах зсадчназся чавстезако есабЧассве Чаксасусса «о застосевава ссзбсаєуоа: вабосісаєь асасцістає Ссбазазче сабсетеста Що сЕдкссаКеу зассоасзцва Бусасточуя асувавсвеч чазебазася зчааучаске ІВ абтасацете сЕсСпеуєяВа СЕбаассвск засассвкеє Букссатоо соссаєсстту 745

Часастчаво сЕВЖахссва Боссосвсод вксоіоевсо атастаєдеу ссоусуєтає Зо зЕсцськасс соска соссптсата чсаЗсаваач асуссаслас ваасзаЧев ох во зївачецспай авбвивасвоа асвавсвчва бсавсечочо созаласає чеку че 129 чагссчдсся вопссастча свсцоуєаає сзуувасвчя сусаочгцах сугссдасивеа 4850 пгвасозастЕ Ззчатавачсс сасастсчася здспасевяс бадсотоцес дадсссоває а песедсвістоУ ассо су сяк соое засоссузев счсяасвсзЯа сбзсассаза 200 сазк:зпакх педсооія сзсовводев доавнссеяв сс воосо дека вей кЕсплечват свусаккЕаве асясссяесу ссразесевеа: зо судеу стазасеває ще аксцсеасач сзасваєзах сассзбваско сдссасовзас псажчввавк злочи То їсдсучасьо бедавісоУ дассскодос овгатаєтча сстапазуат ссссодеває вай савяєсеочия ЕКсВоповсо пов вол «коп 1 «її» 1036 киїй» ДАК «віз» люамосекупенваттетде сдімташісвв АТС13И3 вУоравня «012 "ахой «0805 15.91 отут лу шодо хіт пвх се чашу З' кінець Тена агою. жар «віх ага! лайк (503). .И

КВОЗ» 5'-ківець йена акчЕ «ВН «ші» С акон айс (985р..5ЗВ) «иа З'є«кінеце гена зав «ВУ». сект с ТВе «пи» (6051. 11084) «ий» 5'-кінець рамки зчитувачння сеча «пох в зач аста дессчосдає госстодозс агсвосвасцча соавдсоаттасєю осссатоєає БО счассасоце свадауасьї часа гЕсСссВувою бостоссоа песаствосе 120 чідевосрза асстоавісасс ссачасааяс асоцсаєсас сс судсоде гвссотацво ї80 древо жо ЧУ, ч Я ча ке ссскдкасвцє дссявацов Ззтсосеевя сечутесавЕча сосеєтеспе сазана єка я госчеазвоуч соапшочепе ааоодасство сгщсспачице бавсучссЕх дгадавуєоо Зо чечисачеза тгегчасакоо Часозсезсас гочачсусов счссстеавваз баачсеовео 350 хІчЧАБвасЕ стазцеасоче яшеакксєгУз зеЕдсвессоо бодасвасяаке ассеуексча 125 ссссозсеае часзвісвсо дасувачява бодсапасиує вшссвачусьт вікасозача Ано саедксзовіа вопавсссва ассттаєдаєсєх їсасвассас апзсзучУусас зессвгавою ап акбачьесас сассетоакУуєсє зе жососаЕ сосоцчваєЕ Уусасвачеса бЕКатоаєса ЕКО зЕтсагчаве ачсрссссхо асстасксвай авнаїстсна чосачацчас кер каке 50 сЕрадасасс абостастоає гсозЕсасчеВ асівусуаіс стчосоуусє дсодавосає пев сцесасдоса зазсосстсоп чассавораа согтдвссцає дрсасассач засеплессо тво ччаавачезу чвасссгеса азоазвіссвцв зжеухслав чествозося асеасочемх 845 їпазчисавс пдепзасвссп саоадчатстся всзовісясо зселасоват зскепавссе зда чоазсчакес асуххсоссас сссставасо асстчсЯчсзу зазЗзатекосу аауссадоиви я састасозчос счаттсаєсо сасвосастс зесравузся чсадсавсве сова Тако шастасоасаи астпато ІЗ

«2105 29 кв1ї». 28 «812. ДНК «тіж сбпітонеклестид «ВД «й їувЕ 1,6 ан КС «АП а тосдаєаєсвї здосаваєсікс астасвау 2 «у ий «рі й б жі ких - «ві18 ДНК кій». опігоцуютастид «вах «вії» азу р есе и Ви ВС «ом З тчесвадате вахкассеоуд сзвазчисво су 32 «й» 4 «ік ЗЕ «ій дик «ій опікснУКкКЛеОоТИИЙ «ЕВ бх краї» ахаЕван в «ий а тапОх й часзососка чдессцпасдат БЕсрІтчевс ве 32 «815 55 киУУх а «иїак ШИК кг» лпараокуклаотих кобо» «кві сакчтвон ай ви и В ВА «8005 005 васуспіакс адасовессос остчидоск бозачеса на 5 «вій тб хе 7 «вішх ДНК крійЗз сдлегонеУкивоТид

ЄДКОт «ваї- втцЕвОВ ах «айв 5. КВ «Ох Б чаччкасеє. бадвачсатх 20 «війж «Бім ЗЕ кої» ДНК «ЕАУк сзнітонунклевтид «йо. хі» своаЕАонК оЯ «дет 1,135 «80 97 часлпактасоас візчскчасов ббссоввсев ко зи «Фе Я сЕЖІ» ВЗА «Еї2 ДНК «812» БцчаввВа Сокуперестетісе чізсатшісот вТОСІЗ032 «ве хой1» ВЗ «Ен (ВЕ. и кап В сетахасопаюсє сеЧеВесвосє гЧеравасех сус срсссо песпааатсєо етзвсазчтє -0 засасчудачі Ечастсдасєтч сактатссва Бокс баце стсопстосує зчазесудава 125 заїссцесає асьсасеесе чЧоазссоссоєс адоїозачав їссставякоа всоувичово ї8о їзасбсассї васкостЕса сасасвасат тесстасває сектачаєтца часасває шЗЯ

Кік й кот сяг «ет» ДНК еІйжх репу «ох я сессачачов засозссобеп Ясвсстосс ссосодосод Фосуссвассо Япеоссасай я асесссрссає дссссовсова деадсчзісс: чзсазуссгой гепссссс сочЧассвое ї2о сасстуєдба азчесссоад сепеддасоцє усдсбосася водсададссо ссасосудаа Іри

Есезіссадоа єстхабодаєт дсасодтося ссавбаствс Соосчесвао озасозссоо го зачекчІчоак агожсочос вослосесава ссастосата віссосажоч стсавчосЯє зоба астоовасьо сестер аЄ ПЕТ Бечсасс часаксовева ссоастссадцс заакатуєску зе вавезазчета Бесвасваєка абовкецосс счевіваєчс астачавстах бадсоадчатай ї20 сазієссаса свудазасає айсрососадє ЄбЄсадсаЗздеа свавтсосзес Звустесове 485 чазесжітсоє пізачстадой азвааставлає чЧасаавааєв вкЕсастачає аввесасоз Зо кчасакаєсо савкосусасс човазувася кос паасра сурсадісву Сбоосовакт 200 тасстакайс сацдассЯстс воскчЧчакат сасадессксВ пІвазудвосу гвазчаавва БО кайдсасаву пекебахессопе севскакжса сабсссттасе сусстоааероав абовтсакос то сдавекссує аїддсагаєся аачасудезяа спа чеоааса спсдчаксачья бтесасссеоу тво сбасассобї бгссасчачЧо вевссдаайс чере оссотчєзата айтаєстасув ваз сцакетссту падкскскяс атайасайьо зслазаєсчіч аодсоссвов ододааатох зоб чЧччсескаівко ссталатуоє ссабЕбвуай бавдіввеке орсксачсва вахсссуадаце ай чаФікесасс зестьссасв базасявслео сайсаєууас ааствсвссод сесесаввее ї07хо сассатауос ваасастаса сосвадасдча сазучьчсто асчссусвосє савбрсааУє 1285 тевссасосе дпглововсв пос есасев суцсваовавс стєватчавс тасаводоєа Ії4о стдсдабсай оче чацсасааке Сгтеківадосвоеаксаскуоє Ясссвваднх їлОо пестсчесас гасеостова бхадедасаа бвапсозчато вахозсвоава есе сУау іо чЧечосассоке чесадсочає ссасодестсос вацазсісуса зсовзессває севбтасччай 1383 вестЗїсавУ зчсадсзавєсх зассогбодся чавсакаїсо зіІсцочесот св«ассооссах 1383 сачесосася соссолсвЕст ссясЕчеКЕК уртчазозаз адвазассЕю садессласа ї442 сачастеває сададодесло забез всзаавасвом аттсцсссув сЯдеачесває ОРБОйЙ чЧспЧсулсес пзесечасси саттесуває сСсваозаусов васобсптад сосодатоуе х5аб ачіЗічачов свосспсводеи бачацовупе застусесвУчс сессвавтав запанвавцюв: ІБ ссадссцчаваА застудцсее скеебкссак сествавЕсе сеовсгаєу ссесесвава ВЕБЕо сазласахає ссзссздово содасестав саскуеуяаз сазсодосоя чаовасочеу 740 чеасвазасає бсзосасаве ссассадоаса ксааахсхаво свсвацуєса Еспсвасоча МО гассосКБеЕ дсуестсівс вавасествсос Іптодтсаса їстасвадос авссссссає 1850 зчзівспска застачески чЕКстЕчсаК сасазавчса дластсчува пбасоасава їв чекаскессс зеувсаваєе ЧЕкакосуєє сасзастоса сясаасакас дапссвовац таноа патазчвуєоас аааесооут зкасстваєц вуссаоства ссосасавбях сСсосасваса дах шксвсвдссо Чевстссаче сузуаааєсеє отеЗвассву стасатсває двасоовбсое 100 «сссзсчосюо зуасдсочек бостраству асосьестесз добтоссото гозседчасто 2165 пееасосссч дос ісоде тпсооосувас засассацев сассосвазяз сачсавкаоо гей чигатосаса чавесацезчоа аказсспалу алазаасвіз гдачесазаву досвласалявна 8285 чоссадуває сахаваавят сспочсваше зво сагаучевос Чсосипосвов аа спазсаупас вавейатсобас чзсосавсіся дача овоЗа авсссдвесаоз Частатазад апа акассачеасч бсхссоссовр чааостсосоо сво собак ссув соскусецсе 2450 касодчакає стажсслсси ББекссоКЕс часависята шесестсстіє вкадсксаса как сіпсачлтає спесацчуточо сатадассд ссзстесава схсодетова спевовдазес 258 ссесдттсау сесазассзст чебостсвсе садкансках ссететеівбасль сбавссвубт 2645 азбасаснас сЕвБсдесас содсаосадо сасбодьзає яадастацева леадсовудта 8700 кчкачосезс асгзсвазае спстсдавдціа деоцестяве сзозостаса стазавчаве 2765 ачсзссі ах «сечо чико Ссссдазчес апставсктс зчаваєаову сс иве ви кЕщатссоее знасейвсса созсізотає седсоацье єеЕсУссосо воусадсадає «80 твсусясаця взаввеудає соксаезоваца Бооєведасе свссссясую дассхуасеє хо

Есачездаве чайвасисвс обвачачає сво свтв асзетаєсяа ззаччавск зап папставчато стосу зсочоцосава депаєссесях дксксваває стотсасоєе За всахІсчсаса ачасавайає акассвесає севсвасвав асрУксЕчсо басвізався 3180

Чравізсвас заобостасо адесзтаєсс авслозавас зок васксу аадосецєсе зіко вастчазчсЗоа сек а ацзвпававкцсс сосвосаиказ зсачЧосовУує сосоестааво лико ачезочес вс ксоЧчвО зссусзастя аасвссваса гоЗасусвоа Естатавяв 3595 твтасатцао єтсдваявЧе гаєдассаса ветасоссва чеекосавас свпсоааоксо 1350 зссстачази ахссассзо авсовосуся счатсчаресє сСссессвє чавсачссой 3420 асазсвувеї Євастсвссс вавсевестЯз азтсссстча сзссчауєтв Зазеоодакся 5480 зсдадвтісоссасовсоєт зусвссавса Бскодопсова Чоассасозво сосеачаєсо па чЧосечцавааска асссзссваєс ваксаЗсоєеза сучесаакує Зссасбасв астлассасов 36пО пчуасавічаї стаФфсассво «ссткасчцс созасадедиа зодезасвак чсЕдссассо че счаавсстас сазсучсває сатчассацчоє сЕЧссасЧав сесповачея чеїаавакое тей вссавБесЯче чдосасестаб ссосзссца спссуссчаї зачзсасааао Зочсссавах Зтво зесптвкссчуа дсксвассву дссаповсза бсусовісва сабозасКсе асссваасоє 8 чекоашькаєс дасєбсебасс ссласссоса сссаЗссосу собсаїсазса дссассоєсев 0 З800 запсузссаа аочсскдтса сСсеодовеою БЕоЧЕВсвуЮ сЕсексавву австсухоуся 3980 стоспасоєк черв есаке усобсстесо ссуссакзаєс зосаваєссве васадуєазе 4080 счахдесасс ссассовас» зівиесувоса сузссцесає чесастоадає вавзувенсавя ее сгчесссзвзасає дссоадоозаєд засавагацча суссадаватє гядасасасу вззаадажост 4145 свасзацісс сесцоасоса аквесскаве сСаассвссаЗ Басаєсстос чепосовко гом асачсвааво астоцессос азавасвуве сбузавтзах чавсєссакц акогосатод 3255 тасставея вастасттаз чЧудижасча кчоссогева свкаціїсаа сасадевеся 485 зпазссепас Бивастяуас астівасест сааксвосчв сплаачасаче гесузачцосо зно ссессткалде: сстсвсєраве собсесрввсоюш соседаскса чЧецсадавос ссасуєасое з449 зестсозако сестдвсосс соскенаєсо вівасасЗЯ Чевааксадав дедасвавосю азпО восовчскот Кассаекосїс ессапасьса зЕсатсаско агачЕчзацтьх сесасфісчає 56 «аствЕтакве ЕссасаячаЧй чазасввата чЧуготоасУ абочкєавсу зуссусаае за зсашасстає асслдцяксх Едосатсоста сустаастуєсе Соодсчачко Сестостєса 4евй сгасвчавас ус ссСа авватасоче абтусаєсвеїс сбоакасува гГаадусасає 8 сттевквтда косесяаєда Чсеоссстав Єсапааєтоя сварок дбааовекоя 15855 с«вазасаєся песводссід ассусасуєс аск чЕсо зарвавссоя аєстьсястя або аусксчавоча гладЧасїсвся сассстспсоу асавсусаса пед кесуку десаавчсвай що адесслазак сассваєтоу бссабогаса всавайсссс бетсвасецЕ дассссосса Я9Во сЕТКССа ОО здваєсавача педасьсаче себочбасча сбсзаразсв ссср одо, 5ОЯЕ пазесазасс Ксадечесес сеспескстз пеосеустаєс зессцавуєЕ ссчавевоца ЗУ коадасетаст паєсьсуєак чесзакавЕвЕ ЕсСоохооВЕ сусесаскев тегаєдатод БІО ссзозчсцаа ачесасчсзс чдесдусзасесю дсочесето сажкссавтає пече ве

Есастосвсс ссссттсвоа бутспгодсат ачЧавсвасос спасоваооч пече сот зада чЧчучевечсвУ ахжсевосов чесрсосвеос дсвактссст гзссвачусу азазовосек а чсвазвсастач злаазсвссє ассдвзаєсвсс саїсезалса згададочає сЕсстсв ск Бай чачоссІдса ЕКссЯзевчає часстаскех гасу азаліотаве зкавовочея ца суктєваєос ассодавояе сасяссаскс восадессає з5годосвав Заззастає виго чучЧетатчасе КЕаБЕссссг кескцесуЧЕ зок аЧеввнУує ВЕстстаос Зстсядеава во сусоуезаєо весвастетр Зчачсвестс всСеочЕЕєтає авудесаеаєс дескеввове бас сттастцеасі: чеславоууана сасоатсасУЧчЕ чассасчася часі кадсат Кидссіео Зібв гхстаувасе Бссасчевос сеЕсавасстіс сзсівосвас Зостуєачка сособкуває зей сЕСЕЕЯЕвВах ЕЗсЕасьста зсезтассве Яуггдесаса севтавуасю сптаціадсео зви тсастчсуака сазссасссос агусухтацев аасастуєос зеасстсазє сезеквоа яв састусєссост Ззсбастацвс зсасетасьс асасетяосЄ азсосасабця свобасаєує звас агеїхлдсвчхе атасечсасо засчеЧчеваа асабатасвї усапчасстосу сазоакасає Осо чаччсчспай свисссусто еспдсовпчкое счспчасскЕцс сесусовасСи сачисачеяча ак чсассуцоче всстасуєчс зчабассссс секадуракс чдесваодчква сообосовуо БІО кечатулайви бесткаастах Бовзасасчзу Евачетоута сдслакассоса застадуєоя вів псвсразаса ссестваайза їгватацетс стадасавуа садасоссоя счсзазскає вва савотсатакє чсзсазчву сабасазссе двадеачекс савехоасна псакасевсе жзой зазстзацвся всочЗпасав басостоясв аастгсусась зсодсавссос дсасавовко аїво ло ссвоач засастлаза пацавоєуаа сассвстзас саассспсася Єсаазссвваво Яд тістзацавс астісзєвоссв зчЧсокзцоя бадусазавс зебароснса апассассва БЕВО

Бтачбгацчас: стдзсадосі цесахачеакта Яйосзсасздчає чдавцестатва садно АТ час авс собу коця азесслапча ссьчсаваавс Зсгсасушкос Фобос вад асесстоачев баввеЕспаву гоакачасова йсусоосаво дасстдеєста гсоетастав БеКО цазесассва ссзослузо одсоасусеісах пасчІтЕЧеЯ посвосуєто часасвасод 512 стсвсашкса стікусссазЯ сочЧазовчту хаксавчасе чдестассстк совізабувза ТО засажтсьсаєю ссуавоуазаєд засчецеасЯ пдоасудадес дадусасассю авазеласья 5845 сксауовсаса зассесвазо сузасоуєто азсасттосас сусазевтоє бободсвое 500 ччассзссеса схчсосЗасд с ахчлестсва ЧосЧевсова дабісвасай бекеспавио че чЕстуссяУє соч вазч ссоствкода сослесаску субозчсасо часах тора кчвагссяатеусте соссбасслоЗо потоцазаєдес кчедчазавеа певасствсс сезставчво То сасесотсву завсгоасту огссоосає сеаавесвсу вогазччаУю собасзедос 145 чісссвазка срачакакає кгдусодакса езчсоуасссс дасуувутата зазпасастає 07990 скЕсаосзасв соцічасявч азбаєчазас сосок ссаав евессжечЕє сабосучоке 7250 асавчааясі вечсчасе кодлассаа грасатадас Яевавідвас леЕсссднеат ТИЙ чЧевзчзачав сптулрасаацо содосаеврсо поазацсасет тчаасузусєве автсавсссо ЗНО сатЯстяс чопокаясча всесчвавза вЕЗоваасто аскозческа аеЕсцеОе 7440 твадева грає чссеваае зсосдаасва оустовудає здсапосоєкЯ буслвсо Кок 750 счосазраза засоласав чкстапосас яв бссасс собсусасасєда сочоїавточя 78во тсакзіачас БЕуаасесоц весло ствс ссакцасдає пекаштажує чЕЗВЕсгаАа. БО тасадобаку сісусооова аспадсадво какхссісоє асосастада адсодсвтав т восскчкЕса арассссЗсЯ сзаковакеї агазксвату бсусчазчас паастасотах пава заці сврасї Зссдасвато дстзавексов ссзцозакоуд засгатоаву скостатато 7800 собучсвссв ваповазцеї часувсвакч часбцесося сСтдасссчак сбацуроцев зво кЕсЧедудас Есветукеає стшцюцоусад сесеспроває апастусаєв сооснатозя во садіскцове зссвхасіоч созбазасвс сассвоссое ззачводосо дсодсотюаа тва чесстозсчет спа соцек сзазвассяа ЗсоВаксствс чЧесЗУуссяаа поса аста яп сецессосоє бестаосоєс восочасога совувеясяу сдссачовосо зазсдаквечі 8100 зкссасечіч сспбсдосая безусьсясох ачабасцеов с«бсассава бзсазсвусх яТ50 тсссаптсстп псвсаічасо «авсхсзаде сзсаозсвоу абсасзакет сопсоускеє ие чЧсестассч чЧассесезас сосадотоце ссоуєсусся чеососоєпе спессочсре вІйо ч ягВУ «фія 30 «ЕТ 5 -217з РЕЖ «ух Штам сСегуперастекіцв зЗічсетпісвт АОС «гід» «тя» сшьвш Хевіака «ра» ВМ. «га» амінокиспотїма поснідовність білка-активатора Буйох шщтама Согупевраєтеєицни

Яіярсалісие АТОСІЗ03Х хай зо

Мах Мелпогта зе біл опей вер от деп оцей Бах біз І18 Авб бій су 1 5 То із дет рле біз б5іу Аїв Жак їши Азїа Бемд дер їЇа Бех Вхо дет діа Маї 28) аЕ За пех сіп ака Уві був АТ Бер їі Ніз Ніз там 'Єїу Аа Уві їєм Уві я Я бевковкУ тнх сш Бо Аза Буз Аха Твк о зіш Аза о сву Зі уки Шев Уві

МУ ЗЕ 5 чадо Аів Аха Ак Був Ме Чаї рем бе; бів Аіа сі Твж рев ВіЖж ЗІ я 7 75 по

Тед дес шт» вату це); Ата сіє ї11їе Бо без їйк Ізїв со Аїа Ї13е Авий вта взчр. бек її Зеїх ТВХ тТтв Ре гжос ро Маі Рв оАвВп опіий бат діа Ба їб5 105 110

Тур Бі біж Аза Тв Гей ть Бер дк їец бін авв Бій дів нів твЕ 115 ї2О 25

Ов дек пац їжі втЧ Вт пі дню Уа Тед 01У Аза хХаї Лак Вт ЗІ 13 155 13

А1а дп ко Мах Ата біу Суво об): Ущ1 Маї бій депо осбіу ТВЕ Ме Вхе їй ї58 155 152

Міїз пес оАла Тї16 Ата ТВ РКО ЗК зи АХо Ав Вів тух Меб Уві Ввр 155 Іа 75 бі» Бу пев дет Тто дів Аїа о Меє Бус Уві пез джу Бде 51у Бхо Буг їв їв: 195 дво о УВЕ Бемч зії Азо вся Авробеа АБ» о біУу ха УВІ Авроску Рго ах

ГУБ: гра вав

У Аг пк Ак Зах дет її Мах вто Шех Аха біс ооім бе біу сі я ії 22о дів 12 Аху Акц 5ІУ пе бу Тв ЗАуУ Бей за Ре бів Тв о б1в вів ні а 235 ай діа Во Мех бе був'вій сіу бій уз т3з3е зи їй Авр опи їїе вко 248 250 285 їХе Авротит Руб Мек отТух Тер осів ха ТУхв Ак рем бій бех ва Бех ей ах о і: діа Ат Бем ТЗІ АвроАтТа Маї таф Ав Аха Аза ті сій б1У ПМ ат о 285 вх їКо з 2ОБ900314 зарубужні країни

Claims (8)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб одержання І -орнітину, який відрізняється тим, що здійснюють наступні стадії, на яких: а) здійснюють ферментацію бактерії, яка вивільняє в середовище І -орнітин, яка вибрана із групи, яка включає бактерії р. р. Согуперасієгішт, Васійй5, Зперіотусевз, АпНгобасієї і род. Епіегорасієгіасєає, у якій відбувається надекспресія полінуклеотиду, який кодує поліпептид, який має активність експортера І-орнітину і амінокислотна послідовність якого ідентична амінокислотній послідовності, представленій в 5ЕО ІЮО МО: 2, або амінокислотна послідовність якого може бути одержана з послідовності, представленої в 5ЕО 10 МО: 2, шляхом здійснення в цілому максимум 25 делецій, інсерцій, замін або додавань амінокислот на М- або відповідно на С-кінці, б) накопичують І -орнітин у середовищі, одержуючи в результаті ферментаційний бульйон, і в) у якому для здійснення надекспресії не застосовують плазміду РЕС7ТубзЕ, депоновану під реєстраційним номером О5М23239.

2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що при застосуванні Согупебасієгцт дішатісит у результаті надекспресії підвищують рівень активності відносно експорту І-орнітину щонайменше на 1095 у порівнянні з активністю штаму АТСС13032 або АТСС14067, або АТСС13869.

З. Спосіб за пп. 1-2, який відрізняється тим, що надекспресію забезпечують за допомогою однієї або декількох мір, вибраних із групи, яка включає: а) збільшення кількості копій, б) застосування сильного промотору і в) здійснення мутації промотору і г) надекспресію білка-активатора.

4. Спосіб за пп. 1-3, який відрізняється тим, що бактерія являє собою бактерію р. Согупебасіетіцт, краще Согупебасієгійт дішатісмп. Ко)

5. Спосіб за пп. 1-4, який відрізняється тим, що додатково ослаблюють один або кілька генів, вибраних із групи, яка включає: а) ген оанА, який кодує субодиницю ЕТ альфа-кетоглутарат-дегідрогенази (Кф 1.2.4.2), б) ген висА, який кодує дигідроліпоамід-сукцинілтрансферазу (Кф 2.3.1.61), в) ген дарА, який кодує дигідродипіколінатсинтазу (ОЮОарА, Кф 4.2.1.52), г) ген дарв, який кодує дигідродипіколінатсинтазу (Оарв, КФ 1.3.1.26), д) ген ай, який кодує мезо-діамінопімелатдегідрогеназу (ран, КФ 1.4.1.16), є) ген 1у5зА, який кодує діамінопімелатдекарбоксилазу (І узА, Кф 4.1.1.20), ж) ген аг9В,, який кодує будь-який/конкретний репресор (АгоР) біосинтезу І -аргініну, з) ген аг9Е, який кодує орнітинкарбомоїлтрансферазу (АгоЕ, Кф 2.1.3.3), ї) ген агда, який кодує аргінінсукцинатсинтазу (Агдс, КФ 6.3.4.5), к) ген аг9н, який кодує аргінінсукцинатліазу (АБЗАЇ) (АН, КФ 4.3.2.1), л) ген ІузС, який кодує аспартаткіназу (І узС, КФ 2.7.2.4), і м) ген аза, який кодує аспартат напівальдегід дегідрогеназу (Аза, КФ 1.2.1.11).

6. Спосіб за пп. 1-5, який відрізняється тим, що додатково посилюють один або кілька генів, вибраних із групи, яка включає: а) глутаматдегідрогеназу (КФ 1.4.1.3), кодовану геном дан, б) глутамат-М-ацетилтрансферазу (Кф 2.3.1.35 і КФ 2.3.1.1), кодовану геном ага, в) ацетилглутаматкіназу (КФ 2.7.2.8), кодовану геном агоВ, г) М-ацетил-гамма-глутаміл-фосфатредуктазу (Кф 1.2.1.38), кодовану геном агас, д) ацетилорнітинамінотрансферазу (КФ 2.6.1.11), кодовану геном аго0о, е) специфічний відносно глюкози компонент ЕВ (Рів) (КФ 2.7.1.69) системи поглинання глюкози, кодований геном ріва,

ж) специфічний відносно сахарози компонент ЕВ (Рібб5) (КФ 2.7.1.69) системи поглинання сахарози, кодований геном рівзо, 3) глюкозо-6-фосфат-1-дегідрогеназу (КФ 1.1.1.49), кодовану геном 2мії, ї) глюкозо-6-фосфатізомеразу (КФ 5.3.1.9), кодовану геном раї, кю) фосфофруктокіназу (КФ 2.7.1.11), кодовану геном рікА, л) фруктозобіфосфатальдолазу (Кф 4.1.2.13), кодовану геном да, м) гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназу (Кф 1.2.1.59), кодовану геном дар, н) фосфогліцераткіназу (КФ 2.7.2.3), кодовану геном рак, о) піруваткіназу (КФ 2.7.1.40), кодовану геном рук, п) Е1-субодиницю піруватдегідрогенази (Кф 1.2.4.1), кодовану геном асеЕ, р) фосфоеєнолпіруваткарбоксилазу (Кф 4.1.1.31), кодовану геном ррс, с) піруваткарбоксилазу (Кф 6.4.1.1), кодовану геном рус, т) аконітазу (КФ 4.2.1.3), кодовану геном аси, і у) ізоцитратдегідрогеназу (КФ 1.1.1.42), кодовану геном іса.

7. Спосіб за пп. 1-6, який відрізняється тим, що процес ферментації вибирають із групи, яка включає періодичний процес, періодичний процес із підживленням, періодичний процес із повторним підживленням і безперервний процес.

8. Спосіб за пп. 1-7, який відрізняється тим, що виділяють І -орнітин або рідкий або твердий продукт, який містить І-орнітин із ферментаційного бульйону, який містить І -орнітин. 5О0

Вирівнювання амінокислотних послідовностей білків Су її АтрО, вказаних в таблиці 1. Розриви, введені при вирівнюванні, позначені -". Ілдентичні амінокислоти позначені я", їв равЕві.ї мллжня кет юн МЕТ ЕІТССОПОДяЬБиБІСРОМУВУТКОСТКВВОБІАУЄЬУ шво о5тазаояї яке жннякя ення МЕТЕТТОМОрОрЬОАТИРОМУПУХКОСІКВНСІТВИТІУ Ме 939453. шля ну няню -е МОТАТАСКСМОСОВБКУАТОРОМАТТІВОЗІКВЕВОМЕВІЦУУ Хв озя33958, паяти м хх жннино МЕЧЕМ НБН УАТОРОМАУХІКМОУКИРНІСАТТЬХ ХР оозва4к5а.ї МЕВОЕД я зо ню нн не МЕТ МОАОРАФССЕВМІХАХОРОМАУТІКМОТКВОВУЄРТЬА ЖЕ бзЗкІп83.ї яння кт тили МЕТААВЕООЬВОІТАТВОМАБУТВОСТКВЕВОБІМЬДІ пр о392231551 нятлттняя них МКМ ВОКРІсЬВЬХУАОавОоМАМоьКуХВвОНІсСЬХ Гу в 039327960,1 яка налив жмкетяки МОБЖТУПВОВУЮЧОЯрІМАУСРОМАМІ: КУсТВВОМНІОСІТУУ же о3аза35.1 МУБЕМСБЕУССМКОТНМЕХУМУКЕАОМЬЕНЬВОТБАБСРОВАСТОККСОВНОВІТЕМХВУ В бозававої. у Мох лмнявюви тнє ТАТИ ЬАВІ І АОМАКУЮВОВУКЮВЕНМСАУЧЬМ р О53Б5БВІ.1 пніянвнй киянки кн МОХ ВЗКЕвОСВЬТОАУСРОМАМІ КУСІВВОНІСТЬТОТИ в бе835о56.Х пляж жнтяи МІНА СЬВОТУ ДІ ОРОМАСУХНОВУКВВОмМУТЬАХ Ж Ж як жкж Ж Ж тв що5581,ї СБІВВУКЬКІАСТІСЧВЬСЕМААРІУСОІМННОСІД УТ ЬМЕАУМААКОАМТМКУ ВА 3 Р оз74З2о5,ї СПОБОТУБЕХЬСТІОСТІВВТАРІТЬОХІВИСОТ АЛІ ЯВАММААВОАННАНТЕУ Є я ня МрозізаБВ.ї СТЬБОУТЬТКОСТАВУВАСУВНАРТАТУУТКНООУАУЦЬХ КО ТСЕКВАЕКЕНОЮА- - хр Оз833а58.4 СсЕБЕПУТІМАСУСОМСУЮЧУЕКЕРТОВІІМЕУСОЛАЖХБІУЕСКТСРНЛАЕКЕКОЮА Я че поза 52,1 СТО УТОЬІТОЗТВОУаЧТЬУКВЕРТАТАМ КУА КОРТ БВВАКККОВ я яр бзтіхваз. сТОБОЕРОТРОЗТАОУЧУІТЕКАРЬАТ ВЕК ОААУрАНКАУВОВНОМУ- КРЕАє ня р 03322319 САЮВОУКЬІТИТАСУВУЬУВКЕРМИАОТІК УСВА УАХРТЕТСЕВОАККТКОВА У я ях дже 03931755. САСВООТЬІТЧСТАОУТЬУМАРММ ВІ КУТОВУ АВЕХКТСЕВОАККТКОБАТОУВ пр О38ів365у.1 САБСПІТЬКАБЕОЧУЧУСУТООКАРІУЦЕТВУАОКИВОМЕАУТСКЯОАІНРЕТЬВУ я я тв полаввібі. її ПМАЗАТСІ ВСТАВ УЗАНУЧАУ РОВУ СВ НОДАНУСЬНЕАУ ВОВКА дня я ЖР Оо5аББЕВ3.1 САСЕОУТБІТЯСТАУСУЬУЄКЕВНА С ОТЬКУЗААХПАХЕТЕ ТЕКА КТКОВА Я ях р о4835055.У СМЕІБРІЖЦОХІРОСОТАЯУВУТХЕКАРЬАБУАСКИВОАВУБАМЕАТВСЕКОМУКРЕАБОМ я їй ж Ж ж Ж Ж й ж ж. ТР 2355551 янв ТЕ ВТК я ТАМ нн ДА ВДВ б нн ти ВАДА Р 05749209 зер ВИЩ нн НЕЕре хуя Дня Де ВАД Дон вн я дитина яку МР 933459. шви ОБР нижня ВУ ВТАВА нт ВОМ ЕЕ ше о3833858,Х сек ная МВ кю В ТВр ВДВ ння М ШЕ нин яння ККУ ХЕ о0283абБІ.ї пяти ув ЖЕРТВ ЩОКИ я кВ НМ Дн няня яні дн ве ДАВО Фр зіва. яти ВБА яю ТО ери еВ Ве БАР ТАДНУЗНУЮТТВО ях я МОВИ ЯР озерах ех ДЕД я ВТОр ее ке дв ни ЕИДО Ер жен іде жк «ВОВВЯ дво озо3ї780,ї ВБТЕрМ-ЯтТЕе З ЕУАТА я Еф ння Води Дня я кн ВУСТ ЕНОВМАТ хв о38і8353.1 я ТВА КОД ЕТКАНЕВВ ДР ян и ДИВ ТД кою жнн нійн я тн БЕМАТ Же по2958т01.5 РОМА я ОА дими йфутини тині ВИ КВЕ ше 5365583. сну ен Вовка ув ня УДК кт тн я ки ВОВВИ же сяв35056.3 -- ВВА КРОМКОЮ АВ» Р УАНІВМУВ- ВТВ- ДК кт ск ння «ДОМУ Хв 225581.1 ЮТЕМКУВУВУВ- УВЖО я я ВАЛИК У я я З РМОМАТУВТМИОМЕМАХІЮВЕУКТоСУЄ ХР ож749809.5 ТТКОЕРВЬВІТ- З ВОТВ. ну н ВМЬМАХУБТ УМА ОАЕИВІСОМУЯ МР зазаБо сь КТЕТКАОРК- -- ВАД я ВУЖ я -ВІБАВОАРТНЬМРААТ ІВАНОВА йР оз533958.1 МЕІЖДЕтТУ яння КВ ВТНУК ен я БОМ ОАМАВТКБКРЕЬДУЧТОУИМООСТА жр осаяза659У БУБТКЖНВЕУ- - ВЕ ее КВНУКУ я - РУ СБАІТЯЬМВІАУУрА УМОВ шт ОзтіїяВз.ї СТКТВРІТТТА РІКОАНРАВЕНУК- хе РАБАДБАВУНЬМРЕВУІОТІЛМОСОТА бр оззла318.1 ТТКТААНУВІК ян Еб я я РЕМУК У кю я - РВІТАСАБТИ ТМ РОДУ ЛМЬОТА хв бзаліу90. АТАТО-ВОБІК Ве ке ВЕК я ен ВІТА САЦТКІМРОМЕТЮУУМООСТА ЖрР ОЗ518361.1 АТУМЕТАТУУК»-ВКТВ»- ВАТЕНІРОВІКОРАТААВУТОСІМЕАЛКУВЬКУУТОВІВ УТ по2558101.1 пк ню ж ж жим я ж нію ню ТАНЕ ВНИУСОТИ СОВА

Фіг. 1 хр о53б5баЗ. У ТІКТАТЕМНІК----ЕВ----РЕДЧЕ ет ВЕБТАСАСТИ ЛОВУ ПУ УМОВІ пр вавЗз5ОББ.х ЕТЕРІТТТАБІНОАНЕВА ен ВВМУКА нин РАФАЛЬАКТНВМОЕАУТОУТЬМІОСІВ зх Б Ж ж уро а25553.1 ВОХООТСВМІНАВСАТААВІ ТЕРИ ОВ ОАОМЬБВРОЕВЕКУЧВНІМУУУАТУМТАЬНІК: Жр 05749305. АОТСЕТСКМІТААСАКААВСИЧЕРБУОУСАВАСЯВРЯБРАУНОМІМІОСУВУТЬТСЬВУК Мр е19452.1 ПОНОРОЄКИУКАСАТСАВІТМЕРЕТОТТУТВЕОТУБЗАРАЧИНУІКІАТОТТММІМСАХ

Р. озоаззЗка.ї ОНТСВО-ВИУРААОАХМАВАУНЕВТУСУОЛЕКЬЯНУГАКРІТНВУУМЕАТССУММЕСТАК ХЕ бозазаєва,ї МОХОПО-ВИУКАССАТЬАЗАУМКРООКОАУКВНУСАКРУТИВ У УМ ТОСУМОВЕТАХ ЕР ОЗ7ЛІНЕЗ. 1 КОНЗЕБСКИУВАВОМІМАСАУКЕРІІСКЕЗТВКВВУБВЕРОАКВУХМСУ ОСІ МУМОСТВ пр о3з82319.3 ПОЖСЕБОКМНБРАУСАТСАВЕТИКРЕТСКОДАВРО НУ ОВРГУНИМІМРОТОУХ МІСТ ХР 038317891 КОЖСОРСЕНБЕАООАТААЕРТНРРУТОКОААВЕВНУЄВВРЕУНКНІМУСІОУІМІСЬТЬК 2 озвІ183855.ї ВЕЯТЗР-ЮКЯдЦ СУМА рАКОХОАААЬВБВРІОБРЕУНЕСІМТОІОБЕМИКМАВВ Хв бр2358191,1 МОНСРОАВИУКААСАМААЗУ КВАС АКОСАВУСАВРЕАННУ УВУ ТАТА АВ

Бр. 0536БЕВІ.1 МОХОСЕВСЕМЬЕАУЗАЇСАВЕТНЕКРЕІСВОВАКРВНУБЕВРЕУМАНІМРОІСТІМІСОТЬК. в даяЗОвВ ох МОНСЕБСВНУВААСЛІМАВаМЧЕРІООРКЕТВЕВЕУІВВРОАНВУТМОУТОСІМУУМОХВ Ж жо ж ще ож ж їй Ж. жк дя хвоя Ірма хр базавопо,ї ВИМ» Ме ззвач2.х ШІМНе ся в озвазацв.ї ХІД няя ХР 0ог834652. БОЖЕ няя др П3711883,ї ЦАМНЯ ня р 03922313 ВІД я я дР О353К780.1 БОШ шВ О3918361.ї ЧЕМ» ся в по2З58І101.ї пІАВВрУКОа

Р. ОБлЕББВІ.ї ВІД я хр біващоБ.ї БІМНЯ ян Ффіг.1 (продовження)

Нараметр;, які зазають. програми Сівпе Малавеє У фірми осіннє ак

Банозіенаї Зейенев тя визнання сне ен чност дех амінокнен них песліданностей на веневі глобального вирівнивання послідовностей, НЕ ни в в в п в п в В п ОМ ВН ВН «ВЕ з "Морівнуювня звох воклнювностей пи пн і. ї бен ваннння З нн ві оообетюрвняння п ЄдЛокельне Пошук обуустей локально схожеєті двох молеюии Пп и вих пу п ПИЛКИ УК кю ЗАКО ЖЕК ен УМИН ДКОКУКоКюК: х тех МОХИ ТЕ : : Ми о хе Нв а су В АН ПІН в а в М КУ ськ Віревуненвнях збірка: варіння зіеріентенанни з нене їх В с Шо ОО НОЯ 555 вон АНАХ ОВО Об пою, в ек різні п п ВО вобаютюве Мжоввніквніе зврінезнонаненнх есе віз Мне; денвнконнх обеж виалехуя вліво шк ВВ КВК Я ЗІКА ДО ЕН ЕЇ; ЯКЕ КаККЕК ХНУ ЕНСЯ НЕНЕЮ ох и ки ВН ен ще шину ніж Матриця базів ої ее о нн в С Ме Е на о рос НК НИ НН. 115 БАміноввслот гир незесідності п нон НК ло зей ОЛЬОМаНИХ В ОЖНК ЗНАННЯ 00 ши ри пе Є рвнсвювання; віжображення ж внкинні 350000 ЙО ШТОК то оовввуре І ОК ооо ДЕ ще ШИ о пе он 0 Нева Пола м І.

Меревватио 0 Дюпомог іріг