CN117377757A

CN117377757A - 突变的atp依赖性蛋白酶和使用其生产l-氨基酸的方法

Info

Publication number: CN117377757A
Application number: CN202180083708.6A
Authority: CN
Inventors: 尹炳勋; 金善慧; 裵智姸; 崔先亨; 金俓林; 金亨俊
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2020-12-11
Filing date: 2021-07-12
Publication date: 2024-01-09
Also published as: JP2023551275A; KR102679080B1; JP7550315B2; CA3199126A1; WO2022124511A1; EP4242315A1; MX2023006460A; EP4242315A4; US20240002827A1; KR20220083557A

Abstract

本申请涉及一种使用ClpC变体或棒状杆菌属生产L‑支链氨基酸的方法。与非突变微生物相比具有减弱的突变ATP依赖性蛋白酶活性的微生物，生产的L‑支链氨基酸适用于各种产品，例如药物原料和食品添加剂、动物饲料、营养素、农药、杀菌剂等。

Description

突变的ATP依赖性蛋白酶和使用其生产L-氨基酸的方法

技术领域

本公开涉及ATP依赖性蛋白酶变体和使用其生产L-氨基酸的方法。

背景技术

相关技术的描述

L-氨基酸是蛋白质的基本组成单位，具有多种重要用途，如医药原料和食品添加剂、动物饲料、营养品、杀虫剂、杀菌剂等。特别是支链氨基酸(BCAA)为必需氨基酸L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸的统称，并且已知支链氨基酸具有抗氧化作用和直接促进肌肉细胞中蛋白质合成的作用。

同时，利用微生物生产支链氨基酸主要通过大肠杆菌属(Escherichia)的微生物或棒状杆菌属(Corynebacterium)的微生物进行，并且已知支链氨基酸是使用2-酮异己酸盐作为前体通过几个步骤从丙酮酸生物合成的(美国专利9885093、美国专利10351859、美国专利8465962)。然而，通过微生物生产支链氨基酸的问题在于工业上不容易大规模生产。

然而，随着对支链氨基酸的需求不断增加，仍然需要对支链氨基酸有效生产能力进行研究。

本发明人经过大量的努力以提高支链氨基酸的生产能力，结果，发明人开发了一种使用ATP依赖性蛋白酶变体以生产高浓度支链氨基酸的方法，从而完成了本公开。

发明内容

本公开的目的是提供一种棒状杆菌属的微生物，其中与未修饰的微生物相比，ATP依赖性蛋白酶活性减弱，优选为具有支链氨基酸生产能力的棒状杆菌属微生物。

本公开的另一个目的是提供一种ClpC变体，其中基于SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列删除了对应于位置431至433的氨基酸序列。

本公开的另一个目的是提供编码本公开的ClpC变体的多核苷酸。

本公开的另一目的是提供一种生产支链氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养本公开的棒状杆菌属的微生物，或包含本发明的任何一种或多种ClpC变体或本公开的多核苷酸的棒状杆菌属的微生物的步骤，以及包含其的载体的步骤。

生物保藏说明

谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)CA08-1542，保藏于韩国微生物培养中心，保藏地址为韩国首尔西大门区弘济内2号街45号柳林大厦03641，保藏日期为2020年7月2日，保藏编号为KCCM12755P。

谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)CA10-3123，保藏于韩国微生物培养中心，保藏地址为韩国首尔西大门区弘济内2号街45号柳林大厦03641，保藏日期为2020年12月1日，保藏编号为KCCM12858P。

具体实施方式

以下将详细描述本公开内容。同时，本公开中公开的每个描述和实施例也可以应用于其他描述和实施方式。也就是说，本公开中公开的各种元件的所有组合均落入本公开的范围内。此外，本公开的范围不受下面描述的具体描述的限制。此外，本领域技术人员将认识到，或者能够仅使用常规实验来确定，与本文所描述的本公开的具体实施例的许多等同物。此外，这些等同物应当解释为落入本公开的范围内。

本公开的一个方面提供棒状杆菌属的微生物，其中与未修饰的微生物相比，ATP依赖性蛋白酶活性减弱。

如本文所用，术语“ATP依赖性蛋白酶(EC 3.4.21.92)”是指在ATP和Mg2+存在下将蛋白质水解成小肽的酶。本公开的ATP依赖性蛋白酶可以与内肽酶Clp、ATP依赖性Clp蛋白酶、ClpP或Clp蛋白酶互换使用。

本公开的ATP依赖性蛋白酶的弱化可以是ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基的活性的弱化。

ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基可以与AAA家族ATP酶或ClpC互换使用。在本公开中，ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基的序列可以从已知数据库的NCBI的GenBank获得。具体地，所述亚基可以是由clpC编码的具有ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基活性的多肽，但不限于此。

本公开的ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基可以来源于棒状杆菌属。例如，本公开的ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基可以来源于谷氨酸棒杆菌。

本公开的ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基可以包括SEQ ID NO:5或与其具有90％或更高同一性的氨基酸序列表示的多肽。

例如，与本发明SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列具有90％或更高同一性的氨基酸序列可以是与本发明SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列具有至少91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、96.26％或更高、97％或更高、97.5％或更高、97.7％或更高、97.8％或更高、98％或更高、98.5％或更高、98.7％或更高、98.8％或更高、99％或更高、99.5％或更高、99.7％或更高、99.8％或更高，或者低于100％的同源性或同一性的氨基酸序列。此外，很明显，只要氨基酸序列具有这种的同源性或同一性，并且表现出与ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基相同或对应的活性，具有其中一些序列被删除、修饰、取代或添加的氨基酸序列的蛋白质也包括在本公开中待削弱的蛋白质的范围内。

此外，本公开的ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基可以具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与其具有90％或更高同一性的氨基酸序列表示的多肽，或者可以由多肽组成或基本上由多肽组成。本发明的ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基可以包括那些在SEQ ID NO:5的上游或下游添加了无意义序列或与之具有90％或更高同一性的氨基酸序列的亚基(即，在氨基酸序列的N-末端和/或C-末端添加了不改变蛋白质功能的序列)，或天然发生的突变、沉默突变或保守取代。

“保守取代”是指一种氨基酸被具有相似结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代。这种氨基酸取代通常可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性而发生。通常，保守取代可能几乎不影响或不影响蛋白质或多肽的活性。

本发明的微生物可以包括基于SEQ ID NO:5表示的序列具有对应于位置431至433的氨基酸删除的多肽，或者基于SEQ ID NO:6表示的序列具有对应于位置1291至1299的核苷酸删除的多核苷酸。

如本文所用，术语“对应于”是指多肽或多核苷酸中列出的位置处的氨基酸残基或核苷酸残基，或与多肽或多核苷酸中列出的氨基酸残基或核苷酸残基相似、相同或同源的氨基酸残基或核苷酸残基。鉴定相应位置的氨基酸或核苷酸可以是确定涉及特定序列的序列中的特定氨基酸或核苷酸。如本文所用，“相应区域”通常是指相关蛋白质或参考蛋白质中的类似或相应位置。

例如，任意氨基酸序列与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6进行比对，并且基于此，氨基酸序列的每个氨基酸残基可以参考对应于SEQ ID NO:6的氨基酸残基的氨基酸残基或对应于SEQ ID NO:6的核苷酸残基的核苷酸残基的数字位置来编号。例如，本发明中所述的序列比对算法可以通过与查询序列(也称为“参考序列”)中的序列进行比较来确定氨基酸的位置或发生诸如取代、插入或删除等修饰的位置。

例如，对于这种比对，尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)，EMBOSS软件包的尼德曼程序(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,Trends Genet.16:276-277)等，但不限于此，可以适当地使用本领域已知的序列比对程序、成对序列比较算法等。

如本文所用，多肽活性的术语“减弱”是一个概念，包括与内源性活性相比活性降低或活性不存在的两种情况。弱化可以与失活、缺少、下调、减少、降低、减弱等术语互换使用。

弱化还可以包括与微生物最初拥有的多肽的活性相比，由于编码多肽等的多核苷酸的变化而导致多肽本身的活性降低或消除的情况，与天然菌株相比，由于抑制编码多肽的多核苷酸的基因的表达或通过抑制翻译成多肽，细胞中总多肽活性水平和/或浓度(表达水平)较低的情况，多核苷酸根本不表达的情况，和/或即使表达多核苷酸也不存在多肽活性的情况。“内源活性”是指当性状因自然或人工因素的遗传变异而改变时，在性状改变之前，亲本菌株或野生型或未修饰微生物最初具有的特定多肽的活性。内源性活性可以与“修饰前的活性”互换使用。与内源活性相比，多肽的活性“失活、缺少、减少、下调、降低或减弱”这一事实意味着，与性状或未修饰微生物改变之前亲本菌株最初拥有的特定多肽的活性相比，多肽的活性降低。

可以通过本领域已知的任何方法进行多肽活性的这种弱化，但所述方法不限于此，并且可以通过应用本领域已知的各种方法来实现这种弱化(例如，NakashimaN et al.,Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing.Int J MolSci.2014；15(2):2773-2793,Sambrook et al.Molecular Cloning 2012,等)。

具体而言，本发明多肽活性的减弱可以是：

1)编码多肽的基因的全部或部分删除；

2)修饰表达调控区(或表达调控序列)以减少编码多肽的基因的表达；

3)修饰构成多肽的氨基酸序列以消除或减弱多肽的活性(例如，氨基酸序列中一个或多个氨基酸的删除/取代/添加)；

4)修饰编码多肽的基因序列以消除或减弱多肽的活性(例如，在多肽基因的核酸碱基序列中一个或多个核酸碱基的删除/取代/添加以编码经过修饰以消除或减弱多肽活性的多肽)；

5)修饰编码多肽的基因转录物的起始密码子或编码5'-UTR区的碱基序列；

6)引入与编码多肽的基因转录物互补结合的反义寡核苷酸(例如反义RNA)；

7)在编码多肽的基因的核糖体结合点序列之前添加与核糖体结合点序列互补的序列，以形成核糖体不能连接的二级结构；

8)向编码多肽的基因序列的开放阅读框(ORF)的3'端添加一个以相反方向转录(逆转录工程，RTE)的启动子；或

9)从1)到8)中选择的两种或多种的组合，但不限于此。

例如，

1)编码多肽的基因的部分或全部删除可以是删除编码染色体中所需的内在多肽的整个多核苷酸，用其中一些核苷酸被删除的多核苷酸替换，或者用标记基因替换。

此外，2)表达调控区(或表达调控序列)的修饰可以是删除、插入、非保守或保守取代或者其组合，由于而在表达调控区(或表达调控序列)中发生变异，或者用表现出较弱活性的序列替代。表达调控区包括启动子、操作序列、编码核糖体结合位点的序列以及调节转录和翻译终止的序列，但不限于此。

此外，3)和4)氨基酸序列或多核苷酸序列的修饰可以是多肽的氨基酸序列或编码多肽的多核苷酸序列的删除、插入、或非保守或保守取代或者其组合而导致序列发生变异，或氨基酸序列或多核苷酸序列取代表现出较弱活性或修饰为无活性的氨基酸序列或多核苷酸序列，使多肽的活性减弱，但不限于此。例如，可以通过在多核苷酸序列中引入变体并形成终止密码子来抑制或减弱基因的表达，但不限于此。

此外，5)编码多肽的基因转录物的起始密码子或编码5'-UTR区的碱基序列的修饰可以是，例如，与内在起始密码子相比，用编码具有较低多肽表达率的另一起始密码子的碱基序列取代，但不限于此。

此外，6)引入与编码多肽的基因的转录物互补结合的反义寡核苷酸(例如反义RNA)，可以参考文献，例如，[Weintraub,H.et al.,Antisense-RNA as a molecular toolfor genetic analysis,Reviews-Trends in Genetics,Vol.1(1)1986]。

此外，7)在编码多肽的基因的核糖体结合点序列之前添加与核糖体结合点序列互补的序列以形成核糖体不能连接的二级结构可能是使mRNA翻译不可能或减缓mRNA翻译速率。

此外，8)向编码多肽的基因序列的开放阅读框(ORF)的3'端添加一个以相反方向转录(逆转录工程，RTE)的启动子可能是通过使反义核苷酸与编码多肽的基因的转录物互补来减弱活性。

本公开的微生物可以具有产生支链氨基酸的能力。具体而言，本发明的支链氨基酸可以是L-缬氨酸或L-异亮氨酸。

如本文所用，术语“微生物(或菌株)”包括所有野生型微生物或天然或人工遗传修饰的微生物，并且其可以是由于插入外源基因或内源基因的活性增强或失活而减弱或增强特定机制的微生物，其可能是一种包括用于生产多肽，蛋白质或目标产物的基因修饰的微生物。

具体而言，本发明的菌株可以是其中支链氨基酸生产能力被赋予不具有支链氨基酸生产能力的亲本菌株的微生物，或将本发明减弱的ATP依赖性蛋白酶或编码该蛋白酶的多核苷酸(或包含多核苷酸的载体)引入具有支链氨基酸生产能力的微生物中，而不是天然存在的ATP依赖性蛋白酶，或者将天然存在的ATP依赖性蛋白酶修饰为本发明的减弱的ATP依赖性蛋白酶的微生物，但不限于此。

在本公开中，表达ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基变体并产生支链氨基酸的微生物可以是具有包括本发明的多核苷酸并且表达ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基变体，从而提高了支链氨基酸的生产能力特征的微生物。具体而言，在本发明中，表达ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基变体并产生支链氨基酸的微生物，或具有ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基变体表达能力和支链氨基酸生产能力的微生物可以是其中ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基活性减弱，且支链氨基酸生物合成途径中的一些基因增强或减弱，或ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基活性减弱，且支链氨基酸降解途径中的一些基因增强或减弱的微生物。

另外，本发明棒状杆菌属的微生物可以是其中乙酰乳酸合酶同工酶1小亚基活性增强，天冬氨酸激酶活性增强，高丝氨酸脱氢酶活性减弱和/或L-苏氨酸脱水酶生物合成IlvA活性增强的微生物。

如本文所用，术语多肽活性的“增强”是指与内在活性相比多肽的活性增加。增强可以与激活、上调、过表达、增加等术语互换使用。本文中激活、增强、上调、过表达和增加可以包括表现出最初不具有的活性和表现出改善的活性，与修饰前的活性或内在活性相比。“内在活性”是指在性状改变之前由亲本菌株最初拥有的特定多肽的活性，或者当由于自然或人工因素引起的遗传变异改变性状时，未修饰的微生物的活性。这可以与“修改前的活动”互换使用。与内在活性相比，多肽的活性“增强”、“上调”、“过表达”或“增加”，是指与性状或未修饰微生物改变之前亲本菌株最初拥有的特定多肽的活性和/或浓度(表达水平)相比，多肽的活性得到了提高。

可以通过引入外源多肽或增强多肽的内在活性和/或浓度(表达水平)来实现增强。多肽的活性增强可以通过相应多肽的活性程度和表达水平的增加或由相应多肽产生的产物的量的增加来证实。

可以应用本领域众所周知的各种方法增强多肽的活性，并且只要与修饰前的微生物相比，可以增强目标多肽的活性，则该方法不受限制。具体而言，可以使用本领域技术人员熟知的基因工程和/或蛋白质工程，这是分子生物学的常规方法，但该方法不限于此(例如，Sitnicka et al.Functional Analysis of Genes.Advances in Cell Biology.2010,Vol.2.1-16,Sambrook et al.Molecular Cloning 2012，等)。

具体而言，本发明多肽的活性增强可以是：

1)编码多肽的多核苷酸的细胞内拷贝数增加；

2)用表现出强活性的序列替换编码多肽的染色体上的基因表达调控区；

3)修饰编码多肽的基因转录物的起始密码子或编码5'-UTR区的碱基序列；

4)修饰多肽的氨基酸序列以增强多肽的活性；

5)修饰编码多肽的多核苷酸序列以增强多肽的活性(例如，修饰多肽基因的多核苷酸序列以编码经过修饰的多肽以增强多肽活性)；

6)引入表现出多肽活性的外源多肽或编码多肽的外源多核苷酸；

7)编码多肽的多核苷酸的密码子优化；

8)分析多肽的三级结构以选择暴露位点并对暴露位点进行修饰或化学修饰；或

9)从1)到8)中选择的两个或多个的组合，但不限于此。

多肽活性的这种增强可以是相应多肽的活性或浓度表达水平的增加，基于野生型微生物菌株或被修饰前的微生物菌株中表达的多肽的活性或浓度，或者相应多肽产生的产物量的增加，但不限于此。

在本发明的微生物中，多核苷酸的部分或全部修饰可以通过以下方式诱导：(a)使用用于在微生物中插入染色体的载体进行同源重组或使用工程核酸酶(例如CRISPR-Cas9)进行基因组编辑和/或(b)用诸如紫外线的光和辐射和/或化学物质处理来，但不限于此。修饰部分或全部基因的方法可以包括使用DNA重组技术的方法。例如，通过将含有与目的基因同源的核苷酸序列的核苷酸序列或载体引入微生物中以引起同源重组，可以删除基因的一部分或全部。引入的核苷酸序列或载体可以包括显性选择标记，但不限于此。

本发明棒状杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、克氏棒状杆菌(Corynebacterium crudilactis)、荒漠棒状杆菌(Corynebacterium deserti)、有效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、帚石南棒杆菌(Corynebacterium callunae)、停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)、奇棒状杆菌(Corynebacterium singulare)、耐盐棒状杆菌(Corynebacterium halotolerans)、纹带棒状杆菌(Corynebacterium striatum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、污染棒状杆菌(Corynebacteriumpollutisoli)、亚胺棒状杆菌(Corynebacterium imitans)、龟板棒状杆菌(Corynebacterium testudinoris)或微黄棒状杆菌(Corynebacteriumflavescens)。

本发明的另一方面提供了一种ClpC变体，其中基于由SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列删除了对应于位置431至433的氨基酸序列。

ClpC变体可能是ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基变体。“ClpC”或“ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基”如上所述。

例如，本公开的ClpC变体可以包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的氨基酸序列或与其具有90％或更高同一性的氨基酸序列表示的多肽。

如上所述，本发明的ClpC变体可以具有由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的氨基酸序列或与其具有90％或更高同一性的氨基酸序列表示的多肽，或者可以由多肽组成或基本上由多肽组成。具体而言，本发明的ClpC变体可以包括与SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％或更高同源性或同一性的氨基酸序列。此外，很明显，具有氨基酸序列的变体(其中一些序列被删除，修饰，取代，保守取代或添加)也包括在本发明的范围内，只要氨基酸序列具有这种同源性或同一性并且表现出与本发明的ClpC变体相对应的功效。

如本文所用，术语“变体”是指在通过保守取代和/或修饰一个或多个氨基酸之前具有不同于变体的氨基酸序列但保持功能或性质的多肽。通常可以通过修饰多肽氨基酸序列的一个或多个氨基酸并评估修饰多肽的性质来鉴定这种变体。换句话说，与变异前多肽的能力相比，变体的能力可能会增加、不变或减少。一些变体可以包括其中一个或多个部分(例如N末端前导序列或跨膜结构域)已被去除的变体。其他变体可能包括其中一部分N和/或C末端已从成熟蛋白中去除的变体。术语“变体”可以与诸如修饰、修饰的多肽、修饰的蛋白质、突变体、突变蛋白和发散体(divergent)等术语互换使用，并且只要它是具有变体含义的术语，就不限于此。

此外，变体可以包括对多肽的性质和二级结构影响最小的氨基酸的删除或添加。例如，共翻译或翻译后参与蛋白质易位的信号(或前导)序列可以与变体的N末端缀合。该变体可以与其他序列或接头缀合，以便鉴定、纯化或合成。

如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指两个给定氨基酸序列或碱基序列之间的相似程度，可以表示为百分比。术语“同源性和同一性”通常可以互换使用。

保守的多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性由标准比对算法确定，并且可以一起使用由所用程序建立的默认间隙惩罚。基本上，同源的或同一的序列通常能够在中等或高度严格的条件下与整个或部分序列杂交。很明显，考虑到密码子简并性，杂交还包括多核苷酸与包括通用密码子或密码子的多核苷酸的杂交。

可以使用例诸如“FASTA”程序(例如使用Pearson等人(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85]:2444中的默认参数)等已知的计算机算法确定任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性。或者，可以使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)确定同源性，相似性或同一性(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)如在EMBOSS软件包的尼德曼程序(EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,Trends Genet.16:276-277)(版本5.0.0或更高版本)(包括GCG程序包(Devereux,J.,et al,Nucleic AcidsResearch 12:387(1984))，BLASTP，BLASTN，FASTA(Atschul,[S.][F.,][ET AL,J MOLECBIOL 215]:403(1990)；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,[ED.,]AcademicPress,San Diego,1994,and[CARILLO ETA/.](1988)SIAM JApplied Math 48:1073)中执行。例如，可使用美国国家生物技术信息中心的BLAST或ClustalW来确定同源性、相似性或同一性。

可以通过使用例如Needleman et al.(1970),J Mol Biol.48:443等GAP计算机程序(例如Smith and Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482)比较序列信息来确定多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性。总之，GAP程序可以定义为通过将类似比对的符号(即核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中较短的符号总数而获得的值。GAP程序的默认参数可能包括(1)二进制比较矩阵(包括恒等式为1，非恒等式为0的值)和Gribskov et al(1986)Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替代矩阵)，如Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas OfProtein Sequence And Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)所述；(2)每个空位罚分3.0，每个空位中每个符号额外罚分0.10(或空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5)；(3)端部空位不罚分。

对于本发明的一个示例，本发明的变体可以具有ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基活性。此外，与具有ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基活性的野生型多肽相比，本公开的变体可能具有增加支链氨基酸产量的活性。

本发明的另一个方面提供了编码本发明的ClpC变体的多核苷酸。

“ClpC变体”和“ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基变体”如上所述。

如本文所用，术语“多核苷酸”是作为核苷酸的聚合物具有一定长度或更长的DNA或RNA链，其中核苷酸单体通过共价键连接在长链中，更具体地说，它是指编码变体的多核苷酸片段。

编码本公开的ClpC变体的多核苷酸可以包括编码由SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其具有90％或更高同一性的氨基酸序列表示的多肽的碱基序列。作为本公开的一个示例，本发明的多核苷酸可以具有或包括由SEQ ID NO:2的核苷酸序列或与其具有90％或更高同一性的核苷酸序列表示的多核苷酸。此外，本公开的多核苷酸可以由或基本上由SEQID NO:2的核苷酸序列表示的多核苷酸组成。

在本公开的多核苷酸中，考虑到密码子简并性或旨在表达本公开变体的生物体中优选的密码子，只要不改变本公开的变体的氨基酸序列，就可以在编码区中进行各种修饰。

此外，本公开的多核苷酸可以包括可以由已知基因序列制备的探针，例如，只要可以在严格条件下与本公开的多核苷酸序列的全部或部分杂交的序列，序列不受限制。“严格条件”是指能够在多核苷酸之间进行特异性杂交的条件。这些条件在文献中有具体描述(参见J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,ColdSpring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubelet al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York,9.50-9.51,11.7-11.8)。其中的示例包括具有较高同源性或同一性的多核苷酸，即具有70％或更高，75％或更高，80％或更高，85％或更高，90％或更高，95％或更高，96％或更高，97％或更高，98％或更高，或99％或更高的同源性或同一性的多核苷酸相互杂交，而具有较低同源性或同一性的多核苷酸不相互杂交，或在普通Southern杂交的洗涤条件下，进行1次洗涤，具体来说，在盐浓度和60℃温度下，1X SSC，0.1％SDS下，进行2-3次洗涤，具体地，60℃，0.1X SSC，0.1％SDS，更具体地，68℃，0.1X SSC，0.1％SDS。

杂交要求两个核酸具有互补序列，尽管根据杂交的严格程度允许碱基之间的错配。术语“互补”用于描述能够相互杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，关于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本发明的多核苷酸还可以包括基本相似的核酸序列以及与整个序列互补的分离的核酸片段。

具体而言，可以使用杂交条件(包括Tm值为55℃的杂交步骤)和上述条件检测与本发明的多核苷酸具有同源性或同一性的多核苷酸。Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以由本领域技术人员根据目的适当调整。

杂交多核苷酸的适当严格性取决于多核苷酸的长度和互补程度，这些变量在本领域是众所周知的(例如，J.Sambrook et al.,如上文)。

本发明的另一个方面提供了包含本公开的多核苷酸的载体。

载体可以是用于在宿主细胞中表达多核苷酸的表达载体，但不限于此。

本公开的载体是指包括所需的多核苷酸序列的DNA构建体，所述多核苷酸序列可操作地与合适的调控序列连接，以便可以将所需的基因引入合适的宿主。调节序列可以包括能够启动转录的启动子，用于调节转录的任何操作序列，编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，以及调节转录和翻译终止的序列。载体可以转化到合适的宿主细胞中，然后独立于宿主基因组复制或发挥作用，或者可以整合到基因组本身中。例如，染色体中所需的多核苷酸可以通过用于细胞内染色体插入的载体被修饰的多核苷酸取代。可以通过本领域已知的任何方法将多核苷酸插入染色体，例如同源重组，但不限于此。

本发明中使用的载体没有特别限制，可以使用本领域已知的任何载体。常用载体的示例可包括天然或重组质粒、黏性质粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等可用作噬菌体载体或黏性质粒载体。pDZ系统，pBR系统，pUC系统，pBluescript II系统，pGEM系统，pTZ系统，pCL系统，pET系统等可用作质粒载体。具体而言，可以使用pDZ，pDC，pDCM2，pACYC177，pACYC184，pCL，pECCG117，pUC19，pBR322，pMW118，pCC1BAC载体等。

例如，编码所需多肽的多核苷酸可以通过载体将细胞内染色体插入染色体中。可以通过本领域已知的任何方法将多核苷酸插入染色体，例如同源重组，但不限于此。载体还可以包括用于鉴定染色体插入的选择标记。选择标记用于选择用载体转化的细胞，即用于鉴定目的核酸分子的插入，并且可以使用赋予选择性表型的标记，例如药物抗性、营养缺陷型、对细胞毒性剂的抗性或表面多肽的表达。在用选择剂处理的环境中，只有表达选择标记的细胞才能存活或表现出其他表型性状，因此可以选择转化的细胞。

如本文所用，术语“转化”是指将包含编码靶蛋白的多核苷酸的载体引入宿主细胞中，使得由多核苷酸编码的蛋白质可以在宿主细胞中表达。转化的多核苷酸可以通过插入宿主细胞的染色体来定位，也可以定位在染色体之外，只要它可以在宿主细胞中表达。此外，多核苷酸包括编码目的蛋白质的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式引入，只要它可以被引入宿主细胞然后表达。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式引入宿主细胞，所述表达盒是包含自我表达所需的所有元件的基因构建体。表达盒通常可以包括可操作地连接到多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。此外，多核苷酸可以以其自身形式引入宿主细胞中，并可操作地连接到宿主细胞中表达所需的序列，但不限于此。

转化本公开载体的方法包括将核酸引入细胞的任何方法，并且可以通过根据宿主细胞选择本领域已知的适当标准技术来进行。例如，该方法可以包括电穿孔、磷酸钙(CaPO₄)沉淀、氯化钙(CaCl₂)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)方法、DEAE-葡聚糖方法、阳离子脂质体方法和乙酸锂-DMSO方法等，但不限于此。

此外，如本文所用，术语“可操作连接”是指多核苷酸序列与启动子序列在功能上连接，该启动子序列启动并介导编码本发明目的蛋白质的多核苷酸的转录。

本公开的另一个方面提供了棒状杆菌属菌株，该菌株包括本公开的变体、本发明的多核苷酸或本发明的载体的任何一种或多种。

本公开的菌株可以是包括本发明的变体、本公开的多核苷酸和包括本公开的多核苷酸的载体中的任何一种或多种的菌株；修饰以表达本发明变体或本公开多核苷酸的菌株；表达本公开变体或本公开多核苷酸的菌株(例如重组菌株)；或具有本公开的变体活性的菌株(例如重组菌株)，但不限于此。

例如，本公开的菌株是用包括本公开的多核苷酸的载体或编码本公开的ClpC变体的多核苷酸转化并表达本公开的ClpC变体的细胞或微生物。关于本公开的目的，本公开的菌株可以包括能够通过包括本公开的ClpC变体产生支链氨基酸的所有微生物。例如，本公开的菌株可以是重组菌株，其中编码本公开的ClpC变体的多核苷酸被引入产生支链氨基酸的微生物中以表达ClpC变体，因此支链氨基酸生产能力得到增强。与天然野生型微生物或ClpC未修饰的微生物(即表达野生型醛脱氢酶(SEQ ID NO:5)的微生物或不表达修饰的(SEQ ID NO:1)蛋白质的微生物)相比，具有增强的支链氨基酸生产能力的重组菌株可以是具有增强的支链氨基酸生产能力的微生物，但不限于此。例如，作为比较支链氨基酸生产能力增加的ClpC未修饰微生物的目标菌株可以是CA08-0072菌株(KCCM11201P，US 8465962B2)或KCJI-38(KCCM11248P，韩国专利号10-1335789)，但不限于此。

如本文所用，术语“未修饰的微生物”不排除包括可能在微生物中自然发生的突变的菌株，并且可以是野生型菌株或天然菌株本身，或者可以是由于自然或人工因素引起的遗传变异改变性状之前的菌株。例如，未修饰的微生物可以是未引入或尚未引入本说明书中描述的ClpC变体的菌株。术语“未修饰的微生物”可以与“修饰前的菌株”、“修饰前的微生物”、“不变菌株”、“未修饰菌株”、“不变微生物”或“参考微生物”互换使用。

本公开的另一个方面提供了一种生产支链氨基酸的方法，所述方法包括在培养基中培养棒状杆菌属微生物的步骤，与未修饰的微生物相比，所述棒状杆菌属微生物的ATP依赖性蛋白酶活性减弱，或所述棒状杆菌属微生物包括本公开的ClpC变体、编码本公开的ClpC变体的多核苷酸或本公开的载体。

如本文所用，术语“培养”是指在适当控制的环境条件下培养本公开棒状杆菌属的微生物。可以根据本领域已知的合适培养基和培养条件进行本公开的培养方法。本领域技术人员可以根据所选菌株容易地调整和使用这种培养方法。具体而言，培养可以是分批型，连续型和/或补料分批型，但不限于此。

如本文所用，术语“培养基”是指含有培养本公开棒状杆菌属微生物所需营养物质的主要成分的混合物质，并且培养基提供生存和发育必不可少的营养物质和生长因子，包括水。具体而言，作为用于培养本公开棒状杆菌属微生物的培养基和其他培养条件，可以使用任何一种用于普通微生物培养的培养基，而不受特别限制。本公开棒状杆菌属的微生物可以在含有适当碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素等的普通培养基中培养，同时在有氧条件下控制温度、pH等。

具体而言，棒状杆菌属菌株的培养基可以在文献(“Manual ofMethods forGeneral Bacteriology”by theAmerican Society for Bacteriology(Washington D.C.,USA,1981))中找到。

在本公开中，所述碳源包括诸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等的碳水化合物；诸如甘露醇、山梨糖醇等的糖醇；诸如丙酮酸、乳酸、柠檬酸等的有机酸；诸如谷氨酸、蛋氨酸、赖氨酸等的氨基酸；等。可以使用天然有机营养素，如淀粉水解物、糖蜜、黑糖蜜、米糠、木薯、甘蔗渣和玉米浸泡固体(corn steep solids)。具体而言，可以使用碳水化合物如葡萄糖和灭菌的预处理糖蜜(即糖蜜转化为还原糖)，并且可以以各种方式使用适量的其他碳源，但不限于此。这些碳源可以单独使用，也可以两种或两种以上结合使用，但不限于此。

氮源，无机氮源如氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵等；有机氮源如诸如谷氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺等氨基酸、蛋白胨、新西兰胺、肉提取物、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浸泡固体(corn steep solids)、酪蛋白水解物、鱼或其分解产物、脱脂豆饼或其分解产物等是可以使用的。这些氮源可以单独使用，也可以两种或两种以上结合使用，但不限于此。

磷源可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或与相应的含钠盐。作为无机化合物，可以使用氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等。除了这些化合物之外，还可以包括氨基酸、维生素和/或合适的前体等。这些组分或前体可以分批或连续添加到培养基中，但不限于此。

此外，在培养本公开棒状杆菌属的微生物期间，可以通过以适当的方式向培养基中添加诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸或硫酸的化合物来调节培养基的pH。在培养期间，可以通过使用消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制起泡。可以向培养基中注入氧气或含氧气体以维持培养基的有氧状态，也可以不注入气体或注入氮气、氢气或二氧化碳气体以维持厌氧和微氧状态，但不限于此。

在本公开的培养中，培养温度可保持在20℃至45℃，特别是25℃至40℃，菌株可培养约10小时至约160小时，但不限于此。

通过本公开的培养产生的支链氨基酸可以分泌到培养基中或保留在细胞中。

本公开生产支链氨基酸的方法还可以包括制备本公开棒状杆菌属微生物的步骤，制备用于培养微生物的培养基的步骤，或这些步骤(以任意顺序)的组合，例如在培养步骤之前。

本公开生产支链氨基酸的方法还可以包括根据培养基(经过培养的培养基)中的培养物或从本公开棒状杆菌属的微生物中回收支链氨基酸的步骤。可以在培养步骤之后进一步包括所述回收步骤。

回收可以是根据本公开的微生物培养方法，通过本领域已知的合适方法收集所需支链氨基酸，例如分批、连续或补料分批培养方法。例如，可以使用离心、过滤、用结晶蛋白质沉淀剂处理(盐析)、提取、超声波崩解、超滤、透析、各种形式的色谱法(例如分子筛色谱(凝胶过滤)、吸附色谱、离子交换色谱和亲和色谱)、HPLC或其组合。可以通过本领域已知的合适方法从培养基或微生物中回收所需支链氨基酸。

此外，本公开生产支链氨基酸的方法还可以包括纯化步骤。可以通过本领域已知的合适方法进行纯化。例如，当本公开的生产支链氨基酸的方法包括回收步骤和纯化步骤时，可以不连续(或连续)进行回收步骤和纯化步骤，或可以同时进行或通过合并成一个步骤来进行，而不考虑顺序，但不限于此。

在本公开的方法中，变体、多核苷酸、载体、微生物和支链氨基酸等如其他方面所述。

本公开的另一个方面提供了一种用于生产支链氨基酸的组合物，所述组合物包括本公开的变体、编码该变体的多核苷酸、包括多核苷酸的载体或本公开的微生物；培养本公开微生物的培养基；或两种或两种以上的组合。

本公开的组合物还可以包括在用于生产支链氨基酸的组合物中常用的任意合适赋形剂。这些赋形剂可以是例如防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂或等渗剂，但不限于此。

在本公开的组合物中，变体、多核苷酸、载体、菌株、培养基、支链氨基酸等如其他方面所述。

本公开的另一个方面提供了棒状杆菌属微生物在支链氨基酸的生产中的用途，其中与未修饰的微生物相比，ATP依赖性蛋白酶活性减弱。

本公开的另一个方面提供了ClpC变体在支链氨基酸的生产中的用途，其中基于SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列或编码ClpC变体的多核苷酸，删除对应于位置431至433的氨基酸序列。

在下文中，将参考示例性实施例更详细地描述本公开。然而，以下示例性实施例仅是用于说明本公开的优选实施例，因此并不旨在限制本公开的范围。同时，本说明书中未描述的技术事项可以被本公开的技术领域或类似技术领域的技术人员充分理解并容易实施。

实施例1.人工突变选育具有L-缬氨酸生产能力增强的变体

1-1紫外线人工诱变

为了选择具有L-缬氨酸生产能力增强的变异菌株，将产生L-缬氨酸的NTG菌株谷氨酸棒杆菌CA08-0072(KCCM11201P，US 8465962 B2)涂布在含有琼脂的营养培养基上，并在30℃下培养36小时。

在室温下用紫外线照射由此获得的数百个菌落，以诱导菌株基因组的随机突变。

营养培养基的组成如下。

<营养培养基(pH 7.2)>

10g葡萄糖，5g牛肉提取物，10g多肽，2.5g氯化钠，5g酵母提取物，20g琼脂，2g尿素(基于1升蒸馏水)

1-2、诱变菌株发酵效价试验及菌株筛选

为了选择具有L-缬氨酸生产能力增强的变异菌株，与在实施例1-1中用作亲本菌株的谷氨酸棒杆菌CA08-0072相比，对随机突变诱导的菌株进行发酵效价测试。

具体而言，将每个菌落在营养培养基中进行传代培养，并将每个菌株接种到含有25ml生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，并于30℃下以200rpm转速振荡培养72小时。营养培养基和生产培养基的组成分别如下。

<营养培养基(pH 7.2)>

<生产培养基(pH 7.0)>

100g葡萄糖、40g硫酸铵、2.5g大豆蛋白、5g玉米浸泡固体(corn steep solids)、3g尿素、1g磷酸氢二钾、0.5g七水硫酸镁、100μg生物素、1mg盐酸硫胺素、2mg泛酸钙、3mg烟酰胺、30g碳酸钙(以1升蒸馏水计)。

此后，使用HPLC分析L-缬氨酸的浓度，并且分析的L-缬氨酸浓度显示在下表1中。

表1

参考表1，选择了M4菌株，与对照CA08-0072菌株相比，其显示出L-缬氨酸产量的增加最多。

实施例2.通过基因测序鉴定变异

对实施例1中具有L-缬氨酸生产能力增强的M4菌株的主要基因进行测序，并与CA08-0072菌株和野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC14067的主要基因进行比较。结果，证实M4菌株在clpC的开放阅读框(ORF)的特定位置包含变异，clpC是构成ATP依赖性蛋白酶的六聚体ATP酶活性伴侣亚基之一。具体而言，证实M4菌株在由SEQ ID NO:6表示的序列中在位置1291至1299(SEQ ID NO:4)处具有核苷酸删除。SEQ ID NO:6表示的序列是通常包含在野生型谷氨酸棒杆菌(ATCC14067，ATCC13032和ATCC13869)的clpC的ORF中的序列。

在以下实例中，我们试图确认该变体是否影响棒状杆菌属微生物产生氨基酸。

实施例3.变体引入菌株的生产及L-缬氨酸生产能力的检测

3-1.谷氨酸棒杆菌CA08-0072变异株的生产以及L-缬氨酸生产能力的评估

构建了一种用于将核苷酸序列(SEQ ID NO:2)引入产生L-缬氨酸的NTG菌株谷氨酸棒杆菌CA08-0072的载体，其中删除了SEQ ID NO:6表示的序列中1291至1299位(SEQ IDNO:4)的核苷酸。具体而言，根据试剂盒中提供的方案，使用G-Spin总DNA提取微型试剂盒(G-Spin Total DNA Extraction Mini Kit)(Intron，目录号17045)提取野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC14067的基因组DNA。以每个基因组DNA作为模板，分别使用SEQ ID NO:7和SEQID NO:8的引物和SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的引物进行PCR，以获得DNA片段(A和B)。这里使用的引物序列如下表2所示。

表2

SEQIDNO.	序列名称	序列
			7	P1	ctattctagatccagagaccctcaaggacaagcag
8	P2	ggacggtgcggtcatgcgcatgcgggcgcc
			9	P3	ggcgcccgcatgcgcatgaccgcaccgtcc
10	P4	ctattctagatcgatttggatgagggaatcatcg

使用这两个片段作为模板和SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10的引物进行重叠PCR，以获得1040bp的PCR产物(以下称为“变体引入片段”)。PCR方法如下：94℃变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃聚合60秒，25个循环；并在72℃下聚合7分钟。用限制酶XbaI(New England Biolabs，贝弗利，马萨诸塞州)处理变体引入片段，然后用T4连接酶(NewEngland Biolabs，贝弗利，马萨诸塞州)与不能在谷氨酸棒杆菌中复制的pDZ载体(美国专利号9109242和国际专利出版号2008-033001)连接，所述谷氨酸棒杆菌使用相同的限制酶处理。将制备的基因转化到大肠杆菌DH5α中，并在含有25mg/L卡那霉素的LB培养基中进行筛选，并使用DNA-spin质粒DNA纯化试剂盒(DNA-spin plasmid DNA purification kit)(Intron)获得DNA，以构建重组质粒pDZ-clpC_M4。

通过染色体上的同源重组将上述制备的重组质粒pDZ-clpC_M4转化为产生L-缬氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌CA08-0072(van der Rest et al.,Appl Microbiol Biotechnol52:541-545,1999)。在含有25mg/L卡那霉素的培养基中选择通过同源重组将载体插入染色体的菌株。然后，使用SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10的引物对完成了两次杂交谷氨酸棒杆菌转化体进行PCR，以制备变体引入染色体上clpC的ORF菌株。重组菌株命名为谷氨酸棒杆菌CA08-0072-clpC_M4。

为了比较制备的产生L-缬氨酸的谷氨酸棒杆菌CA08-0072和CA08-0072-clpC_M4之间产生L-缬氨酸的能力，进行了发酵效价测试。

具体而言，将每种菌株在营养培养基中传代培养，并接种到含有25ml生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm的转速振荡培养72小时。营养培养基和生产培养基的组成分别如下。

<营养培养基(pH 7.2)>

<生产培养基(pH 7.0)>

此后，使用HPLC分析L-缬氨酸的浓度，并且分析的L-缬氨酸浓度显示在下表3中。

表3

如表3的结果所示，证明了与对照组相比，CA08-0072-clpC_M4菌株的L-缬氨酸生产能力增加了14％。结果证实，通过clpC的ORF变体可以提高L-缬氨酸的生产能力。

CA08-0072-clpC_M4命名为CA08-1542，并根据布达佩斯条约，于2020年7月2日保藏在韩国微生物培养中心，保藏号为KCCM12755P。

3-2.谷氨酸棒杆菌CJ7V变异株的生产以及L-缬氨酸生产能力的评估

为了检查在属于谷氨酸棒杆菌的其他产生L-缬氨酸的菌株中是否也观察到相同的效果，将一种变体(ilvN(A42V)；Biotechnology and Bioprocess Engineering,June2014,Volume 19,Issue 3,pp 456-467)引入野生型谷氨酸棒杆菌ATCC14067中，以生产具有L-缬氨酸生产能力增强的菌株。

具体而言，使用G-Spin总DNA提取微型试剂盒(G-Spin Total DNAExtractionMini Kit)提取野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC14067的基因组DNA。为了构建将A42V变体引入ilvN基因的载体，以基因组DNA为模板，分别使用SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物以及SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的引物进行PCR，以获得DNA片段(A和B)。此处使用的引物序列如表4所示。

表4

SEQIDNO.	序列名称	序列
			11	P5	aatttctagaggcagaccctattctatgaagg
12	P6	agtgtttcggtctttacagacacgagggac
			13	P7	gtccctcgtgtctgtaaagaccgaaacact
14	P8	aatttctagacgtgggagtgtcactcgcttgg

使用这两个片段作为模板和SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14的引物进行重叠PCR，以获得1044bp的PCR产物(以下称为“变体引入片段”)。PCR方法如下：94℃变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃聚合60秒，25个循环；并在72℃下聚合7分钟。结果表明，片段A和B均获得了537bp的多核苷酸。用限制酶XbaI处理变体引入片段。然后用T4连接酶与用相同限制性内切酶的pDZ载体连接，将制备的基因转化到大肠杆菌DH5α中，并在含有25mg/L卡那霉素的LB培养基中进行筛选，并使用DNA-spin质粒DNA纯化试剂盒(DNA-spinplasmidDNApurification kit)(Intron)获得DNA，将A42V变体引入ilvN基因的载体命名为pDZ-ilvN(A42V)。

此后，通过染色体上的同源重组将上述制备的重组质粒pDZ-ilvN(A42V)转化到野生型谷氨酸棒杆菌ATCC14067中。在含有25mg/L卡那霉素的培养基中选择通过同源重组将载体插入染色体的菌株。然后，使用SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14的引物对完成二次杂交的谷氨酸棒杆菌转化体进行PCR以扩增基因片段，然后通过基因测序分析鉴定变体引入的菌株。引入变体的重组菌株命名为谷氨酸棒杆菌CJ7V。

以与实施例3-1相同的方式用pDZ-clpC_M4转化谷氨酸棒杆菌CJ7V，以制备将变体引入clpC的ORF的菌株，该菌株命名为CJ7V-clpC_M4。

为了比较制备菌株的L-缬氨酸生产能力，以与实施例3-1相同的方式培养菌株，并分析L-缬氨酸的浓度，分析的L-缬氨酸浓度如表5所示。

表5

如表5的结果所示，证实与对照组相比，CJ7V-clpC_M4菌株的L-缬氨酸生产能力增加了14％。换句话说，也证实了通过棒状杆菌属微生物中clpC基因的ORF变体可以提高L-缬氨酸生产能力。

3-3.谷氨酸棒杆菌CJ8V变异株的生产及L-缬氨酸生产能力的评估

为了检查在属于谷氨酸棒杆菌的其他生产L-缬氨酸的菌株中是否也观察到相同的效果，将一种变体(ilvN(A42V))以与实施例3-2相同的方式引入野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869中以产生具有L-缬氨酸生产能力的变异菌株。重组菌株命名为谷氨酸棒杆菌CJ8V。

为了制备将clpC变体引入谷氨酸棒杆菌CJ8V的菌株，将实施例3-1中制备的重组载体pDZ-clpC_M4转化到CJ8V中。在含有25mg/L卡那霉素的培养基中选择通过同源重组将载体插入染色体的菌株。然后，使用SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:10的引物检查了完成二次杂交的谷氨酸棒杆菌转化体，并鉴定了clpC变体引入的菌株。如上所述，重组菌株被命名为谷氨酸棒杆菌CJ8V-clpC_M4。

为了比较制备菌株的L-缬氨酸生产能力，以与实施例3-1相同的方式培养菌株，并分析L-缬氨酸的浓度，分析的L-缬氨酸浓度如表6所示。

表6

如表6的结果所示，证实与对照组相比，CJ8V-clpC_M4菌株的L-缬氨酸生产能力增加了12％。换句话说，也证实了通过棒状杆菌属微生物中clpC基因的ORF变体可以提高L-缬氨酸生产能力。

实施例4.异亮氨酸生产菌的生产及生产能力评估

4-1.将clpC ORF变体引入生产L-异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌KCCM11248P菌株的生产及其评估

制备菌株，其中通过染色体上的同源重组将实施例3-1中制备的重组质粒pDZ-clpC_M4以与实施例3相同的方式引入产生L-异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌KCJI-38(KCCM11248P，美国专利号9885093)中，并将菌株命名为KCJI-38-clpC_M4。通过以下方法培养制备的菌株，并比较其生产异亮氨酸的能力。

具体而言，将每种菌株接种到含有25ml种子培养基的250ml角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm转速振荡培养20小时。此后，将1ml种子培养液接种到含有24ml生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm转速振荡培养48小时。种子培养基和生产培养基的组成分别如下。

<种子培养基(pH 7.0)>

20g葡萄糖，10g蛋白胨，5g酵母提取物，1.5g尿素，4g KH₂PO₄，8g K₂HPO₄，0.5gMgSO₄7H₂O，100μg生物素，1000μg硫胺素HCl，2000μg泛酸钙，2000μg烟酰胺(基于1升蒸馏水)

<生产培养基(pH 7.0)>

50g葡萄糖，12.5g(NH₄)₂SO₄，2.5g大豆蛋白，5g玉米浸泡固体(corn steepsolids)，3g尿素，1g KH₂PO₄，0.5g MgSO₄7H₂O，100μg生物素，1000μg硫胺素HCl，2000μg泛酸钙，3000μg烟酰胺，30g CaCO₃(基于1升蒸馏水)。

培养完成后，使用HPLC测定L-异亮氨酸生产能力。每个实验菌株培养液中L-异亮氨酸的浓度如表7所示。

表7

如表7所示，证实与生产L-异亮氨酸的菌株KCJI-38相比，引入clpC变体的KCJI-38-clpC_M4中L-异亮氨酸的浓度增加了约55％。这证实了通过clpC基因的变异可以提高L-异亮氨酸的生产能力。上述结果表明，将clpC ORF变体引入棒状杆菌属的L-异亮氨酸生产菌株中可有效生产L-异亮氨酸。

KCJI-38-clpC_M4命名为CA10-3123，并根据布达佩斯条约，于2020年12月1日保藏在韩国微生物培养中心，保藏号为KCCM12858P。

4-2.clpC ORF变体引入野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株生产L-异亮氨酸菌株和L-异亮氨酸生产能力的评估

为了研究引入clpC-M4变体对L-异亮氨酸生产能力的影响，通过将已知的天冬氨酸激酶变体(lysC(L377K))(US10662450 B2)，高丝氨酸脱氢酶变体(hom(R407H))(Appl.Microbiol.Biotechnol.45,612-620(1996))，或L-苏氨酸脱水酶变体(ilvA(V323A))(Appl.Enviro.Microbiol.,Dec.1996,p.4345-4351)引入谷氨酸棒杆菌ATCC13032(以下简称WT)菌株中来制备菌株，并比较它们产生L-异亮氨酸的能力。

具体而言，以WT的染色体作为模板和SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的引物进行PCR。这里使用的引物序列显示在下面的表8中。

表8

SEQIDNO.	序列名称	核苷酸序列
			15	P9	tcctctagaGCTGCGCAGTGTTGAATACG
16	P10	TGGAAATCttTTCGATGTTCACGTTGACAT
			17	P11	ACATCGAAaaGATTTCCACCTCTGAGATTC
18	P12	gactctagaGTTCACCTCAGAGACGATTA

PCR方法如下：94℃变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃聚合30秒，30个循环；并在72℃下聚合7分钟。结果表明，以lysC基因变体为中心，分别获得了上游5'处509bp的DNA片段和下游3'处520bp的DNA片段。使用扩增的两个DNA片段作为模板和SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:18的引物进行PCR。PCR方法如下：95℃变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃聚合30秒，30个循环；并在72℃下聚合7分钟。结果表明，扩增出1011bp的DNA片段，该DNA片段包括编码天冬氨酸激酶变体的lysC基因变体(L377K)，其中377位的亮氨酸被赖氨酸取代。用限制性内切酶XbaI处理pDZ载体和1011bp的扩增DNA片段，使用DNA连接酶连接，然后克隆以获得质粒，命名为pDZ-lysC(L377K)。

通过电脉冲方法(Appl.Microbiol.Biothcenol.(1999,52:541-545))将上述获得的pDZ-lysC(L377K)载体引入WT菌株，然后在含有25mg/L卡那霉素的选择性培养基中获得转化菌株。获得了一株WT::lysC(L377K)菌株，其中通过二次重组过程插入染色体的DNA片段将核苷酸变体引入lysC基因。

此外，为了制备用于引入hom(R407H)的载体，使用WT基因组DNA作为模板，使用SEQID NO:19和SEQ ID NO:20以及SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的引物进行PCR。这里使用的引物序列如表9所示。

表9

PCR方法如下：95℃变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃聚合30秒，30个循环；并在72℃下聚合7分钟。结果表明，以hom基因变体为中心，分别获得了上游5'处220bp的DNA片段和下游3'处220bp的DNA片段。以扩增的两个DNA片段作为模板和SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的引物进行PCR。PCR方法如下：95℃变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃聚合30秒，30个循环；并在72℃下聚合7分钟。结果表明，扩增出440bp的DNA片段，该DNA片段包括hom基因变体。用限制性内切酶XbaI处理上述使用的pDZ载体和440bp的扩增DNA片段，使用DNA连接酶连接，然后克隆以获得质粒，命名为pDZ-hom(R407H)。

通过电脉冲方法将上述获得的pDZ-hom(R407H)载体引入WT::lysC(L377K)菌株中，然后在含有25mg/L卡那霉素的选择性培养基中获得转化菌株。获得了一株WT::lysC(L377K)-hom(R407H)菌株，其中通过二次重组过程插入染色体的DNA片段将核苷酸变体引入hom基因。

以与上述实施例相同的方式，通过染色体上的同源重组将实施例3-1中制备的重组质粒pDZ-clpC_M4引入WT::lysC(L377K)-hom(R407H)菌株中，制备菌株，命名为WT::lysC(L377K)-hom(R407H)-clpC_M4。

同时，为了制备将已知的ilvA(V323A)变体(S.Morbach et al.,Appl.Enviro.Microbiol.,62(12):4345-4351,1996)引入ilvA基因的载体，以变体的位置为中心，分别设计了一对用于扩增上游5'的引物(SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24)和一对用于扩增下游3'的引物(SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26)。在SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:26的引物中，在每个末端插入BamHI限制酶位点(带下划线)。在SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的引物中，核苷酸取代的变体(带下划线)放置在设计为相互交叉的位点。这里设计的引物序列如表10所示。

表10

SEQ ID NO.	序列名称	序列
			23	P17	ACGGATCCCAGACTCCAAAGCAAAAGCG
24	P18	ACACCACGgCAGAACCAGGTGCAAAGGACA
			25	P19	CTGGTTCTGcCGTGGTGTGCATCATCTCTG
26	P20	ACGGATCCAACCAAACTTGCTCACACTC

以WT的染色体作为模板，并使用SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的引物进行PCR。PCR方法如下：95℃变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃聚合30秒，30个循环；并在72℃下聚合7分钟。结果表明，以ilvA基因变体为中心，分别获得了上游5'处627bp的DNA片段和下游3'处608bp的DNA片段。以扩增的两个DNA片段作为模板和SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:26的引物进行PCR。PCR方法如下：95℃变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃聚合60秒，30个循环；并在72℃下聚合7分钟。结果表明，扩增出1217bp的DNA片段，该DNA片段包括编码ilvA变体的ilvA基因的变体，其中323位的L-缬氨酸被丙氨酸取代。用限制性内切酶BamHI处理pECCG117(韩国专利号10-0057684)载体和1217bp的DNA片段，使用DNA连接酶连接，并克隆以获得质粒，其命名为pECCG117-ilvA(V323A)。

通过将pECCG117-ilvA(V323A)载体引入上述实施例的ATCC13032::hom(R407H)-lysC(L377K)-clpC_M4菌株中来制备ATCC13032::hom(R407H)-lysC(L377K)-clpC/pECCG117-ilvA(V323A)菌株。此外，通过仅将ilvA(V323A)变体引入ATCC13032::-hom(R407H)-lysC(L377K)来制备的菌株作为对照。

以与实施例4-1的烧瓶培养方法相同的方式培养制备的菌株，并分析培养液中L-异亮氨酸的浓度。菌株培养液中L-异亮氨酸的分析浓度如下表11所示。

表11

如表11所示，证实与仅将ilvA(V323A)变体引入ATCC13032::-hom(R407H)-lysC(L377K)的ATCC13032::-hom(R407H)-lysC(L377K)/pECCG117-ilvA(V323A)相比，进一步引入clpC_M4变体的ATCC13032::hom(R407H)-lysC(L377K)-clpC_M4/pECCG117-ilvA(V323A)显示L-异亮氨酸浓度增加约42％。上述结果表明，将clpC变体引入棒状杆菌属的L-异亮氨酸产生菌株中可有效产生L-异亮氨酸。

基于上述描述，本领域技术人员将理解，在不改变其技术精神或基本特征的基础上，本发明可以以不同的具体形式实施。在这方面，应该理解，上述实施例不是限制性的，所有方面是说明性的。本发明的范围由所附权利要求而不是其前面的描述来限定，因此，属于权利要求范围内或此范围的等效物的所有改变和修改均旨包含在权利要求内。

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 突变的ATP依赖性蛋白酶和使用其生产L-氨基酸的方法

<130> OPA21217

<150> KR 10-2020-0173802

<151> 2020-12-11

<160> 26

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 922

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ClpC变体ORF AA

<400> 1

Met Phe Glu Arg Phe Thr Asp Arg Ala Arg Arg Val Ile Val Leu Ala

1 5 10 15

Gln Glu Glu Ala Arg Met Leu Asn His Asn Tyr Ile Gly Thr Glu His

20 25 30

Ile Leu Leu Gly Leu Ile His Glu Gly Glu Gly Val Ala Ala Lys Ala

35 40 45

Leu Glu Ser Met Gly Ile Ser Leu Asp Ala Val Arg Gln Glu Val Glu

50 55 60

Glu Ile Ile Gly Gln Gly Ser Gln Pro Thr Thr Gly His Ile Pro Phe

65 70 75 80

Thr Pro Arg Ala Lys Lys Val Leu Glu Leu Ser Leu Arg Glu Gly Leu

85 90 95

Gln Met Gly His Lys Tyr Ile Gly Thr Glu Phe Leu Leu Leu Gly Leu

100 105 110

Ile Arg Glu Gly Glu Gly Val Ala Ala Gln Val Leu Val Lys Leu Gly

115 120 125

Ala Asp Leu Pro Arg Val Arg Gln Gln Val Ile Gln Leu Leu Ser Gly

130 135 140

Tyr Glu Gly Gly Gln Gly Gly Ser Pro Glu Gly Gly Gln Gly Ala Pro

145 150 155 160

Thr Gly Gly Asp Ala Val Gly Ala Gly Ala Ala Pro Gly Gly Arg Pro

165 170 175

Ser Ser Gly Gly Pro Gly Glu Arg Ser Thr Ser Leu Val Leu Asp Gln

180 185 190

Phe Gly Arg Asn Leu Thr Gln Ala Ala Lys Asp Gly Lys Leu Asp Pro

195 200 205

Val Val Gly Arg Asp Lys Glu Ile Glu Arg Ile Met Gln Val Leu Ser

210 215 220

Arg Arg Thr Lys Asn Asn Pro Val Leu Ile Gly Glu Pro Gly Val Gly

225 230 235 240

Lys Thr Ala Val Val Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Val Asn Gly Lys

245 250 255

Val Pro Glu Thr Leu Lys Asp Lys Gln Val Tyr Ser Leu Asp Leu Gly

260 265 270

Ser Leu Val Ala Gly Ser Arg Tyr Arg Gly Asp Phe Glu Glu Arg Leu

275 280 285

Lys Lys Val Leu Lys Glu Ile Asn Gln Arg Gly Asp Ile Ile Leu Phe

290 295 300

Ile Asp Glu Ile His Thr Leu Val Gly Ala Gly Ala Ala Glu Gly Ala

305 310 315 320

Ile Asp Ala Ala Ser Leu Leu Lys Pro Lys Leu Ala Arg Gly Glu Leu

325 330 335

Gln Thr Ile Gly Ala Thr Thr Leu Asp Glu Tyr Arg Lys His Ile Glu

340 345 350

Lys Asp Ala Ala Leu Glu Arg Arg Phe Gln Pro Val Gln Val Pro Glu

355 360 365

Pro Ser Val Asp Leu Thr Val Glu Ile Leu Lys Gly Leu Arg Asp Arg

370 375 380

Tyr Glu Ala His His Arg Val Ser Ile Thr Asp Gly Ala Leu Thr Ala

385 390 395 400

Ala Ala Gln Leu Ala Asp Arg Tyr Ile Asn Asp Arg Phe Leu Pro Asp

405 410 415

Lys Ala Val Asp Leu Ile Asp Glu Ala Gly Ala Arg Met Arg Met Thr

420 425 430

Ala Pro Ser Ser Leu Arg Glu Val Asp Glu Arg Ile Ala Asp Val Arg

435 440 445

Arg Glu Lys Glu Ala Ala Ile Asp Ala Gln Asp Phe Glu Lys Ala Ala

450 455 460

Gly Leu Arg Asp Lys Glu Arg Lys Leu Gly Glu Glu Arg Ser Glu Lys

465 470 475 480

Glu Lys Gln Trp Arg Ser Gly Asp Leu Glu Asp Ile Ala Glu Val Gly

485 490 495

Glu Glu Gln Ile Ala Glu Val Leu Ala Asn Trp Thr Gly Ile Pro Val

500 505 510

Phe Lys Leu Thr Glu Ala Glu Ser Ser Arg Leu Leu Asn Met Glu Glu

515 520 525

Glu Leu His Lys Arg Ile Ile Gly Gln Asp Glu Ala Val Lys Ala Val

530 535 540

Ser Arg Ala Ile Arg Arg Thr Arg Ala Gly Leu Lys Asp Pro Lys Arg

545 550 555 560

Pro Ser Gly Ser Phe Ile Phe Ala Gly Pro Ser Gly Val Gly Lys Thr

565 570 575

Glu Leu Ser Lys Ala Leu Ala Gly Phe Leu Phe Gly Asp Asp Asp Ser

580 585 590

Leu Ile Gln Ile Asp Met Gly Glu Phe His Asp Arg Phe Thr Ala Ser

595 600 605

Arg Leu Phe Gly Ala Pro Pro Gly Tyr Val Gly Tyr Glu Glu Gly Gly

610 615 620

Gln Leu Thr Glu Lys Val Arg Arg Lys Pro Phe Ser Val Val Leu Phe

625 630 635 640

Asp Glu Ile Glu Lys Ala His Lys Glu Ile Tyr Asn Thr Leu Leu Gln

645 650 655

Val Leu Glu Asp Gly Arg Leu Thr Asp Gly Gln Gly Arg Ile Val Asp

660 665 670

Phe Lys Asn Thr Val Leu Ile Phe Thr Ser Asn Leu Gly Thr Ser Asp

675 680 685

Ile Ser Lys Ala Val Gly Leu Gly Phe Ser Gly Ser Ser Glu Thr Asp

690 695 700

Ser Asp Ala Gln Tyr Asp Arg Met Lys Asn Lys Val His Asp Glu Leu

705 710 715 720

Lys Lys His Phe Arg Pro Glu Phe Leu Asn Arg Ile Asp Glu Ile Val

725 730 735

Val Phe His Gln Leu Thr Lys Asp Gln Ile Val Gln Met Val Asp Leu

740 745 750

Leu Ile Gly Arg Val Ser Asn Ala Leu Ala Glu Lys Asp Met Ser Ile

755 760 765

Glu Leu Thr Glu Lys Ala Lys Asp Leu Leu Ala Ser Arg Gly Phe Asp

770 775 780

Pro Val Leu Gly Ala Arg Pro Leu Arg Arg Thr Ile Gln Arg Glu Ile

785 790 795 800

Glu Asp Gln Met Ser Glu Lys Ile Leu Phe Gly Glu Ile Gly Ala Gly

805 810 815

Glu Ile Val Thr Val Asp Val Glu Gly Trp Asp Gly Glu Ser Lys Asp

820 825 830

Thr Asp Arg Ala Lys Phe Thr Phe Thr Pro Arg Pro Lys Pro Met Pro

835 840 845

Glu Gly Lys Phe Ser Glu Ile Ser Val Gln Ala Ala Glu Ala Ile Gln

850 855 860

Asp Val Asp Ser Ala Ala Asp Gly Asp Val Pro Glu Thr Asp Ser Leu

865 870 875 880

Ser Asp Ile Asp Leu Glu Thr Leu Glu Lys Phe Glu Glu Asp Val Glu

885 890 895

Asn Gly Thr Asp Ile Asp Gln Val Ser Gly Asp Tyr Tyr Gly Thr Asp

900 905 910

Asp Gln Gly Gly Thr Ala Pro Ser Lys Glu

915 920

<210> 2

<211> 2769

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> clpC 变体 ORF NT

<400> 2

atgttcgaga ggtttaccga tcgtgcacgc cgcgtgattg tgctcgcgca ggaagaggcg 60

cgcatgctca accacaatta catcggcacg gagcacattc tcctcggcct cattcacgag 120

ggcgagggcg ttgcagccaa ggctttggaa tccatgggaa tttccctgga cgccgtccgc 180

caggaagtcg aagagattat cggccagggc tcccagccca ccaccggcca cattcctttt 240

actccacgtg ccaagaaggt cctggagctc agcctccgcg agggactaca gatgggacac 300

aagtacatcg gtactgagtt cctgcttctc ggtttgatcc gtgagggcga gggcgttgct 360

gcccaggtcc tggtcaagct tggtgctgat ctgccacgcg tgcgtcagca agttattcag 420

cttctctccg gctacgaagg tggccagggc ggatccccag agggcggtca gggcgcccct 480

actggcggtg acgctgttgg tgcaggagct gctcctggcg gtcgtccatc ttcgggcggc 540

ccaggcgagc gttctacctc tttggttctt gaccagttcg gccgcaacct cacccaggcc 600

gcaaaggacg gcaagctgga cccagttgtt ggtcgtgata aggaaatcga gcgcatcatg 660

caggtgctct cccgtcgtac caagaacaac ccagttctta ttggtgagcc aggtgttggt 720

aagaccgcag ttgttgaagg tcttgcacta gacattgtta acggcaaggt tccagagacc 780

ctcaaggaca agcaggttta ctcccttgac ttaggttcac tggttgcagg ttcccgttac 840

cgcggtgact tcgaagagcg cctgaagaag gtcctcaagg agattaacca gcgcggcgac 900

atcatcctgt ttatcgatga gatccacacc ctcgtgggtg caggtgcagc agaaggcgca 960

atcgacgccg cctccctgct taagccaaag cttgcccgcg gtgaactgca gaccattggt 1020

gcaaccacct tggacgagta ccgtaagcac attgaaaagg acgcagctct tgagcgtcgt 1080

ttccagccag tgcaggttcc agagccttcg gttgatctca ccgttgagat cttgaagggt 1140

ctgcgcgacc gctacgaagc tcaccaccgc gtatccatca ccgatggtgc tcttaccgca 1200

gcagctcagc ttgctgatcg ctacattaac gaccgcttct tgccagataa ggccgttgac 1260

ctcatcgatg aggctggcgc ccgcatgcgc atgaccgcac cgtcctccct ccgcgaggtt 1320

gatgagcgca tcgctgatgt tcgccgtgag aaggaagcag cgatcgatgc tcaggacttt 1380

gagaaggcag caggtcttcg cgataaggag cgcaagctcg gcgaagagcg ttcagagaag 1440

gaaaagcagt ggcgctccgg cgacctcgag gacattgctg aggttggcga agagcagatc 1500

gcagaagtac tggccaactg gactggtatt cctgtcttca agctcaccga agctgagtct 1560

tcccgcctgc tcaacatgga agaagagttg cacaagcgca tcatcggaca ggatgaagct 1620

gtcaaggctg tctcccgtgc gatccgtcgt acccgtgcag gtctgaagga tcctaagcgt 1680

ccttccggct ccttcatctt cgctggtcca tccggtgttg gtaagaccga gctgtccaag 1740

gcacttgctg gattcctctt cggtgacgat gattccctca tccaaatcga catgggtgaa 1800

ttccacgacc gcttcaccgc gtcccgactc ttcggtgccc ctccgggata cgttggctac 1860

gaagaaggtg gccagctgac cgagaaggtt cgccgtaagc cattctccgt tgtgcttttc 1920

gacgagatcg agaaggccca caaggagatc tacaacacct tgctgcaggt gttggaagat 1980

ggtcgcctta ccgatggtca gggtcgcatt gtggacttca agaacaccgt cctgatcttc 2040

acctccaacc tgggcacctc tgacatctcc aaggctgttg gcctgggctt ctccggatcc 2100

tctgagactg acagcgatgc tcagtacgac cgcatgaaga acaaggtcca cgacgagctg 2160

aagaagcact tccgccctga gttcctgaac cgtattgatg agatcgtggt cttccaccag 2220

ctcaccaagg atcagatcgt tcagatggtc gaccttctta ttggccgcgt gtccaacgca 2280

ctggctgaga aggacatgag catcgaactg actgagaagg ctaaggatct ccttgccagc 2340

cgcggcttcg atccagttct gggtgcacga ccattgcgtc gcaccattca gcgcgaaatc 2400

gaagaccaga tgtccgagaa gatcctcttc ggagaaatcg gtgctggcga gatcgtcacc 2460

gtcgacgtcg aaggctggga cggcgagtcc aaggacaccg accgtgcgaa gttcaccttc 2520

acaccacgtc caaagccaat gccagaaggt aagttctctg agatctccgt acaggctgca 2580

gaagcaatcc aagatgtaga ttccgcagct gacggcgatg tcccagaaac cgattcactt 2640

tccgacattg accttgaaac ccttgagaag ttcgaggaag atgtagaaaa cggcaccgac 2700

attgatcagg tatccggtga ctactacggc accgatgatc agggaggcac tgctccaagc 2760

aaggagtag 2769

<210> 3

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 431~433 AA

<400> 3

Ile Lys Arg

1

<210> 4

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1,291~1,299 NT

<400> 4

atcaagcgc 9

<210> 5

<211> 925

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> ClpC ORF WT AA

<400> 5

Met Phe Glu Arg Phe Thr Asp Arg Ala Arg Arg Val Ile Val Leu Ala

1 5 10 15

Gln Glu Glu Ala Arg Met Leu Asn His Asn Tyr Ile Gly Thr Glu His

20 25 30

Ile Leu Leu Gly Leu Ile His Glu Gly Glu Gly Val Ala Ala Lys Ala

35 40 45

Leu Glu Ser Met Gly Ile Ser Leu Asp Ala Val Arg Gln Glu Val Glu

50 55 60

Glu Ile Ile Gly Gln Gly Ser Gln Pro Thr Thr Gly His Ile Pro Phe

65 70 75 80

Thr Pro Arg Ala Lys Lys Val Leu Glu Leu Ser Leu Arg Glu Gly Leu

85 90 95

Gln Met Gly His Lys Tyr Ile Gly Thr Glu Phe Leu Leu Leu Gly Leu

100 105 110

Ile Arg Glu Gly Glu Gly Val Ala Ala Gln Val Leu Val Lys Leu Gly

115 120 125

Ala Asp Leu Pro Arg Val Arg Gln Gln Val Ile Gln Leu Leu Ser Gly

130 135 140

Tyr Glu Gly Gly Gln Gly Gly Ser Pro Glu Gly Gly Gln Gly Ala Pro

145 150 155 160

Thr Gly Gly Asp Ala Val Gly Ala Gly Ala Ala Pro Gly Gly Arg Pro

165 170 175

Ser Ser Gly Gly Pro Gly Glu Arg Ser Thr Ser Leu Val Leu Asp Gln

180 185 190

Phe Gly Arg Asn Leu Thr Gln Ala Ala Lys Asp Gly Lys Leu Asp Pro

195 200 205

Val Val Gly Arg Asp Lys Glu Ile Glu Arg Ile Met Gln Val Leu Ser

210 215 220

Arg Arg Thr Lys Asn Asn Pro Val Leu Ile Gly Glu Pro Gly Val Gly

225 230 235 240

Lys Thr Ala Val Val Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Val Asn Gly Lys

245 250 255

Val Pro Glu Thr Leu Lys Asp Lys Gln Val Tyr Ser Leu Asp Leu Gly

260 265 270

Ser Leu Val Ala Gly Ser Arg Tyr Arg Gly Asp Phe Glu Glu Arg Leu

275 280 285

Lys Lys Val Leu Lys Glu Ile Asn Gln Arg Gly Asp Ile Ile Leu Phe

290 295 300

Ile Asp Glu Ile His Thr Leu Val Gly Ala Gly Ala Ala Glu Gly Ala

305 310 315 320

Ile Asp Ala Ala Ser Leu Leu Lys Pro Lys Leu Ala Arg Gly Glu Leu

325 330 335

Gln Thr Ile Gly Ala Thr Thr Leu Asp Glu Tyr Arg Lys His Ile Glu

340 345 350

Lys Asp Ala Ala Leu Glu Arg Arg Phe Gln Pro Val Gln Val Pro Glu

355 360 365

Pro Ser Val Asp Leu Thr Val Glu Ile Leu Lys Gly Leu Arg Asp Arg

370 375 380

Tyr Glu Ala His His Arg Val Ser Ile Thr Asp Gly Ala Leu Thr Ala

385 390 395 400

Ala Ala Gln Leu Ala Asp Arg Tyr Ile Asn Asp Arg Phe Leu Pro Asp

405 410 415

Lys Ala Val Asp Leu Ile Asp Glu Ala Gly Ala Arg Met Arg Ile Lys

420 425 430

Arg Met Thr Ala Pro Ser Ser Leu Arg Glu Val Asp Glu Arg Ile Ala

435 440 445

Asp Val Arg Arg Glu Lys Glu Ala Ala Ile Asp Ala Gln Asp Phe Glu

450 455 460

Lys Ala Ala Gly Leu Arg Asp Lys Glu Arg Lys Leu Gly Glu Glu Arg

465 470 475 480

Ser Glu Lys Glu Lys Gln Trp Arg Ser Gly Asp Leu Glu Asp Ile Ala

485 490 495

Glu Val Gly Glu Glu Gln Ile Ala Glu Val Leu Ala Asn Trp Thr Gly

500 505 510

Ile Pro Val Phe Lys Leu Thr Glu Ala Glu Ser Ser Arg Leu Leu Asn

515 520 525

Met Glu Glu Glu Leu His Lys Arg Ile Ile Gly Gln Asp Glu Ala Val

530 535 540

Lys Ala Val Ser Arg Ala Ile Arg Arg Thr Arg Ala Gly Leu Lys Asp

545 550 555 560

Pro Lys Arg Pro Ser Gly Ser Phe Ile Phe Ala Gly Pro Ser Gly Val

565 570 575

Gly Lys Thr Glu Leu Ser Lys Ala Leu Ala Gly Phe Leu Phe Gly Asp

580 585 590

Asp Asp Ser Leu Ile Gln Ile Asp Met Gly Glu Phe His Asp Arg Phe

595 600 605

Thr Ala Ser Arg Leu Phe Gly Ala Pro Pro Gly Tyr Val Gly Tyr Glu

610 615 620

Glu Gly Gly Gln Leu Thr Glu Lys Val Arg Arg Lys Pro Phe Ser Val

625 630 635 640

Val Leu Phe Asp Glu Ile Glu Lys Ala His Lys Glu Ile Tyr Asn Thr

645 650 655

Leu Leu Gln Val Leu Glu Asp Gly Arg Leu Thr Asp Gly Gln Gly Arg

660 665 670

Ile Val Asp Phe Lys Asn Thr Val Leu Ile Phe Thr Ser Asn Leu Gly

675 680 685

Thr Ser Asp Ile Ser Lys Ala Val Gly Leu Gly Phe Ser Gly Ser Ser

690 695 700

Glu Thr Asp Ser Asp Ala Gln Tyr Asp Arg Met Lys Asn Lys Val His

705 710 715 720

Asp Glu Leu Lys Lys His Phe Arg Pro Glu Phe Leu Asn Arg Ile Asp

725 730 735

Glu Ile Val Val Phe His Gln Leu Thr Lys Asp Gln Ile Val Gln Met

740 745 750

Val Asp Leu Leu Ile Gly Arg Val Ser Asn Ala Leu Ala Glu Lys Asp

755 760 765

Met Ser Ile Glu Leu Thr Glu Lys Ala Lys Asp Leu Leu Ala Ser Arg

770 775 780

Gly Phe Asp Pro Val Leu Gly Ala Arg Pro Leu Arg Arg Thr Ile Gln

785 790 795 800

Arg Glu Ile Glu Asp Gln Met Ser Glu Lys Ile Leu Phe Gly Glu Ile

805 810 815

Gly Ala Gly Glu Ile Val Thr Val Asp Val Glu Gly Trp Asp Gly Glu

820 825 830

Ser Lys Asp Thr Asp Arg Ala Lys Phe Thr Phe Thr Pro Arg Pro Lys

835 840 845

Pro Met Pro Glu Gly Lys Phe Ser Glu Ile Ser Val Gln Ala Ala Glu

850 855 860

Ala Ile Gln Asp Val Asp Ser Ala Ala Asp Gly Asp Val Pro Glu Thr

865 870 875 880

Asp Ser Leu Ser Asp Ile Asp Leu Glu Thr Leu Glu Lys Phe Glu Glu

885 890 895

Asp Val Glu Asn Gly Thr Asp Ile Asp Gln Val Ser Gly Asp Tyr Tyr

900 905 910

Gly Thr Asp Asp Gln Gly Gly Thr Ala Pro Ser Lys Glu

915 920 925

<210> 6

<211> 2778

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> clpC ORF WT NT

<400> 6

atgttcgaga ggtttaccga tcgtgcacgc cgcgtgattg tgctcgcgca ggaagaggcg 60

cgcatgctca accacaatta catcggcacg gagcacattc tcctcggcct cattcacgag 120

ggcgagggcg ttgcagccaa ggctttggaa tccatgggaa tttccctgga cgccgtccgc 180

caggaagtcg aagagattat cggccagggc tcccagccca ccaccggcca cattcctttt 240

actccacgtg ccaagaaggt cctggagctc agcctccgcg agggactaca gatgggacac 300

aagtacatcg gtactgagtt cctgcttctc ggtttgatcc gtgagggcga gggcgttgct 360

gcccaggtcc tggtcaagct tggtgctgat ctgccacgcg tgcgtcagca agttattcag 420

cttctctccg gctacgaagg tggccagggc ggatccccag agggcggtca gggcgcccct 480

actggcggtg acgctgttgg tgcaggagct gctcctggcg gtcgtccatc ttcgggcggc 540

ccaggcgagc gttctacctc tttggttctt gaccagttcg gccgcaacct cacccaggcc 600

gcaaaggacg gcaagctgga cccagttgtt ggtcgtgata aggaaatcga gcgcatcatg 660

caggtgctct cccgtcgtac caagaacaac ccagttctta ttggtgagcc aggtgttggt 720

aagaccgcag ttgttgaagg tcttgcacta gacattgtta acggcaaggt tccagagacc 780

ctcaaggaca agcaggttta ctcccttgac ttaggttcac tggttgcagg ttcccgttac 840

cgcggtgact tcgaagagcg cctgaagaag gtcctcaagg agattaacca gcgcggcgac 900

atcatcctgt ttatcgatga gatccacacc ctcgtgggtg caggtgcagc agaaggcgca 960

atcgacgccg cctccctgct taagccaaag cttgcccgcg gtgaactgca gaccattggt 1020

gcaaccacct tggacgagta ccgtaagcac attgaaaagg acgcagctct tgagcgtcgt 1080

ttccagccag tgcaggttcc agagccttcg gttgatctca ccgttgagat cttgaagggt 1140

ctgcgcgacc gctacgaagc tcaccaccgc gtatccatca ccgatggtgc tcttaccgca 1200

gcagctcagc ttgctgatcg ctacattaac gaccgcttct tgccagataa ggccgttgac 1260

ctcatcgatg aggctggcgc ccgcatgcgc atcaagcgca tgaccgcacc gtcctccctc 1320

cgcgaggttg atgagcgcat cgctgatgtt cgccgtgaga aggaagcagc gatcgatgct 1380

caggactttg agaaggcagc aggtcttcgc gataaggagc gcaagctcgg cgaagagcgt 1440

tcagagaagg aaaagcagtg gcgctccggc gacctcgagg acattgctga ggttggcgaa 1500

gagcagatcg cagaagtact ggccaactgg actggtattc ctgtcttcaa gctcaccgaa 1560

gctgagtctt cccgcctgct caacatggaa gaagagttgc acaagcgcat catcggacag 1620

gatgaagctg tcaaggctgt ctcccgtgcg atccgtcgta cccgtgcagg tctgaaggat 1680

cctaagcgtc cttccggctc cttcatcttc gctggtccat ccggtgttgg taagaccgag 1740

ctgtccaagg cacttgctgg attcctcttc ggtgacgatg attccctcat ccaaatcgac 1800

atgggtgaat tccacgaccg cttcaccgcg tcccgactct tcggtgcccc tccgggatac 1860

gttggctacg aagaaggtgg ccagctgacc gagaaggttc gccgtaagcc attctccgtt 1920

gtgcttttcg acgagatcga gaaggcccac aaggagatct acaacacctt gctgcaggtg 1980

ttggaagatg gtcgccttac cgatggtcag ggtcgcattg tggacttcaa gaacaccgtc 2040

ctgatcttca cctccaacct gggcacctct gacatctcca aggctgttgg cctgggcttc 2100

tccggatcct ctgagactga cagcgatgct cagtacgacc gcatgaagaa caaggtccac 2160

gacgagctga agaagcactt ccgccctgag ttcctgaacc gtattgatga gatcgtggtc 2220

ttccaccagc tcaccaagga tcagatcgtt cagatggtcg accttcttat tggccgcgtg 2280

tccaacgcac tggctgagaa ggacatgagc atcgaactga ctgagaaggc taaggatctc 2340

cttgccagcc gcggcttcga tccagttctg ggtgcacgac cattgcgtcg caccattcag 2400

cgcgaaatcg aagaccagat gtccgagaag atcctcttcg gagaaatcgg tgctggcgag 2460

atcgtcaccg tcgacgtcga aggctgggac ggcgagtcca aggacaccga ccgtgcgaag 2520

ttcaccttca caccacgtcc aaagccaatg ccagaaggta agttctctga gatctccgta 2580

caggctgcag aagcaatcca agatgtagat tccgcagctg acggcgatgt cccagaaacc 2640

gattcacttt ccgacattga ccttgaaacc cttgagaagt tcgaggaaga tgtagaaaac 2700

ggcaccgaca ttgatcaggt atccggtgac tactacggca ccgatgatca gggaggcact 2760

gctccaagca aggagtag 2778

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P1

<400> 7

ctattctaga tccagagacc ctcaaggaca agcag 35

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P2

<400> 8

ggacggtgcg gtcatgcgca tgcgggcgcc 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P3

<400> 9

ggcgcccgca tgcgcatgac cgcaccgtcc 30

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P4

<400> 10

ctattctaga tcgatttgga tgagggaatc atcg 34

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P5

<400> 11

aatttctaga ggcagaccct attctatgaa gg 32

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P6

<400> 12

agtgtttcgg tctttacaga cacgagggac 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P7

<400> 13

gtccctcgtg tctgtaaaga ccgaaacact 30

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P8

<400> 14

aatttctaga cgtgggagtg tcactcgctt gg 32

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P9

<400> 15

tcctctagag ctgcgcagtg ttgaatacg 29

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P10

<400> 16

tggaaatctt ttcgatgttc acgttgacat 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P11

<400> 17

acatcgaaaa gatttccacc tctgagattc 30

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P12

<400> 18

gactctagag ttcacctcag agacgatta 29

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P13

<400> 19

tcctctagac tggtcgcctg atgttctac 29

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P14

<400> 20

cacgatcaga tgtgcatcat cat 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P15

<400> 21

atgatgatgc acatctgatc gtg 23

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P16

<400> 22

gactctagat tagtcccttt cgaggcgga 29

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P17

<400> 23

acggatccca gactccaaag caaaagcg 28

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P18

<400> 24

acaccacggc agaaccaggt gcaaaggaca 30

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P19

<400> 25

ctggttctgc cgtggtgtgc atcatctctg 30

<210> 26

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P20

<400> 26

acggatccaa ccaaacttgc tcacactc 28

Claims

1.一种棒状杆菌属的微生物，其中与未修饰的微生物相比，ATP依赖性蛋白酶活性减弱。

2.根据权利要求1所述的棒状杆菌属微生物，其中所述微生物具有产生支链氨基酸的能力。

3.根据权利要求2所述的棒状杆菌属微生物，其中所述支链氨基酸为L-缬氨酸或L-异亮氨酸。

4.根据权利要求1所述的棒状杆菌属微生物，其中所述减弱是ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基活性的减弱。

5.根据权利要求4所述的棒状杆菌属微生物，其中ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基来源于棒状杆菌属。

6.根据权利要求4所述的棒状杆菌属微生物，其中ATP依赖性Clp蛋白酶ATP结合亚基包括SEQ ID NO:5或与其具有90％或更高同一性的氨基酸序列表示的多肽。

7.根据权利要求1所述的棒状杆菌属微生物，其中所述微生物包括基于SEQ ID NO:5表示的序列具有对应于位置431至433的氨基酸删除的多肽，或基于SEQ ID NO:6表示的序列具有对应于位置1291至1299的核苷酸删除的多核苷酸。

8.根据权利要求1所述的棒状杆菌属微生物，其中所述棒状杆菌属微生物为谷氨酸棒状杆菌。

9.一种ClpC变体，其中基于SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列，对应于位置431至433的氨基酸序列被删除。

10.根据权利要求9所述的ClpC变体，其中所述变体包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其具有90％或更高同一性的氨基酸序列表示的多肽。

11.一种编码权利要求9所述ClpC变体的多核苷酸。

12.一种生产支链氨基酸的方法，所述方法包括在培养基中对棒状杆菌属微生物或包括ClpC变体的微生物进行培养的步骤，其中所述棒状杆菌属微生物与未修饰的微生物相比，ATP依赖性蛋白酶活性减弱，并且所述ClpC变体中基于SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列或编码ClpC变体的多核苷酸，删除了对应于位置431至433的氨基酸序列。

13.根据权利要求12所述的方法，还包括在培养步骤之后从培养基或微生物中回收支链氨基酸的步骤。

14.棒状杆菌属微生物在生产支链氨基酸中的用途，其中与未修饰的微生物相比，所述棒状杆菌属微生物中ATP依赖性蛋白酶活性减弱。

15.ClpC变体在生产支链氨基酸中的用途，所述变体中基于SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列或编码ClpC变体的多核苷酸，删除对应于位置431至433的氨基酸序列。