CN117500919A - 新型柠檬酸合酶变体和使用其生产l-缬氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种新型柠檬酸合酶变体，包含该变体的微生物，以及通过使用该微生物生产L‑缬氨酸的方法。

Description

新型柠檬酸合酶变体和使用其生产L-缬氨酸的方法
技术领域
本公开涉及一种新型柠檬酸合酶变体，包括该变体的微生物，以及使用该微生物生产L-缬氨酸的方法。
背景技术
为了生产L-氨基酸和其他有益物质，已经进行了各种研究来开发具有高效生产的微生物和用于发酵工艺的技术。例如，靶标特异性方法，例如增加编码参与L-缬氨酸生物合成的酶的基因的表达的方法或去除生物合成不需要的基因的方法，已经被广泛使用(US8465962B2和KR 10-2153534B1)。
同时，柠檬酸合酶(CS)是一种通过催化微生物糖酵解过程中产生的乙酰基CoA和草酰乙酸的缩合来产生柠檬酸的酶，并且其也是决定碳流入TCA途径的重要酶。
先前在文献中报道了由于编码柠檬酸合酶的gltA基因的缺失而导致的生产L-赖氨酸的菌株的表型变化(Ooyen等人，Biotechnol.Bioeng.，109(8):2070-20812012)。然而，这些具有gltA基因缺失的菌株的缺点在于，不仅它们的生长受到抑制，而且它们的糖消耗率显著降低，从而导致每单位时间低的赖氨酸产量。因此，仍然需要进一步的研究，其既要考虑L-氨基酸生产率的有效增加，又要考虑菌株的生长。
公开内容
[技术问题]
作为大量努力来以高产率生产L-缬氨酸的结果，本发明人已经通过确认新型柠檬酸合酶变体增加L-缬氨酸生产能力而完成了本公开。
[技术方案]
本公开的目的是提供一种柠檬酸合酶变体，其中是与SEQ ID NO:1的氨基酸序列第413位对应的氨基酸的甘氨酸被天冬氨酸取代。
本公开的另一个目的是提供编码本公开的变体的多核苷酸。
本公开的仍另一个目的是提供包括本公开的变体或编码该变体的多核苷酸的棒状杆菌属的微生物。
本公开的仍另一个目的是提供使用本公开的微生物生产L-缬氨酸的方法。
本公开的仍另一个目的是提供用于生产L-缬氨酸的组合物，其包括本公开的微生物；在其上生长本公开的微生物的培养基；或其组合。
[有利效果]
当使用本公开的柠檬酸合酶变体时，可以以高产率生产L-缬氨酸。
具体实施方式
在下文中，将详细描述本公开内容。同时，本文公开的每个描述和实施方式可以应用于关于共同特征的其他描述和实施方式。也就是说，本文公开的各种要素的所有组合落入本公开的范围内。此外，本公开的范围不受以下描述的具体描述的限制。此外，在本说明书中参考和引用了许多论文和专利文献。所引用的论文和专利文件的内容通过引用的方式整体并入本文，并且将更清楚地描述本发明所属技术领域的水平和本发明的内容。
本公开的一个方面提供了柠檬酸合酶变体，其中是与SEQ ID NO:1的氨基酸序列第413位对应的氨基酸的甘氨酸被天冬氨酸取代。
本公开的变体可以是其中与SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列中基于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第413位对应的氨基酸是天冬氨酸的变体，并且其与SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.7％或更多的同源性或同一性。例如，本公开的变体可以其中与SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列中基于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第413位对应的氨基酸是天冬氨酸的变体，并且可以具有或包括与SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.7％或更多的同源性或同一性的氨基酸序列，或者可以由该氨基酸序列组成或基本上由该氨基酸序列组成。此外，显而易见的是，任何具有氨基酸序列的变体，其中序列的一部分被缺失、修饰、取代、保守取代或添加，也可以落入本公开的范围内，只要该氨基酸序列具有这样的同源性或同一性，并且表现出与本公开的变体的功效对应的功效即可。
例如，可以是用不改变本公开的变体的功能的序列、天然存在的突变、沉默突变或保守取代来添加或缺失氨基酸序列的N末端、C末端和/或内部的情况。
如本文所用，术语“保守取代”是指用具有相似结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸。这种氨基酸取代通常可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性而发生。通常，保守取代可能对蛋白质或多肽的活性有很少或没有影响。
如本文所用，术语“变体”是指具有与变体在通过保守取代和/或修饰而突变(从而保留蛋白质的功能和特性)之前的氨基酸序列不同的一个或多个氨基酸的多肽。这种变体通常可以通过修饰多肽的一个或多个上述氨基酸序列并评估修饰多肽的性质来鉴定。也就是说，相对于突变前的多肽，变体的能力可以被增强、不变或降低。此外，一些变体可能包括其中一个或多个区域，如N-末端前导序列或跨膜结构域已被去除的变体。此外，其他变体可以包括其中一个区域已经从成熟蛋白质的N-和/或C-末端去除的变体。术语“变体”可以与修饰、修饰多肽、修饰蛋白、突变体、突变蛋白(mutein)、歧化(divergent)等术语互换使用，只要这些术语用于指示突变即可。为了本公开的目的，变体可以是其中是与SEQ ID NO:1的氨基酸序列第415位对应的氨基酸的赖氨酸(Lys，K)被组氨酸(His，H)取代的变体。
此外，变体还可以包括对多肽的性质和二级结构具有最小影响的氨基酸的缺失或添加。例如，变体可以与N末端的信号(或前导)序列缀合，该序列参与蛋白质的共翻译或翻译后易位。此外，变体还可以与另一序列或接头缀合以鉴定、纯化或合成多肽。
如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指两个给定氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关性程度，并且可以用百分比表示。术语同源性和同一性经常可以彼此互换使用。
保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法来确定，并且可以与由所使用的程序建立的默认间隙罚分一起使用。基本上，同源或同一的序列通常预期在中等或高度严格的条件下与全部或部分序列杂交。显然，还包括与杂交多核苷酸中含有通用密码子或简并密码子的多核苷酸的杂交。
任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性可以例如通过使用默认参数的已知计算机算法如“FASTA”程序(Pearson et al.,(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA85]:2444)来确定。可选地，其可以通过Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)——其使用EMBOSS程序包的Needleman程序执行(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,Trends Genet.16:276-277)(优选5.0.0版或之后的版本)(GCG程序包(Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research 12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,[S.][F.,][ET AL.,JMOLEC BIOL 215]:403(1990))；Guide to HugeComputers,Martin J.Bishop,[ED.,]Academic Press,San Diego,1994和[CARILLO ETAL.](1988)SIAM J Applied Math 48:1073)确定。例如，同源性、相似性或同一性可以使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST或ClustalW来确定。
多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性可以例如通过使用例如GAP计算机程序比较序列信息来确定，例如Needleman et al.(1970),J Mol Biol.48:443，如Smith andWaterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482中所公开的。总之，GAP程序将同源性、相似性或同一性定义为通过将相似排列的符号(即核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中较短序列中的符号总数而获得的值。GAP程序的默认参数可以包括(1)二进制比较矩阵(含有对于同一性的值1和对于非同一性的值0)和Gribskov et al.(1986),Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵，如Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas of Protein Sequence andStructure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)中所公开的(或EDNAFLL取代矩阵(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本))；(2)每个间隙3.0的罚分和每个间隙中每个符号额外0.10的罚分(或10的间隙打开罚分和0.5的间隙扩展罚分)；以及(3)对于端部间隙没有罚分。
如本文所用，术语“对应”是指肽中所述位置处的氨基酸残基，或与肽中所述残基相似、同一或同源的氨基酸残基。鉴定对应位置处的氨基酸可以是确定一个序列中的特定氨基酸，所述序列是指一个特定序列。如本文所用的，“对应区域”通常指相关蛋白或参考蛋白中类似或对应的位置。
例如，任意氨基酸序列与SEQ ID NO:1比对，并且基于该比对，可以参考与SEQ IDNO:1的氨基酸残基对应的氨基酸残基的数字位置来对该氨基酸序列的每个氨基酸残基进行编号。例如，与查询序列(也称为“参考序列”)相比，例如本文所述的序列比对算法可以鉴定氨基酸的位置或发生诸如取代、插入或缺失等修饰的位置。
比对的实例可以通过Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定，该算法使用EMBOSS包的Needlemman程序(EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,TrendsGenet.16:276-277)等来执行，但不限于此，并且可以适当地使用本领域已知的序列比对程序，诸如成对序列比较算法等。
如本文所用，术语“柠檬酸合酶”是指通过催化在微生物的糖酵解过程中产生的乙酰基-CoA和草酰乙酸的缩合而产生柠檬酸的酶。此外，柠檬酸合酶催化来自乙酰基-CoA的两个碳乙酸残基与4-碳草酰乙酸分子的缩合反应，形成6-碳草酰乙酸。术语“柠檬酸合酶”可与“合成柠檬酸的酶”、“CS”、“GltA蛋白”或“GltA”互换使用。在本公开中，GltA的序列可以从已知数据库NCBI的GenBank获得。此外，GltA可以是由GltA基因编码的具有柠檬酸合酶活性的多肽，但不限于此。
与野生型多肽相比，本公开的变体可以具有增加L-缬氨酸生产能力的活性。
本公开的变体可以与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有80％或更多的序列同一性。
此外，本公开的变体可以包括由SEQ ID NO:3的氨基酸序列表示的多肽。SEQ IDNO:3的氨基酸序列可以是如此氨基酸序列，其中与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的N末端的第362至413位的氨基酸序列中的第413位对应的甘氨酸被天冬氨酸取代。
本公开的变体可以包括以下通式1的氨基酸序列：
[通式1]
X1N HGGDATX2FMN KVKNKEDGVR LMGFGHRVYK NYDPRAAIVK ETAHEILEHL GGDDLLDLAIKLEEIALADD X3FISRKLYPN VDFYTGLIYR AMGFPTDFFT VLFAIGRLPG WIAHYREQLG AADNX4(序列号：24)；
其中，在上述通式1中，
X1是天冬酰胺或丝氨酸；
X2是丙氨酸或谷氨酸；
X3是酪氨酸或半胱氨酸；和
X4是赖氨酸或组氨酸。
本公开的变体可以与SEQ ID NO:8、10、12或14的氨基酸序列具有90％或更多的序列同一性。此外，本公开的变体可以包括与SEQ ID NO:8、10、12或14的氨基酸序列具有90％或更多的序列同一性的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。例如，本公开的变体可以与SEQ ID NO:8、10、12或14的氨基酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.7％的序列同一性，可以包括具有该序列同一性的氨基酸序列，或者可以由具有该序列同一性的氨基酸序列组成或基本上由具有该序列同一性的氨基酸序列组成。
本公开的另一个方面提供了编码本公开的变体的多核苷酸。
如本文所用，术语“多核苷酸”是由通过共价键连接在长链中的核苷酸单体组成的核苷酸的聚合物，其是具有至少一定长度的DNA或RNA链。更具体地，它可以指编码变体的多核苷酸片段。
在本公开的多核苷酸中，与基于SEQ ID NO:2的核酸序列第1237至1239位对应的核苷酸是GAC，并且可以包括与SEQ ID NO:2表示的核酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％或更高并且少于100％的同源性或同一性的核酸序列表示的任何多核苷酸。此外，很明显，由核酸序列表示的任何多核苷酸，其中序列的一部分被缺失、修饰、取代、保守取代或添加，也可以落在本公开的范围内，只要该序列具有这样的同源性或同一性并且编码表现出与本公开的变体的功效对应的功效的多肽或蛋白质即可。
由于密码子简并或考虑到本公开的变体将在其中表达的生物体中优选的密码子，本公开的多核苷酸可以在不改变本公开的变体的氨基酸序列的范围内在编码区中进行各种修饰。本文中，在具有同源性或同一性的序列中，编码与SEQ ID NO:1的第413位对应的氨基酸的密码子可以是编码天冬氨酸的密码子之一。
此外，本公开的多核苷酸可以包括可以由已知基因序列制备的探针，例如非限制性地，在严格条件下可以与和本公开的全部或部分多核苷酸序列互补的序列杂交的任何序列。“严格条件”是指允许多核苷酸之间进行特异性杂交的条件。这些条件在文献(J.Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,ColdSpring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubelet al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York,9.50-9.51,11.7-11.8)中具体描述。例如，严格条件可以包括这样的条件，在该条件下具有70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多的高同源性或同一性的多核苷酸相互杂交并且与具有的同源性或同一性低于上述同源性或同一性的多核苷酸相互不杂交，或Southern杂交的洗涤条件，即对应60℃，1×SSC，0.1％ SDS，特别是60℃，0.1×SSC，0.1％ SDS，和更具体地68℃，0.1×SSC、0.1％ SDS的盐浓度和温度下洗涤一次，具体地二次或三次。
杂交需要两个核酸包含互补序列，尽管取决于杂交的严格性碱基之间的错配是可能的。术语“互补”用于描述可以相互杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，以及胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开的多核苷酸可以包括与整个序列互补的分离的核苷酸片段以及与其基本相似的核酸序列。
具体而言，可以使用杂交条件检测与本公开的多核苷酸具有同源性或同一性的多核苷酸，所述杂交条件包括在上述条件下在55℃的Tm值下的杂交步骤。此外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以由本领域技术人员根据其目的进行适当调整。
杂交多核苷酸的适当严格性取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且这些变量在本领域中是众所周知的(例如，J.Sambrook等人)。
在一个实例中，本公开的多核苷酸可包括由基于SEQ ID NO:9、11或13的核酸序列第1084-1239位的核酸序列表示的多核苷酸；由基于SEQ ID NO:15的核酸序列第1084-1245位的核酸序列表示的多核苷酸，或由SEQ ID NO:9、11、13或15的核酸序列表示的多核苷酸。在本公开的多核苷酸中，变体如以上其他方面所述。
本公开的仍另一方面提供了含有本公开的多核苷酸的载体。载体可以是用于在宿主细胞中表达多核苷酸的表达载体，但不限于此。
本公开的载体可以包括DNA构建体，该DNA构建体包含编码靶多肽的多核苷酸的核苷酸序列，该多核苷酸可操作地连接到合适的表达调控区(表达调控序列)，以便能够在合适的宿主细胞中表达靶多肽。表达调空区可以包括能够启动转录的启动子、用于调控转录的任何操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、以及用于调控转录和翻译终止的序列。一旦转化到合适的宿主细胞中，载体可以独立于宿主基因组复制或发挥作用，或者可以整合到其基因组中。
本公开中使用的载体没有特别限制，并且可以使用本领域已知的任何载体。通常使用的载体的实例可以包括天然或重组质粒、黏粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或黏粒载体，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A等；作为质粒载体，可以使用基于pDZ、pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL和pET等的那些。具体而言，可以使用pDZ、pDC、pDCM2、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117(Biotechnology letters vol 13,No.10,p.721-726(1991)、韩国专利号10-1992-0007401)、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等。
在一个实例中，编码靶多肽的多核苷酸可通过用于细胞内染色体插入的载体插入染色体中。多核苷酸插入染色体可以通过本领域已知的任何方法进行，例如通过同源重组，但不限于此。载体可以进一步包括用于确认插入染色体的选择标记。选择标记用于选择用载体转化的细胞，即用于确认靶核酸分子是否已被插入，并且可以使用提供可选择表型的标记，例如耐药性、营养缺陷型、对细胞毒性剂的耐药性或表面多肽的表达。只有表达选择标记的细胞能够在用选择剂处理的环境下存活或表现出不同的表型，因此可以选择转化的细胞。
如本文所用，术语“转化”是指将含有编码靶多肽的多核苷酸的载体引入宿主细胞或微生物中，从而由多核苷酸编码的多肽可以在宿主细胞中表达。只要转化的多核苷酸能够在宿主细胞中表达，转化的多核苷酸是整合到宿主细胞的染色体中并位于其中还是位于染色体外并不重要，这两种情况都可以包括在内。此外，多核苷酸可以包括编码靶多肽的DNA和/或RNA。多核苷酸可以以任何形式引入，只要它可以被引入宿主细胞并在其中表达即可。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式引入宿主细胞，表达盒是一种包括其自主表达所需的所有元件的基因构建体。表达盒通常可以包括可操作地连接到多核苷酸的启动子、转录终止子、核糖体结合位点或翻译终止子。表达盒可以是可自复制表达载体的形式。此外，多核苷酸可以原样引入宿主细胞中，并与在宿主细胞中表达所需的序列可操作地连接，但不限于此。
此外，如本文所用，术语“可操作地连接”是指多核苷酸序列在功能上连接到启动子序列，该启动子序列启动并介导编码本公开的靶变体的多核苷酸的转录。
在本公开的载体中，变体和多核苷酸如以上其他方面所述。
本公开的又另一方面提供棒状杆菌属的微生物，其包括本公开的变体或本公开的多核苷酸。
本公开的微生物可以包括本公开的变体、编码该变体的多核苷酸或包含本公开的多核苷酸的载体。
如本文所用，术语“微生物(或菌株)”包括所有野生型微生物，或天然或人工基因修饰的微生物，并且它可以是其中特定机制由于外来基因的插入或内源性基因的活性的增强或失活等而弱化或增强的微生物，并且可以是包括基因修饰以生产所需多肽、蛋白质或产物的微生物。
本公开的微生物可以是包括本公开的变体、本公开的多核苷酸和含有本公开的多核苷酸的载体中的任何一种或多种的微生物；经修饰以表达本公开的变体或本公开的多核苷酸的微生物；表达本公开的变体或本公开的多核苷酸的微生物(例如重组菌株)；或具有本公开的变体活性的微生物(例如重组菌株)，但不限于此。
本公开的微生物可以具有L-缬氨酸生产能力。
本公开的微生物可以是天然具有GltA或L-缬氨酸生产能力的微生物，或者已经用本公开的变体或编码该变体的多核苷酸(或包含该多核苷酸的载体)引入到非天然具有GltA或L-缬氨酸生产能力的亲本菌株的微生物，和/或已被给予GltA或L-缬氨酸生产能力的微生物，但不限于此。
在一个实例中，本公开的微生物是用本公开的多核苷酸或含有本公开的多核苷酸的载体转化以表达本公开的变体的细胞或微生物，并且出于本公开的目的，本公开的微生物可以包括能够产生L-缬氨酸的所有微生物，包括本公开的变体。例如，本公开的菌株可以是重组菌株，其通过将编码本公开的变体的多核苷酸引入天然野生型微生物或生产L-缬氨酸的微生物中来增加L-缬氨酸生产能力。具有增加的L-缬氨酸生产能力的重组菌株可以是与柠檬酸合酶的天然野生型微生物或未修饰的微生物(即，表达野生型蛋白(SEQ ID NO:1)的微生物或不表达本公开的变体的微生物)相比，具有增加的L-缬氨酸生产能力的微生物，但不限于此。例如，为用于比较L-缬氨酸生产能力增加的靶菌株的柠檬酸合酶的未修饰的微生物可以是ATCC14067菌株、ATCC13032菌株、ATCC13869菌株、谷氨酸棒状杆菌CJ7V菌株、谷氨酸棒状杆菌CJ8V菌株或CA08-0072菌株，但不限于此。
在一个实例中，与修饰前的亲本菌株或未修饰的微生物的L-缬氨酸生产能力相比，具有增加的生产能力的重组菌株可以具有增加约1％或更多、5％或更多、约10％或更多、约13％或更多、约15％或更多、约17％或更多、约20％或更多、约30％或更多或约40％或更多(上限没有特别限制，例如，约200％或更低、约150％或更小、约100％或更小、约50％或更低、约45％或更低或约40％或更低)的L-缬氨酸生产能力，但不限于此，只要其与修饰前的亲本菌株或未修饰的微生物的生产能力相比具有增加的+值即可。在另一实例中，与修饰前的亲本菌株或未修饰的微生物的L-缬氨酸生产能力相比，具有增加的生产能力的重组菌株可以具有增加约1.01倍或更多、约1.05倍或更多、约1.1倍或更多、约1.2倍或更多、约1.3倍或更多或约1.4倍或更多(上限没有特别限制，例如，约10倍或更少、约5倍或更小、约3倍或更少、或约2倍或更少)的L-缬氨酸生产能力，但不限于此。
如本文所用，术语“约”是指包括±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等的所有的范围，并且包括与该值之后的值相等或相似的所有值，但该范围不限于此。
如本文所用，术语“未修饰的微生物”不排除含有可能在微生物中自然发生的突变的菌株，并且可以指野生型菌株或自然型菌株本身，或者由于自然或人工因素引起的基因修饰而改变性状之前的菌株。例如，未修饰的微生物可以指未引入本文所述蛋白质变体的菌株，或者在其引入之前的菌株。“未修饰的微生物”可与“修饰前的菌株”、“修饰前的微生物”、“非突变菌株”、“未修饰的菌株”、“非突变微生物”或“参考微生物”互换使用。
在本公开的另一个实例中，本公开的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌、克氏棒状杆菌(Corynebacterium crudilactis)、荒漠棒状杆菌(Corynebacterium deserti)、高效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、帚石南棒状杆菌(Corynebacterium callunae)、停滞棒状杆菌(Corynebacterium stationis)、奇棒状杆菌(Corynebacterium singulare)、耐盐棒状杆菌(Corynebacterium halotolerans)、纹状体棒状杆菌(Corynebacteriumstriatum)、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、污染棒状杆菌(Corynebacterium pollutisoli)、亚胺棒状杆菌(Corynebacterium imitans)、睾丸棒状杆菌(Corynebacterium testudinoris)或微黄棒状杆菌(Corynebacterium flavescens)。
本公开的微生物可以是其中乙酰乳酸合酶同工酶1小亚基(IlvN)的活性被进一步增强的微生物。
如本文所用，术语多肽的活性的“弱化”是一个综合概念，包括与其内源性活性相比活性降低或无活性。弱化可以与失活、缺乏、下调、减少、降低、减弱等术语互换使用。
弱化还可以包括由于编码多肽等的多核苷酸的突变，与微生物最初拥有的多肽的活性相比，多肽活性本身降低或去除的情况；细胞内多肽活性和/或浓度(表达水平)的总体水平与天然菌株相比由于编码多肽的多核苷酸的基因的表达受到抑制或翻译成多肽受到抑制等而降低的情况；多核苷酸根本不表达的情况；和/或即使当多核苷酸表达时也没有观察到多肽活性的情况。如本文所用，术语“内源性活性”是指当性状通过由自然或人工因素引起的基因修饰而改变时，由转化前亲本菌株、野生型或未修饰的微生物最初拥有的特定多肽的活性，并且可以与“修饰前活性”互换使用。多肽活性与其内源性活性相比“失活、缺乏、减少、下调、降低或减弱”的表达意味着多肽活性与转化前亲本菌株或未修饰的微生物最初拥有的特定多肽的活性相比降低。
多肽活性的弱化可以通过本领域已知的任何方法来进行，但方法不限于此，并且可以通过应用本领域熟知的各种方法来实现(例如，Nakashima N et al.,Bacterialcellular engineering by genome editing and gene silencing.Int J Mol Sci.2014；15(2):2773-2793,Sambrook et al.Molecular Cloning 2012等)。
具体地，本公开的多肽活性的弱化可以是：
1)缺失编码多肽的基因的一部分或全部；
2)修饰表达调控区(表达调控序列)，使得编码多肽的基因的表达减少；
3)修饰构成多肽的氨基酸序列，使得多肽活性被去除或弱化(例如，氨基酸序列上一个或多个氨基酸的缺失/取代/添加)；
4)修饰编码多肽的基因序列，使得多肽活性被去除或弱化(例如，多肽基因的核苷酸序列上的一个或多个核苷酸的缺失/取代/添加，以编码已被修饰以去除或弱化多肽活性的多肽)；
5)修饰对编码多肽的基因转录物的起始密码子或5’-UTR进行编码的核苷酸序列；
6)引入反义寡核苷酸(例如，反义RNA)，其与编码多肽的基因转录物互补结合；
7)在编码多肽的基因的SD序列的前端添加与Shine-Dalgarno(SD)序列互补的序列以形成二级结构，从而抑制核糖体附着；
8)逆转录工程化(RTE)，其在编码多肽的基因序列的开放阅读框(ORF)的3′末端添加将被逆转录的启动子；或
9)选自上述1)至8)中的两种或更多种的组合，但不特别限于此。
例如，
1)缺失编码多肽的基因的一部分或全部可以是缺失染色体内编码内源性靶多肽的多核苷酸的全部，或者用具有部分缺失核苷酸的多核苷酸或用标记基因替换多核苷酸。
2)修饰表达调控区(表达调控序列)可以是通过缺失、插入、非保守取代或保守取代或其组合诱导对表达调控区(表达调控序列)的修饰；或者用具有较弱活性的序列替换该序列。表达调控区可以包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列、以及用于调控转录和翻译终止的序列，但不限于此。
3)和4)修饰氨基酸序列或多核苷酸序列可以是通过多肽的氨基酸序列或编码多肽的多核苷酸序列的缺失、插入、非保守或保守取代或其组合来诱导对序列的修饰，以弱化多肽的活性，或者用被修饰为具有较弱活性的氨基酸序列或多核苷酸序列、或者被修饰为不具有活性的氨基酸序列或多核苷酸序列替换该序列，但不限于此。例如，可以通过将突变引入多核苷酸序列以形成终止密码子来抑制或弱化基因的表达，但不限于此。
5)修饰对编码多肽的基因转录物的起始密码子或5’-UTR进行编码的核苷酸序列可以是，例如，用编码另一个起始密码子(其多肽表达率低于内源性起始密码子)的核苷酸序列取代核苷酸序列，但不限于此。
6)引入反义寡核苷酸(例如，反义RNA)，其与编码多肽的基因转录物互补结合，可在文献中找到[Weintraub,H.et al.,Antisense-RNA as a molecular tool for geneticanalysis,Reviews-Trends in Genetics,Vol.1(1)1986]。
7)在编码多肽的基因的SD序列的前端添加与Shine-Dalgarno(SD)序列互补的序列以形成二级结构，从而抑制核糖体附着可以是抑制mRNA翻译或降低其速度。
此外，8)逆转录工程化(RTE)，其在编码多肽的基因序列的开放阅读框(ORF)的3’末端添加将被逆转录的启动子，可以是形成与编码多肽的基因转录物互补的反义核苷酸，以弱化活性。
如本文所用，术语多肽活性的“增强”是指多肽的活性与其内源性活性相比增加。所述增强可以与诸如激活、上调、过表达、增加等术语互换使用。特别地，所述激活、增强、上调、过度表达和增加可以包括表现出最初不具有的活性，或者与内源性活性或修饰前活性相比活性被增强的两种情况。“内源性活性”是指当性状通过自然或人工因素引起的基因修饰而改变时，转化前亲本菌株或未修饰的微生物最初拥有的特定多肽的活性，并且可以与“修饰前活性”互换使用。多肽活性与其内源性活性相比的“增强”、“上调”、“过表达”或“增加”意味着多肽的活性和/或浓度(表达水平)与转化前亲本菌株或未修饰的微生物最初拥有的特定多肽的活性相比被增强。
增强可以通过引入外来多肽或通过增强内源性多肽的活性和/或浓度(表达水平)来实现。多肽活性的增强可以通过多肽活性水平、表达水平或从多肽分泌的产物量的增加来证实。
多肽活性的增强可以通过本领域公知的各种方法来应用，并且该方法不受限制，只要其与修饰前微生物的活性相比能够增强靶多肽的活性即可。具体地，可以使用本领域技术人员熟知的基因工程化和/或蛋白质工程化，这是分子生物学的常见方法，但该方法不限于此(例如，Sitnicka et al.Functional Analysis of Genes.Advances in CellBiology.2010,Vol.2.1-16,Sambrook et al.Molecular Cloning 2012等)。
具体地，本公开的多肽的活性的增强可以是：
1)增加编码多肽的多核苷酸的细胞内拷贝数；
2)用具有更强活性的序列替换染色体上编码多肽的基因的表达调控区；
3)修饰对编码多肽的基因转录物的起始密码子或5’-UTR进行编码的核苷酸序列；
4)修饰多肽的氨基酸序列，使得多肽活性被增强；
5)修饰编码多肽的多核苷酸序列，使得多肽活性被增强(例如，修饰多肽基因的多核苷酸序列以编码已被修饰来增强多肽活性的多肽)；
6)引入表现出多肽活性的外来多肽或编码其的外来多核苷酸；
7)编码多肽的多核苷酸的密码子优化；
8)分析多肽的三级结构，从而选择和修饰暴露的位点，或对其进行化学修饰；或
9)选自以上1)至8)中的两种或更多种的组合，但不特别限于此。
更具体地说，
1)增加编码多肽的多核苷酸的细胞内拷贝数可以通过将载体引入宿主细胞实现，该载体与编码多肽的多核苷酸可操作地连接，并且无论宿主细胞如何都能够复制和发挥作用。可选地，它可以是将编码多肽的多核苷酸的一个拷贝或两个拷贝引入宿主细胞的染色体中。引入染色体可以通过将能够将多核苷酸插入宿主细胞的染色体的载体引入宿主细胞来进行，但不限于此。载体如上所述。
2)用具有强活性的序列替换染色体上编码多肽的基因的表达调控区(或表达调控序列)可以是，例如，通过缺失、插入、非保守或保守取代或其组合诱导对序列的修饰，以进一步增强表达调控区的活性，或用具有更强活性的序列取代该序列。表达调控区可以包括但不特别限于启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列、以及调节转录和翻译终止的序列等。在一个实例中，它可以用强启动子取代原始启动子，但不限于此。
已知的强启动子的实例可包括CJ1至CJ7启动子(US 7662943 B2)、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子、tet启动子、gapA启动子、SPL7启动子、SPL13(sm3)启动子(US10584338 B2)、O2启动子(US10273491 B2)、tkt启动子和yccA启动子等，但强启动子不限于此。
3)修饰对编码多肽的基因转录物的起始密码子或5’-UTR进行编码的核苷酸序列可以是，例如，用编码与内源性起始密码子相比具有更高多肽表达率的另一个起始密码子的核苷酸序列取代核苷酸序列，但不限于此。
4)和5)修饰氨基酸序列或多核苷酸序列可以是通过多肽的氨基酸序列或编码多肽的多核苷酸序列的缺失、插入、非保守或保守取代或其组合来诱导对序列的修饰，以增强多肽的活性，或者用被修饰以具有更强活性的氨基酸序列或多核苷酸序列、或者被修饰以增强活性的氨基酸序列或多核苷酸序列替换该序列，但不限于此。替换可以通过同源重组将多核苷酸插入染色体中而具体地进行，但不限于此。本文中使用的载体可以进一步包括用于确认插入染色体的选择标记。选择标记如上所述。
6)引入表现出多肽活性的外来多核苷酸可以是将编码表现出与多肽相同/相似活性的多肽的外来多核苷酸引入宿主细胞。外来多核苷酸可以不受限制地使用，无论其来源或序列如何，只要其表现出与多肽相同/相似的活性即可。引入可以由本领域普通技术人员通过适当选择本领域已知的转化方法来进行，并且引入的多核苷酸在宿主细胞中的表达能够产生多肽，从而增加其活性。
7)编码多肽的多核苷酸的密码子优化可以是内源性多核苷酸的编码子优化以增加宿主细胞内的转录或翻译，或者优化其密码子以使外来多核苷酸的优化的转录和翻译可以在宿主细胞内实现。
此外，8)分析多肽的三级结构，从而选择和修饰暴露的位点，或对其进行化学修饰可以是，例如，将要分析的多肽的序列信息与存储已知蛋白质的序列信息的数据库进行比较，根据序列相似程度确定候选模板蛋白，从而根据信息确认结构，从而选择并转化或修饰待修饰或化学修饰的暴露位点。
多肽活性的这种增强可以意味着对应多肽的活性或浓度(表达水平)相对于在野生型菌株或修饰前微生物中表达的多肽的活性和浓度(表达水平)增加，或从多肽生产的产物的量增加，但不限于此。
本公开的微生物中多核苷酸的一部分或全部的修饰(例如，用于编码上述蛋白质变体的修饰)可以通过(a)使用用于在微生物中染色体插入的载体的同源重组或使用工程核酸酶(例如CRISPR-Cas9)的基因组编辑来实现，和/或(b)可以通过光诱导，例如紫外线和辐射等和/或化学处理，但不限于此。修饰基因的一部分或全部的方法可以包括使用DNA重组技术的方法。例如，可以通过将核苷酸序列或含有与靶基因同源的核苷酸序列的载体注入到微生物中以诱导同源重组来缺失基因的一部分或全部。注入的核苷酸序列或载体可以包括显性选择标记，但不限于此。
更具体地，本公开的生产L-缬氨酸的微生物可以是包括由SEQ ID NO:22的氨基酸序列表示的多肽和/或由SEQ ID NO:23的核苷酸序列表示的核苷酸的微生物。
在本公开的微生物中，变体、多核苷酸等如以上其他方面所述。
本公开的甚至另一个方面提供了生产L-缬氨酸的方法，包括：在培养基中培养棒状杆菌属的微生物，其包括本公开的变体或本公开的多核苷酸。
本公开的生产L-缬氨酸的方法可以包括在培养基中培养谷氨酸棒状杆菌菌株，该菌株包括本公开的变体、本公开的多核苷酸或本公开的载体。
如本文所用，术语“培养”是指本公开的棒状杆菌属微生物在适当控制的环境条件下生长。本公开的培养过程可以在本领域已知的合适的培养基和培养条件下进行。这种培养过程可以根据待选择的菌株容易地调整以供本领域技术人员使用。具体地，培养可以是分批培养、连续培养和/或补料分批培养，但不限于此。
如本文所用，术语“培养基”是指含有培养本公开的棒状杆菌属微生物所需的营养物质作为主要成分的材料的混合物，并且它提供营养物质和生长因子，以及对生存和生长至关重要的水。具体地，用于培养本公开的棒状杆菌属微生物的培养基和其他培养条件可以是用于常规培养微生物的任何培养基，而没有任何特别限制。然而，本公开的棒状杆菌属的微生物可以在需氧条件下在含有适当碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素的常规培养基中培养，同时调节温度、pH等。
具体而言，棒状杆菌属微生物的培养基可以在文献[the American Society forBacteriology的“Manual of Methods for General Bacteriology”(Washington D.C.,USA,1981)]中找到。
在本公开中，碳源可以包括碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等；糖醇，如甘露醇、山梨醇等；有机酸，如丙酮酸、乳酸、柠檬酸等；氨基酸，如谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸等。此外，碳源可以包括天然有机营养物，如淀粉水解物、糖蜜、黑糖糖蜜、米糠、木薯、甘蔗糖蜜和玉米浸液等。具体而言，可以使用碳水化合物，如葡萄糖和灭菌的预处理的糖蜜(即转化为还原糖的糖蜜)，并且另外地，可以非限制地使用适当量的各种其它碳源。这些碳源可以单独使用或以两种或更多种的组合使用，但不限于此。
氮源可以包括无机氮源，例如氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵等；氨基酸，如谷氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺等；以及有机氮源，例如蛋白胨、NZ胺、肉提取物、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浸液、酪蛋白水解物、鱼或其分解产物、脱脂豆饼或其分解产品等。这些氮源可以单独使用，也可以两种或更多种组合使用，但不限于此。
磷源可包括磷酸一钾、磷酸二钾或相应的含钠盐等。无机化合物的实例可包括氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等。另外，可包括氨基酸、维生素和/或适当的前体。这些构成成分或前体可以以分批或连续的方式添加到培养基中，但这些磷源不限于此。
此外，在本公开的谷氨酸棒状杆菌菌株的培养过程中，可以通过以适当的方式添加化合物如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸、硫酸等来调节培养基的pH。此外，在培养过程中可以使用消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯来防止气泡形成。此外，可以将氧气或含氧气体注入培养基中，以维持培养基的需氧条件；或者可以注入氮气、氢气或二氧化碳以维持厌氧或微需氧条件，不注入气体，但气体不限于此。
本公开的培养过程中的温度可以在20℃至45℃的范围内，具体地25℃至40℃，并且培养可以进行约10至160小时，但培养不限于此。
通过本公开的培养产生的L-缬氨酸可以释放到培养基中或保留在细胞中。
本公开的生产L-缬氨酸的方法可以进一步包括制备本公开的棒状杆菌属微生物的步骤、制备用于培养微生物的培养基的步骤，或其组合(无论顺序如何，以任何顺序)，例如，在培养步骤之前。
本公开的生产L-缬氨酸的方法可以进一步包括从本公开的培养基(培养物生长在其上的培养基)或棒状杆菌属的微生物中回收L-缬氨酸的步骤。可以在培养步骤之后进一步包括回收步骤。
在回收步骤中，可以使用本公开的培养微生物的方法，例如使用根据分批培养、连续培养或补料分批培养方法的本领域已知的合适方法，收集期望的L-缬氨酸。例如，可以使用方法诸如离心、过滤、用蛋白质结晶沉淀剂处理(盐析法)、提取、超声破碎、超滤、透析、各种色谱法(如分子筛色谱法(凝胶过滤)、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法等)、HPLC或其组合，并且可以使用本领域已知的合适方法从培养基或微生物中回收期望的L-缬氨酸。
此外，本公开的生产L-缬氨酸的方法还可以包括纯化步骤，该步骤可以使用本领域已知的适当方法进行。在一个实例中，当本公开的生产L-缬氨酸的方法包括回收步骤和纯化步骤两者时，回收步骤和纯化步骤可以连续地或间歇地进行，而与顺序无关，或者可以同时进行，或者可以整合到一个步骤中，但是该方法不限于此。
在本公开的方法中，变体、多核苷酸、载体、微生物等如以上其他方面中所述。
本公开的进一步另一个方面提供了一种用于生产L-缬氨酸的组合物，其包括：棒状杆菌属的微生物，其包括本公开的变体、编码本公开的变体的多核苷酸或包含本公开的多核苷酸的载体；培养基，微生物在其上生长；或其组合。
本公开的组合物可以进一步包括通常用于生产L-缬氨酸的组合物中的任何合适的赋形剂，并且这类赋形剂包括例如防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂或等渗剂等，但不限于此。
在本公开的组合物中，变体、多核苷酸、载体、菌株、培养基等如以上其他方面中所述。
[实施例]
在下文中，将通过实施例的方式详细描述本公开。然而，这些实施例仅仅是出于说明目的给出的优选实施例，因此，本公开的范围不旨在局限于这些实施例或由这些实施例限定。同时，在本公开的技术领域或类似技术领域中本领域技术人员可以充分理解并容易地实施本文未描述的技术特征。
实施例1：选择通过随机突变增加L-缬氨酸生产能力的变体菌株
实施例1-1：通过UV照射诱导随机突变
为了选择具有增加的L-缬氨酸生产能力的变体菌株，将谷氨酸棒状杆菌CA08-0072(KCCM11201P，US 8465962 B2)的生产L-缬氨酸的菌株平板接种在含有琼脂的营养培养基上，并在30℃下培养36小时。在室温下用UV照射数百个由此获得的菌落，以在菌株的基因组上诱导随机突变。
<营养培养基(pH 7.2)>
葡萄糖10g、肉提取物5g、聚蛋白胨10g、氯化钠2.5g、酵母提取物5g、琼脂20g、尿素2g(基于1L蒸馏水)。
实施例1-2：对突变诱导菌株的发酵效价的实验及菌株的选择
为了选择与用作亲本菌株的谷氨酸棒状杆菌CA08-0072相比具有增加的L-缬氨酸生产能力的变体菌株，对诱导了随机突变的菌株的发酵效价进行了实验。将每个菌落(M1至M16)在营养培养基中亚培养，然后将每个菌株接种到含有25ml生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养72小时。此后，使用HPLC分析L-缬氨酸的浓度，并且分析的L-缬氨酸浓度显示在下表1中。
<营养培养基(pH 7.2)>
葡萄糖10g、肉提取物5g、聚蛋白胨10g、氯化钠2.5g、酵母提取物5g、琼脂20g、尿素2g(基于1L蒸馏水)
<生产培养基(pH 7.0)>
葡萄糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浆固体5g、尿素3g、K2HPO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、硫胺素-HCl 1mg、泛酸钙2mg、烟酰胺3mg、CaCO330g(基于1L蒸馏水)
[表1]
结果，选择了L-缬氨酸生产能力增加最大的M5和M12菌株，与对照CA08-0072菌株相比，其L-缬氨酸生产能力分别增加了178％和181％。
实施例2：通过基因测序确认突变
对L-缬氨酸生产能力增加的M5和M12菌株的L-缬氨酸生产主基因进行测序，并与CA08-0072菌株和谷氨酸棒状杆菌ATCC14067、ATCC13032和ATCC13869的野生型菌株的那些基因进行比较。结果，确认M5和M12菌株在柠檬酸合酶(GltA)的特定位置含有突变。具体而言，在M5和M12中，确认了为GltA的第413位氨基酸的甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)取代。
在以下实施例中，试图确认突变是否影响棒状杆菌属微生物的L-缬氨酸生产率。
实施例3：用于引入突变的载体和用于引入突变的菌株的构建
实施例3-1：柠檬酸合酶变体的选择和载体的构建
构建其中为GltA第413位氨基酸的甘氨酸被天冬氨酸取代的载体。
基于野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC14067gDNA作为模板，使用SEQ ID NO:25和26以及SEQ ID NO:27和28的引物对进行PCR，以构建用天冬氨酸取代为GltA第413位氨基酸的甘氨酸的载体。此处，PCR在以下条件下进行：95℃下变性5分钟，然后30个循环的在95℃下变性30秒、在55℃下退火30秒并在72℃下聚合30秒，然后在72℃下聚合5分钟。使用SEQ IDNO:25和26的引物对，基于以上获得的两个片段的混合物作为模板进行重叠PCR以获得片段。在此，PCR在以下条件下进行：94℃下变性5分钟，然后30个循环的在94℃下变性30秒、在55℃下退火30秒并在72℃下聚合1分30秒，然后在72℃下聚合5分钟。用smaI处理pDCM2载体(韩国申请公开号10-2020-0136813)，并对以上获得的PCR产物各自进行融合克隆。使用InHD克隆试剂盒(Clontech)进行融合克隆。所得质粒命名为pDCM2-gltA(G413D)。本实施例中使用的引物的序列如下表2所示。
[表2]
实施例3-2：将GltA变体引入生产L-缬氨酸的菌株及其评价
实施例3-2-1.基于L-缬氨酸生产的菌株的构建以及其评价
将一种突变[ilvN(A42V)；Biotechnology and Bioprocess Engineering,June2014,Volume19,Issue 3,pp 456-467](SEQ ID NO:22)引入野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC14067和ATCC13869的乙酰乳酸合酶同工酶1小亚基(ilvN)中，以构建具有增强的L-缬氨酸生产能力的菌株(KR 10-1947945B1)。
具体而言，基于野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC14067 gDNA作为模板，使用SEQ IDNO:31和33以及SEQ ID NO:32和34的引物对进行PCR。使用SEQ ID NO:31和34的引物对，基于以上获得的两个片段的混合物作为模板进行重叠PCR以获得PCR片段。在此，PCR在以下条件下进行：94℃下变性5分钟，然后30个循环的在94℃下变性30秒、在55℃下退火30秒并在72℃下聚合1分30秒，然后在72℃下聚合5分钟。用smaI处理pDCM2载体，并对以上获得的PCR产物各自进行融合克隆。使用InHD克隆试剂盒(Clontech)进行融合克隆。所得质粒被命名为pDCM2-ilvN(A42V)。之后，将pDCM2-ilvN(A42V)转化到野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC14067和ATCC13869的每个中，以诱导染色体上的同源重组(van der Rest et al.,Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545,1999)。在含有25mg/L卡那霉素的培养基中选择通过同源序列重组在染色体上引入载体的菌株。通过使用SEQ ID NO:35和36的引物对的PCR，基于选择的谷氨酸棒状杆菌转化体扩增基因片段，并且通过基因测序分析确认了突变的引入。重组菌株分别命名为谷氨酸棒状杆菌CJ7V和CJ8V。在本实施例中使用的引物的序列如下面的表3所示。
[表3]
此后，基于野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC14067和ATCC13869以及上述构建的CJ7V和CJ8V菌株进行对发酵效价的实验。将每个菌株在营养培养基中亚培养，然后接种到含有25ml生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，并在30℃下以200rpm振荡培养72小时。此后，使用HPLC分析L-缬氨酸的浓度，并且分析的L-缬氨酸浓度如下面的表4所示。
<营养培养基(pH 7.2)>
葡萄糖10g、肉提取物5g、聚蛋白胨10g、氯化钠2.5g、酵母提取物5g、琼脂20g、尿素2g(基于1L蒸馏水)
<生产培养基(pH 7.0)>
葡萄糖100g、(NH4)2SO4 40g、大豆蛋白2.5g、玉米浆固体5g、尿素3g、K2HPO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、生物素100μg、硫胺素-HCl 1mg、泛酸钙2mg、烟酰胺3mg、CaCO330g(基于1L蒸馏水)
[表4]
基于L-缬氨酸生产的菌株CJ7V和CJ8V的L-缬氨酸生产能力
菌株 L-缬氨酸(g/L)
ATCC14067 1.5
CJ7V(ilvN(A42V)) 2.2
ATCC13869 1.0
CJ8V(ilvN(A42V)) 1.9
如结果所示，确认了与野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC14067和ATCC13869菌株相比，在引入ilvN(A42V)基因突变的CJ7V和CJ8V菌株中，L-缬氨酸生产能力增加。
实施例3-2-2：将GltA变体(G413D)引入生产L-缬氨酸的菌株及其评价
通过将GltA变体引入生产L-缬氨酸的菌株中评价L-缬氨酸生产能力。通过在染色体上同源重组将实施例3-1中构建的pDCM2-gltA(G413D)转化到生产L-缬氨酸的菌株CJ7V和CJ8V以及CA08-0072的每一个中。在含有25mg/L卡那霉素的培养基中选择通过同源序列重组在染色体上引入载体的菌株。
此后，通过使用SEQ ID NO:29和30(表5)的引物对的PCR，基于其中完成二次重组的谷氨酸棒状杆菌转化体扩增基因片段，然后通过基因测序分析确认了突变引入的菌株。重组菌株命名如下所示，并与实施例1中相同的方式进行效价评价。结果如表6所示。
[表5]
SEQ ID NO: 序列名称 序列
29 引物5 ATGTTTGAAAGGGATATCGTGGCT
30 引物6 TTAGCGCTCCTCGCGAGGAACC
[表6]
GltA变体菌株的L-缬氨酸生产能力
菌株 OD600 L-缬氨酸(g/L)
CJ7V 77 2.2
CJ7V:gltA(G413D) 76 2.5
CJ8V 89 1.9
CJ8V:gltA(G413D) 89 2.3
CA08-0072 62 2.6
CA08-0072:gltA(G413D) 60 2.9
如表6所示，G413D变体具有增加的L-缬氨酸生产能力，而没有生长降低。
实施例3-3：将GltA变体整合到生产L-缬氨酸的菌株的评价
实施例3-3-1.GltA变体整合载体的构建
基于实施例3-1中构建的载体，构建了整合变体的载体，该变体用组氨酸(H)取代为GltA第415氨基酸的赖氨酸(K)。具体而言，基于在实施例3-1中构建的pDCM2-gltA(G413D)作为模板，使用SEQ ID NO:37和38的引物对进行定点诱变PCR(BMC Biotechnologyvolume 9,Article number:61(2009))。由此，获得了其中为第413个氨基酸的甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)取代，并且为第415个氨基酸的赖氨酸(K)被组氨酸(H)取代的质粒，并且将其命名为pDCM2-gltA(G413D，K415H)。
[表7]
构建GltA变体整合载体的引物序列
SEQ ID NO: 名称 序列
37 引物13 CGTGGGCGGTTGATGTGGTTGTCTGCTGCAC
38 引物14 GTGCAGCAGACAACCACATCAACCGCCCACG
实施例3-3-2.将GltA变体整合菌株构建成生产L-缬氨酸的菌株和其评价
通过将GltA变体引入生产L-缬氨酸的菌株中评价L-缬氨酸生产能力。通过在染色体上同源重组将实施例3-3-1中构建的pDCM2-gltA(G413D,K415H)载体转化到生产L-缬氨酸的菌株CJ7V和CJ8V以及CA08-0072的每一个中。在含有25mg/L卡那霉素的培养基中选择通过同源序列重组在染色体上引入载体的菌株。
此后，通过使用SEQ ID NO:29和30的引物对的PCR，基于其中完成二次重组的谷氨酸棒状杆菌转化体扩增基因片段，然后通过基因测序分析确认了突变引入的菌株。重组菌株命名如下所示，并与实施例1中相同的方式进行效价评价。结果如表8所示。
[表8]
GltA变体整合菌株的L-缬氨酸生产能力
菌株 OD600 L-缬氨酸(g/L)
CJ7V 77 2.2
CJ7V:gltA(G413D) 76 2.5
CJ7V:gltA(G413D,K415H) 76 2.7
CJ8V 89 1.9
CJ8V:gltA(G413D) 89 2.3
CJ8V:gltA(G413D,K415H) 88 2.8
CA08-0072 62 2.6
CA08-0072:gltA(G413D) 60 2.9
CA08-0072:gltA(G413D,K415H) 61 3.1
从上述结果可以看出，确认了与未引入变体的亲本菌株相比，所有引入GltA变体的菌株都具有增加的L-缬氨酸产生能力，而没有生长降低。
CA08-0072:gltA(G413D)被命名为CA08-1687，并于2020年9月28日根据布达佩斯条约保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM)，登录号为KCCM12794P。此外，CA08-0072:gltA(G413D，K415H)被命名为CA08-1689，并于2020年9月28日根据布达佩斯条约保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM)，登录号为KCCM12796P。
根据以上内容，本公开所属领域的技术人员将能够理解，在不修改本公开的技术概念或基本特征的情况下，本公开可以以其他特定形式来体现。在这方面，本文公开的示例性实施方式仅用于说明目的，而不应被解释为限制本公开的范围。相反，本公开旨在不仅覆盖示例性实施方式，而且覆盖各种替代方案、修改、等价物和其他实施方式，这些实施方式可以包括在由所附权利要求限定的本公开的精神和范围内。
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> 新型柠檬酸合酶变体和使用其生产L-缬氨酸的方法
<130> OPA21398
<150> KR 10-2021-0031642
<151> 2021-03-10
<160> 38
<170> KoPatentIn 3.0
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<212> PRT
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Met Phe Glu Arg Asp Ile Val Ala Thr Asp Asn Asn Lys Ala Val Leu
1 5 10 15
His Tyr Pro Gly Gly Glu Phe Glu Met Asp Ile Ile Glu Ala Ser Glu
20 25 30
Gly Asn Asn Gly Val Val Leu Gly Lys Met Leu Ser Glu Thr Gly Leu
35 40 45
Ile Thr Phe Asp Pro Gly Tyr Val Ser Thr Gly Ser Thr Glu Ser Lys
50 55 60
Ile Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Ala Gly Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr
65 70 75 80
Asp Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asn Ala Thr Phe Asn Glu Val Ser Tyr
85 90 95
Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Phe
100 105 110
Asn Asp Glu Ile Arg His His Thr Leu Leu Asp Glu Asp Phe Lys Ser
115 120 125
Gln Phe Asn Val Phe Pro Arg Asp Ala His Pro Met Ala Thr Leu Ala
130 135 140
Ser Ser Val Asn Ile Leu Ser Thr Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Asn Pro
145 150 155 160
Leu Asp Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ala Thr Val Arg Leu Met Ala Lys
165 170 175
Val Pro Met Leu Ala Ala Tyr Ala His Arg Ala Arg Lys Gly Ala Pro
180 185 190
Tyr Met Tyr Pro Asp Asn Ser Leu Asn Ala Arg Glu Asn Phe Leu Arg
195 200 205
Met Met Phe Gly Tyr Pro Thr Glu Pro Tyr Glu Ile Asp Pro Ile Met
210 215 220
Val Lys Ala Leu Asp Lys Leu Leu Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln
225 230 235 240
Asn Cys Ser Thr Ser Thr Val Arg Met Ile Gly Ser Ala Gln Ala Asn
245 250 255
Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Gly Ile Asn Ala Leu Ser Gly Pro Leu
260 265 270
His Gly Gly Ala Asn Gln Ala Val Leu Glu Met Leu Glu Asp Ile Lys
275 280 285
Asn Asn His Gly Gly Asp Ala Thr Ala Phe Met Asn Lys Val Lys Asn
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Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Met Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys
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Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile Val Lys Glu Thr Ala His Glu Ile
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Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp Leu Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu
340 345 350
Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp Tyr Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr
355 360 365
Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe
370 375 380
Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly
385 390 395 400
Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Ala Gly Asn Lys Ile
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Asn Arg Pro Arg Gln Val Tyr Thr Gly Asn Glu Ser Arg Lys Leu Val
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Pro Arg Glu Glu Arg
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ggcgagttcg aaatggacat catcgaggct tctgagggta acaacggtgt tgtcctgggc 120
aagatgctgt ctgagactgg actgatcact tttgacccag gttatgtgag cactggctcc 180
accgagtcga agatcaccta catcgatggc gatgcgggaa tcctgcgtta ccgcggctat 240
gacatcgctg atctggctga gaatgccacc ttcaacgagg tttcttacct acttatcaac 300
ggtgagctac caaccccaga tgagcttcac aagtttaacg acgagattcg ccaccacacc 360
cttctggacg aggacttcaa gtcccagttc aacgtgttcc cacgcgacgc tcacccaatg 420
gcaaccttgg cttcctcggt taacattttg tctacctact accaggatca gctgaaccca 480
ctcgatgagg cacagcttga taaggcaacc gttcgcctca tggcaaaggt tccaatgctg 540
gctgcgtacg cacaccgcgc acgcaagggt gctccttaca tgtacccaga caactccctc 600
aacgcgcgtg agaacttcct gcgcatgatg ttcggttacc caactgagcc atacgagatc 660
gacccaatca tggtcaaggc tctggacaag ctgctcatcc tgcacgctga ccacgagcag 720
aactgctcca cctccaccgt tcgtatgatc ggttccgcac aggccaacat gtttgtctcc 780
atcgctggtg gcatcaacgc tctgtccggc ccactgcacg gtggcgcaaa ccaggctgtt 840
ctggagatgc tcgaagacat caagaacaac cacggtggcg acgcaaccgc gttcatgaac 900
aaggtcaaga acaaggaaga cggcgtccgc ctcatgggct tcggacaccg cgtttacaag 960
aattacgatc cacgtgcagc aatcgtcaag gagaccgcac acgagatcct cgagcacctc 1020
ggtggcgacg atcttctgga tctggcaatc aagctggaag aaattgcact ggctgatgat 1080
tacttcatct cccgcaagct ctacccgaac gtagacttct acaccggcct gatctaccgc 1140
gcaatgggct tcccaactga cttcttcacc gtattgttcg caatcggtcg tctgccagga 1200
tggatcgctc actaccgcga gcagctcggt gcagcaggca acaagatcaa ccgcccacgc 1260
caggtctaca ccggcaacga atcccgcaag ttggttcctc gcgaggagcg ctaa 1314
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Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu
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Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe
20 25 30
Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu
35 40 45
Gly Ala Ala Asp
50
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Met Phe Glu Arg Asp Ile Val Ala Thr Asp Asn Asn Lys Ala Val Leu
1 5 10 15
His Tyr Pro Gly Gly Glu Phe Glu Met Asp Ile Ile Glu Ala Ser Glu
20 25 30
Gly Asn Asn Gly Val Val Leu Gly Lys Met Leu Ser Glu Thr Gly Leu
35 40 45
Ile Thr Phe Asp Pro Gly Tyr Val Ser Thr Gly Ser Thr Glu Ser Lys
50 55 60
Ile Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Ala Gly Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr
65 70 75 80
Asp Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asn Ala Thr Phe Asn Glu Val Ser Tyr
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Gln Phe Asn Val Phe Pro Arg Asp Ala His Pro Met Ala Thr Leu Ala
130 135 140
Ser Ser Val Asn Ile Leu Ser Thr Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Asn Pro
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Leu Asp Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ala Thr Val Arg Leu Met Ala Lys
165 170 175
Val Pro Met Leu Ala Ala Tyr Ala His Arg Ala Arg Lys Gly Ala Pro
180 185 190
Tyr Met Tyr Pro Asp Asn Ser Leu Asn Ala Arg Glu Asn Phe Leu Arg
195 200 205
Met Met Phe Gly Tyr Pro Thr Glu Pro Tyr Glu Ile Asp Pro Ile Met
210 215 220
Val Lys Ala Leu Asp Lys Leu Leu Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln
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Asn Cys Ser Thr Ser Thr Val Arg Met Ile Gly Ser Ala Gln Ala Asn
245 250 255
Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Gly Ile Asn Ala Leu Ser Gly Pro Leu
260 265 270
His Gly Gly Ala Asn Gln Ala Val Leu Glu Met Leu Glu Asp Ile Lys
275 280 285
Ser Asn His Gly Gly Asp Ala Thr Glu Phe Met Asn Lys Val Lys Asn
290 295 300
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305 310 315 320
Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile Val Lys Glu Thr Ala His Glu Ile
325 330 335
Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp Leu Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu
340 345 350
Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp Tyr Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr
355 360 365
Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe
370 375 380
Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly
385 390 395 400
Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Ala Gly Asn Lys Ile
405 410 415
Asn Arg Pro Arg Gln Val Tyr Thr Gly Asn Glu Ser Arg Lys Leu Val
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Gly Asn Asn Gly Val Val Leu Gly Lys Met Leu Ser Glu Thr Gly Leu
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Asn Asp Glu Ile Arg His His Thr Leu Leu Asp Glu Asp Phe Lys Ser
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Gln Phe Asn Val Phe Pro Arg Asp Ala His Pro Met Ala Thr Leu Ala
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Leu Asp Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ala Thr Val Arg Leu Met Ala Lys
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aatgcgcgtg agaacttcct gcgcatgatg ttcggttacc caaccgagcc atacgagatc 660
gacccaatca tggtcaaggc tctggacaag ctgctcatcc tgcacgctga ccacgagcag 720
aactgctcca cctccaccgt tcgtatgatc ggttccgcac aggccaacat gtttgtctcc 780
atcgctggtg gcatcaacgc tctgtccggc ccactgcacg gtggcgcaaa ccaggctgtt 840
ctggagatgc tcgaagacat caagagcaac cacggtggcg acgcaaccga gttcatgaac 900
aaggtcaaga acaaggaaga cggcgtccgc ctcatgggct tcggacaccg cgtttacaag 960
aactacgatc cacgtgcagc aatcgtcaag gagaccgcac acgagatcct cgagcacctc 1020
ggtggcgacg atcttctgga tctggcaatc aagctggaag aaattgcact ggctgatgat 1080
tacttcatct cccgcaagct ctacccgaac gtagacttct acaccggcct gatctaccgc 1140
gcaatgggct tcccaactga cttcttcacc gtattgttcg caatcggtcg tctgccagga 1200
tggatcgctc actaccgcga gcagctcggt gcagcagaca accacatcaa ccgcccacgc 1260
caggtctaca ccggcaacga atcccgcaag ttggttcctc gcgaggagcg ctaa 1314
<210> 18
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ATCC13869 GltA G413D, K415H AA
<400> 18
Met Phe Glu Arg Asp Ile Val Ala Thr Asp Asn Asn Lys Ala Val Leu
1 5 10 15
His Tyr Pro Gly Gly Glu Phe Glu Met Asp Ile Ile Glu Ala Ser Glu
20 25 30
Gly Asn Asn Gly Val Val Leu Gly Lys Met Leu Ser Glu Thr Gly Leu
35 40 45
Ile Thr Phe Asp Pro Gly Tyr Val Ser Thr Gly Ser Thr Glu Ser Lys
50 55 60
Ile Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Ala Gly Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr
65 70 75 80
Asp Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asn Ala Thr Phe Asn Glu Val Ser Tyr
85 90 95
Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Phe
100 105 110
Asn Asp Glu Ile Arg His His Thr Leu Leu Asp Glu Asp Phe Lys Ser
115 120 125
Gln Phe Asn Val Phe Pro Arg Asp Ala His Pro Met Ala Thr Leu Ala
130 135 140
Ser Ser Val Asn Ile Leu Ser Thr Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Asn Pro
145 150 155 160
Leu Asp Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ala Thr Val Arg Leu Met Ala Lys
165 170 175
Val Pro Met Leu Ala Ala Tyr Ala His Arg Ala Arg Lys Gly Ala Pro
180 185 190
Tyr Met Tyr Pro Asp Asn Ser Leu Asn Ala Arg Glu Asn Phe Leu Arg
195 200 205
Met Met Phe Gly Tyr Pro Thr Glu Pro Tyr Glu Ile Asp Pro Ile Met
210 215 220
Val Lys Ala Leu Asp Lys Leu Leu Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln
225 230 235 240
Asn Cys Ser Thr Ser Thr Val Arg Met Ile Gly Ser Ala Gln Ala Asn
245 250 255
Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Gly Ile Asn Ala Leu Ser Gly Pro Leu
260 265 270
His Gly Gly Ala Asn Gln Ala Val Leu Glu Met Leu Glu Asp Ile Lys
275 280 285
Asn Asn His Gly Gly Asp Ala Thr Ala Phe Met Asn Lys Val Lys Asn
290 295 300
Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Met Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys
305 310 315 320
Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile Val Lys Glu Thr Ala His Glu Ile
325 330 335
Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp Leu Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu
340 345 350
Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp Cys Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr
355 360 365
Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe
370 375 380
Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly
385 390 395 400
Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Ala Asp Asn His Ile
405 410 415
Asn Arg Pro Arg Gln Val Tyr Thr Gly Lys Glu Ser Arg Lys Leu Val
420 425 430
Pro Arg Glu Glu Arg
435
<210> 19
<211> 1314
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ATCC13869 GltA G413D, K415H NT
<400> 19
atgtttgaaa gggatatcgt ggctactgat aacaacaagg ctgtcctgca ctaccccggt 60
ggcgagttcg aaatggacat catcgaggct tctgagggta acaacggtgt tgtcctgggc 120
aagatgctgt ctgagactgg actgatcact tttgacccag gttatgtgag cactggctcc 180
accgagtcga agatcaccta catcgatggc gatgcgggaa tcctgcgtta ccgcggctat 240
gacatcgctg atctggctga gaatgccacc ttcaacgagg tttcttacct acttatcaac 300
ggtgagctac caaccccaga tgagcttcac aagtttaacg acgagattcg ccaccacacc 360
cttctggacg aggacttcaa gtcccagttc aacgtgttcc cacgcgacgc tcacccaatg 420
gcaaccttgg cttcctcggt taacattttg tctacctact accaggatca gctgaaccca 480
ctcgatgagg cacagcttga taaggcaacc gttcgcctca tggcaaaggt tccaatgctg 540
gctgcgtacg cacaccgcgc acgcaagggt gctccttaca tgtacccaga caactccctc 600
aacgcgcgtg agaacttcct gcgcatgatg ttcggttacc caaccgagcc atacgagatc 660
gacccaatca tggtcaaggc tctggacaag ctgctcatcc tgcacgctga ccacgagcag 720
aactgctcca cctccaccgt tcgtatgatc ggttccgcac aggccaacat gtttgtctcc 780
atcgctggtg gcatcaacgc tctgtccggc ccactgcacg gtggcgcaaa ccaggctgtt 840
ctggagatgc tcgaagacat caagaacaac cacggtggcg acgcaaccgc gttcatgaac 900
aaggtcaaga acaaggaaga cggcgtccgc ctcatgggct tcggacaccg cgtttacaag 960
aactacgatc cacgtgcagc aatcgtcaag gagaccgcac acgagatcct cgagcacctc 1020
ggtggcgacg atcttctgga tctggcaatc aagctggaag aaattgcact ggctgatgat 1080
tgcttcatct cccgcaagct ctacccgaac gtagacttct acaccggcct gatctaccgc 1140
gcaatgggct tcccaactga cttcttcacc gtattgttcg caatcggtcg tctgccagga 1200
tggatcgctc actaccgcga gcagctcggt gcagcagaca accacatcaa ccgcccacgc 1260
caggtctaca ccggcaagga atcccgcaag ttggttcctc gcgaggagcg ctaa 1314
<210> 20
<211> 172
<212> PRT
<213> 未知的
<220>
<223> IlvN AA
<400> 20
Met Ala Asn Ser Asp Val Thr Arg His Ile Leu Ser Val Leu Val Gln
1 5 10 15
Asp Val Asp Gly Ile Ile Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg
20 25 30
Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu Val Ser Ala Lys Thr Glu Thr Leu Gly
35 40 45
Ile Asn Arg Ile Thr Val Val Val Asp Ala Asp Glu Leu Asn Ile Glu
50 55 60
Gln Ile Thr Lys Gln Leu Asn Lys Leu Ile Pro Val Leu Lys Val Val
65 70 75 80
Arg Leu Asp Glu Glu Thr Thr Ile Ala Arg Ala Ile Met Leu Val Lys
85 90 95
Val Ser Ala Asp Ser Thr Asn Arg Pro Gln Ile Val Asp Ala Ala Asn
100 105 110
Ile Phe Arg Ala Arg Val Val Asp Val Ala Pro Asp Ser Val Val Ile
115 120 125
Glu Ser Thr Gly Thr Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Leu Asp Val Met
130 135 140
Glu Pro Phe Gly Ile Arg Glu Leu Ile Gln Ser Gly Gln Ile Ala Leu
145 150 155 160
Asn Arg Gly Pro Lys Thr Met Ala Pro Ala Lys Ile
165 170
<210> 21
<211> 520
<212> DNA
<213> 未知的
<220>
<223> IlvN NT
<400> 21
atggctaatt ctgacgtcac ccgccacatc ctgtccgtac tcgttcagga cgtagacgga 60
atcatttccc gcgtatcagg tatgttcacc cgacgcgcat tcaacctcgt gtccctcgtg 120
tctgcaaaga ccgaaacact cggcatcaac cgcatcacgg ttgttgtcga cgccgacgag 180
ctcaacattg agcagatcac caagcagctc aacaagctga tccccgtgct caaagtcgtg 240
cgacttgatg aagagaccac catcgcccgc gcaatcatgc tggttaaggt ctctgcggat 300
agcaccaacc gtccgcagat cgtcgacgcc gcgaacatct tccgcgcccg agtcgtcgac 360
gtggctccag actctgtggt tattgaatcc acaggcaccc caggcaagct ccgcgcactg 420
cttgatgtga tggaaccatt cggaatccgc gaactgatcc aatccggaca gattgcactc 480
aaccgcggtc cgaagaccat ggctccggcc aagatctaaa 520
<210> 22
<211> 172
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IlvN A42V AA
<400> 22
Met Ala Asn Ser Asp Val Thr Arg His Ile Leu Ser Val Leu Val Gln
1 5 10 15
Asp Val Asp Gly Ile Ile Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg
20 25 30
Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu Val Ser Val Lys Thr Glu Thr Leu Gly
35 40 45
Ile Asn Arg Ile Thr Val Val Val Asp Ala Asp Glu Leu Asn Ile Glu
50 55 60
Gln Ile Thr Lys Gln Leu Asn Lys Leu Ile Pro Val Leu Lys Val Val
65 70 75 80
Arg Leu Asp Glu Glu Thr Thr Ile Ala Arg Ala Ile Met Leu Val Lys
85 90 95
Val Ser Ala Asp Ser Thr Asn Arg Pro Gln Ile Val Asp Ala Ala Asn
100 105 110
Ile Phe Arg Ala Arg Val Val Asp Val Ala Pro Asp Ser Val Val Ile
115 120 125
Glu Ser Thr Gly Thr Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Leu Asp Val Met
130 135 140
Glu Pro Phe Gly Ile Arg Glu Leu Ile Gln Ser Gly Gln Ile Ala Leu
145 150 155 160
Asn Arg Gly Pro Lys Thr Met Ala Pro Ala Lys Ile
165 170
<210> 23
<211> 519
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IlvN A42V NT
<400> 23
atggctaatt ctgacgtcac ccgccacatc ctgtccgtac tcgttcagga cgtagacgga 60
atcatttccc gcgtatcagg tatgttcacc cgacgcgcat tcaacctcgt gtccctcgtg 120
tctgtaaaga ccgaaacact cggcatcaac cgcatcacgg ttgttgtcga cgccgacgag 180
ctcaacattg agcagatcac caagcagctc aacaagctga tccccgtgct caaagtcgtg 240
cgacttgatg aagagaccac catcgcccgc gcaatcatgc tggttaaggt ctctgcggat 300
agcaccaacc gtccgcagat cgtcgacgcc gcgaacatct tccgcgcccg agtcgtcgac 360
gtggctccag actctgtggt tattgaatcc acaggcaccc caggcaagct ccgcgcactg 420
cttgatgtga tggaaccatt cggaatccgc gaactgatcc aatccggaca gattgcactc 480
aaccgcggtc cgaagaccat ggctccggcc aagatctaa 519
<210> 24
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通式1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa是N或S。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)
<223> Xaa是A或E。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (73)
<223> Xaa是Y或C。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (127)
<223> Xaa是K或H。
<400> 24
Xaa Asn His Gly Gly Asp Ala Thr Xaa Phe Met Asn Lys Val Lys Asn
1 5 10 15
Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Met Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys
20 25 30
Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile Val Lys Glu Thr Ala His Glu Ile
35 40 45
Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp Leu Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu
50 55 60
Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp Xaa Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr
65 70 75 80
Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe
85 90 95
Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly
100 105 110
Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Ala Asp Asn Xaa
115 120 125
<210> 25
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物1
<400> 25
tcgagctcgg tacccccgtt cgtatgatcg gttccgcaca ggcc 44
<210> 26
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物2
<400> 26
cgtgggcggt tgatcttgtt gtctgctgca c 31
<210> 27
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物3
<400> 27
gtgcagcaga caacaagatc aaccgcccac g 31
<210> 28
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物4
<400> 28
ctctagagga tccccgccgt aagcagcctc tggtggaatg gtcagc 46
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物5
<400> 29
atgtttgaaa gggatatcgt ggct 24
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物6
<400> 30
ttagcgctcc tcgcgaggaa cc 22
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物7
<400> 31
tcgagctcgg tacccccgcg tcaccaaagc gga 33
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物8
<400> 32
gtccctcgtg tctgtaaaga ccgaaacact 30
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物9
<400> 33
agtgtttcgg tctttacaga cacgagggac 30
<210> 34
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物10
<400> 34
ctctagagga tccccttaga tcttggccgg agcca 35
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物11
<400> 35
ccgcgtcacc aaagcgga 18
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物12
<400> 36
ttagatcttg gccggagcca 20
<210> 37
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物13
<400> 37
cgtgggcggt tgatgtggtt gtctgctgca c 31
<210> 38
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物14
<400> 38
gtgcagcaga caaccacatc aaccgcccac g 31

Claims (12)

1.一种柠檬酸合酶变体，其中是与SEQ ID NO:1的氨基酸序列第413位对应的氨基酸的甘氨酸被天冬氨酸取代。
2.根据权利要求1所述的变体，其中所述变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有80％或更多的序列同一性。
3.根据权利要求1所述的变体，其中所述变体包含由SEQ ID NO:3的氨基酸序列表示的多肽。
4.根据权利要求1所述的变体，其中所述变体包含由以下通式1的氨基酸序列表示的多肽：
[通式1]
X1N HGGDATX2FMN KVKNKEDGVR LMGFGHRVYK NYDPRAAIVK ETAHEILEHL GGDDLLDLAIKLEEIALADD X3FISRKLYPN VDFYTGLIYR AMGFPTDFFT VLFAIGRLPG WIAHYREQLG AADNX4(SEQID NO:24)；
其中，在上述通式1中，
X1是天冬酰胺或丝氨酸；
X2是丙氨酸或谷氨酸；
X3是酪氨酸或半胱氨酸；和
X4是赖氨酸或组氨酸。
5.根据权利要求1所述的变体，其中所述变体与SEQ ID NO:8、10、12或14的氨基酸序列具有90％或更多的序列同一性。
6.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至5中任一项所述的变体。
7.一种棒状杆菌属的微生物，其包含柠檬酸合酶变体，其中是与SEQ ID NO:1的氨基酸序列第413位对应的氨基酸的甘氨酸被天冬氨酸取代，或编码所述变体的多核苷酸。
8.根据权利要求7所述的微生物，其中所述微生物具有L-缬氨酸生产能力。
9.根据权利要求7所述的微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒状杆菌。
10.一种生产L-缬氨酸的方法，其包括：在培养基中培养棒状杆菌属的微生物，所述微生物包含柠檬酸合酶变体，其中是与SEQ ID NO:1的氨基酸序列第413位对应的氨基酸的甘氨酸被天冬氨酸取代，或编码所述变体的多核苷酸。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述方法还包括从所培养的培养基或微生物中回收L-缬氨酸。
12.一种用于生产L-缬氨酸的组合物，所述组合物包含棒状杆菌属的微生物，所述微生物包含柠檬酸合酶变体，其中是与SEQ ID NO:1的氨基酸序列第413位对应的氨基酸的甘氨酸被天冬氨酸取代，或编码所述变体的多核苷酸；培养基，所述微生物在其上生长；或其组合。
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