KR101585061B1

KR101585061B1 - ClpC1 유전자 또는 ClpC2 유전자를 이용하여 식물체의 유리 아미노산 함량을 증가시키는 방법 및 그에 따른 식물체

Info

Publication number: KR101585061B1
Application number: KR1020140045319A
Authority: KR
Inventors: 백광현; 알리사라팟
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2014-04-16
Filing date: 2014-04-16
Publication date: 2016-01-13
Also published as: KR20150119652A

Abstract

본 발명은 ClpC1 유전자 또는 ClpC2 유전자를 이용하여 식물체의 유리 아미노산 함량을 증가시키는 방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 본 발명에 의한 방법은 ClpC1 유전자와 ClpC2 유전자의 기능을 밝히는 것에 유용하게 이용될 수 있으며, 상기 방법에 의해 유리 아미노산의 함량이 증가된 형질전환 식물체를 창출할 수 있다.

Description

ClpC1 유전자 또는 ClpC2 유전자를 이용하여 식물체의 유리 아미노산 함량을 증가시키는 방법 및 그에 따른 식물체{Method for increasing free amino acid content of plant using ClpC1 gene or ClpC2 gene and plant therof}

본 발명은 ClpC1 유전자 또는 ClpC2 유전자를 이용하여 식물체의 유리 아미노산 함량을 증가시키는 방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 ClpC1 유전자 또는 ClpC2 유전자를 식물체에서 침묵시키는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 유리 아미노산 함량을 증가시키는 방법, ClpC1 유전자 또는 ClpC2 유전자를 포함하는 재조합 VIGS(Virus-induced gene silencing) 벡터 또는 RNAi 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 유리 아미노산 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 유리 아미노산 함량이 증가된 형질전환 식물체 및 ClpC1 유전자 또는 ClpC2 유전자를 포함하는 유전자 침묵 벡터를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 유리 아미노산 함량 증가용 조성물에 관한 것이다.

식물 엽록체에는 FtsH 프로테아제(protease), Deg 프로타아제 및 Clp 프로테아제 등 세균 유래의 많은 종류의 프로테아제가 있다. FtsH 프로테아제와 Deg 프로테아제는 틸라코이드 막과 관련이 있는 반면, Clp 프로테아제는 스트로마에 위치하는데, 식물의 생존에 필수적인 활성을 가지는 스트로마에서 중요한 항존성의(houskeeping) 단백질 분해효소로서 기능적으로 매우 중요한 구성요소 중 하나이다. 애기장대의 경우, Clp 프로테아제 패밀리는 11개의 별개 서브유닛(ClpP1, ClpP3, ClpP4, ClpP5, ClpP6, ClpR1, ClpR2, ClpR3, ClpR4, ClpT, ClpT2)과 세 개의 잠재적 샤페론 파트너(ClpC1, ClpC2, ClpD)와 함께 단일의 단백질 분해의 핵심 복합체를 구성한다.

ClpC1 단백질 및 ClpC2 단백질은 염기서열과 아미노산 서열 수준에서 서로 높은 유사성을 갖는다. ClpC1 단백질 및 ClpC2 단백질은 단백질의 질적 관리 기능에 더해, 엽록체에서 많은 다른 기능을 수행하는데, 핵 암호화 세포질 전단백질을 엽록체로 수송하고, 중요한 아미노산의 재활용과 이상 폴리펩타이드의 분해에 있어 중요한 인자이다. ClpC1 단백질과 ClpC2 단백질은 Tic110, Tic40 및 다른 스트로마 샤페론과 같은 막단백질과 연관되어 Tic 복합체를 이루고, Toc-Tic 경로를 통해서 세포질 전단백질을 수송한다. 스트로마에서는 틸라코이드 막으로 일반적으로 타겟된 이상 수송된 전단백질이 ClpC 프로테아제에 의해 분해된다. Shanklin 등(1995, Plant Cell, 7:1713-1722)의 연구에서 안티센스 기술을 사용한 담배의 ClpC1 유전자 및 ClpC2 유전자의 동시 억제는 생존가능한 세포주 생산에 실패했고, Kovacheva 등(2007, Nature, 425:86-89)의 연구에서 애기장대 clpc1 삭제 돌연변이체(null mutant)는 식물의 성장감소와 엽록체 이상발달을 야기했지만 동형의 식물체는 생존가능한 종자를 생산했다. ClpC1은 또한 클로로필라이드 a 옥시게나아제를 불안정하게 하여 클로로필 b의 생합성을 조절하고, 이것은 클로로필 a에서 클로로필 b로 전환시킨다. Kovacheva 등(2007, Nature, 425:86-89)의 연구에서 애기장대 clpc2 유전자 삭제 돌연변이체는 어떤 분명한 가시적인 이상 표현형도 나타내지 않았으나, clpc1 유전자 삭제 돌연변이체와 clpc2 유전자 삭제 돌연변이체 사이의 교잡은 종자를 생산하지 않았으며, 이는 ClpC1 유전자 및 ClpC2 유전자의 결손이 배발생을 억제한다는 것을 의미했다.

식물은 생존과 성장에 부적합한 환경적 조건에 적응하기 위한 다양한 보호기작으로 진화해 왔다. 식물은 불리한 여러 환경조건에 적응을 위해 호환성 용질과 방어용 용질로 알려진 저분자량 대사산물을 합성하고 축적하는데, 이는 일반적인 것이다. 이 대사 산물은 정상 대사에 영향없이 수분을 보유하기 위한 세포의 능력을 증가시키는 데 중요한 역할을 한다. 식물은 호환성 용질로서 유리 아미노산, 당, 폴리올과 다양한 사차 암모늄과 삼차 설포니움염 화합물을 축적하는데, 이러한 화합물은 직접 혹은 간접적으로 건조, 고염, 극한의 온도의 영향에 대하여 단백질의 사차 구조와 세포막을 안정시킨다. 이것은 이러한 화합물을 합성하도록 조작된 식물이 광 저해나 활성산소종으로부터 증가된 방어를 보인다는 것으로 입증된다. 호환성 용질은 스트레스가 경감되었을 때 식물에 의해 사용될 수 있는 질소를 저장하는데 제공될 수 있다고 보고되어 있다(Rhodes 와 Hanson, 1993, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 44:357-384).

유리 아미노산은 감소된 탄소와 질소로부터 합성되고, 스트레스 조건하에 식물체에서 고농도로 축적된다. 그 중 글루타메이트(glutamate)는 아미노산의 대사에서 핵심역할을 한다. 특히, 글루타메이트는 세포질에서 글루타메이트 디카르복실라아제(glutamate decarboxylase, GAD)에 의해 촉매된 글루타메이트의 탈탄산반응의 원-스텝 반응에 의한 네 개 탄소 비단백질 아미노산인 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA)의 생합성 전구체이다. 일반적으로, 식물은 저함량의 감마-아미노뷰티르산을 식물 조직에서 보유하나, 열 자극, 기계적 자극, 저산소증, 식물호르몬, 감마-방사선, 낮은 pH, 혐기 조건, 저온 및 고온을 포함하는 다양한 자극에 대한 반응으로 몇 배로 증가된다.

생물정보학적 분석은 담배(Nicotiana benthamiana) 게놈이 이질사배체로서 NbClpC1 유전자와 NbClpC2 유전자를 각각 적어도 두 카피를 지닌다는 것을 나타낸다. 식물 발달과 성장에서 Clp 프로테아제 복합체의 기능에 관한 많은 연구가 있었으나, ClpC1과 ClpC2로 구성된 샤페론 영역의 기능은 ClpC1 유전자와 ClpC2 유전자의 동시 삭제 돌연변이체에서 종자의 무생산으로 인해 연구된 바가 없다. 본 발명에서는, 높은 서열 유사성으로 두 유전자를 동시에 침묵시킬 수 있는 VIGS(Virus-induced gene silencing) 기술을 적용하였다. NbClpC1 유전자와 NbClpC2 유전자가 동시에 침묵되었을 때, 현저한 표현형의 변화를 관찰하였고, 두 유전자가 동시에 침묵된 담배 잎에서 유리 아미노산의 축적이 있음을 확인하였다.

한국등록특허 제1197246호에는 '식물의 엽록체 및 미토콘드리아의 발달에 관여하는 담배 유래의 STF 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2013-0115560호에는 '콩에서 유용 유전자의 기능 분석을 위한 SYCMV 유래의 재조합 VIGS 벡터 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 ClpC1 유전자 또는 ClpC2 유전자를 이용하여 식물체의 유리 아미노산 함량을 증가시키는 방법 및 그에 따른 식물체에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 고추 유래 ClpC1 유전자를 포함하는 재조합 VIGS 벡터로 담배 세포를 형질전환시켜, ClpC1 유전자와 ClpC2 유전자가 동시 침묵된 담배의 잎 세포에서 유리 아미노산 함량이 증가하고 총 단백질 함량이 감소하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 Clp protease에서 샤페론으로 작용하는 ClpC1과 ClpC2에 대한 각각의 유전자들인 ClpC1 유전자 또는 ClpC2 유전자를 식물체에서 침묵시키는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 유리 아미노산 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 ClpC1 유전자 또는 ClpC2 유전자를 포함하는 재조합 VIGS(Virus-induced gene silencing) 벡터 또는 RNAi 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 유리 아미노산 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 유리 아미노산 함량이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 ClpC1 유전자 또는 ClpC2 유전자를 포함하는 유전자 침묵 벡터를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 유리 아미노산 함량 증가용 조성물을 제공한다.

본 발명의 ClpC1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 사용하여 ClpC1 유전자와 ClpC2 유전자의 동시 침묵을 유발하는 방법은 ClpC1 유전자와 ClpC2 유전자의 기능을 밝히는 것에 유용하게 이용될 수 있으며, 또한, 상기 방법에 의해 유리 아미노산의 함량이 증가된 형질전환 식물체를 창출할 수 있다.

도 1은 담배 NbClpC1 유전자 및 NbClpC2 유전자의 동시 침묵을 위한 VIGS 벡터 모식도와 유전자 침묵을 확인하기 위해 사용한 프라이머들의 부착부위를 나타낸 모식도이다.
도 2는 GFP로 침묵된 담배(GFP)와 ClpC1 유전자 및 ClpC2 유전자가 동시 침묵된 담배(ClpC)의 표현형 및 전사량을 확인한 반정량적 RT-PCR 결과이다. A; 식물체의 모습, B; 식물체 잎의 모습, C; NbClpC1 유전자와 NbClpC2 유전자 및 NbActin 유전자의 발현량 비교.
도 3은 GFP로 침묵된 담배(GFP)와 ClpC1 유전자 및 ClpC2 유전자가 동시 침묵된 담배(ClpC)의 잎 색을 측정한 결과이다. A; 백화도(L*) 관찰결과, B; 녹색도(a*) 관찰결과, C; 황색도(b*) 관찰결과.
도 4는 GFP로 침묵된 담배(GFP)와 ClpC1 유전자 및 ClpC2 유전자가 동시 침묵된 담배(ClpC)의 잎 내 총 유리 아미노산 함량, 총 단백질 함량 및 아미노산 함량 조절에 연관된 유전자의 발현량을 확인한 반정량적 RT-PCR 결과이다. A; 총 유리 아미노산 함량, B; 총 단백질 함량, C; NbATP - PRT 유전자, NaDAHPS 유전자, NbCM1 유전자, NbPAT 유전자 및 NbActin 유전자의 발현량 비교.
도 5는 GFP로 침묵된 담배(GFP)와 ClpC1 유전자 및 ClpC2 유전자가 동시 침묵된 담배(ClpC)의 잎을 현미경으로 관찰한 결과이다. A; GFP로 침묵된 담배의 잎, B; ClpC1 유전자 및 ClpC2 유전자가 동시 침묵된 담배의 잎, 동그라미; 관다발.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ClpC1 유전자 또는 ClpC2 유전자를 식물체에서 침묵시키는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 유리 아미노산 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 ClpC1 유전자 또는 ClpC2 유전자는 고추(Capcicum annum) 유래의 CaClpC1 유전자, CaClpC2 유전자 또는 담배(Nicotiana benthamiana) 유래의 NbClpC1 유전자 또는 NbClpC2 유전자일 수 있고, 바람직하게는 NbClpC1 유전자 또는 NbClpC2 유전자일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 NbClpC1 유전자 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 NbClpC2 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 ClpC1 유전자 또는 ClpC2 유전자의 침묵은 VIGS(Virus-induced gene silencing) 벡터 또는 RNAi 벡터를 이용하여 수행될 수 있으나, 유전자의 발현을 침묵시킬 수 있는 방법이면 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 ClpC1 유전자 또는 ClpC2 유전자의 침묵은 담배 유래 NbClpC1 유전자(서열번호 1) 또는 NbClpC2 유전자(서열번호 2)와 염기서열 유사도가 높은 고추(Capcicum annum) 유래 CaClpC1 유전자의 일부(서열번호 3)를 TRV 벡터에 삽입하여 이루어졌다.

또한, 본 발명의 NbClpC1 유전자 NbClpC2 유전자 및 CaClpC1 유전자는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 각각 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물체는 담배(Nicotiana benthamiana)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 유리 아미노산은 단백질 아미노산인 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 프롤린(proline), 발린(valine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 리신(lysine), 히스티딘(histidine), 아르기닌(arginine), 아스파르테이트(aspartate) 또는 글루타메이트(glutamate), 또는 비단백질 아미산인 감마-아미노뷰티르산(γ-amino butyric acid, GABA) 및 하이드록실리신(hydroxylysine)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은

ClpC1 유전자 또는 ClpC2 유전자를 포함하는 재조합 VIGS(Virus-induced gene silencing) 벡터 또는 RNAi 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 ClpC1 유전자 또는 ClpC2 유전자, ClpC1 유전자 또는 ClpC2 유전자의 침묵 및 상기 유리 아미노산은 전술한 바와 같다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에의 일 구현 예에 따른 제조 방법에서, 상기 ClpC1 유전자는 재조합 VIGS 벡터 내로 삽입될 수 있다. 상기 재조합 VIGS 벡터는 숙주 내에서 복제된 후, 전사 후 유전자 침묵 현상(post-transcriptional gene silencing, PTGS)을 발생시킬 수 있는 TRV(Tobacco rattle virus) 벡터, PEBV(Pea early browning virus) 벡터 또는 PVX(Potato virus X) 벡터일 수 있고, 바람직하게는 TRV 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

상기 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이 포함된다. 상기 단자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 벼, 밀, 보리, 죽순, 옥수수, 토란, 아스파라거스, 양파, 마늘, 파, 부추, 달래, 마 및 생강이 있다. 쌍자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 카멜리나 및 완두가 있다. 상기 식물체는 바람직하게는 담배이다.

본 발명은 또한, ClpC1 유전자 또는 ClpC2 유전자를 포함하는 유전자 침묵 벡터를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 유리 아미노산 함량 증가용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 NbClpC1 유전자, NbClpC2 유전자 또는 CaClpC2 유전자를 포함하는 유전자 침묵 벡터를 함유하며, 상기 유전자 침묵벡터를 식물체에 형질전환시킴으로써 식물체의 유리 아미노산 함량을 증가시킬 수 있는 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 유전자 침묵 벡터는 VIGS 벡터 또는 RNAi 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 ClpC1 유전자 또는 ClpC2 유전자 및 유리 아미노산은 전술한 바와 같다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

식물체 및 VIGS 실험 조건

담배(Nicotiana benthamiana) 종자는 코코피트 70%, 피트모스 17%, 제올라이트 5%, 퍼라이트 8%가 혼합되어있는 플라스틱 화분에 심고 키웠다. 식물은 정기적으로 물을 주고 광도 120μEinstein/m²s 형광등 하에서 16시간(명주기) 및 8시간(암주기)인 광주기로 22±2℃인 환경 제어가 가능한 온실에서 재배했다.

NbClpC1 유전자와 NbClpC2 유전자를 동시 침묵시키기 위한 VIGS 벡터는 고추로부터 유래한 ClpC1 유전자 558bp를 TRV2 벡터의 멀티-클로닝 사이트로의 삽입에 의해 수행되었다(도 1). 558bp의 산물은 정방향 프라이머 5'-CGGAATTCTTGGAGGTGGAACGTCTG-3'(서열번호 4)과 역방향 프라이머 5'-TCCGCTCGAGCTGGCTGGAACCTCCTCT-3'(서열번호 5)을 사용하여 증폭되었다. PCR 산물은 EcoRⅠ과 XhoⅠ 제한효소로 잘라 TRV2 벡터로 클로닝되어 TRV:CaClpC 플라스미드가 제조되었다. 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV2260는 Liu 등(2002, Plant J., 31:777-786)의 방법에 따라 VIGS 벡터의 형질전환을 위해 준비되었으며, Chung 등(2004, Mol. Cell., 17:377-380)의 방법에 따라 TRV1과 TRV2:CaClpC, TRV2:green fluorescent protein(TRV2:GFP), TRV2:phytoene desaturase(TRV2:PDS) 플라스미드로 형질전환되었다.

TRV1과 TRV2 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머파시엔스는 밤새 배양되었고, OD₆₀₀에서 각각 0.1과 0.5 값으로 조정되어 1:1 비율로 혼합되었다. 혼합된 아그로박테리움 튜머파시엔스에 아세토시린곤(최종농도 100μM)을 첨가하고, 22℃에서 4시간 동안 배양 후 1㎖ 주사기로 4잎 시기의 담배보다 더 낮은 잎(2~3주 된)에 접종되었다. 처리된 식물은 환경이 조절되는 온실에서 재배되었다. 모든 실험은 접종 4주 후에 담배의 접종된 잎 위의 6번째 잎을 사용하여 수행되었다.

ClpC1 유전자 및 ClpC2 유전자 또는 GFP로 침묵된 담배 잎의 색은 크로마 미터(chroma meter)를 사용하여 측정되었다. L*(백색도), a*(녹색도), b*(황색도) 값은 세 개의 다른 잎의 중앙 6부분으로부터 기록되었다.

반정량적 RT - PCR 분석

총 RNA는 Trizol^TM 용액(Molecular Research Center, Inc., Taiwan)을 사용하여 분리되었고, 총 RNA 1㎍을 cDNA 합성에 사용하였다. cDNA 합성은 GoScript^TM 역전사 시스템(Promega, madison, USA)을 사용하였다. 반정량적 PCR은 50ng의 합성 cDNA에 유전자 특이적 프라이머(표 1)를 Hipi PCR Premix(ELPis Biotech, Korea)에 섞어 PCR을 수행하였다. PCR은 95℃에서 3분 동안 전변성시키는 단계, 95℃에서 10초 동안 변성, 50℃에서 40초 동안 어닐링, 72℃에서 40초 동안 신장의 25 사이클 반복하는 증폭단계, 72℃에서 5분 동안 최종신장시키는 단계를 PCR 기기를 사용하여 수행하였다. 증폭된 산물은 1.2% 아가로스 겔에서 확인하였다.

NbClpC1 유전자 및 NbClpC2 유전자 침묵을 확인하기 위한 반정량적 RT-PCR 분석에 사용된 프라이머

유전자	정방향(F) 및 역방향(R) 프라이머 서열		서열번호
NbClpC1	F	5'-ACACCGTCTCTAAACTCATTGG-3'	6
NbClpC1	R	5'-CAACTCCTCAGTCACTAAGC-3'	7
NbClpC2	F	5'-CATCAGTGACCGTTTTCTGCCTG-3'	8
NbClpC2	R	5'-GTGCTGAATATCTGCTTCAGTC-3'	9
NbActin	F	5'-ACGAGAAATCGTGAGGGATG-3'	10
NbActin	R	5'-ATTCTGCCTTTGCAATCCAC-3'	11

유리 아미노산과 총 단백질 분석

유리 아미노산과 총 단백질 분석을 위하여 ClpC1 유전자 및 ClpC2 유전자 또는 GFP로 침묵된 담배 잎을 동결시켰다. 동결건조된 시료 0.25g은 막자사발과 막자를 사용하여 갈았고 3% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid) 5㎖에 녹였다. 혼합물은 2~3분간 볼텍싱하여 180rpm에서 1시간 동안 진탕배양시켜 4℃ 1,680 x g에서 1분 동안 원심분리시켰다. 원심분리 후 상층액은 0.45㎛ 막 여과기를 사용하여 여과멸균시켰고 Hitachi 아미노산 분석기를 사용하여 분석하였다. 아미노산의 함량은 건중량 g당 ㎍으로 표시했다.

총 단백질 함량 분석을 위해, 신선한 잎 0.5g을 액체 질소를 사용하여 막자사발과 막자로 갈고 5㎖의 차가운 추출버퍼(50mM의 K₂HPO₄, 50mM KH₂PO₄, pH7.0)를 첨가하였다. 12,000 x g에서 4℃로 20분간 원심분리한 후, 상층액을 수집하여 Pierce^TM BCA 단백질 시험 키트(Thermo Scientific, Rockford, USA)를 사용하여 단백질량 분석에 사용되었다.

잎 관다발 조직의 관찰

광학 현미경을 사용하여 잎의 해부학적 구조를 분석하였다. 잎의 중앙부 부분을 50% 에탄올과 5% 빙초산(glacial acetic acid), 37% 포름알데히드(formaldehyde) 10%, 멸균수(ddH₂O) 35%가 포함되어 있는 고정액 믹스에 4℃로 약 10시간 정도 고정시켰다. 시료는 에탄올 연속 희석물을 통해 탈수시켰다. 95% 에탄올에 밤새 배양한 후, 자일렌(xylene)과 에탄올의 혼합비가 25:75, 50:50 및 75:25인 용액에 순서대로 각 30분씩 세척시켰다. 시료를 100% 자일렌에서 30분 동안 배양 후 파라핀 왁스를 침투시켰다. 시료는 핫 보트에서 정돈되어 파라플라스트로 몰드하고, 파라핀 블록은 로터리 마이크로톰(rotary microtome, MICROM GmbH, D-6900 Heigelberg, Germany)를 사용하여 5~8㎛ 크기로 면도날로 절단했다. 잘려진 조각은 슬라이드 위에 얹어져 45℃에서 밤새 배양되었다. 슬라이드로부터 파라플라스트를 제거하기 위하여, 슬라이드를 100% 자일렌에 30분, 자일렌 50%와 에탄올 50%의 혼합액에 10분, 100% 에탄올에 5분 동안 침지시켰다. 시료는 에탄올 연속 희석액과 최종적으로 멸균수를 거치면서 다시 수화되었다. 절단면은 0.5% 헤이든헤인스 헤마톡실린(Heidenheins hematoxylin)으로 염색한 후에, 에탄올-자일렌 시리즈 용액으로 세척시키고 최종적으로 글리세롤(glycerol)로 고정하여, 카메라가 장착된 광학현미경 하에 관찰하였다.

통계 처리

시료 데이터의 변이는 통계 분석 소프트웨어(SAS) version 9.2를 사용한 ANOVA를 통해서 분석하였다.

실시예 1. NbClpC1 유전자 및 NbClpC2 유전자가 동시 침묵된 식물의 표현형 변화

NbClpC1 유전자 및 NbClpC2 유전자가 동시 침묵된 식물체는 표현형에 있어서 현저한 변화를 보였다(도 2A 및 2B). TRV2:CaClpC의 VIGS 벡터에 의한 NbClpC1 유전자 및 NbClpC2 유전자의 동시 침묵은 그들 사이에 염기 서열의 유사성 때문에 예측되었고, 더욱이, 두 유전자가 VIGS 벡터 TRV2:CaClpC 하나에 의해 침묵되었다(도 2C). NbClpC1 유전자 및 NbClpC2 유전자의 동시 침묵은 외소한 성장과 심각한 잎 황화를 유발했는데, 이것은 샤페론 부분의 기형이 정아 우세(apical dominance)와 엽록체 발달에서 기형을 유발했다는 것을 의미한다. GFP로 침묵된 식물과 비교하여, NbClpC1 유전자 및 NbClpC2 유전자가 동시 침묵된 식물은 비정상적으로 하위 잎이 더 크고 더 넓으며 더 두꺼운 모양으로 발달했으나, 상위 잎은 다면 발현성의 표현형으로 더 작게 발달되었다.

NbClpC1 유전자 및 NbClpC2 유전자가 동시 침묵된 식물에서 백색도(L*)와 황색도(b*)는 각각 1.5, 1.3배 증가했고, 반면 녹색도(a*)는 1.7배 감소했다(도 3). 증가된 b* 값과 감소된 a* 값은 클로로필의 감소의 순서인데, 녹색에서 황색으로 색변화를 나타낸다.

실시예 2. NbClpC1 유전자 및 NbClpC2 유전자가 동시 침묵된 식물 잎의 유리 아미노산 함량 및 총 단백질 함량의 변화

NbClpC1 유전자 및 NbClpC2 유전자가 동시 침묵된 식물의 유리 아미노산은 야생형과 뚜렷하게 차이를 나타내며 두드러지게 증가했다(표 2). 비극성 지방족 아미노산인 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 프롤린(proline), 발린(valine), 류신(leucine), 이소류신(isolucine) 및 메티오닌(methionine)은 각각 5.7배, 6.4배, 1.7배, 14.9배, 25.7배, 12.0배 및 2.3배 증가했다. 비극성 방향족 아미노산인 페닐알라닌(phenylalanine)과 티로신(tyrosine)은 각각 16.6배, 18.1배가 증가했다. 극성 비전하 아미노산인 세린(serine)과 트레오닌(threonine)은 각각 14.6배, 11.3배 증가했다. 극성 양전하 아미노산인 리신(lysine), 히스티딘(histidine) 및 아르기닌(arginine)은 각각 11.1배, 69.1배, 14.9배가 증가했다. 극성 음전하 아미노산인 아스파르테이트(aspartate)는 12.0배, 글루타메이트(glutamate)는 33.6배가 증가했다. 비단백질 아미노산 GABA(γ-amino butyric acid)와 히드록시리신(hydroxylysine)은 각 1.1배씩 증가했고 총 유리 아미노산은 8.6배가 증가했다(도 4A).

또한, GFP로 침묵된 식물체와 NbClpC1 유전자 및 NbClpC2 유전자가 동시 침묵된 식물로부터 총 단백질 농도를 측정한 결과, NbClpC1 유전자 및 NbClpC2 유전자가 동시 침묵된 식물에서 총 단백질의 농도는 GFP로 침묵된 식물에 비해 3.08배 감소했다(도 4B).

NbClpC1 유전자 및 NbClpC2 유전자가 침묵된 담배 잎의 아미노산 함량 변화

Amino acids	Concentration(㎍/g dw)
Amino acids	GFP-침묵	ClpC-침묵
Aspartate	9.4±2.7^b	113.3±28.1^a
Leucine	3.3±0.5^b	85.9±19^a
Glutamate	2.6±0.9^b	88.7±5.4^a
Valine	3.6±0.3^b	53.6±12.6^a
Arginine	2.3±0.6^b	34.4±7.4^a
Serin	2.3±0.3^b	34.0±9.2^a
Lysin	2.8±0.5^b	31.3±11.2^a
Alanine	4.8±0.7^b	30.7±11.0^a
Histidine	0.3±0.1^b	21.8±4.3^a
Phenylalanine	1.1±0.1^b	17.9±5.1^a
Tyrosine	0.9±0.2^b	16.4±9.9^a
Threonine	1.9±0.2^b	21.1±7.1^a
Isoleucine	1.2±0.1^b	14.8±4.0^a
Glycine	0.8±0.1^b	4.8±1.5^a
Methionine	0.8±0.1^b	1.9±0.8^a
Proline	11.3±4.0^a	19.1±7.3^a
GABA	13.0±2.7^a	14.8±7.9^a
Hydroxylysine	0.6±0.1^a	0.7±0.2^a
Total	63.2±9.6^b	605.1±143.8^a

실시예 3. NbClpC1 유전자 및 NbClpC2 유전자가 동시 침묵된 식물에서 반정량적 RT - PCR 결과

유리 아미노산의 증가된 양은 유리 아미노산의 합성의 더 높은 활성 및 체관부 이동문제라는 두 가지 요인에 의할 것이라고 추측되었다. 따라서 두 가지 중요한 생합성 경로와 연관된 중요한 효소의 mRNA를 측정하였다. 측정된 효소는 ATP-PRT(ATP-phosphorybosyltransferase), DAHPS(3-deoxy-d-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase), CM1(chorismate mutase1), PAT(prephenate aminotransferase)이었다. 그러나 이 네가지 효소 중 어떤 것도 전사적으로 다량 조절된 것은 없었다(도 4C).

실시예 4. NbClpC1 유전자 및 NbClpC2 유전자가 동시 침묵된 식물 잎의 현미경적 관찰

현미경을 사용한 해부학적 관찰은 GFP로 침묵된 식물체와 NbClpC1 유전자 및 NbClpC2 유전자가 동시 침묵된 식물체의 잎에서 수행되었고, GFP로 침묵된 식물체에서 하나의 관다발로 잎맥이 형성되었던 것(도 5A)과 다르게, NbClpC1 유전자 및 NbClpC2 유전자가 동시 침묵된 식물체에서 하나 이상의 관다발이 관찰되었다(도 5B). NbClpC1 유전자 및 NbClpC2 유전자가 동시 침묵된 식물의 복병립 관다발 형태화 또한 증가된 물관과 감소된 체관으로 지장을 받았다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yeungnam University <120> Method for increasing free amino acid content of plant using ClpC1 gene or ClpC2 gene and plant therof <130> PN14013 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2721 <212> DNA <213> Nicotiana benthamiana <400> 1 atggctagag ctttagttca gtcaaccaac atcccatctt cagttgccgg tgaaaggact 60 aggcaattta gtggatctgg gaaaaacaaa aaaactgtta aaatgctatg taatgtacaa 120 ccaccctcca taaggttgac caattttaca ggactgcgag ggtgcaatgc aatagataca 180 cttgtaaaat ctggacaaac tctccattca aaagtggcag ctgcaacttc tgtcagacgg 240 ccaaaaggtt gccgatttgt cccaaaggca atgtttgagc gcttcaccga gaaagcaatt 300 aaagtcatta tgcttgcaca agaagaggct agacgactag gtcataactt cgttggcaca 360 gagcagattt tgctgggtct tattggtgag ggaactggta ttgcagccaa agttcttaaa 420 tccatgggca tcaatttaaa agatgctcgt gtggaggtgg agaagataat tggaaggggt 480 agtgggtttg ttgctgttga gattccattt actcctcgtg caaagcgcgt tcttgaactc 540 tctctggagg aagcccgcca actagggcat aactacattg gctcggaaca cttgctactt 600 ggattgctgc gtgaaggtga aggtgtggct gcccgtgttc ttgagaactt gggtgctgac 660 cccagtaaca ttcgcactca ggcaagggta tctaaatcac ttgaattcat tgtcattcga 720 atggttggcg agagtaatga ggctgttggg gctagtgttg gtggtggaac ttctggacaa 780 aagatgccta cattggagga gtacggcacc aatttgacaa agttagctga agaggggaaa 840 ctggatcccg ttgttggaag acagccgcaa attgagcgcg ttactcaaat cttgggtcgg 900 cgtacaaaaa acaatccttg ccttattgga gaaccaggtg tcataacact agatatgggt 960 ttgcttgttg ctgggacaaa ataccgtgga gagtttgagg aaagactgaa gaaactaatg 1020 gaagaaatta aacaaagtga tgaaataata ctctttattg atgaagtgca cacattgatt 1080 ggagctggag ctgcagaggg ggcaattgat gctgcaaaca tcttgaaacc tgccttagct 1140 agaggggaac tacagtgtat tggagccaca accctggatg agtacagaaa gcacattgag 1200 aaagatcctg cgttggagag gagattccag ccagttaaag tccctgaacc tactgtggat 1260 gaaaccatac aaatcttgaa agggcttcgg gagagatatg agattcatca caagctccgt 1320 tacaccgatg aggcattaga agctgctgcc cagctttctt atcagtacat cagtgaccgt 1380 tttctgcctg ataaagcaat tgatttgatt gatgaagctg gttctcgtgt tagacttcgc 1440 catgcacagc ttcctgagga agcaagagag ctcgagaaag aacttcgtca gattacaaag 1500 gagaaaaatg aagccgtgcg tggtcaagat tttgaaaagg ctggggaact gcgtgataga 1560 gaaatggatc ttaaggcaca gatctcagcc ctgatagaca aaaacaaaga gatgagcaag 1620 gctgaatctg aggctggaga tacaggtccc ctcgttacag aggcagatat tcagcacatt 1680 gtatcttcat ggactggcat ccctgttgag aaggtttcta cagatgagtc tgatcgcctc 1740 ttgaaaatgg aagaaacact tcacaccaga atcattggcc aggatgaagc tgttaaagcc 1800 attagtcgcg ctatccgacg tgctcgtgtc gggctcaaga atcccaaccg acctattgcc 1860 agtttcatct tttctggtcc aactggtgtt gggaaatcag aactggctaa ggctttagca 1920 gcatactact ttggttctga agaagcaatg atccggcttg atatgagtga gtttatggag 1980 agacacaccg tctctaaact cattggttca ccccctggtt atgttggtta cactgaaggt 2040 ggtcaactga ctgaagctgt gaggcgtcga ccttacactg ttgtgctctt tgatgagatt 2100 gagaaggctc atcctgatgt cttcaacatg atgcttcaaa ttcttgaaga tggaagattg 2160 acagacagca agggcagaac tgtcgacttc aagaatacac ttctcatcat gacatcgaat 2220 gttggaagca gtgtgataga gaaaggaggc cgtcgtatag gttttgatct agattatgac 2280 gagaaggata gcagttacaa ccgtatcaaa agcttagtga ctgaggagtt gaaacagtac 2340 ttcaggccag agttcttgaa cagattggat gagatgattg tattccgtca gctcactaag 2400 ttagaggtga aggagatagc tgatatcatg cttaaggagg tctttgagag gttgaaaaat 2460 aaggagatag aacttcaagt gacagagagg tttagagaca gggtggttga cgaagggtac 2520 aacccaagct acggagcaag accgttgagg agagctatta tgagactgct ggaagacagc 2580 atggccgaga agatgcttgc aggtgagatc aaagaaggtg attcagtaat tgtggacgtg 2640 gactctgatg gcaatgtgac cgtcctcaat ggcactagcg gaactccctc agatccagct 2700 cctgagccta tccctgtgta g 2721 <210> 2 <211> 2727 <212> DNA <213> Nicotiana benthamiana <400> 2 atggctagag ctttagttca gtcgacgaac ataccatcat cagtgtctgg tgaaaggacg 60 acaaaattca atggatctgg gaaaacgaac agaactgtta aaatgctatg cagtgcacaa 120 tctccttcac taaggctgcg ggatttttca ggattgcgag gatgcaatgc agtagataca 180 ctagttagat ctggacaaac tctccaatcc aaggtagcag ctgcaacttc tgtgagacga 240 ccacgaggtt gccgatttgt accaaaagca atgtttgagc gcttcacgga gaaggcaata 300 aaagtcatta tgcttgcaca agaagaggcc agacgacttg gtcacaattt tgttggcaca 360 gagcagattc tgttgggtct tattggtgag ggaactggta ttgctgctaa agttcttaaa 420 tccatgggaa ttaatttgaa agatgctcgt gtggaagtgg agaagataat tggacggggt 480 agtggatttg ttgctgttga gatccctttt acgcctcgtg ccaagcgtgt tttggaactc 540 tctctggagg aggcccgcca gctagggcat aactatattg gttcggagca cttgctactt 600 gggttgctcc gtgaaggtga aggtgtggct gcccgtgtga tccgaatggt tggagagagt 660 aatgaggctg ttggtgctag cgttggaggt ggaagttctg gccaaaaaat gcctacactg 720 gaggagtacg gcacaaattt gacaaagtta gctgaagagg gaaaattaga tcctgttgtt 780 ggaagacaac cgcaaattga acgggtcact caaatcttgg gtcggcggac taagaacaac 840 ccttgtctta ttggagaacc aggtgttggc aaaacagcta ttgctgaggg tctggcacaa 900 agaattgcaa acggtgatgt ccctgaaaca attgagggga agaaggtgat aactcttgat 960 atgggtttgc ttgttgctgg gacaaaatac cgtggagagt ttgaggaaag gctaaagaag 1020 ctaatggagg aaatcaaaca gagtgatgaa ataatactat ttatcgatga agtccacacc 1080 ttgatcggag ctggagcagc agagggggcc atcgatgctg caaacatctt gaaacctgcc 1140 ctagcacgag gtgaactaca gtgtattgga gctaccacac tagatgaata cagaaagcat 1200 attgagaaag atcctgcatt ggagaggcga ttccagccag ttaaggtccc tgaacctact 1260 gttgatgaaa ccattcagat tctgaaaggg cttcgggaga gatatgagat tcatcacaag 1320 cttcgttaca ctgacgaggc attagaggct gctgcccagc tttcatacca gtacatcagt 1380 gaccgttttc tgcctgataa agcaattgac ttgattgatg aagctggttc tcgtgttcga 1440 cttcgccatg cacagctccc tgaggaagca aaagagcttg agaaagagct tcgtcaaatc 1500 acaaaggaga agaacgaagc tgtccgcggt caggatttcg aaaaggctgg ggaattacgt 1560 gatagagaaa tggatcttaa ggcacagatc acggccctca tagacaaaaa caaagagatg 1620 agcaaggctg aaagtgaggc tggagatata ggtccgcttg tgactgaagc agatattcag 1680 cacattgtct cttcttggac tggcatccct gttgagaagg tctctactga cgaatctgat 1740 cgcctcctaa aaatggaaga aacacttcac actcgaatca ttggccaaga tgaagctgtc 1800 aaagccatta gtcgtgccat tcgacgtgcg agggttgggc tcaagaatcc caaccgacct 1860 attgctagtt tcatcttttc tggtccaact ggtgttggga agtcagaact ggcaaagtca 1920 ctggctgcat attactttgg ttctgaagaa gcaatgatcc ggcttgatat gagtgagttt 1980 atggagagac acacagtctc taagctcatc ggatcacccc caggttatgt tggttacaca 2040 gaaggtggtc aattgactga agccgtaagg cgacgacctt atactgttgt gctctttgat 2100 gaaattgaga aggctcatcc cgatgtcttc aacatgatgc ttcaaattct tgaagatgga 2160 aggctgactg acagcaaggg gagaactgtc gatttcaaga acacacttct catcatgaca 2220 tcaaatgttg gaagtagtgt gatagagaaa ggtggccgtc gtataggttt tgatctcgat 2280 tatgatgaga aggatagcag ttacaatcgt atcaagagct tagtgactga agaattgaaa 2340 cagtacttca ggccagagtt tttgaacaga ttggatgaga tgattgtatt ccgtcagctc 2400 acaaagttag aggttaagga gataggtgat atcatgctta aggaggtatt tgagaggctg 2460 aagggtaagg agatagaact tcaagtgaca gagaggttta gggatagggt ggttgatgaa 2520 ggatataacc cgagctatgg agcacggcct ctgagaagag ctatcatgag actgttagag 2580 gacagcatgg cggagaaaat gcttgcaggt gagatcaaag aaggtgattc agttattgtg 2640 gacgtggatt cagacggcaa tgtgactgtc ctcaatggca gtagtggtac tccctcagac 2700 cacgctccgg agcctatccc tgtgtag 2727 <210> 3 <211> 598 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 3 tcgctgtcga gattcctttt actcctcgtg caaagcgtgt tctagaactc tctttagagg 60 aagcccgcca actagggcat aattacattg gctcggaaca cttgctactt ggattgctgc 120 gcgaaggtga aggtgtggct gcccgcgttc ttgaaaactt gggtgctgac cccagtaata 180 ttcgcacaca ggtcatacgg atggttggcg agagtaatga agctgttggt gctagtgttg 240 gaggtggaac gtctggtcag aagatgccta cattggagga gtatggtacc aatttgacga 300 agttggctga agagggcaaa ctagatcctg tagttggaag acaggatcaa atcgagcgtg 360 tcactcaaat cttgggccgc cgcacaaaaa acaacccttg tcttattgga gaaccaggtg 420 ttggaaaaac tgctattgct gaagggctag ctcaaagaat tgctaatggt gatgtccctg 480 aaacaatcga gggaaagaag gtcataacac ttgatatggg attgcttgtt gctgggacaa 540 aataccgtgg agagtttgag gagagactga agaaactaat ggaggaaata aaacaaag 598 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cggaattctt ggaggtggaa cgtctg 26 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tccgctcgag ctggctggaa cctcctct 28 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 acaccgtctc taaactcatt gg 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 caactcctca gtcactaagc 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 catcagtgac cgttttctgc ctg 23 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gtgctgaata tctgcttcag tc 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 acgagaaatc gtgagggatg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 attctgcctt tgcaatccac 20

Claims

서열번호 3의 염기서열로 이루어진 CaClpC1 유전자를 포함하는 유전자 침묵 벡터로 식물세포를 형질전환하여 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 NbClpC1 유전자 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 NbClpC2 유전자를 식물체에서 동시에 침묵시키는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 유리 아미노산 함량을 증가시키는 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 유전자 침묵은 VIGS(Virus-induced gene silencing) 벡터 또는 RNAi 벡터를 이용하는 것을 특징으로 하는 식물체의 유리 아미노산 함량을 증가시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 유리 아미노산은 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 프롤린(proline), 발린(valine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 리신(lysine), 히스티딘(histidine), 아르기닌(arginine), 아스파르테이트(aspartate) 및 글루타메이트(glutamate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 식물체의 유리 아미노산 함량을 증가시키는 방법.
서열번호 3의 염기서열로 이루어진 CaClpC1 유전자를 포함하는 재조합 VIGS(Virus-induced gene silencing) 벡터 또는 RNAi 벡터로 식물세포를 형질전환하여 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 NbClpC1 유전자 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 NbClpC2 유전자를 식물세포에서 동시에 침묵시키는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물체를 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 유리 아미노산 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
제5항에 있어서, 상기 유리 아미노산은 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 프롤린(proline), 발린(valine), 류신(leucine), 이소류신(isoleucine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 리신(lysine), 히스티딘(histidine), 아르기닌(arginine), 아스파르테이트(aspartate) 및 글루타메이트(glutamate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체의 제조 방법.
제5항 또는 제6항의 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 유리 아미노산 함량이 증가된 형질전환 식물체.
제7항에 있어서, 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
제8항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 담배인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
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