CN1894416A - 通过发酵制备精细化学品的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明特征在于通过将编码酶即甘油激酶的基因进行去调节的方式来增加精细化学品如赖氨酸从微生物如棒杆菌属(Corynebacterium)生产的方法。在优选的实施方案中，本发明提供了通过甘油激酶活性表达增加的方式来增加谷氨酸棒杆菌中赖氨酸生产的方法。本发明还提供了通过调节流向草酰乙酸(OAA)的碳通量的方式来生产赖氨酸的新方法。在优选的实施方案中，本发明提供了通过利用果糖或蔗糖作为碳源的方式来生产赖氨酸的方法。

Description

通过发酵制备精细化学品的方法
发明背景
赖氨酸的工业生产已成为经济上重要的工业过程。由于赖氨酸能够通过增加其它氨基酸的吸收而改善饲料质量，所以赖氨酸在商业上可用作动物饲料添加剂，赖氨酸还可用于人类医药中，特别是作为输注溶液的成分，并且还可以用于药物工业。
赖氨酸的商业生产主要利用革兰氏阳性细菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)和乳糖发酵短杆菌((Brevibacterium lactofermentum)进行(Kleemann，A.等人，“Amino Acids，”ULLMANN′S ENCYCLOPEDIA OF INDUSTRIALCHEMISTRY，第A2卷，第57-97页，Weinham：VCH-Verlagsgesellschaft(1985))。目前，这些生物体担负着每年约250,000顿赖氨酸的生产。大量的研究致力于分离能够产生更大量赖氨酸的突变菌株上。在用于氨基酸生产的微生物方法中采用的微生物分为4类：野生型菌株、营养缺陷型突变体、调节突变体和营养缺陷型调节突变体(K.Nakayama等人，在：Nutritional Improvement of Food and Feed Proteins，M.Friedman编，(1978)，第649-661页)。棒杆菌属(Corynebacterium)和相关生物体的突变体可以通过直接发酵从便宜的碳源，例如糖蜜、乙酸和乙醇廉价生产氨基酸。此外，通过发酵生产立体特异性氨基酸(L异构体)使得该方法与合成方法相比更有利。
改进赖氨酸商业生产效率的另一种方法是通过对赖氨酸生产和经过戊糖磷酸途径的代谢通量之间的相关性进行研究实现的。考虑到通过发酵方法生产赖氨酸在经济方面的重要性，所以已经对赖氨酸合成的生物化学途径进行了深入研究，显然这是为了提高所生产赖氨酸的总量和降低生产成本(由Sahm等人，(1996)Ann.N.Y.Acad.Sci.782：25-39综述)。在使用代谢工程指导葡萄糖来源碳流向芳香氨基酸形成方面已有一些成功(Flores，N.等人，(1996)Nature Biotechnol.14：620-623)。一旦葡萄糖被细胞吸收，则通过消耗磷酸烯醇丙酮酸使葡萄糖磷酸化(磷酸转移酶系统)(Malin和Bourd，(1991)Journal of Applied Bacteriology 71，517-523)，然后作为葡萄糖-6-磷酸被细胞利用。通过磷酸转移酶系统(Shio等人，(1990)Agriculturaland Biological Chemistry 54，1513-1519)和转化酶反应(Yamamoto等人，(1986)Journal of Fermentation Technology 64，285-291)蔗糖转变成果糖和葡萄糖-6-磷酸。
在葡萄糖分解代谢过程中，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(EC 1.1.14.9)和葡萄糖-6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.9)竞争底物葡萄糖-6-磷酸。葡萄糖-6-磷酸异构酶催化Embden-Meyerhof-Parnas途径或糖酵解中的第一个反应步骤，即转变成果糖-6-磷酸。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化戊糖磷酸循环中氧化部分的第一个反应步骤，即转变成6-磷酸葡糖酸内酯。
在戊糖磷酸循环的氧化部分中，葡萄糖-6-磷酸转变成核酮糖-5-磷酸，因此产生NADPH形式的还原当量。随着戊糖磷酸循环的进一步进行，戊糖磷酸、己糖磷酸和丙糖磷酸互相转变。在核苷酸生物合成中，需要戊糖磷酸如5-磷酸核糖-1-焦磷酸。此外，5-磷酸核糖-1-焦磷酸是芳香氨基酸和L-组氨酸的前体。NADPH在众多合成代谢的生物合成中用作还原当量。在从草酰乙酸生物合成一分子赖氨酸中要消耗4分子的NADPH。因此，流向草酰乙酸盐(OAA)的碳通量仍然保持恒定，而不管系统是否受到干扰(J.Vallino等人，(1993)Biotechnol.Bioeng.，41，633-646)。
发明简述
本发明至少部分地基于以下发现，即在谷氨酸棒杆菌中发现了编码戊糖磷酸途径关键酶(例如甘油激酶)的基因并且发现对甘油激酶的去调节(deregulation)(如表达降低和活性降低)导致了赖氨酸生产的增加。此外，已经发现，通过去调节(如降低)甘油激酶表达和活性使得赖氨酸生产过程中碳产量增加会导致赖氨酸生产的增加。在一个实施方案中，碳源是果糖和蔗糖。因此，本发明提供用于提高以果糖或蔗糖为底物的微生物(例如谷氨酸棒杆菌)对赖氨酸生产的方法。
因此，在一个方面，本发明提供用于增加微生物中流经戊糖磷酸途径的代谢通量的方法，该方法包括培养包含在一定条件下被去调节(以致于增加了流经戊糖磷酸途径的代谢通量)的基因的微生物。在一个实施方案中，微生物用于发酵生产精细化学品，如赖氨酸。在另一个实施方案中，果糖或蔗糖用作碳源。在另一个实施方案中，基因是甘油激酶基因。在相关的实施方案中，甘油激酶基因来自棒杆菌属，例如谷氨酸棒杆菌。在另一个实施方案中，甘油激酶基因表达不足。在另一个实施方案中，甘油激酶基因编码的蛋白质具有降低的活性。
在另一个实施方案中，微生物还包含一个或多个额外的去调节基因。一个或多个另外的去调节基因包括(但不限于)ask基因、dapA基因、asd基因、dapB基因、ddh基因、lysA基因、lysE基因、pycA基因、zwf基因、pepCL基因、gap基因、zwa1基因、tkt基因、tad基因、mqo基因、tpi基因、pgk基因和sigC基因。在特定的实施方案中，基因可以是过表达的或者表达不足。此外，去调节基因可以编码选自下列的蛋白质：反馈抵抗天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸差向异构酶、赖氨酸输出子(exporter)、丙酮酸羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、RPF蛋白质前体、转酮酶、转醛酶、甲基萘醌类氧化还原酶(menaquinine oxidoreductase)、丙糖磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸激酶和RNA聚合酶σ因子sigC。在特定实施方案中，蛋白质具有增加的或降低的活性。
依照本发明方法，一种或多种另外的去调节基因还包括(但不限于)pepCK基因、malE基因、glgA基因、pgi基因、dead基因、menE基因、citE基因、mikE17基因、poxB基因、zwa2基因和sucC基因。在特定实施方案中，至少一种基因的表达被上调、削弱、降低、下调或抑制。此外，去调节基因可以编码选自以下的蛋白质：烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、苹果酸酶、糖原合酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、ATP依赖的RNA解旋酶、o-琥珀酰苯甲酸-CoA连接酶、柠檬酸裂合酶β链、转录调节物、丙酮酸脱氢酶、RPF蛋白质前体和琥珀酰CoA合成酶。在特定实施方案中，蛋白质具有降低的或增加的活性。
在一个实施方案中，用于本发明方法的微生物属于棒杆菌属，例如谷氨酸棒杆菌。
在另一个方面，本发明提供用于生产精细化学品的方法，其包括将甘油激酶被去调节的微生物发酵并在培养基或微生物细胞中积累精细化学品如赖氨酸，由此生产精细化学品。在一个实施方案中，方法包括回收精细化学品。在另一个实施方案中，甘油激酶表达不足。在另一个实施方案中，果糖或蔗糖用作碳源。
在一个方面，甘油激酶来自谷氨酸棒杆菌并且包含核苷酸序列SEQ IDNO：1和氨基酸序列SEQ ID NO：2。
从以下详细叙述和权利要求可见，本发明的其它特征和优势是显而易见的。
附图简述
图1：戊糖生物合成途径示意图。
图2：在谷氨酸棒杆菌ATCC 21526以葡萄糖和果糖为基础生产赖氨酸的追踪实验中，通过GC/MS测定的所分泌赖氨酸和海藻糖中相对质量同位素异构物(isotopomer)级分的比较。
图3：在以葡萄糖为基础生产赖氨酸的过程中，谷氨酸棒杆菌ATCC21526中心代谢中碳通量的体内分布，这是使用组合代谢物均衡和同位素异构物模型的综合方法对实验结果进行最佳拟合推测出来的，其中同位素异构物模型用于通过GC/MS分别对所分泌赖氨酸和海藻糖进行标记性测定的13C追踪实验。净通量在正方形符号中给出，对于可逆反应，净通量的方向用相应黑框旁的箭头标出。在转醛酶、转酮酶和葡萄糖6-磷酸异构酶通量下方括号内的数字显示了可逆性通量。所有通量均表示为平均特异葡萄糖摄取率(1.77mmol g-1h-1)的摩尔百分数。
图4：在以果糖为基础生产赖氨酸的过程中，谷氨酸棒杆菌ATCC21526中心代谢中碳通量的体内分布，这是使用组合代谢物均衡和同位素异构物模型的综合方法对实验结果进行最佳拟合推测出来的，其中同位素异构物模型用于通过GC/MS分别对所分泌赖氨酸和海藻糖进行标记性测定的13C追踪实验。净通量在正方形符号中给出，对于可逆反应，净通量的方向用相应黑框旁的箭头标出。在转醛酶、转酮酶和葡萄糖6-磷酸异构酶通量下方括号内的数字显示了可逆性通量。所有通量均表示为平均特异果糖摄取率(1.93mmol g-1h-1)的摩尔百分数。
图5：生长于葡萄糖(A)和生长于果糖(B)中的生产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的中心代谢的代谢网络，包括转运通量、同化通量和中间代谢池间的通量。
发明详述
本发明至少部分地基于编码戊糖磷酸途径必需酶的基因，如谷氨酸棒杆菌基因的鉴定。本发明以方法为特征，其中所述方法包括控制微生物如谷氨酸棒杆菌中的戊糖磷酸生物合成途径以致于碳产量增加并且产生(例如以增加的产量产生)某些目的精细化学品如赖氨酸。具体而言，本发明包括通过具有去调节的(如降低的)甘油激酶表达和活性的微生物(如谷氨酸棒杆菌)的发酵来生产精细化学品如赖氨酸的方法。在一个实施方案中，使用果糖或蔗糖作为微生物发酵的碳源。已经证实，果糖对于精细化学品(如赖氨酸)在微生物中的生产是效率较差的底物。然而，本发明提供用于优化以果糖或蔗糖为底物的微生物如谷氨酸棒杆菌中赖氨酸产生的方法。甘油激酶表达或活性的去调节(如降低)导致经过戊糖磷酸途径的较高通量，从而导致NADPH产生增加和赖氨酸产量增加。
术语“戊糖磷酸途径”包括精细化学品如赖氨酸形成或合成中所利用的戊糖磷酸酶(例如由编码生物合成酶的基因所编码的多肽)、化合物(例如前体、底物、中间体或产物)、辅因子等等所参与的途径。戊糖磷酸途径将葡糖糖分子转变为生物化学可利用的较小的分子。
为了更容易地理解本发明，文中首先定义某些术语。
术语“戊糖磷酸生物合成途径”包括精细化学品如赖氨酸形成或合成中所利用的戊糖磷酸生物合成基因、酶(例如由编码生物合成酶的基因所编码的多肽)、化合物(例如前体、底物、中间体或产物)、辅因子等等所参与的生物合成途径。术语“戊糖磷酸生物合成途径”包括导致精细化学品如赖氨酸在微生物中合成(例如体内)的生物合成途径以及导致精细化学品如赖氨酸体外合成的生物合成途径。
术语“戊糖磷酸生物合成途径蛋白质”或“戊糖磷酸生物合成途径酶”包括直接或间接参与戊糖磷酸生物合成途径的那些肽、多肽、蛋白质、酶和其片段，例如甘油激酶。
术语“戊糖磷酸生物合成途径基因”包括编码直接或间接参与戊糖磷酸生物合成途径的肽、多肽、蛋白质和酶的那些基因和基因片段，例如甘油激酶基因。
术语“氨基酸生物合成途径基因”意思是包括编码直接参与氨基酸合成的肽、多肽、蛋白质和酶(例如甘油激酶)的那些基因和基因片段。这些基因可以与宿主细胞中天然存在的和参与宿主细胞中任意氨基酸并且特别是赖氨酸合成的那些基因相同。
术语“赖氨酸生物合成途径基因”包括编码直接或间接参与赖氨酸合成的肽、多肽、蛋白质和酶(例如甘油激酶)的那些基因和基因片段。这些基因可以与宿主细胞中天然存在的和参与宿主细胞中赖氨酸合成的那些基因相同。备选地，可以对此种基因进行修饰或突变，例如基因可以包含没有显著影响所编码蛋白质生物活性的修饰或突变。例如，可以通过诱变作用或者通过引入或替代一个或多个核苷酸或者通过去除基因中的非必需区域对天然基因进行修饰。此类修饰可以按照标准技术容易地实现。
术语“赖氨酸生物合成途径蛋白质”意思是包括直接参与赖氨酸合成的那些肽、多肽、蛋白质、酶和其片段。这些蛋白质可以与宿主细胞中天然存在的和参与宿主细胞中赖氨酸合成的那些蛋白质相同。备选地，可以对此类蛋白质进行修饰或突变，例如蛋白质可以包含没有显著影响蛋白质生物活性的修饰或突变。例如，可以通过诱变作用或者通过引入或替代一个或多个氨基酸(优选通过保守氨基酸替代)或者通过去除蛋白质中的非必需区域对天然蛋白质进行修饰。此类修饰可以按照标准技术容易地实现。备选地，赖氨酸生物合成蛋白质可以是相对特定宿主细胞而言为外源的蛋白质。此类蛋白质可以来自带有编码具有相同或相似生物合成作用蛋白质的基因的任何生物。
术语“碳通量”指与竞争性途径相比沿着特定代谢途径前进的葡萄糖分子的数量。具体而言，微生物中NADPH的增加可以通过改变该生物体内糖酵解和戊糖磷酸途径间的碳通量分布实现。
“甘油激酶活性”包括如按照标准技术体内或体外测定的甘油激酶蛋白质、多肽或核酸分子所发挥出来的任何活性。甘油激酶参与许多不同代谢途径并且在许多生物体中发现了甘油激酶。优选地，甘油激酶活性包括将ATP和甘油催化生成ADP和3-磷酸甘油。
术语“精细化学品”是本领域公认的并且包括由生物产生的用于多种工业例如(但不限于)制药业、农业、化妆品业的分子。此类化合物包括有机酸例如酒石酸、衣康酸、二氨基庚二酸、生蛋白氨基酸(proteinogenicamimo acid)与非生蛋白氨基酸(non-proteinogenic amino acid)、嘌呤与嘧啶碱基、核苷与核苷酸(如描述于Kuninaka，A.(1996)Nucleotides andrelated compounds，第561-612页，Biotechnology第6卷，Rehm等人编，VCH：Weinheim以及在其中所包含的参考文献)、脂类、饱和与不饱和脂肪酸(例如花生四烯酸)、二醇类(例如丙二醇和丁二醇)、糖类(例如透明质酸和海藻糖)、芳香化合物(例如芳香胺、香草醛和靛蓝)、维生素与辅因子(如描述于Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第A27卷，“Vitamins”，第443-613卷(1996)VCH：Weinheim以及其中的参考文献；以及Ong，A.S.，Niki，E.和Packer，L.(1995)“Nutrition，Lipids，Health，and Disease”UNESCO会议录/Confederation of Scientific andTechnological Associations in Malaysia和Society for Free RadicalResearch-Asia，于1994年9月1-3日在马来西亚槟城召开，AOCS出版社，(1995))、酶、聚酮化合物(Cane等人，(1998)Science 282：63-68)和描述于Gutcho(1983)Chemicals by Fermentation，Noyes Data Corporation，ISBN：0818805086以及其中的参考文献中的所有其它化学物质。下面详细描述当中某些精细化学品的代谢和用途。
氨基酸代谢和用途
氨基酸构成了所有蛋白质的基本结构单元，并且因此氨基酸是所有生物体的正常细胞功能所必需的。术语“氨基酸”是本领域公认的。生蛋白氨基酸有20种，它们是蛋白质的结构单元，在蛋白质中通过肽键将氨基酸连接，而非生蛋白氨基酸(已知其中数百种)是正常情况下蛋白质中不存在的(见Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第A2卷，第57-97页VCH：Weinheim(1985))。虽然L-氨基酸是通常在天然存在蛋白质中存在的唯一类型，但是氨基酸可以是D-光学构型和L-光学构型。20种生蛋白氨基酸中每一种氨基酸的生物合成和降解途径已经在原核细胞和真核细胞中很好地表征(见例如Stryer，L.Biochemistry，第3版，第578-590页，(1988))。“必需”氨基酸(组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸)可以通过单一生物合成途径容易地转变成11种“非必需”氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸)，对“必需”氨基酸之所以如此命名是因为这些氨基酸生物合成的复杂性使得它们通常为营养需求的。高等动物的确保留了合成这些氨基酸中的一些氨基酸的能力，但是为了实现正常蛋白质的合成必需氨基酸则必须从饮食中供给。
除了它们在蛋白质生物合成中的功能以外，这些氨基酸本身还是令人感兴趣的化学物质，并且已经发现许多氨基酸可以在食品业、饲料业、化学工业、化妆品业、农业和制药业中具有多种应用。赖氨酸不但是人类营养中的重要氨基酸，它还是单胃动物如家禽和猪营养中的重要氨基酸。谷氨酸最常见地用作调味添加剂(谷氨酸单钠，MSG)并且广泛用于整个食品业，天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸和半胱氨酸也是如此。甘氨酸、L-蛋氨酸和色氨酸均用于制药业。谷氨酰胺、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸可用于制药业和化妆品业。苏氨酸、色氨酸和D/L-蛋氨酸是常见的饲料添加剂(Leuchtenberger，W.(1996)Amino aids-technical production and use，第466-502页，在：Rehm等人(编者)Biotechnology第6卷，第14a章，VCH：Weinheim)。另外，已经发现这些氨基酸可用作合成氨基酸和蛋白质合成的前体，例如N-乙酰半胱氨酸、S-羧甲基-L-半胱氨酸、(S)-5-羟色氨酸以及描述于Ulmann’sEncyclopedia of Industrial Chemistry，第A2卷，第57-97页，VCH：Weinheim，1985中的其它物质。
这些天然氨基酸在能够产生它们的生物体如细菌中的生物合成已经很好地进行了表征(对于细菌氨基酸生物合成及其调节的综述见Umbarger，H.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47：533-606)。谷氨酸通过柠檬酸循环中间体α-酮戊二酸的还原胺化作用合成。随后从谷氨酸产生谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸中的每一种。丝氨酸的生物合成是以3-磷酸甘油酸(糖酵解中间体)开始的三步骤过程，在氧化作用、转氨作用和水解步骤之后产生了丝氨酸。半胱氨酸和甘氨酸从丝氨酸产生；半胱氨酸通过高半胱氨酸和丝氨酸的缩合形成，甘氨酸是通过在丝氨酸转羟甲基酶催化的反应中经侧链β-碳原子转移至四氢叶酸而形成。苯丙氨酸和酪氨酸在9步生物合成途径中自糖酵解和戊糖磷酸途径前体赤藓糖4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸合成，它们仅在预苯酸合成之后的最后两个步骤不同。色氨酸还可以从这两个起始分子产生，但是其合成是一个11步的途径。酪氨酸还可以在苯丙氨酸羟化酶催化的反应中自苯丙氨酸合成。丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸都是糖酵解终产物丙酮酸的生物合成产物。天冬氨酸从柠檬酸循环中间体草酰乙酸形成。天冬酰胺、蛋氨酸、苏氨酸和赖氨酸中的每一个通过天冬氨酸变换产生。异亮氨酸从苏氨酸形成。组氨酸从活化糖5-磷酸核糖-1-焦磷酸经复杂的9步途径产生。
超过细胞中蛋白质合成需要的氨基酸不能够被储存，而是降解以提供中间体用于细胞的主要代谢途径(对于综述见Stryer，L.Biochemistry，第3版，第21章，“Amino Acid Degradation and the Urea Cycle”，第495-516页，(1988))。虽然细胞能够将不必要的氨基酸转变成有用的代谢中间体，但是从合成氨基酸所需要的能量、前体分子和酶方面看，氨基酸的生产是昂贵的。因此，毫不惊讶，氨基酸生物合成是通过反馈抑制调节的，其中特定氨基酸的存在用来减慢和完全停止其自身生产(对于氨基酸生物合成途径中的反馈机制的综述见Stryer，L.Biochemistry，第3版，第24章，：“Biosynthesis of Amino Acids and Heme”，第575-600页，(1988))。因此，任何特定氨基酸的生产量是通过细胞中存在的该氨基酸的数量限制的。维生素、辅因子及营养补充品(Nutraceutical)的代谢和用途
维生素、辅因子及营养补充品包含另一组的分子，高等动物已丧失合成它们的能力，所以必须摄取，但是其可轻易地由其它生物如细菌合成。这些分子为本身具有生物活性分子或者为作为许多代谢途径中的电子载体或中间体的生物活性物质前体。这些化合物除了具有营养价值以外，它们还作为着色剂、抗氧化剂和催化剂或其它加工辅料具有明显的工业价值。(对于这些化合物的结构、活性及工业应用的综述，见例如Ullmann’sEncyclopedia of Industrial Chemistry，“Vitamins”，第A27卷，第443-613，VCH：Weinheim，1996)。术语“维生素”为本领域所知并且包括生物正常功能所需要但无法由该生物本身合成的营养物。维生素组可包括辅因子和营养补充品化合物。术语“辅因子”包含正常酶活性所需的非蛋白质化合物。这些化合物可以是有机的或无机的；本发明的辅因子分子优选是有机的。术语“营养补充品”包括在植物和动物、特别是人中具有健康促进作用的食物添加剂。此类分子的实例为维生素、抗氧化剂以及某些脂类(如多不饱和脂肪酸)。
这些分子在能够生产它们的生物(如细菌)中的生物合成已被详细地表征(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，“Vitamins”，第A27卷，第443-613页，VCH：Weinheim，1996，Michal，G(1999)BiochemicalPathways：An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology，John Wilely& Sons；Ong，A.S.，Niki，E.和Packer，L.(1995)“Nutrition，Lipids，Healthand Disease”UNESCO会议录/Confederation of Scientific andTechnological Associations in Malaysia和the Society for Free RadicalResearch-Asia，1994年9月1-3日于马来西亚槟城举行，AOCS Press，Champaign，IL X，374S)。
硫胺(维生素B1)由嘧啶及噻唑部分化学偶联形成。核黄素(维生素B2)从鸟苷5’-三磷酸(GTP)和核糖-5’-磷酸合成。核黄素用于合成黄素单核酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。此化合物家族统称为“维生素B6”(例如吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛5’-磷酸和商业使用的盐酸吡哆醇)，其皆为共同结构单元5-羟基-6-甲基吡啶的衍生物。泛酸盐(泛酸，R-(+)-N-(2，4-二羟基-3，3-二甲基-1-氧丁基)-β-丙氨酸)可通过化学合成或发酵制备。泛酸生物合成的最后步骤为ATP驱动的β-丙氨酸与泛解酸的缩合。负责转变成泛解酸和转变成β-丙氨酸以及缩合成泛酸的生物合成步骤的酶是已知的。泛酸的代谢活性形式为辅酶A，其生物合成由5个酶促步骤产生。泛酸、磷酸吡哆醛5’-磷酸、半胱氨酸和ATP为辅酶A的前体。这些酶不仅催化泛酸的形成，还催化(R)-泛解酸、(R)-泛解酸内酯、(R)-泛醇(维生素原B5)、泛酰巯基乙胺(及其衍生物)和辅酶A的形成。
已经详细研究了微生物中生物素从前体分子庚二酰-CoA的生物合成，并且已经鉴定出几个有关基因。已显示许多相应蛋白质参与Fe簇合物合成并且是nifS蛋白质类成员。硫辛酸源自辛酸并且作为能量代谢中的辅酶，它成为丙酮酸脱氢酶复合物和α-酮戊二酸脱氢酶复合物的一部分。叶酸类为全部源自叶酸的一组物质，叶酸依次从L-谷氨酸、对氨基苯甲酸和6-甲基喋呤衍生而来。已经在某些微生物中详细研究了从代谢中间产物鸟苷5’-三磷酸(GTP)、L-谷氨酸和对氨基苯甲酸开始的叶酸及其衍生物的生物合成。
类咕啉(如钴胺素，特别是维生素B12)和卟啉属于通过四吡咯环系统表征的一组化学品。维生素B12的生物合成太过复杂以致于尚未完全了解，但现已知许多有关的酶及底物。
烟酸(烟酸酯)及烟酰胺为吡啶衍生物，也称为“尼克酸”。尼克酸是重要辅酶NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)及其还原形式的前体。
虽然这些化合物中有一些已经通过大规模微生物培养而生产，如核黄素、维生素B6、泛酸和生物素，但是这些化合物在工业规模上的生产主要基于无细胞的化学合成。只有维生素B12由于其合成的复杂性而只能通过发酵生产。体外方法需要相当大的投入材料和时间，并且成本常常很高。
嘌呤、嘧啶、核苷及核苷酸的代谢和用途
用于嘌呤和嘧啶代谢的基因及其相应蛋白质对于肿瘤疾病和病毒感染的治疗为重要的靶标。术语“嘌呤”或“嘧啶”包括含氮碱基，其是核酸、辅酶及核苷酸的组成成分。术语“核苷酸”包括核酸分子的基础结构单元，其由含氮碱基、戊糖(在RNA中此糖为核糖，在DNA中此糖为D-脱氧核糖)和磷酸组成。术语“核苷”包括作为核苷酸前体的分子，但其缺乏核苷酸所具有的磷酸部分。通过抑制这些分子的生物合成或者通过抑制其动员形成核酸分子，可以抑制RNA和DNA合成；在癌细胞中对该活性的靶向抑制则能够抑制肿瘤细胞分裂和复制的能力。另外，还有一些核苷酸不形成核酸分子而是作为能量储存(即AMP)或辅酶(即FAD和NAD)。
几个出版物已经描述了这些化学品通过影响嘌呤和/或嘧啶代谢在医学指征中的用途(例如Christophrson，R.I.和Lyons，S.D.(1990)，“Potentinhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis aschemotherapeutic agents”，Med.Res.Reviews 10：505-548)。对参与嘌呤和嘧啶代谢的酶的研究集中于可以用作例如免疫抑制剂或抗增殖剂的新药开发上(Smith，J.L.(1995)“Enzymes in Nucleotide Synthesis”Curr.Opin.Struct.Biol.5752-757；(1995)Biochem.Soc.Transact.23877-902)。然而，嘌呤及嘧啶碱基、核苷及核苷酸还有其它用途：作为多种精细化学品生物合成中的中间体(如硫胺、S-腺苷甲硫氨酸、叶酸或核黄素)、作为细胞的能量载体(例如ATP或GTP)并且对于化学品自身通常用作增味剂(例如IMP或GMP)或用于许多医学应用(见例如Kuninaka，A.，(1996)“Nucleotidesand Related Compounds in Biotechnology”，第6卷，编者Rehm等，VCH：Weinheim，第561-612页)。参与嘌呤、嘧啶、核苷或核苷酸代谢的酶也日渐成为为了作物保护而开发的化学品(包括杀真菌剂、除草剂和杀虫剂)所针对的目标。
这些化合物在细菌中的代谢已被表征(对于综述，见例如Zalkin，H.和Dixon，J.E.(1992)“De novo purine nucleotide biosynthesis”，在：Progressin Nucleic Acids Research an d Molecular biology，第42卷，AcademicPress，第259-287页；以及Michal，G.(1999)，“Nucleotides andNucleosides”；第8章，在：Biochemical Pathways：An Atlas of Biochemistryand Molecular Biology，Wiley，New York)。嘌呤代谢为深入研究的课题，其为细胞正常功能所必需的。高等动物中嘌呤代谢受损可能引起严重疾病，例如痛风。通过一系列步骤从核糖5-磷酸经由中间体化合物肌苷5’-磷酸(IMP)合成嘌呤核苷酸，导致产生鸟苷5’-单磷酸(GMP)或腺苷5’-单磷酸(AMP)，由此可轻易地形成作为核苷酸使用的三磷酸形式。将这些化合物还可以作为能量储存使用，以致于它们的降解能够为细胞中的许多不同生物化学过程提供能量。嘧啶生物合成从核糖5-磷酸形成尿苷5’-单磷酸(UMP)进行。之后，将UMP转变成胞苷5’-三磷酸(CTP)。所有这些核苷酸的脱氧形式都是在一步还原反应中由核苷酸的二磷酸核糖形式变成核苷酸的二磷酸脱氧核糖形式而产生。磷酸化后，这些分子可参与DNA合成。
海藻糖代谢和用途
海藻糖由以α，α-1，1键连接在一起的两个葡萄糖分子组成。它通常在食品业中用作甜味剂、干燥或冷冻食品及饮料中的添加剂。然而，其还用于制药业或化妆品业和生物工程业(见例如Nishimoto等人，(1998)美国专利号5 759 610；Singer，M.A.和Lindquist，S.(1998)Trends Biotech.16460-467；Paiva，C.L.A和Panek，A.D.(1996)Biotech Ann.Rev.2293-314；以及Shiosaka，M.(1997)J.Japan 17297-102)。海藻糖由许多微生物的酶生产并且以天然方式被释放入周围培养基，可通过本领域已知的方法从所述培养基中分离海藻糖。
I.重组微生物和用于培养微生物从而产生精细化学品的方法
本发明方法学的特色是微生物，例如优选包括文中所描述载体或基因(例如野生型基因和/或突变的基因)和/或以导致目的精细化学品如赖氨酸产生的方式培养的重组微生物。术语“重组”微生物包括与其所来自的天然存在微生物相比已经进行遗传改变、修饰或工程化改造(例如遗传工程化改造)从而使其呈现出改变的、修饰的或不同的基因型和/或表现型(例如，当遗传修饰影响微生物的编码核酸序列时)的微生物(例如细菌、酵母细胞、真菌细胞等等)。优选地，本发明“重组”微生物已经进行遗传工程化改造从而使其至少一种文中所述细菌基因或基因产物表达不足，优选的是如文中所述包含于重组载体内的生物合成酶编码基因例如甘油激酶基因和/或从重组载体表达的生物合成酶如甘油激酶。普通技术人员将意识到，基因产物表达或表达不足的微生物会产生基因产物或者由于编码基因产物的核酸序列和/或基因的表达不足而使基因产物表达不足。在一个实施方案中，重组微生物具有降低的生物合成酶(例如甘油激酶)活性。
在本发明的某些实施方案中，除了甘油激酶基因或酶以外，至少一种基因或蛋白质可以进行去调节，从而增加L-氨基酸的生产。例如，诸如糖酵解、糖回补、三羧酸循环、戊糖磷酸循环或氨基酸输出的生物合成途径的基因或酶可以被去调节。另外，调节基因或蛋白质可以被去调节。
在多种实施方案中，基因的表达可以增加以便增加该基因所编码蛋白质的细胞内活性或浓度，由此最终提高目的氨基酸的生产。本领域的每个技术人员可以使用多种技术获得预期结果。例如熟练工作人员可以增加某一基因或多个基因的拷贝数、使用有效启动子和/或使用编码具有高活性的相应酶的基因或等位基因。使用本发明的方法，例如过表达特定基因，相应蛋白质的活性和浓度可以基于起始活性或浓度增加至少大约10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％、500％、1000％或2000％。
在多种实施方案中，去调节基因可以包括(但不限于)至少以下基因或蛋白质之一：
●编码反馈抗性天冬氨酸激酶的ask基因(如国际公布号WO2004069996中所公开)；
●编码二氢吡啶二羧酸合酶的dapA基因(如分别公开于国际公布号WO200100843中的SEQ ID NO：55和56)；
●编码天冬氨酸半醛脱氢酶的asd基因(如分别公开于欧洲公布号1108790中的SEQ ID NO：3435和6935)；
●编码二氢吡啶二羧酸还原酶的dapB基因(如分别公开于国际公布号WO200100843中的SEQ ID NO：35和36)；
●编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因(如分别公开于欧洲公布号1108790中的SEQ ID NO：3444和6944)；
●编码二氨基庚二酸差向异构酶的lysA基因(如分别公开于欧洲公布号1108790中的SEQ ID NO：3451和6951)；
●编码赖氨酸输出子的lysE基因(如分别公开于欧洲公布号1108790中的SEQ ID NO：3455和6955)；
●编码丙酮酸羧化酶的pycA基因(如分别公开于欧洲公布号1108790中的SEQ ID NO：765和4265)；
●编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因(如分别公开于国际公布号WO200100844中的SEQ ID NO：243和244)；
●编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的pepCL基因(如分别公开于欧洲公布号1108790中的SEQ ID NO：3470和6970)；
●编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(如分别公开于国际公布号WO200100844中的SEQ ID NO：67和68)；
●编码RPF蛋白质前体的zwa1基因(如分别公开于欧洲公布号1108790中的SEQ ID NO：917和4417)；
●编码转酮酶的tkt基因(如分别公开于国际公布号WO200100844中的SEQ ID NO：247和248)；
●编码转醛酶的tad基因(如分别公开于国际公布号WO200100844中的SEQ ID NO：245和246)；
●编码甲基萘醌类氧化还原酶的mqo基因(如分别公开于国际公布号WO200100844中的SEQ ID NO：569和570)；
●编码丙糖磷酸异构酶的tpi基因(如分别公开于国际公布号WO200100844中的SEQ ID NO：61和62)；
●编码3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因(如分别公开于国际公布号WO200100844中的SEQ ID NO：69和70)；和
●编码RNA聚合酶σ因子sigC的sigC基因(如分别公开于欧洲公布号1108790中的SEQ ID NO：284和3784)。
在特定实施方案中，基因可以是过表达的和/或蛋白质活性可以是增加的。
备选地，在其它实施方案中，基因的表达可以是减弱的、降低的或受抑制的，以便降低(例如消除)由该基因所编码的蛋白质的细胞内活性或浓度，由此最终提高目的氨基酸的生产。例如，本领域的技术人员可以使用弱启动子。备选地或者组合地，熟练工作人员可以使用编码具有低活性的相应酶的基因或等位基因或者失活相应基因或酶的基因或等位基因。利用本发明的方法，相应蛋白质的活性或浓度能够降低至野生型蛋白质活性或浓度的大约0-50％、0-25％、0-10％、0-9％、0-8％、0-7％、0-6％、0-5％、0-4％、0-3％、0-2％或0-1％。
在某些实施方案中，去调节基因可以包括(但不限于)至少以下基因或蛋白质之一：
●编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pepCK基因(如分别公开于国际公布号WO200100844中的SEQ ID NO：179和180)；
●编码苹果酸酶的mal E基因(如分别公开于欧洲公布号1108790中的SEQ ID NO：3328和6828)；
●编码糖原合酶的glgA基因(如分别公开于欧洲公布号1108790中的SEQ ID NO：1239和4739)；
●编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因(如分别公开于国际公布号WO200100844中的SEQ ID NO：41和42)；
●编码ATP依赖的RNA解旋酶的dead基因(如分别公开于欧洲公布号1108790中的SEQ ID NO：1278和4778)；
●编码o-琥珀酰苯甲酸-CoA连接酶的menE基因(如分别公开于欧洲公布号1108790中的SEQ ID NO：505和4005)；
●编码柠檬酸裂合酶β链的citE基因(如分别公开于国际公布号WO200100844中的SEQ ID NO：547和548)；
●编码转录调节物的mikE17基因(如分别公开于欧洲公布号1108790中的SEQ ID NO：411和3911)；
●编码丙酮酸脱氢酶的poxB基因(如分别公开于国际公布号WO200100844中的SEQ ID NO：85和86)；
●编码RPF蛋白质前体的zwa2基因(如欧洲公布号1106693中所公开)；和
●编码琥珀酰CoA合成酶的sucC基因(如欧洲公布号1103611中所公开)。
在特定实施方案中，基因的表达可以是减弱的、降低的或受抑制的和/或蛋白质的活性可以是降低的。
术语“经操作的微生物”包括已经工程化改造(例如遗传工程化改造)或修饰以致于导致代谢途径破坏或改变从而引起碳代谢变化的微生物。当酶以比其在可比较的野生型细胞中的表达更低水平表达时，则酶在代谢工程化改造细胞中“表达不足”，其包括(但不限于)全然不表达的情况。基因表达不足会导致由该基因所编码的蛋白质(例如甘油激酶)的活性降低。
此类微生物的修饰或工程化改造可以按照文中所述的任意方法进行，方法包括(但不限于)生物合成途径的去调节和/或至少一种生物合成酶的表达不足。“经操作的”酶(例如“经操作的”生物合成酶)包括这样一种酶，即其表达或产生已经改变或修饰以致于与例如野生型或天然存在的酶相比至少一种酶的上游或下游前体、底物或产物被改变或修饰，例如具有降低的活性。
术语“表达不足的”或“表达不足”包括基因产物(例如戊糖磷酸生物合成酶)以比在操作之前的微生物或者未经操作的可比微生物中的表达更低的水平进行表达。在一个实施方案中，微生物遗传操作的(例如遗传工程化改造)以便以比在操作之前的微生物或者未经操作的可比微生物中的表达水平更低的水平表达基因产物。遗传操作可包括(但不限于)改变或修饰调节序列或与特定基因表达相关的位点(例如通过去除强启动子、可诱导启动子或多重启动子)、修饰特定基因的染色体位点、改变与特定基因相邻的核酸序列例如核糖体结合位点或转录终止子、降低特定基因的拷贝数、修饰参与特定基因转录和/或特定基因产物翻译的蛋白质(例如调节蛋白质、抑制物、增强子、转录激活物等等)，或者本领域中去调节特定基因表达的任何其它常规方法(包括但不限于使用反义核酸分子，或者敲除或封闭靶蛋白质表达的其它方法)。
在另一个实施方案中，微生物可以是自身或环境上经过操作的以便比在操作之前的微生物或者未经操作的可比微生物中的表达更低的水平表达基因产物。例如，微生物可以用已知或怀疑降低特定基因转录和/或特定基因产物翻译的试剂进行处理或在其存在下进行培养，从而使转录和/或翻译降低。备选地，微生物可以在所选温度下进行培养以降低特定基因的转录和/或特定基因产物翻译，从而降低转录和/或翻译。
术语“去调节的”或“去调节”包括微生物中至少一个编码生物合成途径中酶的基因的改变或修饰，以致于微生物中生物合成酶的水平或活性被改变或修饰。优选地，至少一个编码生物合成途径中酶的基因被改变或修饰以致于基因产物减少，由此降低该基因产物的活性。术语“去调节的途径”也可以包括这样一种生物合成途径，其中一种以上编码生物合成途径中酶的基因被了改变或修饰以致于一种以上生物合成酶的水平或活性被改变或修饰。在微生物中“去调节”途径(例如同时去调节给定生物合成途径中的一种以上基因)的能力源子微生物的特殊现象，其中一种以上的酶(例如两种或三种生物合成酶)由遗传物质的连续部分上彼此相邻存在的基因(称为“操纵子”)所编码。
术语“操纵子”包括基因表达的协同单元，其包含启动子以及可能的与一种或多种、优选至少两种结构基因(例如编码酶如生物合成酶的基因)相关的调节元件。结构基因的表达可进行协同调节，例如通过调节蛋白质结合至调节元件或者通过转录的抗终止作用。结构基因可转录形成编码全部结构蛋白质的单一mRNA。由于操纵子所包括基因的协同调节，单一启动子和/或调节元件的改变或修饰会导致由该操纵子所编码的每个基因产物的改变和修饰。调节元件的改变和修饰可包括(但不限于)去除内源性启动子和/或调节元件；加入强启动子、可诱导启动子或多重启动子或者去除调节序列以致于基因产物的表达得到修饰；修饰操纵子的染色体位置；改变与操纵子相邻或操纵子内的核酸序列例如核糖体结合位点；降低操纵子拷贝数；修饰参与操纵子转录和/或操纵子基因产物翻译的蛋白质(例如调节蛋白质、抑制物、增强物(enhancer)、转录激活物等等)，或者本领域中去调节基因表达的任何其它常规方法(包括但不限于使用反义核酸分子，如封闭抑制蛋白质的表达)。去调节还涉及改变一种或多种基因的编码区以产生例如具有反馈抗性或具有更高或更低特异性活性的酶。
本发明特别优选的“重组”微生物已经进行了遗传工程化改造，以便使细菌来源的基因或者基因产物表达不足。术语“细菌来源的”或“来自”例如细菌的包括天然存在于细菌的基因或者由细菌基因(例如甘油激酶基因)所编码的基因产物。
本发明的方法学的特色是其中一种或多种基因如甘油激酶基因表达不足或者具有降低的甘油激酶活性的重组微生物。本发明特别优选的重组微生物(例如谷氨酸棒杆菌、乙酰谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidoph ilum)和热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)等等)已经进行遗传工程化改造使生物合成酶(例如甘油激酶，氨基酸序列为SEQ ID NO：2或者由核酸序列SEQ ID NO：1所编码)表达不足。
本发明其它优选的“重组”微生物在戊糖磷酸途径中将酶去调节。用语“具有去调节的戊糖磷酸途径的微生物”包括在至少一种编码戊糖磷酸途径的酶的基因中具有改变或修饰的微生物或者在包含一种以上编码戊糖磷酸途径酶的基因的操纵子中具有改变或修饰的微生物。优选的“具有去调节的戊糖磷酸途径的微生物”已经进行遗传工程化改造以使棒杆菌(例如谷氨酸棒杆菌)生物合成酶表达不足(例如已经工程化改造以使甘油激酶表达不足)。
在另一个优选的实施方案中，将重组微生物进行设计或工程化改造以致于一种或多种戊糖磷酸生物合成酶表达不足或被去调节。
在另一个优选的实施方案中，本发明微生物对细菌来源的基因或生物合成酶(例如戊糖磷酸生物合成酶)表达不足或者对其进行了突变。术语“细菌来源的”或“来自”例如细菌的包括由细菌基因所编码的基因产物(例如甘油激酶)。
在一个实施方案中，本发明重组微生物是革兰氏阳性微生物(例如由于微生物周围革兰氏阳性壁的存在而能够保留碱性染料如结晶紫的微生物)。在一个优选的实施方案，重组微生物是属于选自芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Cornyebacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococci)和链霉菌属(Streptomyces)微生物。在更加优选的实施方案中，重组微生物是棒杆菌属微生物。在另一个优选实施方案中，重组微生物选自谷氨酸棒杆菌、乙酰谷氨酸棒杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌或热产氨棒杆菌。在特别优选的实施方案中，重组微生物是谷氨酸棒杆菌。
本发明重要的方面涉及培养文中所述重组微生物，从而产生目的化合物(例如目的精细化学品)。术语“培养”包括使本发明的活微生物得以维持和/或生长(例如使培养物或菌株得以维持和/或生长)。在一个实施方案中，本发明微生物培养于液体培养基中。在另一个实施方案中，本发明微生物培养于固体培养基或半固体培养基中。在优选的实施方案中，本发明微生物培养于包含微生物维持和/或生长所必需的或有利的营养物的培养基(例如无菌液体培养基)中。可以使用的碳源包括糖类和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素；油和脂肪，例如大豆油、葵花子油、花生油和椰子油；脂肪酸，例如软脂酸、硬脂酸和亚油酸；醇类，例如甘油和乙醇；以及有机酸例如醋酸。在优选的实施方案中，果糖或蔗糖用作碳源。这些物质可以单独使用或者作为混合物使用。
可以使用的氮源包括包含氮有机化合物例如蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麦芽浸膏、玉米浆、大豆粉和尿素，或者无机化合物例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可以单独使用或作为混合物使用。可以使用的磷源是磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或者相应的钠盐。此外，培养基还必须包含生长所必需的金属盐，例如硫酸镁或硫酸亚铁。最后，除上述物质外，还可以使用必需的生长促进物质，例如氨基酸和维生素。而且，可以将适宜前体加入培养基中。所述供给物质可单一批次加入培养基中或者在培养过程中适当供给。
优选地，本发明微生物在所控制pH下培养。术语“所控制pH”包括导致目的精细化学品如赖氨酸生产的任意pH。在一个实施方案中，微生物培养于大约为7的pH条件下。在另一个实施方案中，微生物培养于6.0到8.5的之间的pH条件下。所预期pH可以通过本领域技术人员已知的任意方法进行维持。例如，使用诸如氢氧化钠、氢氧化钾、铵或氨水的碱性化合物，或者诸如磷酸或硫酸的酸性化合物适当控制培养物的pH。
同样优选地，本发明微生物可以在所控制充气条件下培养。术语“所控制充气”包括充分充气(例如氧气)以导致预期精细化学品如赖氨酸的产生。在一个实施方案中，充气是通过调节培养物中的氧水平进行控制的，例如通过调节溶解于培养基中的氧的量。优选地，培养物的充气是通过搅动培养物进行控制的。搅动可以通过螺旋桨或类似机械搅动装置、通过旋转或振荡生长容器(例如发酵罐)或者通过多种泵装置进行。通过使无菌空气或氧气穿过培养基(例如穿过发酵混合物)可以进一步控制充气。同样优选地，本发明微生物在没有过多泡沫形成的情况下(例如，通过加入消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯)培养。
此外，本发明微生物可以在所控制温度条件下培养。术语“所控制温度”包括导致预期精细化学品如赖氨酸产生的任意温度。在一个实施方案中，所控制温度包括15℃和95℃之间的温度。在另一个实施方案中，所控制温度包括15℃和70℃之间的温度。优选的温度在20℃和55℃之间，更加优选在30℃和45℃之间或者30℃和50℃之间。
微生物可以培养(例如维持和/或生长)于液体培养基，并且优选地通过常规培养方法如静止培养、试管培养、振荡培养(例如旋转振荡培养、摇瓶培养等等)、充气旋动培养或发酵持续地或间歇地进行培养。在优选的实施方案中，微生物在摇瓶中培养。在更加优选的实施方案中，微生物在发酵罐中培养(例如发酵方法)。本发明的发酵方法包括(但不限于)分批、分批补料和连续补料的发酵方法。术语“分批法”或“分批发酵”指一种封闭的系统，其中培养基、营养物、添加物等等的组合物在发酵开始时放入并且在发酵过程中保持不变，然而，仍可以试图控制诸如pH和氧浓度的因素以便防止培养基过度酸化和/或微生物死亡。术语“分批补料方法”或者“分批补料”发酵是指除了随着发酵过程加入一种或多种底物或添加物(例如增量或连续加入)之外的分批发酵。术语“连续方法”或“连续发酵”是指这样一种系统，其中所限定的发酵培养基连续地加入到发酵罐中并且同时去除等量的使用过的或“条件”培养基，优选地用于目的精细化学品如赖氨酸的回收。已经研发出多种此类方法并且在本领域中是众所周知的。
短语“在导致目的精细化学品如赖氨酸生产的条件下培养”包括在适于或者足以获得目的精细化学品生产或者获得预期生产量的所生产特定精细化学品(如赖氨酸)的条件(例如温度、压力、pH、持续时间等等)下使微生物维持和/或生长。例如，连续培养达到足以产生预期量精细化学品(例如赖氨酸)的时间。优选地，连续培养达到足以基本实现精细化学品(例如赖氨酸)最大生产的时间。在一个实施方案中，培养持续大约12-24小时。在另一个实施方案中，培养持续大约24-36小时、36-48小时、48-72小时、72-96小时、96-120小时、120-144小时，或者大于144小时。在另一个实施方案中，连续培养达到足以实现精细化学品最大生产量的时间，例如培养细胞以致于产生至少大约15-20g/L精细化学品、产生至少大约20-25g/L精细化学品、产生至少大约25-30g/L精细化学品、产生至少大约30-35g/L精细化学品、产生至少大约35-40g/L精细化学品、产生至少大约40-50g/L精细化学品、产生至少大约50-60g/L精细化学品、产生至少大约60-70g/L精细化学品、产生至少大约70-80g/L精细化学品、产生至少大约80-90g/L精细化学品、产生至少大约90-100g/L精细化学品、产生至少大约100-110g/L精细化学品、产生至少大约110-120g/L精细化学品、产生至少大约120-130g/L精细化学品、产生至少大约130-140g/L精细化学品，或者产生至少大约140-160g/L精细化学品。在另一个实施方案中，微生物在使得在大约24小时内、大约36小时内、大约40小时内、大约48小时内、大约72小时内、大约96小时内、大约108小时内、大约122小时内或大约144小时内产生优选生产量精细化学品(例如上述所列范围内的生产量)的条件下培养。
本发明的方法学可以进一步包括回收目的精细化学品如赖氨酸的步骤。术语“回收”目的精细化学品如赖氨酸包括从培养基提取、收获、分离或纯化化合物。按照本领域已知的任意常规分离或纯化方法可以进行化合物的回收，这些方法包括(但不限于)用常规树脂(例如阴离子或阳离子交换树脂、非离子吸附树脂等等)进行处理、用常规吸附剂(例如活性炭、硅酸、硅胶、纤维素、铝等等)进行处理、pH改变、溶剂抽提(例如使用常规溶剂如乙醇、乙酸乙酯、己烷等等)、透析、过滤、浓缩、结晶、重结晶、pH调节、冻干等等。例如，通过首先从培养物中回收微生物可以从培养基中回收精细化学品如赖氨酸。然后将培养基经过阳离子交换树脂以去除不需要的阳离子，并且然后使其经过阴离子交换树脂以去除不需要的无机阴离子和比目的精细化学品(如赖氨酸)具有更强酸性的有机酸。
优选地，本发明目的精细化学品是“提取的”、“分离的”或“纯化的”，以致于所得到的制剂基本上无其它成分(例如无培养基成分和/或发酵副产品)。短语“基本上无其它成分”包括目的化合物制剂，其中化合物是从培养基成分或者产生其的培养物发酵副产品分离(例如纯化或者部分纯化)得到的。在一个实施方案中，制剂含有大于约80％(以干重计)的目的化合物(例如少于大约20％的其它培养基成分或发酵副产品)，更加优选大于约90％的目的化合物(例如少于大约10％的其它培养基成分或发酵副产品)，仍然更加优选大于约95％的目的化合物(例如少于大约5％的其它培养基成分或发酵副产品)，并且最优选大于约98-99％的目的化合物(例如少于大约1-2％的其它培养基成分或发酵副产品)。
在备选的实施方案中，目的精细化学品如赖氨酸不是从微生物纯化得到的，例如当微生物在生物学上无害(例如安全)时。例如，全部培养物(或者培养上清液)可用作产物来源(例如粗产品)。在一个实施方案中，培养物(培养物上清液)可不作处理进行使用。在另一个实施方案中，培养物(培养物上清液)是浓缩的。在另一个实施方案中，培养物(培养物上清液)是干燥的或者冷冻干燥的。
II.不依赖于前体补料需求的生产精细化学品的方法
依赖于所操作生物合成酶或者生物合成酶组合，向本发明微生物提供(例如补料)至少一种戊糖磷酸途径生物合成前体以致于产生精细化学品如赖氨酸是所希望的或者必需的。术语“戊糖磷酸途径生物合成前体”或者“前体”包括这样的试剂或化合物，当向微生物培养基提供它们、它们与微生物培养基接触或者微生物培养基包含它们时，它们可以增强或者提高戊糖磷酸生物合成。在一个实施方案中，戊糖磷酸生物合成前体或前体是葡萄糖。在另一个实施方案中，戊糖磷酸生物合成前体是果糖。所加入的葡萄糖或果糖的量优选地为导致培养基中浓度足以增强微生物生产力(例如足以增强精细化学品如赖氨酸生产的浓度)的量。本发明的戊糖磷酸生物合成前体可以浓缩液或者悬浮液的形式(例如溶于适当溶剂如水或缓冲液)或者以固体形式(例如以粉末形式)加入。而且，本发明的戊糖磷酸生物合成前体可作为单一等分试样在给定时间阶段内连续或者间隔加入。
在本发明的戊糖磷酸生物合成方法学中提供戊糖磷酸生物合成前体可能与高成本相关，例如当方法学用于产生高产量精细化学品时。因此，本发明优选的方法学特征在于具有至少一种所操作生物合成酶或者生物合成酶组合(例如至少一种戊糖磷酸生物合成酶)的微生物，所述操作使得微生物以不依赖于前体补料的方式生产赖氨酸或其它目的精细化学品。当指用于生产目的化合物的方法时，术语“不依赖于前体补料的方式”包括生产目的化合物的方法或模式，其不依赖于或不依靠于向被用来生产目的化合物的微生物所提供(例如补料)的前体。例如，本发明方法学中起重要作用的微生物用于以不需要前体葡萄糖或果糖补料的方式生产精细化学品。
本发明备选的优选方法学特征在于具有至少一种所操作生物合成酶或生物合成酶组合的微生物，所述操作使赖氨酸或其它精细化学品以基本上不依赖于前体补料的方式产生。短语“基本上不依赖于前体补料的方式”包括较小程度依赖或依靠于向所利用微生物提供(例如补料)的前体而生产目的化合物的途径或方法。例如，在本发明方法学中起重要作用的微生物用于以需要提供基本降低数量的前体葡萄糖或果糖的方式生产精细化学品。
以不依赖于前体补料的方式或者备选地以基本上不依赖于前体补料的方式生产目的精细化学品的优选方法涉及培养微生物，这些微生物已经进行了操作(例如设计或工程化改造，如遗传工程化改造)以致于使至少一种戊糖磷酸生物合成酶的表达得到修饰。例如，在一个实施方案中，对微生物进行操作(例如设计或工程化改造)以致于使至少一种戊糖磷酸生物合成酶被去调节。在优选的实施方案中，对微生物进行操作(例如设计或工程化改造)以致于使其具有去调节的生物合成途径，例如文中所定义的去调节戊糖磷酸生物合成途径。在另一个优选的实施方案中，对微生物进行操作(例如设计或工程化改造)以致于使至少一种戊糖磷酸生物合成酶如甘油激酶表达不足。
III.高产量生产方法学
本发明特别优选的实施方案是用于生产精细化学品如赖氨酸的高产量生产方法，其包括在导致以显著高产量生产赖氨酸的条件下培养所操作的微生物。术语“高产量生产方法”，例如用于生产目的精细化学品如赖氨酸的高产量生产方法，包括导致以提高的水平或超过通常可比较的生产方法的水平生产目的精细化学品的方法。优选地，高产量生产方法导致以显著高产量生产目的化合物。术语“显著高产量”包括足以提高的或者超过通常可比较生产方法的生产或产量水平，例如其提高至足以商业生产目的产物的水平(例如以商业可行的成本生产产物)。在一个实施方案中，本发明特征在于生产赖氨酸的高产量生产方法，其包括在使得赖氨酸以大于2g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L、85g/L、90g/L、95g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L、150g/L、160g/L、170g/L、180g/L、190g/L或200g/L的水平产生的条件下培养已操作微生物。
本发明进一步表征了用于生产目的精细化学品如赖氨酸的高产量生产方法，该方法涉及在一定条件下培养已操作微生物，所述条件使得在商业期望时间阶段内生产出提高水平的化合物。在代表性实施方案中，本发明表征了生产赖氨酸的高产量生产方法，该方法包括在一定条件下培养已操作微生物，所述条件使得在5小时内生产高于15-20g/L水平的赖氨酸。在另一个实施方案中，本发明表征了生产赖氨酸的高产量生产方法，该方法包括在一定条件下培养已操作微生物，所述条件使得在10小时内生产高于25-40g/L水平的赖氨酸。在另一个实施方案中，本发明表征了生产赖氨酸的高产量生产方法，该方法包括在一定条件下培养已操作微生物，所述条件使得在20小时内生产高于50-100g/L水平的赖氨酸。在另一个实施方案中，本发明表征了生产赖氨酸的高产量生产方法，该方法包括在一定条件下培养已操作微生物，所述条件使得在40小时内生产高于140-160g/L水平的赖氨酸(例如在40小时内生产高于150g/L水平的赖氨酸)。在另一个实施方案中，本发明表征了生产赖氨酸的高产量生产方法，该方法包括在一定条件下培养已操作微生物，所述条件使得在40小时内生产高于130-160g/L水平的赖氨酸(例如在40小时内生产高于135、145或150g/L水平的赖氨酸)。包括于和/或介于文中所列范围之间的数值和范围也旨在包括于本发明的范围内。例如，以40小时内至少140、141、142、143、144、145、146、147、148、149和150g/L的水平生产赖氨酸旨在包括于40小时内140-150g/L的范围内。在另一个实例中，140-145g/L或145-150g/L的范围旨在包括于40小时内140-150g/L的范围内。此外，熟练技术人员将意识到，培养已操作微生物以获得例如“40小时内140-150g/L”的生产水平包括将微生物培养额外的一段时间(例如比40小时更长的时间段)，任选地导致所生产赖氨酸产量甚至更高。
IV.分离的核酸分子和基因
本发明另一方面表征了用于本发明方法的编码蛋白质(例如谷氨酸棒杆菌蛋白质)如棒杆菌属戊糖磷酸生物合成酶(例如谷氨酸棒杆菌戊糖磷酸酶)的分离的核酸分子。在一个实施方案中，用于本发明方法的分离的核酸分子是甘油激酶核酸分子。
术语“核酸分子”包括DNA分子(例如线性的、环状的cDNA或染色体DNA)和RNA分子(例如tRNA、rRNA、mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链或双链，但是优选地为双链DNA。术语“分离的”核酸分子包括不含核酸分子所来源的有机体的染色体DNA中核酸分子两侧天然存在的序列(例如位于核酸分子5′和3′末端的序列)。在多种实施方案中，分离的核酸分子可能包含核酸分子所来源的微生物的染色体DNA中核酸分子两侧天然存在的少于大约10kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、0.1kb、50bp、25bp或10bp核苷酸序列。而且，“分离的”核酸分子例如cDNA分子当通过重组技术产生是可能基本上不含其它细胞物质，或者当通过化学合成产生是基本上不含化学前体或其它化合物。
如文中所使用，术语“基因”包括在生物中通过基因间DNA(即生物染色体DNA中天然位于基因两侧和/或将基因分隔开的间插DNA或间隔DNA)与另一个基因或其它基因分开的核酸分子(例如DNA分子或其片段)，例如编码蛋白质或RNA的核酸分子。基因可以指导酶或其它蛋白质分子(例如可以包含编码序列，如编码蛋白质的不间断可读框(ORF))的合成或者其自身在生物体内具有作用。生物体中的基因可以在操纵子中成簇存在，如文中所定义，所述操纵子通过基因间DNA与其它基因和/或操纵子分开。操纵子内所包含的各个基因可以重叠，而在所述各个基因之间不含基因间DNA。如文中所使用，“分离的基因”包括基本上不含基因所来源生物染色体DNA中天然位于基因两侧的序列的基因(即，不含编码第二个或不同蛋白质或RNA分子的相邻编码序列、相邻结构序列等等)，并且任选地包括5’和3’调节序列，例如启动子序列和/或终止子序列。在一个实施方案中，分离的基因主要包括蛋白质的编码序列(例如编码棒杆菌蛋白质的序列)。在另一个实施方案中，分离的基因包括蛋白质(例如棒杆菌蛋白质)的编码序列和基因所来源生物染色体DNA中邻近的5’和/或3’调节序列(例如邻近5’和/或3’棒杆菌调节序列)。优选地，分离的基因包含天然位于基因所来源生物染色体DNA中基因两侧的少于大约10kb、5kb、2kb、1kb、0.5kb、0.2kb、0.1kb、50bp、25bp或10bp的核苷酸序列。
在一个方面，本发明的方法特征在于分离的甘油激酶核酸序列或基因的用途。
在优选的实施方案中，核酸或基因来自棒杆菌(例如，为棒杆菌来源的)。术语“来自棒杆菌的”或者“棒杆菌来源的”包括天然存在于棒杆菌属微生物的核酸或基因。优选地，核酸或基因来自选自以下的微生物：谷氨酸棒杆菌、乙酰谷氨酸棒杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌或热产氨棒杆菌。在特别优选的实施方案中，核酸或基因来自谷氨酸棒杆菌(例如，为谷氨酸棒杆菌来源的)。在另一个优选的实施方案中，核酸或基因是棒杆菌基因同系物(例如来自与棒杆菌不同的物种但与本发明棒杆菌基因如棒杆菌甘油激酶基因具有显著同源性)。
包括于本发明范围内的是细菌来源的核酸分子或基因和/或棒杆菌来源的核酸分子或基因(例如谷氨酸棒杆菌来源的核酸分子或基因)，例如本发明人所鉴定的基因如棒杆菌或谷氨酸棒杆菌甘油激酶基因。此外，包括于本发明范围内的是不同于天然存在的细菌和/或棒杆菌核酸分子或基因(例如谷氨酸棒杆菌核酸分子或基因)的细菌来源核酸分子或基因和/或棒杆菌来源核酸分子或基因(例如谷氨酸棒杆菌来源的核酸分子或基因)(例如谷氨酸棒杆菌核酸分子或基因)，例如具有替代、插入或缺失，但编码与本发明天然存在基因产物基本相似的蛋白质的核酸分子或基因。在一个实施方案中，分离的核酸分子包含如SEQ ID NO：1所列的核苷酸序列，或者编码SEQ ID NO：2所列的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明的分离的核酸分子包含与SEQ ID NO：1所列核苷酸序列至少约60-65％、优选至少约70-75％、更加优选至少约80-85％且甚至更加优选至少约90-95％或更高同一性的核苷酸序列。在另一个实施方案中，分离的核酸分子在严格条件下与具有SEQ ID NO：1所列核苷酸序列杂交的核酸分子。此类严格条件是本领域技术人员已知的并且能够在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。严格(例如高严格)杂交条件的优选的非限定性实例为：在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中于大约45℃杂交，接着在0.2XSSC，0.1％SDS中于50-65℃洗涤一次或多次。优选地，在严格条件下与序列SEQ ID NO：1杂交的本发明分离的核酸分子对应着天然存在的核酸分子。如文中所使用，“天然存在”核酸分子是指具有自然界所存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子。
使用标准分子生物学技术和文中所提供的序列信息能够分离本发明的核酸分子(例如具有核苷酸序列SEQ ID NO：1的核酸分子)。例如，可以使用标准杂交和克隆技术(例如描述于Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第2版，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989中的那些)分离核酸分子，或者通过使用基于序列SEQ ID NO：1所设计的合成寡核苷酸引物的聚合酶链式反应分离核酸分子。使用cDNA、mRNA或者备选地使用基因组DNA作为模板并使用适宜寡核苷酸引物，按照标准PCR扩增技术可以扩增本发明的核酸。在另一个优选的实施方案中，本发明分离的核酸分子包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列互补体的核酸分子。
在另一个实施方案中，分离的核酸分子为甘油激酶基因或其部分或片段或者包括甘油激酶基因或其部分或片段。在一个实施方案中，分离的甘油激酶核酸分子或基因包含SEQ ID NO：1所列核苷酸序列(例如包含谷氨酸棒杆菌甘油激酶核苷酸序列)。在另一个实施方案中，分离的甘油激酶核酸分子或基因包含编码如SEQ ID NO：2所列氨基酸序列(例如编码谷氨酸棒杆菌甘油激酶氨基酸序列)的核苷酸序列。在另一个实施方案中，分离的甘油激酶核酸分子或基因编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的甘油激酶蛋白质的同系物。如文中所使用，术语“同系物”包括与文中所述野生型蛋白质或多肽的氨基酸序列具有至少约30-35％、选地至少约35-40％、更优选至少约40-50％且甚至更优选至少约60％、70％、80％、90％或更高同一性，并且具有与所述野生型蛋白质或多肽基本上等效的功能活性或生物学活性的蛋白质或多肽。例如，甘油激酶同系物与具有SEQ ID NO：2所列氨基酸序列的蛋白质具有至少约30-35％、优选至少约35-40％、更优选至少约40-50％且甚至更优选至少约60％、70％、80％、90％或更高同一性，并且具有与具有如SEQ ID NO：2所列氨基酸序列的蛋白质基本上等效功能活性或生物学活性(即，为功能等效物)(例如，具有基本上等效泛酸激酶活性)。在优选的实施方案中，分离的甘油激酶核酸分子或基因包含编码如SEQ ID NO：2所列多肽的核苷酸序列。在另一个实施方案中，分离的甘油激酶核酸分子与具有SEQ ID NO：1中所列核苷酸序列的全部或部分核酸分子杂交，或者与具有编码具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的多肽的核苷酸序列的全部或部分核酸分子杂交。此类杂交条件是本领域技术人员已知的并且在Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人，编，John Wiley & Sons，Inc.(1995)，第2、4和6部分中能够找到。另外的严格条件能够在Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Sambrook等人，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)，第7、9和11章中找到。严格杂交条件的优选的非限定性实例包括：在4X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中于大约65-70℃杂交(或者在4X SSC加50％甲酰胺中于大约42-50℃杂交)，随后在1X SSC中于大约65-70℃洗涤一次或多次。高严格杂交条件的优选的非限定性实例包括：在1X SSC中于大约65-70℃杂交(或者在1X SSC加50％甲酰胺中于大约42-50℃杂交)，随后在0.3X SSC中于大约65-70℃洗涤一次或多次。降低的严格杂交条件的优选的非限定性实例包括：在4X SSC中于大约50-60℃杂交(或者备选地在6X SSC加50％甲酰胺中于大约40-45℃杂交)，随后在2X SSC中于大约50-60℃洗涤一次或多次。介于上述数值之间的范围，例如在65-70℃或在42-50℃也旨在包括于本发明中。在杂交和洗涤缓冲液中，SSPE(1X SSPE为0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH 7.4)可代替SSC(1X SSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；每次杂交完成后洗涤15分钟。对于预期长度少于50bp的杂合体，杂交温度应比杂合体的解链温度(Tm)低5-10℃，其中Tm是根据以下公式确定的。对于长度少于18bp的杂合体，Tm(℃)＝2(A+T碱基数)+4(G+C碱基数)。对于长度在18和49bp之间的杂合体，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N为杂合体中的碱基数，并且[Na+]是杂交缓冲液中钠离子的浓度(对于1X SSC，[Na+]＝0.165M)。熟练工作人员还会认识到，还可向杂交和/或洗涤缓冲液中加入额外试剂以便降低核酸分子与膜(如硝酸纤维素膜或尼龙膜)的非特异性杂交，此类额外试剂包括(但不限于)封闭剂(例如BSA或鲑鱼或鲱鱼精子载体DNA)、去污剂(例如SDS)、螯合剂(例如EDTA)、Ficoll、PVP等等。具体而言，当使用尼龙膜时，严格杂交条件的另外优选的非限定性实例为：在0.25-0.5M NaH2PO4、7％SDS中于大约65℃杂交，随后在0.02M NaH2PO4、1％SDS中于65℃洗涤一次或多次，见例如Church和Gilbert(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1991-1995(或者，备选地为0.2X SSC、1％SDS)。在另一个优选的实施方案中，分离的核酸分子包含与文中所列甘油激酶核苷酸序列互补的核苷酸序列(例如，SEQ IDNO：1所列核苷酸序列的完全互补体)。
使用标准分子生物学技术和文中所提供的序列信息可以分离本发明核酸分子(例如甘油激酶核酸分子或基因)。例如，使用标准杂交和克隆技术(例如，如Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：ALaboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中所描述)可以分离核酸分子，或者通过聚合酶链式反应使用基于文中所列甘油激酶核苷酸序列或其侧翼序列所设计的合成寡核苷酸引物分离核酸分子。使用cDNA、mRNA或备选地使用染色体DNA作为模板并使用适宜寡核苷酸引物，按照标准PCR扩增技术，可以扩增本发明核酸(例如，甘油激酶核酸分子或基因)。
本发明另一个实施方案特征在于突变体甘油激酶核酸分子或基因。如文中所使用，术语“突变体核酸分子”或“突变体基因”包括具有包含至少一种改变(例如替代、插入、缺失)的核苷酸序列的核酸分子或基因，其中改变使得由所述突变体编码的多肽或蛋白质呈现出与由野生型核酸分子或基因所编码的多肽或蛋白质不同的活性。优选地，突变体核酸分子或突变体基因(例如突变体甘油激酶基因)编码在例如相似条件下测定时(例如在培养于相同温度的微生物中进行测定)与野生型核酸分子或基因所编码的多肽或蛋白质相比具有增加的活性(例如，具有增加的甘油激酶活性)的多肽或蛋白质。突变体基因还可以使野生型多肽生产水平降低。
如文中所使用，“降低的活性”或“降低的酶活性”是比野生型核酸分子或基因所编码多肽或蛋白质的活性低至少5％、优选至少5-10％、更优选至少10-25％并且甚至更优选至少25-50％、50-75％或75-100％的活性。介于上述数值之间的范围例如75-85％、85-90％、90-95％也旨在包括于本发明中。如文中所使用，“降低的活性”或“降低的酶活性”还包括已经被删除或“敲除”的活性(例如，比野生型核酸分子或基因所编码多肽或蛋白质的活性低大约100％的活性)。按照广泛接受的测量特定目的蛋白质活性的任意分析法可以确定活性。活性可直接测量或分析，例如测量从细胞分离或纯化的蛋白质的活性。备选地，可在细胞内或细胞外培养基中测量或分析活性。
本领域技术人员应该理解，甚至核酸或基因序列中的单一替代(例如，编码在相应氨基酸序列中发生变化的氨基酸的碱基替代)都能够显著影响与相应野生型多肽和蛋白质相比其所编码的多肽和蛋白质的活性。如文中所定义，突变体核酸或突变体基因(例如，编码突变体多肽或蛋白质)容易与编码如上所述蛋白质同系物的核酸或基因相区别，因为突变体核酸或突变体基因编码具有改变活性的蛋白质或多肽，任选地可以在表达所述突变体基因或核酸或者产生所述突变体蛋白质或多肽的微生物(即突变体微生物)中观察到与表达野生型基因或核酸或者产生所述突变体蛋白质或多肽的相应微生物不同的或可区别的表现型。相反，蛋白质同系物具有相同或基本相似的活性，任选地，当在微生物中产生时与表达野生型基因或核酸的相应微生物相比在表型上不可辨别。因此，例如核酸分子、基因、蛋白质或多肽之间的序列同一性的程度不能用于区别同系物和突变体，而是所编码蛋白质和多肽的活性用于区别同系物和突变体：同系物具有例如低的序列同一性(例如30-50％序列同一性)而具有基本等效的功能活性，并且突变体具有例如99％的序列同一性而具有显著不同或改变的功能活性。
V.重组核酸分子和载体
本发明进一步的特征在于重组核酸分子(例如重组DNA分子)，其包括文中所述的核酸分子和/或基因(例如分离的核酸分子和/或基因)，优选为棒杆菌基因，更加优选为谷氨酸棒杆菌基因，甚至更加优选为谷氨酸棒杆菌甘油激酶基因。
本发明进一步的特征在于载体(例如重组载体)，其包括文中所述的核酸分子(例如分离的或重组的核酸分子和/或基因)。具体而言，重组载体特征在于包括编码如文中所述的细菌基因产物、优选棒杆菌基因产物、更优选谷氨酸棒杆菌基因产物(例如戊糖磷酸酶如甘油激酶)的核酸序列。
术语“重组核酸分子”包括已经进行改变、修饰或工程化改造以致于其在核苷酸序列上与重组核酸分子所来源的固有或天然核酸分子不同(例如，通过加入、缺失或替代一个或多个核苷酸)的核酸分子(例如DNA分子)。优选地，重组核酸分子(例如重组DNA分子)包括与调节序列有效连接的本发明分离的核酸分子或基因(例如分离的甘油激酶基因)。
术语“重组载体”包括已经进行改变、修饰或工程化改造的载体(例如质粒、噬菌体、噬粒、病毒、粘粒或其它纯化的核酸载体)，以致于这些载体包含比重组载体所来源的固有或天然核酸分子中更多、更少或不同的核酸序列。优选地，重组载体包含甘油激酶基因或者包括有效连接至调节序列如启动子序列、终止子序列和/或人工核糖体结合位点(RBS)的该甘油激酶基因的重组核酸分子。
短语“有效连接至调节序列”意思是指目的核酸分子或基因的核苷酸序列以允许核苷酸序列表达(例如增强表达、增加表达、组成型表达、基础表达、减弱表达、降低表达或被抑制表达)、优选为核苷酸序列所编码基因产物的表达(例如当重组核酸分子包括于如上所定义的载体中并导入微生物时)的方式连接至调节序列。
术语“调节序列”包括影响(例如调整或调节)其它核酸序列表达的核酸序列。在一个实施方案中，调节序列以相对于特定目的基因相似或相同的位置和/或方向包括于重组核酸分子或重组载体，正如对于调节序列和目的基因在自然界所观察到的那样，例如天然位置和/或方向。例如，重组核酸分子或重组载体包括与在天然生物中同目的基因相伴和相邻的调节序列有效连接的方式(例如有效连接至“天然”调节序列如“天然”启动子上)的目的基因。备选地，重组核酸分子或重组载体包括与在天然生物中同另一基因(例如不同的基因)相伴和相邻的调节序列有效连接的目的基因。备选地，重组核酸分子或重组载体包括与来自另一生物的调节序列有效连接的目的基因。例如，来自微生物的调节序列(例如其它细菌调节序列、噬菌体调节序列等等)与特定目的基因有效连接。
在一个实施方案中，调节序列是非固有或非天然存在的序列(例如已经进行修饰、突变、替代、衍生、缺失的序列，包括化学合成的序列)。优选的调节序列包括启动子、增强子、终止信号、抗终止信号和其它表达控制元件(例如在转录的mRNA中的阻抑物或诱导物结合的序列和/或转录和/或翻译调节蛋白质的结合位点)。例如，此类调节序列描述于Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：ALaboratory Manual.第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989。调节序列包括指导核苷酸序列在微生物中组成型表达的那些调节序列(例如组成型启动子和强组成型启动子)、指导核苷酸序列在微生物中诱导表达的那些调节序列(例如可诱导启动子如木糖诱导启动子)和减弱或抑制核苷酸序列在微生物中表达的那些调节序列(例如衰减信号或阻抑物序列)。通过去除或删除调节序列来调节目的基因的表达也在本发明的范围内。例如，将参与产生增加转录或组成型转录的转录调节序列去除，从而使目的基因的表达降低。
在一个实施方案中，本发明的重组核酸分子或重组载体包括至少一种与启动子或启动子序列有效连接的编码细菌基因产物(例如，戊糖磷酸生物合成酶如甘油激酶)的核酸序列或基因。本发明优选的启动子包括棒杆菌启动子和/或噬菌体启动子(例如感染棒杆菌的噬菌体)。在一个实施方案中，启动子是棒杆菌启动子，优选为强的棒杆菌启动子(例如，与棒杆菌中生物化学持家基因相关的启动子或者与棒杆菌中糖酵解途径基因相关的启动子)。在另一个实施方案中，启动子是噬菌体启动子。
在另一个实施方案中，本发明的重组核酸分子或重组载体包括一个终止子序列或多个终止子序列(例如转录终止子序列)。术语“终止子序列”包括用于终止基因转录的调节序列。终止子序列(或串联转录终止子)可进一步用于稳定mRNA(例如通过向mRNA中添加结构)，例如抗核酸酶。
在另一个实施方案中，本发明的重组核酸分子或重组载体包括允许检测包含所述序列的载体的序列(即，可检测和/或可筛选标记)，例如克服营养缺陷型突变的序列如ura3或ilvE、荧光标记物和/或比色法标记物(例如lacZ/β-半乳糖苷酶)，和/或抗生素抗性基因(例如amp或tet)。
在另一个实施方案中，本发明的重组载体包括抗生素抗性基因。术语“抗生素抗性基因”包括促进或赋予宿主生物(例如芽孢杆菌属)抗性抗生素的序列。在一个实施方案中，抗生素抗性基因选自：cat(对氯霉素抗性)基因、tet(对四环素抗性)基因、erm(对红霉素抗性)基因、neo(对新霉素抗性)基因和spec(对壮观霉素抗性)基因。本发明的重组载体还可以包括同源重组序列(例如设计用于允许目的基因重组进入宿主生物染色体的序列)。例如，amyE序列可用作重组进入宿主染色体的同源靶标。
本领域技术人员还应该理解，依赖于诸如对待进行遗传工程化改造的微生物的选择、所预期的基因产物表达水平等等因素，对载体进行特定设计。
VI.分离的蛋白质
本发明的另一方面特征在于分离的蛋白质(例如，分离的戊糖磷酸生物合成酶如分离的甘油激酶)。在一个实施方案中，蛋白质(例如，分离的戊糖磷酸酶如分离的甘油激酶)是通过重组DNA技术产生的并且可以使用标准蛋白质纯化技术通过适当的纯化方案从本发明的微生物分离得到。在另一个实施方案中，蛋白质是利用标准肽合成技术化学合成的。
“分离的”或“纯化的”蛋白质(例如分离的或纯化的生物合成酶)基本上不含来自蛋白质所来源微生物的细胞物质或者其它污染蛋白质，或者当为化学合成时基本上不含化学前体或其它化学试剂。在一个实施方案中，分离的或纯化的蛋白质含有少于大约30％(以干重计)的污染蛋白质或化学试剂，更加优选少于大约20％的污染蛋白质或化学试剂，仍然更加优选少于大约10％的污染蛋白质或化学试剂，并且最优选少于大约5％的污染蛋白质或化学试剂。
在优选的实施方案中，蛋白质或基因产物来自棒杆菌(例如，是棒杆菌来源的)。术语“来自棒杆菌的”或“棒杆菌来源的”包括由棒杆菌基因所编码的蛋白质或基因产物。优选地，基因产物来自选自以下的微生物：谷氨酸棒杆菌、乙酰谷氨酸棒杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌或热产氨棒杆菌。在特别优选的实施方案中，蛋白质或基因产物来自谷氨酸棒杆菌(例如，是谷氨酸棒杆菌来源的)。术语“来自谷氨酸棒杆菌的”或“谷氨酸棒杆菌来源的”包括由谷氨酸棒杆菌基因所编码的蛋白质或基因产物。在另一个优选的实施方案中，蛋白质或基因产物是由棒杆菌基因同系物(例如，来自不同于棒杆菌的物种但是与本发明的棒杆菌基因具有显著同源性的基因，例如棒杆菌甘油激酶基因)编码的。
包括于本发明范围之内的为细菌来源的蛋白质或基因产物和/或棒杆菌来源的蛋白质或基因产物(例如谷氨酸棒杆菌来源的基因产物)，它们是由天然存在的细菌和/或棒杆菌基因(例如谷氨酸棒杆菌基因)所编码的，例如本发明者所鉴定的基因如棒杆菌或谷氨酸棒杆菌甘油激酶基因。进一步包括于本发明范围之内的为细菌来源的蛋白质或基因产物和/或棒杆菌来源的蛋白质或基因产物(例如谷氨酸棒杆菌来源的基因产物)，它们是由不同于天然存在的细菌和/或棒杆菌基因(例如谷氨酸棒杆菌基因)的细菌和/或棒杆菌基因(例如谷氨酸棒杆菌基因)所编码的，例如，具有已突变、插入或删除的核酸但编码与本发明天然存在的基因产物基本相似的蛋白质的基因。例如，众所周知本领域的技术人员能够将核酸突变(例如替代)，由于遗传密码的简并性，该突变的核酸编码与天然存在基因所编码氨基酸相同的氨基酸。而且，众所周知本领域的技术人员可以将核酸突变(例如替代)，其导致保守氨基酸替代。众所周知本领域的技术人员可以在一定程度上将氨基酸替代、加入或缺失而与天然存在的基因产物相比基本上不影响基因产物的功能，其中每一情况旨在包括于本发明范围之内。
在优选的实施方案中，本发明分离的蛋白质(例如，分离的戊糖磷酸生物合成酶如分离的甘油激酶)具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。在其它实施方案中，本发明分离的蛋白质是如SEQ ID NO：2所列蛋白质的同系物(例如包含与氨基酸序列SEQ ID NO：2至少约30-40％、优选约40-50％、更加优选约50-60％并且甚至更加优选约60-70％、70-80％、80-90％、90-95％或更高同一性的氨基酸序列，并且具有与氨基酸序列SEQ ID NO：2所编码蛋白质活性基本相似的活性)。
为了确定2个氨基酸序列或2个核酸序列的同源性百分数，将序列比对以达到最佳比较目的(例如，可以将缺口引入第一条氨基酸或核酸序列以达到与第二条氨基酸或核酸序列的最佳比对)。当第一条序列中的一个位置由与第二条序列中相应位置上相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的。两条序列之间的同一性百分数是两条序列所共享相同位置数的函数(即，同一性百分数＝相同位置数/总位置数×100)，优选考虑产生最佳比对所必需的缺口数目和所述缺口大小。
使用数学算法可以实现两条序列之间的序列比较和同一性百分数的确定。用于序列比较的数学算法的优选的非限定性实例是如在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77中进行修改的Karlin和Altschul的算法((1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68)。此种算法被整合入Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)。使用NBLAST程序(分值＝100，字长＝12)进行BLAST核苷酸检索，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。使用XBLAST程序(分值＝50，字长＝3)可进行BLAST蛋白质检索，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有缺口的比对，如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Research25(17)：3389-3402中所描述使用缺口BLAST(Gapped BLAST)。当使用BLAST和缺口BLAST程序时，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列比较的数学算法的另一个优选的非限定性实例是Myers和Miller(1988)ComputApplBiosci.4：11-17的算法。此种算法被整合入ALIGN程序，该程序可在例如GENESTREAM网络服务器、IGH Montpellier、FRANCE(http://vega.igh.cnrs.fr)或在ISREC服务器(http://www.ch.embnet.org)上得到。当利用ALIGN程序进行氨基酸序列比较时，可使用PAMl20加权残余表(weight residue table)、缺口长度罚分为12和缺口罚分为4。
在另一个优选的实施方案中，利用GCG软件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可得到)，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，并且缺口加权为12、10、8、6或4且长度加权为2、3或4，可以确定两条氨基酸序列之间的同源性百分数。在另一个优选的实施方案中，利用GCG软件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可得到)，使用缺口加权为50且长度加权为3，可以确定两条核酸序列之间的同源性百分数。
本发明通过以下不构成限制的实施例进一步举例说明。整个申请中所引用的全部参考文献、专利、序列表、图和已公布专利申请的内容在文中引用作为参考。
实施例
一般方法学：
菌株
谷氨酸棒杆菌ATCC 21526从美国典型培养物保藏中心(Manassas，美国)获得。由于协同的天冬氨酸激酶旁路抑制，该种高丝氨酸营养缺陷型菌株在L-苏氨酸限制期间分泌赖氨酸。将预培养物生长于含有5g L-1果糖或葡萄糖的复合培养基中。对于琼脂平板，复合培养基中额外加入12g L-1琼脂。为了产生作为用于追踪实验和示踪研究接种物的细胞，使用了补充1mg ml-1泛酸钙·HCl的基本培养基(Wittmann，C.和E.Heinzle.2002.Appl.Environ.Microbiol.68：5843-5859)。如下所指出，在该培养基中碳源葡萄糖或果糖的浓度、必需氨基酸苏氨酸、蛋氨酸和亮氨酸的浓度，以及柠檬酸盐的浓度是变化的。
培养
预培养由三步组成，包括(i)使用来自琼脂平板的细胞作为接种物在复合培养基中进行起始培养，(ii)用于适应基本培养基的短期培养和(iii)在必需氨基酸浓度提高的基本培养基上的长期培养。从琼脂平板接种的预培养物在100ml带挡板摇瓶中的10ml复合培养基上生长过夜。然后通过离心(8800g，2分钟，30℃)收获细胞，接种入基本培养基并且生长至光密度为2，以获得适应基本培养基的指数生长细胞。然后通过离心(8800g，30℃，2分钟)收获细胞，其中包括用无菌的0.9％NaCl洗涤的步骤。然后将它们接种入50ml带挡板摇瓶中的6ml基本培养基中，其中含有初始浓度为0.30g L-1的苏氨酸、0.08g L-1的蛋氨酸、0.20g L-1的亮氨酸和0.57g L-1的柠檬酸盐。分别添加70mM葡萄糖或80mM果糖作为碳源。细胞生长直到消耗完必需氨基酸，这可通过HPLC分析检查。生长期结束时收获细胞并用无菌NaCl(0.9％)洗涤。随后将细胞转移入25ml带挡板摇瓶中的4ml基本示踪培养基中，以便在产生赖氨酸的条件下进行代谢通量分析。示踪培养基不含任何苏氨酸、蛋氨酸、亮氨酸或柠檬酸盐。对于每种碳源，接种两个平行的摇瓶，其中分别包含(i)40mM[1-13C]标记的底物和(ii)20mM[13C6]标记的底物加上20mM天然标记的底物。全部培养在旋转摇床(Inova 4230，New Brunswick，Edison，NJ，美国)上于30℃和150转每分进行。
化学试剂
99％[1-13C]葡萄糖、99％[1-13C]果糖、99％[13C6]葡萄糖和99％[13C6]果糖购自Campro Scientific(Veenendaal，荷兰)。酵母提取物和胰蛋白胨从Difco Laboratories(Detroit，Michigan，美国)获得。所有其它所应用化学试剂分别来自Sigma(St.Louis，MI，美国)、Merck(Darmstadt，德国)或Fluka(Buchs，瑞士)，并且为分析级。
底物和产物分析
通过使用光度计(Marsha Pharmacia biotech，Freiburg，德国)测量660nm处的细胞密度(OD660nm)或者通过重量分析法确定细胞浓度。重量分析法是通过将培养液于室温下3700g离心10分钟而收获的10ml细胞确定的，收获过程中包括用水洗涤的步骤。洗涤过的细胞在80℃干燥直到重量恒定。经确定，干的细胞干质量和OD660nm之间的相关因子(g生物量/OD660nm)为0.353。
细胞外的底物和产物浓度是在培养上清液中确定的，该上清液通过16000g离心3分钟获得。在衍生为三甲基硅烷基肟衍生物后通过GC对果糖、葡萄糖、蔗糖和海藻糖进行定量。为了该目的，应用了具有HP 5MS柱(5％苯基-甲基-硅氧烷基-联苯二甲基聚硅氧烷，30m×250μm，HewlettPackard，Paolo Alto，CA，USA美国)的HP 6890气相色谱仪(HewlettPackard，Palo Alto，美国)和具有在70eV下电子碰撞电离的四极质量选择检测器(Agilent Technologies，Waldbronn，德国)。样品制备包括培养上清液的冷冻干燥、溶解于吡啶和随后使用羟胺和(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)(Macherey & Nagel，Düren，德国)(13，14)进行糖的两步衍生作用。β-D-核糖用作定量的内部标准。注射样品体积为0.2μl。GC分析的时间程序如下：150℃(0-5分钟)、8℃ min-1(5-25分钟)、310℃(25-35分钟)。氦用于载气，流量为1.5l min-1。进气口温度为310℃且检测器温度为320℃。通过利用Aminex-HPX-87H Biorad柱(300×7.8mm，Hercules，CA，美国)并使用流速为0.8ml min-1的4mM硫酸作为流动相以及在210nm处进行UV检测的HPLC测定乙酸、乳酸、丙酮酸、2-酮戊二酸和二羟基丙酮。通过酶学测定法(Boehringer，Mannheim，德国)定量甘油。通过利用具有自动化联机衍生化(邻苯二甲醛+3-巯基丙酸)，流速为2ml min-1的Zorbax Eclypse-AAA柱(150×4.6mm，5μm，Agilent Technologies，Waldbronn，德国)以及荧光检测的HPLC(Agilent Technologies，Waldbronn，德国)分析氨基酸。指导手册中给出了详细细节。α-氨基丁酸盐用作定量的内部标准。
13C标记分析
通过GC-MS对培养上清液中赖氨酸和海藻糖的标记模式进行定量。
从而确定单一质量同位素异构物级分。在目前的工作中将它们定义为M0(非标记质量同位素异构物级分的相对量)、M1(单一标记质量同位素异构物级分的相对量)和用于更高标记的相应术语。如先前所述(Rubino，F.M.1989.J.Chromatogr.473：125-133)，将赖氨酸转变成叔丁基-二甲基甲硅烷基(TBDMS)衍生物之后用GC-MS分析。对质量同位素异构物分布的定量在用于离子团m/z 431-437的选择离子监测(SIM)模式下进行。该离子团对应碎片离子，其通过衍生作用残基的叔丁基的损失形成，并且因此包括赖氨酸的全部碳骨架(Wittmann，C.，M.Hans和E.Heinzle.2002.AnalyticalBiochem.307：379-382)。如先前所述(Wittmann，C.，H.M.Kim和E.Heinzle.2003.Metabolic analysis at miniaturized scale.已提交)，从海藻糖的三甲基甲硅烷基(TMS)衍生物确定海藻糖的标记模式。海藻糖的标记模式通过在m/z 361-367处的离子团进行判断，该离子团对应包含海藻糖全部单体单位的碎片离子，并且应此碳骨架等于葡萄糖6-磷酸的碳骨架。全部样品首先以扫描模式进行测量，由此排除所分析的产物和其它样品成分之间的同量异位元素干扰。通过SIM进行的全部测量一式两份重复进行。果糖追踪实验中单一质量同位素异构物级分的试验误差分别为：对于以[1-13C]果糖为底物的赖氨酸为0.85％(M0)、0.16％(M1)、0.27％(M2)、0.35％(M3)、0.45％(M4)，对于以[1-13C]果糖为底物的海藻糖为0.87％(M0)、0.19％(M1)、0.44％(M2)、0.45％(M3)、0.88％(M4)，并且对于以50％[13C6]果糖为底物的海藻糖为0.44％(M0)、0.54％(M1)、0.34％(M2)、0.34％(M3)、0.19％(M4)、0.14％(M5)和0.52％(M6)。葡萄糖追踪实验中MS测量的试验误差分别为：对于以[1-13C]葡萄糖为底物的赖氨酸为0.47％(M0)、0.44％(M1)、0.21％(M2)、0.26％(M3)、0.77％(M4)，对于以[1-13C]葡萄糖为底物的海藻糖为0.71％(M0)、0.85％(M1)、0.17％(M2)、0.32％(M3)、0.46％(M4)，并且对于以50％[13C6]葡萄糖为底物的海藻糖为1.29％(M0)、0.50％(M1)、0.83％(M2)、0.84％(M3)、1.71％(M4)、1.84％(M5)和0.58％(M6)。
代谢模型和参数估计
全部代谢模拟在个人计算机上进行。产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的代谢网络应用于Matlab 6.1和Simulink 3.0(Mathworks，Inc.，Natick，MA，美国)。软件应用包括在Simulink中的同位素异构物模型以便计算网络中13C标记的分布。对于参数的估计，将同位素异构物模型与Matlab中反复最优化算法相结合。关于所应用的计算机工具的详细细节由Wittmann和Heinzle给出(Wittmann，C.和E.Heinzle.2002.Appl.Environ.Microbiol.68：5843-5859)。
代谢网络基于先前的工作并且包括糖酵解、戊糖磷酸途径(PPP)、三羧酸(TCA)循环、丙酮酸的回补羧化作用、赖氨酸和其它分泌产物(表1)的生物合成，以及从中间体前体至生物量的合成代谢通量。另外，选择应用葡萄糖和果糖吸收系统。葡萄糖的吸收涉及通过PTS对葡萄糖6-磷酸的磷酸化作用(Ohnishi，J.，S.Mitsuhashi，M.Hayashi、S.Ando、H.Yokoi、K.Ochiai和M.A.Ikeda.2002.Appl.Microbiol.Biotechnol.58：217-223)。对于果糖，认为有两种吸收系统，分别为：(i)通过PTS果糖吸收并经由果糖1-磷酸转化成果糖1，6-二磷酸，和(ii)通过PTS甘露糖吸收导致形成果糖6-磷酸(Dominguez，H.，C.Rollin，A.Guyonvarch，J.L.Guerquin-Kern，M.Cocaign-Bousquet和N.D.Lindley.1998.Eur.J.Biochem.254：96-102)。此外，将果糖-1，6-二磷酸酶应用于模型中以便允许糖酵解上部分中存在两个方向的碳通量。所涉及的可逆反应是PPP中的转醛酶和转酮酶。另外，对于葡萄糖的实验，认为葡萄糖6-磷酸异构酶也是可逆的，从而海藻糖标记敏感地反映了该酶的可逆性。相反，对于果糖实验，不能确定葡萄糖6-磷酸异构酶的可逆性。在以果糖生长的细胞中，葡萄糖6-磷酸唯一地由果糖6-磷酸形成，导致对两个库相同的标记模式。因此，葡萄糖6-磷酸和果糖6-磷酸之间通过可逆的葡萄糖6-磷酸异构酶互相转换，而不导致能够判断葡萄糖6-磷酸异构酶可逆性的标记差异。赖氨酸和海藻糖的可测量标记对于(i)磷酸烯醇丙酮酸/丙酮酸和苹果酸/草酰乙酸集总库之间通量的可逆性，和(ii)TCA循环中的苹果酸脱氢酶和延胡索酸水合酶的可逆性是不敏感的。因此这些反应被视为是不可逆的。在该研究中不能得到来自天然标记和[13C6]标记底物混合物的丙氨酸标记，所述丙氨酸标记对于这些通量参数是敏感的。基于先前的结果，乙醛酸途径被假定为是非活化的(Wittmann，C.和E.Heinzle.2002.Appl.Environ.Microbiol.68：5843-5859)。
关于谷氨酸棒杆菌生长、产物形成和生物量组成的化学计量数据与所分泌赖氨酸和海藻糖的质谱标记数据一起用于计算代谢通量分布。能够给出两组平行试验中赖氨酸和海藻糖的实验(Mi，exp)和模拟(Mi，calc)质量同位素异构物级分之间最小偏差的通量组被认为是对细胞内通量分布的最好的评价。如附录所述，在葡萄糖上生长的细胞和在果糖上生长的细胞的两个网络已全部确定。因此最小二乘法是可以的。作为误差标准，使用了最小二乘法(SLS)的加权和，这里Si，exp是测量的标准偏差(方程1)。
SLS = Σ i ( M l , exp - M l , calc ) 2 S l , exp 2 (方程1)
应用多重参数初始化以便研究所获得的通量分布是否代表了总体最佳值。对于全部菌株，在赖氨酸生产过程中葡萄糖吸收通量设置为100％并且网络中的其它通量给定为对葡萄糖吸收通量进行归一化的相对摩尔通量。
统计学评价
通过先前所描述的Monte-Carlo方法(Wittmann，C.和E.Heinzle.2002.Appl.Environ.Microbiol.68：5843-5859)对所获得的进行代谢通量进行统计分析。对于每一菌株，统计学分析通过100次参数估计游程(parameterestimation runs)进行，由此对包括所测量质量同位素异构物比率和所测量通量的实验数据在统计学上是不同的。从所获得的数据计算了单一参数的90％的置信界限。
实施例I：通过生长于果糖和葡萄糖上的谷氨酸棒杆菌进行的赖氨酸生产
在可比的葡萄糖和果糖分批培养中分析了产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的代谢通量。为了该目的，将预生长的细胞转移入示踪培养基并培养大约5小时。在追踪实验开始和结束时对底物和产物的分析揭示了两种碳源之间的巨大差异。在葡萄糖生长的细菌，总共产生了11.1mM赖氨酸，而在果糖上生长的细菌仅产生8.6mM的低浓度赖氨酸。在5小时的培养期间，细胞浓度从3.9g L-1增加至6.0g L-1(葡萄糖)和从3.5g L-1增加至4.4g L-1(果糖)。由于培养基中不存在苏氨酸和蛋氨酸，所以细胞可能利用内部来源合成生物量。与葡萄糖的平均的特异糖吸收率(1.71mmol g-1h-1)相比，果糖的平均的特异糖吸收率(1.93mmol g-1h-1)较高。如表1中所描述，所获得的谷氨酸棒杆菌ATCC 21526生产量在果糖和葡萄糖之间显著不同。这涉及主要产物赖氨酸和多种副产品。关于赖氨酸，在果糖上的生产量为244mmol mol-1并且因此比在葡萄糖上的生产量(281mmol mol-1)更低。另外，碳源对生物量的生产量具有巨大影响，与在葡萄糖上相比，在果糖上生物量的生产量几乎降低50％。针对二羟丙酮、甘油和乳酸观察了碳源对副产品形成最显著的影响。在果糖上，这些副产品的积累极大增提高。甘油的生产量提高10倍，而二羟丙酮和乳酸分泌增加6倍。二羟丙酮是在果糖上产生的主要副产品。由于较低的生物量生产量，所以在果糖上生长的细胞对合成代谢前体的需求显著降低(表2)。
表1：在谷氨酸棒杆菌ATCC 21526的赖氨酸生产阶段中来自葡萄糖(左)和果糖(右)的生物量和代谢产物。实验生产量是在(i)40mM[1-13C]标记底物和(ii)20mM [13C6]标记底物加20mM天然标记底物上两次平行培养的平均值与两次培养间的相应偏差。除了生物量的生产量是以(干生物量的mg数)(mmol)-1给出以外，全部生产量以(产物mmol数)(mol)-1给出。
  生产量   在葡萄糖上的赖氨酸生产   在果糖上的赖氨酸生产
  生物量赖氨酸缬氨酸丙氨酸   54.1±0.8281.0±2.00.1±0.00.1±0.0   28.5±0.0244.4±23.30.0±0.00.4±0.1
  甘氨酸二羟丙酮甘油海藻糖α-酮戊二酸乙酸丙酮酸乳酸   6.6±0.026.3±15.33.8±2.43.3±0.51.6±0.445.1±0.31.2±0.47.1±1.7   7.1±0.4156.6±25.838.4±3.90.9±0.16.5±0.336.2±5.72.1±0.538.3±3.5
表2：谷氨酸棒杆菌ATCC 21526在赖氨酸生产阶段中对来自葡萄糖(左)和果糖(右)的合成代谢需求。实验数据是在(i)[1-13C]标记底物和(ii)1∶1的天然标记底物与[13C6]标记底物的混合物上两次平行培养的平均值与两次培养之间的偏差。
前体需求*mmol(mol葡萄糖)-1   在葡萄糖上的赖氨酸生产   在果糖上的赖氨酸生产
葡萄糖6-磷酸果糖6-磷酸戊糖5-磷酸赤藓糖4-磷酸甘油醛3-磷酸3-磷酸甘油酸丙酮酸/磷酸烯醇丙酮酸α-酮戊二酸草酰乙酸乙酰辅酶A二氨基庚二酸+赖氨酸**   11.09±0.163.84±0.0647.50±0.7014.50±0.226.98±0.1059.95±0.89107.80±1.6092.51±1.3748.91±0.72135.30±2.0018.83±0.28   5.84±0.052.02±0.0225.05±0.217.64±0.063.68±0.0336.85±0.3156.80±0.4848.73±0.4145.76±0.3871.25±0.609.92±0.08
*)对前体需求的估计是基于对每一菌株所获得的实验生物量的生产量(表1)和先前所测量的对于谷氨酸棒杆菌的生物量组成(Marx，A.，A.A.de Graaf，W.Wiechert，L.Eggeling和H.Sahm.1996.Biotechnol.Bioeng.49：111-129)。
**)二氨基庚二酸和赖氨酸被认为是单独的合成代谢前体。这是由于从丙酮酸和草酰乙酸到二氨基庚二酸(细胞壁)和赖氨酸(蛋白质)的合成代谢通量，除了助于赖氨酸分泌的通量以外还助于通过赖氨酸生物合成途径的总通量。
实施例II：追踪实验中13C标记模式的人工检查
所分泌的赖氨酸和海藻糖的相对质量同位素异构物级分通过GC-MS定量。这些质量同位素异构物级分对于细胞内通量是敏感的并且因此显示所研究生物系统fluxome的指纹图谱。如图2中所示，所分泌赖氨酸和海藻糖的标记模式在葡萄糖和果糖上生长的谷氨酸棒杆菌细胞之间显著不同。对于两种所应用示踪标记物和两种所测量产物都发现了这些差异。这表明依赖于所应用的碳源在碳通量模式中存在本质差别。如先前所示，在[1-13C]和[13C6]葡萄糖混合物上对谷氨酸棒杆菌进行两次平行培养的质量同位素异构物级分几乎相同(Wittmann，C.，H.M.Kim和E.Heinzle.2003.Metabolic flux analysis at miniaturized scale.已提交)。因此，在代谢通量中所观察到的差异可能与底物特异性差异明显相关。
实施例III：细胞内通量的估计
所进行研究的中心问题是，在分别以葡萄糖和果糖为碳源时赖氨酸生产期间谷氨酸棒杆菌细胞内通量的比较性研究。为此，从追踪实验获得的实验数据用于应用上述通量估计软件计算对于每种底物的代谢通量分布。参数估计通过将实验和计算质量同位素异构物级分之间的偏差最小化实现。在优化的每一个步骤，所开展的方法利用代谢物平衡。这包括(i)产物分泌的化学计量数据(表2)和(ii)对于生物量前体的合成代谢需求化学计量数据(表3)。给出实验和模拟标记模式之间最小偏差的细胞内通量组(set)被作为是对细胞内通量分布的最佳估计。对于两种情况，使用多个初始化数值获得相同的通量分布，表明鉴定出了总体最低量。很明显，在实验确定的质量同位素异构物和计算的质量同位素异构物比率之间具有良好一致性(表4)。
表3：分别培养于葡萄糖和果糖上的产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌ATCC 21526所分泌赖氨酸和海藻糖的相对质量同位素异构物级分。对于两种碳源，在(i)[1-13C]标记示踪底物和(ii)天然13C标记示踪底物和[13C6]标记示踪底物的1∶1混合物上开展了两个平行追踪实验。显示了实验GC/MS数据(exp)和通过数学模型作出的对应最优化通量组的预测数值(calc)。M0表示非标记质量同位素异构物级分的相对量，M1表示单一标记质量同位素异构物级分的相对量，并且相应术语代表更高标记质量同位素异构物级分的相对量。
             赖氨酸(在[1-13C]标记底物上)               海藻糖(在[1-13C]标记底物上)                         海藻糖(在50％[13C6]标记底物上)
  M0   M1   M2   M3   M4   M0   M1   M2   M3   M4   M0   M1   M2   M3   M4   M5   M6
  葡萄糖expcalc果糖expcalc   0.2340.2420.1330.139   0.3600.3550.3160.321   0.2470.2450.3040.298   0.1100.1100.1620.159   0.0370.0370.0620.061   0.1100.1140.2120.195   0.5510.5490.4120.419   0.2160.2120.2440.254   0.0940.0940.0920.094   0.0230.0230.0300.030   0.2710.2680.1410.144   0.1140.1130.1030.103   0.0870.0850.1040.102   0.1150.1130.2500.245   0.0690.0680.1330.131   0.0660.0640.1100.111   0.2790.2890.1590.164
实施例IV：对于果糖和葡萄糖，在赖氨酸生产期间的代谢通量
对于在葡萄糖和果糖上生长的产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌所获得的细胞内通量分布示于图(4，5)。很明显，细胞内通量会取决于所应用的碳源而有极大不同。在葡萄糖上，62％的碳通量流向PPP，而仅36％流经糖酵解链(图4)。由于该相对高的量，124％的NADPH通过PPP中的葡萄糖6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡糖酸脱氢酶产生。对于果糖，情况完全不同(图5)。所进行的通量分析揭示了两种PTS对于果糖吸收的体内活性，由此92.3％的果糖是通过果糖特异PTS果糖摄入的。相比之下，小部分果糖(7.7％)是通过PTS甘露糖摄入的。因此，绝大多数果糖在果糖1，6-二磷酸水平进入糖酵解，而仅一小部分在果糖6-磷酸上游进入糖酵解链。与在葡萄糖上生长的细胞相比，PPP呈现急剧降低的活性，仅14.4％。葡萄糖6-磷酸异构酶对两种碳源起相反的作用。在葡萄糖上生长的细胞中，36.2％的净通量从葡萄糖6-磷酸流向果糖6-磷酸，而对于果糖则观察到15.2％的反向净通量。
在果糖上，流经葡萄糖6-磷酸异构酶和PPP的通量是流经PTS甘露糖的通量的大约两倍。然而这不是因为碳从果糖1，6二磷酸到果糖6-磷酸的葡萄糖异生通量，葡萄糖异生已经向PPP提供了额外的碳通量。事实上，流经果糖1，6-二磷酸酶所催化该反应的通量是零。负责流向PPP的额外通量的代谢反应是PPP中的可逆酶转醛酶和转酮酶。大约3.5％的该额外通量由转酮酶2提供，这使得源自PPP的碳重新循环进入该途径。此外，4.2％的通量通过转醛酶的作用流向了果糖6-磷酸和PPP。
取决于碳源，在丙酮酸结点周围还可以观察到产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌中的完全不同的通量模式(图4，5)。对于葡萄糖，进入赖氨酸途径的通量是30.0％，而对于果糖进入赖氨酸途径的通量是25.4％降低。与果糖相比，对于葡萄糖提高的赖氨酸生产量是该种通量差异的主要原因，而且导致对用于细胞壁合成的二氨基庚二酸和用于蛋白质合成的赖氨酸的更高需求的更高生物量生产量也促成了该差异。对于葡萄糖，回补通量为44.5％并因此显著高于相比较的对于果糖的通量(33.5％)。这主要是由于对用于赖氨酸生产的草酰乙酸的更高需求，而且还是由于在葡萄糖上对草酰乙酸和2-酮戊二酸的更高合成代谢需求。另一方面，与果糖(95.2％)相比，对于葡萄糖流经丙酮酸脱氢酶的通量基本上更低(70.9％)。这种进入TCA循环的降低的碳通量导致了对于葡萄糖降低了的通量中30％以上的通量流经TCA循环酶(图3，4)。
通过Monte-Carlo方法对所获得的通量进行统计学评价，以计算所确定通量参数的90％置信区间。如表5中所示的多种关键通量，置信区间通常较窄。例如，流经葡萄糖6-磷酸脱氢酶的通量的置信区间对于在葡萄糖上生长的细胞仅为1.2％并且对于在果糖上生长的细胞仅为3.5％。因此所选方法允许精确估计通量。可以得出结论：对于葡萄糖和果糖所观察到的通量差异无疑是由所应用的碳源引起的。
已经注意到，对于果糖平均特异底物摄入(1.93mmol g-1h1)略高于对于葡萄糖的平均特异底物摄入(1.77mmol g-1h-1)。由此，与上面所讨论的相对通量相比，对于葡萄糖以mmol g-1h-1表示的绝对的细胞内通量微有增加。然而，分别在果糖和葡萄糖上生长的产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌通量分布如此完全不同，以致于从上面得出的所有比较对于绝对碳通量也有效。
表4：通过使用质谱和代谢产物平衡的13C示踪研究所确定的生长于果糖(左)和葡萄糖(右)上的产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌ATCC 21526代谢通量的统计学评价：主要通量参数的90％置信区间是通过Monte-Carlo方法获得的，包括对具有统计学差异实验数据的每一种底物进行100次参数估计游程。
  通量参数   葡萄糖   果糖
  净通量通过PTSFrc的果糖摄入通过PTSMan的果糖摄入葡萄糖6-磷酸异构酶 --[35.7  36.8] [90.0  96.1][3.9   10.0][13.4  16.9]
  磷酸果糖激酶果糖1，6-二磷酸酶*果糖1，6-二磷酸酶醛缩酶葡萄糖6-磷酸脱氢酶转醛酶转酮酶1转酮酶2甘油醛3-磷酸脱氢酶丙酮酸激酶丙酮酸脱氢酶丙酮酸羧化酶柠檬酸合酶异柠檬酸脱氢酶酮戊二酸脱氢酶天冬氨酸激酶通量可逆性**葡萄糖6-磷酸异构酶转醛酶转酮酶1转酮酶2   [35.7  36.8]-[73.7  73.8][62.5  63.7][19.4  19.8][19.4  19.8][17.9  18.3][158.1 164.5][156.2 167.4][69.5  72.5][43.7  44.8][51.2  54.8][51.2  54.8][41.6  45.6][29.6  30.3][4.5   5.1][4.3   4.9][0.0   0.0][0.4   0.6]   -[-2.1  3.4][91.7  92.9][12.6  16.1][3.6   4.1][3.6   4.1][2.9   4.0][163.3 174.6][158.9 168.2][87.1  102.3][29.9  37.3][76.5  91.5][76.5  91.5][70.9  86.0][21.8  29.2]-[14.5  18.2][0.0   0.1][0.0   0.1]
*较低置信范围的负通量等于相反方向上的正通量(流经磷酸果糖激酶)。
**通量可逆性定义为反向通量与净通量的比。
实施例I-IV的讨论：
A.底物特异性培养特征
产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌分别在果糖和葡萄糖上的生长揭示，生长和产物形成强烈依赖于所应用的碳源。先前也已经报道过，对于谷氨酸棒杆菌的另一菌株，在果糖上生长显著降低了赖氨酸生产量和生物量，其中与葡萄糖相比，赖氨酸和生物量生产量分别减少30％和20％(Kiefer，P.，E.Heinzle和C.Wittmann.2002.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.28：338-43)。与葡萄糖相比，在果糖上培养谷氨酸棒杆菌和栖糖蜜棒杆菌(C.melassecola)与更高的二氧化碳生产率相关联(Dominguez，H.，C.Rollin，A.Guyonvarch，J.L.Guerquin-Kern，M.Cocaign-Bousquet和N.D.Lindley.1998.Eur.J.Biochem.254：96-102；Kiefer，P.，E.Heinzle和C.Wittmann.2002.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.28：338-43)。这与在本研究中对于该碳源所观察到的流经TCA循环的升高的通量相一致。对于副产品也观察到底物特异性差异。与葡萄糖相比，对于果糖海藻糖的形成较低。这与葡萄糖和果糖进入糖酵解的进入点差异相关(Kiefer，P.，E.Heinzle和C.Wittmann.2002.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.28：338-43)。考虑到谷氨酸棒杆菌中的摄入系统，葡萄糖的利用导致海藻糖前体葡萄糖6-磷酸的形成，而果糖被转变成果糖1，6-二磷酸并因此进入葡萄糖6-磷酸下游的中心代谢(Dominguez，H.，C.Rollin，A.Guyonvarch，J.L.Guerquin-Kern，M.Cocaign-Bousquet和N.D.Lindley.1998.Eur.J.Biochem.254：96-102)。当果糖作为碳源使用时，其它副产品如二羟丙酮、甘油和乳酸显著增加。从赖氨酸生产的角度看，这不是所期望的，因为相当大部分的碳从中心代谢中撤出而形成副产品。对于果糖，特异底物摄入(1.93mmol g-1h-1)高于葡萄糖(1.77mmol g-1h-1)。该结果不同于先前对指数生长的栖糖蜜棒杆菌ATCC 17965进行的研究(Dominguez，H.，C.Rollin，A.Guyonvarch，J.L.Guerquin-Kern，M.Cocaign-Bousquet和N.D.Lindley.1998.Eur.J.Biochem.254：96-102)，其中在先前研究中对于果糖和葡萄糖观察到相似的特异摄入率。在我们的研究中所观察到的对于果糖更高的摄入率可能是由于所研究的菌株不同。栖糖蜜棒杆菌和谷氨酸棒杆菌是相关物种，但是在某些代谢特性上可能不同。本工作中所研究的菌株是先前通过经典菌株优化得到的。这可能已经导入了影响底物摄入的突变。另一种解释是培养条件的差异。在限制生长和赖氨酸生产的条件下，果糖可以被更有效地利用。
B.代谢通量分布
对于葡萄糖和果糖所获得的产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的细胞内通量分布显示了巨大差异。对所获得的通量的统计学评价揭示了狭窄的90％置信区间，以致于所观察到的通量差异无疑可以归因于所应用的碳源。最显著的差异之一涉及糖酵解和PPP之间的通量分配。在葡萄糖上，62.3％的碳流经PPP途径。在该底物上产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的PPP优势已经在先前不同的研究中观察到了(Marx，A.，A.A.de Graaf，W.Wiechert，L.Eggeling和H.Sahm.1996.Biotechnol.Bioeng.49：111-129；Wittmann，C.和E.Heinzle.2001.Eur.J.Biochem.268：2441-2455；Wittmann，C.和E.Heinzle.2002.Appl.Environ.Microbiol.68：5843-5859)。在果糖上，进入PPP的通量降低至14.4％。如通过所进行的代谢通量分析所鉴定，这主要是归因于果糖在果糖1，6-二磷酸水平的进入与果糖1，6二磷酸酶失活之间的不利组合。所观察到的果糖1，6二磷酸酶的失活与分别在果糖和葡萄糖上指数生长期间的栖糖蜜棒杆菌ATCC 17965的酶学测量结果非常一致(Dominguez，H.，C.Rollin，A.Guyonvarch，J.L.Guerquin-Kern，M.Cocaign-Bousquet和N.D.Lindley.1998.Eur.J.Biochem.254：96-102)。
令人惊讶的是，当谷氨酸棒杆菌在果糖上培养时，流经葡萄糖6-磷酸异构酶和PPP的通量是流经PTS甘露糖的通量的大约两倍。由于果糖1，6二磷酸酶的失活，因此这不是由葡萄糖异生通量引起的。事实上，谷氨酸棒杆菌拥有经过果糖6-磷酸、葡萄糖6-磷酸和核糖5-磷酸的有效代谢循环。进入PPP的额外通量是由转酮酶2和转醛酶的作用提供的，其中转酮酶2将来自PPP的碳重新循环返回该途径，转醛酶使甘油醛3-磷酸返回PPP，因此绕过葡萄糖异生作用。该循环活性可以帮助细胞克服以果糖为底物时的NADPH限制。对于在果糖上生长的谷氨酸棒杆菌中到达葡萄糖6-磷酸的极大降低的通量，还可以解释在该底物上海藻糖形成的降低(Kiefer，P.，E.Heinzle和C.Wittmann.2002.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.28：338-43)。葡萄糖6-磷酸异构酶会取决于碳源而在相反方向上起作用。在葡萄糖上生长时，净通量直接从葡萄糖6-磷酸流向果糖6-磷酸，而在果糖上观察到相反的净通量。这强调了该酶的可逆性对于谷氨酸棒杆菌中代谢灵活性的重要性。
C.NADPH代谢
以下计算提供了在果糖和葡萄糖上产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的NADPH代谢的比较。从所估计的流经葡萄糖6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶的通量计算了NADPH的全部供给。在葡萄糖上，PPP中葡萄糖6-磷酸脱氢酶(62.0％)和葡萄糖6-磷酸脱氢酶(62.0％)提供大部分的NADPH。异柠檬酸脱氢酶(52.9％)提供的程度较小。在果糖上观察到PPP和TCA循环对NADPH供给的贡献完全不同，其中异柠檬酸脱氢酶(83.3％)是NADPH主要的来源。在果糖上，葡萄糖6-磷酸脱氢酶(14.4％)和葡萄糖6-磷酸脱氢酶(14.4％)产生非常少的NADPH。NADPH是生长和赖氨酸形成所必需的。生长所需的NADPH从11.51mmol NAPDH(g生物量)-1化学计量需求量计算，假定这对于在葡萄糖和果糖上生长(Dominguez，H.，C.Rollin，A.Guyonvarch，J.L.Guerquin-Kern，M.Cocaign-Bousquet和N.D.Lindley.1998.Eur.J.Biochem.254：96-102)和对于本研究所得实验生物量生产量(表1)是相同的。对于在葡萄糖上的生物量生产，谷氨酸棒杆菌消耗62.3％的NADPH，这比以果糖作为碳源(32.8％)更高。产物合成所需的NADPH的量从所估计的进入赖氨酸的通量(表1)和4mol(mol赖氨酸)-1的相应化学计量NADPH需求量确定。对于从葡萄糖生产赖氨酸为112.4％而对于从果糖生产赖氨酸为97.6％。在葡萄糖上全部NADPH供给(176.9％)显著高于果糖(112.1％)，这可能主要是由于在葡萄糖上PPP通量的增加。在葡萄糖上，NADPH平衡几乎关闭。相反，在果糖上，观察到显著的NADPH(18.3％)缺乏。这引起这样的疑问，即除了上面提到的葡萄糖6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶，催化代谢反应的酶能否提供NADPH。可能的候选者似乎是NADPH依赖的苹果酸酶。先前，与在葡萄糖上生长的细胞相比，在果糖上生长的栖糖蜜棒杆菌中检测到该酶增加的特异性活性(Dominguez，H.，C.Rollin，A.Guyonvarch，J.L.Guerquin-Kern，M.Cocaign-Bousquet和N.D.Lindley.1998.Eur.J.Biochem.254：96-102)。然而，流经该特定酶的通量不能在本研究中通过实验解决。假定苹果酸酶为缺乏的产生NADPH的酶，18.3％的通量将足以补充NADPH的明显缺乏。以葡萄糖作为碳源的谷氨酸棒杆菌的详细通量研究显示苹果酸酶无显著活性(Petersen，S.，A.A.deGraaf，L.Eggeling，M.Mllney，W.Wiechert和H.Sahm.2000.J.Biol.Chem.75：35932-35941)。然而，在果糖上的情况可以联想到该酶提高的体内活性。
D.NADH代谢
在果糖上，谷氨酸棒杆菌显示NADH形成酶活性增加。在果糖上，421.2％的NADH由甘油醛3-磷酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、2-酮戊二酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶形成。在葡萄糖上，NADH的产生仅为322.4％。另外，在果糖上合成代谢的NADH需求量显著低于在葡萄糖上的需求量。显著增加的NADH生产与降低的代谢需求量一起导致增加的NADH/NAD比。对于栖糖蜜棒杆菌，先前已经显示，与葡萄糖相比在果糖上生长导致增加的NADH/NAD比(Dominguez，H.，C.Rollin，A.Guyonvarch，J.L.Guerquin-Kern，M.Cocaign-Bousquet和N.D.Lindley.1998.Eur.J.Biochem.254：96-102)。这引起对在果糖上赖氨酸生产期间NADH再生机制的疑问。在果糖上生长的细胞呈现出增强的二羟丙酮、甘油和乳酸分泌。增加的二羟丙酮和甘油形成可能是由于较高的NADH/NAD比。先前已经显示，NADH可抑制甘油醛脱氢酶，以致于二羟丙酮和甘油的过剩可能与该酶通量能力的降低相关。二羟丙酮到甘油的减少另外还可能是由于高NADH/NAD比的影响，并且因此有助于过量NADH的再生。从丙酮酸形成乳酸所需NADH可能与甘油的产生具有相似的背景。与指数生长相比较，在赖氨酸生产条件下，以相对高TCA循环活性和降低的生物量生产量为特征的NADH过剩甚至可能更高。
E.用于在果糖上优化产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的有效靶点
基于所获得的通量模式，阐明了几个用于对在果糖上生长的谷氨酸棒杆菌进行赖氨酸生产优化的有效靶点。中心点是NADPH供给。果糖1，6二磷酸酶是用于增加NADPH供给的一个靶点。去调节(如其活性增强)导致流经PPP的更高通量，从而导致增加的NADPH再生和增加的赖氨酸生产量。通过果糖1，6-二磷酸酶的增强使流经PPP的通量增加对于芳香氨基酸的生产也是有利的(Ikeda，M.2003.Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.79：1-36)。从赖氨酸生产的观点来看，在果糖上生长期间果糖1，6-二磷酸酶的失活是有害的，但毫不令人惊奇，因为这种葡萄糖异生酶在糖上生长期间是不需要的并且很可能受到抑制。在原核细胞中，通过例如果糖1，6-二磷酸酶、果糖-2，6二磷酸酶、金属离子和AMP使该酶处于有效的代谢控制下(Skrypal，I.G.和O.V.Iastrebova.2002.Mikrobiol Z.64：82-94)。已知谷氨酸棒杆菌能够在乙酸上生长(Wendisch，V.F.，A.A.de Graaf，H.SahmH.和B.Eikmans.2000.J.Bacteriol.182：3088-3096)，在其中该酶对于维持葡萄糖异生是必需的。增加流经PPP通量的另一个有效靶点是用于果糖摄入的PTS。对PTS果糖和PTS甘露糖之间通量分配的修饰可以产生更高比例的果糖(其在果糖6-磷酸水平进入)，并因此还导致增加的PPP通量。另外，可能明显助于在果糖上的NADPH供给的苹果酸酶的增强可能是目的靶点。
另一个瓶颈包括二羟丙酮、甘油和乳酸的强分泌。二羟丙酮和甘油的形成可以通过去调节(例如相应酶的缺失)阻断。二羟丙酮磷酸至二羟丙酮的转化可能由相应磷酸酶催化。然而，在谷氨酸棒杆菌中仍然没有对二羟丙酮磷酸酶进行注释(见国立生物技术信息中心(NCBI)的分类学网站： http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/)。该反应还可以被激酶如甘油激酶催化。目前，谷氨酸棒杆菌基因组数据库中两个条目涉及二羟丙酮激酶(见国立生物技术信息中心(NCBI)分类学网站：http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/)。
乳酸分泌还可以通过去调节，例如乳酸脱氢酶的敲除而消除。尽管甘油和乳酸形成对于NADH再生可能是重要的，但其对生物体总体性能的负作用无论如何也不能排除。如先前所推测，在流经较低部分糖酵解链的碳通量受甘油醛3-磷酸脱氢酶能力限制的情况下(Dominguez，H.，C.Rollin，A.Guyonvarch，J.L.Guerquin-Kern，M.Cocaign-Bousquet和N.D.Lindley.1998.Eur.J.Biochem.254：96-102)，二羟丙酮和甘油生产的抑制作用可能最终导致果糖1，6二磷酸酶的活化和流经PPP的碳通量的改道。应该注意到，二羟丙酮在谷氨酸棒杆菌培养期间不被重新利用，并因此至于产物合成则表现出碳的浪费，然而对于乳酸情况并非如此(Cocaign-Bousquet，M.和N.D.Lindley.1995.Enz.Microbiol.Technol.17：260-267)。
在一个实施方案中，将以上组合基因中的一种或多种基因进行去调节利于精细化学品如赖氨酸的生产。
另外，对于通过谷氨酸棒杆菌的赖氨酸产生，蔗糖也是有用的碳源，例如与本发明方法联合使用。蔗糖是糖蜜中的主要碳源。如先前所显示，蔗糖中的果糖单位在果糖1，6-二磷酸酶水平进入糖酵解(Dominguez，H.和N.D.Lindley.1996.Appl.Environ.Microbiol.62：3878-3880)。因此，该部分蔗糖分子-假定果糖1，6-二磷酸酶失活-可能不进入PPP，从而可能使产赖氨酸的菌株中的NADPH供给受到限制。
实施例V：质粒PCIS LYSC的构建
在菌株构建的第一步骤中要求在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中进行lysC野生型基因的等位基因交换。在该种状况下，在lysC基因中进行核苷酸交换以便在所得到的蛋白质中位置311上的氨基酸Thr被Ile替换。从作为PCR反应模板的ATCC 13032染色体DNA起始并使用寡核苷酸引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，通过Pfu Turbo PCR系统(Stratagene，美国)并按照产品说明书扩增lysC。按照Tauch等人(1995)Plasmid33：168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology 140：1817-1828的方法制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA。在扩增片段的5’端为SalI限制性酶切位点且其3’端为MluI限制性酶切位点。克隆之前，通过这两种限制性酶消化所扩增的片段并使用GFXTMPCR DNA及凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)纯化。
SEQ ID NO：3：
5’-GAGAGAGAGACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATC-3’
SEQ ID NO：4：
5’-CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTG-3’
通过SalI和MluI限制性位点将所得到的多核苷酸克隆入具有整合的SacB的pCLIK5MCS(在下文中称为pCIS(SEQ ID NO：5))中，并转化进入大肠杆菌XL-1blue中。通过涂布于含有卡那霉素(20μg/ml)的LB琼脂(Lennox，1955，Virology，1∶190)上对含有质粒的细胞进行筛选。分离质粒并通过测序来证实预期核苷酸序列。通过Qiagen公司的方法并使用来自Qiagen公司的材料制备质粒DNA。按照Sanger等人(1977)Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 74：5463-5467所述进行测序反应。使用ABI prism 377(PE Applied Biosystems，Weiterstadt)对测序反应进行分离和分析。将所得到的质粒pCIS lysC列为SEQ ID NO：6。
实施例VI：来自谷氨酸棒杆菌的lysC基因的诱变
使用QuickChange试剂盒(公司：Stratagene/美国)按照产品说明书对谷氨酸棒杆菌的lysC基因进行定向诱变。在质粒pCIS lysC(SEQ ID NO：6)中进行诱变。合成以下寡核苷酸引物用于通过QuickChange方法(Stratagene)将thr 311替换成311ile：
SEQ ID NO：7：
5’-CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCG-3’
SEQ ID NO：8：
5’-CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCG-3’
这些寡核苷酸引物在QuickChange反应中的使用导致在lysC基因SEQ ID NO：9中932位上发生核苷酸交换(由C变成T)。在转化进入大肠杆菌XL1-blue中并制备质粒之后，通过[a]测序反应证实了lysC基因中的氨基酸交换Thr311Ile。将质粒命名为pCIS lysC thr311ile并列于SEQ IDNO：10。
如Liebl等人(1989)FEMS Microbiology Letters 53：299-303所述，通过电穿孔将质粒pCIS lysC thr311ile转化入谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中。对该方案的修改描述于DE 10046870中。使用如Sambrook等人(1989)，Molecular cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor中所述的标准方法，通过Southern印迹及杂交来检查各个转化体的lysC基因座上的染色体排列。此举确保转化体已通过同源重组在lysC基因座上整合了所转化的质粒。此类菌落在不含抗生素的培养基中生长过夜之后，将细胞涂布于蔗糖CM琼脂培养基(10％蔗糖)上并于30℃下培养24小时。由于载体pCISlysC thr311ile中所存在的sacB基因将蔗糖转化为有毒产物，因此能够生长的菌落仅仅为通过野生型lysC基因与所突变lysC thr311ile基因之间的第二个同源重组步骤而缺失sacB基因的那些菌落。在同源重组过程中，或者是野生型基因或者是突变的基因与sacB基因一起缺失。如果SacB基因与野生型基因一起去除，则导致产生突变的转化体。
挑取生长菌落并检验其卡那霉素敏感性表型。缺失SacB基因的菌落必须同时显示出卡那霉素敏感性生长行为。在摇瓶中研究此类卡那霉素敏感性克隆的赖氨酸生产力(见实施例6)。为了比较，选取未经处理的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032。选择与对照组相比赖氨酸生产提高的菌落，回收染色体DNA，通过PCR反应扩增lysC基因的相应区并测序。将具有增加的赖氨酸合成特性且在lysC的932位上具有所检测突变的一个此种克隆称作ATCC13032lysCfbr。
实施例VII：质粒PK19MOB SACBδ甘油激酶的制备
按照Tauch等人，(1995)Plasmid 33：168-179或Eikmanns等人，(1994)Microbiology 140：1817-1828的方法制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA。按照如Innis等人，(1990)PCR Protocols.A Guide to Methodsand Applications，Academic Press所描述的标准方法，通过聚合酶链式反应(PCR)使用寡核苷酸引物SEQ ID NO：11和12、作为模板的染色体DNA和Pfu Turbo聚合酶(公司：Stratagene)扩增带有侧翼区域的甘油激酶基因。
SEQ ID NO：11：
CK 345：5’-GGCCGCTAGCGTTTTTGGTCACCCCGGAAT-3’
SEQ ID NO：12：
CK 346：5’-GGCCTCTAGAACACGCTTGGACCAGTGCTT-3’
使用GFXTMPCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)按照产品说明书纯化所得到的大约2.4kb大小的DNA片段。之后，使用限制性内切酶NheI和XbaI(Roche Diagnostics，Mannheim)将其断裂并且使用GFXTMPCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒纯化DNA片段。
质粒pK19mob sacB SEQ ID NO：13也用限制性内切酶NheI和XbaI进行酶切并在电泳分离后使用GFXTMPCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒分离5.5kb大小的片段。
使用快速连接试剂盒(Roche Diagnostics，Mannheim)按照产品说明书将载体片段与PCR片段连接到一起，并且按照如Sambrook等人，(Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，(1989))所描述的标准方法将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，美国)。通过涂布于含有卡那霉素(20μg/mL)的LB琼脂(Lennox，1955，Virology，1∶190)上实现携带载体的细胞的筛选。按照Qiagen公司的方法并使用Qiagen公司的材料进行质粒DNA的制备。测序反应按照Sanger等人，(1977)Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 74：5463-5467进行。通过ABI Prism 377(PE Applied Biosystems，Weiterstadt)方法分离测序反应物并进行分析。所得到的命名为pK19甘油激酶。
随后使用限制性内切酶BamHI和XhoI(Roche Diagnostics，Mannheim)酶切质粒pK19甘油激酶(SEQ ID NO：14)并在电泳分离后使用GFXTM PCR DNA和凝胶条带纯化试剂盒分离6.3kb大小的片段。按照产品说明书使用Klenow酶处理该片段之后，使用快速DNA连接试剂盒(Roche Diagnostics，Mannheim)按照产品说明书进行再次连接。按照Sambrook等人，(Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，(1989))描述的标准方法将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，美国)。通过涂布于含有卡那霉素(20μg/mL)的LB琼脂(Lennox，1955，Virology，1∶190)上实现对携带载体细胞的筛选。
按照Qiagen公司的方法并使用Qiagen公司的材料进行质粒DNA的制备。测序反应按照Sanger等人，(1977)Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 74：5463-5467进行。通过ABI Prism 377(PEApplied Biosystems，Weiterstadt)方法分离测序反应物并进行分析。所得到的质粒pK19δ甘油激酶列于SEQ ID NO：15。
实施例VIII：赖氨酸生产
如Liebl等人，(1989)FEMS Microbiology Letters 53：299-303所述，使用电穿孔方法将质粒pK19δ甘油激酶转化入谷氨酸棒杆菌ATCC13032lysCfbr。对该方案的修改描述于DE 10046870中。使用如Sambrook等人(1989)，Molecular cloning.A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor中所述的标准方法，通过Southern印迹及杂交来检查各个转化体甘油激酶基因座上的染色体排列。此举确保转化体已通过同源重组在甘油激酶基因座上整合了所转化的质粒。此类菌落在不含抗生素的培养基中生长过夜之后，将细胞涂布于蔗糖CM琼脂培养基(10％蔗糖)上并于30℃下培养24小时。
由于载体pK19δ甘油激酶中所存在的sacB基因将蔗糖转化为有毒产物，因此能够生长的菌落仅仅为通过野生型甘油激酶基因与所截短基因之间的第二个同源重组步骤而缺失sacB基因的那些菌落。在同源重组过程中，或者是野生型基因或者是截短的基因与sacB基因一起缺失。如果SacB基因与野生型基因一起被去除，则导致产生突变的转化体。
挑取生长菌落并检验其卡那霉素敏感性表型。缺失SacB基因的菌落必须同时显示出卡那霉素敏感性生长行为。如Innis等人，(1990)PCRProtocols.A Guide to Methods and Applications，Academic Press所描述，按照标准方法利用聚合酶链式反应(PCR)检查是否已经发生了截短基因对天然基因的预期替换。为了该分析，分离了起始菌株和所得到克隆的染色体DNA。为了该目标，使用牙签从琼脂平板上取出各个克隆并悬于100μLH2O中，在95℃煮沸10分钟。在每种情况下，取10μL所得到的溶液用作PCR中的模板。使用的引物为寡核苷酸CK345和CK346。由于寡核苷酸的选择，可以预期用起始菌株DNA所得到的PCR产物比用截短基因所得到的PCR产物更大。阳性克隆命名为ATCC13032 Psod lysCfbrδ甘油激酶。
为了研究δ甘油激酶构建体对赖氨酸生产的作用，在30℃下将菌株ATCC13032、ATCC13032 lysCfbr和ATCC13032 lysCfbrδ甘油激酶于CM平板(10.0g/l D-葡萄糖、2.5g/l NaCl、2.0g/l尿素、10.0g/l细菌用胰蛋白胨(Difco)、5.0g/l酵母提取物(Difco)、5.0g/l牛肉膏(Difco)、22.0g/l琼脂(Difco)，经高压灭菌(121℃下20分钟))上培养2天。随后，将细胞从平板上刮下并悬浮于盐水中。对于主要培养物，将10ml培养基I及0.5g经高压灭菌的CaCO3(Riedel de Haen)置于100ml Erlenmeyer烧瓶中，用细胞悬浮液接种直至OD600为1.5，在Infors AJ118型摇床(公司：Infors，Bottmingen，瑞士)上于220转/分培养39小时。然后确定分泌至培养基中的赖氨酸浓度。
培养基I：
40g/l       蔗糖
60g/l       糖蜜(以100％糖含量计算)
10g/l         (NH4)2SO4
0.4g/l        MgSO4·7H2O
0.6g/l        KH2PO4
0.3mg/l       硫胺·HCl
1mg/l         生物素(来自1mg/ml储存溶液，该储存溶液已通过过滤除菌并用NH4OH调整至pH8.0)
2mg/l         FeSO4
2mg/l         MnSO4
用NH4OH调至pH 7.8，高压灭菌(121℃，20分钟)。
此外，加入维生素B12(羟钴胺素，Sigma Chemicals)储存溶液(200μg/ml，通过过滤除菌)直至维生素B12终浓度为100μg/l。
在Agilent 1100系列LC系统HPLC上通过Agilent高压液相层析测定氨基酸浓度。用邻苯二甲醛进行柱前衍生化作用允许对所形成的氨基酸进行定量，并且在Hypersil AA柱(Agilent)上将氨基酸混合物分离。
而且，利用酶学检验法确定所述副产品甘油和二羟丙酮的浓度。
等效物
本领域的技术人员应该认识到或者能够仅利用常规实验确定文中所述的本发明特定实施方案的许多等效物。以下权利要求旨在包括此类等效物。
序列表
<110>巴斯福股份公司(BASF AKTIENGESELLSCHAFT)
<120>通过发酵制备精细化学品的方法
<130>BGI-159PC2
<150>PCT/IB2003/006464
<151>2003-12-18
<160>15
<170>用于Windows的FastSEQ版本4.0
<210>1
<211>1650
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebact eriumglutamicum)
<220>
<221>CDS
<222>(101)...(1627)
<400>1
accaacgacg acgccggtgt agcagatgta ttggagtggt ggttctaata ggtggtgtta 60
aaacactgct tagtggccca atacgtgcaa aaataaggcc atg aga atc tca aag   115
                                            Met Arg Ile Ser Lys
                                             1               5
gcc aat gcg tat gtt gca gcg att gac caa ggc acc act tcc act cgg   163
Ala Asn Ala Tyr Val Ala Ala Ile Asp Gln Gly Thr Thr Ser Thr Arg
                 10                  15                  20
tgc atc ttc att gat gcc caa gga aaa gtg gtg tct tct gct tcc aag   211
Cys Ile Phe Ile Asp Ala Gln Gly Lys Val Val Ser Ser Ala Ser Lys
             25                  30                  35
gag cac cgc caa atc ttc cca caa cag ggc tgg gta gag cac gat cct   259
Glu His Arg Gln Ile Phe Pro Gln Gln Gly Trp Val Glu His Asp Pro
         40                  45                  50
gaa gaa att tgg gac aac att cga tct gtc gtc agc cag gcg atg gtc   307
Glu Glu Ile Trp Asp Asn Ile Arg Ser Val Val Ser Gln Ala Met Val
     55                  60                  65
tcc att gac atc acc cca cac gag gtt gca tcg ctg gga gtc acc aac   355
Ser Ile Asp Ile Thr Pro His Glu Val Ala Ser Leu Gly Val Thr Asn
 70                  75                  80                  85
cag cgc gaa acc acc gtg gtg tgg gac aag cac acc ggc gaa cct gtc   403
Gln Arg Glu Thr Thr Val Val Trp Asp Lys His Thr Gly Glu Pro Val
                 90                  95                 100
tac aac gca atc gtg tgg caa gac acc cgc acc tct gac att tgc cta   451
Tyr Asn Ala Ile Val Trp Gln Asp Thr Arg Thr Ser Asp Ile Cys Leu
            105                 110                 115
gag atc gcg ggc gaa gaa ggc cag gaa aag tgg ctt gac cgc acc ggc   499
Glu Ile Ala Gly Glu Glu Gly Gln Glu Lys Trp Leu Asp Arg Thr Gly
        120                 125                 130
ctg ctg atc aac tcc tac cca tcg ggg ccc aaa atc aag tgg att ctc   547
Leu Leu Ile Asn Ser Tyr Pro Ser Gly Pro Lys Ile Lys Trp Ile Leu
    135                 140                 145
gac aac gtt gag gga gct cgc gaa cgc gcc gaa aag ggc gac ctt ttg   595
Asp Asn Val Glu Gly Ala Arg Glu Arg Ala Glu Lys Gly Asp Leu Leu
150                 155                 160                 165
ttt ggc acc atg gat acc tgg gtg ctg tgg aac ctg acc ggc ggt gtc   643
Phe Gly Thr Met Asp Thr Trp Val Leu Trp Asn Leu Thr Gly Gly Val
                170                 175                 180
cgc ggc gac gac ggt gat gat gcc atc cac gtc acc gat gtc acc aac   691
Arg Gly Asp Asp Gly Asp Asp Ala Ile His Val Thr Asp Val Thr Asn
            185                 190                 195
gca tcc cgc aca cta ttg atg gat ctc cgc acg caa cag tgg gat cca   739
Ala Ser Arg Thr Leu Leu Met Asp Leu Arg Thr Gln Gln Trp Asp Pro
        200                 205                 210
gaa cta tgc gaa gcc cta gac att ccg atg tcc atg ctc cct gag att   787
Glu Leu Cys Glu Ala Leu Asp Ile Pro Met Ser Met Leu Pro Glu Ile
    215                 220                 225
cgt ccc tcc gtc gga gaa ttc cgc tcc gtg cgc cac cgc gga acc cta   835
Arg Pro Ser Val Gly Glu Phe Arg Ser Val Arg His Arg Gly Thr Leu
230                 235                 240                 245
gcc gac gtc ccg att act ggc gtg ctc ggc gac cag caa gcg gcc ctt   883
Ala Asp Val Pro Ile Thr Gly Val Leu Gly Asp Gln Gln Ala Ala Leu
                250                 255                 260
ttt ggt cag ggc gga ttc cac gaa ggt gct gct aaa aat acc tac ggc   931
Phe Gly Gln Gly Gly Phe His Glu Gly Ala Ala Lys Asn Thr Tyr Gly
            265                 270                 275
acc ggc ctc ttc ctg ctg atg aac acc ggc acc tcg ttg aag att tcc   979
Thr Gly Leu Phe Leu Leu Met Asn Thr Gly Thr Ser Leu Lys Ile Ser
        280                 285                 290
gag cac ggc ctg ctg tcc acc atc gcc tat caa cgg gaa gga tcc gct   1027
Glu His Gly Leu Leu Ser Thr Ile Ala Tyr Gln Arg Glu Gly Ser Ala
    295                 300                 305
ccg gtc tac gcg ctg gaa ggt tcc gta tcc atg ggc ggt tcc ttg gtg   1075
Pro Val Tyr Ala Leu Glu Gly Ser Val Ser Met Gly Gly Ser Leu Val
310                 315                 320                 325
cag tgg ctg cgc gac aac cta cag cta atc ccc aac gca cca gcg att   1123
Gln Trp Leu Arg Asp Asn Leu Gln Leu Ile Pro Asn Ala Pro Ala Ile
                330                 335                 340
gaa aac ctc gcc cga gaa gtc gaa gac aac ggt ggc gtt cat gtt gtc   1171
Glu Asn Leu Ala Arg Glu Val Glu Asp Asn Gly Gly Val His Val Val
            345                 350                 355
cca gca ttc acc gga ctg ttc gca cca cgt tgg cgc ccc gat gct cgt   1219
Pro Ala Phe Thr Gly Leu Phe Ala Pro Arg Trp Arg Pro Asp Ala Arg
        360                 365                 370
ggc gtc att aca ggc ctc acc cgt ttt gcc aac cgc aaa cac atc gcc   1267
Gly Val Ile Thr Gly Leu Thr Arg Phe Ala Asn Arg Lys His Ile Ala
    375                 380                 385
cgc gca gtc ctt gaa gcc aac gcc ttc caa acc cgc gaa gtt gtg gac   1315
Arg Ala Val Leu Glu Ala Asn Ala Phe Gln Thr Arg Glu Val Val Asp
390                 395                 400                 405
gcc atg gcc aaa gac gca ggc aaa gcc ctc gaa tcc ctc cgc gtc gac   1363
Ala Met Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ala Leu Glu Ser Leu Arg Val Asp
                410                 415                 420
ggt gcg atg gtg gaa aat gac ctc ctc atg caa atg caa gcc gac ttc   1411
Gly Ala Met Val Glu Asn Asp Leu Leu Met Gln Met Gln Ala Asp Phe
            425                 430                 435
ctc ggc atc gac gtc caa cgt ctc gag gac gta gaa acc acc gcc gtc   1459
Leu Gly Ile Asp Val Gln Arg Leu Glu Asp Val Glu Thr Thr Ala Val
        440                 445                 450
ggc gtc gca ttc gct gca ggt ctc ggc tct gga ttc ttc aaa aca act   1507
Gly Val Ala Phe Ala Ala Gly Leu Gly Set Gly Phe Phe Lys Thr Thr
    455                 460                 465
gac gag atc gaa aaa ctt att gca gtg aag aaa gtc tgg aac cct gac   1555
Asp Glu Ile Glu Lys Leu Ile Ala Val Lys Lys Val Trp Asn Pro Asp
470                 475                 480                 485
atg agc gaa gaa gag cgc gaa cgt cgc tat gcc gaa tgg aat agg gca   1603
Met Ser Glu Glu Glu Arg Glu Arg Arg Tyr Ala Glu Trp Asn Arg Ala
                490                 495                 500
gtg gag cat tct tat gac cag gcc tagctgattt gggtcggcct tta         1650
Val Glu His Set Tyr Asp Gln Ala
            505
<210>2
<211>509
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌
<400>2
Met Arg Ile Ser Lys Ala Asn Ala Tyr Val Ala Ala Ile Asp Gln Gly
 1               5                  10                  15
Thr Thr Ser Thr Arg Cys Ile Phe Ile Asp Ala Gln Gly Lys Val Val
            20                  25                  30
Ser Ser Ala Ser Lys Glu His Arg Gln Ile Phe Pro Gln Gln Gly Trp
        35                  40                  45
Val Glu His Asp Pro Glu Glu Ile Trp Asp Asn Ile Arg Ser Val Val
    50                  55                  60
Ser Gln Ala Met Val Ser Ile Asp Ile Thr Pro His Glu Val Ala Ser
65                  70                  75                  80
Leu Gly Val Thr Asn Gln Arg Glu Thr Thr Val Val Trp Asp Lys His
                85                  90                  95
Thr Gly Glu Pro Val Tyr Asn Ala Ile Val Trp Gln Asp Thr Arg Thr
            100                 105                 110
Ser Asp Ile Cys Leu Glu Ile Ala Gly Glu Glu Gly Gln Glu Lys Trp
        115                 120                 125
Leu Asp Arg Thr Gly Leu Leu Ile Asn Ser Tyr Pro Ser Gly Pro Lys
    130                 135                 140
Ile Lys Trp Ile Leu Asp Asn Val Glu Gly Ala Arg Glu Arg Ala Glu
145                 150                 155                 160
Lys Gly Asp Leu Leu Phe Gly Thr Met Asp Thr Trp Val Leu Trp Asn
                165                 170                 175
Leu Thr Gly Gly Val Arg Gly Asp Asp Gly Asp Asp Ala Ile His Val
            180                 185                 190
Thr Asp Val Thr Asn Ala Ser Arg Thr Leu Leu Met Asp Leu Arg Thr
        195                 200                 205
Gln Gln Trp Asp Pro Glu Leu Cys Glu Ala Leu Asp Ile Pro Met Ser
    210                 215                 220
Met Leu Pro Glu Ile Arg Pro Ser Val Gly Glu Phe Arg Ser Val Arg
225                 230                 235                 240
His Arg Gly Thr Leu Ala Asp Val Pro Ile Thr Gly Val Leu Gly Asp
                245                 250                 255
Gln Gln Ala Ala Leu Phe Gly Gln Gly Gly Phe His Glu Gly Ala Ala
            260                 265                 270
Lys Asn Thr Tyr Gly Thr Gly Leu Phe Leu Leu Met Asn Thr Gly Thr
        275                 280                 285
Ser Leu Lys Ile Ser Glu His Gly Leu Leu Ser Thr Ile Ala Tyr Gln
    290                 295                 300
Arg Glu Gly Ser Ala Pro Val Tyr Ala Leu Glu Gly Ser Val Ser Met
305                 310                 315                 320
Gly Gly Ser Leu Val Gln Trp Leu Arg Asp Asn Leu Gln Leu Ile Pro
                325                 330                 335
Asn Ala Pro Ala Ile Glu Asn Leu Ala Arg Glu Val Glu Asp Asn Gly
            340                 345                 350
Gly Val His Val Val Pro Ala Phe Thr Gly Leu Phe Ala Pro Arg Trp
        355                 360                 365
Arg Pro Asp Ala Arg Gly Val Ile Thr Gly Leu Thr Arg Phe Ala Asn
    370                 375                 380
Arg Lys His Ile Ala Arg Ala Val Leu Glu Ala Asn Ala Phe Gln Thr
385                 390                 395                 400
Arg Glu Val Val Asp Ala Met Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ala Leu Glu
                405                 410                 415
Ser Leu Arg Val Asp Gly Ala Met Val Glu Asn Asp Leu Leu Met Gln
            420                 425                 430
Met Gln Ala Asp Phe Leu Gly Ile Asp Val Gln Arg Leu Glu Asp Val
        435                 440                 445
Glu Thr Thr Ala Val Gly Val Ala Phe Ala Ala Gly Leu Gly Ser Gly
    450                 455                 460
Phe Phe Lys Thr Thr Asp Glu Ile Glu Lys Leu Ile Ala Val Lys Lys
465                 470                 475                 480
Val Trp Asn Pro Asp Met Ser Glu Glu Glu Arg Glu Arg Arg Tyr Ala
                485                 490                 495
Glu Trp Asn Arg Ala Val Glu His Ser Tyr Asp Gln Ala
            500                 505
<210>3
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>3
gagagagaga cgcgtcccag tggctgagac gcatc                 35
<210>4
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>4
ctctctctgt cgacgaattc aatcttacgg cctg                  34
<210>5
<211>4323
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<400>5
tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtacca cgcgtcatat gactagttcg gacctaggga 60
tatcgtcgac atcgatgctc ttctgcgtta attaacaatt gggatcctct agacccggga 120
tttaaatcgc tagcgggctg ctaaaggaag cggaacacgt agaaagccag tccgcagaaa 180
cggtgctgac cccggatgaa tgtcagctac tgggctatct ggacaaggga aaacgcaagc 240
gcaaagagaa agcaggtagc ttgcagtggg cttacatggc gatagctaga ctgggcggtt 300
ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag 360
ccctgcaaag taaactggat ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg caggggatca 420
agatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac 480
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gtagcttgca gtgggcttac atggcgatag ctagactggg cggttttatg gacagcaagc 1380
gaaccggaat tgccagctgg ggcgccctct ggtaaggttg ggaagccctg caaagtaaac 1440
tggatggctt tcttgccgcc aaggatctga tggcgcaggg gatcaagatc tgatcaagag 1500
acaggatgag gatcgtttcg catgattgaa caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc 1560
gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat 1620
gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg 1680
tccggtgccc tgaatgaact ccaagacgag gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg 1740
ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta 1800
ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta 1860
tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac ctgcccattc 1920
gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc 1980
gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg 2040
ctcaaggcgc ggatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga tgcctgcttg 2100
ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt 2160
gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga agagcttggc 2220
ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc 2280
atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgagcgg gactctgggg ttcgctagag 2340
gatcgatcct ttttaaccca tcacatatac ctgccgttca ctattattta gtgaaatgag 2400
atattatgat attttctgaa ttgtgattaa aaaggcaact ttatgcccat gcaacagaaa 2460
ctataaaaaa tacagagaat gaaaagaaac agatagattt tttagttctt taggcccgta 2520
gtctgcaaat ccttttatga ttttctatca aacaaaagag gaaaatagac cagttgcaat 2580
ccaaacgaga gtctaataga atgaggtcga aaagtaaatc gcgcgggttt gttactgata 2640
aagcaggcaa gacctaaaat gtgtaaaggg caaagtgtat actttggcgt caccccttac 2700
atattttagg tcttttttta ttgtgcgtaa ctaacttgcc atcttcaaac aggagggctg 2760
gaagaagcag accgctaaca cagtacataa aaaaggagac atgaacgatg aacatcaaaa 2820
agtttgcaaa acaagcaaca gtattaacct ttactaccgc actgctggca ggaggcgcaa 2880
ctcaagcgtt tgcgaaagaa acgaaccaaa agccatataa ggaaacatac ggcatttccc 2940
atattacacg ccatgatatg ctgcaaatcc ctgaacagca aaaaaatgaa aaatatcaag 3000
tttctgaatt tgattcgtcc acaattaaaa atatctcttc tgcaaaaggc ctggacgttt 3060
gggacagctg gccattacaa aacgctgacg gcactgtcgc aaactatcac ggctaccaca 3120
tcgtctttgc attagccgga gatcctaaaa atgcggatga cacatcgatt tacatgttct 3180
atcaaaaagt cggcgaaact tctattgaca gctggaaaaa cgctggccgc gtctttaaag 3240
acagcgacaa attcgatgca aatgattcta tcctaaaaga ccaaacacaa gaatggtcag 3300
gttcagccac atttacatct gacggaaaaa tccgtttatt ctacactgat ttctccggta 3360
aacattacgg caaacaaaca ctgacaactg cacaagttaa cgtatcagca tcagacagct 3420
ctttgaacat caacggtgta gaggattata aatcaatctt tgacggtgac ggaaaaacgt 3480
atcaaaatgt acagcagttc atcgatgaag gcaactacag ctcaggcgac aaccatacgc 3540
tgagagatcc tcactacgta gaagataaag gccacaaata cttagtattt gaagcaaaca 3600
ctggaactga agatggctac caaggcgaag aatctttatt taacaaagca tactatggca 3660
aaagcacatc attcttccgt caagaaagtc aaaaacttct gcaaagcgat aaaaaacgca 3720
cggctgagtt agcaaacggc gctctcggta tgattgagct aaacgatgat tacacactga 3780
aaaaagtgat gaaaccgctg attgcatcta acacagtaac agatgaaatt gaacgcgcga 3840
acgtctttaa aatgaacggc aaatggtacc tgttcactga ctcccgcgga tcaaaaatga 3900
cgattgacgg cattacgtct aacgatattt acatgcttgg ttatgtttct aattctttaa 3960
ctggcccata caagccgctg aacaaaactg gccttgtgtt aaaaatggat cttgatccta 4020
acgatgtaac ctttacttac tcacacttcg ctgtacctca agcgaaagga aacaatgtcg 4080
tgattacaag ctatatgaca aacagaggat tctacgcaga caaacaatca acgtttgcgc 4140
cgagcttcct gctgaacatc aaaggcaaga aaacatctgt tgtcaaagac agcatccttg 4200
aacaaggaca attaacagtt aacaaataaa aacgcaaaag aaaatgccga tgggtaccga 4260
gcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg 4320
ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga cgccctcgcg gacgtgctca 4380
tagtccacga cgcccgtgat tttgtagccc tggccgacgg ccagcaggta ggccgacagg 4440
ctcatgccgg ccgccgccgc cttttcctca atcgctcttc gttcgtctgg aaggcagtac 4500
accttgatag gtgggctgcc cttcctggtt ggcttggttt catcagccat ccgcttgccc 4560
tcatctgtta cgccggcggt agccggccag cctcgcagag caggattccc gttgagcacc 4620
gccaggtgcg aataagggac agtgaagaag gaacacccgc tcgcgggtgg gcctacttca 4680
cctatcctgc ccggctgacg ccgttggata caccaaggaa agtctacacg aaccctttgg 4740
caaaatcctg tatatcgtgc gaaaaaggat ggatataccg aaaaaatcgc tataatgacc 4800
ccgaagcagg gttatgcagc ggaaaagcgc tgcttccctg ctgttttgtg gaatatctac 4860
cgactggaaa caggcaaatg caggaaatta ctgaactgag gggacaggcg agagacgatg 4920
ccaaagagct cctgaaaatc tcgataactc aaaaaatacg cccggtagtg atcttatttc 4980
attatggtga aagttggaac ctcttacgtg ccgatcaacg tctcattttc gccaaaagtt 5040
ggcccagggc ttcccggtat caacagggac accaggattt atttattctg cgaagtgatc 5100
ttccgtcaca ggtatttatt cggcgcaaag tgcgtcgggt gatgctgcca acttactgat 5160
ttagtgtatg atggtgtttt tgaggtgctc cagtggcttc tgtttctatc agctcctgaa 5220
aatctcgata actcaaaaaa tacgcccggt agtgatctta tttcattatg gtgaaagttg 5280
gaacctctta cgtgccgatc aacgtctcat tttcgccaaa agttggccca gggcttcccg 5340
gtatcaacag ggacaccagg atttatttat tctgcgaagt gatcttccgt cacaggtatt 5400
tattcggcgc aaagtgcgtc gggtgatgct gccaacttac tgatttagtg tatgatggtg 5460
tttttgaggt gctccagtgg cttctgtttc tatcagggct ggatgatcct ccagcgcggg 5520
gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 5580
aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 5640
gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 5700
acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 5760
tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag 5820
ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 5880
atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 5940
agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 6000
cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 6060
agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 6120
acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 6180
gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 6240
ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 6300
gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt 6360
gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag 6420
gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa 6480
tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat 6540
gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg 6600
ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac 6660
gccaagcttg catgcctgca                                             6680
<210>15
<211>6272
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<400>15
ggtcgactct agaacacgct tggaccagtg cttggcgctg ccactggtgg cgaaaccacc 60
gtgaagtaca ccagcgacca gaactctgag gttactttcg tgccgtttga aaatggcatc 120
atggtgtctt cccctgaggc tggaactcac ggcctgtggg gcgcaatcgg tgacgcgtgg 180
gctcagcagg gcgctgacct tggccctctg ggacttccaa ccagtaatga atacaccgtt 240
ggcgaacagc ttcgtgttga tttccagaat ggttacatca cttacgattc tgcgactggc 300
caggcaagca ttcagctgaa ctagtctcaa ttagagccga aaaccccgct accttccctg 360
aggaggcggg gttttctcca atcaaaagcc aattaaaggc cgacccaaat cagctaggcc 420
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gttttgaaga atccagagcc gagacctgca gcgaatgcga cgccgacggc ggtggtttct 600
acgtcctcga gggatccttc ccgttgatag gcgatggtgg acagcaggcc gtgctcggaa 660
atcttcaacg aggtgccggt gttcatcagc aggaagaggc cggtgccgta ggtattttta 720
gcagcacctt cgtggaatcc gccctgacca aaaacgctag cttcacgctg ccgcaagcac 780
tcagggcgca agggctgcta aaggaagcgg aacacgtaga aagccagtcc gcagaaacgg 840
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ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc 1200
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gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct 1500
acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa 1560
gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa 1620
ctgttcgcca ggctcaaggc gcggatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc 1680
gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt 1740
ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct 1800
gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc 1860
gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgagc gggactctgg 1920
ggttcgctag aggatcgatc ctttttaacc catcacatat acctgccgtt cactattatt 1980
tagtgaaatg agatattatg atattttctg aattgtgatt aaaaaggcaa ctttatgccc 2040
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tttaggcccg tagtctgcaa atccttttat gattttctat caaacaaaag aggaaaatag 2160
accagttgca atccaaacga gagtctaata gaatgaggtc gaaaagtaaa tcgcgcgggt 2220
ttgttactga taaagcaggc aagacctaaa atgtgtaaag ggcaaagtgt atactttggc 2280
gtcacccctt acatatttta ggtctttttt tattgtgcgt aactaacttg ccatcttcaa 2340
acaggagggc tggaagaagc agaccgctaa cacagtacat aaaaaaggag acatgaacga 2400
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caggaggcgc aactcaagcg tttgcgaaag aaacgaacca aaagccatat aaggaaacat 2520
acggcatttc ccatattaca cgccatgata tgctgcaaat ccctgaacag caaaaaaatg 2580
aaaaatatca agtttctgaa tttgattcgt ccacaattaa aaatatctct tctgcaaaag 2640
gcctggacgt ttgggacagc tggccattac aaaacgctga cggcactgtc gcaaactatc 2700
acggctacca catcgtcttt gcattagccg gagatcctaa aaatgcggat gacacatcga 2760
tttacatgtt ctatcaaaaa gtcggcgaaa cttctattga cagctggaaa aacgctggcc 2820
gcgtctttaa agacagcgac aaattcgatg caaatgattc tatcctaaaa gaccaaacac 2880
aagaatggtc aggttcagcc acatttacat ctgacggaaa aatccgttta ttctacactg 2940
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catcagacag ctctttgaac atcaacggtg tagaggatta taaatcaatc tttgacggtg 3060
acggaaaaac gtatcaaaat gtacagcagt tcatcgatga aggcaactac agctcaggcg 3120
acaaccatac gctgagagat cctcactacg tagaagataa aggccacaaa tacttagtat 3180
ttgaagcaaa cactggaact gaagatggct accaaggcga agaatcttta tttaacaaag 3240
catactatgg caaaagcaca tcattcttcc gtcaagaaag tcaaaaactt ctgcaaagcg 3300
ataaaaaacg cacggctgag ttagcaaacg gcgctctcgg tatgattgag ctaaacgatg 3360
attacacact gaaaaaagtg atgaaaccgc tgattgcatc taacacagta acagatgaaa 3420
ttgaacgcgc gaacgtcttt aaaatgaacg gcaaatggta cctgttcact gactcccgcg 3480
gatcaaaaat gacgattgac ggcattacgt ctaacgatat ttacatgctt ggttatgttt 3540
ctaattcttt aactggccca tacaagccgc tgaacaaaac tggccttgtg ttaaaaatgg 3600
atcttgatcc taacgatgta acctttactt actcacactt cgctgtacct caagcgaaag 3660
gaaacaatgt cgtgattaca agctatatga caaacagagg attctacgca gacaaacaat 3720
caacgtttgc gccgagcttc ctgctgaaca tcaaaggcaa gaaaacatct gttgtcaaag 3780
acagcatcct tgaacaagga caattaacag ttaacaaata aaaacgcaaa agaaaatgcc 3840
gatgggtacc gagcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg 3900
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cggacgtgct catagtccac gacgcccgtg attttgtagc cctggccgac ggccagcagg 4020
taggccgaca ggctcatgcc ggccgccgcc gccttttcct caatcgctct tcgttcgtct 4080
ggaaggcagt acaccttgat aggtgggctg cccttcctgg ttggcttggt ttcatcagcc 4140
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ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt 5880
tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt 5940
attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag 6000
tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg 6060
ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc 6120
aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt 6180
ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat 6240
gaccatgatt acgccaagct tgcatgcctg ca                               6272

Claims (54)

1.一种用于增加微生物中流经戊糖磷酸途径的代谢通量的方法，包括在使得流经戊糖磷酸途径的代谢通量增加的条件下培养微生物，其中所述微生物包含被去调节的基因。
2.权利要求1所述的方法，其中果糖或蔗糖用作碳源。
3.权利要求1所述的方法，其中果糖用作碳源。
4.权利要求1所述的方法，其中基因是甘油激酶。
5.权利要求4所述的方法，其中甘油激酶基因来自棒杆菌属(Corynebacterium)。
6.权利要求4所述的方法，其中甘油激酶基因是表达不足的。
7.权利要求1所述的方法，其中基因编码甘油激酶。
8.权利要求7所述的方法，其中甘油激酶具有降低的活性。
9.权利要求1所述的方法，其中微生物是革兰氏阳性微生物。
10.权利要求1所述的方法，其中微生物属于棒杆菌属。
11.权利要求10所述的方法，其中微生物是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
12.权利要求1所述的方法，其中将微生物发酵以生产精细化学品。
13.权利要求1所述的方法，其中微生物还包含一种或多种额外的去调节基因。
14.权利要求13所述的方法，其中一种或多种额外的去调节基因选自ask基因、dapA基因、asd基因、dapB基因、ddh基因、lysA基因、lysE基因、pycA基因、zwf基因、pepCL基因、gap基因、zwa1基因、tkt基因、tad基因、mqo基因、tpi基因、pgk基因和sigC基因。
15.权利要求14所述的方法，其中一种或多种额外的去调节基因是过表达的。
16.权利要求13所述的方法，其中一种或多种额外的去调节基因编码选自以下的蛋白质：反馈抵抗天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸差向异构酶、赖氨酸输出子、丙酮酸羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、RPF蛋白质前体、转酮酶、转醛酶、甲基萘醌类氧化还原酶、丙糖磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸激酶和RNA聚合酶σ因子sigC。
17.权利要求16所述的方法，其中蛋白质具有增加的活性。
18.权利要求13所述的方法，其中一种或多种额外的去调节基因选自：pepCK基因、malE基因、glgA基因、pgi基因、dead基因、menE基因、citE基因、mikE17基因、poxB基因、zwa2基因和sucC基因。
19.权利要求18所述的方法，其中一种或多种额外的去调节基因是减弱的、降低的或受抑制的。
20.权利要求13所述的方法，其中一种或多种额外的去调节基因编码选自以下的蛋白质：烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、苹果酸酶、糖原合酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、ATP依赖的RNA解旋酶、o-琥珀酰苯甲酸-CoA连接酶、柠檬酸裂合酶β链、转录调节物、丙酮酸脱氢酶、RPF蛋白质前体和琥珀酰CoA合成酶。
21.权利要求20所述的方法，其中蛋白质具有降低的活性。
22.一种用于生产精细化学品的方法，包括：
a)培养其中甘油激酶被去调节的微生物；和
b)在培养基中或微生物细胞中积累精细化学品，由此生产精细化学品。
23.一种用于生产精细化学品的方法，包括在使得精细化学品生产的条件下培养微生物，其中在所述微生物中至少一种戊糖磷酸生物合成途径基因或酶被去调节。
24.权利要求23所述的方法，其中所述生物合成基因是甘油激酶。
25.权利要求23所述的方法，其中所述生物合成酶是甘油激酶。
26.权利要求22或24所述的方法，其中甘油激酶表达是降低的。
27.权利要求22或25所述的方法，其中甘油激酶活性是降低的。
28.权利要求22所述的方法，其还包括回收精细化学品。
29.权利要求22或23所述的方法，其中一种或多种额外的基因是去调节的。
30.权利要求29所述的方法，其中一种或多种额外的去调节基因选自：ask基因、dapA基因、asd基因、dapB基因、ddh基因、lysA基因、lysE基因、pycA基因、zwf基因、pepCL基因、gap基因、zwa1基因、tkt基因、tad基因、mqo基因、tpi基因、pgk基因和sigC基因。
31.权利要求30所述的方法，其中一种或多种额外的去调节基因是过表达的。
32.权利要求29所述的方法，其中一种或多种额外的去调节基因编码选自以下的蛋白质：反馈抵抗天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、二氨基庚二酸脱氢酶、二氨基庚二酸差向异构酶、赖氨酸输出子、丙酮酸羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、RPF蛋白质前体、转酮酶、转醛酶、甲基萘醌类氧化还原酶、丙糖磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸激酶和RNA聚合酶σ因子sigC。
33.权利要求32所述的方法，其中蛋白质具有增加的活性。
34.权利要求29所述的方法，其中一种或多种额外的去调节基因选自：pepCK基因、malE基因、glgA基因、pgi基因、dead基因、menE基因、citE基因、mikE17基因、poxB基因、zwa2基因和sucC基因。
35.权利要求34所述的方法，其中一种或多种额外的去调节基因是减弱的、降低的或受抑制的。
36.权利要求29所述的方法，其中一种或多种额外的去调节基因编码选自以下的蛋白质：烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、苹果酸酶、糖原合酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、ATP依赖的RNA解旋酶、o-琥珀酰苯甲酸-CoA连接酶、柠檬酸裂合酶β链、转录调节物、丙酮酸脱氢酶、RPF蛋白质前体和琥珀酰CoA合成酶。
37.权利要求36所述的方法，其中蛋白质具有降低的活性。
38.权利要求22或23所述的方法，其中微生物是革兰氏阳性微生物。
39.权利要求22或23所述的方法，其中微生物属于棒杆菌属。
40.权利要求39所述的方法，其中微生物是谷氨酸棒杆菌。
41.权利要求22或23所述的方法，其中精细化学品是赖氨酸。
42.权利要求41所述的方法，其中赖氨酸是以至少100g/L的生产量生产的。
43.权利要求41所述的方法，其中赖氨酸是以至少150g/L的生产量生产的。
44.权利要求22或23所述的方法，其中果糖或蔗糖用作碳源。
45.权利要求22或23所述的方法，其中果糖用作碳源。
46.权利要求22或24所述的方法，其中甘油激酶包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
47.权利要求22或24所述的方法，其中甘油激酶编码包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列的多肽。
48.一种重组微生物，其具有去调节的戊糖磷酸生物合成途径。
49.一种重组微生物，其包含去调节的戊糖磷酸生物合成基因。
50.权利要求49所述的重组微生物，其中所述的去调节基因是甘油激酶。
51.权利要求50所述的重组微生物，其中甘油激酶表达是降低的。
52.权利要求50所述的重组微生物，其中所述甘油激酶基因编码具有降低活性的甘油激酶蛋白质。
53.权利要求49所述的重组微生物，其中微生物属于棒杆菌属。
54.权利要求53所述的重组微生物，其中微生物是谷氨酸棒杆菌。
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