CN108624516A - 一种提高发酵细胞中的代谢产物量及制备idms标准品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高发酵细胞中的代谢产物量及制备IDMS标准品的方法。本发明人通过在批发酵基础上在适当的时机补加底物的方式，进行多批次地、瞬间地底物补加，使得胞内代谢物产生动态响应，部分胞内代谢物浓度出现升高，在该阶段收集发酵细胞，从而高效地制备具有¹³C标记的代谢物标准品，大幅提高标准品的浓度。

Description

一种提高发酵细胞中的代谢产物量及制备IDMS标准品的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，更具体地，本发明涉及一种提高发酵细胞中的代谢产物量及制备IDMS标准品的方法。

背景技术

在微生物研究及生产领域，为高效获取的微生物代谢工程改造所需信息，需要对其代谢途径及途径酶的在体(in vivo)动力学特性有全面的了解。然而，现有技术中，如何快速准确测量微生物的胞内代谢物浓度是一个难题，这主要是因为通常情况下胞内微生物代谢物浓度较低，加之微生物提取、回收、加工等处理过程中胞内代谢物会发生损耗、稀释，进一步地加剧了该类检测的难度。

同位素稀释质谱检测法(IDMS)是通过同位素丰度的精确质谱测量和所加入稀释剂的准确称量，求得待测样品中某元素的绝对量，有效地把元素的化学分析转变为同位素测量，因此具有同位素质谱测量的高精度和化学计量的高准确度。在众多的微生物胞内代谢物检测方法之中，IDMS被认为是目前进行胞内代谢物浓度高通量检测精度最高的一种方法。

Wu等在液质联用检测基础上，通过引入同位素稀释质谱检测技术，以¹³C全标葡萄糖培养的酵母细胞抽提物为内标，大大提高了胞内代谢物浓度的检测精度。毕赤酵母由于其具有生长快，培养基成分明确简单的特点，在制备IDMS技术中已被本领域技术人员采用。

由于制作的原材料相对昂贵，制备待检测代谢物对应的¹³C标准品成为IDMS检测的关键。传统制备¹³C全标记标准品的方法是采用批培养的模式获取，但该方法所制备的胞内代谢物浓度通常较低。并且，有些代谢物的¹³C标记的对应标准品甚至无商品化产品，阻碍了这些代谢物的代谢工程研究进程。

综上可见，¹³C胞内中间代谢物标准品的制备成为应用IDMS方法进行胞内代谢物浓度检测的一个瓶颈，如何降低制备¹³C标准品的成本也成为检测者们迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高发酵细胞中的代谢产物量及制备IDMS标准品的方法。

在本发明的第一方面，提供一种制备用于同位素稀释质谱检测的具有¹³C标记的代谢物标准品的方法，所述方法包括：

(1)利用发酵培养基培养细胞，所述的发酵培养基中的碳源是¹³C标记(全标记)的碳源；

(2)当发酵培养基中¹³C标记葡萄糖基本耗尽时，分批补加¹³C标记的碳源；每次补加后，取发酵液，制备IDMS标准品。

在一个优选例中，步骤(1)中，所述的细胞是酵母细胞；较佳地为毕赤酵母细胞。

在另一优选例中，¹³C标记葡萄糖基本耗尽时，分2～10批补加¹³C标记的碳源；更佳地分3～6批(如4、5批)补加¹³C标记的碳源。

在另一优选例中，在首批补加¹³C标记的碳源前(如提前1～4小时)，还包括提高溶氧的步骤；较佳地通过提高转速来提高溶氧；较佳地将转速提高20～40％。

在另一优选例中，首批次补加¹³C标记的碳源后溶氧下降，待溶氧回升时，进行后一批次补加¹³C标记的碳源。

在另一优选例中，每批补加¹³C标记的碳源的量根据菌体量确定；较佳地为0.8～5g/L；较佳地1.2～3g/L；更佳地1.5～2g/L，以碳源在发酵液中的终浓度计。

在另一优选例中，在每批补加¹³C标记的碳源后3～10分钟，较佳地4～7分钟(如5，6分钟)，取发酵液，制备IDMS标准品。

在另一优选例中，步骤(1)中，所述的碳源是葡萄糖。

在另一优选例中，所述的发酵培养基包括：碳源，钾离子，钙离子，镁离子，微量元素和磷酸根。

在另一优选例中，所述的发酵培养基包括：

在另一优选例中，所述的发酵培养基还包括消泡剂；较佳地消泡剂为有机硅类消泡剂；更佳地其用量为0.5～3mL/L。

在另一优选例中，所述的发酵培养基包括：

在另一优选例中，步骤(2)中，制备IDMS标准品的方法包括：

(i)取发酵液至冷甲醇溶液中，均匀分装样液，离心并去除上清；较佳地冷甲醇溶液的浓度为60±5％；较佳地冷甲醇溶液的温度为-40±2℃；取发酵液至冷甲醇溶液中时，较佳地为快速取发酵液；

(ii)在(i)处理后的样品中加入乙醇溶液，混匀后升温至95±1℃处理2～10分钟，冷却，离心获取上清；乙醇溶液较佳地为75±5％，更佳地为75±1℃；在样品中加入乙醇溶液时，较佳地为快速加入；

(iii)对(ii)获得的样品进行浓度调节、定容、分装，获得所述的具有¹³C标记的代谢物标准品。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、利用毕赤酵母发酵，进行¹³C标记的代谢物标准品制备过程的示意图。

图2、发酵过程中，DO随时间变化曲线。其中，1代表第一次底物补加，2代表第二次底物补加，3代表第三次底物补加，4代表第四次底物补加，5代表搅拌转速提高。

图3、发酵过程中，未底物补加组与底物补加组实验CER和OUR变化曲线。

图4、底物补加组与为底物补加组的细胞的胞内有机酸含量对比。其中，Pyr为丙酮酸，Fum为延胡索酸，Suc为琥珀酸，Oxa为草酸，Mal为苹果酸，αKG为α-酮戊二酸，Cit为柠檬酸。

图5、底物补加组与未底物补加组的细胞的胞内磷酸糖含量对比。其中，G3P为甘油-3-磷酸，3PG为3-磷酸甘油酸，2PG为2-磷酸甘油酸，E4P为赤藓糖-4-磷酸，R5P为核酮糖-5-磷酸，RL5P为核酮糖-5-磷酸，6PG为6-磷酸葡萄糖酸，FBP为1,6-二磷酸果糖。

图6、底物补加组与未底物补加组的细胞的胞内氨基酸Ala，Asp，Ser，Thr，His，Met，Pro，Val，Gly对比。

图7、底物补加组与未底物补加组的细胞的胞内核苷酸类物质AMP，ADP，ATP，NAD，NADH，NADP，NADPH对比。

具体实施方式

传统的用于IDMS的¹³C胞内中间代谢物标准品的制备方法是采用批发酵的模式，在发酵结束后收集菌体进行处理，本发明人发现，这样收集获得的菌体往往处于饥饿状态，胞内磷酸糖类物质被消耗，导致浓度过低，其他代谢产物的浓度也偏低。经过深入的研究，本发明人通过在批发酵基础上在适当的时机补加底物(¹³C标记的碳源)的方式，进行瞬间地、多批次地底物补加，相应的胞内代谢物产生动态响应，部分胞内代谢物浓度出现短暂的升高，在该阶段收集发酵细胞，可高效地制备具有¹³C标记的代谢物标准品。

如本发明所用，所述的“中间代谢产物”包括：胞内有机酸、胞内磷酸糖、胞内氨基酸、胞内核苷酸等。

如本发明所用，所述的“胞内有机酸”包括但不限于：丙酮酸，延胡索酸，琥珀酸，草酸，苹果酸，α-酮戊二酸，柠檬酸。

如本发明所用，所述的“胞内磷酸糖”包括但不限于：甘油-3-磷酸，3-磷酸甘油酸，2-磷酸甘油酸，赤藓糖-4-磷酸，核糖-5-磷酸，核酮糖-5-磷酸，6-磷酸葡萄糖酸，1,6-二磷酸果糖、磷酸烯醇式丙酮酸、葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、景天庚酮糖-7-磷酸。

如本发明所用，所述的“胞内氨基酸”包括但不限于：Ala，Asp，Ser，Thr，His，Met，Pro，Val，Gly等。

如本发明所用，所述的“胞内核苷酸”包括但不限于：AMP，ADP，ATP，NAD，NADH，NADP，NADPH。

本发明提供了一种制备用于同位素稀释质谱检测的具有¹³C标记的代谢物标准品的方法，所述方法包括：(1)利用发酵培养基培养细胞，所述的发酵培养基中的碳源是¹³C标记(全标记)的碳源；(2)当发酵培养基中¹³C标记葡萄糖基本耗尽时，分批补加¹³C标记的碳源；每次补加后，取发酵液，制备IDMS标准品。

作为本发明的优选方式，用于制备标准品的细胞为酵母细胞；最为优选的是毕赤酵母细胞。

尽管也可以对培养基中其他物质进行标记，例如标记氨基酸，标记进气CO2，或其他碳源。但从效果上来说葡萄糖效果最佳，且相对而言成本低。

由于¹³C标记的碳源价格较为昂贵，因此希望其均被菌体吸收并转化为胞内代谢物。为了尽可能地提高¹³C胞内中间代谢物标准品的制备效率，本发明人优化了补加底物¹³C标记的碳源的时机。本发明人经过比较后发现，¹³C标记葡萄糖基本耗尽时，分2～10批补加¹³C标记的碳源；更佳地分3～6批补加¹³C标记的碳源；后续获得的胞内代谢产物的量可以显著地提升，从而有效地降低¹³C标记的用量，降低了成本。

传统方法在¹³C标记葡萄糖基本耗尽时就收获菌体，而这时胞内的关键代谢物的浓度却相对较低，本发明的方法则大大提高了胞内代谢物的浓度。

作为本发明的优选方式，在首次补加¹³C标记的碳源前，如提前1～4小时，还包括提高溶氧的步骤；较佳地通过提高转速来提高溶氧；较佳地将转速提高20～40％。本发明人观察到(图2)，在该次提高溶氧后，溶氧瞬间提升后将持续下降，将之提高转速前的数值时，进行首次补加¹³C标记的碳源是较为理想的。

作为本发明的优选方式，首批次补加¹³C标记的碳源后溶氧下降，待溶氧回升时，进行后一批次补加¹³C标记的碳源。

作为本发明的优选方式，每批补加¹³C标记的碳源的量根据菌体量和/或初始时加入的葡萄糖的量；在本发明的优选实施例中，补加¹³C标记的碳源的量为1～5g/L；较佳地1.2～3g/L；更佳地1.5～2g/L。本发明人发现，这种瞬间的、合适浓度的¹³C标记的碳源的补加，可以极为有效地提高发酵细胞中的中间代谢产物的量。

为了尽可能地提高¹³C胞内中间代谢物标准品的制备效率，获取发酵液样本的时间的选择也较为重要。本发明人在比较后，优选地在每批补加¹³C标记的碳源后3～10分钟，较佳地4～7分钟，如5，6分钟，取发酵液，制备IDMS标准品，这一时机胞内中间代谢物含量高。

用于进行细胞发酵培养的发酵液可以是本领域已知配方的发酵液。作为本发明的优选方式，所述的发酵培养基包括：碳源，钾离子，钙离子，镁离子，微量元素和磷酸根。更为优选地，对于易于产生泡沫的发酵过程，所述的发酵培养基中还包括消泡剂，以有效地排除发酵过程的泡沫，提高发酵的效率。

在获得了如上处理的发酵液并在适当的时间取液后，可以采用本领域已知的制备IDMS标准品的方法进行标准品的制备。作为本发明的优选方式，制备IDMS标准品的方法包括：(i)取发酵液至冷甲醇溶液中，均匀分装样液，离心并去除上清；(ii)在(i)处理后的样品中加入乙醇溶液，混匀后升温至95±1℃处理8～10分钟，冷却，离心获取上清；(iii)对(ii)获得的样品进行浓度调节、定容、分装，获得具有¹³C标记的代谢物标准品。

在本发明的具体实施例中，通过以¹³C全位标记葡萄糖作为唯一碳源培养毕赤酵母G1HL菌种，采用¹³C全位标记葡萄糖补加刺激，在批发酵结束前，用一定浓度的底物补加，结合快速取样淬灭方法，成功制备了带¹³C标记的标准品(制备流程见图1)。经LC-MS与GC-MS结果分析，与传统制备方法相比，胞内大部分有机酸、磷酸糖、氨基酸和核苷酸类物质的浓度实现了约2-10倍的提高。因此底物补加法可以有效的提高¹³C全标葡萄糖的单位利用率，并能实现对胞内部分含量低于仪器检测限的代谢物的检测。本发明的方法极大地改善了传统培养方法引起的磷酸糖类物质和能量类物质浓度偏低的问题。

综上所述，进行底物补加制备IDMS标准品可大幅提高标准品的浓度，其快速取样点处于糖未完全耗尽时，因此胞内中心碳代谢大部分代谢物浓度均有大幅度的提高。因此，基于底物补加制备IDMS标准品能极大的改善传统批培养制备标准品浓度较低的问题，同时也能节约成本，提高标准品的利用率。底物补加法对实现胞内部分含量低于当前仪器检测限的代谢物的检测具有重要的参考意义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

I.实验材料与方法

1、培养基成分及菌种

实施例中，应用的发酵培养基的组成(g/L)如表1。

表1

*未进行底物补加实验的发酵组¹³C全标葡萄糖浓度：20g/L；

进行底物补加实验的发酵组¹³C全标葡萄糖浓度：16.5g/L。

其中，PTM1(微量元素)组成(g/L)如表2。

表2

组分	含量
		CuSO4·5HO	6.0g/L
KI	0.08g/L
		CoCl2	0.5g/L
NaMoO4·2H2O	0.2g/L
		MnSO4·H2O	3.0g/L
H3BO3	0.02g/L
		ZnCl2	20.0g/L
FeSO4·7H2O	65.0g/L
		Biotin	0.2g/L
浓H2SO4(浓度为98％)	5mL/L

菌种：毕赤酵母G/DSEL，参见“丁璐妹等，内源信号肽DSE4介导头孢菌素C酰化酶在毕赤酵母中的分泌表达，华东理工大学学报，2015，41(4):449-454”。

2、质谱分析方法

(1)LC-MS分析

测定胞内有机酸，磷酸糖和核苷酸类采用LC-MS/MS(a Thermal Ultimate 3000UPLC system coupled to a Thermal TSQ QUANTUM ULTRA mass spectrum system)分析。

所用数据处理软件为Xcalibur(Thermo Scientific)。质谱采用负离子SRM(selected reaction monitoring)模式。

用直接进样法获取待测物的离子对和最优质谱条件，其中毛细管温度为270℃,雾化温度200℃，鞘气压力15Arb，辅助气压力10Arb，喷雾电压3000V。色谱部分：色谱柱ACQUITY UPLC BEH C₁₈,1.7μm,2.1×150mm，柱温25℃，流动相A为5％乙腈加5mM DBAA(二丁胺乙酸)，流动相B为84％乙腈加5mM DBAA。洗脱梯度如下：0min时B的比例为0％；0～20min时，流动相B的比例从0％上升到20％维持2min后再降到0％并维持10min。流动相流速为0.2mL/min。

(2)GC-MS分析

胞内氨基酸的测定采用GC-MS，该分析方法具体如下：取100μL处理好的样品到气相小瓶中并加入30μL 100mg/mL NaCl放入-80℃冰箱30min后冷冻抽干过夜。加入100μL乙腈和100μL衍生剂N-(特丁基二甲基硅烷基)-N-甲基三氟乙酰胺+1％叔丁基二甲基氯硅烷(MTBSTFA:TBDMSCL＝99:1)70℃维持60min。冷却至室温后，离心取上清进样。

使用的仪器是7890A GC(Agilent,Santa Clara,CA,USA)串联5975CMSD单级质谱(Agilent,Santa Clara,CA,USA)。

测定条件如下：进样量1μL；使用的柱子：HP-5MS 30m×0.25mm×0.25μm(5％Phenyl Methyl Siloxane)非极性弹性石英毛细管柱，升温程序：100℃维持1min后以10℃/min的速度升温到300℃并维持10min。载气高纯氦流速1mL/min。传输线温度250℃，离子源温度230℃，四极杆温度150℃。EI源电压70eV。为了准确定量采取SIM(slectedionmonitoring)模式，质谱扫描范围为1～1050amu。

II.实施例

实施例1、发酵及底物补加

发酵罐使用上海国强生化工程装备有限公司出品的1L罐，发酵液的装液量为0.6L，接种量为1％，预先在220rpm转速，30℃下将种子培养24h，后取6mL离心去除上清，加入6mL生理盐水复溶，接入发酵罐，采用OD₆₀₀测菌浓。整个过程使用NaOH溶液去除通气中CO₂，通气量为0.6L/min(1vvm)，搅拌转速：进行底物补加实验的发酵组初始约300rpm，后续400rpm；未进行底物补加实验的发酵组为400rpm，控制发酵温度为30℃，采用氨水控制pH在5.0，罐压维持在0.05MPa。对于整个发酵过程，使用Biostar软件进行在线监控，使用过程质谱仪(MAX300-LG，Extrel)测定尾气中O₂和CO₂的浓度。

在发酵过程中，采用底物即¹³C全标记葡萄糖补加。并且，为了检测不同方式补加的效果差异，本发明人分别验证了单次补加及多次分批补加的实验结果。具体设置条件如表3。同时设置未进行底物补加实验组。

表3

实施例2、发酵过程宏观数据分析

以实施例1的方法进行发酵，并对未进行底物补加实验组以及底物补加试验组进行数据比较分析。结果如表4。

表4

结果显示，由于培养体积较大，单次取样样品后处理时间较长，为尽量减少样品与冷甲醇的接触时间，防止胞内代谢物的大量泄露，分4次补加、单次补加¹³C全标葡萄糖浓度均为1.5g/L的方式相对而言最为合适。当溶氧DO开始回升，OUR开始下降时进行¹³C全标记葡萄糖补加，5min后开始快速取样操作，每次取样0.15L。在摄氧率(OUR)、二氧化碳释放率(CER)再次下降时，进行第二次底物补加，后续补加重复该步骤。

图2是未进行底物补加刺激实验和进行底物补加刺激实验(补加方式3)的整个发酵过程DO的变化曲线，图中1，2，3，4分别代表4次底物补加，5处表示搅拌转速提高。为避免在培养过程中出现氧限制情况，在补加底物前3小时，将搅拌转速从300rpm提至400rpm，此时DO上升结合图3，CER和OUR在此时并未出现下降，因此DO的上升与菌体的生理状态无关。搅拌转速提升使DO迅速上升后、随着菌体的消耗DO又缓慢下降。在发酵开始后约18h左右开始补加，补加后DO开始回升，发酵罐内¹³C全标记葡萄糖基本耗尽。第一次底物补加，DO快速下降，约5min后开始快速取样。待DO再次回升后进行第二次补加，依次类推，共进行四次补加。

图3是未进行底物补加刺激实验和进行底物补加刺激实验(补加方式3)的整个发酵过程CER和OUR的变化曲线。从图中可以看出两批实验平行性良好，整个培养过程约为20h，经过约10h的延滞期后，CER和OUR开始快速增加。因进行底物补加的实验初始菌浓略低于未进行底物补加的实验(未进行底物补加初糖浓度：20g/L，进行底物补加实验初糖浓度：16.5g/L)，所以CER和OUR下降的时间略早于未进行底物补加的实验。通过OD₆₀₀测出两批发酵液菌浓约为25g/L。

实施例3、IDMS标准品的获得

采用实施例1的方法进行发酵及底物补加刺激处理(补加方式3)，提取发酵液来制备IDMS标准品。制备IDMS标准品的具体方法如图1所示。

标品的量化是通过已知浓度的¹²C标准品定量未知的¹³C代谢物浓度。分别将一定量的¹²C磷酸糖类标准品、¹²C有机酸类标准品、¹²C核苷酸类标准品和¹²C氨基酸类标准品制成4种混标，¹²C标准品除氨基酸外浓度范围50-0.05μmol/L，氨基酸浓度范围200-0.1μmol/L，取一系列浓度梯度。最后将不同浓度梯度的¹²C混标标准品与¹³C胞内代谢物按一定的体积比混合，进样LCMS和GCMS检测分析，最终建立¹³C与¹²C同一代谢物质谱峰面积比与¹²C代谢物浓度的标准曲线，作为¹³C代谢物标品的定量标准。

1、快速取样

胞内代谢物浓度一般很低，而对应的酶反应速度较快，因此需对取样的细胞进行快速淬灭。快速取样淬灭方法具体如下：

快速取出150mL发酵液到750mL的-80℃的60％冷甲醇溶液中，并记录取样前后冷甲醇溶液质量。然后均匀分装至样品管，每个样品管装液量45mL，置于-20℃离心机4000rpm离心5min。

2、乙醇提取

乙醇提取的过程就是使细胞破碎释放胞内代谢物的过程。

将离心好的样品去除上清，迅速加入到30mL 75℃的75％乙醇溶液，漩涡振荡混匀，置于95℃水浴4min。后冷却，低温离心收集上清。

3、浓缩分装

将离心后收集的上清液经旋转蒸发仪浓缩至1mL后，定容至80mL，然后分装至530个1.5mL EP管中，每管装液量为150μL，置于-80℃冰箱内保存，同时取部分制备的标准品进样LC-MS/MS和GC-MS检测分析结果。

实施例4、胞内代谢物浓度分析

1、胞内有机酸

图4是测定得到的未进行底物补加和进行底物补加(以补加方式3进行补加)实验的胞内有机酸浓度对比情况。

从图4中可以看出，经过底物补加刺激后，胞内有机酸含量大幅提高，尤其是苹果酸提高约18倍，其余有机酸均有2-10倍的提高。与传统未底物补加方法相比，在糖耗尽后进行底物补加，瞬间提高的底物浓度被细胞摄取，引起胞内代谢物含量迅速增加，在糖未耗尽前快速取样淬灭，细胞胞内代谢物浓度仍维持在较高水平。而传统方法是在发酵结束糖耗尽之后进行取样，因此造成胞内代谢物浓度较低。

2、胞内磷酸糖

图5是测得的未进行底物补加和进行底物补加(以补加方式3进行补加)的胞内磷酸糖类物质浓度对比。

从图5中可以看出，其中赤藓糖-4-磷酸提高幅度最大，约10倍左右，其他的物质也有不同程度的提高。¹³C全标记葡萄糖被细胞摄取之后，首先经EMP途径和PP途径，传统方法在糖耗尽后取样制备的标准品中磷酸糖类物质优先被代谢，因此浓度较低，而在底物补加之后可使其维持在较高水平。

3、胞内氨基酸

图6为测得的未进行底物补加和进行底物补加(以补加方式3进行补加)的胞内氨基酸含量对比情况。

从图6中可以看出，除天冬氨酸与组氨酸外胞内大部分氨基酸含量在底物补加后都有大幅度提高，尤其脯氨酸和甘氨酸，均提高了约15倍。其余氨基酸含量均有2-5倍的提高。因为胞内氨基酸代谢偶联胞内中心碳代谢的部分代谢物，因此胞内磷酸糖类物质和有机酸类物质浓度的提高，引起相应氨基酸浓度的增加。

4、胞内核苷酸

图7为测得的未进行底物补加和进行底物补加(以补加方式3进行补加)之后胞内核苷酸类物质浓度的对比情况。经底物补加后，胞内ATP、ADP、NADH和NAD的含量都大大提高，但AMP的浓度相对于未补加的实验出现了下降，其具体原因尚不清楚。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种制备用于同位素稀释质谱检测的具有¹³C标记的代谢物标准品的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)利用发酵培养基培养细胞，所述的发酵培养基中的碳源是¹³C标记的碳源；

(2)当发酵培养基中¹³C标记葡萄糖基本耗尽时，分批补加¹³C标记的碳源；每次补加后，取发酵液，制备IDMS标准品。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的细胞是酵母细胞；较佳地为毕赤酵母细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，¹³C标记葡萄糖基本耗尽时，分2～10批补加¹³C标记的碳源；更佳地分3～6批补加¹³C标记的碳源。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，首批次补加¹³C标记的碳源后溶氧下降，待溶氧回升时，进行后一批次补加¹³C标记的碳源。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，每批补加¹³C标记的碳源的量根据菌体量确定；较佳地为0.8～5g/L；较佳地1.2～3g/L；更佳地1.5～2g/L。

6.如权利要求1～5任一所述的方法，其特征在于，在每批补加¹³C标记的碳源后3～10分钟，较佳地4～7分钟，取发酵液，制备IDMS标准品。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的碳源是葡萄糖。

8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基包括：碳源，钾离子，钙离子，镁离子，微量元素和磷酸根。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基包括：

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，制备IDMS标准品的方法包括：

(i)取发酵液至冷甲醇溶液中，均匀分装样液，离心并去除上清；

(ii)在(i)处理后的样品中加入乙醇溶液，混匀后升温至95±1℃处理2～10分钟，冷却，离心获取上清；

(iii)对(ii)获得的样品进行浓度调节、定容、分装，获得所述的具有¹³C标记的代谢物标准品。