CN111849796B - 稳定同位素标记的细胞内中间代谢物及其制备方法 - Google Patents
稳定同位素标记的细胞内中间代谢物及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111849796B CN111849796B CN201910345626.9A CN201910345626A CN111849796B CN 111849796 B CN111849796 B CN 111849796B CN 201910345626 A CN201910345626 A CN 201910345626A CN 111849796 B CN111849796 B CN 111849796B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- acid
- phosphate
- carbon source
- glucose
- stable isotope
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 title claims abstract description 59
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 title claims abstract description 43
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 64
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 32
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims abstract description 31
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 27
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 claims abstract description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 66
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 36
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 32
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 25
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 23
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 23
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 21
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000306 component Substances 0.000 claims description 17
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 16
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 claims description 14
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 claims description 14
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 claims description 13
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 claims description 13
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 13
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 claims description 13
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 claims description 13
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 claims description 12
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Natural products OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- XNEFHYFPRJBTJF-UHFFFAOYSA-N Dehydroshikimic acid Chemical compound OC1C=C(C(O)=O)CC(=O)C1O XNEFHYFPRJBTJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 claims description 10
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 10
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 claims description 9
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Natural products OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 claims description 9
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N shikimic acid Chemical compound O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@@H](O)[C@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-HSUXUTPPSA-N 0.000 claims description 9
- JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N shikimic acid Natural products O[C@@H]1CC(C(O)=O)=C[C@H](O)[C@@H]1O JXOHGGNKMLTUBP-JKUQZMGJSA-N 0.000 claims description 9
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 9
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims description 8
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 8
- RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone Chemical compound OCC(=O)CO RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 claims description 6
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 6
- PJWIPEXIFFQAQZ-PUFIMZNGSA-N 7-phospho-2-dehydro-3-deoxy-D-arabino-heptonic acid Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CC(=O)C(O)=O PJWIPEXIFFQAQZ-PUFIMZNGSA-N 0.000 claims description 6
- GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N D-F6P Natural products OCC(=O)C(O)C(O)C(O)COP(O)(O)=O GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N D-Glucose 6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 6
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N Glc6P Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- RNBGYGVWRKECFJ-ZXXMMSQZSA-N alpha-D-fructofuranose 1,6-bisphosphate Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@](O)(COP(O)(O)=O)O[C@@H]1COP(O)(O)=O RNBGYGVWRKECFJ-ZXXMMSQZSA-N 0.000 claims description 6
- HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N alpha-D-glucose 1-phosphate Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 6
- BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N beta-D-fructofuranose 6-phosphate Chemical compound OC[C@@]1(O)O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 6
- 229950010772 glucose-1-phosphate Drugs 0.000 claims description 6
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 claims description 6
- JDTUMPKOJBQPKX-GBNDHIKLSA-N sedoheptulose 7-phosphate Chemical compound OCC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O JDTUMPKOJBQPKX-GBNDHIKLSA-N 0.000 claims description 6
- ODBLHEXUDAPZAU-UHFFFAOYSA-N threo-D-isocitric acid Natural products OC(=O)C(O)C(C(O)=O)CC(O)=O ODBLHEXUDAPZAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- XPYBSIWDXQFNMH-UHFFFAOYSA-N D-fructose 1,6-bisphosphate Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(=O)COP(O)(O)=O XPYBSIWDXQFNMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- RNBGYGVWRKECFJ-UHFFFAOYSA-N fructose-1,6-phosphate Natural products OC1C(O)C(O)(COP(O)(O)=O)OC1COP(O)(O)=O RNBGYGVWRKECFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 5
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 5
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 5
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 5
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 4
- ODBLHEXUDAPZAU-ZAFYKAAXSA-N D-threo-isocitric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](C(O)=O)CC(O)=O ODBLHEXUDAPZAU-ZAFYKAAXSA-N 0.000 claims description 4
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 4
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 4
- ODBLHEXUDAPZAU-FONMRSAGSA-N Isocitric acid Natural products OC(=O)[C@@H](O)[C@H](C(O)=O)CC(O)=O ODBLHEXUDAPZAU-FONMRSAGSA-N 0.000 claims description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940100228 acetyl coenzyme a Drugs 0.000 claims description 4
- HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxyglutaric acid Natural products OC(=O)C(O)CCC(O)=O HWXBTNAVRSUOJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940009533 alpha-ketoglutaric acid Drugs 0.000 claims description 4
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 claims description 4
- 229940120503 dihydroxyacetone Drugs 0.000 claims description 4
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 claims description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 claims description 4
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000012533 medium component Substances 0.000 claims description 4
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 claims description 4
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 3
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 3
- GGKLADJTQDGVBP-UHFFFAOYSA-M sodium;propane-1,2,3-triol;chloride Chemical compound [Na+].[Cl-].OCC(O)CO GGKLADJTQDGVBP-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 3
- PXRKCOCTEMYUEG-UHFFFAOYSA-N 5-aminoisoindole-1,3-dione Chemical compound NC1=CC=C2C(=O)NC(=O)C2=C1 PXRKCOCTEMYUEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- KTVPXOYAKDPRHY-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose 5-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O KTVPXOYAKDPRHY-SOOFDHNKSA-N 0.000 claims 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 19
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 16
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000002705 metabolomic analysis Methods 0.000 description 10
- 230000001431 metabolomic effect Effects 0.000 description 10
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 150000001721 carbon Chemical class 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 6
- PPQRONHOSHZGFQ-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose 5-phosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PPQRONHOSHZGFQ-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone phosphate Chemical compound OCC(=O)COP(O)(O)=O GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006151 minimal media Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 3
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 230000004108 pentose phosphate pathway Effects 0.000 description 3
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 3
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 2-oxoglutarate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC(=O)C([O-])=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- SIHHLZPXQLFPMC-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol;hydrate Chemical compound O.OC.ClC(Cl)Cl SIHHLZPXQLFPMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- -1 mgSO 4 ·7H 2 O Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 2
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 229940025237 fructose 1,6-diphosphate Drugs 0.000 description 1
- 238000002013 hydrophilic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000004750 isotope dilution mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种制备稳定同位素标记的细胞内中间代谢物的方法,该方法包括:利用以[U‑13C]碳源为唯一碳源的培养基培养大肠杆菌至对数生长期,收集细胞、淬灭和提取细胞内中间代谢物。本发明填补了国内在代谢组学稳定同位素内标制备方面的空白,体现出了生物法制备的优越性,有利于完善我国定量代谢组学及其应用领域。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及微生物合成稳定同位素标记的细胞内中间代谢物的方法。
背景技术
代谢组学是通过考察生物体系受刺激或扰动前后其内源性代谢产物(相对分子质量一般小于1000Da的小分子化合物)的种类、数量及其动态变化规律,来研究生物体系代谢网络的一种技术。由于代谢组学作为系统生物学最下游的“组学”,故可体现出生物体系整体状态或功能的最终结果。近年来,随着高通量分析技术的高速发展和化学计量学算法的开发,代谢组学发展迅速,已成为生命科学的研究热点之一,并广泛应用于各个领域,如微生物代谢组学、植物代谢组学、生态和环境科学、疾病诊断、药物研发、营养学、毒理学、运动医学等。
代谢组学分为靶向代谢组学和非靶向代谢组学。靶向代谢组学主要是定量特定的代谢物。为避免前处理过程中中间代谢物的降解、基质效应和质谱检测器等因素对定量分析测试结果的影响,同位素稀释质谱法在定量代谢组学领域得到广泛应用,把质谱定量的准确度从70%提高到95%以上。该法在样品中加入已知质量和丰度的待测物质的稳定同位素核素的内标,使其与样品充分混合,通过质谱法测定混合前后同位素丰度的变化,依据同位素稀释原理定量待测物质含量。
我国在生物法同时合成代谢组学关键代谢物稳定同位素内标冻干粉及其产业化方面基本处于空白状态。现有同位素标品种类少,甚至无商品化标品,不能满足定量代谢组学的需要,需从国外进口,价格昂贵。因此,开展代谢组学同位素内标生物法制备的国产化研究,对于完善我国定量代谢组学及拓展其应用领域具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用微生物同时合成稳定同位素标记的包括细胞内关键中心碳代谢物、辅因子和氨基酸在内的细胞内中间代谢物的方法。
为了实现上述目的,本发明提供了一种制备稳定同位素标记的细胞内中间代谢物的方法,包括:利用以[U-13C]碳源为唯一碳源的培养基培养大肠杆菌至对数生长期,收集细胞、淬灭和提取细胞内中间代谢物;其中,所述提取为使用体积比为(40-60):(40-60):(15-25)的甲醇、氯仿和水提取。
在一个或多个实施方案中,所述提取为使用体积比为(40-50):(40-50):(15-20)的甲醇、氯仿和水提取;优选地,所述提取为使用体积比为4:4:1.6的甲醇、氯仿和水提取。
在一个或多个实施方案中,所述[U-13C]碳源选自[U-13C]葡萄糖、[U-13C]果糖、[U-13C]木糖、[U-13C]甘油、[U-13C]乳糖、[U-13C]半乳糖、[U-13C]蔗糖、[U-13C]麦芽糖和[U-13C]碳酸氢钠中的任意一种或任意多种。
在一个或多个实施方案中,所述方法包括通过滤膜或发酵罐将大肠杆菌培养至对数生长期。
在一个或多个实施方案中,用于培养至对数生长期的大肠杆菌来自以[U-13C]碳源为唯一碳源的培养基制备得到的大肠杆菌种子液。
在一个或多个实施方案中,所述培养基含有[U-13C]碳源、最小培养基成分和MgSO4·7H2O,任选地还含有微量元素成分和/或维生素B1。
在一个或多个实施方案中,所述培养基的组成满足以下一项或多项特征:
所述[U-13C]碳源的浓度为2-10g/L;
所述最小培养基成分包括0-73mmol/L Na+、7-324mmol/L K+、3-152mmol/L NH4 +、12-123mmol/L PO4 3-、3-38mmol/L Cl-和0.5-76mmol/L SO4 2-;优选地,所述最小培养基成分包括2-10g/L Na2HPO4、1-5g/L KH2PO4、0.2-1g/L NaCl、2-10g/L(NH4)2SO4、8-20g/L K2HPO4、0.5-5g/L K2SO4和0.5-5g/L NH4Cl中的一种或多种;
所述微量元素成分包括2×10-3-10×10-3g/L CaCl2·2H2O、1×10-2-5×10-2g/LFeCl3·6H2O、0.5×10-3-2×10-3g/L MnCl2·4H2O、1×10-3-5×10-3g/L ZnCl2·2H2O、2×10-4-10×10-4g/L CuCl2·2H2O、5×10-4-10×10-4g/L CoCl2·2H2O和2×10-4-10×10-4g/LNa2MoO4·2H2O;
所述维生素B1浓度为0.5-2mg/L;和
所述MgSO4·7H2O浓度为0.2-2mM。
在一个或多个实施方案中,所述[U-13C]碳源为[U-13C]葡萄糖和任选的[U-13C]碳酸氢钠;优选地,通过发酵罐将大肠杆菌培养至对数生长期。
在一个或多个实施方案中,所述淬灭为冷甲醇淬灭、液氮淬灭、生理盐水淬灭、甘油-氯化钠淬灭、乙醇淬灭或乙醇-水溶液淬灭。
在一个或多个实施方案中,所述提取包括使用超滤管提取;优选地,所述提取包括将使用所述提取试剂提取大肠杆菌细胞所得的上层甲醇-水相转移至超滤管中,离心收集滤液。
本发明还提供一种稳定同位素标记的细胞内中间代谢物,所述细胞内中间代谢物包含[U-13C]葡萄糖-6-磷酸、[U-13C]果糖-6-磷酸、[U-13C]葡萄糖-1-磷酸、[U-13C]果糖-1,6-二磷酸、[U-13C]二羟丙酮磷酸、[U-13C]甘油醛-3-磷酸、[U-13C]3-磷酸甘油酸、[U-13C]磷酸烯醇式丙酮酸、[U-13C]丙酮酸、[U-13C]乙酰辅酶A、[U-13C]核糖-5-磷酸、[U-13C]景天庚酮糖-7-磷酸、[U-13C]α-酮戊二酸、[U-13C]柠檬酸、[U-13C]异柠檬酸、[U-13C]延胡索酸、[U-13C]琥珀酸、[U-13C]苹果酸、[U-13C]3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸、[U-13C]脱氢莽草酸、[U-13C]脱氢奎宁酸、[U-13C]莽草酸、[U-13C]ATP、[U-13C]ADP、[U-13C]AMP、[U-13C]NADH、[U-13C]NAD+、[U-13C]NADPH、[U-13C]NADP+、[U-13C]苯丙氨酸、[U-13C]酪氨酸、[U-13C]色氨酸、[U-13C]精氨酸、[U-13C]谷氨酸、[U-13C]组氨酸、[U-13C]异亮氨酸、[U-13C]亮氨酸、[U-13C]丝氨酸、[U-13C]苏氨酸、[U-13C]天冬氨酸、[U-13C]甘氨酸和[U-13C]缬氨酸。
在一个或多个实施方案中,所述细胞内中间代谢物由本发明所述的方法制备得到。
本发明还提供一种细胞内中间代谢物稳定同位素标品,其含有稳定同位素标记的细胞内中间代谢物。
本发明还提供本发明所述的稳定同位素标记的细胞内中间代谢物在代谢组学研究中的应用,或在制备代谢组学研究用的关键代谢物稳定同位素标品中的应用。更具体而言,所述应用包括在微生物代谢组学、植物代谢组学、生态和环境科学、疾病诊断、药物研发、营养学、毒理学和运动医学等中的应用。
附图说明
图1为包括滤膜培养步骤的细胞内关键中心碳代谢物、辅因子和氨基酸的稳定同位素内标冻干粉的制备方法的流程图。
图2为包括发酵罐分批培养步骤的细胞内关键中心碳代谢物、辅因子和氨基酸的稳定同位素内标冻干粉的制备方法的流程图。
具体实施方式
为使本领域技术人员可了解本发明的特点及效果,以下谨就说明书及权利要求书中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明,否则文中使用的所有技术及科学上的字词,均为本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义,当有冲突情形时,应以本说明书的定义为准。
本文描述和公开的理论或机制,无论是对或错,均不应以任何方式限制本发明的范围,即本发明内容可以在不为任何特定的理论或机制所限制的情况下实施。
在本文中,所有以数值范围或百分比范围形式界定的特征如数值、数量、含量与浓度仅是为了简洁及方便。据此,数值范围或百分比范围的描述应视为已涵盖且具体公开所有可能的次级范围及范围内的个别数值(包括整数与分数)。
本文中,为使描述简洁,未对各个实施方案或实施例中的各个技术特征的所有可能的组合都进行描述。因此,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,各个实施方案或实施例中的各个技术特征可以进行任意的组合,所有可能的组合都应当认为是本说明书记载的范围。
本文中,术语“含有”、“包括”或“包含”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此,术语“主要由……组成”和“由……组成”包含在术语“含有”、“包括”或“包含”中。
本发明的制备稳定同位素标记的细胞内中间代谢物的方法,包括利用以[U-13C]碳源为唯一碳源的培养基培养大肠杆菌至对数生长期,收集细胞、淬灭和提取细胞内中间代谢物。
本发明中,术语“细胞内中间代谢物”是指细胞内关键中心碳代谢物、辅因子和氨基酸。其中,细胞内关键中心碳代谢物通常包括但不限于葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、葡萄糖-1-磷酸、果糖-1,6-二磷酸、二羟丙酮磷酸、甘油醛-3-磷酸、3-磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、乙酰辅酶A、核糖-5-磷酸、景天庚酮糖-7-磷酸、α-酮戊二酸、柠檬酸、异柠檬酸、延胡索酸、琥珀酸、苹果酸、3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸、脱氢莽草酸、脱氢奎宁酸和莽草酸。上述细胞内关键中心碳代谢物通常可分为糖酵解途径代谢物、磷酸戊糖途径代谢物、三羧酸循环代谢物和莽草酸途径代谢物。其中,糖酵解途径代谢物包括葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、葡萄糖-1-磷酸、果糖-1,6-二磷酸、二羟丙酮磷酸、甘油醛-3-磷酸、3-磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸和乙酰辅酶A;磷酸戊糖途径代谢物包括核糖-5-磷酸和景天庚酮糖-7-磷酸;三羧酸循环代谢物包括α-酮戊二酸、柠檬酸、异柠檬酸、延胡索酸、琥珀酸和苹果酸;莽草酸途径代谢物包括3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸、脱氢莽草酸、脱氢奎宁酸和莽草酸。辅因子通常包括但不限于ATP、ADP、AMP、NADH、NAD+、NADPH和NADP+。氨基酸通常包括但不限于苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、精氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和缬氨酸。
本文中,术语“[U-13C]底物”是指该底物中的碳原子全部为13C,例如,[U-13C]葡萄糖是指所含的碳原子全部为13C的葡萄糖,[U-13C]碳酸氢钠是指所含的碳原子全部为13C的碳酸氢钠。本领域技术人员应理解的是,对于碳源而言,所有碳原子被13C标记的效率(chemical purity)超过99%的碳源通常可认为是[U-13C]碳源。
本文中,[U-13C]碳源可以是[U-13C]葡萄糖、[U-13C]果糖、[U-13C]木糖、[U-13C]甘油、[U-13C]乳糖、[U-13C]半乳糖、[U-13C]蔗糖、[U-13C]麦芽糖和[U-13C]碳酸氢钠中的任意一种或任意多种的组合,优选为[U-13C]葡萄糖、[U-13C]果糖、[U-13C]木糖、[U-13C]甘油或其组合,优选还包括[U-13C]碳酸氢钠。
在某些实施方案中,本发明使用[U-13C]葡萄糖作为培养基的唯一碳源。适用于本发明的[U-13C]葡萄糖可以是本领域常用的[U-13C]葡萄糖,包括但不限于CambridgeIsotope Laboratories,Inc.公司的CLM-1396-0.25、CLM-1396-0.5、CLM-1396-1、CLM-1396-5、CLM-1396-10、CLM-1396-25、CLM-1396-25、CLM-1396-50、CLM-1396-2、CLM-1396-0.1MG等。在某些实施方案中,本发明还使用[U-13C]碳酸氢钠作为培养基中的碳源。
本发明中,大肠杆菌(Eescherichia coli)可以是本领域常用的大肠杆菌,优选为E.coli BW25113。
根据大肠杆菌培养方式的不同,本发明的培养基可包括种子培养基、液体培养基、平板培养基和/或发酵培养基。本发明的各类培养基通常都含有[U-13C]碳源作为其唯一碳源、最小培养基成分(如M9培养基成分)和MgSO4·7H2O;任选地,本发明的各类培养基还可含有微量元素成分和维生素B1中的一种或两种。在某些实施方案中,本发明的各类培养基由上述成分组成。当需要制备固体培养基时,可在上述培养基中添加适量(通常为1.5-2wt%)的琼脂糖。在某些实施方案中,各类培养基中的[U-13C]碳源为[U-13C]糖类或甘油和任选的[U-13C]碳酸氢钠。通常,培养基中[U-13C]碳源的浓度为2-10g/L。当含有糖类或甘油作为碳源时,其浓度通常在2-10g/L的范围内;当还含有碳酸氢钠作为碳源时,碳酸氢钠的浓度通常在0.5-2g/L的范围内,两种或多种以上碳源的总浓度通常控制在2-10g/L的范围内。例如,在某些实施方案中,培养基含有2-10g/L的[U-13C]葡萄糖,或含有2-8g/L的[U-13C]葡萄糖和0.5-2g/L的[U-13C]碳酸氢钠。
本文中,最小培养基可以是本领域常用的最小培养基,如M9培养基。最小培养基含有菌体生长所需的矿物质(阳离子和阴离子)。本领域技术人员可以理解的是,只要培养基所含的矿物质能够满足菌体生长,都认为是最小培养基,因此,最小培养基的组成不是唯一的。最小培养基通常包括0-73mmol/L Na+、7-324mmol/L K+、3-152mmol/L NH4 +、12-123mmol/L PO4 3-、3-38mmol/L Cl-和0.5-76mmol/L SO4 2-。例如,最小培养基可含有Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、(NH4)2SO4、K2HPO4、K2SO4和NH4Cl中的任意一种或多种,只要满足上述要求即可。当最小培养基含有Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、(NH4)2SO4、K2HPO4、K2SO4和NH4Cl中的任意一种或多种时,Na2HPO4的浓度可为2-10g/L,KH2PO4的浓度可为1-5g/L、NaCl的浓度可为0.2-1g/L、(NH4)2SO4的浓度可为2-10g/L、K2HPO4的浓度可为8-20g/L、K2SO4的浓度可为0.5-5g/L、NH4Cl的浓度可为0.5-5g/L。在某些实施方案中,最小培养基含有2-10g/L Na2HPO4、1-5g/LKH2PO4、0.2-1g/L NaCl和2-10g/L(NH4)2SO4,或含有1-5g/L KH2PO4、8-20g/L K2HPO4、0.5-5g/L K2SO4和0.5-5g/L NH4Cl。
通常,本发明的培养基中含有0.2-2mM的MgSO4·7H2O。
添加微量元素通常可提高菌体生长的速度。本发明中,微量元素成分是任选存在于培养基中的。微量元素成分通常包括CaCl2·2H2O、FeCl3·6H2O、MnCl2·4H2O、ZnCl2·2H2O、CuCl2·2H2O、CoCl2·2H2O和Na2MoO4·2H2O,或由CaCl2·2H2O、FeCl3·6H2O、MnCl2·4H2O、ZnCl2·2H2O、CuCl2·2H2O、CoCl2·2H2O和Na2MoO4·2H2O组成。微量元素成分中各组分的浓度不受特别限制,通常只要满足本领域所知的最低浓度要求即可。在某些实施方案中,本发明的培养基含有:2×10-3-10×10-3g/L CaCl2·2H2O、1×10-2-5×10-2g/L FeCl3·6H2O、0.5×10-3-2×10-3g/L MnCl2·4H2O、1×10-3-5×10-3g/L ZnCl2·2H2O、2×10-4-10×10-4g/L CuCl2·2H2O、5×10-4-10×10-4g/L CoCl2·2H2O和2×10-4-10×10-4g/L Na2MoO4·2H2O。
在某些实施方案中,本发明的培养基还含有0.5-2mg/L的维生素B1。添加适量的维生素B1也可提高菌体生长的速度。
在一些实施方案中,本发明的培养基含有[U-13C]碳源作为唯一碳源、最小培养基成分、MgSO4·7H2O、微量元素成分和维生素B1,其中,所述最小培养基成分含有Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和(NH4)2SO4。在一些实施方案中,本发明的培养基含有[U-13C]碳源作为唯一碳源、最小培养基成分和MgSO4·7H2O,其中,所述最小培养基成分含有KH2PO4、K2HPO4、K2SO4和NH4Cl;这类培养基可任选地含有微量元素成分和维生素B1。
本发明中,大肠杆菌的培养方式可以是本领域常规的培养方法,例如包括但不限于滤膜培养或发酵罐培养。滤膜培养和发酵罐培养可以采用本领域已知的方案进行。通常,滤膜培养包括使用滤膜对培养获得的菌液进行过滤,再将带有菌体的滤膜移放到固体培养基上进一步培养;发酵罐培养是指在发酵罐中投入一定量的培养基后,接种微生物菌种进行培养。通常,本发明使用在以[U-13C]碳源为唯一碳源的培养基中培养获得的大肠杆菌作为种子液进行滤膜或发酵罐培养。在一些实施方案中,种子液的培养时间可以是6-24小时,培养温度可在30-40℃的范围内。
采用滤膜培养时,可先对种子液进行摇瓶培养,培养至OD600≈0.1,例如为0.08-0.12,然后再将摇瓶培养得到的菌液转移到平板培养基中通过滤膜培养至对数生长期。摇瓶培养的温度通常也在30-40℃的范围内。滤膜培养时,可将摇瓶培养得到的菌液转移到滤膜上,快速过滤收集菌体,再将分布有菌体的滤膜转移到平板培养基上,培养至对数生长期。
采用发酵罐培养时,可将大肠杆菌种子液接种到发酵罐内的培养基中,培养至对数生长期。例如,可将种子液离心,去除上清,加入生理盐水复溶,接入含有发酵培养基的发酵罐中。培养温度可为30-40℃,培养基的pH可为6-8,搅拌转速可为200-500rpm。培养过程中,可根据需要流加培养基或培养基中的部分组分。
在优选的实施方案中,采用发酵罐进行培养时,培养基中碳源为[U-13C]葡萄糖和[U-13C]碳酸氢钠;优选地,[U-13C]葡萄糖的浓度为2-8g/L,[U-13C]碳酸氢钠的浓度为0.5-2g/L。
将大肠杆菌通过上述方法培养至对数生长期后,收集细胞、淬灭,进而提取细胞内中间代谢物。通常,可采用本领域常规的淬灭方法进行本发明的淬灭,例如包括但不限于冷甲醇(如4℃以下,通常大约为0℃)淬灭、液氮淬灭、生理盐水淬灭、甘油-氯化钠淬灭、乙醇淬灭、乙醇-水溶液淬灭等。对于通过滤膜培养得到的细胞,优选采用冷甲醇淬灭,即将带有菌体的滤膜快速浸入冷甲醇中,可伴以冰上超声10s-1min,然后静置5-30min。对于通过发酵罐分批培养得到的细胞,优选采用液氮淬灭。
本发明采用体积比为(40-60):(40-60):(15-25)的甲醇-氯仿-水作为提取试剂提取细胞内中间代谢物。在某些实施方案中,本发明采用体积比为(40-50):(40-50):(15-20)、优选40:(40-50):(15-20)、更优选4:4:1.6的甲醇-氯仿-水作为提取试剂提取细胞内中间代谢物。优选地,本发明使用超滤管提取细胞内中间代谢物,以提高提取效率。在某些实施方案中,本发明的提取过程包括:液氮淬灭后,离心2-7min去除上清,在菌体中加入甲醇、氯仿和水,使得液体中甲醇:氯仿:水的体积比为(40-60):(40-60):(15-25),离心2-10min,转移上层甲醇-水相至超滤管中,离心1-5h以去除蛋白,所得滤液即为本发明的稳定同位素标记的细胞内中间代谢物的甲醇-水溶液。在另一些实施方案中,本发明的提取过程包括:冷甲醇淬灭后,向淬灭后获得的液体中加入氯仿和水以及任选的甲醇(由于该液体中已含有甲醇,因此此时可仅加入氯仿和水),使得液体中甲醇:氯仿:水的体积比为(40-60):(40-60):(15-25),离心2-10min,转移上层甲醇-水相至超滤管中,离心1-5h以去除蛋白,所得滤液即为本发明的稳定同位素标记的细胞内中间代谢物的甲醇-水溶液。
通常,本发明的稳定同位素标记的细胞内中间代谢物包含[U-13C]葡萄糖-6-磷酸、[U-13C]果糖-6-磷酸、[U-13C]葡萄糖-1-磷酸、[U-13C]果糖-1,6-二磷酸、[U-13C]二羟丙酮磷酸、[U-13C]甘油醛-3-磷酸、[U-13C]3-磷酸甘油酸、[U-13C]磷酸烯醇式丙酮酸、[U-13C]丙酮酸、[U-13C]乙酰辅酶A、[U-13C]核糖-5-磷酸、[U-13C]景天庚酮糖-7-磷酸、[U-13C]α-酮戊二酸、[U-13C]柠檬酸、[U-13C]异柠檬酸、[U-13C]延胡索酸、[U-13C]琥珀酸、[U-13C]苹果酸、[U-13C]3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸、[U-13C]脱氢莽草酸、[U-13C]脱氢奎宁酸、[U-13C]莽草酸、[U-13C]ATP、[U-13C]ADP、[U-13C]AMP、[U-13C]NADH、[U-13C]NAD+、[U-13C]NADPH、[U-13C]NADP+、[U-13C]苯丙氨酸、[U-13C]酪氨酸、[U-13C]色氨酸、[U-13C]精氨酸、[U-13C]谷氨酸、[U-13C]组氨酸、[U-13C]异亮氨酸、[U-13C]亮氨酸、[U-13C]丝氨酸、[U-13C]苏氨酸、[U-13C]天冬氨酸、[U-13C]甘氨酸和[U-13C]缬氨酸。
本发明的稳定同位素标记的细胞内中间代谢物中,糖酵解途径代谢物的13C全碳标记的效率可达到90%以上,如94%以上、95%以上等,在发酵罐培养的实施方案中可达到99%以上;磷酸戊糖途径代谢物的13C全碳标记的效率可达到90%以上,如95%以上、96%以上等,在发酵罐培养的实施方案中可达到98%以上;三羧酸循环代谢物的13C全碳标记的效率可达到70%以上,如75%以上、76%以上、76%-97%等;莽草酸途径代谢物的13C全碳标记的效率可达到90%以上,如93%以上、93%-96%等;辅因子的13C全碳标记的效率可达到20%-65%,如22%-65%、22%-51%等,在发酵罐培养的实施方案中可达到29%-65%;氨基酸的13C全碳标记的效率可达到50%以上,如51%以上,在发酵罐培养的实施方案中可达到80%以上。
在某些实施方案中,本发明的稳定同位素标记的细胞内中间代谢物的13C全碳标记的效率满足以下一项或多项特征:[U-13C]葡萄糖-6-磷酸、[U-13C]果糖-6-磷酸、[U-13C]葡萄糖-1-磷酸、[U-13C]果糖-1,6-二磷酸、[U-13C]二羟丙酮磷酸、[U-13C]甘油醛-3-磷酸、[U-13C]磷酸烯醇式丙酮酸、[U-13C]丙酮酸、[U-13C]乙酰辅酶A、[U-13C]核糖-5-磷酸、[U-13C]景天庚酮糖-7-磷酸、[U-13C]琥珀酸、[U-13C]莽草酸、[U-13C]甘氨酸和[U-13C]缬氨酸的13C全碳标记的效率各自独立地大于等于95%;[U-13C]3-磷酸甘油酸、[U-13C]α-酮戊二酸、[U-13C]延胡索酸、[U-13C]苹果酸、[U-13C]3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸、[U-13C]脱氢莽草酸、[U-13C]脱氢奎宁酸和[U-13C]色氨酸的13C全碳标记的效率各自独立地大于等于90%;[U-13C]苯丙氨酸、[U-13C]酪氨酸、[U-13C]谷氨酸、[U-13C]组氨酸和[U-13C]亮氨酸的13C全碳标记的效率各自独立地大于等于85%;[U-13C]柠檬酸、[U-13C]异柠檬酸和[U-13C]天冬氨酸的13C全碳标记的效率各自独立地大于等于75%;[U-13C]异亮氨酸的13C全碳标记的效率大于等于70%;[U-13C]丝氨酸和[U-13C]苏氨酸的13C全碳标记的效率各自独立地大于等于60%;[U-13C]ATP和[U-13C]精氨酸的13C全碳标记的效率各自独立地大于等于50%;[U-13C]AMP的13C全碳标记的效率大于等于45%;[U-13C]ADP的13C全碳标记的效率大于等于40%;[U-13C]NADH和[U-13C]NAD+的13C全碳标记的效率各自独立地大于等于30%;[U-13C]NADPH的13C全碳标记的效率大于等于25%;[U-13C]NADP+的13C全碳标记的效率大于等于20%。
本发明中,所有碳原子被13C标记(13C全碳标记)的效率(丰度)是指某一细胞内中间代谢物成分中,所有碳原子均被13C标记的分子占该成分总量(包括未标记、部分碳原子被13C标记和所有碳原子均被13C标记的分子)的质量分数。
获得稳定同位素标记的细胞内中间代谢物的甲醇-水溶液后,对其进行冻干,即可得到细胞内中间代谢物稳定同位素内标冻干粉。可采用本领域常规的冻干方法进行冻干,例如,在某些实施方案中,本发明使用离心浓缩仪(温度可设置为0-25℃)冻干。冻干后,冻干粉可置于-80℃冷冻保存;使用有效期通常为1个月。
本发明取得了以下有益效果:
1、本发明能够同时合成高浓度和丰度的细胞内关键中心碳代谢物、辅因子和氨基酸的稳定同位素内标,填补了国内在代谢组学稳定同位素内标制备方面的空白,体现出了生物法制备的优越性,有利于完善我国定量代谢组学并拓展其应用领域;
2、和其他方法相比,本发明制备得到的同位素标记的细胞内中间代谢物的种类更加全面,且单位碳源得到的细胞内中间代谢物产量相对较高;此外,添加[U-13C]碳酸氢钠的培养基的实施方案还能明显提高产物的13C全碳标记的效率;
3、本发明的制备同位素标记的细胞内中间代谢物的方法具有操作简便、成本较低、生产效率高的优点。
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。对于本文以及实施例中所用的试剂、方法、条件等,除非另有说明,否则均为常规的试剂、方法和条件。下列实施例中未注明具体条件的测试方法,通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准,则按照通用的国际标准、常规条件或制造厂商所建议的条件进行。
以下实施例和对比例中采用液相色谱-质谱(LC-MS)法测定稳定同位素内标冻干粉的浓度和丰度,具体测试条件为:
LC-MS:Waters UPLC I class&Vion IMS QTOF;
色谱条件:色谱柱为SeQuant ZIC-HILIC柱(100mm×2.1mm i.d.,3.5μm);流动相A:50mM甲酸铵水溶液;流动相B:乙腈;柱温:45℃;流速:0.4mL/min;梯度洗脱条件:0-10min,90-50%B;10-12min,50-90%B;12-15min,90%B;
质谱条件:全谱扫描模式;质荷比范围:m/z 50-1000;扫描时间:0.3s;CE:6eV;溶媒挥散温度:500℃;离子源温度:120℃;脱溶剂气流速:1000L/h;进样锥气流速:50L/h;毛细管电压:2000V;
所用数据处理软件为UNIFI 1.8.1。
实施例1:
本实施例以[U-13C]葡萄糖为碳源采用滤膜培养法培养大肠杆菌制备细胞内中间代谢物稳定同位素内标冻干粉,具体包括以下步骤(参见图1):
1、配置液体培养基A:5g/L[U-13C]葡萄糖,最小培养基成分(6.81g/L Na2HPO4、2.99g/L KH2PO4、0.58g/L NaCl和5.94g/L(NH4)2SO4,或4.7g/L KH2PO4、14g/L K2HPO4、1g/LK2SO4和1g/L NH4Cl),1mM MgSO4·7H2O,微量元素成分(5.5×10-3g/L CaCl2·2H2O、1.67×10-2g/L FeCl3·6H2O、1×10-3g/L MnCl2·4H2O、1.75×10-3g/L ZnCl2·2H2O、4.35×10-4g/LCuCl2·2H2O、6.5×10-4g/L CoCl2·2H2O和6.5×10-4g/L Na2MoO4·2H2O),和1mg/L维生素B1;
2、配置平板培养基B:5g/L[U-13C]葡萄糖,最小培养基成分(6.81g/L Na2HPO4、2.99g/L KH2PO4、0.58g/L NaCl和5.94g/L(NH4)2SO4,或4.7g/L KH2PO4、14g/L K2HPO4、1g/LK2SO4和1g/L NH4Cl),1mM MgSO4·7H2O,1.5wt%琼脂糖,微量元素成分(5.5×10-3g/LCaCl2·2H2O、1.67×10-2g/L FeCl3·6H2O、1×10-3g/L MnCl2·4H2O、1.75×10-3g/LZnCl2·2H2O、4.35×10-4g/L CuCl2·2H2O、6.5×10-4g/L CoCl2·2H2O和6.5×10-4g/LNa2MoO4·2H2O),和1mg/L维生素B1;
3、用接种环接入平板保存的E.coli BW25113至5mL种子培养基(液体培养基A),37℃培养12h;
4、取1mL步骤3得到的菌液到含有50mL液体培养基A的250mL摇瓶中,37℃培养,直至OD600≈0.1;
5、取5mL OD600≈0.1的步骤4得到的菌液转移至滤膜上,快速过滤收集菌体;
6、将菌体均匀分布的滤膜转移到平板培养基B上,培养至对数生长期;
7、将滤膜快速浸入5mL冷甲醇(大约0℃)溶液中,冰上超声30s,静置10min,转移4mL液体(其余液体因附着在滤膜上而无法转移)至15mL锥形离心管中,加入4mL氯仿和1.6mL超纯水,离心5min,转移上层甲醇-水相至超滤管中,离心2h;
8、分装5-15管,将滤液用离心浓缩仪(温度设置为4℃)冻干,得到大肠杆菌13C稳定同位素内标冻干粉,置于-80℃冰箱保存。
向步骤8得到的每管大肠杆菌13C稳定同位素内标中加入50μL甲醇:水(1:1v/v),配制复溶液,进样LC-MS测定浓度和丰度,结果如表1所示。
表1:实施例1制备得到的细胞内中间代谢物的稳定同位素内标冻干粉的浓度和丰度
实施例2:
本实施例以[U-13C]葡萄糖和[U-13C]碳酸氢钠为碳源采用发酵罐分批培养法培养大肠杆菌制备细胞内中间代谢物,具体包括以下步骤(参见图2):
1、配置液体培养基A:5g/L[U-13C]葡萄糖,最小培养基成分(6.81g/L Na2HPO4、2.99g/L KH2PO4、0.58g/L NaCl和5.94g/L(NH4)2SO4,或4.7g/L KH2PO4、14g/L K2HPO4、1g/LK2SO4和1g/L NH4Cl),1mM MgSO4·7H2O,微量元素成分(5.5×10-3g/L CaCl2·2H2O、1.67×10-2g/L FeCl3·6H2O、1×10-3g/L MnCl2·4H2O、1.75×10-3g/L ZnCl2·2H2O、4.35×10-4g/LCuCl2·2H2O、6.5×10-4g/L CoCl2·2H2O和6.5×10-4g/L Na2MoO4·2H2O),和1mg/L维生素B1;
2、配置发酵培养基C:5g/L[U-13C]葡萄糖,1g/L[U-13C]碳酸氢钠,最小培养基成分(6.81g/L Na2HPO4、2.99g/L KH2PO4、0.58g/L NaCl和5.94g/L(NH4)2SO4,或4.7g/L KH2PO4、14g/L K2HPO4、1g/L K2SO4和1g/L NH4Cl),1mM MgSO4·7H2O,微量元素成分(5.5×10-3g/LCaCl2·2H2O、1.67×10-2g/L FeCl3·6H2O、1×10-3g/L MnCl2·4H2O、1.75×10-3g/LZnCl2·2H2O、4.35×10-4g/L CuCl2·2H2O、6.5×10-4g/L CoCl2·2H2O和6.5×10-4g/LNa2MoO4·2H2O),和1mg/L维生素B1;
3、用接种环接入平板保存的E.coli BW25113至10mL种子培养基(液体培养基A),37℃培养12h;
4、将10mL步骤3得到的菌液离心,去除上清,加入10mL生理盐水复溶,接入装液量1L包含发酵培养基C的发酵罐。控制发酵温度为37℃,pH为7,搅拌转速为400rpm;
5、发酵罐培养至对数生长期后,用液氮淬灭;
6、分装,淬灭,离心2-7min去除上清,在菌体中加入4mL甲醇、4mL氯仿和1.6mL超纯水,离心5min,转移上层甲醇-水相至超滤管中,离心2h;
7、分装100-300管,将滤液用离心浓缩仪冻干,得到大肠杆菌13C稳定同位素内标冻干粉,置于-80℃冰箱保存。
向步骤7得到的分装的大肠杆菌13C稳定同位素内标加入50μL甲醇:水(1:1v/v),配制复溶液,进样LC-MS测定浓度和丰度,结果如表2所示。
表2:实施例2制备得到的细胞内中间代谢物的稳定同位素内标冻干粉的浓度和丰度
对比例:
本对比例以[U-13C]葡萄糖为碳源采用滤膜培养法培养大肠杆菌,使用甲醇:乙腈:水体积比为2:2:1且含0.1vol%甲酸的溶液作为提取试剂制备细胞内中间代谢物,具体包括以下步骤:
1-6、同实施例1;
7、向滤膜中加入3.5mL-20℃存放的提取试剂(甲醇:乙腈:水=2:2:1,0.1%甲酸),润洗滤膜,转移代谢物溶液至离心管中,离心5min,保留上清;
8、向离心管中加入1.5mL-20℃存放的提取试剂(甲醇:乙腈:水=2:2:1,0.1%甲酸),快速将菌液悬浮,立刻液氮速冻1分钟,室温复溶,低温超声10min,此为一个循环,循环三次;将步骤7的上清连同步骤8的溶液转移至15ml锥形离心管,在-20℃静置2h;
9、13000rpm离心15min,取上清,冻干待上样。
向步骤9得到的大肠杆菌13C稳定同位素内标中加入50μL甲醇:水(1:1v/v)配制复溶液,进样LC-MS测定浓度和丰度,结果如表3所示。
表3:对比例制备得到的细胞内中间代谢物的稳定同位素内标冻干粉的浓度和丰度
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围,其均应涵盖在本发明的权力要求范围当中。
Claims (12)
1.一种制备稳定同位素标记的细胞内中间代谢物的方法,其特征在于,所述方法包括:利用以[U-13C]碳源为唯一碳源的培养基培养大肠杆菌至对数生长期,收集细胞、淬灭和提取细胞内中间代谢物;其中,使用体积比为(40-60):(40-60):(15-25)的甲醇、氯仿和水的混合物进行提取。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述[U-13C]碳源选自[U-13C]葡萄糖、[U-13C]果糖、[U-13C]木糖、[U-13C]甘油、[U-13C]乳糖、[U-13C]半乳糖、[U-13C]蔗糖、[U-13C]麦芽糖和[U-13C]碳酸氢钠中的任意一种或任意多种。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法包括通过滤膜或发酵罐将大肠杆菌培养至对数生长期。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,用于培养至对数生长期的大肠杆菌来自以[U-13C]碳源为唯一碳源的培养基制备得到的大肠杆菌种子液。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述培养基含有[U-13C]碳源、最小培养基成分和MgSO4•7H2O,任选地还含有微量元素成分和/或维生素B1;所述最小培养基成分包括0-73 mmol/L Na+、7-266 mmol/L K+、3-152 mmol/L NH4 +、13-123 mmol/L PO4 3-、3-38 mmol/LCl-和0.5-76 mmol/L SO4 2-。
6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述培养基的组成满足以下一项或多项特征:
所述[U-13C]碳源的浓度为2-10 g/L;
所述微量元素成分包括2×10-3-10×10-3 g/L CaCl2•2H2O、1×10-2-5×10-2 g/LFeCl3•6H2O、0.5×10-3-2×10-3 g/L MnCl2•4H2O、1×10-3-5×10-3 g/L ZnCl2•2H2O、2×10-4-10×10-4 g/L CuCl2•2H2O、5×10-4-10×10-4 g/L CoCl2•2H2O和2×10-4-10×10-3 g/LNa2MoO4•2H2O;
所述维生素B1浓度为0.5-2 mg/L;和
所述MgSO4•7H2O浓度为0.2-2 mM。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法,其特征在于,所述[U-13C]碳源为[U-13C]葡萄糖和任选的[U-13C]碳酸氢钠。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,通过发酵罐将大肠杆菌培养至对数生长期。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述淬灭为冷甲醇淬灭、液氮淬灭、生理盐水淬灭、甘油-氯化钠淬灭、乙醇淬灭或乙醇-水溶液淬灭。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述提取包括使用超滤管提取。
11.如权利要求10所述的方法,其特征在于,所述提取包括将使用所述提取试剂提取大肠杆菌细胞所得的上层甲醇-水相转移至超滤管中,离心收集滤液。
12.采用权利要求1-11中任一项所述的方法制备得到的稳定同位素标记的细胞内中间代谢物,其特征在于,所述细胞内中间代谢物包含[U-13C]葡萄糖-6-磷酸、[U-13C]果糖-6-磷酸、[U-13C]葡萄糖-1-磷酸、[U-13C]果糖-1,6-二磷酸、[U-13C]二羟丙酮磷酸、[U-13C]甘油醛-3-磷酸、[U-13C]3-磷酸甘油酸、[U-13C]磷酸烯醇式丙酮酸、[U-13C]丙酮酸、[U-13C]乙酰辅酶A、[U-13C]核糖-5-磷酸、[U-13C]景天庚酮糖-7-磷酸、[U-13C]α-酮戊二酸、[U-13C]柠檬酸、[U-13C]异柠檬酸、[U-13C]延胡索酸、[U-13C]琥珀酸、[U-13C]苹果酸、[U-13C]3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸、[U-13C]脱氢莽草酸、[U-13C]脱氢奎宁酸、[U-13C]莽草酸、[U-13C]ATP、[U-13C]ADP、[U-13C]AMP、[U-13C]NADH、[U-13C]NAD+、[U-13C]NADPH、[U-13C]NADP+、[U-13C]苯丙氨酸、[U-13C]酪氨酸、[U-13C]色氨酸、[U-13C]精氨酸、[U-13C]谷氨酸、[U-13C]组氨酸、[U-13C]异亮氨酸、[U-13C]亮氨酸、[U-13C]丝氨酸、[U-13C]苏氨酸、[U-13C]天冬氨酸、[U-13C]甘氨酸和[U-13C]缬氨酸。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910345626.9A CN111849796B (zh) | 2019-04-26 | 2019-04-26 | 稳定同位素标记的细胞内中间代谢物及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910345626.9A CN111849796B (zh) | 2019-04-26 | 2019-04-26 | 稳定同位素标记的细胞内中间代谢物及其制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111849796A CN111849796A (zh) | 2020-10-30 |
CN111849796B true CN111849796B (zh) | 2023-01-13 |
Family
ID=72951800
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910345626.9A Active CN111849796B (zh) | 2019-04-26 | 2019-04-26 | 稳定同位素标记的细胞内中间代谢物及其制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111849796B (zh) |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0220951A2 (en) * | 1985-10-25 | 1987-05-06 | Celgene Corporation | Biochemicals labelled with stable isotopes |
US5352590A (en) * | 1991-03-08 | 1994-10-04 | Tokyo Gas. Co., Ltd. | Process for the preparation of 13 C-labelled compounds |
JP2005034149A (ja) * | 2003-06-30 | 2005-02-10 | Ajinomoto Co Inc | 同位体で標識された基質を用いた細胞内代謝フラックスの解析方法 |
WO2015071883A1 (en) * | 2013-11-15 | 2015-05-21 | Basf Plant Science Company Gmbh | Process for growing and preparing cells in-vitro for metabolic profiling |
CN108624516A (zh) * | 2017-03-20 | 2018-10-09 | 华东理工大学 | 一种提高发酵细胞中的代谢产物量及制备idms标准品的方法 |
JP2019024326A (ja) * | 2017-07-25 | 2019-02-21 | 大陽日酸株式会社 | 標識代謝物の製造方法、代謝物の定量方法、及び標識代謝物製造キット |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AT501629B1 (de) * | 2005-04-05 | 2007-10-15 | Erber Ag | Herstellung von hochgradig isotopenmarkierten, sekundären, mikrobiellen stoffwechselprodukten sowie stoffwechselprodukte |
-
2019
- 2019-04-26 CN CN201910345626.9A patent/CN111849796B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0220951A2 (en) * | 1985-10-25 | 1987-05-06 | Celgene Corporation | Biochemicals labelled with stable isotopes |
US5352590A (en) * | 1991-03-08 | 1994-10-04 | Tokyo Gas. Co., Ltd. | Process for the preparation of 13 C-labelled compounds |
JP2005034149A (ja) * | 2003-06-30 | 2005-02-10 | Ajinomoto Co Inc | 同位体で標識された基質を用いた細胞内代謝フラックスの解析方法 |
WO2015071883A1 (en) * | 2013-11-15 | 2015-05-21 | Basf Plant Science Company Gmbh | Process for growing and preparing cells in-vitro for metabolic profiling |
CN108624516A (zh) * | 2017-03-20 | 2018-10-09 | 华东理工大学 | 一种提高发酵细胞中的代谢产物量及制备idms标准品的方法 |
JP2019024326A (ja) * | 2017-07-25 | 2019-02-21 | 大陽日酸株式会社 | 標識代謝物の製造方法、代謝物の定量方法、及び標識代謝物製造キット |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN111849796A (zh) | 2020-10-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Charmantray et al. | Preparative scale enzymatic synthesis of d-sedoheptulose-7-phosphate from β-hydroxypyruvate and d-ribose-5-phosphate | |
CN114085783B (zh) | 马克斯克鲁维酵母及其在催化烟酰胺核糖合成β型烟酰胺单核苷酸中的应用 | |
Rayamajhi et al. | Improved production of 1-deoxynojirymicin in Escherichia coli through metabolic engineering | |
Li et al. | Sample preparation for the metabolomics investigation of poly-gamma-glutamate-producing Bacillus licheniformis by GC–MS | |
Duerre et al. | Formotion and metabolism of S-adenosyl-l-homocysteine in yeast | |
JP6909466B2 (ja) | 標識代謝物の製造方法、代謝物の定量方法、及び標識代謝物製造キット | |
CN110305926B (zh) | 一种基于两性霉素b代谢途径的发酵方法 | |
CN111849796B (zh) | 稳定同位素标记的细胞内中间代谢物及其制备方法 | |
DK2557151T3 (en) | S-adenosyl-L-methionine-containing dry yeast composition with excellent storage stability and process for preparing the same | |
Hunter et al. | Actinomycete metabolism: origin of the guanidine groups in streptomycin | |
CN105543292B (zh) | 一种微生物转化的方法 | |
US9700629B2 (en) | Composition containing S-adenosyl-L-methionine with excellent storage stability | |
US20130090466A1 (en) | Crystallization process of cyclic adenosine 3',5'-monophosphate | |
CN108624516B (zh) | 一种提高发酵细胞中的代谢产物量及制备idms标准品的方法 | |
CN105543290A (zh) | 一种微生物转化的方法 | |
CN105603006A (zh) | 一种微生物转化的方法 | |
Mosin et al. | Research from a Bacterium Bacillus Subtilis B-3157 by FAB Method of Biosynthetic Pathways of 2H-Labeled Purine Ribonucleoside Inosine | |
CN106191139A (zh) | 莱比托游动球菌催化制备丹参素的方法 | |
Mosin et al. | Studying Biosynthetic Pathways of 2H-Labeled Purine Ribonucleoside Inosine in a Bacterium Bacillus Subtilis B-3157 by FAB Method | |
CN112481334A (zh) | 一种腺苷的发酵菌株及其制备工艺优化 | |
Mosin et al. | Preparation from Bacterium Bacillus Subtilis B-3157 of 2H-Labaled Purine Ribonucleoside Inosine | |
Mosin et al. | Deuterated methylotrophic biomass as a substrate for microbiological synthesis of 2 H-labeled purine ribonucleoside inosine by chemoheterotrophic bacterium Bacillus subtilis B-3157 | |
Mosin et al. | Methylotrophic Biomass as Substrate for Cultivation of Chemoheterotrophic Bacterium Bacillus Subtilis B-3157 | |
Mosin et al. | A Strain of a Gram-positive Chemoheterotrophic Bacterium Bacillus Subtilis B-3157–producer of 2H-Labeled Purine Ribonucleoside Inosine | |
Mosin et al. | The Metabolic Pathways of Biosynthesis of 2H-Labeled Purine Ribonucleoside Inosine by a Strain of Chemoheterotrophic Bacterium Bacillus Subtilis B-3157 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |