CN105378055A - 用于通过顺序、自动提供葡萄糖分批补料发酵所供养的小球藻属物种的方法 - Google Patents

用于通过顺序、自动提供葡萄糖分批补料发酵所供养的小球藻属物种的方法 Download PDF

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CN105378055A CN201480039481.5A CN201480039481A CN105378055A CN 105378055 A CN105378055 A CN 105378055A CN 201480039481 A CN201480039481 A CN 201480039481A CN 105378055 A CN105378055 A CN 105378055A
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Abstract

本发明涉及用于通过分批补料发酵生产小球藻属微藻的方法，该方法特征在于响应于微藻的氧消耗的下降顺序并自动供应碳源，特别是当发酵培养基中溶解氧压力(pO2)超过预定义的阈值时。

Description

用于通过顺序、自动提供葡萄糖分批补料发酵所供养的小球藻属物种的方法
本发明涉及一种用于通过分批补料发酵生产小球藻属微藻的新方法。
现有技术的呈现
在历史上，藻类“只需水和阳光”来生长，因此藻类长期被认为是食物的来源。
存在若干可用在食品中的藻类物种，大部分是“大型藻类”，例如海带、海白菜(石莼(Ulvalactuca))和紫菜属(在日本种植的)或红皮藻(帕尔玛利亚掌叶(Palmariapalmata))型红藻。
然而，除了这些大型藻类外，还存在由“微藻”代表的藻类的其他来源，也就是说经种植用于在生物燃料或食品中应用的海产或非海产光合作用类或非光合作用单细胞微藻。
例如，螺旋藻(钝顶螺旋藻(Arthrospiraplatensis))是在开放泄湖中培养的(在光养条件下)，用作食品补充剂，或少量地掺于糖果或饮品中(一般不到0.5重量/重量％)。
其他富含脂质的微藻，包括属于小球藻属的某些物种，在亚洲国家作为食品增补剂也非常受欢迎。
使用可以被用于碳和能量代谢的葡萄糖或其他基于碳的底物，微藻的若干物种能够变光合自养生长(凭借光，该光提供能量用于转化CO2为基于碳的链)为异养生长(不需要光)。
当今工业上使用三种用于生产微藻的方法：
-在异养反应器中(完全封闭的)；
-在露天池中；
-在玻璃管中。
由这些培养方法生产具有变量属性和组合物的小球藻属物种。这些组合物将根据它们是否在光照中产生和是否在露天中产生而不同。
小球藻属型的微藻粉的生产和用途，例如，描述于文件WO2010/120923和WO2010/045368中。
微藻粉的油部分可基本上由单不饱和油构成，与常见于常规食品中的饱和、氢化和多不饱和油相比，可提供营养及健康优势。
当期望从其生物质工业生产微藻粉粉末时，主要困难仍然不仅来自所生产组合物的技术观点，而且来自所生产组合物的感觉属性的观点。
这是因为，当藻类粉末，例如用在露天池中或通过光生物反应器光合培养的藻类所制造的藻类粉末，是可商购的时，它们具有深绿的颜色(与叶绿素有关)和强烈令人不快的味道。
因此事实上，普遍接受的是在异养培养条件下并且在黑暗中抑制叶绿体的形成和生长。
因此在这些异养条件下，微藻并不使用光合作用反应而是通过消耗培养基的糖来生长。
该生产系统的优势为：
-按体积计极大地增加了的生产率，相对于开放系统的100倍，并且相对于生物反应器的10倍，
-非常高浓度的干物质(数百克/升)，
-低生产成本，
-所获得的产物质量非常高，
-有限培养基并且因此无污染，
-不受地点约束，
-工业上非常容易操作，
-通过不同工业，例如化学工业和食品加工业，在工业规模上关于酵母菌和细菌的技术已经完全掌握了几十年，
-不存在叶绿素并且因此味道更中性。
两种形式的异养培养常规描述于文献(例如，里士满的H.岩本(Iwamoto)，A.编辑，2004，微藻培养手册(HandbookofMicroalgalCulture)，布莱克威尔，牛津，255-263)中。
H.岩本(Iwamoto)写到，当以批次处理方式(在发酵起始时一次供应所有的葡萄糖)控制异养培养阶段时，指数生长的初始阶段后是成熟期，以便获得富含有利化合物的细胞。
在初始阶段期间，伴随着葡萄糖的消耗，生物质增加，并且在零葡萄糖时停止。
随后利用第二“成熟”阶段，以便促进其他有利分子(色素、脂质、以及类似物)的产生。
通常在葡萄糖限制的条件下进行分批补料方式的培养(逐步用葡萄糖补料)。
如由H.岩本(Iwamoto)所描述的，方法核心的原则涉及响应于由生长小球藻属物种的葡萄糖的消耗来提供葡萄糖。
连续并自动分析培养基中葡萄糖的浓度，并且保持在1.5％。
当到达所希望的细胞密度时，停止葡萄糖补料。然后将培养保持在该状态持续约10小时，以便促进细胞成熟。
H.岩本(Iwamoto)用规则小球藻(Chlorellaregularis)菌株解释说明了在葡萄糖限制的条件下分批补料培养方式的应用。
培养进行总计40h的持续时间，第一个30小时致力于微藻的生长，并且用葡萄糖供养它们。
随后的10小时致力于成熟，不提供葡萄糖。
然后收集生物质并通过离心、洗涤、在130℃下热灭活(该热灭活使其可以抑制叶绿素酶)3秒钟来浓缩并且通过雾化干燥，以便获得极细粉。
然而，具体地，使用这种处理方式是为了再活化成熟期过程中叶绿素和类葫萝卜素的产生。
它并不适用于富含脂质的小球藻属生物质的生产，该小球藻属生物质不具有造成感官品质不利影响的缺点(异味)，并且特别是不产生叶绿素。
此外，用于测定剩余葡萄糖的自动装置并不够可靠，并且并没有给出足够快速的应答(>1分钟)，以允许精确调节发酵。
因此，仍然存在对可供用于通过分批补料发酵进行有效生产的方法的未满足的需求，该分批补料发酵不受剩余葡萄糖管理的约束。
发明概述
本申请公司已经发现，通过提供一种用于通过分批补料发酵生产小球藻属微藻的方法可以满足该需要，其中在完全特定条件下碳基源的添加是顺序的并且是自动的，也就是说通过顺序添加来供应碳基源以控制发酵培养基的溶解氧压力(pO2)值。
因此，本发明涉及用于通过分批补料发酵生产小球藻属微藻的方法，该方法特征在于响应于微藻氧消耗的下降来顺序并自动进行碳基源的供应。
该微藻可以选自下组，该组由以下各项组成：原壳小球藻(Chlorellaprotothecoides)、耐热性小球藻(Chlorellasorokiniana)和普通小球藻(Chlorellavulgaris)。优选地，该微藻是原壳小球藻。
该碳基源可以是适合于通过发酵培养微藻的任何碳源。其具体可以选自下组，该组由以下各项组成：葡萄糖、乙酸酯和乙醇、以及这些的混合物。优选地，碳基源是葡萄糖。
可以通过测量培养基中的溶解氧压力来检测微藻的耗氧量的下降。因为该压力的增加反映了消耗的下降，当发酵培养基中溶解氧压力(pO2)超过阈值时，可以触发碳基源的供应。
该阈值可以是从1％至100％的pO2值，优选的是从1％至80％，更优选的是从1％至20％，仍更优选的是从10％至20％，当不限制发酵培养基中碳基源的浓度时，大于发酵培养基中的pO2。
优选地，当不限制发酵培养基中碳基源的浓度时，形成的pO2值是从20％至40％，并且更具体优选的是约30％。
优选地，已经完全消耗碳基源的时刻与供应碳基源的时刻之间的时间段为小于5分钟，更具体优选的是小于1分钟。
剩余的碳源优选永久地保持，或几乎永久地保持在大于0并小于20g/l的值，优选的是小于10g/l。
优选地，借助泵进行碳基源供应，该碳基源供应的最大流速使得可以在少于10分钟内向发酵培养基添加从10至20g/l的碳基源。
发明的详细说明
与技术预想相反，该技术预想要求在分批补料发酵的情况下，剩余葡萄糖的浓度必须通过连续添加葡萄糖保持在5和15g/l之间(通过自动测量培养基中剩余的葡萄糖浓度进行调节)，据其，本申请公司利用了观测值，当发酵培养基中的葡萄糖已经完全消耗时，该pO2快速增加。
因此，本申请公司通过对葡萄糖补料泵编程自动化碳基源的供应，以便后者在每次pO2升高时触发葡萄糖脉冲，并且当剩余的葡糖糖浓度在5g/l以下的时候不触发。
换言之，当不限制剩余的葡萄糖浓度时，相比于所测量的pO2，该pO2的测量值一旦大于形成的阈值，就触发该葡萄糖补料泵。
这反映了如下事实：检测到超过预定阈值的pO2的升高触发了葡萄糖补料泵的启动，优选的是以其最大速度，持续预定时间(优选的是少于10分钟)，以便促成对应在1和30g/l之间的浓度的葡萄糖的量，优选的是约10g/l，校正发酵罐的起始体积。
凭借该方法，微藻直接并自动“管理”其葡萄糖需求。
相比于连续补料碳基源的分批补料发酵方法，根据本发明的方法展现了若干如下优势：
-它不需要任何人为干涉，鉴于此能够精确并自动调节发酵，如在实验部分所证实的；
-根据微生物的需求供应碳基源。因此，发酵培养基在任何情况下都不会累积大于由脉冲所定义的葡萄糖的量，在另一方面，在零剩余葡萄糖时终止很长一段时间。这两个参数针对确保成品质量是必不可少的，特别是不存在异味，也就是说不存在不利影响的感官特征；
-该剩余的葡萄糖的控制好得多，并且因此该发酵方案更加稳健并且是更易再生的；
-在不是葡萄糖供料不足并且没有以抑制微藻代谢的浓度积累葡萄糖的情况下，该生产力处于最大。
在此使用的，术语“生产力”对应于分批补料发酵每升并且每小时所产生的生物质的量。
转化率Yx/s通常代表了所形成的生物质与所消耗的葡萄糖的比率。然而，在本发明的含义中，为了比较所试验的各种方案，特别是在试验部分中，并且为了评估这些改良对产量的影响，本申请公司已经选择通过确定生产45％所产生的脂肪酸(按生物质干w/w计)的产值来合理化该参数。
因此，本发明涉及用于通过分批补料发酵生产小球藻属微藻的方法，该方法特征在于响应于微藻氧消耗的下降来顺序并自动进行碳基源的供应。
该碳基源可以是适合于通过发酵培养微藻的任何碳源。其具体可以选自下组，该组由以下各项组成：葡萄糖、乙酸酯和乙醇、以及这些的混合物。优选地，碳基源是葡萄糖。
在分批补料发酵中，在开始分批发酵之后，也就是说在无供应情况下，通过发酵方法添加碳基源直至获得定义量的生物质。
与现有技术的分批补料方法(通过连续补料进行碳基源供应)相反，在根据本发明的方法中，通过顺序添加或脉冲进行碳基源的供应。
每一次，这些顺序添加或脉冲由在相对的短时间内(优选的是小于10min并且特别优选的是约6min)，添加大量的碳基源的浓缩溶液(优选的是葡萄糖浆)组成，以便获得葡萄汁发酵中所希望的浓度。优选地，在葡萄汁发酵中所希望的浓度是在1和30g/l之间，更具体的是在1和20g/l之间，并且非常具体优选的是在10和20g/l之间。根据特定实施例，在葡萄汁发酵中碳基源的所希望的浓度是约10g/l。在此使用的，术语“约”是指一个值+/-20％、10％、5％或2％。
如将在以下例示的，培养基中的葡萄糖一旦完全消耗并因此该pO2一上升，就用浓缩的葡萄糖溶液进行补料，例如700g/l的葡萄糖溶液，持续少于10分钟的时间段，以便获得发酵培养基中1至20g/l的葡萄糖浓度。随后在消耗剩余葡萄糖的期间停止葡萄糖供应。当消耗后者时，该pO2增加，这触发葡萄糖等的进一步供应。
如以上提及的，这些添加不需要特定的人为干涉，这与连续添加相反，在连续添加期间必须确定葡萄糖补料流速实际对应于菌株的代谢需求(参见图1)。这是因为，一旦已经消耗了葡萄糖，微藻引起的发酵培养基的氧消耗将会突然下降。因此，根据搅拌或空气流速或汽室背压或O2供应的PID(比例积分微分)调节，pO2中的一些％将会大幅上升。在根据本发明的方法中，该上升自动触发葡萄糖供应。
借助泵进行碳基源供应，该碳基源供应的最大流速优选使得可以在少于10分钟内向发酵培养基添加从10至20g/l的碳基源。
根据特定的实施例，该pO2一旦超过阈值，就进行碳基源供应，该阈值是当不限制发酵培养基中碳基源的浓度时，大于所形成pO2值的从1％至100％、从1％至80％、从5％至80％、从10％至80％或优选的是从15％至70％。根据特定的实施例，该pO2一旦超过阈值，就进行碳基源供应，该阈值是当不限制发酵培养基中碳基源的浓度时，大于所形成pO2值的从1％至20％、仍更优选的是从10％至20％并且更具体优选的是约15％。根据另一个特定的实施例，该pO2一旦超过阈值，就进行碳基源供应，该阈值是当不限制发酵培养基中碳基源的浓度时，大于所形成pO2值的从50％至80％、仍更优选的是从60％至70％并且更具体优选的是约65％。
通过举例，非限制性葡萄糖浓度可以是在5和15g/l之间的浓度。当不限制发酵培养基中碳基源的浓度时，pO2的值取决于若干参数，该若干参数包括搅拌或空气流速或汽室背压或O2供应的PID(比例积分微分)调节。这些参数优选的是在整个旨在增加生物质的发酵阶段一直不变。因此，pO2的变动忠诚地反应了微藻氧消耗的变动。
当不限制发酵培养基中碳基源的浓度时，该pO2值通常是从20至40％，优选的是约30％。
根据一个特定实施例，当不限制发酵培养基中碳基源的浓度时，该pO2值是约30％，优选的是30％，并且该触发碳基源供应的阈值是在约35％和约55％，优选的是在35％和55％之间。根据另一个特定实施例，当不限制发酵培养基中碳基源的浓度时，该pO2值是约30％，优选的是30％，并且该触发碳源供应的阈值是约35％，优选的是35％。
优选地，在发酵培养基中碳源已经被完全消耗的时刻与碳基源供应的时刻之间的时间段为小于5分钟，非常具体优选的是小于1分钟。如上所指出，该碳基源的完全消耗导致了氧消耗的突然下降，该氧消耗是借助特定的探针通过测量发酵培养基中pO2的值来进行检测，pO2的增加反映了氧消耗的下降，并且因此反映了培养基中碳源的缺少。
因此，该反应时间使得可以保持该剩余碳源在大于0并小于20g/l的值几乎不变，优选的是大于0并小于10g/l，不具有被葡萄糖限制或抑制代谢的风险。
该微藻可以是适用于分批补料发酵的任何小球藻属物种。根据一个实施例，该微藻选自下组，该组由以下各项组成：原壳小球藻、耐热性小球藻和普通小球藻。优选地，该微藻是原壳小球藻。根据一个特定实施例，该微藻是原壳小球藻UTEX250(美国德克萨斯州大学奥斯汀分校藻种保存库(TheCultureCollectionofAlgae))。
使用以下实例，将获得对本发明的更好理解，这些实例意为说明性的而并非限制性的。
实例
实例1.使用两种供应葡萄糖的方法生产富含脂质的原壳小球藻
所用菌株是原壳小球藻UTEX250(美国德克萨斯州大学奥斯汀分校藻种保存库)
预培养：
-在2L埃伦迈尔烧瓶(Erlenmeyerflask)中的500ml培养基；
-该培养基的组成(以g/l计)：
孵育在以下条件下进行：持续时间：72h；温度：28℃；搅拌：110rpm(伊孚森莫特顿(InforsMultitron)孵育器)。
随后将预培养物转移到一个30L赛多利斯(Sartorius)型发酵罐中。
用于生产生物质的培养物：
该基础培养基如下：
在接种后将发酵罐的初始体积(Vi)调节至7L。最后使其变为15-20L。
用于进行发酵的参数如下：
供应的葡萄糖的形式
习惯上，当葡萄糖的剩余浓度降到10g/l以下时，进行葡萄糖供应，以便保持发酵罐中葡萄糖含量在0和20g/l之间。
从浓缩的700g/l葡萄糖溶液开始进行该供应，使用蠕动泵将该葡萄糖溶液转移至发酵罐中。
根据两种不同的方法管理葡萄糖供应：
1)方案1：连续以手动调节的速率供应葡萄糖(试验1和3)
在这种类型的补料中，该泵连续运行。
因为已经对发酵期间菌株对葡萄糖需求的演化进行建模，所以对泵的流速的模型演化曲线进行编程(参见图1，“％模型泵”曲线)。
然而，因为流速(最大量级为20g/l/h)和葡萄糖累积的量(约1000g/l)是非常高的，在采用的流速和菌株消耗的真实速率之间的轻微的差异(小于该模型的精确度)将快速导致剩余葡萄糖的大幅变动。
因此，如图1所示，在培养期间手动调节通常是有必要的(参见图1，“％实际泵”曲线)，以便保持剩余的葡萄糖在所希望的范围内而不能获得良好的稳定性。
因此，该方法需要由操作员连续控制，并且菌株的代谢有时受限于葡萄糖的可用性。
2)方案2：作为pO2的函数，通过顺序并自动添加供应葡萄糖(试验2和4)
通过根据本发明的方法，凭借一种算法添加葡萄糖是顺序并且自动的，该算法使用专用的探针从发酵培养基中溶解氧的含量(pO2)测量控制泵的运行。
该控制原则呈现于图2中。
当发酵罐中葡萄糖的浓度降低至0g/l时，菌株的氧消耗将强烈下降，这样使得尽管搅拌下降但pO2快速上升，这是通过算法触发的，用于调节pO2。
检测到pO2的上升超越了预定阈值(35％)将触发葡萄糖补料泵以其最大速度启动，持续预定时间(6分钟)，以便促成对应于所选择的浓度的葡萄糖量(10g/l，校正发酵罐的起始体积)。
在该实例中，在葡萄糖被完全消耗和另外添加之间的时间段小于一分钟。
因此，该剩余的葡萄糖将永久保持在大于0并小于10g/l的值，不具有被葡萄糖限制或抑制代谢的风险。
与手动方案相反，在任何时候都没有由于葡萄糖减缓发酵的速率。
此外，该方法是完全自动化的，并且在无需人工监测的情况下运行。
富集脂质的阶段
就一切情况而论，当已经消耗了1000g的葡萄糖时并且当生物质已经达到70g/l的浓度时，用氢氧化钾替换氨水来调节pH。这使得生物质能够累积脂质。
结果：
根据本发明的方案2，也就是说通过顺序并自动添加进行葡萄糖供应，使得可以增加生产力。这是因为用根据本发明的方法，为了获得70g/l的生物质，较少的发酵时间是必需的。该差异可以由如下事实来解释：该菌株本身管理葡萄糖供应，并且因此它的代谢是永不受限的。
此外，用根据本发明的方法，剩余葡萄糖浓度的差异是较低的。
实例2：当pO 2 达到50％饱和度时，脉冲式添加葡萄糖生产富含 脂质的原壳小球藻
培养基和操作条件与实例1的试验1的那些一致：
温度 28℃
pH 使用28％w/w NH3并且然后使用5N KOH，6.8
pO2 30％(使用搅拌维持)
搅拌 最小300rpm
气流速率 15l/min
如实例1，凭借一种算法添加葡萄糖是顺序且自动的，该算法使用专用的探针从测量溶解氧含量(pO2)控制泵运行。
然而，触发葡萄糖添加的pO2阈值在这种情况下更高：50％的饱和度代替35％的饱和度。
因此，也就是说当不限制发酵培养基中碳基源的浓度时，触发阈值67％大于发酵培养基中溶解氧的压力。
呈现于图3的图表给出了一种植入脉冲技术的实例。当发酵罐中葡萄糖浓度下降至约0g/l的值时，该菌株的氧消耗强烈下降，这样使得pO2快速增加。在这种情况下，搅拌保持在400rpm。
检测到pO2的上升超越了50％的饱和度(即，67％多于在葡萄糖受限之前的值)触发了葡萄糖补料泵以其最大速度启动。
这项试验的最终结果：
·持续时间：90h
·生物质：176g/l
·脂质含量：45.1％
因此，尽管用于添加的触发阈值上升(50％的饱和度，相比于实例1中的35％)，在耗尽葡萄糖之后这些脉冲非常快速地进行，并且相比于实例1用于实现所希望浓度的生物质的培养持续时间并没有增加。
附图说明
图1：用手动调节连续补料葡萄糖
图2：通过连续并自动添加进行葡萄糖补料-触发阈值：pO2＝35％(即，当不限制发酵培养基中碳基源的浓度时，16.7％大于所获得的值)。
图3：通过连续并自动添加进行葡萄糖补料–触发阈值：pO2＝50％(即，当不限制发酵培养基中碳基源的浓度时，67％大于所获得的值)。

Claims (13)

1.一种用于通过分批补料发酵生产小球藻属微藻的方法，该方法特征在于响应于微藻氧消耗的下降来顺序并自动进行碳基源供应。
2.如权利要求1所述的方法，其中通过测量发酵培养基中的溶解氧压力(pO2)检测微藻氧消耗的下降。
3.如权利要求2所述的方法，其中当发酵培养基中溶解氧压力(pO2)超过预定义的阈值时，触发了碳基源供应。
4.如权利要求3所述的方法，其中当不限制发酵培养基中碳基源的浓度时，该阈值比形成的pO2值大从1％至100％。
5.如权利要求3或4所述的方法，其中当不限制发酵培养基中碳基源的浓度时，该阈值比形成的pO2值大从10％至80％。
6.如权利要求4或5所述的方法，其中当不限制发酵培养基中碳基源的浓度时，形成的pO2值是从20％至40％，优选的是约30％。
7.如权利要求1到6中任一项所述的方法，其中小球藻属微藻选自下组，该组由以下各项组成：原壳小球藻、耐热性小球藻和普通小球藻。
8.如权利要求1到7中任一项所述的方法，其中该微藻是原壳小球藻。
9.如权利要求1到8中任一项所述的方法，其中该碳基源选自下组，该组由以下各项组成：葡萄糖、乙酸酯、和乙醇，以及这些的混合物。
10.如权利要求1到9中任一项所述的方法，其中该碳基源是葡萄糖。
11.如权利要求1到10中任一项所述的方法，其中在碳源已经被完全消耗的时刻与碳基源供应的时刻之间的时间段为小于5分钟，优选的是小于1分钟。
12.如权利要求1到11中任一项所述的方法，其中该剩余的碳源被永久保持为大于0并小于20g/l的值。
13.如权利要求1到12中任一项所述的方法，其中借助泵进行碳基源供应，该碳基源供应的最大流速使得可以在少于10分钟内向发酵培养基添加从10至20g/l的碳基源。
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