CN1483080A

CN1483080A - 发酵生产d-对羟基苯基甘氨酸和d-苯基甘氨酸

Info

Publication number: CN1483080A
Application number: CNA018212166A
Authority: CN
Inventors: C��A��ɭ; C·A·汤森; M·冈斯奥; U·米勒; J; F·B·J·阿塞马范; T·桑科
Original assignee: DSM Biotech GmbH; DSM NV; Johns Hopkins University
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2000-10-27
Filing date: 2001-10-22
Publication date: 2004-03-17
Anticipated expiration: 2021-10-22
Also published as: DE60122917D1; WO2002034921A2; US20050089974A1; MXPA03003680A; EP1328643B1; CN100569950C; EP1328643A2; AU2002214400A1; WO2002034921A3; ES2271088T3; BR0114966A; ATE338822T1

Abstract

本发明公开了一种新的制备对映体纯形式D－对羟基苯基甘氨酸(D－HPG)或D－苯甘氨酸(D－PG)的发酵方法。形成D－HPG和D－PG的前体取自普通的芳香族氨基酸途径，这些前体转变为对羟基苯乙醛酸或苯乙醛酸，最后通过立体转化D－转氨酶的作用转变为D－HPG或D－PG。

Description

发酵生产D-对羟基苯基甘氨酸和D-苯基甘氨酸

本发明领域

本发明涉及制备对映体纯形式的D-对羟基苯基甘氨酸(D-HPG)和D-苯基甘氨酸(D-PG)的生化方法。本发明还涉及生产D-HPG和D-PG的重组微生物。下文的缩写(H)PG是指HPG和/或PG；需要的情况下提及(H)PG的特定对映异构体。本发明由德国政府和美国政府资助，德国Bundesministerium für Bildung und Forschung(BMBF)BioRegio计划授予的资助号为0311644号，美国国立卫生研究院授予的资助号为RO1 A114937。美国政府对本发明拥有一定权利。

本发明背景

除甘氨酸之外，每种普通的天然氨基酸都以两种可能对映体的其中一种形态存在。氨基酸的两种对映体形式可称为D-型和L-型对映体。可以两种对映体形式存在的化合物的对映体纯度通常以其对映体过量(经常缩写为“e.e.”)表示；e.e.可定义为两种对映体量差值除以量的总和，其商乘以100得到百分比值。对本申请而言，对映体纯是指e.e.至少为90％，优选超过95％，或者甚至更优选超过98％。

D-型和L-型对映体之间的区别在于氨基酸α-碳构象是L-型或D-型甘油醛(一种评价标准)。大多数作用于氨基酸的酶都具有L-特异性结合域，因此，大多数天然蛋白质都只含有L-氨基酸。

但也有些例外，D-氨基酸为微生物细胞所利用而且构成微生物细胞。例如，细菌细胞生产胞壁质前体物质D-谷氨酸和D-丙氨酸，胞壁质是一种典型的细胞壁组分。D-氨基酸通常不是直接产生，而是利用氨基酸特异性消旋酶将L-氨基酸转变为对应的D-氨基酸。消旋酶催化L-氨基酸向D-氨基酸转变，反之亦然。在平衡状态，人们发现了L-对映体和D-对映体的外消旋(50％/50％)混合物，因此，消旋酶不能用作生产对映体纯形式D-氨基酸的最终反应步骤。

对抗菌药物的需求增加导致半合成抗生素的大量生产，其中许多都掺入了旋光性D-氨基酸作为结构单元。例如将D-HPG和D-PG掺入到某些β-内酰胺抗生素(例如阿莫西林和头孢氨苄)中。

为低成本有效地生产这些抗生素，需要利用有商业吸引力方法制备对映体纯形式的D-(H)PG。但是，由于D-(H)PG的复杂结构以及分子中存在手性中心，所以用常规化学方法生产D-(H)PG一般包括多个用于生产D-型和L-型(H)PG外消旋混合物的步骤，然后需要另外的旋光拆开步骤，以获得对映体纯形式的产物。额外的工艺步骤增加了工艺成本，使整个方法失去了商业吸引力。

生产精细化学药品的发酵法通常以能够将相对廉价的原料转变为产物而具有商业吸引力为人所知。发酵法包括的反应通常具有高度的区域选择性和立体选择性。因此，这些反应能以相对简单的工艺生产复杂的对映体纯产物。为此，在先有技术中对发酵生产各种精细化学药品已进行了无数的尝试。

已经描述了以使用大肠杆菌菌株的发酵法生产D-苯丙氨酸的方法(EP 0736604A2)，所述大肠杆菌包含球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)立体保守D-转氨酶。“立体保守D-转氨酶”应当理解为专一地由D-型氨基供体生产D-型氨基酸的D-转氨酶。另一方面，“立体转化D-转氨酶”应当定义为使用L-型氨基供体并专一生产D-型氨基酸的转氨酶。例如，L-Glu或L-Asp可用作生产D-PG或D-HPG的氨基供体。

为了提供用于体内立体-保守D-特异性转氨酶反应的D-型氨基供体，细胞中必须存在催化L-氨基酸转变为D-氨基酸的消旋酶编码基因，反之亦然。因此，D-型氨基供体由L-型对映体胞内产生。D-型氨基供体的胞内浓度是所述分子(D-型+L-型)总胞内浓度的一半或一半以下。因为D-型氨基供体(离析物)浓度的降低导致转氨反应平衡向离析物一侧移动，所以氨基供体的外消旋混合物(即组合使用消旋酶和立体保守转氨酶)不适于有效生产需要的D-氨基酸。

另外，将消旋酶克隆入细胞劳动力昂贵，增加了细胞的“代谢负担”，因为细胞不得不合成其它的酶。用于生物合成消旋酶所消耗的前体代谢物和能量不能再用于细胞生长、产物形成等。

本发明的目标是使改进的发酵方法可用于生产D-HPG和D-PG，这种方法克服了上述缺点。

该目标令人惊奇地实现了，其中发酵方法中的丙酮酸苯酯(PP)或对羟基丙酮酸苯酯(HPP)取自芳香族氨基酸途径，分别转变为扁桃酸(MA)或对羟基扁桃酸(HMA)，MA或HMA分别转变为苯乙醛酸(PGL)或对羟基苯乙醛酸(HPGL)，最后通过立体转化转氨酶的作用分别转变为D-PG或D-HPG。

立体转化转氨酶在发酵方法中的应用提供了明显的优势：不需要消旋酶活性，立体转化转氨酶使用天然L-型氨基供体(当通过消旋酶由L-对映体产生对应的D-对映体时，胞内存在的L-型氨基供体的浓度至少是所述D-对映体的两倍)。发酵法的应用使得可以利用廉价原料(例如葡萄糖和其它糖)生产D-(H)PG。

在本发明的含义中，发酵(和发酵法)应当理解为以下的过程：以合适的培养基培养微生物、通过细胞组分的催化活性或自发性化学反应将合适的培养基组分转变为产物，并由培养液和/或生物体本身获得产物。

在本发明的含义中，合适的培养基应当理解为微生物可以在其上生长、增殖的物质混合物和/或可以转变为目的产物的物质混合物。

在本发明的一个优选实施方案中，用于发酵的微生物选自一组比通常观察到的野生型菌株更有效供给HPP和/或PP(在HPP和/或PP取自各自代谢库的情况下)的微生物。选自所述微生物组的微生物应当被认为是对HPP和/或PP具有“改进的生产能力”，并“提供HPP和/或PP的效率更高”。

应用提供HPP和/或PP的效率更高的微生物对有效生产D-HPG或D-PG很重要，因为在一系列反应中，不仅是系列中最慢的反应控制反应速率，而且每个酶反应都在某种程度上控制反应速率。因此，葡萄糖转化为HPP和/或PP也对最终产物D-HPG或D-PG的总产量有影响。

适于增加HPP和PP在所述微生物中效率的方法包括选择显示有益自发突变的微生物、选择由经典菌株改进程序(包括随机诱变)演化出的微生物以及选择由应用重组DNA技术产生的生产能力改进的微生物。例如，适于增加HPP和PP效率的方法可为引入关键酶的反馈抗性突变体或过表达一种或几种途径酶，如Berry综述(1996，TIBTECH，14：250-256)。应用重组DNA技术也可以直接引入磷酸烯醇丙酮酸非依赖性糖吸收系统(WO 98/18936)、去除磷酸转移酶系统(PTS)(Berry，1996，TIBTECH，14：250-256)和/或通过修饰对胞内磷酸烯醇丙酮酸浓度起作用的反应而增加磷酸烯醇丙酮酸的效率(Berry，1996，TIBTECH，14：250-256)。应用重组DNA技术也可以直接引入增加的胞内转酮酶和/或转醛酶活性(WO 98/18936)。

另一种适于提供HPP和/或PP的效率更高的方法是在发酵培养基中分别提供L-酪氨酸和L-苯丙氨酸。在单步转氨酶反应中微生物容易将L-酪氨酸转变为HPP，而容易将L-苯丙氨酸转变为PP。

在一个优选的实施方案中，按照本发明的微生物在对羟基扁桃酸合酶(p-HmaS)催化的单步酶转化中将PP转变为MA和/或将HPP转变为HMA。Choroba等(2000，J.Am.Chem.Soc.，122(22)：5389-90)描述了用称为p-HmaS的酶将HPP转化为HMA。

使用单个酶将HPP或PP转化为HMA或MA的优势在于：在进行相同的整体转化时，单个酶的克隆和体内活性确定通常比多个酶的克隆和活性确定容易。

另一方面，按照本发明的微生物以一系列反应将PP转变为MA和/或将HPP转化为HMA，所述反应包括由PP或HPP分别例如转化为苯乙醛或对羟基苯乙醛、再分别转化为乙酸苯酯或对羟基乙酸苯酯、再分别转化为MA或HMA的反应。相信该系列反应是一条可能的代谢途径，因为Krings等(1996，Journal of Biotechnology，51：123-129))在担子菌的苯丙氨酸降解中观察到该途径。

按照本发明的微生物，不考虑其生产HMA或MA的途径，分别通过扁桃酸脱氢酶和/或对羟基扁桃酸脱氢酶的酶活性将MA转化为PGL和/或将HMA转化为HPGL。或者，所述微生物分别通过氧依赖性扁桃酸氧化酶和/或氧依赖性对羟基扁桃酸氧化酶的酶活性将MA转化为PGL和/或将HMA转化为HPGL。按照本发明的微生物还能够通过立体转化转氨酶的作用将HPGL和PGL分别转化为D-HPG和D-PG。

本发明还涉及通过在合适的培养基中培养所述重组细胞，并由培养液或微生物自身获得产物，产生D-(H)PG。

本发明还涉及能够分泌可检测量的D-HPG和/或D-PG并包含酶编码基因的重组微生物(即重组细胞)，其中所述酶在单一步骤中和/或通过组合和序贯作用催化HPP转变为HMA和/或PP转变为MA、HMA转变为HPGL和/或MA转变为PGL，以及HPGL转变为D-HPG和/或PGL转变为D-PG，最后一步由立体转化D-氨基转移酶作用催化。

值得注意的是，Wiyakrutta和Meevootisom(1997，Journal ofBiotechnology，55：193-203)描述了使用立体转化氨基转移酶生产D-PG和D-HPG。但是，他们未考虑全细胞发酵法。相反，这些作者提及使用纯化酶的反应。此外，Taylor等(1998，TIBTECH，16：412-418)提及PGL和HPGL离析物与终产物D-PG和D-HPG的价值相比非常昂贵。因此，这些参考文献未提出立体转化氨基转移酶对生产D-HPG或D-PG的任何切实可行的应用。

而且，应该预期到的是，将HPGL或PGL的发酵途径和立体转化D-氨基转移酶的体内酶活性组合在一起限制了成功的机会，因为各个酶的最优pH不匹配。据报道大肠杆菌细胞的胞内pH在7.4-7.8的范围内(Neidhardt等，1996，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌，Cellularand molecular biology，第1卷，96章，1539页，ASM Press，Washington，D.C.)。但是，据Wiyakrutta和Meevootisom(参见上文)报道，立体转化氨基转移酶的最优pH为9-10，于中性pH时活性非常低。因此，人们预期立体转化氨基转移酶在大肠杆菌细胞中的体内活性不足以有效生产D-HPG或D-PG。

除了最优pH不匹配之外，当不同生物的酶在宿主细胞中组合成新代谢途径时还可预见到其它几个问题。新引入酶的亲和性可能与胞内代谢物浓度非常不同。而且，外源酶的稳定性可能由于外源蛋白对胞内蛋白酶的高度敏感性而非常低。新构建途径的中间体自身可能不稳定或被宿主细胞原有酶代谢。正确翻译的氨基酸链的不合适折叠或可能阻碍外源酶有效功能性表达的密码子选择差异也可以引起外源酶功能性表达的问题。

尽管预计在构建新代谢途径时有众多问题，但令人惊奇的是，我们发现以本发明方法通过重组微生物可以生产D-HPG和D-PG。

最后，本发明还涉及包含至少一种基因的重组质粒，所述基因序列对应于本申请下文公开的[SEQ ID：NO.9]和/或[SEQ ID：NO.15]和/或[SEQ ID：NO.21]中的任一种，或者与这些序列中的任一种至少80％、优选至少90％、最优选至少95％同源的同源序列。

在以下实施例描述过程中，本发明的其它特征将更会显而易见。

一般方法

标准分子克隆技术如质粒DNA分离、凝胶电泳、核酸的酶促限制修饰、大肠杆菌转化等，都按照Sambrook等，1989，“MolecularCloning：a laboratory manual”，Cold spring Harbor Laboratories，ColdSpring Harbor，NY所述实施。合成寡脱氧核苷酸得自MWG-BiotechAG(Ebersberg，Germany)、Sigma-Genosys(The Woodlands，TX，USA)和LifeTechnologies(Paisley，Scotland，UK)。DNA序列分析使用染料标记双脱氧终止子的链终止法，由BaseClear(Leiden，TheNetherlands)、GATC Biotech AG(Konstanz，Germany)和Johns HopkinsUniversity School of Medicine Biosynthesis and Sequencing Facility(Baltimore，MD，USA)进行。粗提物的蛋白浓度用Bradford试剂按照供应商的说明于595nm(Roth，Karlsruhe，Germany)测定。实验部分I(实施例1-19)：编码活性的相关单个基因的克隆和确定实施例1：构建质粒pBAD-Ao-HmaS、pBAD-Ao-HmaO、pBAD- Sc-HmaS、pBAD-Sc-HmaO

东方诺卡氏菌(Amycolatopsis orientalis)NRRL 18098(美国专利第5,843,437号)得自ARS(农业研究局)专利培养物保藏中心，Peoria，Illinois，USA。

在1％葡萄糖、0.5％酵母提取物(Difco，Detroit，Michigan，USA)、2％淀粉、0.1％酪蛋白氨基酸(Difco)、NaOH调节至pH7.5的溶液中于28℃培养东方诺卡氏菌。在含3g/l酵母提取物(Difco)、5g/l蛋白胨(Difco)、3g/l麦芽提取物(Oxoid，Basingstoke，UK)、10g/l葡萄糖、340g/l蔗糖的YE-ME培养基中于28℃培养John Innes Institute，Norwich(UK)的M.J.Bibb教授惠赠的天蓝色链霉菌A3(2)(Streptomyces coelicolor)。灭菌后加入10g/l甘氨酸和5mM MgCl₂。

通过盐析法(Pospiech and Neumann，1995，Trends Genet.11：217-218)分离东方诺卡氏菌和天蓝色链霉菌的基因组DNA。

将天蓝色链霉菌和东方诺卡氏菌的HmaS和HmaO基因克隆在表达载体pBAD/Myc-HisC(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)中。通过翻译起始(ATG)融合和利用其原有的终止密码子克隆基因。1.1构建质粒pBAD-Ao-HmaS

使用以下引物：5′-GTCCAC GGTCTCC CATGCAGAATTTCGAGAT-3′[SEQ ID：No.1](下划线为Bsa I识别切割位点)和5′-ACATCCC AAGCTTCACGTTCGAGGTC-3′[SEQ ID：No.2](下划线为Hind III切割位点)，通过PCR由东方诺卡氏菌NRRL 18098染色体DNA(保藏号AJ223998的核苷酸14957-16030；扩增区为核苷酸14957-16060)扩增含对羟基扁桃酸合酶可读框(ORF)的1131bp片段。

本申请上下文中使用的所有寡核苷酸序列表见本文附件4。

通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增片段的正确大小，并由该凝胶纯化所述片段。用酶Bsa I和Hind III消化所述片段，以产生粘性末端。用Nco I和Hind III消化质粒pBAD/Myc-HisC。随后连接两种片段，并用于转化化学感受态大肠杆菌Top10细胞(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)。在含100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化体。将显示正确插入序列(通过测序确定)的质粒命名为pBAD-Ao-HmaS，该质粒按照布达佩斯条约已于2000年10月23日保藏于Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen，Braunschweig，Germany(DSMZ)，保藏号为DSM 13786，将该质粒用于进一步的研究。1.2构建质粒pBAD-Ao-HmaO

使用以下引物：5′-CGCTCGG TCATGACGTACGTTTCCCTG-3′[SEQ ID：No.3](下划线为BspH I切割位点)和5′-ACGAAG AAGCTTATCAAACAACCCCCAG-3′[SEQ ID：No.4](下划线为Hind III切割位点)，通过PCR由东方诺卡氏菌NRRL 18098染色体DNA(保藏号AJ223998的核苷酸16027-17100；扩增区为核苷酸16027-17101)扩增含对羟基扁桃酸氧化酶ORF的1096bp片段。

通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增片段的正确大小，并由该凝胶纯化所述片段。

用酶BspH I和Hind III消化所述片段，用Nco I和Hind III消化质粒pBAD/Myc-HisC。连接两种片段，并引入大肠杆菌Top10细胞。在含100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化体。将显示正确插入序列(通过测序确定)的质粒称作pBAD-Ao-HmaO，该质粒按照布达佩斯条约已于2000年10月23日保藏于DSMZ，保藏号为DSM13791，将该质粒用于进一步的研究。1.3构建质粒pBAD-Sc-HmaS

使用以下引物：5′-ATGCCGCCCAGTGACATCGCGTACGC-3′[SEQ ID：No.5]和5′-CCCTC GGTACCAGGTCATCGGCCGGCCACTTCC-3′[SEQ ID：No.6](下划线为Kpn I限制位点)，通过PCR由天蓝色链霉菌A3(2)菌株M145染色体DNA(由保藏号AL035640的核苷酸1418-2533编码；扩增区为核苷酸1415-2494)扩增含对羟基扁桃酸合酶ORF的1091bp片段。

通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增片段的正确大小，并由该凝胶纯化所述片段。按照Dietmaier等(1993，Nucleic Acids Res.21，3603-3604)所述将扩增片段克隆入载体pBAD/Myc-HisC的Nco I/Kpn I位点。

通过电穿孔将获得的质粒导入大肠杆菌Top10细胞中。在含100mg/l羧苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化体。

收集所有由转化体产生的菌落，并将获得的细胞悬浮液用于质粒DNA分离。用Hind III消化总质粒DNA，并在琼脂糖凝胶上分离。由凝胶中分离出线性形式的为目标质粒的5kb DNA片段，再连接并通过电穿孔导入化学感受态大肠杆菌Top10细胞中。

在含100mg/l羧苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化体。

显示正确插入序列(通过测序确定)的质粒称作pBAD-Sc-HmaS，该质粒按照布达佩斯条约于2000年10月23日保藏于DSMZ，保藏号为DSM13790，将该质粒用于进一步的研究。1.4构建质粒pBAD-Sc-HmaO

使用以下引物：5′-ATGCGGGAGCCGCTCACGCTCGAC-3′[SEQID：No.7]和5′-CCAACT GGTACCTGGTCATCCGTGGCTCCTGTCTCG-3′[SEQID：No.8](下划线为Kpn I限制位点)，通过PCR由天蓝色链霉菌A3(2)菌株M145染色体DNA(保藏号AL035640的核苷酸135-1268；扩增区为核苷酸132-1267)扩增含对羟基扁桃酸氧化酶ORF的1149bp片段。

通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增片段的正确大小，并由该凝胶纯化所述片段。按照Dietmaier等(1993，Nucleic Acids Res.21，3603-3604)所述将扩增片段克隆入载体pBAD/Myc-HisC的Nco I/Kpn I位点，随后将将获得的质粒导入大肠杆菌Top10细胞中。在含100mg/l羧苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化体。

分离所有转化体的质粒DNA，用Hind III消化，并在琼脂糖凝胶上分离。由凝胶中分离出线性形式的为目标质粒的5.2kb DNA片段，再连接并导入化学感受态大肠杆菌Top10细胞中。在含100mg/l羧苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化体。

显示正确插入序列(通过测序确定)的质粒称作pBAD-Sc-HmaO，该质粒按照布达佩斯条约已于2000年10月23日保藏于DSMZ，保藏号为DSM 13789，将该质粒用于进一步的研究。实施例2：由东方诺卡氏菌和天蓝色链霉菌表达对羟基扁桃酸合酶和对羟基扁桃酸氧化酶

在含100mg/l羧苄青霉素的50ml LB培养基中于30℃培养携带质粒pBAD-Ao-HmaS或pBAD-Sc-HmaS(对于对羟基扁桃酸合酶)和质粒pBAD-Ao-HmaO或pBAD-Sc-HmaO(对于对羟基扁桃酸氧化酶)的大肠杆菌Top10菌株的单菌落。于OD_620nm为1.2时加入0.002％(终浓度)阿拉伯糖诱导所述细胞。3.5小时后收获细胞，并用pH7.4的1mM MgSO₄清洗。于-20℃冷冻等份的清洗细胞待以后使用。作为对照，相应地处理携带质粒pBAD/Myc-HisC的大肠杆菌Top10。

临用前用pH7.5的200mM磷酸钾缓冲液超声处理制备粗提物。实施例3：分析东方诺卡氏菌和天蓝色链霉菌的对羟基扁桃酸合酶 3.1对对羟基丙酮酸苯酯的活性

3ml的测定混合物包含200mM磷酸钾缓冲液pH7.5、5mM对羟基丙酮酸苯酯、10％乙醇(使用50mM对羟基丙酮酸苯酯母液的96％乙醇溶液)、44mM抗坏血酸盐、0.3mM FeSO₄和至终浓度为0.6mg/ml可溶性蛋白的无细胞提取物。对照实验使用煮沸的提取物。

通过加入HPP开始测定，于28℃1小时后通过加入0.1ml 1N HCl至0.5ml等份的反应系统中终止测定。通过HPLC分析样品并于215nm检测。使用Nucleosil-120-5-C18柱(250×4mm，Macherey-Nagel，Düren，Germany)。用洗脱液A(50mM H₃PO₄)和洗脱液B(100％甲醇)洗脱该柱。梯度：0-5分钟，0％ B；5-37分钟，0％-90％ B；37-42分钟，90％ B；42-50分钟，90％-0％ B；50-55分钟，0％ B。流速为1.0ml/分钟，柱温设定在30℃。

得自大肠杆菌/pBAD-Ao-HmaS的无细胞提取物在1小时内生产65mg/l的对羟基扁桃酸，而得自大肠杆菌/pBAD-Sc-HmaS的提取物生产35.6mg/l的对羟基扁桃酸。对照实验(大肠杆菌/pBAD/Myc-HisC的粗提物和煮沸的提取物)未产生对羟基扁桃酸。3.2对丙酮酸苯酯活性

3ml的测定混合物包含200mM磷酸钾缓冲液pH7.5、5mM丙酮酸苯酯、44mM抗坏血酸盐和0.3mM FeSO₄以及终浓度为0.6mg/ml可溶性蛋白的无细胞提取物。

通过加入无细胞提取物于28℃开始测定，通过加入0.1ml 1NHCl至0.5ml等份的反应系统中终止测定。如上所述通过HPLC分析样品。煮沸的提取物和大肠杆菌/pBAD/Myc-HisC的粗提物都用于对照实验。

使用得自大肠杆菌/pBAD-Ao-HmaS的无细胞提取物在1小时内生产63mg/l的扁桃酸。得自大肠杆菌/pBAD-Sc-HmaS的无细胞提取物在6小时内生产25mg/l的扁桃酸。对照实验未检测到扁桃酸。实施例4：分析东方诺卡氏菌和天蓝色链霉菌的对羟基扁桃酸氧化酶4.1对D，L-对羟基扁桃酸的活性

将含0.5-0.8mg蛋白的100μl粗提物与总体积1ml的200mM磷酸钾缓冲液pH7.5、2mM D，L-对羟基扁桃酸、20mg/l过氧化氢酶温育。用分光光度计于340nm监测对羟基扁桃酸的氧化。为消除对羟基扁桃酸的非特异性氧化，使用没有无细胞提取物的测定混合物进行对照测定。

大肠杆菌Top10/pBAD-Sc-HmaO提取物的比活为30nmol/分钟/mg总蛋白，而大肠杆菌Top10/pBAD-Ao-HmaO的比活为5nmol/分钟/mg总蛋白。4.2对(S)-或(R)-扁桃酸的活性

3ml测定混合物包含100mM磷酸钾缓冲液pH7.5、2mM(S)-或(R)-扁桃酸、20mg/l过氧化氢酶以及终浓度为0.6mg/ml可溶性蛋白的无细胞提取物。

通过加入无细胞提取物开始测定，并通过向0.5ml等份的反应系统中加入0.1ml 1N HCl终止测定。以实施例3的方法通过HPLC分析样品。对照实验使用煮沸的提取物。

使用(R)-扁桃酸作为底物，得自大肠杆菌/pBAD-Ao-HmaO或大肠杆菌/pBAD-Sc-HmaO的无细胞提取物未生产苯乙醛酸。用(S)-扁桃酸作为底物，使用大肠杆菌/pBAD-Ao-HmaO的无细胞提取物在1小时内生产9mg/l的苯乙醛酸，而用得自大肠杆菌/pBAD-Sc-HmaO的无细胞提取物在1小时内生产27mg/ml的苯乙醛酸。实施例5：构建质粒pMAL-Nu-HmaS和pMAL-Nu-HmaO

由美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，USA)获得均匀诺卡氏菌津山亚种(Nocardia uniformis subsp.tsuyamanensis)ATCC21806。培养均匀诺卡氏菌津山亚种，按照J.Biol.Chem.1998，273，30695-30703所述分离基因组DNA。将基因及其原有终止密码子克隆入pMAL-c2表达载体(New England BioLabs，Beverly，MA，USA)，获得麦芽糖结合蛋白融合蛋白。还将HmaS克隆入pET-29b(Novagen，Madison，WI，USA)作为C-末端His-6标记融合体。5.1构建质粒pMAL-Nu-HmaS

使用以下引物：5′A GAATTCGCGGCACAGGCAGGCAGCG-3′[SEQ ID：No.11](下划线为EcoRI切割位点)和5′-TTAT AAGCTTTCAGCGCTCGGTCCGGTGGC-3′[SEQ ID：No.12](下划线为Hind III切割位点)，通过PCR由均匀诺卡氏菌津山亚种染色体DNA(附件1给出的SEQ ID：No.9的核苷酸52-1086，编码SEQ ID：No.10的蛋白；扩增区为核苷酸55-1089)扩增含对羟基扁桃酸合酶可读框(ORF)的1052bp片段。

通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增片段的正确大小，并由该凝胶纯化所述片段。用EcoR I和Hind III消化所述片段。用EcoR I和Hind III消化质粒pMAL-c2，随后连接两种片段，并通过电穿孔转化入大肠杆菌TB1细胞(New England BioLabs，Beverly，MA，USA)。在含100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化体。将显示正确插入序列(通过测序确定)的质粒命名为pMAL-Nu-HmaS，该质粒按照布达佩斯条约已于2000年10月27日保藏于ATCC，专利保藏物名称为PTA-2639，将该质粒用于进一步的研究。5.2构建质粒DET-Nu-HmaS

使用以下引物：5′-TATA CCATGGCGGCACAGGCAGGC-3′[SEQID：No.13](下划线为Nco I切割位点)和5′-TTAT AAGCTTGCGCTCGGTCCGGTGGC-3′[SEQ ID：No.14](下划线为Hind III切割位点)，通过PCR由均匀诺卡氏菌津山亚种染色体DNA(附件1给出的SEQ ID：No.9的核苷酸52-1086，编码SEQ ID：No.10的蛋白；扩增区为核苷酸52-1086)扩增含对羟基扁桃酸合酶可读框(ORF)的1051bp片段。

通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增片段的正确大小，并由该凝胶纯化所述片段。用Nco I和Hind III消化所述片段。用Nco I和Hind III消化质粒pET-29b，随后连接两种片段，并通过电穿孔转化入大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Novagen，Madison，WI，USA)中。在含50mg/l卡那霉素的LB琼脂平板上选择转化体。将显示正确插入序列(通过测序确定)的质粒命名为pET-Nu-HmaS，该质粒按照布达佩斯条约已于2000年10月27日保藏于ATCC，专利保藏物命名号为PTA-2638，将该质粒用于进一步的研究。5.3构建质粒pMAL-Nu-HmaO

使用以下引物：5′-A GAATTCGGCGTCCGCAACTCCGCAG-3′[SEQ ID：No.17](下划线为EcoR I切割位点)和5′-AAT AAGCTTTCAGGGCGCACCTCGCC-3′[SEQ ID：No.18](下划线为Hind III限制位点)，通过PCR由均匀诺卡氏菌染色体DNA(附件2给出的SEQ ID：No.15的核苷酸50-1177，编码SEQ ID：No.16的蛋白；扩增区为核苷酸53-1180)扩增含对羟基扁桃酸氧化酶ORF的1144bp片段。

通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增片段的正确大小，并由该凝胶纯化所述片段。用EcoR I和Hind III消化所述片段和质粒pMAL-c2。连接两种片段，并通过电穿孔转化入大肠杆菌TB1细胞。在含100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化体。将显示正确插入序列(通过测序确定)的质粒命名为pMAL-Nu-HmaO，该质粒按照布达佩斯条约已于2000年10月27日保藏于ATCC，专利保藏物命名号为PTA-2637，将该质粒用于进一步的研究。实施例6：由均匀诺卡氏菌制备对羟基扁桃酸合酶和对羟基扁桃酸氧化酶 6.1对羟基扁桃酸合酶(第一种方法)和对羟基扁桃酸氧化酶的表达

用含100mg/l氨苄青霉素的100ml LB培养基(+0.02％葡萄糖)于37℃培养携带质粒pMAL-Nu-HmaS或pMAL-Nu-HmaO的大肠杆菌TB1菌株的单菌落。于OD_600nm为0.6时加入0.3mM(终浓度)的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导所述细胞。3小时后收获细胞，并重悬浮在缓冲液(HmaO为20mM Tris-HCl pH7.4、200mM NaCl、1mMEDTA，而HmaS为20mM Tris-HCl pH7.5、10mM EDTA、1％ TritonX-100)中，于-20℃冷冻待以后使用。作为对照，同样地处理含质粒pMAL-c2的大肠杆菌TB1细胞。6.2对羟基扁桃酸合酶(第一种方法)和对羟基扁桃酸氧化酶的纯化

在临使用前通过超声处理制备重悬浮沉淀的粗提物。通过离心去除提取物中的不溶性细胞碎片，将获得的无细胞提取物上样于直链淀粉树脂柱。通过用含10mM麦芽糖的缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.4、200mM NaCl、1mM EDTA)洗脱获得纯度≥80％的目的蛋白。将部分纯化的提取物用于进一步的研究。6.3对羟基扁桃酸合酶的表达(第二种方法)

用含50mg/l卡那霉素的100ml LB培养基于37℃培养携带质粒pET-Nu-HmaS的大肠杆菌BL21(DE3)菌株的单菌落。于OD_600nm为0.6时加入1mM(终浓度)的IPTG诱导所述细胞。4小时后收获细胞，并重悬浮在缓冲液(50mM磷酸钠pH8、300mM NaCl、10mM咪唑)中，于-20℃冷冻待以后使用。6.4对羟基扁桃酸合酶的纯化(第二种方法)

在临使用前通过超声处理制备粗提物。通过离心去除提取物中的不溶性细胞碎片，将获得的无细胞提取物分批与Ni-NTA树脂(Qiagen，Valencia，CA，USA)以200rpm温育1小时。将CFE-树脂浆倾注到柱中，通过用含浓度递增的咪唑的缓冲液(50mM磷酸钠pH8、300mM NaCl)洗脱获得纯度≥90％的目的蛋白。将部分纯化的提取物用于进一步的研究。实施例7：均匀诺卡氏菌对羟基扁桃酸合酶活性

0.4ml测定混合物包含50mM Tris-HCl缓冲液pH8.0、5mM对羟基丙酮酸苯酯、0.7％乙醇(使用50mg/ml对羟基丙酮酸苯酯母液)、0.5mM二硫苏糖醇(DTT)、0.1mM抗坏血酸盐、0.025mM FeSO₄和部分纯化的HmaS。通过加入HmaS开始测定，于30℃1小时后通过于100℃热失活5分钟终止测定。通过离心去除变性蛋白，在用HmaO的相应测定中使用0.35ml的反应系统。该测定通过加入0.1mg/ml的HmaO开始，并根据对羟基扁桃酸氧化为HPGL而观测332nm的吸光度增加。对照实验未产生HPGL。实施例8：均匀诺卡氏菌对羟基扁桃酸氧化酶活性

0.5ml测定混合物包含50mM Tris-HCl缓冲液pH8.0和2mM(R，S)-对羟基扁桃酸。加入终浓度为0.1mg/ml的部分纯化的HmaO开始测定。用分光光度计于332nm监测对羟基苯乙醛酸(HPGL)的形成。在没有底物时未观测到HPGL形成。HmaO比活测定为240μmol/分钟/mg。

在使用由均匀诺卡氏菌纯化的野生型酶的单独实验中，所述氧化酶显示出黄素依赖性和(S)-扁桃酸特异性。实施例9：构建质粒pGEM-mdlB和pGEM-Bldm

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ATCC 12633得自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，USA)。用LB培养基(10g/l胰蛋白胨(Difco)、5g/l酵母提取物(Difco)、5g/l NaCl)于28℃培养恶臭假单胞菌。在过夜培养后使用Ausubel等(1990，Current Protocols in MolecularBiology，第2、3、4章，1-9步，Whiley-Interscience，New York)描述的标准方法分离这种恶臭假单胞菌菌株的基因组DNA。用RNA酶(20mg/l)处理粗染色体DNA，随后用苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)处理，以去除蛋白。

使用Taq DNA-聚合酶以及以下引物：5′-ACTCGCCAAGGGCTATGGTGTCC-3′[SEQ ID：No.19]和5′-GCCAACAGTTCCAACAGCGGTGTG-3′[SEQ ID：No.20]，通过PCR由恶臭假单胞菌ATCC 12633染色体DNA(由保藏号J05293的核苷酸2251-3432编码；扩增区为核苷酸2110-3518)扩增含(S)-扁桃酸脱氢酶ORF的1409bp片段。

通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增片段的正确大小。

将扩增片段克隆入载体pGEM-T(Promega，Madison，Wisconsin，USA)，以其转化大肠杆菌XL1-Blue MRF′(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。在含100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化体。

对4种不同克隆的插入片段测序，结果揭示全部克隆都以GC代替了位置2291/2292的CG。其中一个没有其它突变的克隆命名为pGEM-Bldm，按照布达佩斯条约已于2000年10月23日保藏于DSMZ，保藏号DSM 13787。该原始保藏物已错误地命名为pGEM-mdlB，但正确地应命名为pGEM-Bldm，将该保藏物用于进一步的克隆实验。另一个克隆具有一个另外的沉默突变，命名为pGEM-mdlB，用于证实目的活性。要指出的是，在所述后一种质粒中，扁桃酸脱氢酶基因的方向与载体携带的lac启动子的方向相匹配。实施例10：由恶臭假单胞菌表达(S)-扁桃酸脱氢酶

用含100mg/l羧苄青霉素和1mM IPTG的LB培养基培养大肠杆菌XL-1 MRF′/pGEM-mdlB。于37℃培养16小时后，离心收获细胞，并重悬浮在50mM磷酸钾缓冲液pH6.8中。通过超声处理破碎细胞，离心(5,000g，10分钟，4℃)去除未破碎的细胞和细胞碎片。最后，通过超离心步骤(1小时，200.000g，4℃)收集细胞膜，然后重悬浮在4ml 50mM磷酸钾缓冲液pH6.8中，并保存在冰上。

通过改良Lowry蛋白测定法(Sandermann and Strominger，1972，J.Biol.247：5123-5131)测定细胞膜蛋白浓度，在所述测定中向Lowry试剂A中加入1％SDS。细胞膜部分包含约1mg/ml的蛋白。实施例11：(S)-扁桃酸脱氢酶活性证明

利用Hegeman法(1996，J.Bacteriol.91：1140-1154)，使用2，6-二氯苯酚-靛酚作为受体染料以分光光度计测定(S)-扁桃酸脱氢酶活性。使用(S)-或(R)-扁桃酸作为底物检测(S)-扁桃酸脱氢酶的立体选择性。而且还分析(S)-扁桃酸脱氢酶是否也可以把羟基扁桃酸作为底物。

用(S)-扁桃酸和(R，S)-对羟基扁桃酸作为底物，大肠杆菌XL-1MRF′/pGEM-mdlB的细胞膜部分600nm的吸光度在5分钟内产生可检测的变化。用(R)-扁桃酸未观测到吸光度变化。实施例12：分离D-对羟基苯基甘氨酸转氨酶(HpgAT)基因

由恶臭假单胞菌NCIMB 12565(国立工业和海洋微生物保藏中心，Aberdeen，Scotland，UK)分离D-对羟基苯基甘氨酸转氨酶基因。使用Ausubel等(1990，Current Protocols in Molecular Biology，第2、3、4章，1-9步，Whiley-Interscienc，New York)描述的标准方法由指数生长细胞(OD_620nm 1.9)提取DNA。用RNA酶(20mg/l)处理粗染色体DNA，随后用苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)处理，以去除蛋白。然后用Sau3A I部分消化染色体DNA。将消化的DNA上0.6％的琼脂糖凝胶，分离出4-10kb大小的DNA片段。

按照Invitrogen的方法通过用BamHI消化1μg pZErO-2(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)制备载体DNA。

用T4 DNA连接酶连接载体DNA和恶臭假单胞菌染色体DNA片段。连接混合物用于转化化学感受态大肠杆菌Top10细胞。将转化体平板接种在含50mg/l卡那霉素的LB培养基上。总共获得5000个菌落，它们构成原始基因文库。将全部5000个菌落倒入补加50mg/l卡那霉素的LB培养基中。加入甘油至终浓度为15％后，将原始基因库以1ml等份储存于-80℃。

在微量滴定板中用150μl补加50mg/l卡那霉素的LB培养基制备1800个菌落的培养物。将培养物于28℃过夜培养，用Eppendorf5804R离心机(Eppendorf，Hamburg，Germany)离心收获培养物。用50mM KPO₄缓冲液pH7.0清洗细胞，并重悬浮在180μl反应混合物(100mM磷酸钾pH7.0、15mM α-酮戊二酸盐、0.1mM吡哆醛磷酸和0.5％v/v Triton X-100)中。

通过加入D-对羟基苯基甘氨酸至终浓度为5mM开始反应。使用Optimax微量滴定板读数器(Molecular Devices，Sunnyvale，California，USA)监测20分钟内每个孔的OD_340nm。相应地处理阴性对照(未转化的大肠杆菌Top10)和阳性对照(恶臭假单胞菌NCIMB12565)。

在筛选的1800个克隆中，一个克隆由于形成HPGL而显示相对于阴性对照OD_340m显著增加。该克隆包含的恶臭假单胞菌D-HpgAT基因位于一个12kb质粒pZErOTagp上。对pZErOTagp测序显示出D-HpgAT基因的完整核苷酸序列。如附件3所示，[SEQ ID：No.21，编码SEQ ID：No.22的蛋白]的核苷酸51-1376列出了该基因序列。实施例13：构建质粒pBAD-HpgAT

使用PCR将恶臭假单胞菌D-对羟基苯基甘氨酸转氨酶基因亚克隆入pBAD/Myc-HisC。使用5′-GTGCAC GGTCTCG CATGTCTATTTATAGCGATTATGAACGTAAAAC-3′[SEQ ID：No.23]和5′-GTGCAC GGTCTCC TCGAGTTAGCCCAGGAGGTTTTCTTCAGC-3′[SEQ ID：No.24]作为引物(下划线为BsaI识别切割位点)，使用恶臭假单胞菌NCIMB 12565染色体DNA作为模板，扩增HpgAT ORF。通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增片段的正确大小(1361bp)。

用BsaI消化所述片段。用XhoI和NcoI消化载体pBAD/Myc-HisC。用T4 DNA连接酶连接纯化的消化pBAD/Myc-HisC载体和消化的插入DNA。

用重组质粒通过电穿孔转化大肠杆菌Top10细胞，并平板接种在补加100mg/l羧苄青霉素的LB培养基上。

进行菌落PCR，并在有或没有0.002％阿拉伯糖作为诱导物的情况下，用补加100mg/l羧苄青霉素的LB培养基培养8个PCR阳性菌落以及大肠杆菌Top10/pBAD/Myc-HisC(阴性对照)。收获细胞，并按实施例12所述测试细胞的HpgAT活性。在阿拉伯糖作为诱导物的情况下，全部8个菌落都显示出HpgAT活性。在这些菌落中，有一个菌落携带显示正确插入序列(通过测序确定)的质粒，该菌落命名为大肠杆菌pBAD-HpgAT，按照布达佩斯条约于2000年10月23日保藏于Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen，Braunschweig，Germany(DSMZ)，保藏号为DSM 13788。实施例14：制备无细胞提取物

用补加阿拉伯糖(0.002％)和羧苄青霉素(100mg/l)的LB培养基于28℃过夜培养大肠杆菌Top10/pBAD-HpgAT。离心收获细胞，通过超声处理然后离心由悬浮液(1g细胞+7ml 50mM KPO₄ pH7.0)制备无细胞提取物。实施例15.a：D-HpgAT对对羟基苯乙醛酸的活性

用小玻璃管于20℃温育3ml反应混合物，该混合物含有100mM磷酸钾缓冲液pH7.0、60mM L-谷氨酸、0.1mM磷酸吡哆醛和无细胞提取物(0.27mg蛋白，实施例14)。该混合物在340nm的分光光度计活性检测中用作空白。通过向反应混合物中加入对羟基苯乙醛酸(0.67mM终浓度)开始反应。该反应20℃的最大比活为110nmole/分钟/mg蛋白。实施例15.b：D-HpgAT对D-PG和D-HPG的活性

于30℃温育4ml反应混合物，该混合物含有100mM磷酸钾缓冲液pH8.0、15mMα-酮戊二酸、0.1mM磷酸吡哆醛和无细胞提取物(0.01mg蛋白，实施例14)。通过加入底物D-PG(4mM)开始测定。以一定的时间间隔吸取1ml等份并转移至0.4ml 1M H₃PO₄，以终止反应。通过HPLC分析样品(Astec Chirobiotic T 250mm×4.6mm 5μm柱，Advanced Separation Technologies，Whippany，NJ，20μl注样体积，柱温22℃、1.0ml/分钟80％15mM乙酸铵pH4.1和20％甲醇，于215nm检测)。在20分钟内，7％的D-PG转化为苯乙醛酸，而在用D-HPG作为底物的相似实验中，12％的D-HPG转变为对羟基苯乙醛酸。实施例16：D-HpgAT的最优pH

用5ml反应混合物测定所述酶的最优pH，所述反应混合物包含100mM一定pH的缓冲液、6.5mM对羟基苯乙醛酸、0.05mM磷酸吡哆醛和100μl无细胞提取物(1.35mg蛋白，实施例14)。通过加入300μmole L-谷氨酸(合适pH、60mM终浓度)开始反应。于35℃一定的时间间隔后，吸取样品并通过加入相同体积的0.2M H₃PO₄终止反应。通过HPLC(Biorad HPX-87C 300mm×7.8mm，20μl注样体积，柱温80℃、1ml/分钟5mM磷酸钙)分析样品并于210nm检测。

在pH5-11的范围内测试酶活性。分别应用KH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液(pH5-8)、TRIC-HCl缓冲液(pH8-9)、CHES-NaOH缓冲液(pH9-10)和CAPS-NaOH缓冲液(pH10-11)。

发现所述酶的最优pH在8.5-9之间。在pH6-7.5观察到显著活性。这与Wiyakrutta和Meevootisom(1997，J.Biotechnol.，55：193-203)相反，他们在pH7.5以下未观测到施氏假单胞菌(Psedomonas stutzeri)的任何D-HpgAT活性。实施例17：丙酮酸作为D-HpgAT的氨基受体

应用实施例12的分光光度计测定(但在测定混合物中没有Triton)，用丙酮酸代替α-酮戊二酸作为氨基受体。由于形成HPGL，所以可观测到吸光度增加。因此，恶臭假单胞菌D-HpgAT能够利用丙酮酸作为氨基受体。Wiyakrutta和Meevootisom(1997，J.Biotechnol.，55：193-203)描述的施氏假单胞菌转氨酶利用α-酮戊二酸作为唯一的氨基受体。实施例18：D-HpgAT的对映选择性(I)

使用实施例12的分光光度计测定测试D-HpgAT对L-HPG的活性。当使用L-HPG作为底物时未观测到吸光度增加。加入D-HPG后，吸光度开始增加。因此，所述D-HpgAT对D-对羟基苯基甘氨酸具有选择性。

为测试L-谷氨酸的对映选择性，于20℃温育3ml反应混合物，该混合物含有100mM磷酸钾缓冲液pH7.0、60mM D-谷氨酸和0.1mM磷酸吡哆醛。该混合物在340nm的分光光度计活性检测中用作空白。向反应混合物中加入对羟基苯乙醛酸(0.5mM终浓度)。温育2分钟后，通过向反应混合物中加入20μl无细胞提取物(0.27mg蛋白，实施例14)开始反应。当使用D-谷氨酸作为底物时未能鉴定出吸光度降低。加入L-谷氨酸后，吸光度开始下降。因此，所述D-HpgAT对L-谷氨酸具有选择性。实施例19：D-HpgAT的对映选择性(II)

为进一步证实严格的对映选择性，于35℃预温育两种反应混合物(50ml终体积)10分钟，这两种混合物含有100mM磷酸钾缓冲液pH8.0、13mM对羟基苯乙醛酸、0.05mM磷酸吡哆醛和无细胞提取物(13.5或1.35mg蛋白，实施例14)。通过加入34.8mmol L-谷氨酸pH8.O(终浓度0.7M)开始反应。

一定间隔后吸取样品(1.ml)，通过加入2ml 0.2M H₃PO₄终止反应，以实施例15的方法通过HPLC分析。在反应中仅产生D-HPG(没有L-HPG)。

实验部分II(实施例20-35)：构建和测试人工D-(H)PG生物合成操纵子

实施例20-35的一般性考虑因素

选择质粒pJF119EH作为人工D-(H)PG生物合成操纵子的表达载体。这种宿主范围广泛的载体由Fǖrste等(1986，Gene，48：119-131)构建，适于在各种革兰氏阴性菌中进行蛋白表达。pJF119EH表达系统使用IPTG诱导型tac启动子，并携带lac阻遏蛋白(lac I^q基因)，lac阻遏蛋白在没有诱导物的情况下使克隆外源基因的表达保持在极低的水平。

在所有情况下，都通过PCR由实施例1、实施例9和实施例13描述的合适质粒扩增属于D-(H)PG操纵子的不同基因。为确保在这些基因前存在最佳的核糖体结合位点(RBS)，包括实际上存在于pBAD/Myc-HisC中的RBS。

实施例20：构建质粒pJU-Sc-HmaS

使用PCR将天蓝色链霉菌对羟基扁桃酸合酶基因亚克隆入pJF119EH。使用5′-GG GAATTCAGGAGGAATTAACC CCGCCgAGcGAC-3′[SEQID：No.25](下划线为EccoRI限制位点，双下划线为起始密码子，将非大写字母表示的密码子3和4更改为大肠杆菌更常使用的密码子)和5′-GAATTCCCATAT TCTAGAAGG

TCGGCCGGCCACT-3′[SEQ ID：No.26](下划线为Xba I限制位点，双下划线为终止密码子)作为引物，使用pBAD-Sc-HmaS(参见实施例1.3)质粒DNA作为模板，扩增包含RBS的HmaS ORF。通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增片段的正确大小(1120bp)。

用EcoRI和Xba I消化所述片段和质粒pJF119EH。连接两种片段，并转化入大肠杆菌DH5α中。在含100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化体。显示正确插入序列(通过测序证实)的质粒叫做pJF-Sc-HmaS。

实施例21：构建质粒pJF-Ao-HmaS

使用PCR将东方诺卡氏菌对羟基扁桃酸合酶基因亚克隆入pJF119EH。使用5′-TGG GAATTCAGGAGGAATTAACC

CAG-3′[SEQ ID：No.27](下划线为EcoRI限制位点，双下划线为起始密码子)和5′-GCCGGACC TCTAGATACG

TCGCCG-3′[SEQ ID：No.28](下划线为Xba I限制位点，双下划线为终止密码子)作为引物，使用pBAD-Ao-HmaS(参见实施例1.1)质粒DNA作为模板，扩增包含RBS的HmaS ORF。通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增片段的正确大小(1115bp)。

用EcoR I和Xba I消化所述片段和质粒pJF119EH。连接两种片段，并转化入大肠杆菌DH5α中。在含100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化体。显示正确插入序列(通过测序证实)的质粒叫做pJF-Ao-HmaS。

实施例22：构建质粒pJF-Sc-HmaO

使用PCR将天蓝色链霉菌对羟基扁桃酸氧化酶基因亚克隆入pJF119EH。使用5′-TGGG TCTAGAGGAGGAATTAACC CGcGAGCCG-3′[SEQ ID：No.29](下划线为XbaI限制位点，双下划线为起始密码子，将非大写字母表示的密码子2更改为大肠杆菌更常使用的密码子)和5′-GAATTCCCATA GCATGCCTGG TCCGTGGCTCC-3′[SEQ ID：No.30](下划线为Sph I限制位点，双下划线为终止密码子)作为引物，使用pBAD-Sc-HmaO(参见实施例1.4)质粒DNA作为模板，扩增包含RBS的HmaO ORF。通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增片段的正确大小(1178bp)。

用Xba I和Sph I消化所述片段和质粒pJF119EH。连接两种片段，并转化入大肠杆菌DH5α中。在含100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化体。显示正确插入序列(通过测序证实)的质粒叫做pJF-Sc-HmaO，将该质粒用于进一步的研究。

实施例23：构建质粒pJF-Sc-HmaS-Sc-HmaO

在该实施例中，将实施例20和22的克隆Sc-HmaS和Sc-HmaO组合在表达载体pJF119EH中。通过用Xba I和Sph I消化切除表达载体中pJF-Sc-HmaO上的Sc-HmaO基因，通过凝胶电泳纯化包含Sc-HmaO的该DNA片段。用Xba I和Sph I消化质粒pJF-Sc-HmaS，将其与Sc-HmaO Xba I/Sph I片段连接在一起，并转化入大肠杆菌DH5α中。在含100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化体。选择不同的转化体，小量制备质粒，通过限制酶切作图分析质粒DNA。在pJF119EH中以正确的顺序包含所述两种基因的质粒命名为pJF-Sc-HmaS-Sc-HmaO，将该质粒用于进一步的研究。

实施例24：构建质粒pJF-Ao-HmaS-Sc-HmaO

在该实施例中，以和实施例23描述的pJF-Sc-HmaS-Sc-HmaO构建相同的方式将实施例21和22的克隆Ao-HmaS和Sc-HmaO组合在表达载体pJF119EH中。在pJF119EH中以正确的顺序包含所述两种基因的质粒命名为pJF-Ao-HmaS-Sc-HmaO，将该质粒用于进一步的研究。

实施例25：构建质粒pJF-HpgAT

使用PCR将恶臭假单胞菌D-对羟基苯基甘氨酸转氨酶基因亚克隆入pJF119EH。使用5′-TTTCCC AAGCTTACAGGAGGAATTAACC [SEQ ID：No.31](下划线为Hind III限制位点，双下划线为起始密码子)和5′-GTACCAGCTGCA AAGCTTGAG GCCCAG-3′[SEQ ID：No.32](下划线为Hind III限制位点，双下划线为终止密码子)作为引物，使用pBAD-HpgAT(参见实施例13)质粒DNA作为模板，扩增包含RBS的HpgAT ORF。通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增片段的正确大小(1378bp)。

用Hind III消化所述片段和质粒pJF119EH。连接两种片段，并转化入大肠杆菌DH5α中。在含100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化体。使用限制酶切分析确认目的片段以和tac启动子相同的方向插入。除了一个沉默突变(密码子46由GCG变为GCA)以外，显示正确插入序列的质粒叫做pJF-HpgAT，将该质粒用于进一步的研究。实施例26：构建质粒pJF-Sc-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT

在该实施例中，将实施例25的克隆HpgAT亚克隆入实施例23的质粒pJF-Sc-HmaS-Sc-HmaO。通过用Hind III消化切除表达载体中pJF-HpgAT上的HpgAT基因，通过凝胶电泳纯化含HpgAT基因的该DNA片段。用Hind III消化质粒pJF-Sc-HmaS-Sc-HmaO。去磷酸化后，将该片段与HpgAT Hind III片段连接在一起，并转化入大肠杆菌DH5α中。在含100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化体。选择不同的转化体，小量制备质粒，通过限制酶切作图分析质粒DNA。在pJF119EH中以正确的顺序和方向包含所述三个基因的质粒命名为pJF-sc-HmaS-ScHmaO-HpgAT，将该质粒用于进一步的研究。

实施例27：构建质粒pJF-Ao-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT

在该实施例中，以和实施例26描述的pJF-Sc-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT构建相同的方式将实施例25的克隆HpgAT亚克隆入实施例24的质粒pJF-Ao-HmaS-Sc-HmaO。在pJF119EH中以正确的顺序包含所述三个基因的质粒命名为pJF-Ao-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT，将该质粒用于进一步的研究。

实施例28：构建质粒p-JF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT

在该实施例中，将存在于pJF-Sc-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT(实施例26)中的克隆Sc-HmaO与恶臭假单胞菌的mdlB基因互换，获得质粒pJF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT。使用5′-GGG TCTAGAGGAGGAATTAACC

AGCCAGAATCTCTTT-3′[SEQ ID：No.33](下划线为Xba I限制位点，双下划线为起始密码子)和5′-CTGCAGAA CCAGCATCGGTGGTCAGTACTTCAC

TGCG-3′[SEQ ID：No.34](下划线为BstX I限制位点，双下划线为终止密码子)作为引物，并使用pGEM-Bldm(参见实施例9)质粒DNA作为模板，通过PCR扩增包含RBS序列的恶臭假单胞菌扁桃酸脱氢酶基因，所述RBS序列实际上存在于质粒pBAD/Myc-His中。通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增片段的正确大小(1236bp)。

用Xba I和BstX I消化所述片段。用Xba I和Sph I消化质粒pJF-Sc-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT，产生一个无HmaO基因的7692bp质粒片段。将纯化的7692bp Xba I/Sph I片段与含Xba I/BstX I片段的mdlB ORF连接在一起，并转化入大肠杆菌DH5α中。在含100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择转化体。选择不同的转化体，小量制备质粒，通过限制酶切作图分析质粒DNA。在pJF119EH中以正确的顺序包含所述三个基因的质粒命名为pJF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT，将该质粒用于进一步的研究。实施例29：构建质粒pJF-Ao-HmaS-mdlB-HpgAT

在该实施例中，以和实施例28描述的pJF-Sc-HmaS-Sc-mdlB-HpgAT构建相同的方式将存在于pJF-Ao-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT(实施例27)中的克隆Sc-HmaO与恶臭假单胞菌的mdlB基因互换，产生质粒pJF-Ao-HmaS-mdlB-HpgAT。

将在pJF119EH中以正确的顺序包含所述三个基因的质粒命名为pJF-Ao-HmaS-mdlB-HpgAT，将该质粒用于进一步的研究。实施例30：人工D-(H)PG簇在质粒pJF-Sc-HmaS-Sc-HmaO- HpgAT、pJF-Ao-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT、pJF-Sc-HmaS-mdlB- HpgAT和pJF-Ao-HmaS-mdlB-HpgAT上的表达

用携带质粒pJF-Sc-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT、pJF-Ao-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT、pJF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT或pJF-Ao-HmaS-mdlB-HpgAT的大肠杆菌DH5α菌株的单菌落接种含氨苄青霉素(100μg/ml)的10ml LB培养基，并于30℃温育16小时。

随后用1ml这些培养物接种50ml同样的培养基。于30℃、180rpm培养细胞。在OD_620nm0.8时，通过加入0.1mM IPTG诱导细胞。4小时后，收获细胞，并用100mM磷酸钾缓冲液pH7.5清洗。于-20℃冷冻等份的清洗细胞待以后使用。作为对照，同样处理携带质粒pJF119EH的大肠杆菌DH5α。

临使用前用B-PER^TM(在磷酸缓冲液中)(Pierce，Rockford，Illinois，USA)制备粗提物。实施例31：由对羟基丙酮酸苯酯体外生产D-HPG

3ml的测定混合物包含200mM磷酸钾缓冲液pH8.0、5mM对羟基丙酮酸苯酯(HPP)、10％乙醇(使用50mM对羟基丙酮酸苯酯母液的96％乙醇溶液)、44mM抗坏血酸、40mM L-谷氨酸、40mMNAD⁺、0.1mM磷酸吡哆醛和至终浓度为0.6mg/ml可溶性蛋白的实施例30的无细胞提取物。

通过加入HPP开始测定，于30℃、65小时后通过加入0.1ml 1NHCl至0.5ml等份的反应系统中终止测定。按实施例3所述的HPLC分析样品。

表1概述了所产生的对羟基扁桃酸(HMA)、对羟基苯乙醛酸(HPGL)和D-HPG的mg/l量。

表1：

质粒 HMA HPGL D-HPG

pJF-Sc-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT 17 67 9

pJF-Ao-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT 0 166 11

pJF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT 37 73 24

pJF-Ao-HmaS-mdlB-HpgAT 0 97 26

PJF119EH 0 0 0

由表可见，在使用得自大肠杆菌DH5α/pJF119EH的无细胞提取物的对照实验中未检测到这些化合物(HMA、HPGL和D-HPG)。实施例32：由丙酮酸苯酯体外生产D-PG

3ml测定混合物包含200mM磷酸钾缓冲液pH8.0、5mM丙酮酸苯酯(PP)、44mM抗坏血酸、40mM L-谷氨酸、40mM NAD⁺、0.1mM磷酸吡哆醛和至终浓度为0.3mg/ml可溶性蛋白的实施例30的无细胞提取物。

通过加入PP开始测定，于30℃、39小时后通过加入0.1ml 1NHCl至0.5ml等份的反应系统中终止测定。按实施例3所述的HPLC分析样品。

在39小时内，用得自大肠杆菌DH5α/pJF-Ao-HmaS-Sc-HmaO-HpgAT的无细胞提取物生产32mg/l的D-PG，而用得自大肠杆菌DH5α/pJF-Ao-HmaS-mdlB-HpgAT的无细胞提取物生产27mg/l的D-PG。在使用得自大肠杆菌DH5α/pJF119EH的无细胞提取物的对照实验中未检测到D-PG。

实施例33：构建质粒pCR-Bl-tyrA使用5′-GCGTGG AAGCTTAAGAGGTTTATT

GTTGCTGAA-3′[SEQID：No.35](下划线为Hind III限制位点，双下划线为起始密码子)和5′-GTGCAC GGTCTCGAGCTGAATTC CTGGCGATTGTCAT-3′[SEQ ID：No.36](下划线为Bsa I识别切割位点，双下划线为终止密码子)作为引物，并使用野生型大肠杆菌菌株LJ110(Zeppenfeld等2000)染色体DNA作为模板，扩增含大肠杆菌原有RBS的编码大肠杆菌分支酸变位酶-预苯酸脱氢酶的tyrA ORF(保藏号AE000346的核苷酸4740-5877)。通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增片段的正确大小(1169bp)。

按照供应商的说明书，将扩增片段直接插入载体pCR-Blunt II-TOPO(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)，并转化入化学感受态大肠杆菌Top10(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)。在含50mg/l卡那霉素的LB琼脂平板上选择转化体。显示正确插入序列(通过测序证实)的质粒叫做pCR-Bl-tyrA，将该质粒用于进一步的研究。

实施例34：构建质粒pJF-Sc-HmaS-mdlB-HDgAT-tyrA

选择大肠杆菌KB532(Δ(pheA-tyrA)，ΔtyrR，aroF^for，thiA，hsdR17，endAl，supE44)作为D-HPG的生产宿主菌株。KB532是L-酪氨酸和L-苯丙氨酸营养缺陷型菌株。该菌株没有tyrA基因(分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶)、pheA基因(分支酸变位酶/预苯酸脱水酶)和全局调节子tyrR，并携带有编码反馈(L-酪氨酸)抗性DAHP合酶的aroFOF^fbr。tyrA基因在KB532中过表达导致大肠杆菌宿主产生酪氨酸，随之也产生传递大量对羟基丙酮酸苯酯的菌株。

为能够过表达tyrA和人工D-(H)PG操纵子，将实施例33的克隆tyrA基因亚克隆入实施例28的质粒pJF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT。通过用Hind III和Bsa I消化切除表达载体中pCR-Bl-tyrA上的tyrA基因及其RBS，并通过凝胶电泳纯化含tyrA ORF的DNA片段。

因为pJF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT含有三个Hind III位点，所以用Hind III部分消化质粒pJF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT，以获得线性化质粒片段。通过琼脂糖凝胶电泳确认限制性片段的正确大小，并由该凝胶纯化对应于该线性化质粒的8912bp片段。用碱性磷酸酶处理以防止质粒再环化后，将这些8912bp片段与tyrA Hind III/Bsa I片段连接在一起。

通过转化tyrA缺陷型大肠杆菌宿主KB532(参见上文)并在补加50mg/l L-苯丙氨酸和0.01mM IPTG的基本培养基上生长，根据互补性选择重组质粒。选择不同的转化体，小量制备质粒，并通过限制酶切作图分析质粒DNA。在pJF119EH中以正确的顺序和方向包含所述四个基因的质粒命名为pJF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT-tyrA，相应菌株叫做KB532/pJF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT-tyrA，将其用于进一步研究。实施例35：发酵生产D-HPG

用矿质培养基研究大肠杆菌KB532/pJF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT-tyrA由葡萄糖生产D-HPG。该矿质培养基包含柠檬酸钠·3H₂O(1.0g/l)、MgSO₄·7H₂O(0.3g/l)、KH₂PO₄(3.0g/l)、K₂HPO₄(12.0g/l)、NaCl(0.1g/l)、(NH₄)₂SO₄(5.0g/l)、CaCl₂·2H₂O(15.0mg/l)、FeSO₄·7H₂O(75.0mg/l)、盐酸硫胺素(维生素B1)(5.0mg/l)和L-苯丙氨酸(0.05g/l)。其它矿物质以痕量元素溶液(1ml/l)形式加入，所述痕量元素溶液包括Al₂(SO₄)₃·18H₂O(2.0g/l)、CoCl₂·6H₂O(0.7g/l)、CuSO₄·5H₂O(2.5g/l)、H₃BO₃(0.5g/l)、MnCl₂·4H₂O(20.0g/l)、Na₂MoO₄·2H₂O(3.0g/l)、NiSO₄·6H₂O(2.0g/l)、ZeSO₄·7H₂O(15.0g/l)。葡萄糖母液(30g/l)单独高压蒸汽灭菌，并加入到无菌培养基中至终浓度为4g/l。

使用大肠杆菌KB532/pJF-Sc-HmaS-mdlB-HpgAT-tyrA单菌落接种10ml含氨苄青霉素(100μg/ml)的基本培养基，并于30℃培养16小时。随后用4ml该培养物接种50ml相同培养基，并于33℃、180rpm培养24小时。12小时后OD_620nm约为0.6时，通过加入0.1mM IPTG诱导细胞。将培养物上清液样品调节至pH5.8，冻干，并再溶解于D₂O中。323K的600MHz¹H-NMR显示预期的谐振频谱，形成少量HPG尖峰证实存在HPG。由2-D COSY实验获得了大量证据。存在量测定为5mg/l。(除了HPG之外，还存在80mg/l的其前体对羟基苯乙醛酸，但没有对羟基扁桃酸)。

序列表

序列表<110>DSM N.V.

DSM Biotech GmbH

Johns Hopkins University<120>发酵生产D-对羟基苯基甘氨酸和D-苯基甘氨酸<130>发酵生产D-PG和D-HPG<140>美国<141>2000-10-27<160>36<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>1gtccacggtc tcccatgcag aatttcgaga t 31<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>2acatcccaag cttcacgttc gaggtc 26<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>3cgctcggtca tgacgtacgt ttccctg 27<210>4<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>4acgaagaagc ttatcaaaca acccccag 28<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>5atgccgccca gtgacatcgc gtacgc 26<210>6<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>6ccctcggtac caggtcatcg gccggccact tcc 33<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>7atgcgggagc cgctcacgct cgac 24<210>8<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>8ccaactggta cctggtcatc cgtggctcct gtctcg 36<210>9<211>1140<212>DNA<213>均匀诺卡氏菌<220><221>CDS<222>(52)..(1086)<223>均匀诺卡氏菌津山亚种ATCC 21806对羟基扁桃酸合酶CDS<400>9aaaccgtcta taaatgctgc cggagggcga tcccacggct ggaggttcgt g atg gcg 57

Met Ala

1gca cag gca ggc agc gtg ttc gac ggc atg acg ctc gac cac acc gtg 105Ala Gln Ala Gly Ser Val Phe Asp Gly Met Thr Leu Asp His Thr Val

5 10 15ttc tac gtc ggc gac gcg gac cgc gcg gcg ggc gag ctc acc gac aag 153Phe Tyr Val Gly Asp Ala Asp Arg Ala Ala Gly Glu Leu Thr Asp Lys

20 25 30tac ggg ctg gtg gtg ctc ggc acg tcc gag acc tcg tcg gtg cgc tcg 201Tyr Gly Leu Val Val Leu Gly Thr Ser Glu Thr Ser Ser Val Arg Ser35 40 45 50gtc gcg gtg ggc ggc ggc tcc atc cgg ctg gtg ttc tcc cag gcc atc 249Val Ala Val Gly Gly Gly Ser Ile Arg Leu Val Phe Ser Gln Ala Ile

55 60 65gcc gac gac acc ccg gct gcc gcg tac gtg aag gtg cac ggc gac ggc 297Ala Asp Asp Thr Pro Ala Ala Ala Tyr Val Lys Val His Gly Asp Gly

70 75 80gtg gcc gac ctc gcg ctg ggc gtc gcc gac gcc cgc gcc gcg ttc gcc 345Val Ala Asp Leu Ala Leu Gly Val Ala Asp Ala Arg Ala Ala Phe Ala

85 90 95gag gcg gtg cgg cgg ggc gcg cgg ccg gtg gcc gag ccc acc gag gcc 393Glu Ala Val Arg Arg Gly Ala Arg Pro Val Ala Glu Pro Thr Glu Ala

100 105 110gac ggc gcg gtg ctc gcc acg atc atg ggc ttc ggc gac gtg gtg cac 441Asp Gly Ala Val Leu Ala Thr Ile Met Gly Phe Gly Asp Val Val His115 120 125 130acc ttc gtc cag cgc ccc ggc ggc gcg ccc ggc gag gac ccg gag agc 489Thr Phe Val Gln Arg Pro Gly Gly Ala Pro Gly Glu Asp Pro Glu Ser

135 140 145gcg ggc ggc ctg cgc gtg ctg gac cac ttc gcg gtc tgc ctc gag gcg 537Ala Gly Gly Leu Arg Val Leu Asp His Phe Ala Val Cys Leu Glu Ala

150 155 160ggc ggg ctg gag ccg acc gtg gcg ttc tac cag gag gtg ctg gac ttc 585Gly Gly Leu Glu Pro Thr Val Ala Phe Tyr Gln Glu Val Leu Asp Phe

165 170 175cgg gtg gtc ttc gag gag aag atc gtc gtc ggg gcg cag gcg atg aac 633Arg Val Val Phe Glu Glu Lys Ile Val Val Gly Ala Gln Ala Met Asn

180 185 190tcc aag gtc gtg cag agc acg tcc ggc gcg gtc acg ctg acc ctc atc 681Ser Lys Val Val Gln Ser Thr Ser Gly Ala Val Thr Leu Thr Leu Ile195 200 205 210gaa ccg gac acc tcg cgc aag ccc ggt cag atc gac gac ttc atc aag 729Glu Pro Asp Thr Ser Arg Lys Pro Gly Gln Ile Asp Asp Phe Ile Lys

215 220 225aac cac ggt ggc gcg ggc gtg cag cac atc gcc ttc gcc acc gac ggc 777Asn His Gly Gly Ala Gly Val Gln His Ile Ala Phe Ala Thr Asp Gly

230 235 240atc gtg gac gcg gtg cgc cgg ttg cgc gag cgg ggc gtg gag ctg ctc 825Ile Val Asp Ala Val Arg Arg Leu Arg Glu Arg Gly Val Glu Leu Leu

245 250 255acc acg ccc gcc gcc tac tac gac ctg ctg gcg gac cgc ctc gga ccg 873Thr Thr Pro Ala Ala Tyr Tyr Asp Leu Leu Ala Asp Arg Leu Gly Pro

260 265 270acc cgg tac tcc acg gcc gag ctg gcc gag ctg aac ctg ctg gtc gac 921Thr Arg Tyr Ser Thr Ala Glu Leu Ala Glu Leu Asn Leu Leu Val Asp275 280 285 290gag gac cag gac ggc aag ctg tac cag atc ttc gcc cgg tcc acc cac 969Glu Asp Gln Asp Gly Lys Leu Tyr Gln Ile Phe Ala Arg Ser Thr His

295 300 305ccc agg ggc acg ttc ttc ttc gag atc atc gag cgc gcg ggc gcg cac 1017Pro Arg Gly Thr Phe Phe Phe Glu Ile Ile Glu Arg Ala Gly Ala His

310 315 320acc ttc ggc agc ggc aac atc aag gcc ctc tac gag gcc gtc gag gcc 1065Thr Phe Gly Ser Gly Asn Ile Lys Ala Leu Tyr Glu Ala Val Glu Ala

325 330 335gag cgc cac cgg acc gag cgc tgagcgcggg gcacggcgat ggacccgctg 1116Glu Arg His Arg Thr Glu Arg

340 345cgcgccggtg acctgcacgg ctcg 1140<210>10<211>345<212>蛋白质<213>均匀诺卡氏菌<400>10Met Ala Ala Gln Ala Gly Ser Val Phe Asp Gly Met Thr Leu Asp His1 5 10 15Thr Val Phe Tyr Val Gly Asp Ala Asp Arg Ala Ala Gly Glu Leu Thr

20 25 30Asp Lys Tyr Gly Leu Val Val Leu Gly Thr Ser Glu Thr Ser Ser Val

35 40 45Arg Ser Val Ala Val Gly Gly Gly Ser Ile Arg Leu Val Phe Ser Gln

50 55 60Ala Ile Ala Asp Asp Thr Pro Ala Ala Ala Tyr Val Lys Val His Gly65 70 75 80Asp Gly Val Ala Asp Leu Ala Leu Gly Val Ala Asp Ala Arg Ala Ala

85 90 95Phe Ala Glu Ala Val Arg Arg Gly Ala Arg Pro Val Ala Glu Pro Thr

100 105 110Glu Ala Asp Gly Ala Val Leu Ala Thr Ile Met Gly Phe Gly Asp Val

115 120 125Val His Thr Phe Val Gln Arg Pro Gly Gly Ala Pro Gly Glu Asp Pro

130 135 140Glu Ser Ala Gly Gly Leu Arg Val Leu Asp His Phe Ala Val Cys Leu145 150 155 160Glu Ala Gly Gly Leu Glu Pro Thr Val Ala Phe Tyr Gln Glu Val Leu

165 170 175Asp Phe Arg Val Val Phe Glu Glu Lys Ile Val Val Gly Ala Gln Ala

180 185 190Met Asn Ser Lys Val Val Gln Ser Thr Ser Gly Ala Val Thr Leu Thr

195 200 205Leu Ile Glu Pro Asp Thr Ser Arg Lys Pro Gly Gln Ile Asp Asp Phe

210 215 220Ile Lys Asn His Gly Gly Ala Gly Val Gln His Ile Ala Phe Ala Thr225 230 235 240Asp Gly Ile Val Asp Ala Val Arg Arg Leu Arg Glu Arg Gly Val Glu

245 250 255Leu Leu Thr Thr Pro Ala Ala Tyr Tyr Asp Leu Leu Ala Asp Arg Leu

260 265 270Gly Pro Thr Arg Tyr Ser Thr Ala Glu Leu Ala Glu Leu Asn Leu Leu

275 280 285Val Asp Glu Asp Gln Asp Gly Lys Leu Tyr Gln Ile Phe Ala Arg Ser

290 295 300Thr His Pro Arg Gly Thr Phe Phe Phe Glu Ile Ile Glu Arg Ala Gly305 310 315 320Ala His Thr Phe Gly Ser Gly Asn Ile Lys Ala Leu Tyr Glu Ala Val

325 330 335Glu Ala Glu Arg His Arg Thr Glu Arg

340 345<210>11<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>11agaattcgcg gcacaggcag gcagcg 26<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>12ttataagctt tcagcgctcg gtccggtggc 30<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>13tataccatgg cggcacaggc aggc 24<210>14<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>14ttataagctt gcgctcggtc cggtggc 27<210>15<211>1227<212>DNA<213>均匀诺卡氏菌<220><221>CDS<222>(50)..(1177)<223>均匀诺卡氏菌津山亚种ATCC 21806对羟基扁桃酸氧化酶CDS<400>15ccccgcgcgt ggggaggcgg cgtgcccgac ggacaggagg caacgagcc atg ggc gtc 58

Met Gly Val

1cgc aac tcc gca ggg ggc ggc gcg gaa gac ccc gag gac ctg gct gag 106Arg Asn Ser Ala Gly Gly Gly Ala Glu Asp Pro Glu Asp Leu Ala Glu

5 10 15gtg gaa cgg gcc gcc gcc gcc cgg ctg ccg ggg gac gtg cgc gac ttc 154Val Glu Arg Ala Ala Ala Ala Arg Leu Pro Gly Asp Val Arg Asp Phe20 25 30 35atc gcg ggc ggc agc ggc gac gag gtg acg ctg gcc gcc aac cgc gcg 202Ile Ala Gly Gly Ser Gly Asp Glu Val Thr Leu Ala Ala Asn Arg Ala

40 45 50gcg ctc gac gac gtg gcc ctg ctc ccc agg gtg crc gcg ggt gtc cag 250Ala Leu Asp Asp Val Ala Leu Leu Pro Arg Val Leu Ala Gly Val Gln

55 60 65gcg gcc gac acg agc acc tcg ctc gtg ggc acg gcg gcc acg ctg ccc 298Ala Ala Asp Thr Ser Thr Ser Leu Val Gly Thr Ala Ala Thr Leu Pro

70 75 80gtc gcc gtg gcg ccg atg ggc tac cag tgc ctc gtc cae ccc gac ggc 346Val Ala Val Ala Pro Met Gly Tyr Gln Cys Leu Val His Pro Asp Gly

85 90 95gag gtc gcg gct gcc gcc gcg gcg ggc gcc gcc ggc gtc ccc ttc acc 394Glu Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Val Pro Phe Thr100 105 110 115gtc ggc acg ctg agc agc cgg tcg gtc gag gag atc gcc gag acc ggc 442Val Gly Thr Leu Ser Ser Arg Ser Val Glu Glu Ile Ala Glu Thr Gly

120 125 130gcg tcg ctg tgg ttc cag ctc tac tgg ctg cgc gat cgc ggc ctg gtc 490Ala Ser Leu Trp Phe Gln Leu Tyr Trp Leu Arg Asp Arg Gly Leu Val

135 140 145gcc gaa ctc gtg gcg cgg gcc gag gcg gcg ggc tgc cgg gcg ctg gtg 538Ala Glu Leu Val Ala Arg Ala Glu Ala Ala Gly Cys Arg Ala Leu Val

150 155 160atc acc gtg gac gtg ccg gtg atg ggc cgc agg ctc cgg gac gtg cgc 586Ile Thr Val Asp Val Pro Val Met Gly Arg Arg Leu Arg Asp Val Arg

165 170 175aac ggg atc acc ctg ccc cgg acc gtc cgg gcc gtc cac ctc gcc gac 634Asn Gly Ile Thr Leu Pro Arg Thr Val Arg Ala Val His Leu Ala Asp180 185 190 195ggc ccg tca tcc gcg cac gag ccg cgc cag gtc ggc tcc ggc gtc gcc 682Gly Pro Ser Ser Ala His Glu Pro Arg Gln Val Gly Ser Gly Val Ala

200 205 210cag cac acg agc gcg gtc ttc gac ccc gcg ttc ggg tgg cgc gac ctg 730Gln His Thr Ser Ala Val Phe Asp Pro Ala Phe Gly Trp Arg Asp Leu

215 220 225gag tgg ctg cgg gcg cgc acc agg ctc ccc ctg gtg gtc aag ggc gtg 778Glu Trp Leu Arg Ala Arg Thr Arg Leu Pro Leu Val Val Lys Gly Val

230 235 240ctc gac ccg cgc gac gcc acc agg tgc gtc gag ctg ggc gcc tcg gcg 826Leu Asp Pro Arg Asp Ala Thr Arg Cys Val Glu Leu Gly Ala Ser Ala

245 250 255gtg gtg gtg tcc aac cac ggc ggg cgg cag ctc gac ggc gcg gcg ccc 874Val Val Val Ser Asn His Gly Gly Arg Gln Leu Asp Gly Ala Ala Pro260 265 270 275agc gcg gtg gcc ctg ccg cgc gtc gtc gac gcg gtg gcg ggc gcg gcc 922Ser Ala Val Ala Leu Pro Arg Val Val Asp Ala Val Ala Gly Ala Ala

280 285 290gag gtg ctg ttc gac agc ggc gtc cgc ggc ggc gtc gac gtg ctg cgc 970Glu Val Leu Phe Asp Ser Gly Val Arg Gly Gly Val Asp Val Leu Arg

295 300 305gcc ctc gcg ctc ggc gcg acc ggc gtg ctg ctc ggc cgc cca atc ctg 1018Ala Leu Ala Leu Gly Ala Thr Gly Val Leu Leu Gly Arg Pro Ile Leu

310 315 320tgg ggg ctc gcg gtc ggc ggc gag cgc ggc gcg gcg cgg gtg ctg gaa 1066Trp Gly Leu Ala Val Gly Gly Glu Arg Gly Ala Ala ATg Val Leu Glu

325 330 335ctg ctg cgc acc gag ttc gcg cag gcc ctg ctg ctc gcc ggg tgc gcc 1114Leu Leu Arg Thr Glu Phe Ala Gln Ala Leu Leu Leu Ala Gly Cys Ala340 345 350 355gac gtc gac gcg gcc agg gga ctc gcg acc gcg cag gcc gcg ccg acc 1162Asp Val Asp Ala Ala Arg Gly Leu Ala Thr Ala Gln Ala Ala Pro Thr

360 365 370cgg cga ggt gcg ccc tgaccgcctc ggggaccgcg atcggggccg gggcgcgggg 1217Arg Arg Gly Ala Pro

375tcaggggaag 1227<210>16<211>376<212>蛋白质<213>均匀诺卡氏菌<400>16Met Gly Val Arg Asn Ser Ala Gly Gly Gly Ala Glu Asp Pro Glu Asp1 5 10 15Leu Ala Glu Val Glu Arg Ala Ala Ala Ala Arg Leu Pro Gly Asp Val

20 25 30Arg Asp Phe Ile Ala Gly Gly Ser Gly Asp Glu Val Thr Leu Ala Ala

35 40 45Asn Arg Ala Ala Leu Asp Asp Val Ala Leu Leu Pro Arg Val Leu Ala

50 55 60Gly Val Gln Ala Ala Asp Thr Ser Thr Ser Leu Val Gly Thr Ala Ala65 70 75 80Thr Leu Pro Val Ala Val Ala Pro Met Gly Tyr Gln Cys Leu Val His

85 90 95Pro Asp Gly Glu Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Val

100 105 110Pro Phe Thr Val Gly Thr Leu Ser Ser Arg Ser Val Glu Glu Ile Ala

115 120 125Glu Thr Gly Ala Ser Leu Trp Phe Gln Leu Tyr Trp Leu Arg Asp Arg

130 135 140Gly Leu Val Ala Glu Leu Val Ala Arg Ala Glu Ala Ala Gly Cys Arg145 150 155 160Ala Leu Val Ile Thr Val Asp Val Pro Val Met Gly Arg Arg Leu Arg

165 170 175Asp Val Arg Asn Gly Ile Thr Leu Pro Arg Thr Val Arg Ala Val His

180 185 190Leu Ala Asp Gly Pro Ser Ser Ala His Glu Pro Arg Gln Val Gly Ser

195 200 205Gly Val Ala Gln His Thr Ser Ala Val Phe Asp Pro Ala Phe Gly Trp

210 215 220Arg Asp Leu Glu Trp Leu Arg Ala Arg Thr Arg Leu Pro Leu Val Val225 230 235 240Lys Gly Val Leu Asp Pro Arg Asp Ala Thr Arg Cys Val Glu Leu Gly

245 250 255Ala Ser Ala Val Val Val Ser Asn His Gly Gly Arg Gln Leu Asp Gly

260 265 270Ala Ala Pro Ser Ala Val Ala Leu Pro Arg Val Val Asp Ala Val Ala

275 280 285Gly Ala Ala Glu Val Leu Phe Asp Ser Gly Val Arg Gly Gly Val Asp

290 295 300Val Leu Arg Ala Leu Ala Leu Gly Ala Thr Gly Val Leu Leu Gly Arg305 310 315 320Pro Ile Leu Trp Gly Leu Ala Val Gly Gly Glu Arg Gly Ala Ala Arg

325 330 335Val Leu Glu Leu Leu Arg Thr Glu Phe Ala Gln Ala Leu Leu Leu Ala

340 345 350Gly Cys Ala Asp Val Asp Ala Ala Arg Gly Leu Ala Thr Ala Gln Ala

355 360 365Ala Pro Thr Arg Arg Gly Ala Pro

370 375<210>17<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>17agaat tcggc gtccgcaact ccgcag 26<210>18<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>18aataagcttt cagggcgcac ctcgcc 26<210>19<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>19actcgccaag ggctatggtg tcc 23<210>20<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>20gccaacagtt ccaacagcgg tgtg 24<210>21<211>1427<212>DNA<213>恶臭假单胞菌<220><221>CDS<222>(51)..(1376)<223>恶臭假单胞菌NCIMB 12565 D-对羟基苯基甘氨酸转氨酶CDS<400>21tcagttaact gccatgtaat ctcaaaaacc agtccaatag aggcatcagc atg tct 56

Met Ser

1att tat agc gat tat gaa cgt aaa acg gtg ggc tcc gcg cat tgg gcg 104Ile Tyr Ser Asp Tyr Glu Arg Lys Thr Val Gly Ser Ala His Trp Ala

5 10 15gat cgg gca cga gct gta atg cca gat ggc gta acg gct gat aca cgt 152Asp Arg Ala Arg Ala Val Met Pro Asp Gly Val Thr Ala Asp Thr Arg

20 25 30gtt ttt gat ccg cat ggg ctg tac atc tgt gac gcg caa ggt gtt cac 200Val Phe Asp Pro His Gly Leu Tyr Ile Cys Asp Ala Gln Gly Val His35 40 45 50aag acc gat gtt gat ggc aac gta tac ctg gat ttt ttt ggt ggg cat 248Lys Thr Asp Val Asp Gly Asn Val Tyr Leu Asp Phe Phe Gly Gly His

55 60 65ggc gct tta gtg ctt ggt cat gga cat cca cgt att aac aag gca atc 296Gly Ala Leu Val Leu Gly His Gly His Pro Arg Ile Asn Lys Ala Ile

70 75 80tct gca gcg ctg acg cat ggc gtc caa tac ggt gca agc cat ccg ctt 344Ser Ala Ala Leu Thr His Gly Val Gln Tyr Gly Ala Ser His Pro Leu

85 90 95gaa gtg cga tgg gcc gag cgc ttg gtc aac gcc ttc cct tcg atg cat 392Glu Val Arg Trp Ala Glu Arg Leu Val Asn Ala Phe Pro Ser Met His

100 105 110aaa gtg cgc ttt gcc ggc agc ggc act gag gcg act tta ttg gca ctg 440Lys Val Arg Phe Ala Gly Ser Gly Thr Glu Ala Thr Leu Leu Ala Leu115 120 125 130cga atg gcg cgg gcg ttt act ggc agg tcg aaa ata cta cgt att gcc 488Arg Met Ala Arg Ala Phe Thr Gly Arg Ser Lys Ile Leu Arg Ile Ala

135 140 145acc cac tat cat ggc tgg cat gac ttc tcc gcc tct ggt tac aac agt 536Thr His Tyr His Gly Trp His Asp Phe Ser Ala Ser Gly Tyr Asn Ser

150 155 160cac ttc gac ggc cag cca gca ccg ggc gtc ctt gct gaa att gca cag 584His Phe Asp Gly Gln Pro Ala Pro Gly Val Leu Ala Glu Ile Ala Gln

165 170 175agc aca cta ctg gtt cgc cca gat gac ttc gaa gga tta cgc gca cta 632Ser Thr Leu Leu Val Arg Pro Asp Asp Phe Glu Gly Leu Arg Ala Leu

180 185 190ttc gct caa tac ggc ggt gag att gcg acc att att gcg gag cca gtc 680Phe Ala Gln Tyr Gly Gly Glu Ile Ala Thr Ile Ile Ala Glu Pro Val195 200 205 210ggc tct cat ttc ggt atc act ccg gtc agc gac gat ttc ttg cta gaa 728Gly Ser His Phe Gly Ile Thr Pro Val Ser Asp Asp Phe Leu Leu Glu

215 220 225ggc gcc gcg ctg gct cga aag cac ggt gca ata ttc att ctt gac gaa 776Gly Ala Ala Leu Ala Arg Lys His Gly Ala Ile Phe Ile Leu Asp Glu

230 235 240gtg ata acc ggt ttt cgc gtg ggt aac cac ggt atg cag ggg ctt ctc 824Val Ile Thr Gly Phe Arg Val Gly Asn His Gly Met Gln Gly Leu Leu

245 250 255gac att gca ccg gat ctt acg tgc ttg gcc aag gcc agt gct gga ggt 872Asp Ile Ala Pro Asp Leu Thr Cys Leu Ala Lys Ala Ser Ala Gly Gly

260 265 270ctt cct gga ggc gta gtc gga gga agg gcg gat gtc atg gcg gta ctg 920Leu Pro Gly Gly Val Val Gly Gly Arg Ala Asp Val Met Ala Val Leu275 280 285 290gat cgc ggt tca gac cgt aag gtt ctg cat caa ggc acc ttc acc gga 968Asp Arg Gly Ser Asp Arg Lys Val Leu His Gln Gly Thr Phe Thr Gly

295 300 305aac cca att acg gcg gcg gca gca atc gcg gcg atc gat acc att atc 1016Asn Pro Ile Thr Ala Ala Ala Ala Ile Ala Ala Ile Asp Thr Ile Ile

310 315 320gaa gat gac gtg tgc aca cac atc aat gcc ctc ggt caa tac gcc cgg 1064Glu Asp Asp Val Cys Thr His Ile Asn Ala Leu Gly Gln Tyr Ala Arg

325 330 335gac tcg atg aac gaa ctc ttc gct cgt aag cat ttg gac tgg ttg gct 1112Asp Ser Met Asn Glu Leu Phe Ala Arg Lys His Leu Asp Trp Leu Ala

340 345 350tat ggc cgc ttt tcc ggc ttc cac ctg atg ccg gga tta tct ccg ctg 1160Tyr Gly Arg Phe Ser Gly Phe His Leu Met Pro Gly Leu Ser Pro Leu355 360 365 370acc act gac acg ggt gtg atc act cgc gga gaa gtt gca cgg ccc gca 1208Thr Thr Asp Thr Gly Val lle Thr Arg Gly Glu Val Ala Arg Pro Ala

375 380 385gta aaa atg att gcc gct atg cgc atg gca tta atc ctt gag ggc atc 1256Val Lys Met Ile Ala Ala Met Arg Met Ala Leu Ile Leu Glu Gly Ile

390 395 400gat att ggt ggc cgt gga tct gtg ttt ctc tct gcg cag cat gat cgc 1304Asp Ile Gly Gly Arg Gly Ser Val Phe Leu Ser Ala Gln His Asp Arg

405 410 415gga cat gtc gac caa ctg gtg tcg acc ttt gat tcc att ctt ggc cgc 1352Gly His Val Asp Gln Leu Val Ser Thr Phe Asp Ser Ile Leu Gly Arg

420 425 430ctg gct gaa gaa aac ctc ctg ggc taagccctta cacatctgtc tggaatatga 1406Leu Ala Glu Glu Asn Leu Leu Gly435 440atcatgaaaa ctagcctgaa a 1427<210>22<211>442<212>蛋白质<213>恶臭假单胞菌<400>22Met Ser Ile Tyr Ser Asp Tyr Glu Arg Lys Thr Val Gly Ser Ala His1 5 10 15Trp Ala Asp Arg Ala Arg Ala Val Met Pro Asp Gly Val Thr Ala Asp

20 25 30Thr Arg Val Phe Asp Pro His Gly Leu Tyr Ile Cys Asp Ala Gln Gly

35 40 45Val His Lys Thr Asp Val Asp Gly Asn Val Tyr Leu Asp Phe Phe Gly

50 55 60Gly His Gly Ala Leu Val Leu Gly His Gly His Pro Arg Ile Asn Lys 65 70 75 80Ala Ile Ser Ala Ala Leu Thr His Gly Val Gln Tyr Gly Ala Ser His

85 90 95Pro Leu Glu Val Arg Trp Ala Glu Arg Leu Val Asn Ala Phe Pro Ser

100 105 110Met His Lys Val Arg Phe Ala Gly Ser Gly Thr Glu Ala Thr Leu Leu

115 120 125Ala Leu Arg Met Ala Arg Ala Phe Thr Gly Arg Ser Lys Ile Leu Arg

130 135 140Ile Ala Thr His Tyr His Gly Trp His Asp Phe Ser Ala Ser Gly Tyr145 150 155 160Asn Ser His Phe Asp Gly Gln Pro Ala Pro Gly Val Leu Ala Glu Ile

165 170 175Ala Gln Ser Thr Leu Leu Val Arg Pro Asp Asp Phe Glu Gly Leu Arg

180 185 190Ala Leu Phe Ala Gln Tyr Gly Gly Glu Ile Ala Thr Ile Ile Ala Glu

195 200 205Pro Val Gly Ser His Phe Gly Ile Thr Pro Val Ser Asp Asp Phe Leu

210 215 220Leu Glu Gly Ala Ala Leu Ala Arg Lys His Gly Ala Ile Phe Ile Leu225 230 235 240Asp Glu Val Ile Thr Gly Phe Arg Val Gly Asn His Gly Met Gln Gly

245 250 255Leu Leu Asp Ile Ala Pro Asp Leu Thr Cys Leu Ala Lys Ala Ser Ala

260 265 270Gly Gly Leu Pro Gly Gly Val Val Gly Gly Arg Ala Asp Val Met Ala

275 280 285Val Leu Asp Arg GLy Ser Asp Arg Lys Val Leu His Gln Gly Thr Phe

290 295 300Thr Gly Asn Pro Ile Thr Ala Ala Ala Ala Ile Ala Ala Ile Asp Thr305 310 315 320Ile Ile Glu Asp Asp Val Cys Thr His Ile Asn Ala Leu Gly Gln Tyr

325 330 335Ala Arg Asp Ser Met Asn Glu Leu Phe Ala Arg Lys His Leu Asp Trp

340 345 350Leu Ala Tyr Gly Arg Phe Ser Gly Phe His Leu Met Pro Gly Leu Ser

355 360 365Pro Leu Thr Thr Asp Thr Gly Val Ile Thr Arg Gly Glu Val Ala Arg

370 375 380Pro Ala Val Lys Met Ile Ala Ala Met Arg Met Ala Leu Ile Leu Glu385 390 395 400Gly Ile Asp Ile Gly Gly Arg Gly Ser Val Phe Leu Ser Ala Gln His

405 410 415Asp Arg Gly His Val Asp Gln Leu Val Ser Thr Phe Asp Ser Ile Leu

420 425 430Gly Arg Leu Ala Glu Glu Asn Leu Leu Gly

435 440<210>23<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>23gtgcacggtc tcgcatgtct atttatagcg attatgaacg taaaac 46<210>24<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>24gtgcacggtc tcctcgagtt agcccaggag gttttcttca gc 42<210>25<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>25gggaattcag gaggaattaa ccatgccgcc gagcgac 37<210>26<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>26gaattcccat attctagaag gtcatcggcc ggccact 37<210>27<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>27tgggaattca ggaggaatta accatgcag 29<210>28<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>28cggccaggtc tagatacgtc atcgccg 27<210>29<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>29tgggtctaga ggaggaatta accatgcgcg agccg 35<210>30<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>30gaattcccat agcatgcctg gtcatccgtg gctcc 35<210>31<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>31tttcccaagc ttacaggagg aattaaccat g 31<210>32<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>32gtaccagctg caaagcttga gttagcccag 30<210>33<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>33gggtctagag gaggaattaa ccatgagcca gaatctcttt 40<210>34<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>34ctgcagaacc agcatggtgg tcagtacttc actcatgcg 39<210>35<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>35gcgtggaagc ttaagaggtt tattatggtt gctgaa 36<210>36<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：用于PCR的基因特异性寡核苷酸<400>36gtgcacggtc tcgagctgaa ttcttactgg cgattgtcat 40

Claims

1.一种重组微生物生产D-苯甘氨酸(D-PG)或D-对羟基苯基甘氨酸(D-HPG)的发酵方法，其中：

a)分别用于生产D-PG和D-HPG的丙酮酸苯酯和对羟基丙酮酸苯酯分别取自芳香族氨基酸途径；

b)并分别转变为扁桃酸或对羟基扁桃酸；

c)此后分别转变为苯乙醛酸或对羟基苯乙醛酸；

d)此后通过立体转化D-转氨酶的作用苯乙醛酸或对羟基苯乙醛酸分别转变为D-苯甘氨酸或D-对羟基苯基甘氨酸。

2.权利要求1的方法，其中所应用的微生物高效产生丙酮酸苯酯和对羟基丙酮酸苯酯。

3.权利要求2的方法，其中分别通过供给苯丙氨酸(对于丙酮酸苯酯而言)或酪氨酸(对于对羟基丙酮酸苯酯而言)高效产生丙酮酸苯酯或对羟基丙酮酸苯酯。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述丙酮酸苯酯转变为扁桃酸或对羟基丙酮酸苯酯转变为对羟基扁桃酸经由对羟基扁桃酸合酶催化的一步酶反应实现。

5.权利要求1-3任一项的方法，其中所述丙酮酸苯酯转变为扁桃酸或对羟基丙酮酸苯酯转变为对羟基扁桃酸经由多步反应实现，所述多步反应包括以下步骤：PP或HPP分别转变为苯乙醛或对羟基苯乙醛，然后分别转变为乙酸苯酯或对羟基乙酸苯酯，最后分别转变为MA或HMA。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中在酶存在下催化对羟基扁桃酸和扁桃酸分别转变为对羟基苯乙醛酸和苯乙醛酸，所述酶选自扁桃酸脱氢酶、对羟基扁桃酸脱氢酶、氧依赖性扁桃酸氧化酶和氧依赖性对羟基扁桃酸氧化酶。

7.一种能够分泌可检测量D-HPG或D-PG的重组细胞，该细胞包含：

a)催化对羟基丙酮酸苯酯转变为对羟基扁桃酸或催化丙酮酸苯酯转变为扁桃酸的酶的编码基因；

b)催化对羟基扁桃酸转变为对羟基苯乙醛酸或催化扁桃酸转变为苯乙醛酸的酶的编码基因；

c)催化对羟基苯乙醛酸转变为D-HPG或催化苯乙醛酸转变为D-PG的立体转化D-转氨酶的编码基因。

8.一种重组质粒，它包含至少一种下述基因，所述基因的序列对应于本申请公开的[SEQ ID：No.9]和/或[SEQ ID：No.15]和/或[SEQID：No.21]中的任一种或者与这些序列中的任一种至少80％同源、优选至少90％同源、最优选至少95％同源的同源物。