CN1656219A

CN1656219A - 新的多磷酸amp磷酸转移酶

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Publication number: CN1656219A
Application number: CNA038123606A
Authority: CN
Inventors: 柴肇一; 野口利忠
Original assignee: Yamasa Corp
Current assignee: Yamasa Corp
Priority date: 2002-05-29
Filing date: 2003-05-28
Publication date: 2005-08-17
Anticipated expiration: 2023-05-28
Also published as: ES2344552T3; WO2003100056A1; ATE468393T1; JP2009050264A; US7329522B2; EP1514927B1; DE60332623D1; AU2003241818A1; US20060088918A1; JP4256341B2; CN100562573C; KR100864901B1; US20080108111A1; EP1514927A1; KR20050004855A; CA2499885C; JPWO2003100056A1; EP1514927A4; CA2499885A1

Abstract

本发明涉及到下述的新的多磷酸AMP磷酸转移酶(Polyphosphate：AMP Phosphotransferase：PAP)、编码该酶的基因以及他们的利用。(A)作用：催化下述两个反应。NMP(dNMP)+PolyP_(n)→NDP(dNDP)+PolyP_(n－1) (式中，NMP为核苷一磷酸、NDP为核苷二磷酸、dNMP为脱氧核苷一磷酸、dNDP为脱氧核苷二磷酸，n表示多磷酸的聚合度、为100以下的整数)。(B)底物特异性：对AMP、GMP、IMP、dAMP、dGMP特异，也可作用于CMP、UMP、dCMP、TMP。(C)分子量：约55～56Kd(千道尔顿)。(D)比活：每1mg酶蛋白70单位以上。

Description

新的多磷酸AMP磷酸转移酶

技术领域

本发明涉及到新的多磷酸AMP磷酸转移酶(Polyphosphate：AMPPhosphotransferase)、编码该酶的基因以及他们的利用。

背景技术

由于近年来基因操作技术的进展，各种各样的酶的廉价大量制备成为可能，以往一直通过使用微生物菌体的微生物转化或发酵生产，或通过化学合成法合成的有用的生理活性物质已经可以通过酶反应廉价制造了。

可是，在磷酸化反应、氨基化反应等需要高能量的酶反应中，需要腺苷5’-三磷酸(ATP)作为能量供体或磷酸供体。在以往的微生物转化或发酵生产中，ATP由使用的微生物的生物体内供给，在酶法中要向反应体系添加ATP，所以必须要开发有效的ATP再生体系。

然而，ATP的廉价合成法现在还没有确立，而市售的ATP价格非常高。另外，作为ATP的再生体系一般利用磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶的组合、或乙酰磷酸和乙酸激酶的组合等，由于底物、酶价格都非常高，所以其利用被限定于实验室水平的利用，还不能实用。

而相对于高价的ATP，腺苷5’-一磷酸(AMP)可以比较廉价地制造。现在，ATP可以使用化学合成法或使用微生物或酵母菌体由AMP或腺嘌呤合成。因此，期盼在使用ATP的酶反应体系中，不添加高价的ATP，而是通过酶反应由价廉的AMP生成ATP，且可以有效地使消耗的ATP再生的方法的开发。

在构建实用的ATP的生成·再生体系方面，使用的磷酸供体也非常重要，作为价廉而且稳定的磷酸供体认为多磷酸是第1候补。另外，作为与多磷酸代谢有关，也作用于腺苷系核苷酸的酶，已知有多磷酸激酶和多磷酸AMP磷酸转移酶(以后略记为「PAP」)。

PAP是以多磷酸作为磷酸供体，将AMP磷酸化后生成ADP的酶(J.Bacteriol.，173，6484-6488(1991))。据Zenhder等人报告，对来自约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)的该酶进行了部分纯化，通过与腺苷酸激酶并用，具有以AMP和多磷酸作为底物的ATP生成·再生体系的功能(Appl.Environ.Microbiol.，66，2045-2051(2000))。另外，据龟田等人报告，在消耗ATP的生成AMP的酶反应体系中，通过将来自黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)的PAP和大肠菌多磷酸激酶组合，可以有效起到以多磷酸作为磷酸供体的由AMP合成ATP的再生体系的作用(J.Biosci.Bioeng.91，557-563(2001))。

然而，Acinetobacter johnsonii菌体内的PAP的存在量非常少，如果在反应中使用菌体提取液等粗纯化酶，也会混入了很多分解参与反应的物质(AMP、ADP、ATP、反应底物和/或反应生成物)的酶，结果存在着反应效率降低的问题。作为解决该问题的对策，虽然可以不使用粗纯化酶，而使用高度纯化的PAP，但该酶不稳定而且纯化操作又非常繁杂，无论如何也达不到实用化标准。

本发明人认为通过利用重组DNA手法使可以解决上述问题的Acinetobacter johnsonii的PAP大量生产，能够解决上述问题。

然而，关于该酶的氨基酸序列和该酶的基团，没有任何报道。

发明内容

本发明人通过构建利用PAP活性的用于基因克隆的筛选体系，使用该筛选体系，对编码PAP的基因进行克隆，在大肠菌中大量生产该酶方面获得了成功。而且，当对生产的重组PAP进行解析时，发现该酶具有非常高的比活性，另外通过与腺苷酸激酶组合可以构建有效的ATP生成·再生体系。

更令人惊奇的是发现该重组PAP与以往的来自Acinetobacterjohnsonii的PAP不同，具有即使是AMP或GMP以外的核苷一磷酸，也可以以多磷酸作为磷酸供体使磷酸转移，生成核苷二磷酸的活性。

一般来说，核苷二磷酸虽然作为用于用作医药或化学合成品的聚核苷酸的酶合成的原料是有用的，但合成他决不是容易的事。即，在微生物转化法中由于不能使磷酸化反应停止在二磷酸体，所以现状是不得不依赖化学磷酸化。然而，在化学磷酸化中，由于副反应也同时进行，也生成副产物，所以存在着从反应液中分离纯化目的核苷二磷酸非常繁杂的问题。因此，希望开发通过核苷一磷酸的酶反应磷酸化的核苷二磷酸的有效合成法，作为酶合成法中使用的酶，认为PAP也可作为候选酶。

然而，根据来自Zehnder等人报告：来自Acinetobacter johnsonii的PAP对AMP特异，确认也可向GMP转移若干磷酸，但完全没有证实可以向其他核苷酸(CMP、UMP、IMP)转移磷酸(Appl.Environ.Microbiol.，66，2045-2051(2000))，所以认为在通过核苷一磷酸的酶催化磷酸化进行核苷二磷酸的合成中不能利用PAP。

本发明人以上述新的见解作为基础，又不断进行研究，完成本发明。因此，本发明涉及到具有下述理化性质的PAP(本发明的PAP)。(A)作用：催化下述两个反应。

(式中，NMP为核苷一磷酸、NDP为核苷二磷酸、dNMP为脱氧核苷一磷酸、dNDP为脱氧核苷二磷酸，n表示多磷酸的聚合度、为100以下的整数。)

(B)底物特异性：对AMP、GMP、IMP、dAMP、dGMP特异，也可作用于CMP、UMP、dCMP、TMP。

(C)分子量：约55～56Kd(千道尔顿)。

(D)比活：每1mg酶蛋白70单位(unit)以上。

另外，本发明涉及到具有序列编号1所示的氨基酸序列的或在该氨基酸序列中缺失、置换或附加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列的PAP。

另外，本发明还涉及到编码具有序列编号1所示氨基酸序列的或在该氨基酸序列中缺失、置换或附加一个或多个氨基酸的氨基酸序列的PAP基因。

另外，本发明涉及到具有序列编号2所示碱基序列的或在该碱基序列中缺失、置换或附加一个或多个碱基的碱基序列的PAP基因。

另外，本发明涉及到在严格条件下与上述基因杂交，而且编码具有PAP活性的多肽的DNA片段。

另外，本发明涉及到通过酶反应由核苷一磷酸制造核苷二磷酸的方法，其是作为酶使用上述本发明的PAP，作为磷酸供体使用多磷酸的核苷二磷酸的制造方法。

另外，本发明涉及到通过酶反应由AMP制造ATP的方法，其是作为酶使用上述的PAP和腺苷酸激酶二种酶，作为磷酸供体使用多磷酸的ATP的制造方法，

另外，本发明涉及到由AMP、多磷酸、PAP以及腺苷酸激酶构成的ATP生成·再生体系中，作为PAP使用上述本发明的PAP的ATP的生成·再生体系。

最后，本发明还涉及到化合物的制造方法，其特征是在利用消耗ATP的酶反应的该化合物的制造方法中，利用生成的AMP和由多磷酸、PAP以及腺苷酸激酶构成的ATP的再生体系进行再生时，作为PAP使用本发明的PAP，一边由AMP再生成ATP，一边进行该酶反应。

附图的简单说明

图1是表示含有获得的Acinetobacter Johnsonii 210A株的PAP基因的约10Kb DNA片段的限制酶谱。PAP基因包含在SacI-HpaI DNA片段中。

图2表示含有PAP基因的2.5kb DNA片段的碱基序列以及PAP的氨基酸序列(其1)。

图3表示含有PAP基因的2.5kb DNA片段的碱基序列以及PAP的氨基酸序列(其2)。

图4表示本发明PAP的pH稳定性的结果。

图5表示本发明PAP的最适pH的结果。

图6表示本发明PAP的热稳定性的结果。

图7表示本发明PAP的最适温度的结果。

图8表示通过以多磷酸作为磷酸供体的PAP和腺苷酸激酶由AMP合成ADP以及ATP。

具体实施方式

(1)本发明的PAP

本发明的PAP是具有下述理化性质的酶(参照下面叙述的实施例)。

(A)作用：催化下述两个反应。

(C)分子量：约55～56Kd(千道尔顿)。

(D)比活：每1mg酶蛋白70单位(unit)以上。

(E)最适pH：8.5附近。

(F)最适温度：50℃附近。

(E)pH稳定性：7～9附近。

(F)热稳定性：在50℃附近之前稳定。

而这里所谓1个单位(unit)指的是于37℃下在1分钟内生成1μmole ADP的活性，在以下条件下测定。

<测定条件>

向含有20mM氯化镁、10mM AMP以及多磷酸(换算为无机磷酸30mM)的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.8)中添加酶标准品后，通过于37℃下保温进行反应，通过于100℃、热处理1分钟使反应停止，使用高效液相色谱(HPLC)对反应液中的ADP进行定量。

本发明的PAP具有序列编号1所示的氨基酸序列。特别是用重组DNA法制备的重组PAP从酶活性看实质上是纯粹的，不拥有对AMP磷酸化不利的AMP分解活性。

另外，该氨基酸序列只要是维持催化上述反应的活性，也可以缺失、置换、修饰或附加一个或多个氨基酸。上述氨基酸序列的缺失、置换、修饰或附加可以通过作为申请前的众所周知技术的部位特异的突变诱导法(例如，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，4662-5666(1984)、Nucleic Acid Res.10，6487-6500(1982)；Nature 316，601-605(1985)等)等实施。另外，本发明的PAP只要是维持催化上述反应的活性，也包括与序列编号1所示氨基酸序列有90％以上、最好95％以上同源性的酶。

本发明的PAP通过对来自于Acinetobacter johnsonii编码具有序列编号1所示氨基酸序列的酶的基因，具体来说对由序列编号2所示的碱基序列构成的PAP基因进行克隆，使用该基因进行制备。例如，以来自Acinetobacter johnsonii的基因作为具体例子进行说明，给出了用图2以及图3所示的限制酶谱中SacI以及HpaI酶切的DNA片段的碱基序列进行解析的结果，图2和图3的碱基编号604～2031位所示的序列相当于PAP的结构基因，与上述序列编号2所示的碱基序列是同一序列。

在本发明中，只要是能够生成本发明的PAP，也可以利用序列编号2所示碱基序列中缺失、置换、插入或附加一个或多个碱基的基因，或者在严格条件下可与这些基因杂交的基因，或者具有与序列编号2所示碱基序列有90％以上、更优选95％以上同源性的基因。

而所谓缺失、置换、插入或附加一个或多个碱基的基因与上述的氨基酸序列同样，指的是通过部位特异的突变诱导法等众所周知方法缺失、置换、修饰或附加能够缺失、置换、修饰或附加程度的数个碱基。而所谓严格条件指的是使用含有5×SSC(1×SSC是在1升水中溶解了氯化钠8.76g、柠檬酸钠4.41g的溶液)、0.1％w/v N-月桂酰替肌氨酸钠盐、0.02％w/v SDS、0.5％w/v封闭试剂的溶液，于60℃下反应20小时左右的反应温度条件下进行杂交反应。

另外在本发明中，还可以利用编码PAP的基因的上游含有SD序列(Shine-Dalgarno Sequence)的基因，通过利用这样的基因，其好处是可以显著增加酶的产量。

这样基因的克隆、使用克隆化的DNA片段的表达载体的制备、使用表达载体的PAP的制备等对于属于分子生物学领域的技术人员是众所周知的技术，具体来说，可以依据例如「Molecular Cloning」(Maniatis等人编，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold SpringHarbor，New York(1982))记载的方法进行。

例如，利用已知的方法决定从属于Acinetobacter属的微生物纯化的PAP的N-末端、C-末端等氨基酸序列的一部分，合成相当于该部分的寡核苷酸。可以以合成的寡核苷酸作为探针，由属于Acinetobacter属菌体的染色体DNA克隆含有编码PAP的基因的DNA片段。另外，用适当的限制酶切染色体DNA，使用得到的DNA片段通过常规方法做成基因组文库，从做成的基因组文库中通过以PAP活性为基础进行筛选，可以对目的基因进行克隆。

另外，由于PAP如果高度纯化，失活的可能性高，所以希望使用利用了PAP活性的筛选体系。而作为在筛选中利用的PAP活性，为了做到更高灵敏度检测，所以最好利用使PAP和多磷酸激酶(PPK)组合的由AMP生成ATP的活性。具体来说，使用PAP和PPK，以放射性同位素标记的多磷酸作为磷酸供体，以AMP为底物使ATP生成，可以检测放射性标记的ATP的生成。

克隆使用的宿主没有特别限定，从操作性和简便性考虑，大肠杆菌作为宿主合适。

为了构建克隆的基因的高表达体系，应用Maxam-Gilbert的方法(Methods in Enzymology，65，499(1980))或双脱氧链终止法(Methods in Enzymology，101，20(1983))等，对克隆的DNA片段的碱基序列进行解析，特定该基因的编码区，相应于宿主微生物，制作在其上游连接表达控制信号(转录起始以及翻译起始信号)的重组表达载体，使得该基因在微生物菌体中可以自表达。

作为为使PAP在异种微生物内大量产生所使用的表达控制信号可以是人为的控制，优选是使用使PAP的产量飞跃上升的那样强力转录起始以及翻译起始信号。作为这样的转录起始信号，当使用大肠菌作为宿主时，可举出如lac启动子、trp启动子、tac启动子(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，80，21(1983)、Gene，20，231(1982))、trc启动子(J.Biol.Chem.，260，3539(1985))等。

作为载体，可以使用各种各样的质粒载体、噬菌体载体等，希望使用可以在微生物菌体内复制、带有适当的药物抗性标记和特定的限制酶切位点、在菌体内的拷贝数高的质粒载体。具体来说，以大肠菌作为宿主时，可举出如pBR322(Gene，2，95(1975))、pUC18、pUC19(Gene，33，103(1985))等。

使用制作的重组载体转化微生物。作为宿主的微生物，只要是安全性高、处理容易的没有特别限定。例如可以使用大肠菌、酵母等DNA重组操作中常用的微生物。其中，大肠菌有利，例如可以使用在重组DNA实验中使用的K12株、C600菌、JM105菌、JM109菌(Gene，33，103-119(1985))等。

转化微生物的方法已经报告了很多方法，可以根据用作宿主的微生物适当选择。例如使用大肠菌作为宿主时，可以通过低温下、进行氯化钙处理将质粒导入菌体内的方法(J.Mol.Biol.，53，159(1970))对大肠菌进行转化。

使得到的转化体在该微生物可增殖的培养基中增殖，再诱导克隆的PAP基因的表达，培养至该酶在菌体内大量蓄积为止。转化体的培养可以使用含有碳源、氮源等该微生物增殖必需的营养源的培养基按照常规方法进行。例如，使用大肠菌作为宿主时，作为培养基使用2xYT培养基(Methods in Enzymology，100，20(1983))、LB培养基、M9CA培养基(Molecular Cloning、上述)等在大肠菌培养中常用的培养基，于20～40℃的培养温度下，根据需要可以边通气搅拌，边进行培养。另外，使用质粒作为载体时，为了防止在培养中质粒的脱落，在适当量培养液中加适当的抗生素(根据质粒的抗药标记，氨苄青霉素、卡那霉素等)药物进行培养。

当培养中需要对PAP基因的表达进行诱导时，通过使用的启动子，利用常用的方法对该基因的表达进行诱导。例如，使用lac启动子或tac启动子时，在培养中期添加适当量的表达诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(以下略称为IPTG)。

通过膜分离或离心分离处理等从上述那样制备的培养物中回收菌体。回收的菌体也可以将菌体本身作为PAP利用，但优选是将回收的菌体混悬于适当的缓冲液中，进行超声处理、弗氏细胞压碎器处理等对菌体进行物理破碎，或经溶菌酶处理等使其溶菌，通过离心分离除去残留菌体，制备无细胞提取液，将该无细胞提取液作为PAP利用。在该无细胞提取液内由于存在过量的PAP，所以即使不实施特别纯化处理也可以作为酶源利用，另外将热处理、硫铵盐析处理、透析处理、乙醇等溶剂处理、各种层析处理等酶纯化中通常使用的处理单独、或数种组合得到的粗纯化物或纯化物作为PAP利用也可以。

(2)本发明的PAP的利用

上述那样制备的本发明PAP可以在核苷二磷酸或脱氧核苷二磷酸的合成、ATP的合成或再生等中利用。

首先，在核苷5’-二磷酸(NDP)或脱氧核苷5’-二磷酸(dNDP)合成中使用的核苷5’-一磷酸(NMP)或脱氧核苷5’-一磷酸(dNMP)可以使用市售产品。作为使用浓度可以在例如1～200mM、优选是10～100mM范围内适当设定。

另外，使用的多磷酸也可以使用市售产品。作为使用的浓度换算成无机磷酸后可以在1～1000mM、优选是10～200mM范围内适当设定。

另外，多磷酸的聚合度(n)在100以下，优选10～50左右的聚合度。

NDP或dNDP的合成反应可以通过向pH4～9范围的适当的缓冲液中添加NMP或dNDP和多磷酸，再添加0.001单位/ml以上、优选是0.001～10单位/ml的本发明的PAP，于20℃以上、优选是在30～40℃范围，根据需要可以边搅拌，边反应1～50小时左右来实施。

生成的NDP或dNDP的分离纯化可以通过各种层析处理等众所周知的方法进行。

接下来，ATP的合成可以在多磷酸存在下，并用本发明的PAP和腺苷酸激酶，通过将AMP转化为ADP，接着再转化为ATP来实施。

向反应液中添加的AMP可以使用市售产品。作为使用浓度在例如1～200mM、优选是10～100mM范围内适当设定。

另外，添加的多磷酸也可以使用市售产品。作为使用浓度，换算成无机磷酸后可以在1～1000mM、优选是10～200mM范围内适当设定。另外，多磷酸的聚合度(n)优选在100以下，10～50左右的聚合度更好。

ATP的合成反应可以通过向pH4～9范围的适当的缓冲液中添加AMP和多磷酸，再添加0.001单位/ml以上、优选是0.001～10单位/ml的本发明的PAP，以及0.01单位/ml以上、优选是0.01～100单位/ml以上的腺苷酸激酶，于20℃以上、优选是在30～40℃范围，根据需要可以边搅拌，边反应1～50小时来实施。

生成的ATP的分离纯化可以通过各种层析处理等众所周知的方法进行。

而腺苷酸激酶活性单位(unit)通过以下方法测定、算出。即，向含有10mM MgCl₂、10mM AMP、10mM ATP的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.8)中添加酶标准品，于37℃下保温进行反应，通过于100℃下热处理1分钟停止反应。使用HPLC对反应液中的ADP进行定量，将于37℃下在1分钟生成2μmole的ADP的活性作为1个单位(unit)。

另外，由AMP、多磷酸、本发明的PAP以及腺苷酸激酶构成的ATP的生成·再生体系可以应用于对存在的微量ATP进行检测，对食品工场等处眼睛看不见的微生物进行检测，检查其清洁度、以及通过可应用于测定食肉、鲜鱼、蔬菜等食物的鲜度的生物发光进行的腺苷酸检查方法中(WO01/53513)。

另外，在利用消耗ATP的酶反应的化合物的制造方法中，通过利用生成的AMP和由多磷酸、本发明的PAP以及腺苷酸激酶构成的ATP再生体系，可以一边由AMP再生成ATP，一边有效地进行目的化合物的酶合成反应。

作为可以与这样的ATP再生体系组合的酶反应体系，例如使用半乳糖激酶的半乳糖-1-磷酸合成体系、使用UMP激酶的UDP合成体系、使用胆碱激酶的磷酸胆碱合成体系等，但不限定于这些体系，只要是消耗ATP的酶反应都适用。

这样的ATP合成体系和酶反应的反应条件可以通过小规模试验适当决定，另外目的化合物的分离纯化也可以通过众所周知的方法进行。

实施例

以下给出实施例，对本发明进行具体说明，显然本发明不限定于这些实施例。另外，实施例中的DNA的制备、通过限制酶进行的酶切、通过T4DNA连接酶进行的DNA连接、以及大肠菌的转化法都依据「Molecular cloning II」(Sambrook等人编，Cold spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York(1989))进行。另外限制酶、以及AmpliTaq DNA聚合酶、T4DNA连接酶等与DNA有关的酶都从宝酒造(株)购入。另外，反应液中的核苷酸类的定量利用HPLC法进行。具体来说，分离时使用YMC公司生产的ODS-AQ312柱，洗脱液使用0.5M磷酸二氢钾溶液。

实施例1：本发明PAP的制备

(1)Acinetobacter johnsonii 210株的PAP基因的克隆

(1-1)大肠菌多磷酸激酶以及放射性标记多磷酸的制备

通过文献(J.Biosci.Bioeng.，91，557-563(2001))记载的方法制备大肠菌多磷酸激酶。再使用制备的多磷酸激酶按照秋山等人的方法(J.Biol.Chem.，268，633-639(1993))制备放射性标记的多磷酸。

(1-2)Acinetobacter Johnsonii基因组文库的制作和筛选

将Acinetobacter johnsonii 210A株接种到LB培养基中，于30℃下振荡培养过夜。通过离心分离回收菌体，制备染色体DNA。用限制酶Sau3AI对Acinetobacter johnsonii染色体DNA进行部分分解后，通过蔗糖密度梯度离心进行分级，回收约7-10Kb的级分。用T4DNA连接酶连接该DNA片段和用BamHI切的质粒载体pBlueScript SK(+)(由东洋纺购入)，用该DNA液转化大肠菌JM109(由宝酒造购入)。分离得到的氨苄青霉素抗性转化体6000株，进行分组，每组50株。

将各组在LB培养基中于37℃下培养过夜，通过离心分离回收菌体后用20mM Tris-HCl(pH8.0)清洗菌体，用同一缓冲液将菌体再混悬。向菌体混悬液中加入等量的BugBuster(由宝酒造购入)，于室温下放置30分钟，进行溶菌后，加入3倍容量的20mM Tris-HCl(pH8.0)，作为菌体提取液。

将1μl菌体提取液加入到含有先前制备的放射性标记多磷酸(以无机磷酸计算为0.24mM)的活性检测液20μl(50mMTris-HCl(pH8.0)、40mM(NH₄)₂SO₄、4mM MgCl₂、1mM AMP)中，于37℃下反应1小时。将该反应液进行薄层层析(展开液0.75MKH₂PO₄(pH3.5))，通过使用磷酸图像分析仪BASS2000(Fujix生产)检测ADP的生成，对得到的转化体进行筛选，在6000株中一个菌系(clone)检测到PAP活性。

从得到的菌系(clone)得到插入了Acinetobacter johnsonii210A株的PAP基因的质粒pPAP2(图1)。另外，质粒pPAP2插入了约10kb的Acinetobacter johnsonii 210A株的染色体DNA，以质粒DNA(pPAP2)的表记按照布达佩斯条约于平成14年(2002)5月2 1日国际委托于独立行政法人产业技术综合研究所专利微生物寄托中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央6(邮编号305-8566))，委托号为FERM BP-8047。(1-3)Acinetobacter johnsonii 210株的PAP基因的解析

将pPAP2含有的10Kb Acinetobacter johnsonii 210A株的DNA亚克隆到各种质粒中，用上述的方法测定这些转化体的PAP化活性，结果确认在约2.5kb的SacI-HpaI DNA片段中存在PAP基因(图1)。用双脱氧链终止法(Science，214，1295(1981))决定该DNA片段的碱基序列。结果判明PAP基因编码由475个氨基酸构成的多肽(分子量：55.8kd)(图2和图3)。

(2)Acinetobacter johnsonii PAP的制备

将保持质粒pPAP2的大肠菌JM109菌在含有100μg/ml的氨苄青霉素的2xYT培养基中，于28℃下培养过夜。通过离心分离回收菌体，混悬于由50mM Tris-HCl(pH7.8)、1mM EDTA构成的缓冲液中，超声处理后，通过离心分离回收菌体提取液。测定得到的提取液中的PAP活性，PAP为每1ml培养液18.1单位的产量，约是对照(没有保持质粒的大肠菌JM109)活性的9000倍。

而且该产率相当于Acinetobacter johnsonii的PAP产率的约150倍。将提取液通过DEAEトヨパ-ル650M(东曹)的离子交换层析(洗脱液：50mM Tris-HCl(pH7.8)，0～0.5M NaCl的浓度梯度)进行分级，对PAP进行部分纯化，将回收的级分作为酶标准品。而该级分中的PAP的比活性为80.5单位/mg蛋白质。

(3)PAP的诸性质的解析

(3-1)各种NDP的合成(底物特异性解析)

向含有100mM MgCl₂、多磷酸(以无机磷酸计量为10mM)、5mM各种NMP或dNMP的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中添加不同浓度的PAP，于37℃下保温10分钟。再于100℃下通过进行1分钟热处理使反应停止，将反应结束的溶液用HPLC对生成的NDP或dNMP进行定量。将AMP磷酸化中的PAP的比活性作为100％，表1给出了各种NMP或dNMP中的比活性的相对值。

表1

底物比活性(相对值)

AMP 100％

GMP 10

CMP 0.09

UMP 0.13

IMP 2.2

dAMP 18

dGMP 2.6

dCMP 0.008

TMP 0.012

(3-2)pH稳定性

设定在各个pH的50mM马来酸盐或50mM Tris-HCl缓冲液中，在有100mM氯化镁存在下于37 ℃下反应10分钟，测定残余活性。残余活性是在50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、100mM氯化镁、5mM AMP、多磷酸(以无机磷酸计量为10mM)存在下于37℃下反应10分钟，通过HPLC对生成的ADP进行定量测定的。

测定结果就象图4所示那样，当以pH8的酶活性作为100时，判明该酶在pH7～9表现出80％以上的活性。

(3-3)最适pH

设定在各个pH的50mM马来酸盐或50mM Tris-HCl缓冲液中，在有100mM氯化镁、多磷酸(以无机磷酸计量为10mM)、5mM AMP存在下于37℃下反应10分钟，通过HPLC对生成的ADP进行定量来测定的。

测定结果就象图5所示那样，该酶的最适pH为8.5。

(3-4)热稳定性

在含有100mM氯化镁的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，在有多磷酸(以无机磷酸计量为10mM)存在下、或不存在下于设定的各个温度的热水浴中保温10分钟，利用上述的方法测定残余活性。

测定结果就象图6所示那样，在多磷酸存在下，判明该酶在50℃之前是稳定的。

(3-5)最适温度

在含有100mM氯化镁的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，在有多磷酸(以无机磷酸计量为10mM)以及5mM AMP存在下于设定的各个温度的热水浴中保温10分钟，通过HPLC对生成的ADP进行定量，测定酶活性。

测定结果就象图7所示那样，判明该酶的最适温度为50℃。

实施例2：通过PAP和腺苷酸激酶合成ATP

(1)大肠杆菌腺苷酸激酶的制备

大肠杆菌腺苷酸激酶利用文献(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，14168-14171(2000))记载的方法制备。将经超声处理制备的菌体提取液作为酶液，该酶液中的腺苷酸激酶的比活性为12.5单位/mg蛋白质。

(2)ATP的合成

在含有20mM MgCl₂、多磷酸(以无机磷酸计量为30mM)、10mM AMP的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.8)中添加使终浓度达到1.5单位/ml的PAP、终浓度达到0.4单位/ml的腺苷酸激酶，于37℃下保温60分钟。利用HPLC对反应结束后反应液中的核苷酸进行定量。

结果如图8所示那样，确认AMP被PAP迅速磷酸化生成ADP，再通过共存的腺苷酸激酶的催化下，生成的ADP迅速转化为ATP和AMP，通过反复进行该循环，ATP蓄积。

实施例3：通过PAP和腺苷酸激酶的组合构成的ATP再生体系合成半乳糖-1-磷酸

(1)大肠菌半乳糖激酶的制备

将保持含有大肠菌半乳糖激酶基因的质粒pDR540(Gene，20，231(1982)、由Phamacia公司购入)的大肠菌JM109菌接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素的2xYT培养基中，于37℃下进行振荡培养。在达到4×10⁸菌/ml时，向培养液中添加使终浓度达到1mM的IPTG，再继续于30℃下进行5小时振荡培养。培养结束后，通过离心分离回收菌体，混悬于30ml的缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.8)、1mM EDTA)中。对菌体混悬液进行超声处理，破碎菌体，再通过离心分离除去残余菌体。将回收液通过DEAEトヨパ-ル650M(东曹)的离子交换层析(洗脱液：50mM Tris-HCl(pH7.8)，0～0.5M NaCl的浓度梯度)进行分级，对半乳糖激酶进行部分纯化，将回收的上清作为半乳糖激酶酶液。酶液中的半乳糖激酶的比活性为6.5单位/mg蛋白质。

而半乳糖激酶活性单位(unit)利用以下给出的方法测定、算出。向含有5mM MgCl₂、10mM ATP、10mM半乳糖的100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.8)中添加酶标准品，通过于37℃下保温进行反应，于100℃下热处理1分钟停止反应。使用糖分析装置(ダイオネツクス公司)对反应液中的半乳糖-1-磷酸进行定量，将于37℃下在1分钟生成1μmole的半乳糖-1-磷酸的活性作为1个单位。

(2)半乳糖-1-磷酸的合成

在含有20mM MgCl₂、多磷酸(以无机磷酸计量为30mM)、5mM AMP和50mM(d)半乳糖的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.8)中添加0.2单位/ml的PAP、0.2单位/ml的腺苷酸激酶，再添加使终浓度达到0.5单位/ml的半乳糖激酶，于37℃下保温8小时。另外在反应2小时后以及4小时后添加以无机磷酸计算终浓度为20mM的多磷酸。用糖分析装置(ダイオネツクス公司)分析反应结束后的溶液，确认生成37.8mM的半乳糖-1-磷酸。

实施例4：核苷二磷酸的合成

(1)各种NDP的合成

向含有100mM MgCl₂、多磷酸(以无机磷酸计量为30mM)、10mM各种NMP(AMP、GMP、CMP、UMP、IMP)的50mM Tris-HCl缓冲液中添加使终浓度达到16单位/ml的PAP，于37℃下保温30分钟。表2给出了利用HPLC对反应液分析的结果。另外，作为对照使用大肠菌JM109的菌体提取液时，确认没有NDP的生成。

表2

底物生成的NDP

AMP 6.76mM ADP

GMP 7.16mM GDP

CMP 0.98mM CDP

UMP 0.85mM UDP

IMP 6.75mM IDP

(2)IDP的酶合成

向含有100mM MgCl₂、多磷酸(以无机磷酸计量为65mM)、40mM IMP的50mM Tris-HCl缓冲液中添加使终浓度达到16单位/ml的PAP，于37℃下保温19小时。利用HPLC对反应液分析，结果确认生成了21.2mM的IDP。

本发明提供新的PAP及其基因，可以很容易地大量制备以往不可能大量制备的PAP。由此可以由AMP有效而且价廉地合成或再生ATP，通过与消耗ATP的酶反应体系组合，也可以使被消耗的ATP再生、有效地合成目的化合物。

另外，本发明的PAP与以往的PAP不同，还具有除了AMP以外的其他核苷5’-一磷酸或脱氧核苷5’-一磷酸合成的磷酸化活性，可以通过酶反应很容易地制备各种核苷5’-二磷酸或脱氧核苷5’-二磷酸。

序列表

<110>Yamasa Corporation

<120>新多磷酸：AMP磷酸转移酶

<130>YS0007

<140>

<141>

<150>JP P2002-156049

<151>2002-05-29

<150>JP P2003-008931

<151>2003-01-17

<160>2

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>475

<212>PRT

<213>约氏不动杆菌

<400>1

Met Asp Thr Glu Thr Ile Ala Ser Ala Val Leu Asn Glu Glu Gln Leu

1 5 10 15

Ser Leu Asp Leu Ile Glu Ala Gln Tyr Ala Leu Met Asn Thr Arg Asp

20 25 30

Gln Ser Asn Ala Lys Ser Leu Val Ile Leu Val Ser Gly Ile Glu Leu

35 40 45

Ala Gly Lys Gly Glu Ala Val Lys Gln Leu Arg Glu Trp Val Asp Pro

50 55 60

Arg Phe Leu Tyr Val Lys Ala Asp Pro Pro His Leu Phe Asn Leu Lys

65 70 75 80

Gln Pro Phe Trp Gln Pro Tyr Thr Arg Phe Val Pro Ala Glu Gly Gln

85 90 95

Ile Met Val Trp Phe Gly Asn Trp Tyr Gly Asp Leu Leu Ala Thr Ala

100 105 110

Met His Ala Ser Lys Pro Leu Asp Asp Thr Leu Phe Asp Glu Tyr Val

115 120 125

Ser Asn Met Arg Ala Phe Glu Gln Asp Leu Lys Asn Asn Asn Val Asp

130 135 140

Val Leu Lys Val Trp Phe Asp Leu Ser Trp Lys Ser Leu Gln Lys Arg

145 150 155 160

Leu Asp Asp Met Asp Pro Ser Glu Val His Trp His Lys Leu His Gly

165 170 175

Leu Asp Trp Arg Asn Lys Lys Gln Tyr Asp Thr Leu Gln Lys Leu Arg

180 185 190

Thr Arg Phe Thr Asp Asp Trp Gln Ile Ile Asp Gly Glu Asp Glu Asp

195 200 205

Leu Arg Asn His Asn Phe Ala Gln Ala Ile Leu Thr Ala Leu Arg His

210 215 220

Cys Pro Glu His Glu Lys Lys Ala Ala Leu Lys Trp Gln Gln Ala Pro

225 230 235 240

Ile Pro Asp Ile Leu Thr Gln Phe Glu Val Pro Gln Ala Glu Asp Ala

245 250 255

Asn Tyr Lys Ser Glu Leu Lys Lys Leu Thr Lys Gln Val Ala Asp Ala

260 265 270

Met Arg Cys Asp Asp Arg Lys Val Val Ile Ala Phe Glu Gly Met Asp

275 280 285

Ala Ala Gly Lys Gly Gly Ala Ile Lys Arg Ile Val Lys Lys Leu Asp

290 295 300

Pro Arg Glu Tyr Glu Ile His Thr Ile Ala Ala Pro Glu Lys Tyr Glu

305 310 315 320

Leu Arg Arg Pro Tyr Leu Trp Arg Phe Trp Ser Lys Leu Gln Ser Asp

325 330 335

Asp Ile Thr Ile Phe Asp Arg Thr Trp Tyr Gly Arg Val Leu Val Glu

340 345 350

Arg Val Glu Gly Phe Ala Thr Glu Val Glu Trp Gln Arg Ala Tyr Ala

355 360 365

Glu Ile Asn Arg Phe Glu Lys Asn Leu Ser Ser Ser Gln Thr Val Leu

370 375 380

Ile Lys Phe Trp Leu Ala Ile Asp Lys Asp Glu Gln Ala Ala Arg Phe

385 390 395 400

Lys Ala Arg Glu Ser Thr Pro His Lys Arg Phe Lys Ile Thr Glu Glu

405 410 415

Asp Trp Arg Asn Arg Asp Lys Trp Asp Asp Tyr Leu Lys Ala Ala Ala

420 425 430

Asp Met Phe Ala His Thr Asp Thr Ser Tyr Ala Pro Trp Tyr Ile Ile

435 440 445

Ser Thr Asn Asp Lys Gln Gln Ala Arg Ile Glu Val Leu Arg Ala Ile

450 455 460

Leu Lys Gln Leu Lys Ala Asp Arg Asp Thr Asp

465 470 475

<210>2

<211>1847

<212>DNA

<213>约氏不动杆菌

<400>2

atggatacag aaacgatcgc cagtgcagtg ctgaatgaag aacagctttc actggactta 60

attgaagcgc aatatgcgtt gatgaatacc cgtgatcaga gcaatgcaaa aagtttagtg 120

attttggtca gtggaatcga acttgcgggt aaaggcgaag cggtgaaaca gctccgcgaa 180

tgggtcgatc ctcgtttttt atatgtcaaa gccgatccac cgcatctgtt taatctaaaa 240

cagccttttt ggcagcccta tacccgattt gtgcctgccg aagggcaaat tatggtgtgg 300

tttggtaatt ggtatgggga tttgttggct acggccatgc atgcttcaaa gcctttagat 360

gacactttgt ttgatgaata cgtcagcaat atgcgggctt ttgaacagga cttaaaaaat 420

aacaacgtag atgtcttaaa agtttggttc gatttgtcgt ggaagtctct gcaaaagcgt 480

ctagatgata tggacccgag cgaagtgcat tggcataagt tgcatgggct agactggcgc 540

aataaaaaac aatatgacac cttacaaaag ctacgtacgc gcttcaccga tgactggcaa 600

atcattgatg gtgaagatga ggatttgcgt aatcacaatt ttgcacaagc aattttaacg 660

gcactacgac actgcccaga gcatgaaaaa aaggccgcgc taaaatggca gcaagcacca 720

ataccagata ttctgactca gtttgaagtc cctcaagctg aggatgcgaa ctataaatca 780

gaattgaaaa aactcaccaa acaagtggcc gatgccatgc gctgtgatga ccgtaaagtg 840

gtgattgctt ttgaaggtat ggatgctgcg ggtaaagggg gggcgattaa gcgtattgtg 900

aaaaagctcg acccacgaga atatgaaatt cataccattg ccgcacctga aaaatatgag 960

ttacgccgtc cttatctgtg gcgtttttgg agcaaattgc agtcggatga catcactatt 1020

tttgatcgga cgtggtatgg acgcgtttta gtcgagcggg tagaaggctt cgcaaccgag 1080

gtagagtggc aacgcgctta tgcggaaatc aatcgttttg aaaaaaacct cagtagcagc 1140

caaaccgtgc tgattaagtt ttggctggcg attgataaag atgaacaagc agcgcgtttt 1200

aaagcccgcg aaagtactcc gcataaacgt tttaaaatta ccgaagaaga ttggcgcaat 1260

cgcgacaaat gggatgacta tttaaaggca gccgcggata tgtttgcgca taccgacacc 1320

agctatgcgc cttggtatat tatttccacc aatgataaac aacaggcccg cattgaagtc 1380

ttaagggcaa ttttaaaaca gctcaaagcg gatcgcgaca cggattaaaa aaattaaaaa 1440

aaaacggtca tttgaccgtt ttttatagag gcagatttag ttttttaact taagggaatt 1500

tgggtcactg gcgctgcaac aggaacacct tgttcagcgg cttgttttag ttgaatgcct 1560

ttggcgagct tatacgactc ttccacatgg gtttccgcaa tttttttcat cacgacataa 1620

cccaagctgg ccgcaatcat ttgtccacct aagggaataa atttagtgac ttgtttggta 1680

atgaatttgg ctgccatgtt attgatggat tttttcacgg ctgtacgtgc gaccaccagt 1740

ccagagaact ccacaccacg tttacgcagt tctgaccaat gtatttgctt agtttctggg 1800

tcgtagacac tgacttgctc aggggttaaa ccaaagcggg cgttaac 1847

Claims

1.一种具有下述理化性质的多磷酸AMP磷酸转移酶，

(A)作用：催化下述两个反应，

NMP+PolyP_(n)→NDP+PolyP_(n-1)

dNMP+PolyP_(n)→dNDP+PolyP_(n-1)

式中，NMP为核苷一磷酸、NDP为核苷二磷酸、dNMP为脱氧核苷一磷酸、dNDP为脱氧核苷二磷酸，n表示多磷酸的聚合度、为100以下的整数，

(B)底物特异性：对AMP、GMP、IMP、dAMP、dGMP特异，也可作用于CMP、UMP、dCMP、TMP，

(C)分子量：约55～56Kd(千道尔顿)，

(D)比活：每1mg酶蛋白70单位以上，

而所谓1个单位表示于37℃下在1分钟生成1μmole的ADP的活性，在以下条件下测定，

<测定条件>

向含有20mM氯化镁、10mM AMP以及多磷酸(以无机磷酸计量30mM)的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.8)中添加酶标准品后，通过于37℃下保温进行反应，于100℃、热处理1分钟使反应停止，使用高效液相色谱法(HPLC)对反应液中的ADP进行定量。

2.一种具有序列编号1所示氨基酸序列或在该氨基酸序列中缺失、置换或附加一个或多个氨基酸的氨基酸序列的多磷酸AMP磷酸转移酶。

3.一种具有编码序列编号1所示氨基酸序列或在该氨基酸序列中缺失、置换或附加一个或多个氨基酸的氨基酸序列的多磷酸AMP磷酸转移酶基因。

4.权利要求3所述基因，其中多磷酸AMP磷酸转移酶基因是具有序列编号2所示的碱基序列或在该碱基序列中缺失、置换或附加一个或多个碱基的碱基序列的基因。

5.一种在严格条件下与权利要求3或4所述的基因杂交，而且编码具有多磷酸AMP磷酸转移酶活性的多肽的DNA片段。

6.一种核苷二磷酸的制造方法，是通过酶反应由核苷一磷酸制造核苷二磷酸的方法，作为酶使用权利要求1或2所述的多磷酸AMP磷酸转移酶，作为磷酸供体使用多磷酸。

7.一种ATP的制造方法，是通过酶反应由AMP制造ATP的方法，作为酶使用权利要求1或2所述的多磷酸AMP磷酸转移酶和腺苷酸激酶二种酶，作为磷酸供体使用多磷酸。

8.一种ATP的生成和再生体系，其中在由AMP、多磷酸AMP磷酸转移酶以及腺苷酸激酶构成的ATP的生成和再生体系中，作为多磷酸AMP磷酸转移酶使用权利要求1或2所述的酶。

9.一种化合物的制造方法，其特征是在利用消耗ATP的酶反应的该化合物制造方法中，利用生成的AMP和由多磷酸、多磷酸：AMP磷酸转移酶以及腺苷酸激酶构成的ATP的再生体系进行再生时，作为多磷酸AMP磷酸转移酶使用权利要求1或2所述的酶，一边由AMP再生成ATP，一边进行该酶反应。