CN1031251A

CN1031251A - T7脱氧核糖酸聚合酶

Info

Publication number: CN1031251A
Application number: CN88100646A
Authority: CN
Inventors: 斯坦利·泰伯; 查理斯·C·理查德逊
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 1987-01-14
Filing date: 1988-01-14
Publication date: 1989-02-22
Also published as: AU1022488A; CA1341512C; DE386858T1; EP0386858A3; ES2068323T3; EP0265293A3; DE516245T1; EP0386857A2; US4942130A; NO880126L; EP0386857B1; DE3789623D1; IL85073A0; JPH06237765A; JP2606777B2; DE3789623T4; ES2060569T1; JPH0670773A; DK13288A; EP0386858A2

Abstract

本发明涉及T7-型DNA聚合酶及其使用方法。

Description

本发明涉及适用于DNA顺序的DNA聚合酶。

DNA顺序测定涉及四种单链DNA片段的形成，每一条链具有一个确定的末端和一个可变的末端。可变末端总是终止于某一给定的特异核苷酸碱基（鸟嘌呤（G）、腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）或胞嘧啶（C）中任一种）。四套不同的片段根据其长度在高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶上分离;凝胶上的每一条带，线性地对应于DNA顺序中的某一特异核苷酸，这样可鉴别出特定核苷酸碱基在顺序中的位置。

一般说来，有两种测定DNA顺序的方法。一种方法（Maxam和Gilbert测定法）涉及DNA分离片段的化学降解，每一条链在其确定的末端用单一放射性标记进行标记，每一反应专一于四种碱基中（G、A、T或C）的一种或多种而进行有限的切割。另一种方法（双脱氧测序法）涉及DNA链的酶促合成。分别进行四种合成，每一反应通过加入合适的链终止双脱氧核苷酸而终止于某一特定碱基（G、A、T或C）。后一种方法较为优越，因为DNA片段被均一标记（而不是末端标记），因此较大的DNA片段含有逐步增加的放射性强度。并且，可用³⁵S-标记的核苷酸代替³²P-标记的核苷酸，使结果更为清晰;由于每一泳带只对应于G、A、T或C中的任一种，因此，很容易阐明反应产物。大多数双脱氧测序法所用的酶是大肠杆菌（Escherichia coli）DNA聚合酶Ⅰ大片段（“Klenow”）。所用另一种聚合酶是AMV逆转录酶。

在一个方面，本发明的牲是一种测定DNA分子中核苷酸碱基顺序的方法，包括使DNA分子与能与此DNA分子杂交的引物分子退火;使退火混合物分成几份后至少在四个容器中保温，这四个容器中含有：四种不同的脱氧核苷三磷酸;一种连续性DNA聚合酶，该聚合酶在DNA测序反应的延长反应通常所用的环境条件下，可在它与DNA解离之前，与DNA维持结合状态至少达到500碱基，聚合酶的核酸外切酶活性为每毫克酶小于500单位;以及四种DNA合成终止试剂中的一种，它在特异的核苷酸碱基处终止DNA合成。四个容器中的试剂分别在不同的特异核苷酸碱基处终止。保温反应的DNA产物根据其大小分离，这样，至少能测出DNA分子的部分核苷酸碱基顺序。

在较好的具体方案中，聚合酶与DNA分子在解离前保持结合至少达1000碱基;该聚合酶实质上与用T7-型噬菌体（即其中DNA聚合酶需要宿主的硫氧还蛋白作为一个亚基的噬菌体;例如，T7-型噬菌体是T7、T3、φⅠ、φⅡ、H、W31、gh-1、Y、A1122或SP6，Studier，Virology 95：70，1979）;感染的细胞中的聚合酶相同;该聚合酶不能区分双脱氧核苷酸类似物;该聚合酶被修饰，使每毫克聚合酶的核酸外切酶活性小于50单位，更好是小于1单位，进一步更好是小于0.1单位，最好是检测不出核酸外切酶活性;聚合酶能够利用短至10个碱基或更好是短至4个碱基的引物;引物含有4至40个核苷酸碱基，并且是单链DNA或RNA;退火步骤包括使DNA分子和引物加热至65℃以上，最好是65℃至100℃，使加热后的混合物冷却至65℃以下，最好是0℃至30℃;保温步骤包括一个脉冲步骤和一个追止步骤，其中脉冲步骤包括使退火混合物与所有四种不同的脱氧核苷三磷酸和一种连续性DNA聚合酶混合，其中至少有一种脱氧核苷三磷酸是标记的;脱冲步骤最好在聚合酶不表现其连续性的条件下进行，在0℃至20℃进行30秒至20分钟，或者至少限制一种三磷酸核苷;追止步骤包括在四份等分量的脉冲步骤后的混合物中分别加入一种链终止试剂;追止步骤最好是在30℃至50℃下进行1至60分钟;终止试剂是双脱氧核苷酸，或一种有限量的脱氧核苷三磷酸;四种脱氧核苷酸中的一种是dITP或脱氮鸟苷，使用标记引物可免去脉冲步骤，标记最好是放射性或荧光标记;在DNA顺序反应的脉冲反应通常所用的第二环境条件下，聚合酶不能表现其连续性。

在其它方面，本发明的牲是：a）使用没有核酸外切酶活性的连续性DNA聚合酶，由没有3′伸出末端的线性DNA分子产生平端双链DNA分子的方法;b）一种扩增DNA顺序的方法，包括使第一和第二引物与双链DNA顺序的相反链退火，使退火后的混合物与连续性DNA聚合酶保温，每毫克该聚合酶的核酸外切酶活性小于500单位，最好是小于1单位，在此方法中，第一和第二引物与DNA顺序的相反链退火;在一个较好的具体桨钢校锏?′端位于相互对立的方向;此方法进一步包括，在保温步骤后使产生的DNA变性，使第一和第二引物与产生的DNA退火，使退火后的混合物与聚合酶保温;变性退火和保温的循环最好重复10至40次;c）一种体外诱变克隆的DNA片段的方法，包括提供一种克隆片段，并用连续性DNA聚合酶合成DNA链，每毫克该聚合酶的核酸外切酶活性小于1单位;d）一种由在同一细胞中非渗漏启动子（见下述）控制下的克隆的DNA片段产生活性T7型DNA聚合酶的方法，包括仅在细胞处于对数生长期或平衡期时诱导基因表达，并从细胞中分离聚合酶;克隆片段最好在需T7 RNA聚合酶进行表达的启动子的调控下;e）一种编码T7-型DNA聚合酶的基因，该基因经过基因修饰降低了天然存在的核酸外切酶活性;最好是修饰了一个组氨酸（His）残基，进一步更好的是修饰了基因5的His-123;f）编码经过基因修饰的聚合酶基因的产物;g）一种从含有聚合酶表达载体的细胞中纯化T7 DNA聚合酶的方法，包括的步骤有细胞裂解，使聚合酶通过离了交换柱，通过DE 52 DEAE柱、磷酸纤维素柱、羟基磷灰石柱;在柱层析步骤之前，此方法最好包括用硫酸胺沉淀聚合酶;此方法进一步包括使聚合酶通过Sephadex DEAE A50柱的步骤;离子交换柱是DE 52 DEAE柱;h）一种使DNA聚合酶溶液中核酸外切酶活性失活的方法，包括使该溶液在含有氧、还原剂和过渡金属的容器中保温;i）一种测定DNA顺序的药盒，包括如上述定义的连续性DNA聚合酶，每毫克聚合酶的核酸外切酶活性小于500单位，其中，聚合酶能够在第一环境条件下表现其连续性，在第二环境条件下最好不能表现其连续性，以及一种测定顺序必需的选自链终止剂的试剂，以及dITP;j）一种标记DNA片段3′端的方法，包括使DNA片段与连续性DNA聚合酶以及一种标记的脱氧核苷酸保温，每毫克该聚合酶的核酸外切酶活性小于500单位;k）一种克隆的DNA片段体外诱变的方法，包括提供一种引物和一种模板，引物和模板具有一个特异的错配碱基，用连续性DNA聚合酶延长引物;l）一种克隆的DNA片段体外诱变的方法，包括提供克隆片段，用核酸外切酶活性小于50单位的连续性DNA聚合酶，在导致核苷酸碱基错误掺入的条件下合成DNA链。

本发明提供的DNA聚合酶是连续性的、无区别力的，并能够利用短引物。而且，此聚合酶没有结合的核酸外切酶活性。这些特点对于上述方法都是理想的性质，对于DNA顺序反应尤其是这样，因为聚酰胺凝胶中放射性的本底水平可以忽略，泳带上很少或没他伪带，而且条带很清晰-这使得很容易阅读DNA顺序。进一步，这种聚合酶能够用于DNA长片段的新测序方法，下面将予详细描述。

本发明的其它特点和长处从下面的优选具体实例的描述及权利要求书中将是明显可见的。

首先简要描述附图。

图1-3分别是载体pTrx-2、mGP1-1和pGP5-5的图示;

图4是T7 DNA聚合酶选择性氧化的示意图;

图5是修饰的T7聚合酶在亚乙烯基-dATP存在下合成DNA能力的示意图;

图6是使用修饰的T7 DNA聚合酶酶促扩增基因组DNA的示意图;

图7、8和9分别是pTrx-2、pGP5-5的一部分和mGP1-2的核苷酸顺序;

图10是pGP5-6的图示。

DNA聚合酶

一般说来，本发明的DNA聚合酶是连续性的，没有结合的核酸外切酶活性，不区分核苷酸类似物的掺入，能够使用小的寡核苷酸（如四聚体、六聚体和八聚体）作为特殊引物。现在详细讨论这些性质。

连续性：

连续性（Processivity）是指DNA聚合酶在DNA顺序测定的延长反应所常用的条件下，能够利用同一引物-模板连续掺入许多核苷酸而不从模板上解离。不同聚合酶的连续性程度不同：有些只掺入几个碱基即解离，如Klenow（约15个碱基）、T4DNA聚合酶（约10个碱基）、T5 DNA聚合酶（约180碱基）和逆转录酶（约200碱基）（Das et al.，J.Biol.Chem.254：1227，1979;Bambara et al.，J.Biol.Chem.253：413，1978），而其它聚合酶，例如本发明的聚合酶，在合适的环境条件下将保持结合至少到500碱基，更好是至少1000碱基。这种环境条件包括提供足够的所有四种脱氧核苷三磷酸，并且保温温度为10℃-50℃。连续性在大肠杆菌单链结合（ssb）蛋白存在下大大提高。

使用连续性酶时，测序反应的终止只会在掺入了一个链终止剂例如双脱氧核苷酸的碱基处发生。如果DNA聚合酶是非连续性的，则在测序反应中在对应于聚合酶解离的核苷酸处产生伪带。频繁的解离在错误位置形成条带的本底，使真正的DNA顺序模糊不清。用高浓度底物使反应混合物长时间（30-60分钟）保温可以部分克服这一弊病，这样可“追止”伪带直至凝胶顶部的高分子量区，使其离开阅读DNA顺序的区域。这并不是理想的解决方案，因为非连续性DNA聚合酶在模板的二级结构致密区域（或发夹区）解离的几率很高。在这些位点没有充分地重新启动引物的延长，则通常的结果是，在同一位置形成了所有四种核苷酸的带，从而模糊了DNA顺序。

类似物区分：

本发明的DNA聚合酶不能清楚地区分双脱氧核苷酸类似物和正常的核苷酸。就是说，类似物掺入的机会大约等同于正常核苷酸，或至少以正常分子十分之一的效率掺入类似物。本发明的聚合酶也不能清楚地分辨其他一些类似物。这一点很重要。因为除了四种正常的脱氧核苷三磷酸（dGTP、dATP、dTTP和dCTP）外，顺序测定反应还需要掺入其他类型的核苷酸衍生物，例如放射性或荧光标记的核苷三磷酸，通常用于用³⁵S、³²P或其它化学试剂标记合成链。如果DNA聚合酶不能区分类似物，则类似物的掺入几率将和正常核苷酸相同。这一点是很重要的。因为这样便可用最少量的放射性，用标记的核苷三磷酸高效率标记合成的DNA链。进一步，这种酶只需要低浓度的类似物，这使测序反应比使用区分性酶时更为便宜。

区分性聚合酶当以连续方式进行聚合和受阻时（克服二级结构障碍进行合成）表现出不同程度的区分性。由于这种障碍，凝胶上不同的放射性条带的强度将出现差异，这可能使顺序模糊不清。

核酸外切酶活性

本发明DNA聚合酶的核酸外切酶活性小于正常的或天然水平的50%，更好是小于1%，最好是小于0.1%（每个聚合酶分子的活性量）。正常或天然水平是指未修饰的T7-型聚合酶的核酸外切酶活性。根据下述改变的Chase等人的方法（J.Biol.Chem.249：4545，1974），测得每毫克聚合酶中结合的核酸外切酶活性一般为约5，000单位。核酸外切酶通过切下与模板错误配对的新合成碱基而提高DNA合成的精确度。这种结合的核酸外切酶活性不利于DNA测序反应的质量，它们提高了必须加入反应中的所需核苷酸前体的最低浓度，因为当核苷酸浓度下降时，聚合酶活性的速率降至和核酸外切酶活性差不多，导致没有DNA净合成，或甚至降解已合成的DNA。

更重要的是，结合的核酸外切酶活性将导致DNA聚合酶闲滞于模板上具有二级结构障碍的区域，当聚合酶接近这种结构时，其合成速率在它努力穿过此区域时会降低。当聚合酶受阻时，结合的核酸外切酶将切下新合成的DNA。其结果是将发生合成和切割的多次循环。这可能导致聚合酶最终越过发夹区进行合成（不损害测序反应的质量）;或者聚合酶可能从合成的链上解离（在所有四种测序反应中导致同一位置的伪带）;或者，一种链终止剂可能以高频率掺入，并使测序凝胶上的不同片段的强度产生很大的差异。发生这一现象是由于链终止剂在任何给定位点的掺入频率随着聚合酶掺入终止核苷酸的机会的次数而上升，因此，DNA聚合酶在闲滞位点将以比在其他位点高得多的频率掺入链终止剂。

一个理想的测序反应将在整个凝胶上产生强度均一的带。这对于使每一放射性片段在X-光胶片上得到最佳曝光是至关重要的。如果放射性条带有不同强度，则弱带可能检测不出来。为了使所有片段得到均一的放射性强度，DNA聚合酶在DNA的每一位置上应当占用同样的时间间隔，在任何给定位点对核苷酸的加入或去除都不表现出偏重。DNA聚合酶如果缺乏任何结合的核酸外切酶则会发生这一现象，这样，它将在沿着模板的每一位置都只有一次掺入链终止核苷酸的机会。

短引物

本发明的DNA聚合酶能够使用10个或更少碱基的引物，也能使用更长的引物，最好是4-20碱基的引物。使用短链引物的能力为DNA顺序测定提供了若干重要的有利条件。购买较短的引物更为便宜，也比通常的15-20聚体引物更易合成。它们与DNA模板上的互补位点退火也更为迅速，从而使测序反应进行得更快。进一步，在DNA顺序测定中使用小的寡核苷酸引物（如6或7个碱基）的能力，使得能够测定用别的方法不能测定的长DNA片段的顺序。例如，可以生产一种含有80个随机六聚体的药盒，其中没有一个互补于克隆载体的任何位点。从统计学观点来看，在有待测定顺序的DNA片段上，平均每50个碱基中将会出现一个80个六聚体中之一的顺序。3000碱基顺序的测定将只需进行五次测序循环。首先，用一种“普遍的”引物（如New England Biolabs ＃1211，顺序为5′GTAAAACGACGGCCAGT3′）测定插入片段一端大约600个碱基的顺序。利用此测序反应的结果，可从药盒中选出一个新的引物，它与测定顺序的末端附近的一个区域同源，在第二次循环中，用此引物测定下一个600碱基的顺序。此过程重复五次将测完3000碱基的顺序，不需要任何亚克隆步骤，不必化学形成任何新的寡核苷酸引物。在测序反应中加进T7的基因2.5和4蛋白，可提高使用这种短引物的效果。

本发明的DNA聚合酶（即具有上述性质）包括修饰的T7-型聚合酶。即该DNA聚合酶需要宿主硫氧还蛋白作为一个亚基，它们与修饰的T7 DNA聚合酶或从有关噬菌体例如T3、φⅠ、φⅡ、H、W31、gh-1、Y、A1122和SP6等中分离的等价酶是基本一致的。这些酶中的每一种都能经修饰而具有类似于修饰的T7酶的性质。能够从噬菌体感染的细胞中直接分离该酶，但该酶最好从过量生产它的细胞中分离，基本一致是指该酶可能具有不影响酶的总体性质的氨基酸置换。特别期望的氨基酸置换的实例之一是对天然酶进行修饰以去除任何外切核酸酶活性。此修饰可在基因或化学水平上进行（见下述）。

T7聚合酶的克隆

作为本发明的一个实例，我们将描述T7 DNA聚合酶的克隆、过量生成、纯化、修饰及应用。这种连续酶由两个密切复合的多肽以一对一的化学数量组成。一个是84，000道尔顿的噬菌体T7编码的基因5蛋白（Modrich等人，J.Biol.Chem.150：5515，1975），另一个是12，000道尔顿的大肠杆菌编码的硫氧还蛋白（Tabor等人，J.Biol.Chem.262：16.216，1987）。硫氧还蛋白是一种辅助蛋白，它使基因5蛋白（非连续性的实际DNA聚合酶）附着在引物模板上。天然的DNA聚合酶结合有很高的3′至5′核酸外切酶活性。此活性使得聚合酶不能用DNA顺序测定，而必须在使用聚合酶之前使其失活或进行修饰。如下所述，通过化学法局部氧化核酸外切酶区域，或通过基因工程修饰聚合酶基因中编码此活性的编码区，很容易达到这一点。

pTrx-2

为了克隆大肠杆菌的trxA（硫氧还蛋白）基因，用Sau3A部分切割野生型大肠杆菌DNA，将所得片段与从T7 ST9菌株中分离的BamHI切割的T7 DNA连接（Tabor等人，in Thioredoxin and Glutaredoxin Systems：Structure and Function（Holmgren等人，eds）pp.285-300，Rave Press，NY;and Tabor等人，如上）。连接后的DNA转染至大肠杆菌trxA细胞中，将混合物涂布在trxA细胞上，挑出产生的T7空斑。由于T7没有大肠杆菌的活性trxA基因就不能生长，因此只有那些含有trxA基因的噬菌体才能形成空斑。克隆的trxA基因定位于470碱基对HincⅡ片段上。

为了过量生成硫氧还蛋白，构建一种叫pTrx-2的质粒。简单地说，通过常规方法（Maniatis et al.，Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labs.，Cold Spring Harbor，N.Y.）分离含有trxA基因的470碱基对HincⅡ片段，将其连接到含有Ptac启动子（ptac-12，Amann et al.，Gene 25：167，1983）的pBR322衍生物上。参见图2，用PvuⅡ切割含有β-内酰胺酶和ColEI起点的ptac-12，产生一个2290碱基对的片段，然后用市售的连接子（SmaⅠ-BamHI多连接子）使之与二个串联的trxA拷贝（HincⅡ片段）连接，形成pTrx-2。图7显示了pTrx-2的完整核苷酸顺序。现有，硫氧还蛋白的生成在tac启动子的调控下，这样可特异地例如利用IPTG（异丙基β-D-硫代半乳糖苷）进行诱导。

pGP5-5和mGP1-2

T7的某些基因产物在大肠杆菌中的表达是致死性的。以T7 RNA聚合酶的可诱导表达为基础，发展出了促进致死基因克降和表达的表达系统。基因5蛋白在某些大肠杆菌株中是致死性的，Tabor等人（Proc.Nat.Acad.Sci.82：1074，1985）描述了这样一种系统的一个实例，其中，T7的基因5处在φ10启动子的调控下，只有当细胞中存在有T7 RNA聚合酶时才会表达。

简言之，通过常规方法构建pGP5-5（图3），利用合成的BamHI连接子，使T7的含有基因5的14306（NdeⅠ）至16869（AhaⅢ）片段，与T7的含有φ1.1A和φ1.1B两个启动子的5667（HincⅡ）至6166（Fnu4H1）的560碱基对片段（它由T7 RNA聚合酶所识别），以及pACYC177的3Kb BamHⅠ-HincⅡ片段相连接（Chang et al.，J.Bacteriol.134：1141，1978）。图8显示了T7插入片段和连接子的核苷酸顺序。在此质粒中，基因5只在细胞中提供有T7 RNA聚酶时表达。

参见图3，T7 RNA聚合酶是在噬菌体载体mGP1-2上提供的。这与pGP1-2（Tabor et al.，同上）相类似，不同的是分别用BglⅡ和SalⅠ连接子。将含有T7 RNA聚合酶的3133（HaeⅢ）至5840（HinfⅠ）的T7片段，与BamHⅠ-SalⅠ切割的M13mp8相连接，使聚合酶基因置于1ac启动子的调控下。图9显示了mGP1-2的完整核苷酸顺序。

由于pGP5-5和pTrx-2有不同的复制起点（分别为P15A和CalE1起点），所以它们能同时转化到一个细胞中去pTrx-2在IPTG存在下表达大量的硫氧还原白。mGP1-2象这两个质粒一样能共存于同一细胞中，并能简单地通过用IPTG诱导1ac启动子导致T7-RNA聚合酶的生成，而用于调控pGP5-5的T7-DNA聚合酶表达。

T7 DNA聚合酶的过量生成

有机种可行的方案可用于trxA和基因5两种基因产物的过量生成和再构成。在所有方案中可使用相同的细胞株和质粒。在较好的方案中，两种基因在同一细胞中共同进行过量表达。（这是因为基因5在与硫氧还蛋白结合之前对蛋白酶敏感。）正如下面详细描述的，一种方法是将两种基因分别置于同一细胞中的两个相容质粒上。另外，两种基因也可串联置于同一质粒上。将T7基因5置于非渗漏的可诱导启动子如T7的φ1.1A、φ1.1B和φ10的调控之下是很重要的，因为在大多数大肠杆菌细胞中，这两种多肽即使少量地同时合成也是有害的。非渗漏是指当控制基因表达的启动子未活化时，在每个细世代中由基因产生的基因产物少于500分子。最好是使用T7 RNA聚合酶表达系统，但是可诱导启动子的其他表达系统也可使用。渗漏启动子（例如plac）即使在未诱导时，也允许合成多于500分子的蛋白质，这样，含有在这种启动子控制之下的致死基因的细胞生长不良，因此，不能用于本发明中。当然，也可能产生的产物对细胞并非致死。此时，如plac启动子则适用于这种细胞。

在第二方案中，每种基因可分别克隆并进行过量表达。应用这种方案时，将含有单种过量生成的多肽的细胞先行合并，然后制备提取物，此时两种多肽形成活性的T7 DNA聚合酶。

实例1 T7 DNA聚合酶的生成

用大肠杆菌71.18株（Messing et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.74：3642，1977）制备mGP1-2贮备物。71.18株于-80℃下储存在50%甘油中，在常规的基本培养基琼脂平板上划线培养。使单一菌落于37℃下在25ml常规M9培养基中生长过夜，利用新制备的71.18细胞测定贮备物效价得到mGP1-2的单个噬斑。用噬斑接种10ml含有JM103的2×LB（2%Bacto-Tryptone，1%酵母抽提物，0.5%NaCl，8mM NaOH）使之生长至A₅₉₀＝5.0。此培养物将提供大量制备mGP1-2培养物的噬菌体贮备。3-12小时后，离心此10ml培养物，用上清液感染大量（2L）培养物。对于此大量培养物，用培养在M9中的4×5ML 71.18细胞接种4×500ml 2×LB，并在37℃下振摇。当大量细胞培养物生长至A₅₉₀＝1.0时（大约3小时），用10ml含有mGP1-2初始溶菌液的上清液对它们接种。然后将感染的细胞于37℃下培养过夜。第二天，离心去除细胞，上清液可备用于K38/pGP5-5/pTrx-2的诱导（见下述）。上清液可以～5×10¹¹φ/ml的滴定度在4℃下储存大约6个月。在此滴定度下，1升噬菌体将感染12升A₅₉₀＝5的细胞，感染复数是15。如果滴定度很低，可在上清液中溶入NaCl（60g/l）和PEG-6000（65g/l），使混合物于0℃下静置1-72小时，然后离心（7000rpm，20分钟），使mGP1-2噬菌体从上清液中浓缩。含有mGP1-2噬菌体的沉淀再悬浮于大约原来体积1/20的M9培养基中。

K38/pGP5-5/pTrx-2是含有两种相容质粒pGP5-5和pTrx-2的大肠杆菌株（基因型Hfr-C（λ））。pGP5-5质粒具有P15A复制起点并表达卡那霉素（Km）抗性基因。pTrx-2具有ColE1复制起点并表达氨苄青霉素（Ap）抗性基因。质粒是通过常规方法导入K38中的，分别选择Km^R和Ap^R。K38/pGP5-5/pTrx-2细胞于-80℃储存在50%甘油中。使用之前，使它们在含有50μg/ml氨苄青霉素和卡那霉素的平板上划线培养，在37℃下培养过夜，单一菌落于37℃下在10ml含有50μg/ml氨苄青霉素和卡那霉素的LB培养基中培养4-6小时。用此10ml细胞培养物接种500ml含有50μg/ml氨苄青霉素和卡那霉素的LB培养基，于37℃下振摇过夜。第二天1，用此500ml培养物接种12升2×LB-KPO₄培养基（2%Bacto-Trypton，1%酵母抽提物，0.5%NaCl，20mM KPO₄，0.2%右旋糖和0.2%酪蛋白氨基酸，pH7.4），于37℃下在发酵罐中通气培养。当细胞达到A₅₉₀＝5.0（即对数期或稳定期细胞）时，用感染复数10的mGP1-2感染，并加入IPTG（终浓度为0.5mM）。IPTG在mGP1-2中诱导硫氧还蛋白和T7 RNA聚合酶的产生，并因此诱导克隆的DNA聚合酶的生成。细胞再在搅拌和通气下培养2.5小时，然后收集。细胞沉淀再悬浮于1.5升10%蔗糖/20mMTris-HCl pH8.0/25mM EDTA中并再离心。最后，细胞沉淀再悬浮于200ml 10%蔗糖/20mM Tris-HCl pH8/1.0mM EDTA中，冰冻在液氮中。由12升诱导细胞中得到70克细胞膏状物，其中含有大700mg基因5蛋白和100mg硫氧还蛋白。

K38/pTrx-2（仅含有pTrx-2的K38）过量生产硫氧还蛋白，将它作为“激发剂”加到K38/pGP5-5/pTrx-2提取物中，以确保开始纯化时硫氧还蛋白多于基因5蛋白。K38/pTrx-2细胞于-80℃下储存于50%甘油中。使用之前，使它们在含有50μg/ml氨苄青霉素的平板上划线培养，于37℃下培养24小时，单一菌落于37℃下在25ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜。用此25ml培养物接种2升2×LB培养基并于37℃下振荡。当细胞达到A₅₉₀＝3.0时，加入IPTG（终浓度0.5mM）诱导pTac启动子，并因此诱导硫氧还蛋白的生成。细胞于37℃再振荡培养12-16小时，然后收集，再悬浮于600ml 10%蔗糖/20mM Tris-HCl，pH8.0/25mM EDTA中并再离心。最后，细胞再悬浮于40ml 10%蔗糖/20mM Tris-HCl，pH8/0.5mM DETA中，冰冻在液氮中，由2升细胞得到16g细胞膏状物，其中含有150mg硫氧还蛋白。

检测聚合酶时，要使用单链小牛胸腺DNA（6mM）作为底物。这是马上就要使用之前如下述制备的：用50mM NaOH于20℃处理双链小牛胸腺DNA 15分钟使之变性，然后用HCl中和。任何纯化的DNA都可用来作为聚合酶检测的模板，但它最好具有大于1，000碱基的长度。

所用的常规T7 DNA聚合酶检测法是经修改的Grippo等人所述的方法（J.Biol.chem.246：6867，1971）。标准的反应混合物（终体积200μl）含有40mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl₂、5mM二硫苏糖醇、100nmol碱变性的小牛胸腺DNA、0.3mM dGTP、dATP、dCTP和〔³H〕dTTP（20cpm/pm）、50μg/ml BSA和含量不同的T7 DNA聚合酶。在37℃（10℃-45℃）下保温30分钟（5分-60分）。加入3ml冷的（0℃）1N HCl-0.1M焦磷酸盐终止反应。根据Hinkle等人的方法（J.Biol.Chem.250：5523，1974）测定不溶于酸的放射性。DNA在冰上沉淀15分钟（5分-12小时），然后通过过滤而沉淀在玻璃纤维滤器上。滤器用4ml冷的（0℃）0.1M HCl-0.1M焦磷酸盐洗涤5次，再用冷的（0℃）90%乙醇洗涤2次。干燥后，滤器上的放射性利用非水闪烁液计数。

在上述给定条件下，一单位聚合酶活性于37℃下30分钟时间内，催化10nmol的总核苷酸掺入到溶于酸的形式中。利用上述的常规检测条件，天然的T7 DNA聚合酶和修饰的T7 DNA聚合酶（见下）具有相同的聚合酶比活±20%，对于天然型酶范围在5，000-20，000单位/mg，对于修饰的聚合酶范围在5，000-50，000单位/mg，根据制剂而不同。

通过沉淀和层析技术从上述提取物中纯化T7 DNA聚合酶。下面是这种纯化的一个实例。

冰冻细胞（200ml K38/pGP5-5/pTrx-2和40ml K38/pTrx-2）的提取物在0℃下融解过夜。合并上述细胞，加入5ml溶菌酶（15mg/ml）和10ml NaCl（5M）。0℃下45分钟后，细胞置入37℃水浴中直至其温度达到20℃。然后使细胞在液氮中冰冻。再加入50ml NaCl（5M）。细胞在37℃水浴中融解。融解后，细胞在0℃下轻轻混合60分钟。溶解液在Beckman 45Ti转子中以35，000rpm离心1小时。上清液（250ml）即是组分1。它含有大约700mg基因5蛋白和250mg硫氧还蛋白（硫氧还蛋白与基因5蛋白的比例为2∶1）。

将90g硫酸胺溶入组分Ⅰ（250ml）中搅动60分钟。使悬浮液静置60分钟，以8000rpm离心60分钟以收集产生的沉淀。沉淀再溶入300ml 20mM Tris-HCl pH7.5/5mM 2-巯基乙醇/0.1mM EDTA/10%甘油（缓冲液A）中。这即是组分Ⅱ。

制备Whatman DE52 DEAE柱（12.6cm²×18cm）并用缓冲液A洗涤。组分Ⅱ在1升缓冲液A中透析过夜，换液2次，直至组分Ⅱ的电导率与含100mM NaCl的缓冲液A的电导率相等时为止。透析过的组分Ⅱ以100ml/小时的流速加到柱上，用400ml含有100mM NaCl的缓冲液A洗涤。用3.5升梯度为100-400mM NaCl的缓冲液A以60ml/小时的流速洗脱蛋白。收集在200mM NaCl时洗脱的含有T7DNA聚合酶的组分。这即是组分Ⅲ（190ml）。

制备Whatman p11磷酸纤维素柱（12.6cm²×12cm），并用20mM KPO₄pH7.4/5mM2-巯基乙醇/0.1mM EDTA/10%甘油（缓冲液B）洗涤。组分Ⅲ用缓冲液B稀释2倍（380ml），然后以60ml/小时的流速加到柱上，用200ml含有100mM KCl的缓冲洗B洗涤。用1.8升梯度为100-400mM KCl缓冲液B以60ml/小时的流速洗涤蛋白。收集用300mM KCl洗脱的含有T7 DNA聚合酶的组分。这即是组分Ⅳ（370ml）。

制备DEAE-Sephadex A-50柱（4.9cm²×15cm），并用20mM Tris-HCl pH7.0/0.1mM二硫苏糖醇/0.1mM EDTA/10%甘油（缓冲液C）洗涤。组分Ⅳ用1升缓冲液C透析2次，透析至最终电导率与含100mM NaCl的缓冲液C的电导率相等。以40ml/小时的流速将透析过的组Ⅳ加到柱1上，用150ml含有100mM NaCl的缓冲液C洗涤。用1升梯度为100-300mM NaCl的缓冲液C以40ml/小时的流速洗脱蛋白。收集以210mM NaCl洗脱的含T7 DNA聚合酶的组分。这即是组分Ⅴ（120ml）。

制备Bio Rad HTP羟磷灰石柱（4.9cm²×15cm），并用20mM KPO₄，pH7.4/10mM 2-巯基乙醇/2mM柠檬酸钠/10%甘油（缓液液D）洗涤。每次用500ml缓冲液D透析组分Ⅴ2次。透析过的组分Ⅴ以30ml/小时的流速加到柱上，用100ml缓冲液D洗涤。用900ml梯度为0-180mM KPO₄，pH7.4的缓冲液D以30ml/小时的流速洗脱蛋白。收集以50mM KPO₄洗脱的含有T7 DNA聚合酶的组分。这即是组分Ⅵ（130ml）。它含有270mg均一的T7 DNA聚合酶。

组分Ⅵ在20mM KPO₄pH7.4/0.1mM二硫苏糖醇/0.1mM EDTA/50%甘油中透析。这是浓缩的组分Ⅵ（～65ml，4mg/ml），于-20℃下保存。

分离的T7聚合酶结合有核酸外切酶活性。如上所述必须使此活性失活。下面是一个通过化学修饰进行失活的实例。

浓缩的组分Ⅵ在20mM KPO pH7.4/0.1mM二硫苏糖醇/10%甘油中透龉梗ゴ嬖谟诖⒋婊撼逡褐械腅DTA。透析后，将浓度用20mM KPO pH7.4/0.1mM二硫苏糖醇/10%甘油调整为2mg/ml，将30ml（2mg/ml）的等分试样置于50ml聚丙烯管中（2mg/ml时，T7 DNA聚合酶的摩尔浓度为22μM）。

二硫苏糖醇（DTT）和硫酸铵亚铁（Fe（NH₄）₂（SO₄）₂6H₂O）在即将使用前新制备，并加到T7 DNA聚合酶的30ml等分试样中，加入浓度为5mM DTT（0.6ml 250mM母液）和20μM Fe（NH₄）₂（SO₄）₂6H₂O（0.6ml 1mM母液）。在修饰时，T7 DNA聚合酶和铁的摩尔浓度都是大约20μm，而DTT的摩尔数则过量250倍。

修饰过程如下述于0℃下在饱和的氧气氛中进行。反应混合物置于干燥器中的冰上，干燥器通过真空排除了空气并随之用100%氧充满。此循环重复3次。反应可在空气（20%氧）中进行，但速率只有三分之一。

图4给出了丧失核酸外切酶活性的时间过程。根据Richardson所述（J.Molec.Biol.15：49，1966），由细菌噬菌体T7制备³H-标记的双链DNA（6cpm/p mol）。³H-标记的单链T7 DNA在即将使用前如下制备：用50mM NaOH于20℃下使³H标记的双链T7 DNA变性15分钟，然后用HCl中和。所用的常规核酸外切酶检测法是修改过的Chase等人所述的方法（同上）。标准的反应混合物（终体积100μl）含有40mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl₂、10mM DTT、60nmol³H-标记的单链T7 DNA（6cpm/pmole），以及含量不同的T7 DNA聚合酶。³H-标记的双链T7 DNA也可作为底物使用。而且，任何均一放射标记的DNA，单链的或双链的，都可用于检测中。3′端标记的单链或双链DNA也可用于检测。在37℃下保温15分钟后，加入30μl BSA（10mg/ml）和25μl TCA（100% W/V）终止反应。检测可在10℃-45℃下进行1-60分钟。DNA在冰上沉淀15分钟（1分钟-12小时），然后以12，000g离心30分钟（5分钟-3小时）。用100μl上清液测定溶于酸的放射性，即通过将它加入400μl水和5ml水性闪烁混合液中测定。

在检测条件下，一个单位的核酸外切酶活性在30分钟内，催化10nmol的总核苷酸的酸溶解。使用上述的标准检测条件，天然T7DNA聚合酶的核酸外切酶比活为5000单位/mg。修饰的T7 DNA聚合酶的核酸外切酶比活根据化学修饰的程度而定，但理想情况是至少比天然T7DNA聚合酶低10-100倍，或使用上述的标准检测条件为500至50或更少的单位/mg。如果使用双链底物，则核酸外切酶活性大约高7倍。

在前面概括的条件下，核酸外切酶活性指数衰变，半衰期为8小时。每天混合一次反应容器，使溶解氧均匀分布，否则，反应在氧浓度较高的表面进行得更为迅速。每天加入一次2.5mM DTT（0.3ml新制备的250mM母液加至30ml反应液中）以补充被氧化的DTT。

8小时后，T7 DNA聚合酶的核酸外切酶活性降低50%，损失的聚合酶活性可忽略。50%的损失可能是一半聚合酶分子的核酸外切酶活性完全失活的结果，而不是所有分子的核酸外切酶活性速率普遍降低。因此，在8小时反应后，所有分子都具有正常的聚合酶活性，一半分子具有正常的核酸外切酶活性，而另一半分子的核酸外切酶活性小于原来的0.1%。

当50%的分子被修饰时（8小时反应），尽管不太理想，此酶仍适用于DNA顺序测定。为了进行更高质量的DNA顺序测定，使反应一直进行到发生大于99%的修饰（核酸外切酶活性小于50单位），这需要4天时间。

4天后，反应混合物用2次250ml的20mM KPO₄pH7.4/0.1mM DTT/0.1mM EDTA/50%甘油透析，除去铁。修饰的T7 DNA聚合酶（～4mg/ml）于-20℃下存储。

T7 DNA聚合酶化学修饰的反应机理依赖于由于还原态过渡金属（如Fe⁺）和氧的存在而产生的活泼氧。下面概括了产生羟基自由基的可能的反应机理：

（1）Fe²⁺+O₂→Fe³⁺+O₂

（2）2O₂+2H⁺→H₂O₂+O₂

（3）Fe²⁺+H₂O₂→Fe³⁺+OH+OH^-

在反应式1中，还原态金属铁的氧化作用产生超氧物自由基O₂。超氧物自由基可经过歧化反应产生过氧化氢（反应式2）。最后，过氧化氢可与还原态金属铁离子反应形成羟基自由由基即OH^-（Fenton反应，反应式3）。利用还原剂如DTT，氧化的金属离子再循环到还原态。

这些活泼氧可能通过特异氨基酸残基的不可逆的化学改变而使蛋白质失活。对由CNBr或胰蛋白酶产生的基因5的片段进行SDB-PAGE时观察到了这种损害。有些片段消失了，发生高分子量的交联，而某些段被断裂成两个较小的片段。

如前所述，氧、还原剂（如DTT、2-羟醯基乙醇）和过渡金属（如铁）是修饰反应中的重要成分。反应可在空气中进行，使用100%的氧可促使反应速率提高3倍。反应在不加入过渡金属时将进行缓慢，因为在大多数缓冲液制剂中含有微量过渡金属（1-2μM）。

正如所预想的，修饰反应的抑制剂包括无氧条件（如氮）如金属螯合剂（如EDTA、柠檬酸盐、次氮基三乙酸盐等）。此外，过氧化氢酶和超氧物歧化酶可能抑制反应，这与活泼氧在生成修饰的T7 DNA聚合酶中具有主要作用是一致的。

作为可供选择的方法，有可能使T7的基团5发生基因突变，从而专一性地使该蛋白的核酸外切酶结构域失活。从这种突变体中纯化得到的T7基因5蛋白可很理想地用于DNA顺序测定，而不需要通过氧过化使核酸外切酶失活，也不会在化学修饰时对蛋白质产生不可避免的二级结构损害。

基因修饰的T7 DNA聚合酶可如下分离：使基因5发生随机突变，然后筛选那些丧失核酸外切酶活性，但未丧失聚合酶活性的突变体。诱变如下述进行。通过常规方法制备在T7 RNA聚合酶启动子控制下的含有基因5的单链DNA（如克隆在pEMBL-8中，这是一个含有单链DNA复制起点的质粒），用两种不同的化学诱变剂处理：肼，它将使C和T变突;以及甲酸，它将使G和A突变（Myers et al.，Science 229：242，1985）。应用能使平均每一质粒分子中有一个碱基改变的剂量使DNA诱变。然后，此单链的诱变质粒接上普遍性的17聚体引物（见上述），并用作合成相反链的模板。合成链在对应于模板的突变碱基处含有随机掺入的碱基。然后，用此双链的突变DNA转化K38/pGP1-2菌株，它是含有质粒pGP1-2的K38株（Tabor et al.，见上）。在热诱导条件下，此菌株表达T7 DNA聚合酶。转化的细胞于30℃下进行平板培养，每个平板大约200个菌落。

以下列发现为基础，筛选具有缺乏核酸外切酶活性的T7 DNA聚合酶细胞。DNA聚合酶的3′至5′核酸外切酶活性具有校正的功能。当掺入错误碱基时，核酸外切酶将把新掺入的碱基作为“非正常”的碱基切掉。dATP的类似物就是这种情况，T7 DNA聚合酶很容易在dATP的位置掺入亚乙烯基-dATP。但如果T7 DNA聚合酶具有3′至5′核酸外切酶活性，它一掺入就迅速被切下，从而没有DNA净合成。如图6所示，利用交错的共聚物多聚d（AT）作为模板，天然的T7 DNA聚合酶只有在dATP存在下才能催化大量DNA的合成，而亚乙烯基-dATP存在时不行。与此相反，修饰的T7 DNA聚合酶由于没有结合的核酸外切酶活性，则以可与dATP相比的速率将亚乙烯基-dATP稳定地掺入DNA中。因此，利用多聚d（AT）作为模板，dTTP和亚乙烯基-dATP作为前体，天然的T7DNA聚合酶不能由此模板合成DNA，而缺乏核酸外切酶活性的T7 DNA聚合酶将能够用此模板合成DNA。

Raetz描述了裂解和筛选大量菌落的方法（Proc.Nat.Acad.Sci.72：2274，1975）。简言之，将用含有突变的基因5的质粒转化的K38/pGP1-2细胞，从培养皿转移至滤纸片上（“复制平板”），在培养皿上的转化细胞大约为每块平板200个菌落。然后，将滤纸圆片置于42℃下60分钟以诱导T7 RNA聚合酶，它则能使基因5蛋白得到表达。硫氧还蛋白本质上是从染色体基因中产生的。在滤纸片上加入溶菌酶以溶解细胞。在经过冻融步骤以确保细胞溶解后，滤纸圆片与多聚d（AT）、[α³²P]dTTP和亚乙烯基-dATP于37℃下保温60分钟。然后用酸洗涤滤纸圆片以去除未掺入的[³²P]dATP。DNA将在酸中沉淀在滤纸片上，而核苷酸是可溶的。然后用X-光胶片对洗过的滤纸曝光。诱导出缺乏核酸外切酶活性的T7 DNA聚合酶的菌落，将掺入不溶于酸的³²P，并将由放射自显影而观察到。表达天然的T7 DNA聚合酶，或表达缺乏聚合酶活性的T7 DNA聚合酶的菌落，则将不会在放射自显影中出现。

从含有原初菌落的主培养皿中回收呈现阳性的菌落。对每份含可能的阳性克隆的细胞进行大规模（1升）诱导，从每份制备物中纯化T7 DNA聚合物，以确定每个突变体结合的核酸外切酶水平。核酸外切酶活性较低的适于进行DNA顺序测定。

也可使用定向诱变以分离出T7基因5蛋白的核酸外切酶结构域的基因突变体。下面是此方法的一个实例。

核酸外切酶活性降低的T7 DNA聚合酶（修饰的T7 DNA聚合酶）也可利用其穿越二级结构区域进行合成的能力而与天然的T7 DNA聚合酶区别开。也就是说，用修饰的DNA聚合酶，由标记引物在具有二线结构的模板上合成DNA时，延伸长度与未修饰的或天然的DNA聚合酶相比长得多。这种检测法可作为对小百分比DNA聚合酶分子转化为修饰聚合酶进行筛选的基础。

用若干化学试剂处理后，用上述检测法筛选改变的T7 DNA聚合酶。有三种反应导致该酶转化成修饰的酶。第一是如上述的用铁和还原剂处理。另两个是用光氧化染料玫瑰红和甲烯蓝在光的存在下处理酶。染料必须小心滴定，但与铁诱导的氧化作用相比较，即使在最佳条件下，对核酸外切酶活性而不对聚合酶活性失活的专一性也较低。由于这些染料对于组氨酸残基的修饰有高度专一性，此结果有力地表明，组氨酸残基是核酸外切酶活性位点中的一个重要部分。

在T7基因5蛋白中有23个组氨酸残基。其中有8个残基位于蛋白质的氨基端一半，根据与大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段的同源性，这个区域可能是核酸外切酶结构域所在之处（Ollis et al.，Nature 313：818，1984）。如下所述，8个组氨酸残基中有7个通过合成合适的寡核苷酸而单个地进行突变，然后掺入基因5中。它们相应于表1中的突变体1和6-10。

突变体的构建是首先将来自pGP5-3的T7基因5（Tabor et al.，J.Biol.Chem.282，1987）克隆入M13 mp18载体的SmaⅠ和HindⅢ位点中，产生mGP5-2（在此方法中，所用载体和基因5的来源不是很关键的）。由在脱氧胸腺嘧啶处掺入了脱氧尿嘧啶的菌株制备单链的mGP5-2DNA（Kunke;Proe.Natl.Acad.Sci.USA 82：488，1985）。转染到野生型大肠杆菌中后，由于含有尿嘧啶的链将优先降解，因此，此方法对于仅有合成链（含有突变的链）的存活提供了有利的选择作用。

利用常规方法合成长度为15-20碱基的突变的寡核苷酸。将每种寡核苷酸与模板退火，用天然的T7 DNA聚合酶延伸，用T4 DNA连接酶连接。由琼脂糖凝胶电脉分离出共价闭合的环状分子，电泳时存在有0.5μg/ml的溴化乙锭。然后，用得到的纯化分子转化大肠杆菌71.18。从产生的空斑分离DNA，测定相关区域的顺序以证实每一个突变的存在。

以下概括了用以在基因5核酸外切酶中产生基因突变的寡核苷酸。用划下线标出产生的突变。采用Dunn等人（J.Molec.Biol.166：477，1983）的氨基酸和碱基对编号。同时还显示了与突变的基因5区域相关的野生型顺序。

野生型顺序：

109（aa） 122 123

Leu Leu Arg Ser Gly Lys Leu Pro Gly Lys Arg Phe Gly Ser His Ala Leu Glu

CTT CTG CGT TCC GGC AAG TTG CCC GGA AAA CCC TTT GGG TCT CAC GCT TTG GAG

14677（T7碱基对）

突变1：His 123→Ser 123

所用引物：5′ CGC TTT GGA TCC TCC GCT TTG 3′

突变顺序：

123

Leu Leu Arg Ser Gly Lys Leu Pro Gly Lys Arg Phe Gly Ser Ser Ala Leu Glu

CTT CTG CGT TCC GGC AAG TTG CCC GGA AAA CGC TTT GGA TCC TCC GCT TTG GAG

突变2：Ser 122和His123的缺失

所用引物：5′ GGA AAA CGC TTT GGC GCC TTG GAG GCG 3′

Δ

6个碱基缺失

突变顺序

122 123

Leu Leu Arg Ser Gly Lys Leu Pro Gly Lys Arg Phe Gly … … Ala Leu Glu

CTT CTG CGT TCC GGC AAG TTG CCC GGA AAA CGC TTT GGC --- --- GCC TTG GAG

突变3：Ser 122，His 123→Ala 122，Glu 123

所用引物：5′ CGC TTT GGG GCT GAG GCT TTG G 3′

突变顺序：

122 123

Leu Leu Arg Ser Gly Lys Leu Pro Gly Lys Arg Phe Gly Ala Glu Ala Leu Glu

CTT CTG CGT TCC GGC AAG TTG CCC GGA AAA CGC TTT GGG GCT GAG GCT TTG GAG

突变4：Lys 118，Arg 119→Glu 118，Glu 119

所用引物：5′ 5′ G CCC GGG GAA GAG TTT GGG TCT CAC GC 3′

突变顺序

118 119

Leu Leu Arg Ser Gly Lys Leu Pro Gly Glu Glu Phe Gly Ser His Ala Leu Glu

CTT CTG CGT TCC GGC AAG TTG CCC GGG GAA GAG TTT GGG TCT CAC GCT TTG GAG

突变5：Arg 111，Ser 112，Lys 114→Glu 111，Ala 112，Glu 114

所用引物：5′ G GGT CTT CTG GAA GCC GGC GAG TTG CCC GG 3′

突变顺序

111 112 114

Leu Leu Glu Ala Gly Glu Leu Pro Gly Lys Arg Phe Gly Ser His Ala Leu

Glu

CTT CTG GAA GCC GGC GAG TTG CCC GGA AAA CGC TTT GGG TCT CAC GCT TTG GAG

突变6：His 59，His 62→Ser 59，Ser 62

所用引物：5′ ATT GTG TTC TCC AAC GGA TCC AAG TAT GAC G 3′

野生型顺序：

aa：55 59 62

Leu Ile Val Phe His Asn Gly His Lys Tyr Asp Val

CTT ATT GTG TTC CAC AAC GGT CAC AAG TAT GAC GTT

T7碱基对：14515

突变顺序

59 62

Leu Ile Val Phe Ser Asn Gly Ser Lys Tyr Asp Val

CTT ATT GTG TTC TCC AAC GGA TCC AAG TAT GAC GTT

突变7：His 82→Ser 82

所用引物：5′ GAG TTC TCC CTT CCT CG 3′

野生型顺序

aa：77 82

Leu Asn Arg Glu Phe His Leu Pro Arg Glu Asn

TTG AAC CGA GAG TTC CAC CTT CCT CGT GAG AAC

T7碱基对：14581

突变型顺序

82

Leu Asn Arg Glu Phe Ser Leu Pro Arg Glu Asn

TTG AAC CGA GAG TTC TCC CTT CCT CGT GAG AAC

突变8：Arg 96，His 99→Leu 96，Ser 99

所用引物：5′ CTG TTG ATT TCT TCC AAC CTC 3′

野生型顺序

aa：93 96 99

Val Leu Ser Arg Leu Ile His Ser Asn Leu Lys Asp Thr Asp

GTG TTG TCA CGT TTG ATT CAT TCC AAC CTC AAG GAC ACC GAT

T7碱基对：14629

突变顺序

96 99

Val Leu Ser Leu Leu Ile Ser Ser Asn Leu Lys Asp Thr Asp

GTG TTG TCA CTG TTG ATT TCT TCC AAC CTC AAG GAC ACC GAT

突变9：His 190→Ser 190

所用引物：5′ CT GAC AAA TCT TAC TTC CCT 3′

野生型顺序

aa：185 190

Leu Leu Ser Asp Lys His Tyr Phe Pro Pro Glu

CTA CTC TCT GAC AAA CAT TAC TTC CCT CCT GAG

T7碱基对：14905

突变顺序

190

Leu Leu Ser Asp Lys Ser Tyr Phe Pro Pro Glu

CTA CTC TCT GAC AAA TCT TAC TTC CCT CCT GAG

突变10：His 218→Ser 218

所用引物：5′ GAC ATT GAA TCT CGT GCT GC 3′

野生型顺序

aa：214 218

Val Asp Ile Glu His Arg Ala Ala Trp Leu Leu

GTT GAC ATT GAA CAT CGT GCT GCA TGG CTG CTC

T7碱基对：14992

突变顺序

218

Val Asp Ile Glu Ser Arg Ala Ala Trp Leu Leu

GTT GAC ATT GAA TCT CGT GCT GCA TGG CTG CTC

突变11：缺失氨基酸118至123

所用引物：5′ C GGC AAG TTG CCC GGG GCT TTG GAG GCG TGG G 3′

Δ

18个碱基缺失

野生型顺序

109（aa） 118 122 123 126

Leu Leu Arg Ser Gly Lys Leu Pro Gly Lys Arg Phe Gly Ser His Ala Leu Glu

CTT CTG CGT TCC GGC AAG TTG CCC GGA AAA CGC TTT GGG TCT CAC GCT TTG GAG

14677（T7碱基对）

突变顺序

117 124

Leu Leu Arg Ser Gly Lys Leu Pro Gly ……（6个氨基酸）……Ala Leu Glu

CTT CTG CGT TCC GGC AAG TTG CCC GGG ……（18个碱基）……GCT TTG GAG

突变12：His 123→Glu 123

所用引物：5′ GGG TCT GAG GCT TTG G 3′

突变顺序

123

Leu Leu Arg Ser Gly Lys Leu Pro Gly Lys Arg Phe Gly Ser Glu Ala Leu Glu

CTT CTG CGT TCC GGC AAG TTG CCC GGA AAA CGC TTT GGG TCT GAG GCT TTG GAG

突变13：（Arg131，Lys136，Lys140，Lys144，Arg145→

Glu131，Glu136，Glu140，Glu144，Glu145）

作用引物：5′ GGT TAT GAG CTC GGC GAG ATG GAG GGT GAA TAC GAA

GAC GAC TTT GAG GAA ATG CTT GAA G 3′

野生型顺序

129（aa）131 136 140 144 145

Gly Tyr Arg Leu Gly Glu Met Lys Gly Glu Tyr Lys Asp Asp Phe Lys Arg Met Leu Glu Glu

GGT TAT CGC TTA GGC GAG ATG AAG GGT GAA TAC AAA GAC GAC TTT AAG CGT ATG CTT GAA G

14737（T7 bp）

突变顺序

129（aa）131 136 140 144 145

Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Met Glu Gly Glu Tyr Glu Asp Asp Phe Glu Glu Met Leu Glu Glu

GGT TAT GAG CTC GGC GAG ATG GAG GGT GAA TAC GAA GAC GAC TTT GAG GAA ATG CTT GAA G

14737（T7 bp）

如下所述，通过使突变的噬菌体感染进K38/pGP1-2而产生每一种突变的基因5蛋白。细胞于30℃下生长至A₅₉₀＝1.0。温度转至42℃维持30分钟，以诱导T7 RNA聚合酶。加入IPTG至0.5mM，加入每一种噬菌体的溶解产物使moi＝10。感染的细胞于37℃下生长90分钟。然后收集细胞，根据常规方法制备T7基因5蛋白的提取物。

提取物通过磷酸纤维素和DEAE A-50柱而部分纯化，如上述直接测定聚合酶和核酸外切酶活性进行检验。结果示于表1中。

表1：T7基因5突变体的核酸外切酶和聚合酶活性。

突变体核酸外切酶聚合酶活性

活性% %

[野生型] [100]^a[100]^b

突变1

（His123→Ser123） 10-25 ＞90

突变2

（ΔSer122，His123） 0.2-0.4 ＞90

突变3

（Ser122，His123→Ala122，Glu123）＜2 ＞90

突变4

（Lys118，Arg119→Glu118，Glu119）＜30 ＞90

突变5

（Arg111，Ser112，Lys114→

Glu111，Ala112，Glu114）＞75 ＞90

突变6

（His59，His62→Ser59，Ser62）＞75 ＞90

突变7

（His82→Ser82）＞75 ＞90

表1：T7基因5突变体的核酸外切酶和聚合酶活性。

突变体核酸外切酶聚合酶活性

活性% %

突变8

（Arg96，His99→Leu96，Ser99）＞75 ＞90

突变9

（His190→Ser190）＞75 ＞90

突变10

（His218→Ser218）＞75 ＞90

突变11

（ΔLys118，Arg119，Phe120，

Gly121，Ser122，His123）＜0.02 ＞90

突变12

（His123→Glu123）＜30 ＞90

突变13

（Arg131，Lys136，Lys140，Lys144，Arg145→

Glu131，Glu136，Glu140，Glu144，Glu145）＜30 ＞90

a.核酸外切酶活性用单链[³H]T7 DNA测定。100%核酸外切酶活性相应于5，000单位/mg。

b.聚合酶活性用单链的小牛胸腺DNA测定。100%的聚合酶活性相应于8，000单位/mg。

在所测的7个组氨酸中，只有一个（His123：突变体1）具有修饰的T7 DNA聚合酶特征的酶活性。用DEAE-纤维素、磷酸纤维素、DEAE-Sephadex和羟磷灰石层析从此突变体中纯化T7的基因5蛋白。聚合酶活性几乎是正常的（大于天然酶水平的90%），而核酸外切酶活性则降低了4至10倍。

构建了一个此突变体的变种，其中His 123和Ser 122都缺失掉了。从此突变体中纯化的基因5蛋白的核酸外切酶活性低200-500倍，并也保留了大于90%的聚合酶活性。

这些数据有力地表明，His 123位于T7基因5蛋白的核酸外切酶结构域的活性位点。进一步，有可能His 123实际上是通过铁、氧和还原剂氧化而修饰的残基，因为这种氧化作用在其他蛋白中已表明是修饰组氨酸残基的（Levine，J.Biol.Chem，258：11823，1983;Hodgson et al.，Biochem.14：5294，1975）。突变体11中残留的核酸外切酶水平与通过化学修饰得到的水平差不多。

虽然描述了在组氨酸残基的突变作用，在附进位点或甚至在远位点的突变作用也可能产生适于本发明的突变酶，例如Lys和Arg（突变体4和15。）与此相似，虽然某些组氨酸残基的突变对于核酸外切酶活性很少有影响，但这并不一定表明，靠近这些残基的突变将不会影响核酸外切酶活性。特别有效果的突变包括具有2个或更多氨基酸缺失的突变，例如最好是6-8个，并靠近His-123区域。其他突变将进一步或完全降低核酸外切酶活性。

作为应用这些突变体菌株的实例，下面给出说明。含有pGP5-6（突变体11）的菌株已寄存于ATCC（见下述）。此菌株如上述进行培养，如Tabor等人（J.Biol.Chem.262：16212，1987）所述进行诱导。可加入K38/Ptrx-2细胞以提高基因修饰的T7 DNA聚合酶的产量。

上述已寄存的菌株还含有质粒pGP1-2，它表达T7 RNA聚合酶。Tabor等人（Proc.Nat.Acad.Sci.USA 82：1074，1985）描述了此质粒，它在1985年3月22日寄存于ATCC，寄存号为40，175。

参见图10，pGP5-6包括下列片段：

1.来自M13 mp 10的EcoRⅠ-SacⅠ-SmaⅠ-BamHⅠ多连接子顺序（21碱基对）。

2.T7的碱基对14309至16747，其中含有T7的基因5，并具有下述修饰：

T7碱基对14703由A变成G，产生一个SmaⅠ位点。

T7碱基对14304至14321缺失（包括它们二者本身，18碱基对）。

3.来自M 13 mp 10的SalⅠ-PatⅠ-HindⅢ多连接子顺序（15碱基对）。

4.pBR322碱基对29（HindⅢ位点）至pBR322碱基对375（BamHⅠ位点）。

5.T7的碱基对22855至T7的碱基对22927，其中含有T7RNA聚合酶启动子φ10，每一端都插有BamHⅠ连接子（82碱基对）。

6.pBR322碱基对375（BamHⅠ位点）至pBR322碱基对4361（EcoRⅠ位点）。

利用修饰的T7-型DNA聚合酶测定DNA顺序

使用修饰的T7-型DNA聚合酶进行DNA合成反应，在长度为几个碱基至成千个碱基的范围内，使链终止片段具有均一的放射性强度。由于终止位点不依赖于链终止剂的掺入（即在暂停位点或二级结构障碍处），因此基本上没有本底。

使用修饰的T7-型聚合酶进行测序反应由脉冲和追止组成，脉冲是指合成短标记的DNA片段;追止是指延长短片段直至链终止剂掺入为止。每一步的基本原理与常规的DNA测序反应不同。在脉冲中，反应液在高水平的三种核苷三磷酸（如dGTP、dCTP和dTTP）和有限水平的另一种标记的、无载体的核苷三磷酸（如[³⁵S]dATP）存在下，于0℃-37℃下保温0.5-4分钟。在这些条件下，修饰的聚合酶无法表现其连续特性，因而将会合成一批其大小在几个碱基至几百碱基的放射性片段。脉冲的目的是放射标记每个引物，利用最少量的放射性核苷酸掺入最多的放射性。在此实例中，脉冲反应中的两个条件（低温，如从0-20℃，以及有限水平的dATP，如从0.1μM至1μM）限制了修饰的T7-型聚合酶表现其连续特性。混合物中的其他重要的环境组分将具有相似的作用，例如限制不止一种的核苷三磷酸或提高反应液的离子强度。如果引物已经标记（例如通过激酶），则不需要脉冲步骤。

在追止中，反应在高水平（50-500μM）的所有四种脱氧核苷三磷酸和有限有水平（1-50μM）的四种链终止剂中的任一种，例如双脱氧核苷三磷酸存在下，于45℃下保温1-30分钟，DNA合成在平均为50-600个碱基后终止。追止的目的是在DNA连续合成条件下延伸每一个放射标记的引物，在分别利用四种双脱氧核苷三磷酸的四个独立的反应中，链延长无一例外地在正确位点终止。追止的两个条件（高温，例如从30-50℃，以及高水平的所有四种脱氧核苷三磷酸，（高于50μM），允许修饰的T7-DNA聚合酶表现其连续特性，掺入成千上万的碱基;因此，同一聚合酶分子将通过引物-模板合成到掺入一个双脱氧核苷酸为止。在45℃的追止温度下，合成速率为大于700核苷酸/秒。因此，对于测序反应来说追止步骤在不到一秒内就完成了。在整个测序反应中如果使用dITP，或如果使用低温或高离子强度，或低水平的三磷酸盐，则单链结合蛋白可提高连续性。

在用修饰的T7-型DNA聚合酶进行的DNA测序反应中，可以使用[α³⁵S]dATP、[α³²P]dATP或荧光标记的核苷酸。如果荧光类似物在引物的5′末端，则不需要脉冲步骤。

两个因素决定合成反应的平均延伸长度。第一是脉冲反应的时间长度。由于脉冲是在没有链终止剂存在下进行的，所以脉冲反应时间越长，引物延伸就越长。在0℃时，聚合酶平均延伸10核苷酸/秒。第二是追止反应中脱氧核糖核苷三磷酸与链终止剂的比例。修饰的T7-型DNA聚合酶不能辨别这些类似物的掺入，因此，追止中的平均延伸长度是追止反应中脱氧核苷三磷酸浓度与链终止剂浓度比值的四倍。因此，为了缩短延伸的平均长度，将脉冲时间缩短至例如30秒和/或在追止反应中提高链终止剂与脱氧核苷三磷酸浓度的比例。提高链终止剂浓度或降低脱氧核苷三磷酸浓度可做到这一点。在追止反应中，为了提高延伸的平均长度，则增加脉冲时间至例如3-4分钟，和/或降低链终止剂浓度（例如20μM至2μM）。

实例2：利用修饰的T7 DNA聚合酶测定DNA顺序

下面是用双脱氧核苷酸作为终止剂测定顺序的实例。

浓度为0.7mM的9μl单链M13 DNA（mGP1-2，由常规方法制备）与1μl互补的顺序测定引物（常规的普遍性17聚体，0.5pmole引物/μl）和2.5μl 5X退火缓冲液（200mM Tris-HCl，pH7.5，50mM MgCl₂）旌希尤戎?5℃维持3分钟，在30分钟内缓慢冷却至室温。在脉冲反应中，将12.5μl上述的退火混合物与下述溶液混合：1μl 0.1MDTT、3mM的3种dNTP（dGTP、dCTP、dTTP）各2μl（P.L.Biochemi-cals，在ET中）、2.5μl[α³⁵S]dATP（1500Ci/mmol，New England Nuclear）和1μl实例1所述的修饰的T7 DNA聚合酶（0.4mg/ml，2500单位/ml，即0.4μg，2.5单位），于0℃下保温2分钟，旋转搅拌后，再用微型离心机离心1秒钟。保温时间可在30秒至20分钟间变动，温度可在0℃至37℃间变动。用较长的时间测定远离引物的顺序。

分别取4.5μl的上述脉冲反应液的等分试样加入含有预保温至45℃的追止混合物的四支试管中，这四支试管标以G、A、T、C，每支中含有痕量的双脱氧（dd）G、A、T或C（P-L Biochemicals）中的任一种。专用的追踪止液在下面给出。每支试管含有1.5μl 1mM dATP，0.5μl 5×退火缓冲液（200mM Tris-HCl，pH7.5，50mM MgCl₂）和1.0μl 100μM ddNTP（其中的ddNTP对应于各试管中的ddG、A、T或C）。每份追止反应液于45℃下（或30℃-50℃）保温10分钟，然后，在每支试管中加入6μl终止溶液（90%甲酰胺、10mM EDTA、0.1%二甲苯胺），将试管置于冰上。追踪时间可在1-30分钟之间变动。

测序反应液在常规的含7M脲的6%聚丙烯酰胺测序凝胶中电泳，电泳在30瓦下进行6小时。在凝胶上进行电泳之前，反应液加热至75℃维持2分钟。用10%乙酸、10%甲醇固定凝胶，在凝胶干燥器上干燥，并在柯达OM1高反差放射自显影胶片上曝光过夜。

实例3利用有限浓度的dNTP测定DNA顺序

在此实例中，在脉冲反应中使用限定水平的所有四种脱氧核糖核苷三磷酸，以进行mGP1-2DNA的DNA顺序分析。此方法与实例2的方案相比有若干优越之处。首先，脉冲反应进行至完全，而在前一方案中必须在时间进程中打断。其结果是反应更易于操纵。其次，此方法更易于控制脉冲的延伸程度，并因此将引物附近顺序（前面50个碱基）的标记效率提高大约10倍。

7μl 0.75mM单链M13 DNA（mGP1-2）与1μl互补的测序引物（17聚体，0.5pmole引物/μl）和2μl 5×退火缓冲液（200mM TrIS-HCl pH7.5，50mM MgCl₂，250mM NaCl）混合，加热至65℃维持2分钟，在30分钟内缓慢冷却至室温。在脉冲反应中，10μl上述退火混合物与下述溶液混合：1μl 0.1M DTT、2μl各为1μM的3种dNTP（dGTP、dCTP、dTTP）、0.5μl[α³⁵S]dATP，[α10μM]（约10μM，1500Ci/m mol，New England Nuclear）和2μl修饰的T7DNA聚合酶（0.1mg/ml，1000单位/ml，即0.2μg，2单位），于37℃下保温5分钟（保温温度和时间分别可在20℃-45℃和1-60分钟之间变动）。

分别取3.5μl的上述脉冲反应液试样加入含有预保温至37℃的追止混合物的四支试管中。这四支试管标以G、A、T、C，每支中含有痕量的双脱氧G、A、T、C中的一种。专用的追止溶液在下面给出。每支试管含有0.5μl 5×退火缓冲液（200mM Tris-HCl pH7.5，50mM MgCl₂、250mM NaCl）、200μM的4种dNTP（dGTP、dATP、dTPP、dCTP）各1μl，和1.0μl 20μM ddNTP.每份追止反应液于37℃保温5分钟（或分别是20℃-45℃和1-60分钟），然后，每支试管中加入4μl终止溶液（95%甲酰胺、20mM，EDTA、0.05%二甲苯胺），将试管置于冰上，然后如上述在常规聚丙烯酰胺测序凝胶上进行电泳。

实例4 用dITP代替dGTP测定DNA顺序

为了穿过DNA的压缩区（即具有致密的二级结构的区域）进行顺序测定，通常使用dITP（Mills et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.76：2232，1979）或脱氮鸟苷三磷酸（脱氮GTP，Mizusawa et al.，Nuc.Acid Res.14：1319，1986）。我们发现这两种类似物都能与T7-型聚合酶正常作用，尤其是在单链结合蛋白存在下使用dITP时。这些反应最好是用上述基因修饰的T7聚合酶进行，或者为了降低核酸外切酶的降解作用，追止反应进行1-2分钟和/或在20℃下进行。

修饰的T7DNA聚合酶有效地使用dITP或脱氮GTP以代替dGTP。在脉冲和追止混合物中，用dITP取代dGTP，浓度为使用dGTP时的2-5倍。在ddG追止混合物中仍然使用ddGTP（不是ddITP）。

使用dITP的追止反Χ圆辛舻牡退剑ㄔ?.01单位）核酸外切酶活性很敏感。为了避免这一麻烦，如果使用dITP，则追止反应的时间不应超过5分钟。建议使四份dITP反应与四份使用dGTP的反应一起进行，而不是将后者取消。如果常规性地使用dGTP和dITP二者，可通过下述方法使所需的混合物数目降至最低：（1）在追止混合物中不加dGTP和dITP，这意味着对于dGTP和dITP追止反应来说，可使用四种追止混合物。（2）在合适的脉冲混合物中加入高浓度的dGTP或dITP（分别为0.5mM和1-2.5mM，各2μl）。这样，两种脉冲混合物都含有低浓度的dCTP、dTTP和[α³⁵S]dATP，和高浓度的dGTP或dITP中的一种。这种改变一般不会对测序反应的质量产生不利影响，并将用dGTP和dITP进行反应所需的脉冲和追止混合物的数目降至6份。

测序反应与实例3差不多，只是脉冲混合物中有二份含有a）对dGTP有3种dNTP混合物：1.5 μMdCTP、dTTP，和2mM dITP和b）对dITP有3种dNTP混合物：1μMdCTP、dTTP和2mMdITP。在追止反应中，从追止混合物中去掉dGTP（即追止混合物含有30μM dATP、dTTP和dCTP，以及8μM的四种双脱氧核苷酸中的一种），使用dITP的追止时间不超过5分钟。

寄存

菌株K38/pGP5-5/pTrx-2、K38/pTrx-2和M13mGP1-2已寄存于ATCC，寄存号分别为67，287、67，286和40，303，日期为1987年1月13日。菌株K38/pGP1-2/pGP5-6已寄存于ATCC，寄存日为1987年12月4日，寄存号67571。

申请人及其代理人认可他们具有下述责任：这些培养物如果在此处公布的专利的期限终点之前死亡，最后一次请求培养物后5年内死亡，或30年内死亡，依时限最长的那种情况而定，则他们有责任替换这些培养物，并有责任在些专利公开时公布寄存物，此时，将使寄存物可由公众不可取消地得到。直至那时之前，根据37CFR的1-14条和35USC的112条，这些寄存物将由专利局局长不可取消地得到。

其他具体方案

其他具体方案在下面权利要求书的范围内。

本发明的修饰的DNA聚合酶的其他用途，即利用其连续性和缺乏核酸外切酶活性的优点的用途，包括基因组DNA顺序的直接酶促扩增。这一方法对于其他聚合酶已有描述（Saiki et al.，Science 230：1350，1985;Scharf，Science 233：1076，1986）。

参见图6，特定DNA区域的酶促扩增需要使用两个引物，它们在双链DNA顺序的目的区域与对立链退火，其3′端方向相对（见黑箭头）。实际方法涉及变性、退火和DNA合成的多重循环（10-40次，最好是16-20次）。利用此方法，有可能使人基因组DNA的特定区域扩增200，000倍以上。其结果是特定基因片段代表大约五分之一，而不是原来的百万分之一。这极大地促进了基因组DNA的克隆和直接分析。对于诊断应用来说，它可将分析过程由几周加速到1-2天。

Klenow片段的扩增过程限于长度小于200碱基的片段。与此不同，修饰的T7-型DNA聚合酶应能允许长度为数千碱基的DNA片段扩增（最好是与大肠杆菌DNA结合蛋白或单链结合蛋白结合，以防止单链DNA的“快速恢复形成）”。

修饰的T7-型DNA聚合酶也适用于标准的反应混合物：1）填平由限制性酶切割产生的DNA片段的5′伸出末端，以便（例如）由具有无3′伸出端的单链区的线性DNA分子产生平末端的双链DNA;b）用于标记限制性片段的3′端，由S1核酸酶分析确定mRNA起始位点的图谱，或用Maxam和Gilbert的化学修饰法测定DNA顺序;C）用于克隆的DNA片段的体外诱变。例如，使含有专一错配碱基的化学合成的引物与DNA模板杂交，然后利用修饰的T7-型DNA聚合酶进行延伸。用这种方法，突变将永远掺入合成链中。用聚合酶由引物合成完整长度的DNA是有利的。使用连续性DNA聚合酶能最有效地做到这一点。另外，通过DNA合成（见上）时的错误掺入可进行诱变。此方法已用于使用克隆的DNA片段的特定区域发生诱变。所用酶没有核酸外切酶活性是很重要的。标准反应混合物是指含有聚合酶和任何必需的脱氧核苷或其他化合物的缓冲液。

Claims

1、一种测定DNA分子的塑账峒罨承虻姆椒ǎǎ?

使所述DNA分子与能与所述DNA分子杂交的引物分子退火；

在至少四个容器中分别保温退火混合物的各部分，每个容器中含有四种不同的脱氧核苷三磷酸；一种连续性DNA聚合酶，其中，所述聚合酶与所述DNA分子维持结合状态至少达500个碱基，然后在DNA测序反应的延长反应通常所用的环境条件下解离，所述聚合酶的核酸外切酶活性少于每毫克所述聚合酶500单位；以及四种DNA合成终止剂中的一种，它在特定的核苷酸碱基位点终止DNA合成，其中每一种所述终止剂在不同的核苷酸碱基处终止DNA合成；

根据大小分离每个保温反应液中的DNA产物，通过这种方法，至少能够确定所述DNA分子的部分核苷酸碱基顺序。

2、权利要求1的方法，其中所述聚合酶与所述DNA分子维持结合状态至少达500个碱基后才解离。

3、权利要求1的方法，其中所述聚合酶与所述DNA分子维持结合状态至少达1000个碱基后才解离。

4、权利要求1的方法，其中所述聚合酶是用T7-型噬菌体感染的细胞中的聚合酶。

5、权利要求4的方法，其中所述的T7-型噬菌体是T7、T3、φⅠ、φⅡ、H、W31、gh-1、Y、A1122或SP6。

6、权利要求1的方法，其中所述聚合酶是不区分双脱氧核苷酸类似物的。

7、权利要求1的方法，其中所述聚合酶是修饰过的聚合酶，每毫克聚合酶的核酸外切酶活性少于50单位。

8、权利要求7的方法，其中所述修饰的聚合酶的核酸外切酶活性小于每毫克聚合酶1单位。

9、权利要求7的方法，其中所述修饰的聚合酶的核酸外切酶活性小于每毫克聚合酶0.1单位。

10、权利要求1的方法，其中所述聚合酶没有可测的核酸外切酶活性。

11、权利要求1的方法，其中所述聚合酶能够利用10碱基对或更多碱基对的引物。

12、权利要求1的方法，其中所述聚合酶能够利用4碱基对或更多碱基对的引物。

13、权利要求1的方法，其中所述引物包括4-20碱基对，所述聚合酶能够利用4-20碱基对的引物。

14、权利要求4的方法，其中所述聚合酶不区分核苷酸类似物，它是一种修饰的聚合酶，每毫克聚合酶的核酸外切酶活性小于500单位，

所述引物是含有4-10个碱基的单链RNA或DNA，所述聚合酶能够利用4-10个碱基的引物，

所述保温过程包括一个脉冲和一个追止步骤。

15、权利要求1的方法，其中所述引物是单链DNA或RNA。

16、权利要求1的方法，其中所述退火步骤包括使所述DNA分子和所述引物加热到65℃以上，并使加热混合物冷却至0℃-30℃。

17、权利要求1的方法，其中所述保温过程包括一个脉冲和一个追止步骤。

18、权利要求17的方法，其中所述的脉冲步骤包括使所述的退火混合物与所有四种脱氧核苷三磷酸和一种连续性DNA聚合酶混合，其中至少一种所述脱氧核苷三磷酸具有标记并以有限浓度存在。

19、权利要求18的方法，其中所述脉冲步骤的保温进行30秒至20分钟。

20、权利要求18的方法，其中所述追止步骤包括在进行了所述脉冲步骤后，在四等份混合物中分别加入一种所述链终止剂。

21、权利要求20的方法，其中所述追止步骤的保温进行1至60分钟。

22、权利要求1的方法，其中所述终止剂是双脱氧核苷酸。

23、权利要求1的方法，其中所述终止剂是一种有限水平的脱氧核苷三磷酸。

24、权利要求1的方法，其中一种所述脱氧核苷三磷酸从dITP或脱氮鸟苷中选择。

25、权利要求1的方法，其中所述引物在所述退火步骤前进行标记。

26、权利要求25的方法，其中所述保温过程包括一个追止步骤。

27、权利要求25的方法，其中所述引物是荧光标记的。

28、一种由克隆的片段产生活性T7-型DNA聚合酶的方法，包括将编码所述聚合酶的基因置于单一细胞中非渗漏启动子的调控之下，诱导所述基因在所述细胞处于对数生长期或稳定期时的表达，并从所述细胞中分离所述聚合酶。

29、权利要求28的方法，其中所述基因之一处在表达时需要T7RNA聚合酶的启动子的调控之下。

30、权利要求28的方法，其中所述聚合酶是从两个克隆基因中产生的活性T7DNA聚合酶，一个所述基因处在表达时需要T7RNA聚合酶的启动子的调控之下。

31、一种从含有表达所述聚合酶的载体的细胞中纯化T7DNA聚合酶的方法，包括下列步骤：溶解所述细胞，使所述聚合酶通过按分子大小分离的层析柱、DE52 DEAE柱、磷酸纤维素柱和羟基磷灰石柱。

32、权利要求31的方法，该方法在层析步骤之前包括用硫酸铵沉淀所述聚合酶。

33、权利要求31的方法，其中进一步包括使所述聚合酶通过Sephadex DEAE A-50柱的步骤。

34、权利要求31的方法，其中所述按分子大小分离的柱是Sephadex C150柱。

35、一种在DNA重组技术所产生的DNA聚合酶溶液中使核酸外切酶失活的方法，包括使所述溶液在含有氧、还原剂和过渡金属的容器中保温。

36、一种测定DNA顺序的药盒，包括：

一种连续性DNA聚合酶，其中所述聚合酶与DNA分子的至少500碱基维持结合状态后才解离，所述聚合酶的核酸外切酶活性小于每毫克聚合酶500单位，在DNA测序反应的延伸反应通常所用的环境条件下，所述聚合酶能够表现其连续性，

所述顺序测定的一种必需的试剂，选自

（a）dITP

（b）一种链终止剂。

37、一种制造编码T7-型DNA聚合酶基因的方法，此种聚合酶具有降低了其天然存在的核胤外切酶活性，该方法包括遗传修饰T7-型DNA聚合酶基因。

38、一种制造具有降低了其天然存在的核酸外切酶活性的T7-型DNA聚合酶的方法，此种方法包括权利要求38的基因表达。

39、一种从具有单链区的线性DNA分子产生平末端双链DNA的方法，其中所述分子的3′端是双链的并且没有3′伸出末端，该方法包括：

使所述DNA分子与连续性DNA聚合酶保温，所述聚合酶基本上没有天然存在的核酸外切酶活性。

40、一种扩增DNA顺序的方法，包括使第一和第二引物与双链DNA顺序相反的链退火，使退火混合物与一种连续性DNA聚合酶保温，每毫克该聚合酶的核酸外切酶活性小于500单位，其中所述第一和第二引物是与所述DNA顺序相反的链退火。

41、权利要求41的方法，其中所述第一和第二引物的3′端在退火后位于相对方向。

42、权利要求41的方法，其中所述方法在所述保温步骤后进一步包括，使产生的DNA变性，使所述第一和第二引物对所述产生的DNA退火，用所述聚合酶与退火混合物保温。

43、权利要求43的方法，其中所述的变性、退火和保温的循环重复10-40次。

44、权利要求41的方法，其中每毫克聚合酶的所述核酸外切酶活性小于1单位。

45、一种标记DNA片段3′端的方法，包括使所述DNA片段与一种连续性DNA聚合酶和一种标记的脱氧核苷酸保温，其中每毫克所述聚合酶的核酸外切酶活性小于500单位。

46、一种克隆的DNA片段体外诱变的方法，包括提供一种引物和一种模板，所述引物和所述模板具有特异错配的碱基，并用一种连续性的修饰的DNA聚合酶延伸所述引物。

47、一种克隆的DNA片段体外诱变的方法，包括提供所述克隆的片段，并在导致错误掺入核苷酸碱基的条件下，用一种连续性DNA聚合酶合成DNA链，其中每毫克该聚合酶的核酸外切酶活性小于1单位。

48、权利要求12的方法，其中所述混合物包括T7基因2.5或基因4。

49、权利要求13的方法，其中所述混合物包括T7基因2.5或基因4。

50、权利要求38方法，其中所述的具有降低了核酸外切酶活性的基因，含有一个修饰了的His残基。

51、权利要求51的方法，其中所述的His残基是His-123。

52、权利要求51的方法，其中删除了His残基。

53、制造具有降低了其天然存在的核酸外切酶活性的T7-型DNA聚合酶的方法，此方法包括权利要求52或53的基因表达。

54、如在权利要求38中所要求的方法，其中所述的基因修饰作用包括删除用于所述的T7-型聚合酶的118至123氨基酸编码的碱基序列。

55、一种药盒，包括多种适于DNA顺序测定的至少25寡聚体，每种所述寡聚体装在不同的容器中，并具有长度小于15个碱基的不同的碱基顺序。

56、权利要求56的药盒，其中所述寡聚体各含有6-9个碱基。

57、权利要求1的方法，其中所述聚合酶在DNA测序反应的脉冲反应通常所用的第二环境条件下，不能表现其连续性。

58、权利要求36的药盒，其中所述聚合酶在DNA测序反应的脉冲反应通常所用的第二环境条件下，不能表现其连续性。

59、权利要求4的方法，其中所述T7型噬菌体是T-7。