DE3781809T2 - T7-dns-polymerase. - Google Patents

T7-dns-polymerase.

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DE3781809T2 DE9090201138T DE3781809T DE3781809T2 DE 3781809 T2 DE3781809 T2 DE 3781809T2 DE 9090201138 T DE9090201138 T DE 9090201138T DE 3781809 T DE3781809 T DE 3781809T DE 3781809 T2 DE3781809 T2 DE 3781809T2
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Description

  • Die Erfindung betrifft die Verwendung der DNA-Polymerase vom Bakteriophagen T7 und ein Verfahren zum Amplifizieren einer DNA-Sequenz.
  • Beim Sequenzieren von DNA werden vier Populationen von einsträngigen DNA-Fragmenten erzeugt, die ein definiertes Ende und ein variables Ende haben. Der variable Terminus endet immer mit einer speziellen gegebenen Nukleotidbase (entweder Guanin (G) Adenin (A) Thymin (T) oder Cytosin (C) Die vier unterschiedlichen Sätze von Fragmenten werden jeweils voneinander mittels eines hochauflösenden Polyacrylamidgels auf der Basis ihrer Länge voneinander unterschieden; jedes Band in dem Gel entspricht kolinear einem speziellen Nukleotid in der DNA-Sequenz, womit die Positionen der jeweiligen Nukleotidbase in der Sequenz identifiziert werden.
  • Im allgemeinen gibt es zwei Verfahren zum DNA-Sequenzieren. Ein Verfahren (Sequenzieren nach Maxam und Gilbert) verwendet den chemischen Abbau von isolierten DNA-Fragmenten, von denen jedes mit einer einzigen radioaktiven Marke an seinem festen Terminus markiert ist, wobei jede Reaktion eine beschränkte Spaltung, speziell an einer oder mehreren der vier Basen (G, A, T oder C) ergibt. Das andere Verfahren (Didesoxy-Sequenzieren) verwendet die enzymatische Synthese eines DNA-Stranges Dabei läßt man vier getrennte Synthesen ablaufen, wobei jede Reaktion veranlaßt wird, an einer spezifischen Base (G, A, T oder C) zu terminieren, und zwar durch Einbau des geeigneten kettenterminierenden Didesoxynukleotids. Das letztgenannte Verfahren wird bevorzugt, da die DNA- Fragmente (anstelle der Markierung am Ende) gleichmäßig markiert sind und somit die größeren DNA-Fragmente eine zunehmend größere Radioaktivität zeigen. Außerdem können ³&sup5;S markierte Nukleotide anstelle von ³²P markierten Nukleotiden verwendet werden, was zu einer schärferen Abgrenzung führt; und es sind die Reaktionsprodukte einfach zu interpretieren, da jede Bahn nur entweder G, A, T oder C entspricht. Das für die meisten Dideoxy-Sequenzierungen verwendete Enzym ist das große Fragment der DNA- Polymerase I von Escherichia coli ("Klenow"). Eine andere verwendete Polymerase ist die AMV-Reversetranscriptase.
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Amplifizieren einer DNA-Sequenz, bei der ein erster und ein zweiter Primer an die gegenüberliegenden Stränge einer zweisträngigen DNA-Sequenz angelagert wird und die angelagerte Mischung mit einer prozessiven DNA-Polymerase des Bakteriophagen T7, nachstehend auch als T7 DNA-Polymerase bezeichnet, inkubiert wird, wobei die T7 DNA-Polymerase weniger als 500 Einheiten der Exonukleaseaktivität pro Milligramm Polymerase, vorzugsweise weniger als eine Einheit aufweist, wobei der erste und der zweite Primer an den gegenüberliegenden Strängen der DNA-Sequenz liegen; bei den bevorzugten Ausführungsbeispielen sind die 3'-Enden der Primer einander entgegengerichtet; und das Verfahren sieht weiter vor, daß nach dem Schritt des Inkubierens die erhaltene DNA denaturiert wird, der erste und der zweite Primer an der resultierenden DNA angelagert und die angelagerte Mischung mit der Polymerase inkubiert wird; vorzugsweise wird der Zyklus des Denaturierens, des Anlagerns und des Inkubierens zehn bis vierzig Mal wiederholt.
  • Die Erfindung liefert eine DNA-Polymerase vom Bakteorophagen T7, die prozessiv sowie nicht unterscheidend ist und kurze Primer verwenden kann. Außerdem hat die Polymerase weniger als 50% der Exonukleaseaktivität als es dem natürlich zugehörigen Maß der Exonukleaseaktivität dieser Polymerase entspricht. Dies sind die idealen Eigenschaften für die oben beschriebenen Verfahren.
  • Weitere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung sind aus der nachfolgenden Beschreibung der bevorzugten Beispiele und aus den Ansprüchen ersichtlich.
    • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele
  • Es werden zunächst kurz die Figuren beschrieben.
    • Figuren
  • Die Fig. 1 bis 3 zeigen in einer schematischen Darstellung die Vektoren pTrx-2, mGP1-1 bzw. pGP5-5;
  • die Fig. 4 enthält eine grafische Darstellung der selektiven Oxidation der T7 DNA-Polymerase:;
  • die Fig. 5 enthält eine grafische Darstellung für die Fähigkeit der modifizierten T7 Polymerase DNA bei Anwesenheit von Etheno-dATP zu synthetisieren; und
  • die Fig. 6 zeigt eine schematische Darstellung der enzymatischen Amplifikation von genomischer DNA unter Verwendung modifizierter T7 DNA-Polymerase.
  • Die Fig. 7, 8 und 9 enthalten die Nukleotidsequenzen von pTrx-2, einem Teil von pGP5-5 bzw. mGP1-2.
  • Die Fig. 10 zeigt eine schematische Darstellung von pGP5-6.
    • DNA-Polymerase
  • Die erfindungsgemäße DNA-Polymerase des T7 Bakteriophagen die im wesentlichen dieselbe ist wie diejenige, die in mit einem Phagen vom T7 Typ infizierten Zellen anzutreffen ist, (d. h.einem Bakteriophagen, bei dem die DNA-Polymerase Wirts-Thioredoxin als Untereinheit erfordert; beispielsweise ist der Phage vom Typ T7: T7, T3, ΔI, ΔII, H, W31, gh-1, Y, A1122 or SP6, Studier, 96 Virology 70, 1979) ist prozessiv, hat weniger als 50% der Exonukleaseaktivität, als es dem dieser Polymerase natürlich zugehörigen Wert entspricht, unterscheidet nicht zwischen dem Einbau von Nukleotidanalogen und kann kleine Oligonukleotide (beispielsweise Tetramere, Hexamere und Octamere) als spezifischen Primer verwenden. Diese Eigenschaften werden nachstehend im einzelnen erläutert.
    • Reaktionsfolge
  • Unter Reaktionsfolge ist die Eigenschaft der DNA-Polymerase zu verstehen, in der Lage zu sein, kontinuierlich viele Nukleotide unter Verwendung derselben Primermatrize an zufügen, ohne von der Matrize zu dissoziieren, und zwar unter Bedingungen, wie sie normalerweise für die Verlängerungsreaktionen bei der DNA-Sequenzierung verwendet werden. Das Maß der Prozeßfolge verändert sich mit unterschiedlichen Polymerasen: einige fügen nur wenige Basen an, ehe sie dissoziieren (beispielsweise Klenow (etwa 15 Basen), T4-Polymerase (etwa 10 Basen), T5-DNA-Polymerase (etwa 180 Basen) und Reverse Transcriptase (etwa 200 Basen) (Das et al. in J. Biol. Chem. 254 : 1227,1979 Bambara et al in J. Biol. Chem. 253 : 413, 1978), während andere, wie die erfindungsgemäße, wenigstens etwa 500 Basenpaare lang vorzugsweise wenigstens 1000 Basen unter geeigneten Umgebungsbedingungen gebunden bleiben. Solche Umgebungsbedingungen beinhalten das Vorliegen eines ausreichenden Vorrats aller vier Deoxynukleosidtriphosphate und eine Inkubationstemperatur zwischen 10ºC und 500ºC. Die Reaktionsfolge wird durch die Anwesenheit von einsträngigem Bindungsprotein (ssb) von E. coli stark erhöht.
  • Bei prozessiven Enzymen tritt ein Kettenabbruch der Sequenzierungsreaktion nur bei jenen Basen auf, die einen kettenabbrechenden Wirkstoff, beispielsweise ein Didesoxynukleotid enthalten. Wenn die DNA-Polymerase keine Reaktionsfolge zeigt, entstehen bei der Sequenzierungsreaktion artifaktische Banden an den Stellen, die dem Nukleotid entsprechen, an dem die Polymerase dissoziiert hat. Eine häufige Dissoziation erzeugt einen Hintergrund von Banden an unwichtigen Stellen und verschleiert die wahre DNA-Sequenz. Dieses Problem wird teilweise durch ein lang andauerndes Inkubieren (30 bis 60 Minuten) der Reaktionsmischung mit einer hohen Konzentration an Substraten korrigiert, die die artifaktischen Banden zu dem hohen Molekulargewicht an dem oberen Ende des Gels "scheuchen" und damit weg aus dem Bereich, in dem die DNA-Sequenz ausgelesen wird. Dies stellt keine ideale Lösung dar, da eine nicht prozessive DNA- Polymerase eine große Wahrscheinlichkeit zeigt, von der Matrize in Bereichen einer kompakten sekundären Struktur oder Haarnadelschleifen zu dissoziieren. Die Reinitialisierung der Primerverlängerung an diesen Stellen ist wenig effizient und das übliche Ergebnis besteht in der Bildung von Banden an derselben Stelle für alle vier Nukleotide, womit die DNA-Sequenz verschleiert wird.
    • Unterscheidung von Analogen
  • Die erfindungsgemäßen DNA-Polymerasen unterscheiden nicht signifikant zwischen Didesoxynukleotidanalogen und normalen Nukleotiden. Das heißt, die Wahrscheinlichkeit des Einbaus eines Analogons ist näherungsweise genau so groß wie die für ein normales Nukleotid oder sie inkorporiert das Analogon mit wenigstens einem Zehntel der Effizienz für das normale Analogon. Die erfindungsgemäßem Polymerasen unterscheiden auch nicht signifikant zwischen einigen Analogen. Dies ist wichtig, da die Sequenzierungsreaktionen zusätzlich zu den vier normalen Desoxyriukleosidtriphosphaten (dGTP, dATP, dTTP und dCTP) die Addition anderer Arten von Nukleotidderivaten erfordern wie: radioaktiv- oder fluoreszierend markiertes Nukleosidtriphosphat, das üblicherweise zum Markieren der synthetisierten Stränge mit ³&sup5;S und ³&sup5;P verwendet wird, oder andere chemische Wirkstoffe. Wenn eine DNA-Polymerase nicht zwischen Analogen unterscheidet, gibt es für den Einbau eines Analogons eine genauso große Wahrscheinlichkeit wie für ein normales Nukleotid. Für markierte Nukleosidtriphosphate ist dies wichtig, um den synthetisierten DNA-Strang unter Verwendung einer minimalen Radioaktivität wirksam zu markieren. Außerdem sind geringere Anteile von Analogen bei solchen Enzymen erforderlich, was die Sequenzierungsreaktion billiger macht als bei unterscheidenden Enzymen.
  • Unterscheidende Polymerasen zeigen ein unterschiedliches Unterscheidungsverhalten, wenn sie in einem prozessiven Modus polymerisieren, verglichen mit einem Steckenbleiben, wobei sie die Synthese durch ein Sekundärstrukturhindernis hindurchkämpfen. An solchen Hindernissen entsteht eine Variabilität in der Intensität der unterschiedlichen radioaktiven Banden auf dem Gel, was die Sequenz verschleiern kann.
    • Exonukleaseaktivität
  • Die erfindungsgemäße DNA-Polymerase hat weniger als 50%, vorzugsweise weniger als 1% und noch lieber weniger als 0,1% des normalen oder natürlichen zugehörigen Wertes der Exonukleaseaktivität (Betrag der Aktivität pro Polymerasemolekül). Unter dem zugehörigen normalen oder natürlichen Wert wird die Exonukleaseaktivität von nicht modifizierter T7-Polymerase verstanden. Normalerweise beträgt die zugehörige Aktivität etwa 5000 Einheiten an Exonukleaseaktivität pro Milligramm Polymerase, und zwar gemessen mit einer Abwandlung des Verfahrens nach Chase et al. (249 in J. Biol. Chem. 4545, 1974), wie dies unten beschrieben ist. Exonukleasen erhöhen die Richtigkeit der DNA-Synthese, indem sie jede neu hinzugefügte Base exzisieren, die mit der Matrize eine falsche Basenpaarung ergibt. Derartige zugehörige Exonukleaseaktivitäten sind für die Qualität der DNA-Sequenzierungreaktionen schädlich. Sie erhöhen die minimal erforderliche Konzentration von Nukleotidprecursorn, die der Reaktion zugefügt werden müssen, da, wenn die Nukleotidkonzentration fällt, sich die Polymeraseaktivität auf eine Rate verlangsamt, die der Exonukleaseaktivität vergleichbar ist, was dazu führt, daß nettomäßig keine DNA-Synthese mehr stattfindet oder sogar ein Abbau der synthetisierten DNA erfolgt.
  • Noch wichtiger ist, daß die zugehörige Exonukleaseaktivität dazu führt, daß die DNA-Polymerase an Stellen von sekundären Strukturhindernissen in der Matrize leerläuft. Wenn eine Polymerase sich einer solchen Struktur nähert, vermindert sich die Syntheserate, wenn sie sich darum bemüht, daran vorbeizukommen. Eine zugehörige Exonuklease exzisiert die neu synthetisierte DNA, wenn die Polymerase stecken bleibt. Als Folge davon treten zahlreiche Zyklen von Synthese und Exzision auf. Dies kann dazu führen, daß die Polymerase schließlich über-die Haarnadelschleife hinaus synthetisiert (ohne Beeinträchtigung der Qualität der Sequenzierungsreaktion);oder daß die Polymerase von dem synthetisierten Strang dissoziiert (was zu artifaktischen Banden an derselben Stelle bei allen vier Sequenzierungsreaktionen führt) oder daß mit großer Häufigkeit ein kettenabbrechendes Agens addiert wird und eine große Variabilität in der Intensität der unterschiedlichen Fragmente in einem Sequenzierungsgel auftritt. Dies geschieht, weil die Häufigkeit der Inkorporation eines kettenabbrechenden Agens an jeder Stelle mit der Anzahl der Möglichkeiten steigt, die die Polymerase hat, kettenterminierende Nukleotide anzufügen und somit wird die DNA-Polymerase mit wesentlich größerer Häufigkeit ein kettenabbrechendes Agens an den Stellen des Leerlaufes anfügen als an anderen Stellen.
  • Eine ideale Sequenzierungsreaktion erzeugt über das ganze Gel Banden mit einheitlicher Intensität. Dies ist zum Erhalten einer optimalen Belichtung von Röntgenfilm durch alle radioaktiven Fragmente wichtig. Wenn eine variable Intensität der radioaktiven Banden auftritt, besteht eine größere Wahrscheinlichkeit, daß blassere Banden unentdeckt bleiben. Um eine einheitliche Intensität der Radioaktivität für alle Fragmente zu erhalten, sollte die DNA-Polymerase an jeder Stelle der DNA dieselbe Zeit brauchen und keine Preferenz, weder für die Addition noch für die Excission von Nukleotiden an einer bestimmten Stelle zeigen. So etwas tritt auf, wenn die DNA-Polymerase keinerlei Exonuklease zeigt, so daß sie an jeder Stelle längs der Matrize nur einmal die Möglichkeit hat, ein kettenterminierendes Nukleotid einzufügen.
    • Kurze Primer
  • Die erfindungsgemäße DNA-Polymerase ist in der Lage, Primer aus zehn Basen oder weniger, ebenso wie längere, vorzugsweise mit einer Länge zwischen 4 und 20 Basen zu verwenden. Die Fähigkeit, kurze Primer zu verwenden, ermöglicht eine Reihe von wichtigen Vorteilen für das DNA-Sequenzieren. Die kürzeren Primer sind billiger zu kaufen und leichter zu synthetisieren als die üblichen 15 bis 20-mer-Primer Sie lagern sich auch schneller an die komplementären Stellen an einer DNA-Matrize an und machen so die Sequenzierungsreaktion schneller. Ferner gestattet die Möglichkeit, kleine Oligonukleotidprimer (beispielsweise 6 oder 7 Basen) für die DNA-Sequenzierung zu verwenden, Strategien, die sonst zum Sequenzieren langer DNA-Fragmente nicht möglich sind. Beispielsweise kann ein 80 random- Hexamere enthaltender Satz erzeugt werden, von denen keines zu einer Stelle des zu klonierenden Vektors komplementär ist. Statistisch gesehen, tritt eine der 80 Hexamer-Sequenzen durchschnittlich alle 50 Basen längs des DNA-Fragmentes auf, das sequenziert werden soll. Die Bestimmung einer Sequenz aus 3000 Basen würde nur 5 Sequenzierzyklen erfordern. Zunächst würde ein "Universal"-Primer (beispielsweise die Sequenz 5' GTAAAACGACGGCCAGT 3' von New England Biolabs #1211) verwendet werden, um etwa 600 Basen an einem Ende des Insert zu sequenzieren. Unter Verwendung der Ergebnisse aus dieser Sequenzierungsreaktion würde aus dem Satz ein neuer Primer herausgenommen werden, der zu einem Bereich in der Nähe des Endes der bestimmten Sequenz homolog ist. In dem zweiten Zyklus würde die Sequenz der nächsten 600 Basen unter Verwendung dieses Primers bestimmt werden. Die fünfmalige Wiederholung dieses Vorgangs ließe eine Bestimmung der kompletten Sequenz aus 3000 Basen zu, ohne daß ein Subklonieren notwendig wäre und ohne die chemische Synthese weiterer neuer Oligonukleotidprimer. Die Verwendung solch kurzer Primer wird durch Hinzufügen des 2.5 und 4 Proteingens von T7 in die Sequenzierungsreaktion verbessert.
  • Die erfindungsgemäßen DNA-Polymerasen (d. h. die, die die obigen Eigenschaften haben) umfassen modifizierte Polymerasen vom Bakteorophagen T7. Das heißt, die DNA-Polymerase benötigt Wirtsthioredoxin als Untereinheit und sie ist im wesentlichen mit einer modifizierten DNA-Polymerase des Bakteriophagen T7 identisch oder zu Enzymen äquivalent, die von verwandten Phagen, beispielsweise T3, ΔI, ΔII, H, W31, gh-1, Y, A1122 und SP6 isoliert wurden. Jedes dieser Enzyme kann so modifiziert werden, daß die Eigenschaften ähnlich denen des modifizierten Enzyms des Bakteorophagen T7 sind. Es ist möglich, das Enzym unmittelbar aus durch den Phagen infizierten Zellen zu isolieren, jedoch wird die Isolation aus Zellen, die das Enzym überproduzieren, bevorzugt. Unter im wesentlichen identisch wird verstanden, daß das Enzym Aminosäuresubstitutionen hat, die die Gesamteigenschaften des Enzyms nicht beeinträchtigen. Ein Beispiel einer speziell wünschenswerten Aminosäuresubstitution ist eines, bei dem das natürliche Enzym so modifiziert wurde, daß jegliche Exonukleaseaktivität beseitigt ist. Diese Modifikation kann auf dem genetischen oder dem chemischen Level (siehe unten) durchgeführt werden.
    • Klonieren von T7 Polymerase
  • Als Beispiel für die Erfindung beschreiben wir das Klonieren, die Überproduktion, die Reinigung, die Modifikation und die Verwendung von T7 DNA-Polymerase. Dieses prozessive Enzym besteht aus zwei Polypeptiden, die in einem stoichiometrischen Verhältnis von 1 : 1 eng im Komplex miteinander verbunden sind. Eines ist das vom T7 Phagen kodierte Gen 5 Protein von 84000 Dalton (Modrich et al. in 150 J. Biol.
  • Chem. 5515, 1975) und das andere ist das von- E. coli kodierte Thioredoxin von 12000 Dalton (Tabor et al. in J. Biol. Chem. 262 : 16, 216, 1987). Das Thioredoxin ist ein Ergänzungsprotein und befestigt das Gen-5-Protein (die nicht prozessive tatsächliche DNA-Polymerase) an der Primermatrize. Die DNA-Polymerase hat eine sehr starke 3' → 5' Exonukleaseaktivität. Diese Aktivität macht die Polymerase zum DNA- Sequenzieren unbrauchbar und sie muß inaktiviert oder modifiziert werden, ehe die Polymerase verwendet werden kann. Dies ist, wie unten beschrieben, leicht durchzuführen, und zwar entweder chemisch durch lokale Oxidation der Exonukleasedomäne oder genetisch durch Modifikation des kodierenden Bereiches des Polymerasegens, das für diese Aktivität kodiert.
    • pTrx-2
  • Um das trxA-(Thioredoxin)gen von E. coli zu klonieren, wird die DNA von E. coli teilweise mittels Sau3A gespalten und die Fragmente an BamHI gespaltene T7 DNA gebunden, die aus der T7 ST9 Linie isoliert ist (Tabor et al., in Thioredoxin und Glutaredoxin Systems: Structure and Function (Holmgren et al., eds) 285-300, Raven Press, NY; und Tabor et al., a.a.O). Die gebundene DNA wurde in trxA&supmin; Zellen von E. coli transfiziert, die Mischung auf trxA&supmin; Zellen platiert und die resultierenden T7 Plaques herausgenommen. Da T7 ohne ein aktives trxA Gen von E. coli nicht wachsen kann, konnten nur solche Phagen, die das trxA Gen enthielten, Plaques bilden. Die klonierten trxA Gene wurden auf einen 470 Basenpaaren langen HincII Fragment lokalisiert.
  • Um Thioredoxin im Übermaß zu produzieren, wurde ein pTrx-2 Plasmid konstruiert. Das 470 Basenpaare lange HincII Fragment, das das trxA enthielt, wurde, kurz gesagt, durch Standardverfahren isoliert (Maniatis et al., Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs., Cold Spring Harbor, N.Y.), und an ein Derivat von pBR322 gebunden, das einen Ptac-Promotor enthält (ptac-12, Amann et al., in 25 Gene 167, 1983).
  • Gemäß Fig. 1 wurde ptac-12, das β-Lactamase und Col El Origin enthält, mit PvuII gespalten, um ein Fragment mit 2290 bp zu erhalten, das dann an zwei Tandemkopien von trxA (HincII Fragment) unter Verwendung kommerziell verfügbarer Linker (Smal- BamHI Polylinker) gebunden wurde, um pTrx-2 zu bilden. Die vollständige Nucleotidsequenz von pTrx-2 ist in Fig. 7 gezeigt. Die Thioredoxin-Produktion steht nun unter der Kontrolle des tac- Promotors und kann spezifisch induziert werden, bspw. durch IPTG (Isopropyl β-D-Thiogalactosid).
    • pGP5-5 und mGP1-2
  • Einige Genprodukte von T7 sind lethal wenn sie in E.Coli exprimiert werden. Es wurde ein Exprimierungssystem entwickelt, um das Klonieren und die Exprimierung von lethalen Genen zu erleichtern, und zwar basierend auf der induzierbaren Expression von T7 RNA Polymerase. Das Gen-5-Protein ist in einigen E.-Coli-Linien lethal, und ein Beispiel für ein solches System ist von Tabor et al.in 82 Proc.Nat.Acad. Sci. 1074 (1985) beschrieben, wobei das Gen-5 von T7 unter die Kontrolle des Δ10 Promotors gebracht wurde und nur exprimiert wird, wenn T7-RNA-Polymerase in der Zelle vorhanden ist.
  • Kurz gesagt wurde pGP5-5 (Fig. 3) durch Standardverfahren konstruiert, wobei synthetische BamHI-Linker verwendet wurden, um das Gen-5 enthaltende Fragment von T7 zwischen 14306 (NdeI) bis 16869 (AhaIII) an das 560 bp lange und sowohl den Δ1.1A- als auch den Δ1.1B-Promotor enthaltende Fragment von T7 zwischen 5667 (HincII) und 6166 (Fnu4Hl) und das 3kb lange BamHI- bis HincII-Fragment von pACYC177 zu binden (Chang et al, in 134 J. Bacteriol. 1141, 1978). Die Nukleotid-Sequenz aus den T7-Inserts und den Linkern ist in Fig. 8 gezeigt. Bei diesem Plasmid wird das Gen-5 nur dann exprimiert, wenn die T7-RNA- Polymerase in der Zelle vorhanden ist.
  • Gemäß Fig. 2 befindet sich die T7-RNA-Polymerase auf dem Phagen-Vektor mGP1-2. Dieser ist ähnlich dem pGP1-2 (Tabor et al., aaO), mit der Einschränkung, daß das Fragment von T7 zwischen 3133 (HaeIII) und 5840 (HinfI), das die T7-RNA-Polymerase enthält, unter Verwendung von Linkern (BglII bzw. SalI) an den BamHI-SalI-Ausschnitt von M13 mp8 gebunden wurde, wodurch das Polymerase-Gen unter die Kontrolle des lac Promotors gebracht wurde. Die vollständige Nukleotidsequenz von mGP1-2 ist in Fig. 9 gezeigt.
  • Da pGP5-5 und pTrx-2 unterschiedliche Replikationsursprünge haben (einen P15A- und einen ColE1-Ursprung), können sie in eine Zelle gleichzeitig transformiert werden. pTrx-2 exprimiert große Mengen von Thioredoxin bei Anwesenheit von IPTG. mGP1-2 kann in derselben Zelle wie diese beiden Plasmide koexistieren und zum Regulieren der Expression von T7-RNA-Polymerase durch pGP5-5 verwendet werden, einfach indem die Produktion von T7-RNA- Polymerase durch Induzieren des lac Promotors mit bspw. IPTG hervorgerufen wird.
    • Überproduktion von T7-DNA-Polymerase
  • Es gibt verschiedene mögliche Strategien zur Überproduktion und zur Bildung der beiden Genprodukte von trxA und Gen 5. Für alle Strategien können dieselben Zelllinien und Plasmide verwendet werden. Bei der bevorzugten Strategie sind die beiden Gene in derselben Zelle zusammen überexprimiert. (Die Ursache dafür ist, daß das Gen 5 empfindlich gegenüber Protease ist, bis Thioredoxin daran gebunden ist). Wie unten im einzelnen beschrieben, besteht ein Verfahren darin, die beiden Gene getrennt voneinander auf zwei kompatiblen Plasmiden in derselben Zelle zu plazieren. Alternativ können die beiden Gene auf demselben Plasmid in Tandemanordnung angeordnet werden. Es ist wichtig, daß das T7-Gen 5 unter die Kontrolle eines nicht leckenden induzierbaren Promotors, wie Δ1.1A, Δ1.1B und Δ10 von T7 zu bringen, da selbst geringe Mengen der beiden Polypeptide gemeinsam für die meisten E. coli Zellen toxisch sind. Unter leckfrei ist hierbei verstanden, daß weniger als 500 Moleküle des Genprodukts pro Zellgenerationszeit aus dem Gen erzeugt werden, wenn der Promotor, der die Genexpression steuert, nicht aktiviert ist. Vorzugsweise wird das System der Exprimierung von T7 RNA-Polymerase verwendet, obwohl andere Expressionssysteme, die induzierbare Promotor benutzen, verwendbar sind. Ein leckender Promotor, beispielsweise plac, gestattet die Synthetisierung von mehr als 500 Molekülen, selbst wenn er nicht induziert ist, womit Zellen, die die lethalen Gene enthalten, unter der Kontrolle solcher Promotor schlecht wachsen und für die Erfindung nicht geeignet sind. Es ist natürlich möglich, diese Produkte in Zellen zu erzeugen, in denen sie nicht lethal sind, beispielsweise ist der plac Promotor für solche Zellen geeignet.
  • Gemäß einer zweiten Strategie kann jedes Gen getrennt kloniert und überexprimiert werden. Bei der Verwendung dieser Strategie werden die die speziellen überproduzierten Polypeptide enthaltenden Zellen vor der Bereitung der Extrakte miteinander kombiniert, womit zu diesem Zeitpunkt die beiden Polypeptide eine aktive T7 DNA-Polymerase bilden.
    • Beispiel 1: Produktion von T7 DNA Polymerase
  • Die E. coli Linie 71.18 (Messing et al., in Proc. Nat. Acad. Sci. 74 : 3642, 1977) wird zur Erzeugung einer Grundmenge von mGP1-2 verwendet. 71.18 wird in 50% Glyzerol bei -80ºC aufbewahrt und auf einer standard Minimal-Medium-Agarplatte aufgestrichen. Eine einzelne Kolonie läßt man über Nacht in 25 ml standard M9 Medium bei 370 C wachsen, und eine einzelne Plaque von mGP1-2 wird durch Titern der Grundmenge unter Verwendung frisch erzeugter 71.18 Zellen erhalten. Diese Plaque wird zum Impfen von 10 ml 2X LB (2% Bacto-Trypton, 1% Hefeextrat, 0,5% NaCl, 8 mM NaOH) verwendet, das JM103 enthält, das bis zu einem A&sub5;&sub9;&sub0;=0,5 gewachsen ist. Diese Kultur bildet die Phagengrundmenge zur Erzeugung einer großen Kultur von mGP1-2. Nach drei bis 12 Stunden wird die 10 ml große Kultur zentrifugiert und der Überstand dazu verwendet, die große (21) Kultur zu infizieren. Für die große Kultur werden 4 00 ml 2X LB mit 4 ml 71.18 Zellen geimpft, die in M9 gewachsen sind, und es wird bei 37ºC geschüttelt. Wenn die große Zellkultur bis zu einem A590 = 1,0 gewachsen ist (etwa drei Stunden), wird sie mit 10 ml Überstand geimpft, der das Startlysat von mGP1-2 enthält. Die infizierten Zellen werden sodann bei 37ºC über Nacht wachsen gelassen. Am nächsten Tag werden die Zellen durch Zentrifugieren entfernt, und der Überstand ist zur Verwendung für die Induktion von K38/pGP5-5/pTrx-2 bereit (siehe unten). Der Überstand kann bei 4ºC etwa sechs Monate lang mit einem Titer von ungefähr 5 0¹¹ Δ/ml aufbewahrt werden. Bei diesem Titer infiziert ein Liter Phagen 12 Liter Zellen, bei einem A&sub5;&sub9;&sub0;=5, mit einem Infektionsmultiplikator von 15. Wenn der Titer niedrig ist, kann der Phage GP1-2 aus dem Überstand konzentriert werden, indem NaCl (60 gm/ Liter) und PEG-6000 (65 gm/Liter) in dem Überstand gelöst werden und man die Mischung bei 7ºC 1 bis 72 Stunden lang sich absetzen läßt, worauf dann zentrifugiert wird (7000 U/min., 20 Minuten lang). Das Präzipitat, das den Phagen mGP1-2 enthält, wird in ungefähr 1/20 des ursprünglichen Volumens von M9-Medium wieder suspendiert.
  • K38/pGP5-5/pTrx-2 ist die E.-Coli-Linie (Genotyp HfrC (λ)), der die beiden kompatiblen Plasmide pGP5-5 und pTrx-2 enthält. Das pGP5-5-Plasmid hat einen P15A-Replikationsursprung und trägt das Kanamycin-Resistenzgen (Km). pTrx-2 hat einen ColEI-Replikationsursprung und trägt das Ampicillin- Resistenzgen (Ap). Die Plasmide werden mit Standardverfahren in K38 eingeführt, wobei KmR bzw. ApR ausgewählt sind. Die Zellen K38/pGP5-5/pTrx-2 werden in 50% Glycerol bei -90ºC aufbewahrt. Vor der Verwendung werden sie auf eine Platte, die 50 ug/ml Ampicillin und Kanamycin enthält, aufgestrichen und bei 37ºC wachsen gelassen, während eine einzige Kolonie in 10 ml LB-Medium mit 50 ug/ml Ampicillin und Kanamycin bei 37ºC vier bis sechs Stunden lang wachsen gelassen wird. Die 10 ml Zellkultur wird dazu verwendet, 500 ml LB-Medium mit 50 ug/ml Ampicillin und Kanamycin zu impfen, und es wird das Medium bei 37ºC über Nacht geschüttelt. Am folgenden Tag wird die 500 ml-Kultur dazu verwendet, 12 Liter von 2X LB-KPO&sub4;-Medium zu impfen (2% Bacto-Trypton, 1% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 20 mM KPO&sub4;, 0,2% Dextrose und 0,2% Casaminosäuren, pH 7,4) und unter Belüftung in einem Fermentor bei 37ºC wachsen gelassen. Sobald die Zellen einen A&sub5;&sub9;&sub0; = 5,0 (d. h. logarithmische oder stationäre Zellenphase) erreichen, werden sie mit mGP1-2 bei einem Infektionsmultiplikator von 10 infiziert, und es wird IPTG zugefügt (Endkonzentration 0,5 mM). Das IPTG induziert die Produktion von Thioredoxin und der T7 RNA- Polymerase in mGP1-2 und damit die Produktion der klonierten DNA-Polymerase. Die Zellen werden weitere 2,5 Stunden unter Rühren und Belüftung wachsen gelassen und sodann geerntet. Das Zellpellet wird in 1,5 Liter mit 10% Sucrose/ 25 mM Tris-HCl, pH 8,0/25 mM EDTA erneut suspendiert und geschleudert. Schließlich wird das Zellpellet in 200 ml mit 10% Sucrose/20 mM Tris-HCl, pH 8/1.0 nM EDTA suspendiert und in flüssigem N&sub2; gefroren. Aus 12 Litern induzierter Zellen wird 70 gm Zellpaste erhalten, die etwa 700 mg Gen-5-Protein und 100 mg Thioredoxin enthält.
  • K38/pTrx-2 (K38 mit lediglich pTrx-2) überproduziert Thioredoxin, und-er wird als "Booster" zu dem Extrakt von K38/pGP5-5/pTrx-2 hinzugegeben, um sicherzustellen, daß am Ende der Reinigung Thioredoxin im übermaß gegenüber Gen-5-Protein vorhanden ist. Die K38/pTrx-2-Zellen werden in 50% Glycerol bei -80ºC aufbewahrt. Vor der Verwendung werden sie auf einer Platte, die 50 ug/ml Ampicillin enthält, ausgestrichen und bei 37ºC 24 Stunden lang wachsen gelassen, wobei eine einzige Kolonie bei 37ºC über Nacht in 25 ml LB-Medium mit 50 ug/ml Ampicillin wachsen gelassen wird. Die 25 ml-Kultur wird dazu verwendet, 2 Liter von 2X LB-Medium zu impfen, die sodann bei, 37ºC geschüttelt wird. Sobald die Zellen einen A&sub5;&sub9;&sub0; = 3,0 erreichen, wird der ptac-Promotor und somit die Thioredoxin-Produktion durch die Zugabe von IPTG (Endkonzentration 0,5 mM) induziert. Die Zellen werden unter Schütteln weitere 12 bis 16 Stunden bei 37ºC wachsen gelassen, geernted und in 600 ml mit 10% Sucrose/ 20 mM Tris-HCl, pH 8,0/25 mM EDTA erneut suspendiert und geschleudert. Schließlich werden die Zellen in 40 ml mit 10% Sucrose/20 mM Tris-HCl, pH 8/0,5 mM EDTA suspendiert und in flüssigem N&sub2; gefroren. Aus 2 Litern Zellen werden 16 g: Zellpaste erhalten, die 150 mg Thioredoxin enthalten.
  • Die Tests für die Polymerase sehen den Gebrauch einsträngiger Kälber-Thymus-DNA (6mM) als Substrat vor. Diese wird unmittelbar vor der Verwendung bereitet, indem zweisträngige Kälber-Thymus-DNA mit 50 mM NaOH bei bei 20ºC 15 Minuten lang denaturiert wird, woraufhin eine Neutralisation mit HCl erfolgt. Jede gereinigte DNA kann als Matrize für den Polymerase-Test genutzt werden, obwohl sie vorzugsweise eine Länge' von mehr als 1000 Basen haben sollte.
  • Der verwendete Standard-T7 DNA-Polymerase-Test stellt eine Modifikation des von Grippo et al (246 J. Biol. Chem. 6867, 1971) beschriebenen Verfahrens dar. Die Standardreaktionsmischung (200 ul Endvolumen) enthält 40 mM Tris/HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreitol, 100 nmol alkali-denaturierte Kälber-Thymus-DNA, 0,3 mM dGTP, dATP, dCTP und [³E] dTTP (20 cpm/pm), 50 ug/ml BSA, und unterschiedliche Mengen von T7-DNA-Polymerase. Die Inkubation erfolgt bei 37ºC (10ºC bis 45ºC) 30 Minuten lang (5 Minuten -60 Minuten). Die Reaktion wird durch die Zugabe von 3 ml kaltem (0ºC) 1 N HCl-0,1 M Pyrophosphat gestoppt. Die säure-unlösliche Radioaktivität wurde durch das Verfahren nach Hinkle et al. (250 J. Biol. Chem. 5523, 1974) bestimmt. Die DNA wird auf Eis 15 Minuten lang (5 min.-12 Stunden) präzipitiert und sodann auf Glasfaserfilter durch Filtration präzipitiert. Die Filter werden fünfmal mit 4 ml kaltem (0ºC) 0,1M HCl-0.1M Pyrophosphat und zweimal mit kaltem (0ºC) 90% Ethanol gewaschen. Nach dem Trocknen wird die Radioaktivität auf den Filter unter Verwendung eines nichtwäßrigen Scintillations-Fluor gemessen.
  • Eine Einheit Polymerase-Aktivität katalisiert die Synthese von 10 nmol Gesamtmenge an Nukleotiden in eine säurelösliche Form innerhalb von 30 Minuten bei 37ºC unter den oben angegebenen Bedingungen. Native T7 DNA- Polymerase und modifizierte T7 DNA-Polymerase (siehe unten) haben dieselbe spezifische Polymeraseaktivität ± 20%, und zwar liegt sie im Bereich zwischen 5.000 bis 20.000 Einheiten pro mg für native und 5.000 bis 50.000 Einheiten pro mg für modifizierte Polymerase, abhängig von der Herstellung und unter Verwendung von Standardtestbedingungen, wie sie oben erläutert sind.
  • T7 DNA-Polymerase wird von den oben erwähnten Extrakten durch Präzipitation und Chromatographie- Techniken gereinigt. Ein Beispiel für eine solche Reinigung folgt.
  • Ein Extrakt gefrorener Zellen (200 ml K38/pGP5-5/ pTrx-2 und 40 ml K38/pTrx-2) werden über Nacht bei 0ºC aufgetaut. Die Zellen werden zusammengegeben, und es werden 5 ml Lysozym (15 mg/ml) sowie 10 ml NaCl (5M) hinzugegeben. Nach 45 Minuten bei 0ºC werden die Zellen in ein 37ºC warmes Wasserbad gebracht, bis ihre Temperatur 20ºC erreicht. Die Zellen werden dann in flüssigem N&sub2; gefroren. Weitere 50 ml von NaCl (5M) werden hinzugegeben, und die Zellen werden in einem 37ºC warmen Wasserbad aufgetaut. Nach dem Auftauen werden die Zellen bei 0ºC 60 Minuten lang mäßig durchgemischt. Das Lysat wird eine Stunde lang bei 35.000 U/min. in einem Beckman 45Ti-Rotor zentrifugiert. Der Überstand (250 ml) stellt die Fraktion I dar. Sie enthält näherungsweise 700 mg Gen-5-Protein und 250 mg Thioredoxin (ein 2 : 1 Verhältnis zwischen Thioredoxin und Gen-5-Protein)
  • 90 g Ammonium-Sulfat wird in der Fraktion I (250 ml) gelöst und 60 Minuten lang gerührt. Die Suspension wird dann 60 Minuten lang sich absitzen gelassen, und das erhaltene Präzipitat durch 60-minütige Zentrifugierung bei 8.000 U/min. gesammelt. Das Präzipitat wird in 300 ml 20 mM Tris-HCl pH 7,5/5 mM 2-Mercaptoethanol/0,1 mM EDTA/10% Glycerol (Puffer A) wieder aufgelöst. Dies ist die Fraktion II.,
  • Eine Whatman DE52 DEAE-Säule (12.5 cm²·18 cm) wird vorbereitet und mit Puffer A gewaschen. Die Fraktion II wird über Nacht gegenüber zwei Wechseln von 1 Liter Puffer A dialysiert, jeweils bis die Leitfähigkeit der Fraktion II eine Leitfähigkeit gleich der von Puffer A hat, der 100 mM NaCl enthält. Die dialysierte Fraktion II wird sodann mit einer Flußrate von 100 ml/Stunde in die Säule gegeben und mit 400 ml Puffer A gewaschen, der 100 mM NaCl enthält. Die Proteine werden mit einem 3,5 L-Gradienten aus 100 bis 400 mM NaCl in Puffer A bei einer Strömungsrate von 60 ml/Stunde eluiert. Die T7 DNA-Polymerase enthaltenden Fraktionen, die bei 200 mM NaCl eluieren, werden gesammelt. Dies ist die Fraktion III (190 ml).
  • Eine Whatman Pll Phosphocellulose-Säule (12,6 cm²·12 cm) wird vorbereitet und mit 20 mM KPO&sub4; pH 7,4/ 5 mM 2-Mercaptoethanol/0,1 mM EDTA/10% Glycerol (Puffer B) gewaschen. Die Fraktion III wird mit der zweifachen Menge an Puffer C (380 ml) verdünnt und sodann mit einer Strömungsrate von 60 ml/Stunde der Säule zugeführt und mit 200 ml Puffer B,der 100 mM KCL enthält, gewaschen. Die Proteine werden mit einem 1,8L- Gradienten aus 100 bis 400 mM KCL in Puffer B bei einer Strömungsrate von 60 ml/Stunde eluiert. T7 DNA-Polymerase enthaltende Fraktionen, die bei 400 mM KCL eluieren, werden gesammelt. Dies ist die Fraktion IV (370 ml).
  • Eine DEAE-Sephadex A-50-Säule (4,9 cm²·15 cm) wird bereitet und mit 20 mM Tris-HCl 7,0/0.1 mM Dithiothreitol/ 0,1 mM EDTA/10% Glycerol (Puffer C) gewaschen. Die Fraktion IV wird gegen zwei Wechsel von 1 Liter Puffer C bis zu einer endgültigen Leitfähigkeit gleich der von Puffer C mit 100 mM NACl dialysiert. Die dialysierte Fraktion IV wird der Säule mit einer Strömungsrate von 40 ml/Stunde zugegeben, und es wird mit 150 ml Puffer C mit 10 mM NaCl gewaschen. Die Proteine werden mit einem 1 L-Gradienten zwischen 100 und 300 mM NaCl in Puffer C mit einer Strömungsrate von 40 ml/Stunde eluiert. Die T7 DNA-Polymerase enthaltenden Fraktionen, die bei 210 mM NaCl eluieren, werden gesammelt. Dies ist die Fraktion V (120 ml).
  • Eine BioRad HTP Hydroxylapatit-Säule (4,9 cm²·15 cm) wird vorbereitet und mit 20 mM KPO&sub4;, pH 7,4/10mM 2-Mercaptoethanol/2 mM Na-Citrat/10% Glycerol (Puffer D) gewaschen. Die Fraktion V wird gegen jeweils 500 ml Puffer D dialysiert. Die dialysierte Fraktion V wird der Säule mit einer Strömungsrate von 30 ml/Stunde zugegeben, und es wird mit 100 ml Puffer D gewaschen. Die Proteine werden mit einem 900 ml-Gradienten von 0 bis 180 mM KPO&sub4;, pH 7,4 in Puffer D mit einer Strömungsrate von 30 ml/Stunde eluiert. Die Fraktionen, die T7 DNA-Polymerase enthalten, die bei 50 mM KPO&sub4; eluiert, werden gesammelt. Dies ist die Fraktion VI (130 ml). Sie enthält 270 mg homogener T7 DNA-Polymerase.
  • Die Fraktion VI wird gegen 20 mM KPO&sub4; pH 7,4/0,1 mM Dithiothreitol/0,1 mM EDTA/50% Glycerol dialysiert. Diese ist die konzentrierte Fraktion VI ( 65 ml, 4 mg/ml), und bei -20ºC aufbewahrt.
  • Die isolierte T7-Polymerase zeigt eine exonuklease Aktivität. Wie oben ausgeführt, muß diese inaktiviert werden.
  • Ein Beispiel zum Inaktivieren durch chemische Modifikation folgt.
  • Die konzentrierte Fraktion VI wird über Nacht gegen 20 mM KPO&sub4; pH 7,4/0,1 mM Dithiothreitol/10% Glycerol dialysiert, um das in dem Aufbewahrungspuffer enthaltene EDTA zu entfernen. Nach der Dialyse wird die Konzentration mittels 20 mM KPO&sub4;, pH 7,4/0,1 mM Dithiothreitol/10% Glycerol auf 2 mg/ml eingestellt, und es werden 30 ml (2 mg/ml) Aliquote in 50 ml Polypropilen-Röhrchen gegeben. (Bei 2 mg/ml beträgt die molare Konzentration von T7 DNA-Polymerase 22 uM).
  • Dithiothreitol (DTT) und Ammonium-Eisensulfat (Fe (NH&sub4;)&sub2;(SO&sub4;)&sub2;6H&sub2;O)) werden unmittelbar vor der Verwendung frisch zubereitet und zu einem 30 ml Aliquoten von T7 DNA-Polymerase bis zu Konzentrationen von 5mM DTT (0,6 ml, einer 250 mM Grundmenge) und zu 20 uM Fe(NH&sub4;)&sub2;(SO&sub4;)&sub2;6H&sub2;O (0,6 ml an 1 mM Grundmenge) hinzugegeben. Während der Modifikation liegen die molaren Konzentrationen von T7 DNA-Polymerase und Eisen jeweils bei näherungsweise 20 uM, während DTT in 250fachem molaren Überschuß vorhanden ist.
  • Die Modifikation wird bei 0ºC unter gesättigter Sauerstoffatmosphäre wie folgt durchgeführt. Die Reaktionsmischung wird in einem Dessicator auf Eis angeordnet, und es wird der Dessicator durch Evakuieren und anschließendes Füllen mit 100% Sauerstoff von Luft gereinigt. Dieser Zyklus wird dreimal wiederholt. Die Reaktion kann auch in Luft (20% Sauerstoff) durchgeführt werden, jedoch findet sie dann nur mit einem Drittel der Rate statt.
  • Der zeitliche Verlauf der exonuklearen Aktivität ist in Fig. 4 veranschaulicht. ³H-markierte zweisträngige DNA (6 cpm/pmol) wird, wie von Richardson (15 J. Molec. Biol. 49, 1966) aus dem Bakteriophagen T7 hergestellt. ³H-markierte einsträngige T7 DNA wird unmittelbar vor der Verwendung erzeugt, indem zweisträngige ³H-markierte T7 DNA mit 50 mM NaOH bei 20ºC 15 Minuten lang denaturiert und mit HCl anschließend neutralisiert wird. Der verwendete Standard-Nuklease-Test ist eine Modifikation des von Chase et al (aaO) beschriebenen Verfahrens. Die Standard-Reaktions-Mischung (100 ul Endvolumen) enthielt 40 mM Tris/HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol, 60 nmol ³H-markierte einsträngige T7 DNA (6 cpm/pm), und variierende Mengen von T7 DNA-Polymerase. ³H-markierte zweisträngige T7 DNA kann auch als Substrat eingesetzt werden. Ebenso kann jede gleichmäßig radioaktiv markierte DNA einsträngig oder zweisträngig für den Test verwendet werden. Auch am 3'-Ende markierte einsträngige oder zweisträngige DNA kann für den Test eingesetzt werden. Nach einer 15-minütigen Inkubation bei 37ºC wird die Reaktion durch Zugabe von 30 ul BSA (10 mg/ ml) und 25 ul TCA (100% w/v) gestoppt. Der Test kann bei 10ºC bis 45ºC 1 bis 60 Minuten lang ablaufen. Die DNA wird 15 Minuten lang (1 Minute bis 12 Stunden) auf Eis präzipitiert, dann 30 Minuten lang (5 Minuten bis 3 Stunden) bei 12.000 g zentrifugiert. 100 ul des Überstands werden dazu verwendet, die säurelösliche Radioaktivität zu bestimmen, indem 400 ul Wasser und 5 ml wäßriger Scintillationscocktail hinzugegeben werden.
  • Eine Einheit exonuklease Aktivität katalysiert, die Säurelöslichkeit von 10 nmol Gesamtmenge Nukleotid in 30 Minuten unter den Bedingungen des Tests. Native T7 DNA-Polymerase hat eine spezifische exonuklease Aktivität von 5.000 Einheiten/mg, wobei die Standard- Testbedingungen, wie oben aufgeführt, vorliegen. Die spezifische exonuklease Aktivität der modifizierten T7 DNA-Polymerase hängt von dem Maß, der chemischen Modifikation ab und ist idealerweise 10 bis 100mal niedriger als die nativer D7 DNA-Polymerase oder 500 bis 50 Einheiten pro mg kleiner, wobei die oben erwähnten Standardtestbedingungen verwendet werden. Wenn ein zweisträngiges Substrat eingesetzt wird, ist die Exonukleaseaktivität etwa 7 Mal höher.
  • Unter den aufgezeigten Bedingungen nimmt die Exonukleaseaktivität exponentiell mit einer Halbwertszeit von 8 Stunden ab. Einmal pro Tag wird der Reaktionsbehälter umgemischt, um den löslichen Sauerstoff zu verteilen, weil sonst die Reaktion an der Oberfläche, wo die Sauerstoffkonzentration höher ist, schneller abläuft. Einmal pro Tag werden 2,5 mM DTT (0,3 ml einer frischen 250 mM Grundmenge einer 30 ml Reaktion) zugegeben,um das oxidierte DTT wieder zu ersetzen.
  • Nach 8 Stunden ist die Exonukleaseaktivität von T7 DNA- Polymerase um 50% vermindert, wobei ein vernachlässigbarer Verlust an der Polymeraseaktivität auftritt. Die 50%ige Verminderung ist wohl eher das Ergebnis der vollständigen Inaktivierung der Exonukleaseaktivität von der Hälfte der Polymerasemoleküle anstelle einer allgemeinen Verminderung der Exonukleaseaktivität bei allen Molekülen. Somit zeigen nach 8 Stunden Reaktion alle Moleküle eine normale Polymeraseaktivität, während die Hälfte der Moleküle die normale Exonukleaseaktivität und die andere Hälfte wenigster als 0,1% der ursprünglichen Exonukleaseaktivität aufweist.
  • Wenn 50% der Moleküle modifiziert sind (nach einer 8 Stundenreaktion) , ist das Enzym zwar geeignet, aber noch suboptimal zur DNA Sequenzierung. Für eine bessere Qualität der DNA Sequenzierung läßt man die Reaktion weiterlaufen, bis mehr als 99% modifiziert sind (mit weniger als 50 Einheiten Exonukleaseaktivität), was 4 Tage benötigt.
  • Nach 4 Tagen wird die Reaktionsmischung gegen einen zweimaligen Wechsel von 250 ml von 20 mM KPO&sub4; pH 7,4/0,1 mM Dithiothreitol/0,1 mM EDTA/50% Glyzerol dialisiert, um das Eisen zu entfernen. Die modifizierte T7 DNA-Polymerase ( 4 mg/ml) wird bei -20ºC aufbewahrt.
  • Der Reaktionsmechanismus zur chemischen Modifikation von T7 DNA-Polymerase hängt vom reaktiven Sauerstoff ab, der durch das Vorhandensein von reduziertem Übergangsmetall, wie Fe²&spplus; und Sauerstoff erzeugt wird. Ein möglicher Reaktionsmechanismus für die Erzeugung von Hydroxylradikalen ist nachstehend angegeben:
  • Bei Gleichung 1 führt die Oxidation des reduzierten Metallions zu einem Superoxidradikal O . Das Superoxidradikal kann sich einer Dismutationsreaktion unterziehen und erzeugt Wasserstoffperoxid (Gleichung 2). Schließlich kann das Wasserstoffperoxid mit dem reduzierten Metallion reagieren, um ein Hydroxylradikal OH zu bilden (Fentonreaktion, Gleichung 3). Das oxidierte Metallion wird in die reduzierte Form durch ein reduzierendes Agens wie Dithiothreitol (DTT) zurückgeführt.
  • Diese reaktiven Sauerstoffbestandteile inaktivieren wahrscheinlich durch chemisch irreversible Änderung der spezifischen Aminosäurereste, die Proteine. Solch eine Beschädigung wurde in SDS-PAGE von Fragmenten von Gen 5 beobachtet, die durch CNBr oder Trypsin erzeugt wurden. Einige Fragmente verschwinden, es tritt ein höher molekulares Kreuzvernetzen auf und einige Fragmente werden in kleinere Fragmente zerbrochen.
  • Wie bereits erwähnt, sind Sauerstoff, ein reduzierendes Agens (beispielsweise DTT, 2-Mercaptoethanol) und ein Übergangsmetall (beispielsweise Eisen) wesentliche Bestandteile der Modifikationsreaktion. Die Reaktion geschieht in Luft, wird aber durch Verwendung von 100%-igem Sauerstoff dreifach stimuliert. Die Reaktion läuft bei Fehlen von zugeführtem Übergangsmetall wegen des Vorhandenseins von Spurenmengen von Übergangsmetall (1-2 uM) in den meisten Pufferzubereitungen langsam ab.
  • Wie erwartet, sind Inhibitoren der Modifikationsreaktion anaerobe Bedingungen (beispielsweise N&sub2;) und Metallchelatoren (beispielsweise EDTA, Citrat, Nitrilotriacetat). Außerdem können die Enzyme Catalase und Superoxiddismutase die Reaktion verhindern, was konsistent mit der essentiellen Rolle von reagierenden Sauerstoffanteilen bei der Erzeugung von modifizierter T7 DNA-Polymerase ist.
  • Als ein alternatives Verfahren ist es möglich, das Gen 5 von T7 genetisch zu mutieren, um spezifisch die Exonukleasedomäne des Proteins zu inaktivieren. Das aus solchen Mutanten gereinigte Gen 5 Protein von T7 ist zur Verwendung zum DNA-Sequenzieren ideal, ohne daß die Notwendigkeit besteht, durch Oxidation die Exonuklease zu inaktivieren und ohne eine sekundäre Beschädigung, die während der chemischen Modifikation unweigerlich an dem Protein auftritt.
  • Genetisch modifizierte T7 DNA Polymerase kann isoliert werden, indem das Gen 5 random-mutagenisiert wird und sodann nach solchen Mutanten gescreent wird, die ihre Exonukleaseaktivität verloren haben, ohne daß ein Verlust der Polymeraseaktivität auftritt. Die Matagenese wird, wie folgt, durchgeführt. Einsträngige DNA, die das Gen 5 unter der Kontrolle eines Promotors für T7 RMA-Polymerase enthält, wird mit Standardverfahren erzeugt (beispielsweise in pEMBL-8 kloniert, einem Plasmid, das einen Replikationsursprung für eine einsträngige DNA enthält) und mit zwei unterschiedlichen chemischen Mutagenen behandelt: Hydrazin, das C und T mutiert und Ameisensäure, das G und A mutiert. Myers et al. 229 Science 242, 1985. Die DNA wird mit einer Dosis mutagenisiert, die zu durchschnittlich einer veränderten Base pro Plasmidmolekül führt. Die einsträngigen mutagenisierten Plasmide werden dann mit einem universalen 17-mer Primer (siehe oben) geprimt und als Matrizen zum Synthetisieren des gegenüberliegenden Strangs verwendet. Die synthetisierten Stränge enthalten zufällig eingebaute Basen an denjenigen Positionen, die den mutierten Basen in der Matrize entsprechen. Die zweisträngige mutagenisierte DNA wird dann dazu verwendet, um die Linie K38/pGP1-2 zu transformieren, bei der es sich um die Linie K38 handelt, die das Plasmid pGP1-2 enthält (Tabor et al., a.a.O). Bei Wärmeinduktion exprimiert diese Linie T7 RNA Polymerase. Die transformierten Zellen werden bei 30ºC mit etwa 200 Kolonien pro Platte plattiert.
  • Das Screening nach Zellen mit T7 DNA-Polymerase, denen die Exonukleaseaktivität fehlt, geschieht aufgrund der nachfolgenden Feststellung. Die 3'→5' Exonuklease der DNA Polymerase dient als Korrekturlesefunktion. Wenn falsche Basen addiert wurden, entfernt die Exonuklease die neu synthetisierte Base, die sie als "abnormal" erkennt. Dies gilt für den Fall des Analogons zu dATP, nämlich Etheno-dATP, was von der T7 DNA-Polymerase leicht anstelle von dATP addiert wird. Beim Vorhandensein jedoch einer 3'→5' Exonuklease durch die T7 DNA-Polymerase wird diese so schnell exzisiert wie angefügt, was nettomäßig zu keiner DNA Synthese führt. Wie in Fig. 6 gezeigt, führt die Verwendung des abgewandelten Copolymers Poly d(AT) als Matrize dazu, daß native D7 DNA-Polymerase die extensive DNA Synthese nur bei Vorhandensein von dATP, und nicht bei Vorhandensein von Etheno-dATP katalisiert. Dagegen addiert modifizierte T7 DNA-Polymerase infolge des Fehlens einer zugehörigen Exonuklease stabil Etheno-dATP zu der DNA, und zwar mit einer Geschwindigkeit wie bei dATP. Somit ist bei Verwendung von Poly d(AT) als Matrize und dTTP sowie Etheno-dATP als Precursor native T7 DNA-Polymerase nicht in der Lage, DNA aufgrund dieser Matrize zu synthetisieren, während T7 DNA-Polymerase, die ihre Exonukleaseaktivität verloren hat, in der Lage ist, diese Matrize zur Synthese von DNA zu verwenden.
  • Das Verfahren zum Lysieren und Screenen großer Mengen von Kolonien ist von Retz (72 Proc. Nat. Acad. Sci. 2274, 1975) beschrieben. Kurz gesagt, werden die K38/pGP1-2 Zellen, die mit dem mutagenisierten, das Gen 5 enthaltenden Plasmid transformiert sind, aus der Petrischale, in der sie etwa mit 200 Kolonien pro Platte vorhanden sind, auf ein Stück Filterpapier übertragen ("replica plating"). Die Filterpapierscheiben werden dann bei 42ºC 60 Minuten lang gehalten, um die T7-Polymerase zu induzieren, wodurch wiederum das Gen 5 Protein exprimiert wird. Von dem chromosomalen Gen wird ständig Thiroredoxin erzeugt. Zu dem Filterpapier wird Lysozym hinzugegeben, um die Zellen zu lysieren. Nach einem Gefrier- und Auftautauschritt, der die Zellyse sicherstellt, werden die Filterpapierscheiben mit Poly d(AT), [³²P]dTTP und Etheno-dATP bei 37ºC 60 Minuten lang inkubiert. Die Filterpapierscheiben werden sodann mit Säure gewaschen, um alles nicht inkorporierte [³²P]dATP zu entfernen. Die DNA prezipitiert auf dem Filterpapier in Säure, während die Nukleotide löslich sind. Das gewaschene Filterpapier wird dazu verwendet, einen Röntgenfilm zu belichten. Kolonien, die eine aktive T7 DNA-Polymerase , der die Exonuklease fehlt, induziert haben, haben säureunlöslichen ³²P inkorporiert und sind durch Autoradiographie sichtbar. Kolonien, die native T7 DNA-Polymerase oder T7 DNA-Polymerase exprimieren, die Mängel bei der Polymeraseaktivität haben, erscheinen nicht in dem Autoradiogramm.
  • Kolonien mit positivem Befund werden aus den Master Petrischalen, die die ursprünglichen Kolonien enthalten, zurückgewonnen. Die Zellen, die jeweils einen möglichen positiven Klon enthalten, werden in einem größeren Maße induziert (ein Liter) und die T7 DNA-Polymerase, die aus jeder Zubereitung gereinigt wird, dazu verwendet, das Maß der zu der jeweiligen Mutante gehörenden Exonuklease zu bestimmen. Jene, die eine niedrige Exonuklease zeigen, sind für die DNA Sequenzierung geeignet.
  • Eine gerichtete Mutagenese kann ebenfalls verwendet werden, um genetische Mutanten in der Exonukleasedomäne des T7 Gen 5 Proteins zu isolieren. Nachstehend wird ein Beispiel für dieses Verfahren gegeben.
  • T7 DNA-Polymerase mit verminderter Exonukleaseaktivität (modifizierte T7 DNA-Polymerase) kann von nativer T7 DNA- Polymerase auch durch ihre Fähigkeit unterschieden werden, über Bereiche mit Sekundärstrukturen hinweg zu synthetisieren. Somit führt die DNA Synthese mit einer modifizierten Polymerase, ausgehend von einem markierten Primer, auf einer Matrize mit einer Sekundärstruktur zu einer deutlich größeren Verlängerung, verglichen mit unmodifizierter oder nativer DNA-Polymerase. Dieser Test liefert die Basis zum Screenen nach der Umwandlung eines geringen Prozentsatzes von DNA-Polymerasemolekülen in die modifizierte Form.
  • Der obige Test wurde dazu verwendet, nach der Behandlung mit einer Anzahl von chemischen Reagenzien nach veränderter T7 DNA-Polymerase zu screenen. Drei Reaktionen führten zu einer Umwandlung des Enzyms in eine modifizierte Form. Die erste Behandlung erfolgte mit Eisen und einem reduzierenden Agens, wie oben beschrieben. Die anderen beiden sahen die Behandlung des Enzyms mit fotooxidierenden Farbstoffen, Rose Bengal und Methylenblau in Anwesenheit von Licht vor. Die Farbstoffe mußten sorgfältig getitert werden und selbst unter optimalen Bedingungen war die Spezifität für die Inaktivierung der Exonukleaseaktivität gegenüber der Polymeraseaktivität gering, verglichen mit der hohen Spezifität der eisenverursachten Oxidation. Da diese Farbstoffe für die Modifikation von Histidinresten sehr spezifisch sind, legt dieses Ergebnis stark Histidinreste als wesentliche Teile der für die Exonuklease aktive Stelle dar.
  • In dem T7 Gen 5 Protein gibt es 23 Histidinreste. Acht dieser Reste liegen in der Aminohälfte des Proteins in einem Bereich, in dem, basierend auf der Homologie mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli die Exonukleasedomäne lokalisiert werden kann (Ollis et al. Nature 313, 818, 1984). Wie unten beschrieben, wurden sieben der acht Histidinreste durch die Synthese geeigneter Oligonukleotide individuell mutiert, die dann in das Gen 5 eingefügt wurden. Dies entspricht den Mutanten 1 und 6-10 aus Tabelle 1.
  • Die Mutationen wurden konstruiert, indem zunächst das T7 Gen 5 von pGP5-3 (Tabor et al., in J. Biol. Chem. 282, 1987) in die SmaI und HindIII Bereiche des Vektors M13 mp 18 kloniert wurden, um mGP5-2 zu erhalten. (Der verwendete Vektor und die Quelle für Gen 5 sind bei diesem Verfahren nicht kritisch). Einsträngige mGP5-2 DNA wurde von einer Linie erzeugt, die Deoxyuracil anstelle von Deoxythymidin einbaut bzw. addiert (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488, 1985). Dieses Verfahren liefert eine strenge Überlebensauswahl nur des synthetisierten Stranges (der die Mutation enthält), wenn er in die Wildform von E. coli übertragen wird, da der Strang der Uracil enthält, bevorzugt abgebaut wird.
  • Mutante Oliffigonukleotide mit einer Länge von 15-20 Basen wurden durch Standardverfahren synthetisiert. Jedes Oligonukleotid wurde an die Matrize gebracht,durch Verwendung nativer T7 DNA-Polymerase verlängert und unter Verwendung von T4 DNA-Ligase aneinandergefügt. Covalent geschlossene Ringmoleküle wurden durch Agarosegelelektrophorese isoliert, die in Anwesenheit von 0,5 ug/ml Ethidiumbromid lief. Die erhaltenen gereinigten Moleküle wurden sodann dazu verwendet, E. coli 71.18 zu transformieren. Die DNA von den entstehenden Plaques wurde isoliert und der verwendete Bereich sequenziert, um die jeweilige Mutation zu bestätigen.
  • Nachstehend sind die Oligonukleotide zusammengefaßt, die verwendet wurden, um genetische Mutanten bei der Gen 5 Exonuklease zu erzeugen. Die erzeugten Mutationen sind unterstrichen. Die Aminosäuren und Basenpaarnummern sind von Dunn et al., aus 166 J. Molec. Biol. 477. 1983 entnommen. Auch sind die relevanten Sequenzen des Bereiches des mutierten Gen 5 veranschaulicht. Sequenz der Wildform: Mutation 1: His 123 → Ser 123 Verwendeter Primer: Mutanten-Sequenz: Mutation 2: Deletion von 6 Basen Sequenz in Wildform: Mutanten-Sequenz: Mutation Verwendeter Primer: Mutation Verwendeter Primer: Sequenz der Wildform: Mutanten-Sequenz: Mutation Verwendeter Primer: Sequenz der Wildform: Mutanten-Sequenz:
  • Jedes mutierte Gen-5-Protein wurde wie folgt durch Infektion von K38/pGP1-2 durch die mutierten Phagen erzeugt. Die Zellen wurden bei 30%C bis zu einem A&sub5;&sub9;&sub0;=1,0 wachsen gelassen. Die Temperatur wurde 30 Minuten lang auf 42ºC erhöht, um die T7 RNA- Polymerase zu induzieren. Bis zum 0,5 mM wurde IPTG hinzugefügt und ein Lysat von jedem Phagen mit einem moi=10. Die infizierten Zellen wurden bei 37ºC 90 Minuten-lang wachsen gelassen. Die Zellen wurden dann geerntet, und die Extrakte durch Standardverfahren für T7 Gen-5-Protein hergestellt.
  • Die Extrakte wurden teilweise mittels Passage über eine Phosphorcellulose und eine DEAE A-50-Säule gereinigt und durch Messung der Polymerase und Exonuklease Aktivität unmittelbar getested. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 ZUSAMMENFASSUNG DER EXONUKLEASE UND POLYMERASE- AKTIVITÄT der T7 GEN-5-Mutanten Mutante Exonuklease Aktivität in % Polymerase Aktivität in % [Wildform] Tabelle 1 ZUSAMMENFASSUNG DER EXONURLEASE UND POLYMERASE AKTIVITÄT DER T7 GEN-5-Mutanten Mutante a. Die. Exonukleaseaktivität wurde an einer einsträngigen [³H]T7 DNA gemessen. 100% Exonukleaseaktivität entspricht 5000 Einheiten/mg. b. Die Polymeraseaktivität wurde unter Verwendung einsträngiger Kälber-Thymus DNA gemessen. 100% Polymeraseaktivität entspricht 8000 Einheiten/mg.
  • Von den sieben getesteten Histidinen hat nur eine (His 123: Mutante 1) die Charakteristik der enzymatischen Aktivität von modifizierter T7 DNA-Polymerase. T7 Gen 5- Protein wurde aus dieser Mutante gereinigt, indem DEAE-Zellulose, Phosphozellulose, DEAE-Sephadex und Hydroxylapatitchromatographie verwendet wurde. Während die Polymeraseaktivität nahezu normal war (> 90% des Maßes des nativen Enzyms) war die Exonukleaseaktivität um das vier- bis zehnfache vermindert.
  • Es wurde eine Variante dieser Mutante konstruiert, bei der sowohl His 123 als auch Ser 122 entfernt wurden. Das aus dieser Mutante gereinigte Gen 5 Protein hatte eine 200 bis 500 mal geringere Exonukleaseaktivität, während wiederum > 90% der Polymeraseaktivität erhalten bleiben.
  • Diese Daten lassen stark vermuten, daß His 123 in dem aktiven Bereich der Exonukleasedomäne des T7 Gen-5-Proteins liegt. Ferner ist es wahrscheinlich, daß His 123 tatsächlich jener Rest ist, der durch die Oxidation mit Eisen, Sauerstoff und einem reduzierenden Agens modifiziert wird, da, wie gezeigt wurde, eine solche Oxidation Histidinreste in anderen Proteinen modifiziert (Levine in J. Biol. Chem. 258 : 11823, 1983; und Hodgson et al. in Biochemistry 14 : 5294, 1975). Das Maß der restlichen Exonuklease in Mutante 11 ist dem Wert vergleichbar, der durch chemische Modifikation zu erhalten ist.
  • Obwohl Mutationen an den His-Resten beschrieben sind, erzeugen auch Mutationen an benachbarten Stellen oder sogar an entfernten Stellen mutante Enzyme, die erfindungsgemäß geeignet sind, beispielsweise Lys und Arg (Mutante 4 und 15). Obwohl Mutationen in einigen His- Resten wenig Einfluß auf die Exonukleaseaktivität haben, bedeutet dies in ähnlicher Weise nicht notwendig, daß Mutationen in der Nähe von diesen Resten keinen Einfluß auf die Exonukleaseaktivität haben. Mutationen, die besonders wirksam sind, umfassen jene, bei denen zwei oder mehr Aminosäuren, vorzugsweise 6 bis 8, beispielsweise in der Nähe der His-123-Region fehlen. Andere Mutationen könnten die Exonukleaseaktivität weiter oder vollständig beseitigen.
  • Als Beispiel für die Verwendung dieser mutanten Linie wird folgendes ausgeführt. Eine pGP5-6 (Mutation 11) enthaltende Linie wurde bei der ATCC (siehe unten) hinterlegt. Die Linie ist, wie oben beschrieben, gewachsen und wird, wie bei Taber et al. in J. Biol. Chem. 262 : 16212 (1987) beschrieben, induziert. K38/pTrx-2 Zellen können zugegeben werden, um die Ausbeute an genetisch modifizierter T7 DNA-Polymerase zu erhöhen.
  • Die oben erwähnte hinterlegte Linie enthält auch den Plasmid pGP1-2, der T7 RNA-Polymerase exprimiert. Dieses Plasmid ist von Tabor et al. in Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82 : 1074, 1985 beschrieben und wurde bei der ATCC am 2-2. März 1985 unter der Nr. 40.175 hinterlegt.
  • Gemäß Fig. 10 enthält pGP5-6 die folgenden Segmente:
  • 1. Die EcoRI-SacI-SmaI-BamHI Polylinkersequenz aus M13 mp10 (21bp).
  • 2. Die T7 Basenpaare von 14309 bis 16747, die das T7 Gen 5 mit der folgenden Veränderung enthalten:
  • Das T7 Basenpaar 14703 ist von A nach G verändert, was eine Sma Stelle erzeugt.
  • Die T7 Basenpaare 14304 bis 14321 einschließlich sind entfernt (18 Basenpaare).
  • 3. Die SalI-PstI-HindIII Polylinkersequenz aus M13 mp 10 (15 bp).
  • 4. Von pBR322 Basenpaar 29 (HindIII Stelle) bis Basenpaar 375 (BamHI Stelle).
  • 5. Die Basenpaare 22855 bis 22927 von T7, die den T7 RNA Polymerasepromotor Δ10 enthalten, wobei BamHI Linker an jedem Ende eingefügt sind (82 bp).
  • 6. Basenpaar 3,75 von pBR322 (BamHI Stelle) bis Basenpaar 4361 von pBR322 (EcoRI Stelle).
    • DNA Sequenzierung unter Verwendung modifizierter T7 DNA Polymerase
  • Die DNA Synthesereaktionen unter Verwendung von T7 Type DNA-Polymerasen führen zu Kettenabbruchfragmenten mit gleichmäßiger Intensität der Radioaktivität, und zwar über den gesamten Längenbereich zwischen einigen Basen und tausenden von Basen. Es gibt in der Tat keinen Hintergrund, da die Abbrüche an den Stellen unabhängig von dem Einbau des kettenendenden Wirkstoffes sind (d. h. an Pausestellen oder Sekundärstrukturhindernissen)
  • Die Sequenzierungsreaktionen, die die modifizierte T7 DNA-Polymerase verwenden, bestehen aus einem kurzen Stück (pulse) und einem langen Stück (chase). Unter "pulse" ist zu verstehen, daß ein kurzes markiertes DNA-Fragment synthetisiert wird; unter "chase" ist zu verstehen, daß das kurze Fragment verlängert wird, bis ein kettenabrechendes Agens eingefügt wird. Das Grundprinzip für jeden Schritt unterscheidet sich von den üblichen DNA Sequenzierungsreaktionen. Beim "pulse" wird die Reaktion in Anwesenheit von hohen Mengen der drei Nukleotidtriphosphate (beispielsweise dGTP, dCTP und dTTP) eines anderen markierten trägerfreien Nukleotidtriphosphates, beispielsweise [³&sup5;S]dATP, bei 0 bis 37ºC 0,5 bis 4 Minuten lang inkubiert. Unter diesen Umständen ist die modifizierte Polymerase nicht in der Lage, ihren prozessiven Charakter zu zeigen, und es wird eine Population von radioaktiven Fragmenten synthetisiert, die in der Größe zwischen einigen wenigen Basen und einigen hundert Basen liegen. Der Zweck für den "pulse" besteht darin, jeden Primer radioaktiv zu markieren, wobei eine maximale Radioaktivität inkorporiert wird, während minimale Mengen radioaktiver Nukleotide zum Einsatz kommen. Bei diesem Beispiel verhindern zwei Bedingungen bei der "pulse" Reaktion (niedrige Temperatur, beispielsweise zwischen 0 und 20ºC, begrenzte Mengen von dATP, beispielsweise zwischen 01 uM bis 1 uM), daß die modifizierte T7 DNA Polymerase ihren prozessiven Charakter zeigt. Andere wesentliche Umgebungskomponenten der Mischung haben ähnliche Wirkungen, beispielsweise die Beschränkung von mehr als nur einem Nukleotidtriphosphat oder die Erhöhung der Ionenstärke der Reaktion. Wenn der Primer bereits markiert ist (beispielsweise durch Verknüpfung), ist kein Pulsschritt notwendig.
  • Beim "chase" wird die Reaktion bei 35ºC 1 bis 30 Minuten lang in Anwesenheit hoher Mengen (50 bis 500 uM) aller vier Deoxynukleosidtriphosphate und begrenzter Mengen (1 bis 50 uM) jedes der anderen vier kettenabbrechenden Agenzien, beispielsweise Didesoxynukleosidtriphosphat inkubiert, damit die DNA Synthese nach durchschnittlich 50 bis 600 Basen endet. Der Zweck des "chase" besteht darin, jeden radioaktiv markierten Primer unter den Bedingungen der prozessiven DNA Synthese zu verlängern, wobei jede Verlängerung ausschließlich an korrekten Stellen in vier getrennten Reaktionen endet und jedes der vier Didesoxynukleosidtriphosphate verwendet wird. Zwei Bedingungen des "chase" (hohe Temperaturen, beispielsweise zwischen 30 und 50ºC) und hohe Werte (über 50 uM) aller vier Desoxynukleosidtriphosphate gestatten es, der modifizierten T7 DNA-Polymerase, ihren Charakter der Reaktionsfolge von zehntausenden von Basen zu zeigen; somit synthetisiert dasselbe Polymerasemolekül ab der Primermatrize, bis ein Dideoxynukleotid angefügt ist. Bei einer "chase"- Temperatur von 45ºC geschieht die Synthese mit > 700 Nukleotiden/sec. Somit ist die Sequenzierungsreaktion des "chase" in weniger als einer Sekunde fertig. ssb erhöht die Prozeßfolge, beispielsweise wenn dITP eingesetzt wird oder wenn niedrige Temperaturen oder hohe Ionenstärke oder geringe Mengen von Triphosphaten während der gesamten, Sequenzierungsreaktion verwendet werden.
  • Bei den DNA Sequenzierungsreaktionen mit modifizierter DNA-Polymerase können entweder [α³&sup5;S]dATP, [α³²P]dATP oder fluoreszent markierte Nukleotide verwendet werden. Wenn das Fluoreszenzanalogon an dem 5'-Ende des Primers sitzt, ist kein Pulsschritt erforderlich.
  • Zwei Komponenten bestimmen die durchschnittlichen Längen der Synthesereaktionen. Die erste ist die zeitliche Länge der Pulse-Reaktion. Da der Pulse in Abwesenheit von kettenabbrechenden Agenzien ausgeführt ist, ist die Primerlänge umso größer, je größer die Pulse-Reaktionszeit ist. Bei 0ºC ist die Verlängerung durch die Polymerase im Durchschnitt 10 Nukleotide/sec. Die zweite ist das Verhältnis von Desoxyribonukleosidtriphosphat zu kettenterminierenden Agenzien in der "chase" Reaktion. Eine modifizierte DNA Polymerase unterscheidet nicht bei der Addition dieser Analogen, womit die durchschnittliche Länge der Verlängerung in der "chase" Phase viermal das Konzentrationsverhältnis des Desaxynukleosidtriphosphates zu dem kettenabrechenden Agens in der "chase" Reaktion ist. Somit wird um die durchschnittliche Größe der Verlängerung zu kürzen, die Zeit für die Pulsphase verkürzt, beispielsweise auf 30 Sekunden und/oder es wird das Konzentrationsverhältnis des kettenabbrechenden Agens zum Desoxynukleosidtriphosphat in der "chase" Reaktion erhöht. Dies kann entweder durch Erhöhen der Konzentration an den kettenterminierenden Agens oder durch Erniedrigung der Konzentration von Descxynukleosidtriphosphat geschehen. Um die durchschnittliche Länge der Verlängerung zu erhöhen, wird die Zeit der Pulse-Phase verlängert, beispielsweise auf 3 bis 4 Minuten, und/oder die Konzentraktion des kettenabbrechenden Agens in der "chase" Reaktion erniedrigt (beispielsweise von 20 uM auf 2 uM).
    • Beispiel 2: DNA Sequenzierung unter Verwendung modifizierter T7 DNA-Polymerase
  • Nachfolgend wird ein Beispiel eines Sequenzierungsprotokolls gegeben, das Dideoxynukleotid als terminierendes Agens verwendet.
  • 9 ul einsträngiger M13 DNA (mGP1-2, der nach Standardverfahren hergestellt wurde) werden bei einer Konzentration von 0,7 mM mit 1 ul komplementärem Sequenzierungsprimer (Standarduniversal 17-mer, 0,5 pmole Primer/ul) und 2,5 ul 5X Anlagerungsbuffer (200 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM MgCl&sub2;) gemischt, 3 Minuten lang auf 65ºC aufgeheizt und während 30 Minuten langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Bei der Pulse-Raaktion werden 12,5 ul der obigen Reaktionsmischung mit 1 ul Dithiothreitol 0,1 M, 2 ul von 3 dNTP (dGTP, dCTP, dTTP) jeweils 3 mM (P.L. Biochemicals, in TE), 2,5 ul [α³&sup5;S]dATP (1500 Ci/mmol, New England Nuclear) und 1 ul modifizierter, gemäß dem Beispiel 1 beschriebener T7 DNA-Polymerase (0,4 mg/ml, 2500 Einheiten/ml, d. h. 0,4 ug, 2,5 Einheiten) gemischt und nach einem Umstülpen und einem einsekundigen Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge 2 Minuten lang bei 0ºC inkubiert. Die Inkubationszeit kann zwischen 30 Sekunden und 20 Minuten und die Temperatur zwischen 0ºC und 37ºC variieren. Längere Zeiten werden verwendet, um die Sequenzen, die von dem Primer entfernt liegen, zu bestimmen.
  • 4,5 ul Aliquote der obigen Pulse-Reaktion werden zu jedem der vier Röhrchen zugegeben, die die auf 45ºC vorgeheizte "chase" Mischung enthalten. Die vier Röhrchen, markiert mit G, A, T, C enthalten jeweils Spurenmengen entweder von (dd) G, A, T oder C (P-L Biochemicals). Die spezifischen "chase" Mischungen sind unten angegeben. Jedes Röhrchen enthält 1,5 ul dATP 1mM, 0,5 1l 5X Anlagerungspuffer (200 mM Tris-HCl, ph 7,5, 50 mM MgCl&sub2;) und 1,0 ul ddNTP 100 uM (wobei ddNTP ddG, A, T oder C in dem entsprechenden Röhrchen entspricht). Jede "chase" Reaktion wird bei 45ºC (oder 30 bis 50ºC) 10 Minuten lang inkubiert und es werden sodann 6 ul einer Stopplösung (90% Formamid, 10 mM EDTA, 0,1% Xylolcyanol) jedem Röhrchen zugegeben und das Röhrchen auf Eis gestellt. Die "chase" Time kann zwischen 1 bis 30 Minuten variieren.
  • Die Sequenzierungsreaktionen laufen auf Standard 6% Polyacrylamid-Sequenzierungsgel in 7M Harnstoff bei 30 Watt 6 Stunden lang. Vor dem Laufen auf einem Gel werden die Reaktionsmischungen auf 75ºC 2 Minuten lang erhitzt. Das Gel wird in 10% Essigsäure, 10% Methanol fixiert, und auf einem Geltrockner getrocknet und es wird sodann über Nacht ein Kodak OM1 Autoradiographiefilm mit hohem Kontrast damit belichtet,.
    • Beispiel 3: DNA Sequenzierung unter Verwendung begrenzter Mengen von dNTP
  • Bei diesem Beispiel wird die DNA Sequenzanalyse von mGP1-2 DNA unter Verwendung begrenzter Mengen von allen vier Desoxyribonukleosidtriphosphaten in der Pulsreaktion bestimmt. Dieses Verfahren weist eine Anzahl von Vorteilen gegenüber dem Ablauf von Beispiel 2 auf. Zunächst einmal läuft die Pulse-Reaktion bis zum Ende, während bei dem vorhergehenden Ablauf es notwendig war, den Zeitablauf zu unterbrechen. Als Folge davon sind die Reaktionen leichter durchzuführen. Zweitens ist es bei diesem Verfahren leichter, das Ausmaß der Verlängerungen in der Pulse-Reaktion zu kontrollieren und so ist die Effizienz des Markierens der Sequenz nahe dem Primer (die ersten 50 Basen) nahezu 10-fach größer.
  • 7 ul von 0,75 mM einsträngiger M13 DNA (mGP1-2) wurden mit 1 ul eines komplementären Sequenzierungsprimers ( 17-mer, 0,5 pmole Primer/ul) und 2 ul 5X Anlagerungsbuffer (200 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM MgCl&sub2;, 250 mM NaCl) gemischt, 2 Minuten lang auf 65ºC aufgeheizt und über 30 Minuten langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Bei der Pulsreaktion wurden 10 ul der obigen Reaktionsmischung mit 1 ul Dithiothreitol 0,1 M, 2 ul von 3 dNTP (dGTP, dCTP, dTTP), jeweils 1,5 uM, 0,5 ul ³&sup5;S dATP, (10 uM) (etwa 10 um, 1500 Ci/mmol, New England Nuclear) und 2 ul modifizierter T7 DNA-Polymerase (0,1 mg/ml), 1000 Einheiten/ml, d. h. 0,2 ug, 2 Einheiten) gemischt und 5 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. (Bei der Inkubation können die Temperaturen und die Zeit zwischen 20ºC und 45ºC bzw. 1 und 40 Minuten variiert werden).
  • 3,5 ul Al quoten der obigen Pulse-Reaktion werden jedem von vier Reagenzgläsern zugegeben, die die "chase" Mischung enthalten und auf 37ºC vorgewärmt sind. Die vier mit G, A, T, C markierten Reagenzgläser enthalten jeweils Spurenmengen von entweder Dideoxy G, A, T oder C. Die spezifische "chase" Lösung ist unten angegeben. Jedes Reagenzglas enthält 0,5 ul 5X Anlagerungsbuffer (200 mM Tris-HCl, ph 7,5, 50 mM MgCl&sub2;, 250 mM NaCl), 1 ul 4dNTP (dGTP, dATP, dTTP, dCTP), jeweils 200 uM, und 1,0 ul ddNTP 20 uM. Jede "chase" Reaktion wird bei 37ºC 5 Minuten lang inkubiert (oder 20º bis 45ºC bzw. 1 bis 69 Minuten) und es werden sodann 40 ul einer Stopplösung (95% Formamid, 20 mM EDTA, 0,05% Xylolcyanol) jedem Reagenzglas hinzugegeben und das Reagenzglas vor dem Laufen auf einem Standardpolyacrylamid- Sequenzierungsgel, wie oben beschrieben, auf Eis gestellt.
    • Beispiel 4: Ersatz von dGTP durch dITP zur DNA Sequenzierung
  • Um über Kompressionsbereiche in der DNA, d. h. Bereiche mit einer kompakten Sekundärstruktur zu sequenzieren, ist es üblich, dITP (Mills et al., 76 Proc. Natl. Acad. Sci. 2232, 1979) oder Deazaguanosintriphosphat (deaza GTP, Mizusawa et al., 14 Nuc. Acid. Res. 1319, 1986) zu verwenden. Wir haben festgestellt, daß beide Analogen gut mit T7 Polymerasen arbeiten, insbesondere mit dITP beim Vorhandensein von ssb. Vorzugsweise werden diese Reaktionen mit der oben erläuterten genetisch modifizierten T7 Polymerase ausgeführt oder die "chase" Reaktion dauert 1 bis 2 Minuten und/oder bei 20ºC, um die Exonukleasedegradation zu vermindern.
  • Modifizierte T7 DNA-Polymerase verwendet wirkungsvoll dITP oder deaza-GTP anstelle von dGTP. dITP ersetzt sowohl in der Puls- als auch in der "chase"-Mischung dGTP mit Konzentrationen, die zwei bis fünf mal so groß sind, wie sie bei dGTP verwendet wird. Bei dem ddG "chase" Mix wird ddGTP noch verwendet (nicht ddITP).
  • Die "chase" Reaktionen unter Verwendung von dITP sind gegenüber den restlichen niedrigen Werten (etwa 0,01 Einheiten) der Exonukleaseaktivität empfindlich. Um dieses Problem zu vermeiden, sollten die "chase" Reaktionszeiten 5 Minuten nicht übersteigen, wenn dITP verwendet wird. Es ist zu empfehlen, daß die vier dITP Reaktionen zusammen mit den vier dGTP verwendeten Reaktionen ablaufen, anstatt getrennt von diesen Reaktionen. Wenn sowohl dGTP als auch dITP routinemäßig verwendet werden, kann die Anzahl der
  • erforderlichen Mischungen minimiert werden, indem: (1) Die dGTP und dITP aus den "chase" Mischungen herausgelassen wird, was bedeutet, daß die vier "chase" Mischungen sowohl für die dGTP als auch für die dITP "chase" Reaktionen verwendbar sind; (2) eine hohe Konzentration von dGTP oder dITP (2 ul bei 0,5 mM bzw. 1 bis 2,5 mM) zu dem geeigneten Pulsmix hinzugegeben wird. Die beiden Pulsmischungen enthalten dann jeweils eine niedrige Konzentration von dCTP, dTTP und [α³&sup5;S]dATP und eine hohe Konzentration entweder von dGTP oder dITP. Diese Abwandlung beeinträchtigt für gewöhnlich nicht die Qualität der Sequenzierungsreaktion und reduziert die notwendige Anzahl von "pulse" und "chase"-Mischungen auf sechs, die notwendig sind, um die Reaktionen sowohl unter Verwendung von dGTP als auch dITP laufen zu lassen.
  • Die Sequenzierungsreaktion ist, wie bei dem Beispiel 3, mit Ausnahme, daß zwei der Pulsmischungen enthalten a) 3 dNTP Mischungen für dGTP: 1 ,5 uM dCTP, dTTP und 1 mM dGTP sowie b) einen 3 dNTP-Mix für dITP: 1,5 uM dCTP, dTTP und 2 mM dITP. In der "chase" Reaktion wird das dGTP aus den "chase" Mixen entfernt, (d. h. die "chase" Mixe enthalten 30 uM dATP, dTTP und dCTP und eines der vier Dideoxynukleotide mit 8 uM), während die "chase" Zeit unter Verwendung von diTP 5 Minuten nicht übersteigt.
    • Hinterlegungen
  • Die Linien K38/pGP5-5/pTrx-2, K38/pTrx-2 und M13 mGP1-2 wurden bei der ATCC hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummern 67287, 67286 und 40303. Diese Hinterlegungen erfolgten am 13. Januar 1987. Die Linie K38/pGP1-2/pG5-6 wurde bei der ATCC am 4. Dezember 1987 hinterlegt und erhielt die Nummer 67571.
  • Die Anmelder und ihre Zessionare übernehmen die Verantwortung, diese Kulturen zu ersetzen, falls sie vor dem Ende der Laufzeit des hierauf erteilten Patentes, vor Ablauf von 5 Jahren nach der letzten Nachfrage nach einer Kultur oder vor Ablauf von 30 Jahren sterben, je nachdem, welche Zeit länger ist und sie übernehmen die Verantwortung dafür, die Hinterlegungsstelle von der Erteilung eines solchen Patentes in Kenntnis zu setzen, womit ab diesem Termin die Hinterlegungen unwiderruflich öffentlich zugänglich werden. Bis zu dieser Zeit sind die Hinterlegungen unwiderruflich für den Commissioner of Patents unter den Vorschriften gemäß 37 CFR Section 1-14 und 35 USC Section 112 zugänglich.
    • Andere Ausführungsbeispiele
  • Andere Ausführungsbeispiele liegen innerhalb des Schutzumfangs der Ansprüche.
  • Die direkte enzymatische Amplifikation von Genom DNA Sequenzen wurde für andere Polymerasen von Saiki et al., 230 Science 1350, 1985; und Scharf, 233 Science 1076, 1986 beschrieben.
  • Gemäß Fig. 6 beinhaltet die enzymatische Amplifikation einer spezifischen DNA Region die Verwendung von zwei Primern, die an gegenüberliegenden Strängen einer zweisträngigen DNA Sequenz im interessierenden Bereich angelagert werden, wobei ihre 3'-Enden einander zugekehrt sind (siehe die dunklen Pfeile). Das aktuelle Verfahren sieht mehrere (10 bis 40, vorzugsweise 16 bis 20) Zyklen der Denaturierung, des Anlagerns und der DNA Synthese vor. Unter Verwendung dieser Prozedur ist es möglich, eine spezielle Region des menschlichen DNA Genoms über 200 000 mal zu amplifizieren. Als Ergebnis erstellt das spezifische Genfragment einen Teil in fünf, anstatt, wie ursprünglich einen Teil in einer Million Teile dar. Dies vereinfacht stark sowohl das Klonieren als auch die direkte Analyse der Genom DNA. Für diagnostische Zwecke kann es die Analyse von einigen Wochen auf 1 bis 2 Tage beschleunigen.
  • Anders als das Klenow-Fragment, bei dem der Amplifikationsprozeß auf Fragmente unter zweihundert Basen Länge begrenzt ist, sollten die modifizierten T7 DNA Polymerasen (vorzugsweise in Verbindung mit dem DNA Bindungsprotein von E. coli oder ssb, um eine zurückschnappende Bildung einsträngiger DNA zu verhindern) die Amplifikation von DNA Fragmenten mit einer Länge von tausenden von Basen ermöglichen.
  • Die modifizierten T7 DNA Polymerasen sind auch für die Standardreaktionsmischungen geeignet: a) zum Auffüllen eines vorstehenden 5' Terminus eines DNA-Fragmentes, das durch Restriktionsenzymspaltung entstanden ist; um z. B. stumpf endende doppelsträngige DNA aus einem linearen DNA Molekül mit einem einsträngigen Bereich ohne freien 3'- Terminus zu erzeugen; b) zum Markieren der 3'-Enden von Restriktionsfragmenten zum Bestimmen der mRNA Startregionen mittels S1 Nukleaseanalyse oder zum DNA Sequenzieren unter Verwendung des chemischen Modifikationsverfahrens nach Maxam und Gilbert; und c) zur in vitro Mutagenese klonierter DNA-Fragmente. Beispielsweise wird ein chemisch synthetisierter Primer, der eine spezielle nicht passende Base enthält mit einer DNA Matrize hybridisiert und sodann durch die modifizierte T7 DNA Polymerase verlängert. Auf,diese Weise wird die Mutation auf Dauer in den synthetisierten Strang eingebaut. Für die Polymerase ist es vorteilhaft, von dem Primer über die gesamte Länge der DNA zu synthetisieren. Dies wird sehr wirksam unter Verwendung einer DNA Polymerase mit großer Prozeßfolge ausgeführt. Alternativ kann eine Mutagenese durch fehlerhafte Addition während der DNA Synthese (siehe oben) ausgeführt werden. Diese Anmeldung wird dazu verwendet, spezifische Bereiche klonierter DNA Fragmente zu mutagenisieren. Es ist wichtig, daß dem verwendeten Enzym die Exonukleaseaktivität fehlt. Unter Standardreaktionsmischung ist eine gepufferte Lösung zu verstehen, die die Polymerase sowie die notwendigen Desoxynukleoside oder andere Bestandteile enthält.

Claims (5)

1. Verfahren zum Amplifizieren einer DNA-Sequenz, bei dem an gegenüberliegenden Strängen einer zweisträngigen DNA-Sequenz ein erster und ein zweiter Primer angelagert werden und die angelagerte Mischung mit einer DNA-Polymerase inkubiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase eine prozessive, T7 DNA-Polymerase von Bakteorophagen T7 ist, die weniger als 50% der Exonucleaseaktivität aufweist, als es dem natürlichen Maß der Exonucleaseaktivität dieser Polymerase entspricht.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Polymerase weniger als 500 Einheiten der Exonucleaseaktivität pro mg Polymerase aufweist und daß der an die gegenüberliegenden Stränge der DNA-Sequenz angelagerte erste und zweite Primer mit ihren 3'-Enden nach dem Anlagern einander entgegengerichtet sind, wobei sich die zu amplifizierende DNA-Sequenz zwischen den beiden angelagerten Primern befindet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase eine ausreichende Reaktionsfolge besitzt um an der DNA-Sequenz wenigstens 500 Basen lang gebunden bleibt, ehe sie dissoziiert.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase weniger als 1% der Exonucleaseaktivität aufweist, die die Polymerase natürlicherweise hat.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Polymerase eine T7 DNA-Polymerase ist.
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