RO107769B1 - Metoda pentru determinarea secventei de baza nucleotidica a unei molecule de dna - Google Patents
Metoda pentru determinarea secventei de baza nucleotidica a unei molecule de dna Download PDFInfo
- Publication number
- RO107769B1 RO107769B1 RO131762A RO13176288A RO107769B1 RO 107769 B1 RO107769 B1 RO 107769B1 RO 131762 A RO131762 A RO 131762A RO 13176288 A RO13176288 A RO 13176288A RO 107769 B1 RO107769 B1 RO 107769B1
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- polymerase
- dna
- deoxyribonucleic acid
- dna polymerase
- activity
- Prior art date
Links
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 206
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title claims abstract description 199
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 77
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 74
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 44
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 44
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 38
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 26
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims abstract description 9
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 claims abstract description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract 20
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 50
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 20
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 19
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 11
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 4
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000682719 Adina Species 0.000 claims 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 claims 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 abstract 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 68
- 239000002585 base Substances 0.000 description 48
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 41
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 33
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 30
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 30
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 20
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 20
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 19
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 18
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 18
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 18
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 17
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 17
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 15
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 15
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 description 14
- 229940023064 escherichia coli Drugs 0.000 description 13
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 12
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 11
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 9
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 9
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 9
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 9
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 8
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N Leu-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 7
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 7
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 7
- -1 for example Chemical class 0.000 description 7
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 7
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 7
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N Ala-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 6
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 6
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101150118060 trxA gene Proteins 0.000 description 6
- WALVCOOOKULCQM-ULQDDVLXSA-N Lys-Arg-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O WALVCOOOKULCQM-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 5
- YPLVCBKEPJPBDQ-MELADBBJSA-N Lys-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N YPLVCBKEPJPBDQ-MELADBBJSA-N 0.000 description 5
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 4
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 description 4
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150096316 5 gene Proteins 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MKIAPEZXQDILRR-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN MKIAPEZXQDILRR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N Leu-Pro-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 3
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 3
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 3
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- KQFRUSHJPKXBMB-BHDSKKPTSA-N Ala-Ala-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 KQFRUSHJPKXBMB-BHDSKKPTSA-N 0.000 description 2
- SVFOIXMRMLROHO-SRVKXCTJSA-N Asp-Asp-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 SVFOIXMRMLROHO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 101000755953 Bacillus subtilis (strain 168) Ribosome maturation factor RimP Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 108700005090 Lethal Genes Proteins 0.000 description 2
- IGUOAYLTQJLPPD-DCAQKATOSA-N Leu-Asn-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IGUOAYLTQJLPPD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N Leu-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- KGCLIYGPQXUNLO-IUCAKERBSA-N Leu-Gly-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O KGCLIYGPQXUNLO-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- JKSIBWITFMQTOA-XUXIUFHCSA-N Leu-Ile-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O JKSIBWITFMQTOA-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 2
- RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- QMKFDEUJGYNFMC-AVGNSLFASA-N Leu-Pro-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O QMKFDEUJGYNFMC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- KWUKZRFFKPLUPE-HJGDQZAQSA-N Lys-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KWUKZRFFKPLUPE-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 2
- FIDMVVBUOCMMJG-CIUDSAMLSA-N Ser-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO FIDMVVBUOCMMJG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- WSTIOCFMWXNOCX-YUMQZZPRSA-N Ser-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)N WSTIOCFMWXNOCX-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UABYBEBXFFNCIR-YDHLFZDLSA-N Tyr-Asp-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O UABYBEBXFFNCIR-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 2
- WURLIFOWSMBUAR-SLFFLAALSA-N Tyr-Phe-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N)C(=O)O WURLIFOWSMBUAR-SLFFLAALSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLDYBRXERHITNH-QSFUFRPTSA-N Val-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C XLDYBRXERHITNH-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 2
- BTWMICVCQLKKNR-DCAQKATOSA-N Val-Leu-Ser Chemical compound CC(C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O BTWMICVCQLKKNR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- IMBKASBLAKCLEM-UHFFFAOYSA-L ferrous ammonium sulfate (anhydrous) Chemical compound [NH4+].[NH4+].[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O IMBKASBLAKCLEM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010079547 glutamylmethionine Proteins 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 102220277134 rs776745497 Human genes 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical class OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- YPGMOWHXEQDBBV-QWWZWVQMSA-N (4S,5S)-1,2-dithiane-4,5-diol Chemical compound O[C@@H]1CSSC[C@H]1O YPGMOWHXEQDBBV-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 101150055869 25 gene Proteins 0.000 description 1
- RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- FUSPCLTUKXQREV-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FUSPCLTUKXQREV-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- BEMGNWZECGIJOI-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BEMGNWZECGIJOI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- AKKUDRZKFZWPBH-SRVKXCTJSA-N Asp-Lys-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N AKKUDRZKFZWPBH-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- DPNWSMBUYCLEDG-CIUDSAMLSA-N Asp-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DPNWSMBUYCLEDG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 101100098985 Caenorhabditis elegans cct-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100275473 Caenorhabditis elegans ctc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100351961 Caenorhabditis elegans pgp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 229910016876 Fe(NH4)2(SO4)2 Inorganic materials 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 1
- 101710116281 Gene 5 protein Proteins 0.000 description 1
- KASDBWKLWJKTLJ-GUBZILKMSA-N Glu-Glu-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O KASDBWKLWJKTLJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BRKUZSLQMPNVFN-SRVKXCTJSA-N Glu-His-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O BRKUZSLQMPNVFN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- RXESHTOTINOODU-JYJNAYRXSA-N Glu-Phe-His Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N RXESHTOTINOODU-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- FGSGPLRPQCZBSQ-AVGNSLFASA-N Glu-Phe-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FGSGPLRPQCZBSQ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- WIKMTDVSCUJIPJ-CIUDSAMLSA-N Glu-Ser-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N WIKMTDVSCUJIPJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- RXJFSLQVMGYQEL-IHRRRGAJSA-N Glu-Tyr-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 RXJFSLQVMGYQEL-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- MFYLRRCYBBJYPI-JYJNAYRXSA-N Glu-Tyr-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O MFYLRRCYBBJYPI-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000017278 Glutaredoxin Human genes 0.000 description 1
- 108050005205 Glutaredoxin Proteins 0.000 description 1
- SOEATRRYCIPEHA-BQBZGAKWSA-N Gly-Glu-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SOEATRRYCIPEHA-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- MVORZMQFXBLMHM-QWRGUYRKSA-N Gly-His-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CN=CN1 MVORZMQFXBLMHM-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- CLNSYANKYVMZNM-UWVGGRQHSA-N Gly-Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N CLNSYANKYVMZNM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- FGPLUIQCSKGLTI-WDSKDSINSA-N Gly-Ser-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O FGPLUIQCSKGLTI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- POJJAZJHBGXEGM-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN POJJAZJHBGXEGM-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- GWNIGUKSRJBIHX-STQMWFEESA-N Gly-Tyr-Arg Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)CN)O GWNIGUKSRJBIHX-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- UVTSZKIATYSKIR-RYUDHWBXSA-N Gly-Tyr-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UVTSZKIATYSKIR-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JFSGIJSCJFQGSZ-MXAVVETBSA-N Leu-Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N JFSGIJSCJFQGSZ-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- HRTRLSRYZZKPCO-BJDJZHNGSA-N Leu-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HRTRLSRYZZKPCO-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N Leu-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VTJUNIYRYIAIHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- CKSXSQUVEYCDIW-AVGNSLFASA-N Lys-Arg-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N CKSXSQUVEYCDIW-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YORIKIDJCPKBON-YUMQZZPRSA-N Met-Glu-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O YORIKIDJCPKBON-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- AXHNAGAYRGCDLG-UWVGGRQHSA-N Met-Lys-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O AXHNAGAYRGCDLG-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- RVRRHFPCEOVRKQ-KKUMJFAQSA-N Phe-His-Asn Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N RVRRHFPCEOVRKQ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- YMIZSYUAZJSOFL-SRVKXCTJSA-N Phe-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O YMIZSYUAZJSOFL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- FYUIFUJFNCLUIX-XVYDVKMFSA-N Ser-His-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O FYUIFUJFNCLUIX-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 1
- HHJFMHQYEAAOBM-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HHJFMHQYEAAOBM-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N [[(2s,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1CC[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N 0.000 description 1
- ZXZIQGYRHQJWSY-NKWVEPMBSA-N [hydroxy-[[(2s,5r)-5-(6-oxo-3h-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy]phosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O)CC[C@@H]1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 ZXZIQGYRHQJWSY-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229920005603 alternating copolymer Polymers 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010043240 arginyl-leucyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011095 buffer preparation Methods 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000007323 disproportionation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 108010038983 glycyl-histidyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000011874 heated mixture Substances 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 1
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000989 no adverse effect Toxicity 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- OXMKRYBQXKJXBT-UHFFFAOYSA-N phosphono dihydrogen phosphate hydrochloride Chemical compound OP(O)(=O)OP(=O)(O)O.Cl OXMKRYBQXKJXBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000002683 reaction inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/848—Escherichia
- Y10S435/849—Escherichia coli
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Prezenta invenție se refera la o metodă pentru determinarea secvenței de bază nucleotidică a unei molecule de DNA utilizabilă în diagnosticul probelor de DNA în general, există două metode de secvențare a acidului dezoxiribonucleic. Metoda Maxam și Gilbert cuprinde degradarea chimică a fragmentelor izolate de acid dezoxiribonucleic, fiecare fragment fiind marcat prin radiomarcare simplă la terminusul definit al fiecărui fragment, fiecare reacție producând un clivaj specific limitat la una sau mai multe din cele patru nucleotide de bază guanina, adenina, timina sau citozina. Altă metodă cuprinde secvențarea dideoxi prin sinteza enzimatică a filamentului de acid dezoxiribonucleic. Au loc patru sinteze separate, fiecare reacție fiind terminată cu una din bazele specifice ale nucleotidei, guanina, adenina, timina sau citozina, prin încorporarea unei catene terminale corespunzătoare din dideoxinucleotida respectivă. Cea de-a doua metodă este de preferat, deoarece fragmentele de acid dezoxiribonucleic sunt uniform marcate (în loc de a fi marcate la partea finală) și astfel fragmentele mari de acid dezoxiribonucleic conțin o radioactivitate crescută. în continuare, nucleotidele marcate prin 35-S pot fi utilizate în locul nucleotidelor marcate prin 32-P; produsele de reacție sunt simplu de interpretat deoarece fiecare din acestea corespund numai la una din nucleotidele de bază, guanina, adenina, timina sau citozina. Enzima utilizată pentru secvențarea dideoxi este Escherichia coli polimeraza acidului dezoxiribonucleic I cu fragment mare Klenow”. O altă polimerază utilizată este AMV revers transcriptaza.
Una din metodele de determinare a secvenței de bază nucleotidică din molecula acidului dezoxiribonucleic, ca aspect al prezentei invenții, cuprinde regenerarea moleculei de acid dezoxiribonucleic cu o moleculă de primer capabilă de a hibridiza molecula de acid dezoxiribonucleic; incubarea porțiunilor sepa2 rate a amestecului regenerat în cel puțin patru recipiente cu patru trifosfați dezoxinucleozide diferiți, o polimerază a acidului dezoxiribonucleic procesivă în care polimeraza rămâne legată de molecula acidului dezoxiribonucleic prin cel puțin 500 de baze înainte de disociere în condițiile normale ale mediului ambiant utilizate în reacția de extensie a reacției de secvențare a acidului dezoxiribonucleic, polimeraza având cu cel puțin 500 de unități de activitate de exonuclează pe miligram de polimerază și unul din cei patru agenți terminali de sinteză a acidului dezoxiribonucleic care duc la o sinteză terminală a acidului dezoxiribonucleic la nucleotida specifică de baza. Agentul se termină la o nucleotida specifică de bază diferită în fiecare din cele patru recipiente. Produsele acidului dezoxiribonucleic, în reacția de incubare se separă conform mărimii lor, astfel ca cel puțin o parte din secvența nucleotidei de bază din molecula acidului dezoxiribonucleic să poată fi determinată.
Conform prezentei invenții, polimeraza rămâne legată la molecula acidului dezoxiribonucleic prin cel puțin o mie de nucleotide de bază înainte de disociere; polimeraza este aceeași ca una din celulele infectate cu fag de tip 17 (ca, de exemplu, fagi în care polimeraza acidului dezoxiribonucleic necesită o gazdă subunitară de tipul tioredoxinei; de exemplu, fagul de tip 17 este 17,13, ΦΙ, ΦΙΙ, H, W31, gh-1, Y, Al 122 sau SP6, menționate în Studier, 95 Virology 70, 1979); polimeraza este nediscriminatorie pentru dideoxinucleotide analoage; polimeraza este modificată ca având mai puțin de 50 de unități de activitate exonucleazică pe miligram de polimeraza, de preferat, fiind mai puțin de o unitate și mai preferat, fiind mai puțin de 0,1 unități și mult mai preferat, fiind o activitate exonucleazică nedetectabilă; polimeraza este capabilă să utilizeze primeri de cel puțin 10 baze sau, de preferință, de cel puțin 4 baze nucleotidice; primerii conțin de la 4 până la 40 nucleotide de baza și sunt acizi dezoxiribonucleic sau acizi ribonucleici simplu împletiți; faza de regenerare cuprinde încălzirea moleculei de acid dezoxiribonucleic și a primerului până la temperatura de peste 65°C, de preferință de la 65 până la 100°C, și răcirea amestecului încălzit până la o temperatură de sub 65°C, de preferință până la o temperatură cuprinsă între 0 și 30°C; faza de incubare cuprinde un impuls și o fază de presare în care impulsul cuprinde amestecarea amestecului de regenerare cu cele 4 dezoxinucleozide diferite, trifosfatice și cu polimeraza procesivă a acidului dezoxiribonucleic, în care cel puțin una din dezoxinucleozidele trifosfatice este marcată; mai preferabil, este ca faza de impuls să fie realizată în condițiile în care polimeraza nu manifestă procesivitate, fiind menținută timp de la 30 s până la 20 min, la temperatura de la 0 până la 20°C, sau în care cel puțin una din nucleotidele trifosfatice este limitata; faza de presare cuprinde adăugarea unui agent terminal la 4 părți alicote separate ale acestui amestec după faza de impuls; de preferință, faza de presare durează de la 1 până la 60 min, la o temperatură de la 30 până la 50°C; agentul terminal este o didezoxinucleotidă sau este limitată la nivelul de dezoxinucleozidă trifosfatica; una din cele 4 dezoxinucleotide este diTP saudeazaguanozina; primeni marca ți sunt utilizați, astfel ca nici o fază de impuls sa nu fie necesară și de preferință, marcarea să fie radioactivă sau fluorescentă; polimeraza este incapabilă de a prezenta procesivitatea acesteia în a doua categorie de condiții normale ale mediului ambiant utilizate în reacția de impuls din cadrul reacției de secvențare a acidului dezoxiribonucleic.
Mai departe, aceasta polimeraza permite secvențarea prin noi metode, a acidului dezoxiribonucleic în fragmente lungi, așa cum se va descrie în detaliu, în cele ce urmează.
- fig. 1-3, reprezintă în diagrame vec4 torii pTrx-2, mGPl-1 și pGP5 respectiv; fig.4, este o reprezentare grafică a oxidării selective a polimerazei T7 a acidului dezoxiribonucleic;
- fig.5, este o reprezentare grafică a posibilității de sintetizare a acidului dezoxiribonucleic de către polimeraza Ί7 modificată în prezența eteno-dAPT;
- fig.6, este o reprezentare diagramatică a amplificării enzimatice a acidului dezoxiribonucleic genomic utilizându-se polimeraza 17 a acidului dezoxiribonucleic modificată;
- fig.7-9, reprezintă secvențe de nucleotide ale pTrx-2 și o parte de pGP5-5 și respectiv mGPl-2;
- fig, 10, reprezintă în diagramă pGP5-
6.
Polimeraza acidului dezoxiribonucleic în general, polimeraza acidului dezoxiribonucleic, conform prezentei invenții, este procesivă, neavând o asociere cu activitatea exonucleazei; nu are loc o discriminare împotriva nucleotidei, analoagă încorporării și pot fi utilizate mici cantități de oligonucleotide (ca, de exemplu, tetrameri, hexameri și octameri), ca primeri specifici. Aceste proprietăți vor fi discutate în detaliu în cele ce urmează.
Prin procesivitate se înțelege că polimeraza acidului dezoxiribonucleic este capabilă pentru încorporarea în continuare a mai multor nucleotide utilizânduse modele primer asemănătoare fără disociere din aceste modele, în condițiile normale utilizate pentru reacțiile de extensie utilizate pentru secvențarea acidului dezoxiribonucleic. Gradul de procesivitate variază cu diferite polimeraze: unele încorporează numai câteva baze înainte de disociere (de exemplu, Klenow aproximativ 15 baze), polimeraza T4 a acidului dezoxiribonucleic, aproximativ 10 baze, polimeraze T5 a acidului dezoxiribonucleic aproximativ 180 baze și revers transcriptaza, aproximativ 200 baze, așa cum este menționat în timp ce alte componente, cum sunt cele, conform prezentei invenții, rămân legate de cel puțin 500 de baze și de preferință, de cel puțin o mie de baze in condiții convenabile de mediu ambiant. Astfel de condiții convenabile ale mediului ambiant includ modele adecvate ale celor 4 tipuri de dezoxinucleotide trifosfatice și o temperatură de incubare de la 10 până la 50°C. Procesivitatea este cu mult crescută în prezență de Escherichia coli, cu filament cu simplă răsucire legat de proteină. Cu terminația enzimelor procesive ale reacției de secvențare se vor produce numai acele baze care au încorporate un agent terminal, cum ar fi, de exemplu, o didezoxinucleotidă. Dacă polimeraza acidului dezoxiribonucleic este neprocesivă, atunci benzile artifactuale vor crește în timpul reacțiilor de secvențiere, la pozițiile corespunzătoare nucleotidelor unde polimeraza este disociată. Prin disociere frecventă se crează benzi de bază în poziții incorecte și care umbresc adevărata secvență a acidului dezoxiribonucleic. Această problemă este parțial corectată prin incubarea amestecului de reacție într-un timp mai lung de la 30 până la 60 min, cu o concentrație ridicată a substraturilor, care presează benzile artifactuale peste greutatea moleculară ridicată la partea superioară a gelului care pleacă din regiunea în care se citește secvența de acid dezoxiribonucleic. Aceasta nu este o soluție ideală deoarece o polimerază neprogresivă a acidului dezoxiribonucleic are o probabilitate ridicată de disociere în acest model în regiunile având o structura compactă secundară sau o structura ondulată. Reinițierea elongației primerului în aceste porțiuni este ineficientă și rezultatul uzual este formarea benzilor în aceeași poziție pentru toate cele patru nucleotide, astfel fiind umbrită secvența de acid dezoxiribonucleic.
Discriminarea analoagă: polimerazele acizilor dezoxiribonucleid, conform prezentei invenții, nu trebuie să discrimineze semnificativ între didezoxinucleotidele analoage și nucleotidele normale. Aceasta înseamnă că, șansa de încorporare a unui fragment analog este aproximativ aceeași cu cea a nucleotidei normale, sau că se încorporează cel puțin un compus analog cu cel puțin o zecime din eficiența pe care o are în mod normal un fragment analog. Polimerazele, conform prezentei invenții, nu trebuie să discrimineze așadar semnificativ împotriva unor alți compuși analogi. Acest fapt este important deoarece, în ediție cu 4 dezoxinucleotide trifosfatice normale (dGTP, dATP, dTTP și dCTP), reacțiile de secvențare necesită încorporarea altor tipuri de drivați de nucleozide ca, de exemplu, nucleozidele trifosfatice marcate radioactiv sau prin fluorescență, în mod obișnuit pentru marcarea fragmentelor sintetizate, cu 35 S, 32 P sau alți agenți chimici. Atunci când polimeraza acidului dezoxiribonucleic nu discriminează împotriva unor elemente asemănătoare, există aceeași probabilitate pentru încorporarea unui element analog ca și a unei nucleotide normale. Pentru marcarea nucleozidelor trifosfatice, este important de a sintetiza acidul dezoxiribonucleic cu fragmente răsucite, utilizându-se un minim de radioactivitate. Mai departe, niveluri scăzute de elemente analoage, făcând reacția de secvențare mai ieftină decât în cazul enzimei discriminatorii.
Polimerazele discriminatorii prezintă o extindere diferită a discriminării, atunci când acestea sunt polimerizate într-un mod procesiv în raport cu impedimentul care apare la sintetizarea structurii secundare. în astfel de impedimente, există o variabilitate în intensitatea diferitelor benzi radioactive de pe gel care pot umbri secvența.
Activitatea exonucleazică: polimeraza acidului dezoxiribonucleic, conform prezentei invenții, are mai puțin de 50%, de preferință, mai puțin decât 1% și mult mai preferabil mai puțin de 0,1% din nivelul normal sau natural asociat al activității exonucleazice (cantitatea de activitate pe molecula de polimerază). Prin nivelul normal sau natural asociat se înțelege o activitate exonucleazică a unui tip T7 de polimerază nemodificată, în mod normal o activitate asociata este de aproximativ 5000 de unități de activitate exonucleazică pe miligram de polimerază, măsurată așa cum se descrie mai jos printr-un procedeu modificat, așa cum este menționat în Chase et al. 249 J.Biol.Chem.4545, 1974. Exonucleazele cresc fidelitatea sintezei de acid dezoxiribonucleic prin excizia oricăror baze nou sintetizate care sunt incorect împerecheate pe baza modelului respectiv. Astfel de activități exonucleazice asociate sunt în detrimentul reacțiilor de secvențare a acidului dezoxiribonucleic. Astfel crește concentrația minimă necesara precursorilor nucleotidei care poate fi adăugată la reacție deoarece, atunci când concentrația de nucleotidă scade, activitatea polimerazei scade într-un raport comparabil cu activitatea exonucleazei, rezultând o sinteză care nu este netă sau rezultând o eventuală degradare a acidului dezoxiribonucleic degradat
Mult mai important este faptul ca, activitatea exonucleazei asociata va cauza pierderea polimerazei acidului dezoxiribonucleic în zonele în care apar impedimente în modelul structural secundar. Când o polimerază se apropie ca structură, gradul de sinteza scade, acest fenomen fiind trecător. O exonuclează asociată va determina sintetizarea din nou a acidului dezoxiribonucleic. Ca o consecință ciclurile numeroase de sinteză și de excizie se produc în cadrul acestor reacții. Aceasta rezultă în timpul de sintetizare eventual sinuoasă a polimerazei (care nu este în detrimentul calității reacției de secvențare); sau polimerază poate disocia din fragmentul sintetizat (care rezultă într-o bandă artifactuală în aceeași poziție la toate cele patru reacții de secvențare); sau un agent terminal poate fi încorporat la o frecvență ridicată și produce o mare variabilitate în intensitatea diferitelor fragmente în gelul secvența! Aceasta se produce deoarece frecvența de încorporare a agentului terminal la orice parte dată, crește cu numărul de oportunități al polimerazei care se încorporează în nucleotidă cu catenă terminală și astfel polimerază acidului dezoxiribonucleic va încorpora un agent terminal la o frecvență mult mai ridicată în special în porțiunile cu fucționare în gol, în raport cu alte porțiuni.
O reacție secvențială ideală va produce benzi de o intensitate uniformă în geL Aceasta este esențială pentru obținerea unei prezentări optimale a filmului de raze X pentru fiecare fragment radioactiv. în cazul în care există o intensitate variabilă a benzilor radioactive, atunci benzile slabe au șansa să devină nedetectate. Pentru obținerea unei intensități radioactive uniforme pentru toate fragmentele, polimerază acidului dezoxiribonucleic va utiliza același interval de timp la fiecare poziție a acidului dezoxiribonucleic, arătându-se nici o preferință, fie pentru vreo adiție, fie pentru o separare a nucleotidelor în orice parte dată. Aceasta se produce dacă polimerază acidului dezoxiribonucleic lipsește din asocierile exonucleazelor, astfel ca să existe numai o oportunitate în încorporarea unei catene terminale a nucleotidei la fiecare poziție, de-a lungul modelului acesteia.
Primeni scurți: polimerază acidului dezoxiribonucleic, conform prezentei invenții, este capabilă de a utiliza primeri ai unui număr de 10 baze sau mai puțin, ca și a unor primeri mai lungi decât aceștia, mult mai preferați fiind cei care conțin de la 4 până la 20 de baze. Abilitatea utilizării primerilor scurți, oferă un număr de importante avantaje în ceea ce privește secvențarea acidului dezoxiribonucleic. Primeni mai scurți sunt mai ieftini la cumpărare și mai ușor de sintetizat decât primeni uzuali având de la 15 până la 20 de baze. Așadar acești primeri se regenerează mai repede în porțiunile complementare ale modelului de acid dezoxiribonucleic, făcându-se în acest fel o reacție de secvențare mai rapidă.
în continuare, abilitatea utilizării unor primeri de oligonucleotide cum ar fi cele conținând 6 sau 7 baze pentru secvențarea acidului dezoxiribonucleic permite strategii care nu sunt altfel posibile pentru secvențarea unor fragmente lungi de acid dezoxiribonucleic. De exemplu, un set care conține 80 de hexameri randomizați poate fi generat, niciunul din aceștia nefiind complementar la oricare porțiune a vectorului de clonizare. Statistic, una din ode 80 de secvențe hexamere va produce o medie la fiecare 50 de baze de-a lungul fragmentului acidului dezoxiribonucleic care trebuie secvențat Determinarea secvenței de 3000 de baze necesită numai 5 cicluri de secvențare, așa cum este menționat în New England Biolabs 1211, sequence 5’ GTAAAACGACGGCCAGT 3’ pentru primul primer universal și care se utilizează pentru secvențarea a aproximativ 600 de baze la unul din capetele inserției. Utilizându-se rezultatele din această reacție de secvențare, un nou primer va fi format dintr-un set omolog într-o zonă apropiată de capătul secvenței determinate. In ciclul al doilea, secvența următoarelor 600 de baze se va determina utilizându-se acest primer. Repetarea acestui proces de 5 ori, va determina formarea unei secvențe complete formată din 3000 de baze, fără a necesita vreo subclonizare și fără vreo sinteză chimică a vreunui primer oligonucleotidic nou. Utilizarea unor stfel de primeri scurți poate fi sporită prin includerea genei 2, 5 și 4 a proteinei T7 în reacția de secvențare.
Polimerazele acidului dezoxiribonucleic (de exemplu, cele care posedă proprietățile de mai sus), includ polimeraze de tip Ί7 modificate, aceasta deoarece polimeraza acidului dezoxiribonucleic necesită ca gazdă tioredoxina ca subunitate și acestea sunt substanțial identice cu polimeraza de tip T7 a acidului dezoxiribonucleic modificată sau cu enzime echivalente izolate din fragmentul relatat, cum ar fi, de exemplu: T3, ΦΙ, ΦΙΙ, H, W31, gh-1, Y, A1122 și SP6. Fiecare din aceste enzime poate fi mo10 dificată ca având proprietăți similare cu cele ale enzimelor modificate de tip T7. Este posibil de a izola enzima din fragmentul infectat direct cu celule, dar de preferință, enzima este izolată din celulele care se produc în jurul acesteia. în mod substanțial identic, se pare că, enzima poate avea aminoacizi substituiți care nu trebuie să afecteze proprietățile generale ale enzimei. Un exemplu de substituție de aminoacid în mod special dorită este una în care enzima naturală este modificată pentru separarea oricărei activități a exonucleazeL Această modificare poate fi realizată la nivel genetic sau chimic (așa cum este menționat în continuare).
Clonizarea polimerazei de tip 17: ca exemplu al prezentei invenții, se va descrie clonizarea, supraproducția, purificarea, modificarea și utilizarea polimerazei 17 a aridului dezoxiribonucleic. Această enzimă procesivă constă din două polipeptide complexate sub formă stoiechiometrică. Una este proteina 5 codificată de fagul 17, de 84000 daltoni (Modrich et al. 150 J.Biol.Chem. 5515, 1975), iar alta este tioredoxina codificată de E.coli de 12000 daltoni (Tabor et al., J.Biol.Chem. 262:16, 216, 1987).
Tioredoxina este o proteină accesorie și care leagă gena proteinei cinci (polimeraza acidului dezoxiribonucleic actual neprocesivă), în modelul de primer respectiv. Polimeraza naturală a acidului dezoxiribonucleic are o exonucleaza 3’ până la 5’ foarte activă în asociere cuaceasta. Această activitate face ca polimeraza utilizată pentru secvențarea acidului dezoxiribonucleic a aridului dezoxiribonucleic să fie inactivă sau modificată înainte ca polimeraza să fie utilizată. Aceasta este în mod real realizabilă așa cum se va descrie mai jos, fie pe cale chimică, prin oxidare locală a domeniului exonucleazei, fie genetic, prin modificarea regiunii codificate a genei polimerazei care codifică această activitate.
pTrx-2: în vederea clonizării tioredoxinei trxA ca genă a Escherichiei coli sălbatecă, de tip Escherichia coli acid dezoxiribonucleic, este parțial clivat cu Sau3A și fragmente liga te la BamHI elevat T7 acid dezoxiribonucleic izolat din specia T7-ST9, așa cum este menționat în (Tabor et aL, in Thiredoxin and Glutaredoxin Systems: Structure and Function (Holmgren et al., eds) pp. 285-300, Raven Press, NY; and Tabor et al., șupra). Acidul dezoxiribonucleic ligat este transfectat în Escherichia coli trxA- sub forma de celule, iar amestecul este placat pe celulele de trxA- și se marchează plăcile rezultate T7. Deoarece T7 nu se poate dezvolta fără ca să conțină o genă activă de Escherichia coli, numai fragmentele care conțin gena trxA pot forma plăci. Genele trxA clonizate sunt localizate pe perechea de baza 470 a fragmentului HinclI.
în vederea supraproducerii unui plasmid de tioredoxină, se construiește fragmentul pTrx-2. Pe scurt, cele 470 de perechi de bază HinclI de fragmente care conțin gena trxA au fost izolate prin procedee standard menționate în (Maniatis et al., Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs., Cold Spring Harbor, N.Y.), și ligate la un derivat de pBR322 care conține promotorul Ptac (ptac-12), așa cum este, de asemenea, menționat în (ptac-12, Amann et aL, 25 Gene 167, 1983). Referitor la figura numărul doi, ptac-12 conținând beto-lactamaza și originea Col El, se taie cu PvuII, pentru a se obține un fragment de 2290 bp, care este apoi ligat la două copii tandem de trxA (fragmentul HinclI), utilizându-se linkeri comerciali convenabili (polilinkerul Smal-BamlII) pentru formarea pTrx-2. Secvența completă a nucleotidei pTrx-2 este arătată în fig.7. Producerea de tioredoxină este acum sub controlul promotorului tac și astfel poate fi indusa în mod specific, de exemplu, prin IPTG (izopropil beta-Otiogalactozida).
pGP-5 și mGPl-2: unele produse genetice T7 sunt letale când se exprimă în Escherichia coli. Un sistem de exprimare este dezvoltat pentru facilizarea clonizării și exprimarea genelor letale pe baza exprimării inducibile a polimerazei T7 a acidului ribonucleic. Proteina genetică 5 este legată în unele specii de Escherichia coli și exemple de astfel de sisteme sunt descrise în (Tabor et al.82 Proc.NatAcad.Sci. 1074, 1985), în care gena T7 este adusă sub controlul promotorului Φ10 și este exprimată numai atunci când polimeraza T7 a acidului ribonucleic este prezentă în celule.
Pe scurt, așa cum se arată în fig.3, pGP5-5 se construiește prin procedee standard utilizându-se linkeri sintetici BamHI pentru legarea fragmentului T7 din 14306 (Ndel) la 16869 (AhalII), conținând gena 5, la fragmentul 560 bp al T7 din 5667 (HinclI) la 6166 (Fhu4HI) conținând ambii promotori Φ1.1Α și Φ1.1Β care se recunosc prin polimeraza T7 a acidului ribonucleic și în fragmentul BamHI-HincII al pACYC177 așa cum este menționat în (Chang et aL, 134 JJBacterioL 1141,1978). Secvența nucleotidei inserțiilor T7 și a linkerilor este prezentată în fig.8. în această plasmidă, gena 5 este exprimată numai când polimeraza T7 a acidului ribonucleic este prevăzuta în celulă.
Referitor la fig.3, polimeraza T7 a acidului ribonucleic este prevăzută în fragmentul de vector mGPl-2. Acesta este similar cu pGPl-2 așa cum se menționează în (Tabor et aL, id) exceptând faptul că, fragmentul de T7 din 3133 (JfaelII) până la 5840 (Hinfl) care conține polimeraza T7 a acidului ribonucleic este ligata utilizându-se linkeriifi^/II și respectiv Săli, până la 2tomHI-&zII, tăindu-se M13 mp8 și plasând gena polimerazei sub controlul promotorului lac. Secvența nucleotidei complete a mGPl-2 este arătată în fig.9.
Deoarece pGP-5 și pTrx-2 au diferite origini de replicare (respectiv o origine P15A și o origine ColEI), aceștia pot fi transformați simultan într-o celula. pTrx-2 exprimă cantități mari de tioredoxină în prezența IPTG; mGPl-2 poate sa coexiste în aceeași celulă ca și aceste două plasmide și pot fi utilizate pentru reglarea exprimării polimerazei Ί7 a acidului dezoxiribonucleic din pGP55, simplu prin determinarea producerii polimerazei T7 a acidului ribonucleic prin inducerea promotorului lac, de exemplu, cu IPTG.
Supraproducția de polimeraza T7 a acidului dezoxiribonucleic: exista diferite strategii potențiale pentru supraproducția și reconstituirea celor două produse genetice trxA și a genei 5. Aceleași tipuri de celule și plasmidejpot fi utilizate pentru toate strategiile. In cadrul unei strategii preferate, cele două gene sunt co-supraexprimate prin aceeași celulă. (Aceasta deoarece gena 5 este susceptibilă, până ce proteazele sunt legate de tioredoxină). Așa cum se va descrie mai departe, în detalii, unul din procedee este de a se plasa cele două gene separat pe fiecare din cele două plasmide compatibile în aceeași celulă. în mod alternativ, cele două gene pot fi plasate în tandem pe același plasmid. Este important ca gena T7 5 să fie plasată sub controlul promotorului inducibîl lipsit de curgere, ca, de exemplu, Φ1.1Α, Φ1.1Β și Φ10 al T7, ca și sinteza unor cantități mici din cele două polipeptide la un loc, care sunt toxice în majoritatea celulelor de Escherichia coli. Prin expresia lipsit de curgere” se înțelege că cel puțin 500 de molecule din produsul genetic sunt formate în perioada de generare celulară, din genă, când promotorul, în controlul exprimării genei, nu este activat De preferință, sistemul de exprimare a polimerazei T7 a acidului dezoxiribonucleic este utilizat așadar în alte sisteme de exprimare care utilizează la rândul lor promotori inducibilL Un promotor fără curgere, de exemplu, plac, permite ca să fie sintetizate mai mult de 500de molecule de proteine, deși nu sunt inducibile și aceste celule conțin genele letale sub controlul unui astfel de promotor ce se dezvoltă puțin și care nu este convenabil pentru prezenta invenție. Este, de ase14 menea, posibil ca să se producă aceste produse în celulele în care ele nu sunt letale; de exemplu promotorul plac este convenabil pentru aceste celule.
într-o a doua categorie, fiecare genă poate fi clonizată și supraexprimată separat Utilizându-se această strategie, celulele care conțin polipeptidele supraproduse individuale sunt combinate înainte de prepararea extractelor, punct în care cele două polipeptide formează o polimeraza activă T7 a acidului dezoxiribonucleic.
Exemplul 1. Prepararea polimerazei T7 a acidului dezoxiribonucleic. Specia Escherichia coli 71,18, așa cum este menționat în (Messing et aL, Proc. Nat Acad. Sci. 74:3642, 1977) se utilizează pentru prepararea stocurilor de mGP-1. Elementul 71,18 se păstrează în glicerol 50% concentrație, la temperatura de -80°C și este adus pe o placă cu agar-agar ca mediu minim standard. O singură colonie se dezvoltă până a doua zi în 25 ml de mediu standard M9 la temperatura de 37°C și se obține o placă singura de mGPl-2, prin titrarea stocului, utilizându-se celulele 71,18 proaspăt preparate. Placa este utilizată pentru inocularea a 10 ml 2X LB (bacto-triptofan de 2% concentrație, extract de drojdie 1% concentrație, clorură de sodiu 0,5% concentrație, hidroxid de sodiu 8 mM) care conține JM103 dezvoltat la As90=0,5. Această cultură va conține stocul de fragmente pentru prepararea unei culturi mari de mGPl- 2. După 3...12 h, cultura de 10 ml este centrifugată și supernatantul este utilizat pentru infectarea unei culturi mari (2L). Pentru o cultura mare, 4 serii a 500 ml 2X LB se inoculează cu 4 serii de 5 ml de celule 71,18 dezvoltate în M9 și se agită la temperatura de 37°C. Când o cultura mare de celule se dezvoltă la A590=l,0 (aproximativ 3 h), acestea se inoculează cu 10 ml de supernatant care conține lizatul inițial mGPl-2. Celulele infectate sunt apoi dezvoltate {>ână a doua zi la temperatura de 37°C. n următoarea zi, celulele sunt separate prin centrifugare și supematantul este gata de utilizare pentru inducția K38/pGP5-5 lpTrx-2 (vezi în continuare). Supematantul poate fî conservat la temperatura de 4°C, pentru aproximativ 6 luni, cu un titru de -5 x IO11 Φ/ml. La acest titru, un litru de elemente se infectează cu 12 1 de celule la A59o=5 cu o multiplicitate a infecției în valoare de 15. Dacă titrul este scăzut, elementul mGPl-2 poate fî concentrat din supernatant prin dizolvarea clorurii de sodiu (60 mg/1) și PEG-6000 (65 mg/1) în supernatant, lăsându-se apoi amestecul în repaos la temperatura de 0°C, timp de una până la 72 h, după care se centrifughează timp de 20 min la o viteză de rotație de 7000 rot/min. Precipitatul care conține elementul mGPl-2, este resuspendat în aproximativ 1/20 din volumul original al mediului M9.
K38/pGP5-5/pTrx-2 este o specie de Escherichia coli (genotip HfrC (lamda) care conține cele două plasmide compatibile pGP5-5 si pTrx-2). Plasmida pGP5-5 are originea P15A în gena de rezistență de replicare și exprimare a kanamicinei (km). pTrx- 2 are originea ColEI de replicare și exprimare a genei de rezistență a ampicilinei (Ap). Plasmidele se introduc în prcedeele standard K38, selecționându-se KmR și respectiv Ap . Celulele K38/pGP5-5/pTrx-2 sunt păstrate în glicerol de 50% concentrație, la temperatura de -80°C înainte de utilizare mediul este adus pe o placă care conține 50 /4g/ml de ampicilină și kanamicină, după care sunt lăsate să se dezvolte la temperatura de 37°C până a doua zi, dezvoltându-se o singură colonie în 10 ml de mediu LB care conține 50 /ig/ml de ampicilină și kanamicină, la temperatura de 37°C, timp de 4 până la 6 h. O cultură de 10 ml de celule se utilizează pentru inocularea a 500 ml de mediu LB care conține 50 /zg/ml de ampicilină și kanamicină și se agită la temperatura de 37°C, până a doua zi. în ziua următoare, cultura de 500 ml se utilizează pentru inocularea a 121 de mediu 2X LB-KPO4 (bacto-triptonă 2% concentrație, extract de drojdie 1% concentrație, clorură de sodiu 0,5% concentrație, 20 mmol de fosfat de monopotasic KPO4, dextroză 0,2% concentrație și casamino acizi 0,2% concentrație, pH =7,4) și se dezvoltă în atmosferă aerată într-un fermentator la temperatura de 37°C. Când celulele se îmbogățesc la AS9O=5,O (de exemplu, faza celulara logaritmică sau staționară), acestea se infectează cu mGPl-2 cu o multiplicitate de infectare în valoare de zece și se adaugă IPTG (în concentrație finală de 0,5 nM). IPTG induce producerea de tioredoxină și polimeraza T7 a acidului ribonucleic în mGPl-2 și astfel se induce producerea de polimeraza clonizată a acidului dezoxiribonucleic. Celulele sunt dezvoltate un timp adițional de 2,5 h cu agitare și aerare, după care se efectuează recoltarea. Peletele celulare sunt resuspendate în 1,5 1 de sucroză /20 mM Tris-acid clorhidric de 10% concentrație, lapH = =8/25 mM acid etilendiaminotetraacetic (EDTA) și se agită din nou. în final peletele celulare sunt resuspendate în 200 ml de amestec de sucroză 10% concentrație și 20 mM Tris-acid clorhidric, la pH=8, pe un mM de acid etilendiaminotetraacetic (EDTA) si apoi se congelează în azot lichid. Din 121 de celule induse, se obțin 70 mg de pasta celulară, care conțin aproximativ 700 mg de proteine gena 5 și 100 mg de tioredoxină.
K38/pTrx-2 (K38 conține numai pTrx2) supraproduce tioredoxină și se adaugă ca un booster la extractele K38/pGP55/pTix-2 pentru a se asigura că tioredoxină este în exces față de proteina genei 5 la începutul purificării. Celulele K38/pTrx2 sunt conservate în glicerol de 50% concentrație la temperatura de -80°C. înainte de utilizare acestea sunt aduse pe un disc care conține 50 pg/ml de ampicilină, după care se dezvoltă la temperatura de 37°C, timp de 24 h, dezvoltându-se o singură colonie la temperatura de 37°C, până a doua zi, în mediu de 25 ml LB care conține 50/igfail de ampicilină. Cei 25 ml de mediu de cultură se utilizează pentru inocularea a 2 1 de 2 x LB ca mediu de cultură și apoi se agită la temperatura de 37°C. 5
Când aceste celule se îmbogățesc la A590=3,0, promotorul ptac, se produce astfel tioredoxină, realizându-se inducția prin adiție de IPTG (concentrația finală fiind de 0^5 mM). Celulele sunt dezvoltate 10 sub agitare un timp adițional de 12 până la 16 h, la temperatura de 37°C, după care se recoltează probele și se resuspendă în 600 ml de amestec de sucroză în concentrație de 10%, și 20 ml de 15 mM de Tris-acid clorhidric, la />11=8, utilizându-se o soluție de acid etUendiaminotetraacetic 25 mM, după care se agită din nou. în final, celulele sunt resuspendate în 40 ml de sucroză de 10% 20 concentrație în amestec de 20 mM de Tris-acid clorhidric, lapH=8, în 0,5 mM de acid etilendiaminotetraacetic, după care se congelează în azot lichid. Din 2
Ide celule se obțin 16 mg de pastă celulară 25 care conține 150 mg de tioredoxină. Analizele pentru polimerază cuprind utilizarea timusului de vițel, 6 mM acid dezoxiribonucleic în filamente cu răsucire simplă ca substrat Acest material se 30 prepară imediat înainte de utilizarea prin denaturarea acidului dezoxiribonucleic în filamente dublu răsucite aparținând timusului de vițel, utilizându-se 50 mM de hidroxid de sodiu la temperatura de 35 20°C, timp de 15 min, după care se neutralizează cu acid clorhidric. Orice purificare a acidului dezoxiribonucleic poate fi utilizată ca model pentru analiza polimerazei, de preferință acesta având 40 o lungime mai mare de 1000 baze.
Analiza standard a polimerazei acidului dezoxiribonucleic T7 utilizată în acest caz reprezintă o modificare a procedeului descris în (Grippo et al. 246 45
J.BioLChem. 6867,1971). Amestecul de reacții standard, cu un volum final de 200 μ\ conține 40 mM de Tris-acid clorhidric la/>H=7,5,10 mM clorură de magneziu, mM ditiotreitol, 100 moli normali de 50 acid dezoxiribonucleic din timus de vițel denaturat cu alcali, 0,3 mM dGPT, dATP, dCTP și (Ή) dTTP (20 cpm pe pm), 50 /4g/ml BSA și cantități diferite de polimerază T7 a acidului dezoxiribonucleic. Incubarea se face la temperatura de 37°C (se utilizează un interval de la 10 la 40°C), timp de 30 min (se utilizează un interval de la 5 la 60 min). Amestecul de reacție este oprit prin adăugare de 3 ml de acid clorhidric IN-0,1 M pirofosfat rece, la temperatura de 0°C Radioactivitatea insolubilă în acid este determinată prin procedee cunoscute (Hinkle et al. 250 J.BioLChem. 5523, 1974). Acidul dezoxiribonucleic este precipitat pe gheață timp de 15 min (se utilizează un interval de la 5 până la 12 h), după care precipitatul este filtrat cu ajutorul unor filtre formate din fibre de sticlă. Filtrele sunt spălate de 5 ori cu câte 4 ml de acid clorhidric
0.1 M - 0.1 M pirofosfat rece la temperatura de 0°C și de 2 ori cu etanol de 90% concentrație, la temperatura de 0°Q După uscare, radioactivitatea de pe filtru este măsurată utilizându-se scintilație de fluor neapos.
O unitate de activitate de polimerază catalizează încorporarea a 10 moli din nudeotidele normale într-o formă solu bilă în acid clorhidric timp de 30 min la temperatura de 37°C, în condițiile menționate mai sus. Polimerază nativă T7 a acidului dezoxiribonucleic și polimeraza modificată T7 a acidului dezoxiribonucleic (vezi în continuare) au aceeași activitate specifică de polimerază, ±20% care se situează între 5000 și 20000 unități/mg, pentru polimerază nativă, și 5000 până la 50000 unități/mg pentru polimerază modificată, dependent de modul de preparare, utilizându-se condiții standard de analiză așa cum s-a menționat mai înainte.
Polimerază acidului dezoxiribonucleic T7 este purificată din extractele de mai sus prin precipitate și tehnici de cromatografiere. Se dă în continuare un exmplu de astfel de purificare.
Un extract format din celule congelate (200 ml de K38/pGP5- 5/pTrx-2 și 40 ml de K38/pTix-2) se menține până a doua zi la temperatura de 0°C. Celulele sunt combinate și 5 ml de lizozimă (15 mg/ml) și 10 ml de clorură de sodiu 5M se mai adaugă la acest amestec. După menținere timp de 45 min, la temperatura de 0°C, celulele sunt aduse pe baia de apă la temperatura de 37°C, baia de apă menținândus-se până ce atinge temperatura de20°G Celulele sunt apoi congelate în azot lichid. Se adaugă apoi o cantitate adițională de 50 ml de clorură de sodiu 5M, și apoi celulele se mențin pe baia de apă la temperatura de 37°C. După decongelare, celulele se amestecă ușor la temperatura de 0°C, timp de 60 min. Uzatul astfel obținut este centrifugat timp de o oră, cu o viteză de 35 rot/min într-un rotor tip Beckman 45Ti. Cantitatea de 250 ml de supematant reprezintă fracțiunea I. Aceasta conține aproximativ 700 mg din proteina genei 5 și 250 mg de tioredoxină (raportul între tioredoxină și proteina genei 5 este de 2:1).
O cantitate de 90 mg de sulfat de amoniu se dizolvă în 250 ml de fracțiune I și apoi se agită timp de 60 min. Suspensia este lăsată în repaus timp de 60 min, și precipitatul rezultat este colectat prin centrifugare la o viteză de 8000 rot/min, timp de 60 min. Precipitatul este redizolvat în 300 ml de acid clorhidric-Tris, 20 mM, lapH=1,S!5 mM de 2- mercaptoetanol/0,1 mM de acid etîlendiaminotetraacetic și glicerol de 10% concentrație (amestecul tampon A). Aceasta reprezintă fracțiunea Π.
O coloană (te tip Whatman DE52 DEAE (12,6 cm2 x 18 cm lungime), se prepara și se spală cu amestecul tampon A Fracțiunea Π este dializata peste noapte, obținându-se două porțiuni de câte 11 din amestecul tampon A, fiecare, până ce conductivitatea fracțiunii Π este egală cu cea a amestecului tampon A care conține 100 mM de clorură de sodiu. Fracțiunea dializata II este aplicată pe această coloană într-un ritm de 100 ml/h și apoi se spală cu 400 ml de amestec tampon A care conține 100 mmoli de clorură de sodiu. Proteinele sunt apoi eluate cu 3,5 1 gradient format din 100 până la 400 mmoli de clorură de sodiu, în amestecul tampon A cu ° viteză de 60 ml sol/h. Fracțiunile care conțin polimeraza acidului dezoxiribonucleic T7 care se eluează cu 200 mmoli de clorură de sodiu, sunt combinate. Aceasta reprezintă fracțiunea III (190 ml).
Se prepara apoi o coloană de fosfoceluloză de tip Whatman Pil (de 12,6 cnr x 12 cm lungime), și apoi se spală cu 20 mmoli de fosfat de potasiu cu pH=7,4/5 mmoli de 2- mercaptoetanol/0,1 mmol de acid etilendiaminotetraacetic/ glicerol de 10% concentrație (acesta reprezintă amestecul tampon B). Fracțiunea ΙΠ este apoi diluată de două ori cu câte 380 ml din amestecul tampon B, apoi se aplică pe coloană într-un ritm de 60 ml/h, și apoi se spală cu 200 ml de amestec tampon, care conține 100 mmoli de clorură de potasiu. Proteinele sunt apoi eluate cu gradientul de 1,8 1 format din 100 până la 400 mmoli de clorură de potasiu în amestecul tampon B, într-un ritm de 60 ml/h. Fracțiunile care conțin polimeraza acidului dezoxiribonucleic T7, care se eluează cu 300 mmoli de clorură de potasiu sunt apoi combinate, obținându-se astfel 370 ml din fracțiunea IV.
Se prepară o coloană de Sefadex DEAE A-50 (de 4,9 cm2 și 15 cm lungime), și se spală cu 20 mmoli de Tris-acid clorhidric 20 mmoli (7 g)/0,l mmol de ditiotreitol/0,1 mmol de acid etilendiaminotetraacetic/glicerol de 10% concentrație (amestecul tampon C). Fracțiunea IV este apoi dializata obținându-se două porțiuni a câte un litru de amestec tampon C, având o conductivitate finală egală cu cea a amestecului tampon C, care conține 100 mmoli de clorură de sodiu. Fracțiunea de dializă IV este aplicată pe coloană într-un ritm de 40 ml/h, după care se spală cu 150 ml de amestec tampon C, care conține 100 mmoli de clorură de sodiu. Proteinele sunt eluate cu un litru din gradientul format din 100 până la 300 mmoli clorură de sodiu în amestecul tampon C, într-un ritm de 40 ml/h Fracțiunile care conțin polimeraza acidului dezoxiribonucleic T7 care se aluează cu 210 mmoli de clorură de sodiu, sunt combinate, obținându-se astfel un volum de 120 ml de fracțiune V.
O coloanăde hidroxiapatită BioRad HTP (4,9 an2 și 15 cm lungime), se prepară și apoi se spală cu 20 mmoli de fosfat monopotasic KPO4, la pH = =7,4/10 mmoli 2- mercaptoetanol, pe 2 mmoli de citrat de sodiu pe glicerol de 10% concentrație, acesta formând amestecul tampon D. Fracțiunea V este dializată în două porțiuni a câte 500 ml de amestec tampon D, fiecare. Fracțiunea V dializată este apoi aplicată pe o coloană într-un ritm de 30 ml/h și se spală cu 100 ml din amestecul tampon D. Proteinele sunt eluate cu 900 ml din gradientul format de la 0 până la 180 mmoli de fosfat monopotasic la pH=7,4 în amestec tampon D într-un ritm de 30 ml/h· Fracțiunile care conțin polimeraza acidului dezoxiribonucleic T7, care eluează cu 50 mmoli de fosfat monopotasic KPO4, sunt combinate. Aceasta reprezintă fracțiunea VI într-un volum de 130 ml. Aceasta conține 270 mg din polimeraza omogenă a acidului dezoxiribonucleic T7.
Fracțiunea VI este dializată cu 20 mmoli de fosfat monopotasic la pH = =7,4/0,1 mmol de ditiotreitol/ 0,1 mmol de acid etilendiaminotetraacetic/ glicerol de 50% concentrație. Acest amestec se concentrează obținându-se astfel fracțiunea VI (-65 ml, 4 mg/ml) și se păstrează la temperatura de -20°C.
Polimeraza izolată T7 are o activitate exonucleazică asociată cu aceasta. Așa cum s-a menționat mai sus, aceasta trebuie să fie inactivată. Ca exemplu de inactivate prin modificări chimice se prezintă următorul:
- fracțiunea VI concentrată este dializată până a doua zi în 20 mmoli de fosfat monopotasic lapH=7,4/0,1 mmol de ditiotreitol/ glicerol de 10% concentrație, pentru a se separa acidul etilendiaminotetraacetic prezent în amestecul tampon conservat După dializă, concentrația este ajustată la 2 mg/ml cu 20 mmoli de fosfat monopotasic la pH=7,4/0,1 mmol de ditiotreitol/ glicerol de 10% concentrație și 30 ml (2 mg/ml) alicote care se aduc în tuburi de polipropilen de câte 50 ml (la 2 mg/ml concentrația molară a polimerazei acidului dezoxiribonucleic T7 este de 22 pmoli).
Ditiotreitolul (DTT) și sulfatul de amoniu feros (Fe(NH4)2-6H2O), se prepară proaspăt imediat înainte de utilizare și apoi se adaugă la 30 ml de alicotă a polimerazei acidului dezoxiribonucleic T7 la concentrații de 5 mmoli de ditiotreitol (DTT) (0,6 ml din stocul de 250 mmoli) și 20 pmoli de sulfat de amoniu feros Fe(NH4)2(SO4)2.H2O (0,6 ml din stocul de 1 mmol). în timpul modificării, concentrațiile molare ale polimerazei acidului dezoxiribonucleic T7 și fierului, sunt fiecare aproximativ de 20 pmoli, în timp ce ditiotreitolul este în exces molar de 250 X.
Modificarea este efectuată la temperatura de 0°C, în atmosferă saturată de oxigen, după cum urmează. Amestecul de reacție este plasat pe gheață în excitator, acesta fiind golit de aer prin evacuare și apoi fiind umplut cu oxigen de 100% concentrație. Acest ciclu este repetat de trei ori. Această reacție poate fi realizată în aer, conținând 20% concentrație oxigen, dar se produce într-un coeficient de o treime.
Timpul cursei în pierderea activității exonucleazei este de arătat în fig.4.
Acidul dezoxiribonucleic filamente cu dublă răsucire marcate Ή (6 cpm/pmoli) se prepară din bacteriofagi de tip T7 așa cum este descris în (Richardson 15 J.Molec.BioL 49,1966); acidul dezoxiribonucleic de tip T7 cu filamente simplu răsucite marcate prin ii, se prepară imediat înainte de utilizare, prin denaturarea acidului dezoxiribonucleic de tip
Τ7 cu filamente dublu răsucite, marcate Ή, cu 50 mmoli de hidroxid de potasiu la o temperatură de 20°C, timp de 15 min, urmat de neutralizarea cu acid cloriiidric. Analiza standard o exonucleazei utilizată este o modificare a procedeului descris de (Chase et al. supra).
Amestecul de reacție standard, întrun volum de 100 μΐ în final, conține 40 mmoli Tris-add clorhidric la pH=7,5, 10 mmoli de clorură de magneziu, 10 mmoli de ditiotreitol, 60 mmoli de acid dezoxiribonucleic T7 cu răsucire simplă marcată rl (6 cpm/pm) și diferite cantități de polimerază a acidului dezoxiribonucleic T7. Acidul dezoxiribonucleic T7 cu filamente cu dublă răsucire marcat Ή poate fi, de asemenea, utilizat ca substrat Așadar, orice radioactivitate uniformă marcată a acidului dezoxiribonucleic, cu filamente având răsucire simplă sau dublă, poate fi utilizată pentru aceste teste. Așadar, acidul dezoxiribonucleic cu filamente având răsucire simplă și răsucire dublă marcate cu final 3’ pot fi, de asemenea, utilizate pentru aceste teste. După incubare la temperatura de 37°C, timp de 15 min, reacția este stopată [Min adăugare de 30//ldeBSA(10 mg/ml) și 25 μ\ de TCA (100% greutate/vol). Analiza poate fi efectuată la temperaturi cuprinse între 10 și 45°C, timp de la 1 până la 60 min. Acidul dezoxiribonucleic este precipitat pe gheață timp de 15 min (se utilizează un interval de la 1 min până la 12 h), după care se centrifughează la 12000 rot/min, 30 min (se utilizează un interval de la 5 până la 3 h), aducându-se 100 μΐ de supernatant pentru determinarea radioactivității solubile în acid, prin adăugarea acesteia la 400 μΐ de apă și 5 ml de coctail de scintilare apos.
O unitate de activitate exonucleazică catalizează solubilizarea acidului de 10 mmoli de nucleotide totale în 30 min, în condițiile de analiză. Polimeraza nativă T7 a acidului dezoxiribonucleic are o activitate specifică exonucleazică de 5000 unități/mgutilizându-se condițiile de testare standard menționate mai sus. Acti24 vitatea specifică exonucleazică a polimerazei acidului dezoxiribonucleic de tip T7 modificată este dependentă de extinderea modificării chimice, dar în mod ideal este de cel puțin până la o sută de ori mai mică decât cea a polimerazei acidului dezoxiribonucleic T7 nativ sau de la 500 până la 50 sau mai puține unități/mg utilizându-se condițiile de testare standard menționate mai sus. Când se utilizează un substrat format din filamente cu dublă răsucire, activitatea exonucleazei este de aproximativ șapte ori mai mare.
în condițiile menționate mai sus, activitatea exonudeazei scade exponențial, cu timp de înjumătățire ce scade în 8 h. O data pe zi, recipientul de reacție este amestecat pentru distribuirea oxigenului solubil, altfel, reacția va avea loc mult mai rapid la suprafața unde concentrația de oxigen este mai mare. O dată pe zi, se adaugă 2,5 mmoli de ditiotreitol (0,3 ml de amestec proaspăt de 250 mmoli la 30 ml de amestec de reacție) pentru completarea ditiotreitolului oxidat
După un timp de 8 h, activitatea exonucleazică a polimerazei T7 a acidului dezoxiribonucleic a fost redusă la 50% cu o pierdere neglijabilă a activității polimerazei. Pierderea de 50% poate fi rezultatul inactivării complete a activității exonudeazei la jumătate din moleculele polimerazei, mai mult decât cazul reducerii generale a gradului de activitate exonucleazică în toate moleculele. Astfel, după un timp de reacție de 8 h, toate moleculele au o activitate a polimerazei normală, jumătate din molecule au o activitate exonucleazică normală, în timp ce altă jumătate are mai puțin de 0,1% din activitatea lor exonucleazică originală.
Când 50% din molecule sunt modificate (o reacție de 8 h), enzima este corespunzătoare, suboptimală, pentru secvențarea acidului dezoxiribonucleic. Pentru o calitate optimă a secvențării acidului dezoxiribonucleic, reacția este lăsată să aibă loc cu o modificare mai mare de 99% (având mai puțin de 50 de unități de activitate exonucleazică) care necesită patru zile.
După patru zile, amestecul de reacție este dializat în două porțiuni a câte 250 ml de fosfat monopotasic KPO4 de 20 mmoli la pH=7,44),1 mmol ditiotreitol/0,1 mmol de arid etilendiaminotetraacetic/ gliceroi 50%, pentru îndepărtarea fierului. Modificarea polimerazei acidului dezoxiribonucleic T7 (4 mg/ml) este urmată de menținerea acesteia la temperatura de - 20°C.
Mecanismul de reacție pentru modificarea chimică a polimerazei Ί7 a acidului dezoxiribonucleic depinde de speciile de oxigen reactive generate de prezența metalelor de tranziție reduse, ca de exemplu, fier bivalent și oxigen. Un mecanism de reacție posibil pentru generarea radicalilor hidroxilici este menționat mai jos:
(1) FeZ+ + O2 -* Fe3+ 4- 0’2 (2) 20’2 + 2H+ -* H2O2 + 02 (3) Fe2+ + H2O2 -* FeT+ + OH’ + ΟΙΓ în ecuația (1), oxidarea metalului ionic redus, duce la obținerea radicalului superoxidic, O2. Radicalul superoxidic poate determina o reacție de dismutare, producându-se peroxidul de hidrogen, poate reacționa cu ionii metalici reduși pentru a se forma radicali hidroxilici, OH (conform reacției Fenton, în ecuația numărul (3)). Ionul metalic oxidat este recirculat fit forma redusă cu ajutorul unor agenți de reducere, cum ar fi, ditiotreitolul (DTT).
Aceste specii de oxigen, reactive, inactivează probabil proteinele prin reacții chimice ireversibile, alterându-ee rezidurile de aminoacizi specifici. Astfel de reacții se observă în fragmentele SDS-PAGE ale genei 5, produse de către tripsină sau cianură bromhidrică CNBr. Unele din aceste fragmente dispar producându-se molecule de greutate moleculară ridicată și unele fragmente sunt rupte în câte două fragmente mai mici
Așa cum s-a menționat mai înainte, oxigenul, un agent de reducere (ca, de exemplu, ditiotretiolul, 2-mercaptoetanolul) și metalul de tranziție, ca de exemplu, fierul reprezintă unul din elementele esențiale în modificarea reacției. Reacția are loc în aer, dar este stimulată de utilizarea oxigenului în procent de 100%. Reacția se produce lent în absența metalelor de tranziție adăugate, datorită prezenței urmelor de cantități de metale de tranziție (1 până la 2 pmoli) în majoritatea preparatelor tampon.
Așa cum este de așteptat, inhibitorii reacției modificate includ condiții anaerobe,ca, de exemplu, azot molecular și chelatori metalici, ca de exemplu, acidul etilendiaminotetraacetic, cifratul, nitrilotriacetatuL în plus, catalaza enzimatică și dismutaza superoxidică pot inhiba reacția, rolul esențial consistent avându-1 speciile de oxigen reactive în generarea polimerazei T7 modificate a acidului dezoxiribonucleic.
Ca un procedeu alternativ, este posibil să aibă loc mutații genetice ale polimerazei T7 a genei 5 pentru inactivarea specifică a exonucleazei în domeniul proteinei Proteina T7 a genei 5 purificată din astfel de mutanți este ideală pentru utilizarea secvenței de acid dezoxiribonucleic fără a fi necesară inactivarea chimică a exonucleazei, prin oxidare și iară un efect secundar care se produce în mod inevitabil în proteină în timpul modificării chimice.
Genetic, polimeraza T7 modificată a aridului dezoxiribonucleic poate fi izolată prin mutagenizarea randomizată a genei 5 și apoi prin screeningul acestor mutanți care au pierdut activitatea exonucleazică, fara a fi pierdută activitatea polimerazei. Mutageneza are loc după cum urmează:
Aridul dezoxiribonucleic cu fragmente simplu răsucite care conțin gena 5 (de exemplu, pEMBLr8 clonizată, o plasmidă care conține originea pentru replicarea aridului dezoxiribonucleic cu filamente simplu răsucite), sub controlul promotorului polimerazei T7 a acidului ribonudeic este preparat prin procedee standard și se tratează cu două substanțe muta107769 gene chimice diferite: hidrazina care produce mutații C’s și Ts și acidul formic care produce mutații C’s și A’s, așa cum este menționat în (Myers et al. 229 Science 242, 1985).
Acidul dezoxiribonucleic este mutagenizat într-o doză care rezultă în medie dintr-o singură bază fiind alterată prin molecula plasmideL Plasmidele mutagenizate formate din filamente cu răsucire simplă sunt apoi primate cu primenii universal 17 (cum s-a menționat mai sus) și se utilizează ca modele pentru sintetizare filamentele opuse. Filamentele sintetizate conțin bazele randomizate încorporate în poziții corespunzătoare bazelor mutate în aceste modele. Acidul dezoxiribonucleic mutagenizat cu filamente dublu răsucite mutagenizate este apoi utilizat pentru transformarea speciei K38/pGPl-2, care conține plasmida pGPl-2, așa cum menționează (Tabor et al., supra). După inducția la cald, acest material exprimă polimeraza T7 a acidului ribonucleic. Celulele transformate sunt aduse pe o placă la temperatura de 30°C, cu aproximativ 200 de colonii pe fiecare placa.
Scteening-ul celulelor având polimeraza T7 a acidului dezoxiribonucleic fără activitate exonucleazică, se bazează pe următoarele cercetări: exonucleazele 3’ la 5’ale polimerazei acidului dezoxiribonudeicservescpentru corectarea funcției Când bazele sunt misîncorporate, exonudeaza va fi separata din noua bază încorporată care este recunoscută ca anormală. Acesta este cazul pentru elemente analoage dATP, eteno-dATP, care într- adevăr sunt încorporate de către polimeraza T7 a acidului dezoxiribonucleic în loc de dATP. Mai mult decât atât, în prezența exonucleazei 3’ până la 5’ a polimerazei T7 a acidului dezoxiribonucleic, aceasta este excitată tot atât de rapid pe cât este încorporată, rezultând în sinteza acidului dezoxiribonucleic, sinteză care nu este netă. Așa cum s-a arătat în fig.6, prin utilizarea unui copolimer de alternare poli (dAT) ca model, polimeraza nativă a acidului dezoxiribonucleic T7 catalizează sinteza extensivă a acidului dezoxiribonucleic numai în prezența dATP și nu în prezența eteno-dATP. în contrast cu aceasta, polimeraza modificată T7 a acidului dezoxiribonucleic, datorită lipsei din exonucleaza asociată, încorporează stabil eteno-dATP în acidul dezoxiribonudeic într-un grad comparabil cu dATP. Astfel, utilizându-se poli d(AT) ca model Și dTTP, eleno- dATP ca precursori, polimeraza nativă T7 a acidului dezoxiribonucleic este incapabilă de a sintetiza acidul dezoxiribonucleic din acest model, în timp ce polimeraza Ί7 a acidului dezoxiribonucleic care și-a pierdut activitatea exonucleazică, va fi capabilă de a utiliza acest model pentru sintetizarea acidului dezoxiribonucleic.
Procedeul de liza și screening a unui număr mare de colonii este descris în (Raetz72Proc.NatAcad.Sci. 2274,1975). Pe scurt, celulele K38/pGPl-2 transformate cu gena 5 mutagenizată care conține plasmidele, sunt transferate de pe placa Petri în care sunt prezente aproximativ 200 de colonii pe disc, pe o bucata de hârtie de filtru (disc replică). Discul cu hârtia de filtru este apoi plasat la temperatura de 42°C, timp de 60 min, pentru inducerea polimerazei T7 a aridului ribonucleic, care este exprimată In schimb prin proteina genei 5. Tioredoxina este constitutiv produsă din gena ctomozomală. Pe hârtia de filtru se adaugă apoi lizozima In scopul lizei acestor celule. Urmează faza de congelare pentru asigurarea lizei acestor celule, după care discurile cu hârtie de filtrase incubează cu poli d(AT) (e//a3ZP) dTTP și etenodATP la temperatura de 37°C, timp de 60 min. Discurile cu hârtia de filtra sunt apoi spălate cu arid pentru îndepărtarea (a'3ZP) dATP neîncorporat Aridul dezoxiribonucleic va precipita pe hârtia de filtra în arid, în timp ce nucleotidele vor fi solubile. Hârtia de filtra spălată este apoi utilizată pentru expunerea filmului la raze X Coloniile care au indus o polimerază activă T7 a acidului dezoxiribonucleic care este deficientă în ceea ce privește exonucleaza care este încorporată, insolubilă în acid a- r și care este vizibilă prin autoradiografîe. Coloniile care exprimă polimeraza nativă T7 a acidului dezoxiribonucleic, sau care exprimă polimeraza T7 a acidului dezoxiribonucleic defectivă în ceea ce privește activitatea polimerazei, aceasta nu va apare la autoradiografîe.
Coloniile care apar pozitive sunt recuperate de pe cutiile Petri care conțin coloniile originale. Celulele care conțin fiecare clonă cu potențial pozitiv vor fi induse pe o scală largă de un litru și polimeraza 17 a acidului dezoxiribonucleic este purificată din fiecare preparat, având niveluri nesigure de exonucleaza asociată cu fiecare mutant Cele care scad în exonucleaza, sunt apropiate de secvențarea acidului dezoxiribonucleic.
Mutageneza directă poate fi așadar utilizată pentru izolarea mutanților genetici în domeniul exonucleazei proteinei 17 a genei 5. Se prezintă în continuare un exemplu din acest procedeu.
Polimeraza 17 a aridului dezoxiribonucleic cu activitate exonucleazică redusă (polimeraza 17 modificată a aridului dezoxiribonucleic) poate, de asemenea, să fie distinsă de polimeraza 17 nativă a aridului dezoxiribonucleic prin capacitatea acesteia de a fi sintetizată în zonele cu structură secundară. Astfel, cu polimeraza modificată a aridului dezoxiribonucleic și sinteza aridului dezoxiribonucleic polimerul marcat pe un model având structura secundară care rezultă din extensiile semnificativ mai lungi, se compara polimeraza nemodificată sau nativă a aridului dezoxiribonucleic. Acest test prevede o bază de screening pentru transformarea unor procentaje miri de molecule de polimerază a aridului dezoxiribonucleic într-o formă modificată.
Cercetările de mai sus sunt efectuate pentru screeningul polimerazei T7 alterate a aridului dezoxiribonucleic după tratamentul cu un număr de reactivi chimici. Aceste reacții rezultă prin conversiunea enzimei în forma modificata. Se realizează mai întâi tratamentul cu fier și cu un agent de reducere așa cum s-a descris mai sus. Urmează apoi două teste care includ tratamentul enzimei cu coloranți de fotooxidare, ca de exemplu, Rose Bengal și albastru de metilen, în prezența luminii. Colorantul trebuie să fie titrat cu atenție și eventual în condiții optime, specificitatea inaotivării activității exonucleazice în raport cu activitatea polimerazei fiind mai mică, în comparație cu specificitatea crescută a oxidării prin inducție de fier. Deoarece acești coloranți sunt foarte specifici pentru modificarea reziduurilor de histidină, aceasta duce la obținerea rezultatului de implicare puternică a reziduurilor de histidină ca sperii esențiale în porțiunea activa a exonucleazei.
Există un număr de 23 de reziduuri de histidină în proteina Ί7 a genei 5. Din aceste reziduuri, 8 leagă jumătate de molecule de aminoarid în proteină, în regiunea în care, pe baza omologiei cu un fragment mare de Escherichia coli - polimeraza I a aridului dezoxiribonucleic, exonucleaza în domeniu poate fi localizată, așa cum este menționat în (Ollis et aL Nature 313,818,1984). Așa cum este descris mai jos, 7 din cele 8 reziduuri de histidină sunt mutații individuale prin sinteza unor oligonurieotide apropiate care apoi sunt încorporate în gena numărul 5. Acestea corespund la mutanții 1 și mutanții 6-10 din tabelul L Mutațiile sunt mai întâi construite printr-o primă rionizare a polimerazei T7 din gena 5, din elementul pGPS-3, potrivit datelor din (Tabor et al. J.BioLChem. 282, 1987) în secvențele Smal și Hindîîl ale vectorului M13 mpl8, pentru a se obține mPG5-2. (Vectorul utilizat și sursa genei 5 nu este critic în acest procedeu). Aridul dezoxiribonucleic mGP5-2 cu filamente simplu răsucite este preparat dintr-o sperie care încorporează dezoxiurarilul în loc de dezotxitimidină, conform mențiunilor care apar în (Kunkel, Proc.NatLAcad.ScL USA 82, 488, 1985). Acest procedeu prevede o selecție puternică pentru supraviețuirea numai a speciei sintetizate (care conține mutația) atunci când are 5 loc transfecția în Escherichia coti de tip sălbatec, deorece aceasta specie conține uracil și de preferință este degradată.
Mutanții oligonucleotidelor având de la 15 până la 20 de baze în lungime sunt 10 sintetizați prin procedee standard. Fiecare oligonucleotidă este regăsită în model, în extensie, utilizându- se polimeraza T7 nativă a acidului dezoxiribonucleic și ligaza utilizându-se pentru 15 ligatura acidului dezoxiribonucleic T4. Moleculele circulare legate covalent sunt izolate prin electroforeză pe gel de agaroză, în prezența bromurii de etidium0,5 /tg/ml Moleculele purificate care rezultă sunt apoi utilizate pentru transformarea Escherichiei coli 71,18. Acidul dezoxiribonucleic de pe aceste plăci este izolat și regiunea relevantă este secvențată pentru confirmarea fiecărei mutații.
în continuare se sumarizează oligonudeotidele utilizate pentru generarea mutanților genetici în gena 5 a exonudeazei.
Mutațiile create sunt subliniate. Aminoacizii și numerele perechilor de bază sunt menționate în (Dunn et aL,166 J.Molec.Biol. 477, 1983). Secvențele ca tipuri brute relevante din regiunea mutațiilor a genei 5 sunt' prezentate în continuare.
Secvența tipurilor de mutații:
109 (aa) 122 123
Leu Leu Asr Ser Gty Lys Leu Pro Gty Lys Arg Phe Gly Ser His Ala Leu Glu CIT CKt OGTTCC GGCAAGHG CW GCA AAA CGC ΊΊΤ GGGTCT CAC GCTHG GAG
14677 (T7bp)
Mutația 1: His 123----Ser 123
Primerul folosit: 5’ CGCITTGGA TOC TQCGCTTIO 3’
Secvența mutantei: 123
Leu Leu Arg Ser Gty Lys Leu Pro Gly Lys Arg Phe Gty Ser Ser Ala Leu Glu CIT C3G CGT TCC GGC AfiG HG OOC GGA. AAA GGC TTT GG^TCCICCGCr HG GAG
Mutația 2: Deleția sau Ser 122 și His 123
Primerul folosit: 5’ GGA AAA CGC TTT GGC GCC TTG GAG GCG 3’
Secvența mutantei: deleția bazei 6
122 123
Leu Leu Arg Ser Gty Lys Leu Pro Gty Lys Aig Phe Gty......Ala Leu Glu
CITCXrOGTTCCGGCA«j HG CCCGGAMACGCTITGGÎ>.....GC£HGGAG
Mutația 3: Ser 122, His 123 - - - Ala 122, Glu 123
Primerul folosit: 5’CGC TTT GGG GOT GAG GCT TTG G 3’
Secvența mutantei: 122 123
Leu Leu Arg Ser Gty Lys Leu Pro Gty Lys Arg Phe Gty Ala Glu Ala Leu Glu OCT OG CGT TCC GGC AAG HG CCC GGA AAA CGC ΊΤΓ GGGGCTGA£GCT TIG GAG
Mutația 4: Lys 118, Aig 199 — Glu 118, Glu 119
Primerul folosit- 5’ 5’ G CCC GGG GAAGAGTTTGGGTCTCACGC3’
Secvengi mutantei: 118 199
Leu Leu Arg Ser Gty Lys Leu Pro Gly Glu Glu Phe Gly, Ser His Ala Leu Glu
CIT OG CGT TCC GGC AAG HG CCOGQGGAAGAQ TITGQGlCTCACGCr HG GAG
34
Secvența mutantei:
111 112
Leu Leu Glu Ala Gly Glu Leu Pro Gly Lys Arg Phe Gly Ser His Ala Leu Glu
CIT CTG GAA £CC GGC GAG TTG CCC GGA AAA CGC TTT GGG TCT CAC GCT TTG GAG
Mutația 6: His 59, His 62 — Ser 59, Ser 62
Primerul folosit: 5’ ATT GTG JJC ICC AAC GGA ICC AAG TAT GAC G 3’ Secvența tipului sălbatic:
aa: 55 59 62
Leu Ile Val Phe His Asn Gly His Lys Tyr Asp Val
CTT ATT GTC TTC CAC AAC GGT CAC AAG TAT GAC GTT
T7 bp: 14515
Secvența mutantei: 59 62
Leu Ile Val Phe Ser Asn Gly Ser Lys Tyr Asp Val
CIT ΑΊΤ GIG TTC ICC AAC GGA ICC AAG TAT GAC GTT
Mutația 7: His 82 — Ser 82
Primerul folosit: 5’ GAG ITC ICC CIT CCT CG 3’
Secvența tipului sălbatic:
aa: 77 82
Leu Asn Arg Glu Phe His Leu Pro Arg Glu Asn
TTG AAC CGA GAG TTC CAC CTT CCT CGT GAG AAC
T7 bp:14581
Secvența mutantei: 82
Leu Asn Arg Glu Phe Ser Leu Pro Arg Glu Asn
TTG AAC CGA GAG TTC ICC CTT CCI' CGT GAG AAC
Mutația 8: Arg 96, His 99 — Leu 96, Ser 99
Primerul folosit: 5’ CT(i TTG ATT IQT TCC AAC CTC 3’
Secvența tipului sălbatic:
aa: 93 96 99
Val Leu Ser Arg Leu Ile His Ser Asn Leu Lys Asp Thr Asp
GTG TTG TCA CGT TTG ATT CAT TCC AAC CTC AAG GAC ACC GAT
T7 bp: 14629
Secvența mutantei: 96 99
Val Leu Ser T^u Leu Ile Ser Ser Asn Leu Lys Asp Thr Asp
GTG TTG TCA CTG TTG ATT ICT TCC AAC CTC AAG GAC ACC GAT
Mutația 9: His 190 — Ser 190
Primerul folosit: 5’ CT GAC AAA ICT TAC TTC CCT 3’
Secvența tipului sălbatic:
aa: 185 190
Leu Leu Ser Asp Lys His Tyr Phe Pro Pro Glu
CTC CTC TCT GAC AAA CAT TAC TTC CCT CCT GAG
T7 bp: 14905
Secvența mutantei: 190
Leu Leu ser Asp Lys Ser Tyr Phe Pro Pro Glu
CTC CTC TCT GAC AAA TCT TAC ITC CCT CCT GAG
Mutația 10: His 218 — Ser 218
Primerul folosit: 5’ GAC ATT GAA ICT CGT GCT GC 3’
Secvența tipului sălbatic:
aa: 214 218
Val Asp Ile Glu His Arg Ala Ala Trp Leu Leu
36
GTT GAC ATT GAA CAT CGT GCT GCA TGG CTG CTC
T7 bp: 14992
Secvența mutantei: 218
Val Asp Ile Glu Ser Arg Ala Ala Trp Leu Leu
GTT GAC ATT GAA I£T CGT GCT GCA TGG CTG CTC
Mutația 11: Deleția sau amino acidului 118 la 123
Primenii folosit: 5’ C GGC AAG TTG CCC GGG GCT TTG GAG GCG TGG G 3’ deleția bazei 18
Secvența tipului sălbatic:
109 (aa) 118 122 123 126
Leu Leu Arg Ser Gly Lys Leu Pro Gly Lys Arg Phe Gly Ser His Ala Leu Glu
CIT CTG CGT TCC GGC AAG TTG CCC GGA AAA CGC TTT GGG TCT CAC GCT TTG GAG 14677 (T7 bp)
Secvența mutantei: 117 124
Leu Leu Arg Ser Gly Lvs Leu Pro Glv ... (6 amino acid)... Ala Leu Glu
C IT CTG CGT T CC GGC AAG TTG CCC GGC ... (18 baze)... GCT TTG GAG
Mutația 12: His 123 — Glu 123
Primerul folosit: 5’ GGG TCT GAG GCT TTG 5’
Secvența mutantei: 123
Leu Leu Arg Ser Gly Lys Leu Pro Gly Lys Arg Phe Gly Ser Glu Ala Leu Glu
CTT CTG CGT TCC GGC AAG TTG CCC GGA AAA CGC ΊΤΓ GGG TCT (tA£ GCT TTG GAG Mutația 13: (Arg 131. Lvs 136, Lys 140, Lys 144, Arg 145 — Glu 131, Glu 136, Glu 140, Glu 144, Glu 145)
Primerul folosit: 5’ GGT TAT GAG CTC GGC GAG ATG GAG GGT GAA TAC
GAA GAC GAC TTT QAG GAA A7 CTT GAA G 3’
Secvența tipului sălbatic:
129 (aa) 131 136 140 144 145
Gly Tyr Arg Leu Gly Glu Met Lys Gly Glu Tyr Lys Asp Asp Phe Lys Arg Met Leu Glu Glu
GGT TAT CGC TTA GGC GAG ATG AAG GGT GAA TAC AAA GAC GAC TTT AAG CGT ATG CTT GAA G
14737 (T7 bp)
Secvența mutantei:
129 (aa) 131 136 140 144 145
Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Met Glu Gly Glu Tyr Glu Asp Asp Phe Glu Glu Met Leu Glu Glu
GGT TAT GAG CTC GGC GAG ATG GAG GGT GAA TAC GAA GAC GAC TTT GAG GAA ATG CTT GAA G
14737 (T7 bp)
Fiecare mutant al proteinei genei 5 este realizat prin infectarea elementului mutant în K38/pGPl-2, după cum urmează: celulele se dezvoltă la temperaturadeStTQla A590=l»0. Temperatura este 5 crescută până la 42°C, timp de 30 min, pentru inducerea polimerazei T7 a acidului ribonudeic. La 0(5 mM se adaugă IPTG și se adaugă un lizat din fiecare element, la moi=10. Celulele infectate au fost dez- 10 voltate la temperatura de 37°C, timp de 90 min. Celulele sunt apoi recoltate și extractele preparate prin procedee standard pentru proteina T7 a genei 5.
Extractele sunt apoi parțial purificate prin trecerea peste foefoceluloză și o coloană DEAE A-50 și testate prin măsurarea polimerazei și exonucleazei ca activitate directă, așa cum s-a descris mai sus. Rezultatele astfel obținute sunt prezentate în tabelul 1.
Activitățile exonucleozei și polimerazei ale mutantelor genei cinci T7
ΪΜΙ1
| Mutant | Exonuclează activitate % | Polimerază activitate % |
| Ίιρ sălbatic | 100° | 100* |
| Mutant 1 (His 123 — Ser 123) | 10-25 | 90 |
| Mutant 2 (Ser 122, His 123) | 0,2-0,4 | 90 |
| Mutant 3 (Ser 122. His 123 — Ala 122. Glu 123) | 2 | 90 |
| Mutant 4 (Lvs 118. Are 119 — Glu 118. Glu 119) | 30 | 90 |
| Mutant 5 (Are 111. Ser 112. Lvs 114 — Glu 111. Ala 112. Glu 114) | 75 | 90 |
| Mutant 6 (His 59. His 62 — Ser 59. Ser 62) | 75 | 90 |
| Mutant 7 (His 82--Ser 82) | 75 | 90 |
| Mutant 8 _ (Are 96. His 99 — Leu 96. Ser 99) | 75 | 90 |
| Mutant 9 (His 190 -- Ser 190) | 75 | 90 |
| Mutant 10 (His 218 —Ser 218) | 75 | 90 |
| Mutant 11 (Lys 118. Arg 119. Phe 120. Gly 121. Ser 122. His 123) | 0,02 | 90 |
| Mutant 12 (His 123 -Glu 123) | 30 | 90 |
| Mutant 13 (Are 131, Lye 136, Lys 140, Lys 144, Arg 145 - Glu 131, Glu 136. Glu 140. Glu 144. Glu 145) | 30 | 90 |
a. Activitatea exonucleazică a fost măsurată la un singur filament ADN Ή T7, activitatea exonucleazică corespunde la 5000 unități/mg.
b. Activitatea polimerazică a fost 5 măsurată folosind un singur ADN filament de timus de vițel, activitatea polimerazică corespunde la 8000 unități/mg.
Din cele 7 histidine testate, numai una (histidina 123: mutantul 1) prezintă 10 activități enzimatice caracteristice polimerazei Ί7 a genei 5 a fost purificată din acest mutant utilizându-se celuloză DEAE, fosfoceluloză. Sefadex - DEAE și cromatografie pe hidroxiapatită. în 15 timp ce activitatea polimerazei este aproape normală (mai mare de 90% din nivelul enzimei native), activitatea exonucleazei este redusă de 4 până la 10 ori.
O variantă a acestui mutant este 20 construit, în care ambii aminoacizi histidina 123 și serina 122 sunt utilizați. Proteina genei 5 este purificată din acest mutant având de la 200 până la 500 de ori mai mică activitatea exonucleazică, 25 în raport cu retenția mai mare de 90% a activității polimerazei. Aceste date sugerează că histidina 123 este legată în partea activă de domeniul exonucleazei proteinei Ί7 din gena 5. Mai mult decât 30 atât, este clar că histidina 123 este de fapt un reziduu care este modificat prin oxidare și conține fier, oxigen și un agent de reducere, deoarece astfel de oxidare este arătată ca producând modi- 35 ficarea reziduului de histidină fit alte proteine, așa cum se menționează în (Levine. J.BioLChem. 258: 11823, 1983 și Hodgson et al. Biochemistry 14:5294, 1975). Nivelul exonucleazei reziduale în 40 mutantul 11 este comparabil cu nivelele obtenabile prin modificare chimică.
Se descriu, așadar, mutații la rezidiul de histidină, aceste mutații fiind în părți apropiate sau în porțiuni distanțate în 45 care se pot produce enzime mutante corespunzătoare prezentei invenții, ca de exemplu, lizina și arigina (mutanții 4 și 15). în mod similar, aceste mutații în astfel de reziduuri de histidină au un 50 efect mic asupra activității exonucleazei, care în mod necesar nu indică faptul că mutațiile din apropierea acestor reziduuri nu vor afecta activitatea exonucleazică. Mutațiile care sunt efective în special includ pe cele care conțin doi sau mai mulți aminoacizi, de preferință, de la 6 până la 8 aminoacizi, de exemplu, în apropiere de zona histidinei -123. Alte mutații pot reduce activitatea exonucleazei sau, de asemenea, o pot conpleta. Ca exemplu de utilizare a speciilor de mutanți se pot ilustra următoarele. ApGP5-6 (mutația nr. 11) care conține o specie care poate fi depozitată cu ATCC așa cum se va vedea în continuare. Tulpina este dezvoltată așa cum s-a descris mai sus și se produce o inducție așa cum se menționează în (Tabor et al. J.Biol.Chem. 262:16212,1987). K38/pTrx-2 sunt celule care pot fi adăugate pentru creșterea polimerazei T7 a acidului dezoxiribonucleic genetic modificată.
Tulpina depozitată notată mai sus conține așadar plasmida pGP-1 care exprimă polimerază T7 a acidului ribonucleic. Această plasmidă este descrisă în (Tabor et al., Proc.NatAcad.Sd. USA £2: 1074, 1985 și este depozitată în ATCC în 22 martie 1985 și marcat cu nr.40175).
Referitor la fig. 10, pGP5-6 include următoarele segmente:
1. EcoRl-Sacl-Smal-BamtB. secvența polilinkerului din M13 mp 10 (21bp);
2. T7 bp 14309 până la 16747, care conține gena T7 5, cu următoarele modificații:
T7 bp 14703 se schimbă de la A la G creându-se porțiunea Smal,
T7 bp 14304 până la 14321 inclusiv sunt eliminate (18 bp);
3. Sali-Pstl-Hmdni secvența polilinker de la M13 mp 10 (15 bp);
4. pBR322 bp 29 (JfmJIII site) până la pBR322 bp 375 (BamHI);
5. T7 bp 22855 până la T7 bp 22927, car T7
BamHI cu inserție la fiecare capăt (82 : conține polimerază promotor Φ10 a acidului ribonudeic, cu linkerii bp);
6. pBR322 bp 375 (BamHI) până la pBR322 bp 4361 (EcoRI).
Secvenfializarea acidului dezoxiribonucleic utilizându-se polimeraza T7 modificată a acidului dezoxiribonucleic
Reacțiile de sinteză a acidului dezoxiribonucleic utilizându-se polimeraza aridului dezoxiribonucleic modificata de tipul Ί7 rezidă in fragmente cu catenă terminală cu o intensitate radioactivă uniformă, plecându-se de la câteva baze până la mii de baze ca lungime. Virtual nu există nici o bază care se datorește terminațiilor în porțiuni independente ale agentului cu catenă terminală încorporată (de exemplu, în porțiunile cu pauză sau în cazul impedimentelor cu structură secundara).
Reacțiile secvenționale care utilizează polimeraza modificată de tipul T7 a aridului dezoxiribonucleic, constă în impusuri și marcaje. Prin impulsuri se înțelege un scurt fragment marcat de acid dezoxiribonucleic care este sinteti zat; prin marcaje se înțelege ca un fragment scurt este lungit până când se încorporează un agent terminal. Raționalul pentru fiecare fază diferă de reacțiile secvenționale convenționale ale acidului dezoxiribonucleic. în impuls, reacția este incubată la temperatura de la 0 până la 37°C, timp de la 0,5 până la 4 min, în prezența unor niveluri ridicate ale celor trei nucleotide trifosforice (de exemplu, dGTp, dCTP și dTTP) și nivelurile sunt limitate pentru oricare nucleotidă trifosfat marcată, lipsită de suport, cum ar fi, de exemplu, (35 S) dATP. în aceste condiții, polimeraza modificată este incapabilă de a prezenta un caracter procesiv și populația formată din fragmente radioactive este sintetizată după mărime din câteva baze până la sute de baze. Scopul acestor impulsuri este de a marca radioactiv fiecare primer, încorporând o radioactivitate maximă decât prin utilizarea unor niveluri minimale de nucleotide. în acest exemplu, există două condiții în reacția impulsului (temperatura joasă, de exemplu, de la 0 până la 20°C și nivelurile limitate de dATP, de exemplu, de la 0,1 τομ până la 1 mp),, prevenind astfel polimeraza modificată de tip T7 a 5 acidului dezoxiribonucleic de caracterul ei procesiv care se manifestă. Alte componente esențiale asemănătoare ale amestecului vor avea efecte similare, de exemplu, limitarea unui număr mai mare 10 decât unul de nucleotide trifosfatice sau creșterea tensiunii ionice a reacției. Dacă primenii este deja marcat (de exemplu, în kinasing) nu este necesară faza de impuls.
în acest caz, reacția este incubată la temperatura de 45°C, timp de 1 până la 30 min, în prezența unor niveluri ridicate (de la 50 până la 500 mp) pentru toate cele patru deoxinucleotide trifosfatice 20 și la niveluri limitate (de la 1 la 50 nțu), pentru oricare din agenții (patru agenți) terminal, de exemplu, dideoxinucleozidele trifosfatice, ca de exemplu, sinteza de arid dezoxiribonucleic este terminată 25 după un număr mediu de baze cuprins între 50 și 600 baze. Scopul marcării este de a extinde fiecare primer marcar radioactiv în condiții de sinteză procesivă a aridului dezoxiribonudeic, terminând 30 fiecare extindere exclusivă în părți corecte în patru reacții separate utilizânduse fiecare din cele patru dideoxinudeozide trifosfatice. Două condiții de marcare temperatura ridicată, de exemplu, de la 35 30 până la 50°C și nivele ridicate (de aproximativ 50 //moli) din cele patru dideoxinucleotide, permit polimerazei modificate de tip T7 a aridului dezoxiribonudeic să manifeste caracterul ei pro40 cesiv pentru 10 din miile de baze utilirâte; astfel aceeași moleculă de polimerază se va sintetiza din modelul primer până ce dideoxinudeotida se va încorpora. La o temperatură de marcare de 45°C, sinteza 45 are loc la valori mai mari de 700 nucleotide/s. Astfel, pentru reacțiile de secvențializare, marcarea este completă în mai puțin de o secundă, sau crește procesivitatea, de exemplu, când se uti50 lizează dl'l P sau când se utilizează tem107769 peraturi scăzute, sau forțe ionice superioare, sau niveluri joase de trifosfați prin reacția de secvențializare.
Se pot utiliza atât (alfa dATP, (alfa 32P) dATP, sau nudeotide marcate fluorescent în reacțiile de secvențare a acidului dezoxiribonucleic cu o polimerază modificată de tip T7 a acidului dezoxiribonucleic. Dacă se utilizează analogi fluoresoenți la capătul 5’ al primerului, atunci nu este necesară faza de impuls.
Două componente determină media extensiilor reacțiilor de sinteză. Mai întâi este lungimea timpului de reacție. Deoarece impulsul este dat în absența agenților terminali, cu cât este mai lung timpul de reacție de impuls, cu atât este mai mare extensia primerului. La temperatura de 0°C, extensia polimerazei are o valoare medie de 10 nucleotide/s. în al doilea timp este vorba de procentul de trifosfați deoxiribonucleici față de cel al agenților terminali în reacțiile de marcare. O polimeraza modificată de tip T7 a acidului dezoxiribonucleic nu trebuie să discrimineze fața de încorporarea acestor compuși analogi, astfel că lungimea medie a extensiei în marcare este de patru ori mai mare în raport cu concentrația deoxinucleotidelor trifosfatice și fața de concentrația agentului terminal în reacția de marcare. Astfel, în vederea scurtării mărimii medii a extensiei, impulsul ca timp este scurtat, de exemplu, la 30 s și/sau gradul agentului terminal în cazul concentrației de dezoxinucleozide care crește în reacția de marcare. Aceasta poate fi realizata prin creșterea concentrației în agentul terminal sau prin scăderea concentrației de dezoxinucleozide trifosfatice. Pentru creșterea lungimii medii a extensiilor, timpul de impuls este crescut, de exemplu, la 3 până la 4 min; și/sau concentrația agentului terminal este scăzuta, de exemplu, de la 20 /«moli până la 2/imoli, în reacția de marcare.
Exemplul 2. Secvenfializarea acidului dezoxiribonucleic cu polimeraza modificată de tip T7 a acidului dezoxiribonucleic în continuare, se prezintă un exemplu de protocol de secvențializare utilizânduse dideoxinucleotide ca agenți terminali 9 μΐ de acid dezoxiribonucleic M13 cu filamente cu răsucire simplă (mGPl-2), preparat prin procedee standard) la 0,7 mmoli concentrație, se amestecă cu 1 /11 din primenii secvențional complementar (standard universal 17-mer, 0,5 pmoli primer/il) și 2,5 /115X amestec tampon regenerat (200 mmoli de Tris-add clorhidric la pH=7,5, 50 mmoli de donară de magneziu), se încălzesc până la temperatura de 65°C, timp de 3 min, și se lasă să se răcească la temperatura camerei timp de peste 30 min. în reacția de impuls, 12,5/11 din amestecul de mai sus regenerat, se amesteca cu 1 μΐ de ditiotreitol 0,1 M, cu2/ilde3dNTPs(dGTP, dCTP, dTTP), 3 mmoli fiecare, (P.L.Biochemicals, in TE), 2,5 μ\ (o#a35S) dATP, (1500 Ci/ mmol), și 1 μ\ de polimeraza modificată de tip T7 a acidului dezoxiribonucleic așa cum s-a descris în cadrul exemplului L (0,4 mg/ml,2500 unități/ml, de exemplu 0,4 /tg, 2,5 unități) și se incubeaza la temperatura de 0°C» timp de 2 min, după agitare și centrifugare într-o microfugă timp de 1 s. Timpul de incubare poate varia de la 30 s la 20 min, și temperatura poate varia de la 0 la 37°C. Se utilizează timpuri mai lungi pentru determinarea secvențelor distante înte primeri.
Se adaugă 4,5 /11 de alicote din reacția de impuls de mai sus, la fiecare din cele patru tuburi care conțin amestecul de marcaje, preîncălzit la temperatura de 45°C. Cele patru tuburi, marcate G, A, T, C, conține fiecare cantități în urme din soluțiile dideoxi (dd) G, A, T sau C (P-L biochimici). Soluțiile de marcare specifice sunt prezentate în continuare. Fiecare tub conține 1,5 /11 dATP 1 mmol, 0,5 /115X de amestec tampon regenerat (200 mmoli de Tris-acid clorhidric, la pH=7,5, 50 mmoli de clorură de magneziu) și 1 /ilddNTP 100/imoli (în care ddNTP corespunde la ddG, A, T sau C în tuburile respective). Fiecare reacție de marcare este incubata la temperatura de 45°C (sau la temperaturi cuprinse între 30 și 50°C), timp de 10 min, și apoi 6 μΐ de soluție de stopare (90% formamidă, 10 mmoli de acid etilendiaminotetraacetic, 0,1% xilendanol) se adaugă la fiecare tub și tubul este adus pe gheață. Timpurile de marcare pot varia de la 1 până la 30 min.
Reacțiile de secvențializare se efectuează după metode standard pe gel de secvențializare standard, conținând 6% poliacrilamidă în 7 moli, uree, la 30W, timp de 6 h. Înainte de a fi duse pe gel sunt menținute în amestecul de reacție la o temperatura de 75°C, timp de 2 min. Gelul este fixat apoi într-o soluție de add acetic de 10% concentrație, metanol de 10% concentrație, după care se usucă pe gelul uscat și se expune până a doua zi pe film autoradiografic de mare contrast, de tip Kodak OM1.
Exemplul 3. Secvențalizarea acidului dezoxiribonucleic prin utilizarea concentraților de dNTPs în acest exemplu, analiza secvenței de add dezoxiribonucleic de tip mGPl-2 este realizata utilizându-se niveluri limitate din toate cele patru dezoxiribonucleozide trifostatice în reacția de impuls. Această metodă are un număr de avantaje potrivit protocolului din exemplul 2. in primul rând reacția de impuls are loc pentru completarea acesteia, protocolul amintit fiind modificat cu necesitatea întreruperii timpului de efectuare a reacției. în consecință, în acest caz reacțiile sunt mai ușor de efectuat în al doilea rând, cu această metodă este mai ușor de a se controla extinderea elongațiilor impulsului și astfel efidența marcării secvențelor este mai aproape de primul primer care conține 50 de baze și crește aproximativ de zece ori.
Se amestecă 7 μΐ de 0,75 iriftioti de add dezoxiribonucleic M13 cu filamente simplu răsudte (mGPl-2), cu 1 μΐ din primerul complementar de secvențare (17- merul, 0,5 pmoli primer/jul) și 2 μ\ 5X amestec tampon regenerat (200 mmoli Tris-add clorhidric, pH=7,5, 50 mmoli de clorură de magneziu, 250 mmoli de clorură de sodiu) care se încălzește Ia temperatura de 65°C, timp de 2 min și apoi se răcește ușor la temperatura camerei timp de peste 30 min. în reacția de impuls, 10 μΐ din amestecul regenerat de mai sus se amestecă cu 1 μΐ de ditiotreitol 0,1 M, 2 /imoli de 3 dNTPs (dGȚR dTTP), 1,5 /tmoli fiecare, 0,5 μΐ (alfa λ) dATP, (alfa 10 /«moli aproximativ 10 /«moli, 1500 Ci/mmoli, New Eagland-Nuclear) și 2/ddepolimerază T7 modificată, a acidului dezoxiribonudeic (0,1 mg/ml, 1000 unități/ml, de exemplu, 0,2 /«g, două unități) și se incubează la temperatura de 37°C, timp de 5 min (temperatura și timpul de incubare poate varia de la 20 până la 45°C și respectiv de la 1 până la 60 min).
3,5 μΐ alicote din mediul de reacție de impuls de mai sus, se adaugă la fiecare cele patru tuburi care conțin amestecul respectiv, care este preîncălzit la temperatura de 37°C. Patru tuburi marcate G, A, T, C conțin fiecare urme din cantitățile din fiecare element G, A, T, C. Soluțiile specifice de marcare sunt prezentate mai jos. Fiecare tub conține 0,5/îT5X de amestec tampon regenerat (200 mmoli de Tris- add clorhidric, pH=7,5, 50 mmoli de clorură de magneziu, 250 mmoli de clorură de sodiu), 1 /«mol de 4dNTPs (dGTP, dATP, dTTP, dCTP), 200/«1 fiecare și 1 /ddeddNTP 20 μ molL Fiecare amestec de reacție este incubația temperatura de 37°C, timp de 5 min (sau 20 până la 45°C, și respectiv de la 1 până la 60 min) și apoi 4 μ 1 de soluție de stopare (95% formamidă, 20 mmoli de add etilendiaminotetraacetic, 0,05% de xilen-danol) care se adaugă la fiecare tub și tubul este plasat pe gheață înainte de efectuarea reacției pe gel standard poliacrilamidic de secvențare, așa cum este descris mai sus.
Exemplul 4. Reînlocuirea dGTP cu dJTP pentru secvențarea acidului dezoxiribonucleic în vederea secvențării în zonele de compresie ta acidul dezoxiribonucleic, de exemplu, în zonele care posedă structura secundară compactă, se utilizează de obicei dlTP, așa cum este menționat in (Mills et al., 76 Proc.NatlAcad.Sci. 2232,1979) sau deazaguanozina trifosfat 5 (Mizusawa et aL, 14 Nuc. Acid Res. 1319, 1986). S-a descoperit că ambele funcții sunt analoage polimerazelor T7, în special cu dlTP în prezență de ssb. De preferință aceste reacții sunt realizate cu 10 polimeraza T7 modificată genetic așa cum s-a descris mai sus, sau reacția de marcare este de la 1 la 2 min durată și/sau are loc la temperatura de 20°C, pentru reducerea degradării nucleazei. 15 Polimeraza T7 modificată a acidului dezoxiribonucleic utilizează eficient dlTP sau GTP-deaza în loc de dGTP. dl'l'P este substituit cu dGTP în ambele amestecuri de reacție de impuls și de marcare 20 la o concentrație de la 2 la 5 ori și la care dGTP este utilizat în amestecul ddG de marcare, ddGTP este încă utilizat (nu se utilizează ddITP). Aceste reacții cu utilizare de dlTP, sunt sensibile la 25 niveluri mai mici reziduale (aproximativ 0,01 unități) de activitate exonucleazică. Pentru a rezolva această problemă, timpii de reacție nu vor depăși 5 min când se utilizează dlTP. Se recomandă ca cele 30 patru reacții dlTP să se efectueze în conjuncție, cele patru reacții utilizându-se dGTP (mai bine decât cu excluderea acestora). Dacă, atât dGTP, cât și dlTP se utilizează în mod obișnuit, numărul 35 de amestecuri necesar ce poate fi minimalizat prin: (1) scoaterea din amestecul de reacție a dGTP și dlTP, ceea ce înseamnă că cele patru amestecuri de reacție pot fi utilizate în ambele reacții 40 de marcare dGTP și dl l'P; (2) adăugarea unei concentrații ridicate de dGIT sau dlTP (2μ1 la 0,5 mmol și 1-2,5 mmoli) respectiv, la un amestec corespunzător de reacție de impuls. Cele două ameste- 45 curi de reacție de impuls conțin apoi fiecare o concentrație scăzută de dCTP, dTT și (alfa^S) dATP și o concentrație ridicată fie la dGTP sau dlTP. Aceasta modificare în mod obișnuit nu are efect 50 advers asupra calității reacțiilor secvenționale și reduce numărul necesar al impulsurilor, iar amestecurile de reacție de marcare se efectuează prin utilizarea, atât a dGTP, cât și a dlTP până la 6 ori.
Reacția de secvențializare este aceeași cu cea din exemplul 3, cu excepția că două din amestecurile de reacție de impuls conțin:
a) 3 amestecuri dNTP pentru dGTP;
1,5 /cmoli dCTP, d'lTP și 1 mmol de dGTP și
b) 3 amestecuri dNTP pentru dlTP; 1,5/cmoli dCTP, dTTP și 2 mmoli dlTP. în reacția de marcare, dGTP este îndepărtat din aceste amestecuri de reacție (de exemplu, amestecurile de reacție conțin 30 μ moli de dATP, dlTP și dCTP și una din cele patru dideoxinucleotide la 8 μπιοίΐ) și timpul de reacție la utilizarea dlTP nu trebuie să depășească 5 min.
Depozitarea
Tulpinile K38/pGP5-5/pTix-2, K38/ pTix-2și M13 mGPl-2 au fost depozitate în ATCC și marcate cu numerele 6Ί2ΧΊ, 67,286, și respectiv 40,303. Aceste depozite s-au realizat în 13 ianuarie 1987. Tulpinile de K38/pGPl -2/pGP5-6au fost depozitate în ATCC, fii ziua de 4 decembrie 1987 și marcate cu numărul 67571. Aplicanții și marcatorii își recunosc responsabilitatea de a înlocui aceste culturi care ar putea dispare înainte de termenul {nevăzut de această invenție, la 5 ani după ultima solicitare a culturii, sau la 30 de ani, sau o perioada mai mare și responsabilitatea acestora este de a notifica depozitarea conform unui astfel de patent, in care timp depozitele vor fi făcute irevocabil utilizabile de către co misionarii de patente sub termenii de CFR 37 secția 1-14 și USC 35 secția 112
Alte utilizări ale polimerazelor acidului dezoxiribonucleic modificate conform prezentei invenții care prezintă avantaje prin procesivitatea for și în absența activității exonucleazice, includ amplificarea directă a enzimei secvențelor de acid dezoxiribonucleic genomic. Aceasta este descrisă pentru alte polimerazeîn (Saildetal., 230Science 1350, 1985; și Scharf, 233 Sdence 1076,1986). 5
Referitor la fig.6, amplificarea enzimatică a regiunii specifice a acidului dezoxiribonucleic, include utilizarea a doi primeri care regenerează în filamente opuse ale unei secvențe cu răsucire dublă 40 din acidul dezoxiribonudeictnzona care prezintă interes cu 3’capetele direcționate unul către celălalt Actualul procedeu include multiple cicluri de denaturare (10 până la 40, de preferință, 16 până la 15 20), de regenerare și de sinteză a acidului dezoxiribonucleic. Prin utilizarea acestui procedeu, este posibil de a se amplifica o regiune specifică acidului dezoxiribonucleic genomic uman de un număr de 20 peste 200000 de ori. Așa cum rezultă, fragmentul genei specifice reprezintă aproximativ o parte din 5, mai bine decât ca în partea inițiala de la una la un milion. Aceasta duce mult la ușurarea, atât a 25 clonizării, cât și a analizei directe a acidului dezoxiribonucleic genomic. Pentru uz în diagnostic, se pot grăbi analizele, de la o perioadă de câteva săptămâni, până la una sau două zile. 30
Un fragment Klenow diferit în care amplificarea ca proces, este limitată la fragmente cu 200 de baze în lungime, polimeraza modificată de tip 17 a acidului dezoxiribonucleic (de preferință, în con- 35 juncție cu Escherichiacoli în proteina de legătură a acidului dezoxiribonucleic, sau ssb pentru prevenirea formării rapide a acidului dezoxiribonucleic cu filamente simplu răsucite), permite amplificarea 40 fragmentelor de acid dezoxiribonucleic în mii de baze ca lungime.
Polimerazele de tip T7 modificate sunt, așadar convenabile în amestecurile de reacție standard pentru: 45
a) umplerea în 5’ a fragmentelor de arid dezoxiribonucleic, protruding termini generate prin clivajul enzimei de restricție; în vederea, de exemplu, producerii aridului dezoxiribonucleic cu fi- 50 lamente dublu răsucite cu capete tocite din molecula lineară de acid dezoxiribo nucleic având o zonă cu filamente cu răsucire simplă cu protruding termini numărul 3’;
b) marcarea capătului 3’ a fragmentelor de restricție, pentru aplicarea porțiunilor mRNAde start prin analize SI nucleazice, sau secvențarea acidului dezoxiribonucleic utilizându-se procedeul de modificare chimică Maxam și Gilbert;
c) mutageneza - m vitro a fragmentelor clonizate ale acidului dezoxiribonucleic.
De exemplu, un primer sintetizat chimic care conține bazele specifice, este hibridizat în modelul aridului dezoxiribonucleic și apoi se extinde prin polimeraza modificată de tip Ί7 a acidului dezoxiribonucleic. Pe această cale mutația începe a fi permanent încorporată în filamentul sintetizat Este avantajos pentru polimerază să fie sintetizata din primer în întreaga lungime a acidului dezoxiribonucleic. Aceasta este mniLmai eficientă când se utilizează o polimerază procesivă a acidului dezoxiribonucleic. în mod alternativ, mutageneza este realizată prin misîncorporare în timpul sintezei de arid dezoxiribonucleic, așa cum s-a menționat mai înainte. Această aplicare este utilizată în zonele specifice mutagenezei a fragmentelor clonizate ale acidului dezoxiribonucleic. Este imporatant că enzima utilizată scade activitatea exonucleazeL Printr-un amestec de reacție standard se înțelege o soluție tamponată care conține polimeraza și orice dezoxinucleozide necesare sau alți compuși.
Claims (20)
- Revendicări1. Metodă pentru determinarea secvenței de bază nucleotidică a unei molecule de DNA, caracterizata prin aceea că, cuprinde etapele de regenerare a moleculei de DNA cu o moleculă primer marcată capabilă să hibrideze respectiva moleculă de DNA; incubarea de porțiuni separate ale amestecului regenerat în cel puțin patra recipiente, fiecare reci107769 pient conținând patru deoxinucleozid-trifo6fați diferiți, a DNA polimerază cu excepția revers transcriptazei și un agent de terminare a lanțului care încheie sinteza DNA la o bază nucleotidică specifică, în care fiecare agent încheind sinteza la o baza nucleotidică diferita, și în care concentrațiile tuturor celor patru deoxinucleozid-trifosfați la începutul incubării, sunt suficiente pentru a permite ca sinteza DNA să fie continuată până când este încheiată de agentul respectiv și separarea fragmentelor de DNA obținute din fiecare reacție de incubare după mărimea lor, în care cel puțin o parte a secvenței de bază nucleotidică a moleculei de DNA inițiale poate fi determinată.
- 2 Metodă, conform revendicării 1, caracterizata prin aceea că după etapa de regenerare a respectivei molecule de DNA are loc incubarea amestecului regenerat cu o DNA polimerază într-un unic recipient conținând patru deoxinucleozid-trifosfați diferiți, cel puțin unul dintre deoxinucleozid trifosfații menționați fiind marcat în condiții în care primenii respectiv poate fi extins și apoi incubarea de porțiuni separate din amestecul de primer extins în cel puțin patru recipiente, fiecare recipient conținând patru deoxinucleozid-tnfosfați diferiți și un agent de terminare, iar în final separarea fragmentelor de DNA obținute.
- 3. Metodă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că DNA polimeraza respectivă este o DNA polimerază progresivă.
- 4. Metodă, conform revendicării 3, caracterizata prin aceea că DNA polimeraza respectivă este o DNA polimerază detipT7.
- 5. Metodă, conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că DNA polimeraza de tip T7 este DNA polimerază T7.
- 6. Metodă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că polimeraza respectivă are un nivel al activității exonucleazice suficient de scăzut pentru a permite să fie determinată secvența de bază nucleotidică a moleculei de DNA
- 7. Metodă, conform revendicării 6, caracterizată prin aceea că DNA polimeraza respectivă are mai puțin de 10% activitate exonucleazică față de nivelul asociat activității exonucleazice a polimerazei respective naturale.
- 8. Metodă, conform revendicării 7, caracterizată prin aceea că DNA polimeraza respectivă are mai puțin de 1% activitate exonucleazică față de nivelul asociat activității exonucleazei naturale a polimerazei respective.
- 9. Nțetodă, conform revendicării 3, caracterizată prin aceea că DNA polimeraza respectivă rămâne legată de molecula de DNA menționată, de-a lungul a cel puțin 500 de baze înainte de a disocia.
- 10. Metodă, conform revendicării 9, caracterizată prin aceea că polimeraza respectivă rămâne legată de molecula de DNA menționată, de-a lungul a cel puțin 1000 de baze înainte de a disocia.
- 11. Metodă, conform revendicării 4, caracterizată prin aceea ca respectiva polimerază este în realitate aceeași cu aceea din celulele contaminate cu fag de tip-T7.
- 12. Metodă, conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că fagul de tip T7 menționat mai sus este T7, T3, MI, ΜΗ, H, W31, GH-1, Y, AL122 sau SP6.
- 13. Metodă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că polimeraza respecflVS este nediscriminatorie pentru analogii deoxinucleotidicL
- 14. Metodă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că DNA polimeraza respectivă are mai puțin de 500 unități de activitate exonucleazică pe mg de DNA polimerază.
- 15. Metodă, conform revendicării 14, caracterizata prin aceea că DNA polimeraza respectivă are mai puțin de 50 unități de activitate exonucleazică pe mg de DNA polimerază.
- 16. Metodă, conform revendicării 15, caracterizată prin aceea că DNA poli107769 meraza respectivă are mai puțin de o unitate de activitate exonudeazică pe mg de DNA polimerază.
- 17. Metodă, conform revendicării 16, caracterizată prin aceea că DNA poli- 5 meraza respectivă nu are activitate exonudeazică detectabilă.
- 18. Metodă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că DNA polimeraza respectivă este capabilă sa utili- 10 zeze primeri cu 10 perechi de baze sau mai multe.
- 19. Metodă, conform revendicării 18, caracterizată prin aceea că polimeraza respectivă este capabilă să utilizeze primeri cu 4 perechi de baze sau mai multe.
- 20. Metodă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că agentul de încheiere menționat este o dideoxinudeotida.Președintele comisiei de invenții; farm. Penteiescu Elena Examinator: biocbim. Crețu Adina
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/003,227 US4795699A (en) | 1987-01-14 | 1987-01-14 | T7 DNA polymerase |
| US07/132,569 US4942130A (en) | 1987-01-14 | 1987-12-14 | T7 DNA polymerase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO107769B1 true RO107769B1 (ro) | 1993-12-30 |
Family
ID=26671499
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RO131762A RO107769B1 (ro) | 1987-01-14 | 1988-01-13 | Metoda pentru determinarea secventei de baza nucleotidica a unei molecule de dna |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4942130A (ro) |
| EP (5) | EP0265293B1 (ro) |
| JP (7) | JP2584644B2 (ro) |
| KR (1) | KR930005660B1 (ro) |
| CN (1) | CN1031251A (ro) |
| AT (2) | ATE109207T1 (ro) |
| AU (1) | AU604824B2 (ro) |
| CA (2) | CA1340628C (ro) |
| DD (1) | DD301731A9 (ro) |
| DE (9) | DE3789623T4 (ro) |
| DK (1) | DK13288A (ro) |
| ES (5) | ES2068323T3 (ro) |
| FI (1) | FI880131A (ro) |
| GR (2) | GR880300103T1 (ro) |
| HU (1) | HUT46069A (ro) |
| IL (1) | IL85073A (ro) |
| NO (1) | NO880126L (ro) |
| NZ (1) | NZ223039A (ro) |
| RO (1) | RO107769B1 (ro) |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6384264A (ja) * | 1986-09-27 | 1988-04-14 | Toshiba Corp | 画像読取装置 |
| US4962020A (en) * | 1988-07-12 | 1990-10-09 | President And Fellows Of Harvard College | DNA sequencing |
| GB8827167D0 (en) * | 1988-11-21 | 1988-12-29 | Apothekernes Lab | In vitro mutagenesis |
| US5001050A (en) * | 1989-03-24 | 1991-03-19 | Consejo Superior Investigaciones Cientificas | PHφ29 DNA polymerase |
| US5047342A (en) * | 1989-08-10 | 1991-09-10 | Life Technologies, Inc. | Cloning and expression of T5 DNA polymerase |
| US5541099A (en) * | 1989-08-10 | 1996-07-30 | Life Technologies, Inc. | Cloning and expression of T5 DNA polymerase reduced in 3'-to-5' exonuclease activity |
| US5270179A (en) * | 1989-08-10 | 1993-12-14 | Life Technologies, Inc. | Cloning and expression of T5 DNA polymerase reduced in 3'- to-5' exonuclease activity |
| GB8926269D0 (en) * | 1989-11-21 | 1990-01-10 | Dynal As | Plasmid |
| DK0445097T3 (da) * | 1990-02-26 | 1996-09-16 | Univ Washington | Fremgangsmåde til N-myristoylering af protein |
| US5322785A (en) | 1990-04-26 | 1994-06-21 | New England Biolabs, Inc. | Purified thermostable DNA polymerase obtainable from thermococcus litoralis |
| EP0601010B1 (en) * | 1991-08-30 | 2000-06-14 | Syngenix Limited | Nucleic acid polymerase amplification |
| US6410277B1 (en) | 1993-02-19 | 2002-06-25 | Takara Shuzo Co., Ltd. | DNA polymersases with enhanced length of primer extension |
| US5436149A (en) * | 1993-02-19 | 1995-07-25 | Barnes; Wayne M. | Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension |
| US7465539B1 (en) | 1993-02-19 | 2008-12-16 | Takara Bio, Inc. | DNA polymerases with enhanced length of primer extension |
| US5547859A (en) * | 1993-08-02 | 1996-08-20 | Goodman; Myron F. | Chain-terminating nucleotides for DNA sequencing methods |
| US7312052B1 (en) | 1993-12-08 | 2007-12-25 | Stratagene California | Polymerase compositions and uses thereof |
| US6015668A (en) * | 1994-09-30 | 2000-01-18 | Life Technologies, Inc. | Cloned DNA polymerases from thermotoga and mutants thereof |
| US5614365A (en) * | 1994-10-17 | 1997-03-25 | President & Fellow Of Harvard College | DNA polymerase having modified nucleotide binding site for DNA sequencing |
| ES2072238T3 (es) * | 1994-10-17 | 1997-01-16 | Harvard College | Adn-polimerasas que tienen un sitio de union con nucleotidos modificados para la secuenciacion de adn. |
| US5948614A (en) * | 1995-09-08 | 1999-09-07 | Life Technologies, Inc. | Cloned DNA polymerases from thermotoga maritima and mutants thereof |
| US5888736A (en) * | 1995-12-22 | 1999-03-30 | Visible Genetics, Inc. | Method, compositions and kit for detection and identification of microorganisms |
| US5789168A (en) * | 1996-05-01 | 1998-08-04 | Visible Genetics Inc. | Method for amplification and sequencing of nucleic acid polymers |
| US5830657A (en) * | 1996-05-01 | 1998-11-03 | Visible Genetics Inc. | Method for single-tube sequencing of nucleic acid polymers |
| US6413718B1 (en) | 1996-05-01 | 2002-07-02 | Visible Genetics Inc. | Method for sequencing of nucleic acid polymers |
| US6214555B1 (en) | 1996-05-01 | 2001-04-10 | Visible Genetics Inc. | Method compositions and kit for detection |
| US6083699A (en) * | 1996-05-01 | 2000-07-04 | Visible Genetics Inc. | Method for bi-directional sequencing of nucleic acid polymers |
| US5827716A (en) * | 1996-07-30 | 1998-10-27 | Amersham Life Science, Inc. | Modified Pol-II type DNA polymerases |
| US6291164B1 (en) | 1996-11-22 | 2001-09-18 | Invitrogen Corporation | Methods for preventing inhibition of nucleic acid synthesis by pyrophosphate |
| US5876934A (en) * | 1996-12-18 | 1999-03-02 | Pharmacia Biotech Inc. | DNA sequencing method |
| US6306588B1 (en) | 1997-02-07 | 2001-10-23 | Invitrogen Corporation | Polymerases for analyzing or typing polymorphic nucleic acid fragments and uses thereof |
| JP4245084B2 (ja) | 1997-03-21 | 2009-03-25 | ストラタジーン | ポリメラーゼ増強因子（ｐｅｆ）抽出物、ｐｅｆタンパク質複合体、単離されたｐｅｆタンパク質、並びに精製及び単離方法 |
| JP2003526328A (ja) * | 1999-01-11 | 2003-09-09 | プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ | Ｄｎａの等温増幅 |
| CN1313394A (zh) * | 2000-03-10 | 2001-09-19 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——dna聚合酶10和编码这种多肽的多核苷酸 |
| US7198924B2 (en) | 2000-12-11 | 2007-04-03 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
| US7222059B2 (en) | 2001-11-15 | 2007-05-22 | Siemens Medical Solutions Diagnostics | Electrophoretic trace simulator |
| EP1697534B1 (en) | 2003-12-01 | 2010-06-02 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same |
| WO2009140497A1 (en) * | 2008-05-16 | 2009-11-19 | New England Biolabs, Inc. | Enzyme reagents for amplification of polynucleotides in the presence of inhibitors |
| KR101417989B1 (ko) * | 2013-02-08 | 2014-07-09 | 주식회사 엔지노믹스 | 이중가닥 dna 말단의 단일가닥 길이 조절 방법 |
| US10793841B2 (en) | 2017-06-30 | 2020-10-06 | Codexis, Inc. | T7 RNA polymerase variants |
| JP2020530267A (ja) | 2017-06-30 | 2020-10-22 | コデクシス， インコーポレイテッド | Ｔ７ ｒｎａポリメラーゼバリアント |
| CN114774453B (zh) * | 2022-03-14 | 2023-04-21 | 湖北大学 | 一种运动发酵单胞菌基因表达严谨调控系统的构建方法和应用 |
Family Cites Families (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3444041A (en) * | 1965-09-29 | 1969-05-13 | Univ Illinois | In vitro synthesis of ribonucleic acids and enzyme therefor |
| US3661893A (en) * | 1968-11-25 | 1972-05-09 | Univ Illinois | Synthesis in vitro of nucleic acids and products used therein and products produced therefrom |
| US4072574A (en) * | 1976-07-30 | 1978-02-07 | The Institute For Cancer Research | System for in vitro assay for mutagenicity and/or carcinogenicity of chemicals or other exogenous agents |
| US4363877B1 (en) * | 1977-09-23 | 1998-05-26 | Univ California | Recombinant dna transfer vectors |
| US4331589A (en) * | 1978-11-22 | 1982-05-25 | Abbott Laboratories | Deoxyribonucleic acid synthesis using binding protein extracted from chick embryo fibroblasts |
| US4224408A (en) * | 1978-11-22 | 1980-09-23 | Abbott Laboratories | Deoxyribonucleic acid synthesis using binding protein |
| DK145779A (da) * | 1979-04-09 | 1980-10-10 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til termisk destabilisering af mikrobiel osteloebe |
| US4663283A (en) * | 1980-03-24 | 1987-05-05 | Genentech, Inc. | Method of altering double-stranded DNA |
| US4555486A (en) * | 1980-12-08 | 1985-11-26 | Cetus Corporation | Method for using an amino-terminus DNA sequence to synthesize a specific double-stranded DNA |
| US4394443A (en) * | 1980-12-18 | 1983-07-19 | Yale University | Method for cloning genes |
| US4395486A (en) * | 1981-08-19 | 1983-07-26 | Medical College Of Ga. Research Inst., Inc. | Method for the direct analysis of sickle cell anemia |
| FI63596C (fi) * | 1981-10-16 | 1983-07-11 | Orion Yhtymae Oy | Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser |
| US4663290A (en) * | 1982-01-21 | 1987-05-05 | Molecular Genetics, Inc. | Production of reverse transcriptase |
| US4483922A (en) * | 1982-05-14 | 1984-11-20 | Amf Inc. | Inactivation of enzymes |
| US4483920A (en) * | 1982-05-17 | 1984-11-20 | Hahnemann University | Immobilization of message RNA directly from cells onto filter material |
| US4556643A (en) * | 1982-07-26 | 1985-12-03 | Agracetus | Assay method and probe for polynucleotide sequences |
| US4521509A (en) * | 1982-11-24 | 1985-06-04 | Research Corporation | Method for degrading DNA |
| GB8311018D0 (en) * | 1983-04-22 | 1983-05-25 | Amersham Int Plc | Detecting mutations in dna |
| US4729947A (en) * | 1984-03-29 | 1988-03-08 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | DNA sequencing |
| US4786600A (en) * | 1984-05-25 | 1988-11-22 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Autocatalytic replication of recombinant RNA |
| US4675283A (en) * | 1984-07-19 | 1987-06-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Detection and isolation of homologous, repeated and amplified nucleic acid sequences |
| US4767708A (en) * | 1984-08-07 | 1988-08-30 | Carnegie Mellon University | Enzyme amplification and purification |
| JPS61137158A (ja) * | 1984-12-07 | 1986-06-24 | Toshiba Corp | 電子写真感光体 |
| US4670379A (en) * | 1984-12-19 | 1987-06-02 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Polynucleotide hydridization assays employing catalyzed luminescence |
| US4795700A (en) * | 1985-01-25 | 1989-01-03 | California Institute Of Technology | Nucleic acid probes and methods of using same |
| JPS61219399A (ja) * | 1985-03-27 | 1986-09-29 | Hitachi Ltd | 核酸塩基配列決定法 |
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4707235A (en) * | 1985-10-16 | 1987-11-17 | Pharmacia, Inc. | Electrophoresis method and apparatus having continuous detection means |
| JPH0732719B2 (ja) * | 1986-02-07 | 1995-04-12 | 株式会社日立製作所 | 核酸断片調製法 |
| US4800159A (en) * | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
| CA1338457C (en) * | 1986-08-22 | 1996-07-16 | Henry A. Erlich | Purified thermostable enzyme |
| US4795699A (en) * | 1987-01-14 | 1989-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | T7 DNA polymerase |
-
1987
- 1987-12-14 US US07/132,569 patent/US4942130A/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-22 NZ NZ223039A patent/NZ223039A/xx unknown
- 1987-12-24 EP EP87311435A patent/EP0265293B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-24 DE DE3789623T patent/DE3789623T4/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-24 DE DE3789623A patent/DE3789623D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-12-24 DE DE199292202037T patent/DE516245T1/de active Pending
- 1987-12-24 DE DE3750288T patent/DE3750288T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-24 ES ES90201140T patent/ES2068323T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-24 ES ES90201138T patent/ES2056366T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-24 DE DE199090201140T patent/DE386859T1/de active Pending
- 1987-12-24 DE DE9090201138T patent/DE3781809T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-12-24 EP EP90201138A patent/EP0386857B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-24 EP EP92202037A patent/EP0516245A1/en not_active Ceased
- 1987-12-24 EP EP90201140A patent/EP0386859B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-24 DE DE3751042T patent/DE3751042T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-24 AT AT87311435T patent/ATE109207T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-12-24 EP EP90201139A patent/EP0386858B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-24 ES ES90201139T patent/ES2063243T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-12-24 DE DE198787311435T patent/DE265293T1/de active Pending
- 1987-12-24 ES ES92202037T patent/ES2060569T1/es active Pending
- 1987-12-24 AT AT90201140T patent/ATE118039T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-12-24 DE DE199090201139T patent/DE386858T1/de active Pending
- 1987-12-24 ES ES87311435T patent/ES2001837T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-01-11 IL IL8507388A patent/IL85073A/en not_active IP Right Cessation
- 1988-01-12 DD DD88332342A patent/DD301731A9/de unknown
- 1988-01-13 RO RO131762A patent/RO107769B1/ro unknown
- 1988-01-13 AU AU10224/88A patent/AU604824B2/en not_active Ceased
- 1988-01-13 HU HU88128A patent/HUT46069A/hu unknown
- 1988-01-13 CA CA000556390A patent/CA1340628C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-13 CA CA000616698A patent/CA1341512C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-01-13 JP JP63003927A patent/JP2584644B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-01-13 DK DK013288A patent/DK13288A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-01-13 FI FI880131A patent/FI880131A/fi not_active Application Discontinuation
- 1988-01-13 NO NO880126A patent/NO880126L/no unknown
- 1988-01-14 CN CN88100646A patent/CN1031251A/zh active Pending
- 1988-01-14 KR KR1019880000286A patent/KR930005660B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-10-21 GR GR88300103T patent/GR880300103T1/el unknown
-
1992
- 1992-11-19 JP JP4333524A patent/JPH06237765A/ja active Pending
- 1992-11-19 JP JP4333526A patent/JPH0670773A/ja active Pending
- 1992-11-19 JP JP4333527A patent/JPH0746990A/ja active Pending
- 1992-11-19 JP JP4333528A patent/JP2606777B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-11-19 JP JP4333525A patent/JPH0670772A/ja active Pending
- 1992-12-02 GR GR920402806T patent/GR3006442T3/el unknown
-
1993
- 1993-05-18 JP JP5138959A patent/JPH06141898A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RO107769B1 (ro) | Metoda pentru determinarea secventei de baza nucleotidica a unei molecule de dna | |
| US4994372A (en) | DNA sequencing | |
| US4921794A (en) | T7 DNA polymerase | |
| US4795699A (en) | T7 DNA polymerase | |
| US4946786A (en) | T7 DNA polymerase | |
| US5882904A (en) | Thermococcus barossii DNA polymerase mutants | |
| US6485909B1 (en) | DNA polymerase having ability to reduce innate selective discrimination against fluorescent dye-labeled dideoxynucleotides | |
| JPH05508302A (ja) | Ｐｈ１２９ｄｎａポリメラーゼおよび該ポリメラーゼをコードするｄｎａ断片を用いるイン・ビトロｄｎａ合成反応 | |
| US5173411A (en) | Method for determining the nucleotide base sequence of a DNA molecule | |
| JP2000501616A (ja) | テルモアナエロバクター・テルモヒドロスルフリカスからの熱安定性ｄｎａポリメラーゼおよびエキソヌクレアーゼ活性が除去されているその変異体酵素 | |
| JP2000502882A (ja) | サーモトガ由来のクローン化ｄｎａポリメラーゼ類およびそれらの変異体 | |
| CA2280001A1 (en) | Polymerases for analyzing or typing polymorphic nucleic acid fragments and uses thereof | |
| US5266466A (en) | Method of using T7 DNA polymerase to label the 3' end of a DNA molecule | |
| Sode et al. | Glu742 substitution to Lys enhances the EDTA tolerance of Escherichia coli PQQ glucose dehydrogenase | |
| JPH09220087A (ja) | プルーフリーディング３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する新規ｄｎａポリメラーゼ | |
| US5145776A (en) | Method of using T7 DNA polymerase to mutagenize and fill-in DNA | |
| CA1335263C (en) | T7 dna polymerase | |
| IL101061A (en) | Genes encoding T7 dna polymerase | |
| JP3440954B2 (ja) | Ｄｎａポリメラーゼ遺伝子 | |
| Reverse | Mutations of the RNase HC Helix of the |