KR101417989B1 - 이중가닥 dna 말단의 단일가닥 길이 조절 방법 - Google Patents

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Abstract

본원은 경쟁적 억제 방식을 이용한 DNA 말단에 형성되는 오버행 길이의 조절방법 및 키트, 이를 이용한 dsDNA 연결 방법을 개시한다. 본원에 따른 방법 및 키트를 이용한 라이게이즈 비의존성 DNA 연결방법은, 오버행 길이 조절의 용이성과 정확성으로 인해 그 효율이 향상되어, PCR 산물의 클로닝을 포함하는 다양한 유전자 재조합 실험 및 클로닝에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

이중가닥 DNA 말단의 단일가닥 길이 조절 방법 {Method for regulating length of overhang of double stranded DNA}
본원은 핵산 물질의 말단 단일가닥의 길이 조절에 관련된 것이다.
유전자 재조합 기술의 구현 또는 DNA 단편의 클로닝 등에 있어서, 핵산을 연결하는 라이게이션이 필수적이다. 라이게이션은 DNA의 말단의 형태에 따라 효율이 달라질 수 있다. 선형 이중가닥 DNA는 말단의 마지막 염기까지 이중가닥인 블런트 말단, 또는 말단에 몇 개의 염기가 3' 말단 또는 5' 말단에서 단일가닥으로 존재하는 오버행 말단의 형태로 존재한다. 블런트 말단의 경우, 또는 오버행의 길이가 짧은 경우, 라이게이션의 효율이 낮은 경향이 있다.
클로닝 등에 사용되는 이러한 연결법은 크게 라이게이즈라는 효소를 사용하는 방법과, 라이게이즈 비의존적 방법 (Ligase independent)으로 나눌 수 있으며, PCR에 의한 유전자 조작 및 클로닝이 보편화됨에 따라 보다 신속하며 효율이 우수한 후자의 방법이 많이 사용되고 있다. 전자의 경우 라이게이션을 사용하지 않는 경우와 비교하여 효율이 낮아 효율을 높이기 위한 방법이 개발되었다.
미국 공개 특허공보 제 2012-0283144호는 라이게이션 효율 향상 방법에 관한 것으로 라이게이즈이외에 분자량 1000 Da 이하의 직쇄 또는 분지쇄의 디올 또는 폴리올을 사용한 라이게이션 향상 방법을 개시한다.
라이게이즈 비의존적 방법의 예로는 인비보 재조합기재 클로닝(recombination based cloning)과, 엑소뉴클리아제에 기반을 둔 클로닝 방법이 선호되고 있다. 후자의 예로서 미국특허 제7,575,860호는 DNA 연결 방법에 관한 것으로, 엑소뉴클리아제를 이용한 라이게이션 방법을 개시한다.
엑소뉴클리아제를 사용하는 경우, 라이게이션의 효율이 말단 오버행 길이에 매우 의존적으로, 이에 대한 조절방법의 개발이 필요하다.
본원은 DNA 말단의 오버행을 조절할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 선형 이중가닥 DNA를 제공하는 단계; 및 상기 DNA를, 엑소뉴클리아제 활성을 갖는 폴리머라제 및 상기 폴리머라제와 동일 또는 상이한 것으로 엑소뉴클리아제 활성이 일부 또는 전부 상실된 폴리머라제로 처리하는 단계를 포함하며, 상기 이중가닥 DNA의 말단은 블런트, 5'오버행 또는 3'오버행인, 경쟁적 억제 방식에 의한 DNA 오버행 길이 조절 방법에 관한 것이다. 본원에 따른 일 구현예에서 상기 엑소뉴클리아제 활성은 3'→5' 또는 5'→3' 의 활성을 가지며, 한 구현예에서는 3'→5' 활성을 가진다. 다른 일구현예에서 본원의 방법에 사용되는 엑소뉴클리아제는 교정기능이 있는 DNA 폴리머라제로, 예를 들면 Taq DNA 폴리머라제, Phi29 DNA 폴리머라제, Pyrococcus-유사 폴리머라제, Vent DNA 폴리머라제, Pfx DNA 폴리머라제, Pfu DNA 폴리머라제, E. coli DNA 폴리머라제, T7 DNA 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제, Pyrococcus species GB-D 유래의 DNA 폴리머라제, Thermococcus litoralis 유래의 DNA 폴리머라제, 또는 Thermococcus kodakaraensis KOD1 유래의 DNA 폴리머라제를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 다른 일 구현예에서 상기 엑소뉴클리아제 활성을 갖는 폴리머라제는 백시니아바이러스, 폭스바이러스, 허피스바이러스, 아데노바이러스, 이리도바이러스, 바큘로바이러스를 포함하는 바이러스 유래 또는 사카로마이세스 서레비시에 (S. cerevisiae)를 포함하는 진균류 유래일 수 있다.
본원의 방법에서 상기 엑소뉴클리아제 활성을 갖는 폴리머라제 및 엑소뉴클리아제 활성이 일부 또는 전부 상실된 폴리머라제는 상기 DNA의 말단에 5 내지 100 nt 길이의 오버행이 형성될 수 있는 비, 예를 들면 약 1~100 대 약 1~100의 몰비로 사용되나, 사용되는 구체적 폴리머라제의 종류 및 활성의 상실 정도에 따라 달라질 수 있다.
다른 측면에서 본원은 본 방법에 사용되는 엑소뉴클리아제 활성을 갖는 폴리머라제 및 엑소뉴클리아제 활성이 일부 또는 전부 상실된 폴리머라제를 포함하는, 라이게이즈 비의존성 DNA 연결용 키트를 제공한다. 본 키트에 포함되는 상기 엑소뉴클리아제 활성을 갖는 폴리머라제 및 엑소뉴클리아제 활성이 일부 또는 전부 상실된 폴리머라제는 별개로 또는 혼합된 상태로 포함될 수 있으며, 혼합비는 예를 들면 약 1~100 대 1~100의 몰비일 수 있다.
다른 양태에서 본원은 이중가닥 DNA (dsDNA) 연결 방법으로, 상보적 말단을 갖는 두 개 이상의 선형 dsDNA 제공하는 단계; 상기 선형 dsDNA를 엑소뉴클리아제 활성을 갖는 폴리머라제 및 상기 폴리머라제와 동일 또는 상이한 것으로 엑소뉴클리아제 활성이 일부 또는 전부 상실된 폴리머라제의 혼합물과 반응하는 단계; 상기 두 개 이상의 선형 dsDNA는 상기 혼합물로의 처리에 의해 그 말단에 약 5-100nt의 오버행이 생성되고, 상기 오버행간의 상보적 결합에 의해 상기 두 개 이상의 선형 dsDNA가 서로 결합되는 단계를 포함하는, 이중가닥 DNA 연결방법을 제공한다.
본원에 따른 일 구현예에서, 상기 두 개 중 하나의 dsDNA는 클로닝 벡터이고, 상기 방법은 상기 dsDNA 결합 단계 후에, 상기 결합물을 박테리아에 형질전환하는 단계를 포함하는 것이다.
본원에 따른 방법 및 조성물을 이용한 라이게이션의 경우, 오버행의 조절의 용이성과 정확성으로 인해 엑소뉴클리아제를 이용한 라이게이션 효율이 향상되어, DNA 단편, PCR 산물의 클로닝을 포함하는 다양한 유전자 재조합 실험 및 클로닝에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 엑소뉴클리아제를 이용한 일반적 DNA 라이게이션 방법의 모식도이다.
도 2는 엑소뉴클리아제 활성을 갖는 폴리머라제의 양 (2a) 및 처리 시간 (5분에서 120분) (2b)에 따라 달리 생성되는 DNA 단편의 종류를 나타낸다. 엑소뉴클리아제 기능을 갖는 대표적인 DNA 폴리머라제 중 하나인 KOD DNA 폴리머라제를 사용하여 3' 엑소뉴클리아제 활성을 측정한 결과, 폴리머라제의 양 및 시간이 증가될수록 절단되는 dsDNA 양 및 절단되는 길이가 증가되었다. 실험에 사용된 기질은 도면 상단 쪽에 나타내었으며, 예측되는 산물의 구조는 오른편에 표시하였다.
도 3은 본원의 일 구현예에 따른 돌연변이 엑소뉴클리아제와의 경쟁적 억제 방식을 통한 엑소뉴클리아제의 활성 조절 결과를 나타낸다. (A) 는 야생형 KOD 의 양을 고정하고 돌연변이 KOD의 양을 1:0 내지 1:4 비율로 서서히 증가시키면서 반응한 결과로 14 nt 길이를 기준으로 그 보다 큰 산물 (upper) 및 그 보다 작은 크기 (lower) 산물로 구분하여 정량하였다. (B)는 A 실험에서 정량한 값을 그래프로 나타낸 결과이다.
도 4는 본원의 일 구현예에 따른 경쟁적 억제 방법을 통해 클로닝 효율을 측정한 결과이다. (A)는 각각 1 kb 와 3 kb 길이의 DNA 단편을 벡터를 클로닝한 결과로 검정색 막대 그래프는 생성된 콜로니의 수(왼쪽 축)를 나타내고, 빗금친 막대 그래프는 상기 생성된 콜로니 중 목적하는 DNA가 삽입된 벡터를 포함하는지 여부로 판단된 클로닝 성공률(오른쪽 축)을 나타낸다. (B) 클로닝 성공률을 확인하기 위해 콜로니 PCR을 수행한 결과로 왼편 화살표는 클로닝 성공 시에 예상되는 PCR 산물의 크기를 나타낸다.
도 5는 엑소뉴클리아제에 의해 DNA 오버행 생성시 길이에 따른 라이게이션 효율을 비교한 모식도이다.
본원은 경쟁적 억제방식을 통해 엑소뉴클리아제 활성을 조절하여, 이에 의해 생성되는 오버행의 길이를 조절할 수 있다는 발견에 근거한 것이다.
라이게이즈를 사용하지 않는 DNA 연결방법에서는 DNA의 양 말단이 예를 들면 3'→5' 엑소뉴클리아제 활성에 의해 제거되어 적절한 길이의 5' 오버행이 형성되는 것이 중요하며, 또한 5'→3' 엑소뉴클리아제를 사용하는 경우는 적절한 길이의 3' 오버행이 생성되는 것이 중요하다. 엑소뉴클리아제 예를 들면 3'→5' 엑소뉴클리아제의 활성이 약한 경우에는 짧은 길이 예를 들면 5 nt 이하의 5' ssDNA(single stranded DNA) 말단 영역이 형성되어 상보가닥간의 어닐링 일어나지 못하고 그 결과 라이게이션이 잘 일어나지 않게 된다(도 5 의 A 참조). 반대로, 3'→5' 엑소뉴클리아제 활성이 강한 경우 긴 5' ssDNA 말단 영역이 형성되고 이로 인해 단일가닥 영역에서 2차 구조가 형성되어 라이게이션 효율이 매우 낮아지게 된다(도 5 의 C 참조). 따라서 라이게이즈 비의존적 DNA 연결방법에서 이차구조를 형성하지 않으면서 두 상동서열간의 안정적인 어닐링을 유도할 수 있는 적절한 길이의 오버행 길이의 조절이 효율적이며 성공적 라이게이션에 매우 중요하다(도 5 의 B 참조).
본원에서 사용된 DNA와 관련된 사용된 용어 라이게이션, 연결은 두 개 이상의 DNA 단편을 연결하여 하나의 단편으로 만드는 것으로 상호 교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 용어 이중가닥 DNA (dsDNA)는 전부 또는 일부가 상보적인 두 가닥의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드로, 합성된 것이거나, 세포 또는 조직에서 추출된 것일 수 있으며, 3' 오버행, 5' 오버행 또는 블런트 말단을 가질 수 있다. 본원에 따른 일 실시예에서 dsDNA는 PCR(polymerase chain reaction) 산물이거나, 유전체 DNA 또는 플라스미드 또는 벡터의 물리적 또는 효소를 이용한 절단 산물일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 오버행 (overhang)은 dsDNA의 양 말단에서 단일가닥으로 존재하는 부분을 일컫는 것으로, 단일가닥으로 존재하는 부위의 방향성에 따라 5' 오버행 또는 3' 오버행으로 구분된다. 오버행은 예를 들면 제한효소에 의한 절단, 엑소뉴클리아제 처리, 적절한 dNTP(dATP, dTTP, dCTP, dGTP)의 부가에 의해 생성될 수 있으며, 그 길이도 다양할 수 있다.
따라서 한 양태에서 본원은 선형 이중가닥 DNA를 제공하는 단계; 및 상기 DNA를, 엑소뉴클리아제 활성을 갖는 폴리머라제 및 상기 폴리머라제와 동일 또는 상이한 것으로 엑소뉴클리아제 활성이 결여된 폴리머라제로 처리하는 단계를 포함하며, 상기 이중가닥 DNA의 말단은 블런트, 5' 오버행 또는 3' 오버행인, 경쟁적 억제 방식에 의한 DNA 오버행 길이 조절 방법에 관한 것이다.
본원의 방법에 사용될 수 있는 엑소뉴클리아제 활성을 갖는 DNA 폴리머라제는 내재적 3'→5' 또는 5'→3' 엑소뉴클리아제 활성을 갖는 것으로, 상보적 말단을 갖는 두 개의 DNA 말단을 연결할 수 있는 기능을 갖는 것이다. 이러한 기능을 갖는 한 다양한 유래의 폴리머라제가 본원에 사용될 수 있다.
본원의 방법에는 다양한 호열성, 중온성의 폴리머라제가 사용될 수 있다. 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, Thermus 속 균주 유래의 폴리머라제인 Taq 폴리머라제, Phi29 DNA 폴리머라제, 고정확도 융합 DNA 폴리머라제 (예를 들면 속도 향상 영역을 포함하는 Pyrococcus-유사 폴리머라제, New England Biolabs, USA), Vent DNA 폴리머라제, Pfx DNA 폴리머라제, Pfu DNA 폴리머라제 (예를 들면 Pyrococcus furiosus, Strategene, USA), E. coli DNA 폴리머라제, T7 DNA 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제, Pyrococcus species GB-D 유래의 DNA 폴리머라제 (New England Biolabs, MA), Thermococcus litoralis 유래의 DNA 폴리머라제(New England Biolabs), 또는 Thermococcus kodakaraensis KOD1 유래의 DNA 폴리머라제 (KOD, Toyobo, Japan)를 포함한다. 다른 측면에서는 그 유래를 기준으로 백시니아바이러스, 폭스바이러스, 허피스바이러스, 아데노바이러스, 이리도바이러스, 바큘로바이러스를 포함하는 바이러스 유래 DNA 폴리머라제, 사카로마이세스 서레비시에 (S. cerevisiae) 와 같은 진균류 유래의 DNA 폴리머라제가 사용될 수 있다.
본원에 따른 한 구현예에서는 특히 교정기능이 있는, 즉 3'→5' 엑소뉴클리아제 기능이 있는 폴리머라제 (proofreading DNA polymerase)가 사용된다. 본원의 목적을 달성하는 한 다양한 교정기능을 갖는 폴리머라제가 사용될 수 있으며, 이러한 폴리머라제는 일반적으로 3'→5' 엑소뉴클리아제 활성으로 인해, DNA 합성 중에 잘못 편입된 뉴클레오타이드를 제거하고 상보성에 맞는 뉴클레오타이드로 교체하는 역할을 하나, 반응물의 dNTP의 존재여부에 따라 활성이 달라진다. 즉 반응물에 dNTP가 존재하는 경우는 주로 DNA 합성에 관여하지만, 반응물에 dNTP가 존재하지 않는 경우는 주로 3'→5' 엑소뉴클리아제 기능이 활성화되어 DNA의 뉴클레오타이드를 제거한다.
본원의 방법에 사용되는 이중가닥 DNA의 말단은 블런트, 5' 오버행 또는 3' 오버행일 수 있다.
일반적으로 폴리머라제의 3'→5' 엑소뉴클리아제 활성은 결합된 DNA의 3' 말단을 연속적으로 (processive) 제거해 나가기 때문에 원하는 적절한 길이를 가진 동일한 오버행을 많이 생성하기보다는 긴 오버행부터 짧은 오버행까지 다양한 길이의 오버행이 생성되며, 폴리머라제의 양을 증가시킬수록 긴 오버행이 더 많이 생성되게 클로닝의 효율을 감소시킨다 (도 2 참조).
본원에 따른 방법은 상술한 엑소뉴클리아제 기능을 갖는 DNA 폴리머라제와 함께, 상술한 폴리머라제와 동일 또는 상이한 것으로 엑소뉴클리아제 기능이 전부 또는 일부 상실된 DNA 폴리머라제가 함께 사용하는 경우, 경쟁적 억제방법을 통해 오버행을 조절할 수 있다.
경쟁적 억제에 사용되는 폴리머라제는 예를 들면 야생형 폴리머라제에 엑소큐클리아제의 기능이 불활성화된 돌연변이(exo-)가 발생된 것을 포함하는 것으로, 공지된 다양한 것이 사용될 수 있다. 이러한 폴리머라제의 예로는 KOD 폴리머라제의 210번째 잔기가 아스파라진에서 아스파르트산으로 치환된 돌연변이가 유발된 것을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
이러한 엑소뉴클리아제 기능이 있는 폴리머라제와 3'→5'엑소뉴클리아제 활성만이 불활성화된 exo- 돌연변이 폴리머라제를 조합으로 사용하는 경우, exo- 돌연변이는 DNA에 결합은 할 수 있지만, 엑소뉴클리아제의 기능은 하지 못해 결과적으로 정상적 폴리머라제의 엑소뉴클리아제 기능을 방해하여, 일정 길이 이상을 절단하지 못하도록 조절할 수 있는 것이다.
본원에 포함되는 엑소뉴클리아제 기능이 있는 폴리머라제와 3'→5' 엑소뉴클리아제 활성만이 불활성화된 exo- 돌연변이의 혼합비는 목적하는 오버행 길이에 따라 달라질 수 있다. 본원의 방법은 라이게이즈 비의존성 DNA 연결방법에 유효하게 사용될 수 있으며, 이 경우 오버행에 의해 제공되는 단일가닥 간의 상보성으로 인한 충분한 결합력을 제공할 수 있으며, 2차 구조가 형성되지 않는 범위의 길이로 형성되어야 한다. 이러한 오버행의 길이는 예를 들면 약 5 nt 내지 100 nt, 약 5 nt 내지 약 50 nt 길이이다. 5 nt 보다 작은 경우는 상보성에 의한 결합력이 약해서 어닐링이 잘 일어나지 않을 수 있고(도 6 의 A 참조), 100 nt를 넘는 경우 분자내 2차 구조 형성으로 인해, 어닐링의 효율이 떨어질 수 있다(도 6의 C 참조).
상술한 조건을 만족하기 위한 오버행을 형성하기 위한, 엑소뉴클리아제 기능이 있는 폴리머라제와 3'→5' 엑소뉴클리아제 활성만이 불활성화된 exo- 돌연변이의 비는 따라서 구체적 오버행 길이에 따라 달라질 수 있으며, 또한 사용되는 구체적 폴리머라제 및 돌연변이로 인한 3'→5' 엑소뉴클리아제 활성 정도, 기타 반응 조건에 따라 달라질 수 있다. 한 구현예에서는 KOD 및 3'→5' 엑소뉴클리아제 활성이 전부 상실된 KOD가 사용되며, 약 14nt 길이의 오버행을 생성하기 위해, 상기 폴리머라제는 약 1 대 4의 몰비로 사용된다. 3'→5' 엑소뉴클리아제의 활성으로 5' 오버행이 생성되며, 연결에 참여하는 모든 dsDNA의 오버행의 길이는 동일하지 않을 수 있으며, 또한 오버행의 전체 서열에 걸쳐 상보적이지 않을 수 있고, 이에 따라 상보적 오버행간에 결합이 일어난 후 갭이 존재할 수 있다. 이러한 갭은 박테리아와 같은 세포에서 증폭시 채워지게 된다.
엑소뉴클리아제 기능이 있는 폴리머라제의 반응 조건은 공지되어 있는 것으로 당업자라면 본원의 목적을 고려하여 적절한 조건을 선택할 수 있을 것이다.
예를 들면 엑소뉴클리아제 기능이 있는 대부분의 폴리머라제는 기능을 위해 이가 양이온을 필요로 한다. 이러한 양이온은 마그네슘 또는 망간을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 이러한 양이온은 DNA 증폭이 이루어지기 위한 정도의 양으로 사용되거나 또는 엑소뉴클리아제 활성이 발생할 수 있을 정도의 양으로 사용된다. 반응시간은 사용되는 구체적인 폴리머라제 및 사용되는 이가양이온의 종류, 배양온도에 따라 달라진다. 적절한 반응시간은 예를 들면 약 1분 내지 약 100분이나, 이로 제한하는 것은 아니다.
반응온도는 주로 사용되는 DNA 폴리머라제의 특성에 따라 결정된다. 온도의 상한은 폴리머라제의 안정성 여부에 따라 결정되고, 온도의 하한은 폴리머라제의 활성에 따라 결정된다. 예를 들면 호열성 DNA 폴리머라제의 경우, 반응온도는 -20℃ 내지 105℃, 특히 4 ℃ 내지 95 ℃ 이다. 한 구현예에서는 10 ℃ 내지 50 ℃이다.
다른 양태에서 본원은 또한 상기 방법에 사용되는 엑소뉴클리아제 기능이 있는 폴리머라제와 3'→5' 엑소뉴클리아제 활성만이 불활성화된 exo- 돌연변이의 조합을 포함하는 라이게이즈 비의존성 DNA 라이게이션 조성물 또는 키트에 관한 것이다. 본원에 따른 키트 또는 조성물에 포함되는 상기 폴리머라제는 상술한 바와 같다. 키트에 포함되는 폴리머라제의 경우, 각 폴리머라제는 혼합되어 또는 개별적으로 포함될 수 있다. 개별적으로 포함되는 경우, 사용 전에 적절한 비로 혼합되어 사용된다. 키트는 또한 용도에 맞는 사용안내서를 추가로 포함할 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 상술한 오버행 조절 방법을 이용하는 이중가닥 DNA (dsDNA) 연결 방법에 관한 것이다. 본원에 따른 방법은 상보적 말단을 갖는 두 개 이상의 선형 dsDNA 제공하는 단계; 상기 선형 dsDNA를 엑소뉴클리아제 활성을 갖는 폴리머라제 및 상기 폴리머라제와 동일 또는 상이한 것으로 엑소뉴클리아제 활성이 일부 또는 전부 상실된 폴리머라제의 혼합물과 반응하는 단계; 상기 두 개 이상의 선형 dsDNA는 상기 혼합물로의 처리에 의해 그 말단에 약 5-100 nt의 오버행이 생성되고, 상기 오버행간의 상보적 결합에 의해 상기 두 개 이상의 선형 dsDNA가 서로 결합되는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 연결 방법은 DNA 클로닝 방법으로 이 경우, 상기 두 개 중 하나의 dsDNA는 클로닝 벡터이고, 상기 방법은 상기 dsDNA 결합 단계 후에, 상기 결합물을 박테리아에 형질전환하는 단계를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 벡터란, 재조합 벡터, 클로닝 벡터, 발현 벡터와 상호교환적으로 사용되는, 원핵 및/또는 진핵 세포에서 자가 복제가 가능한 DNA 분자를 일컫는 것으로, 일반적으로 유전자 또는 DNA 단편을 세포 등으로 전달하기 위한 중간 전달체로 사용된다. 벡터는 통상 원핵 및/또는 진핵세포에서 복제할 수 있는 복제원점, 항생제 분해 효소와 같은 특정 조건/물질에 저항성을 부여할 수 있는 선별 마커 유전자, 진핵 또는 원색 세포에서의 유전자의 전사가 가능한 프로모터, 번역이 가능한 서열을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
칼슘포스페이트 법, 전기 천공, 샷건 방법등 박테리아에 형질전환 방법 및 이에 사용되는 박테리아는 공지되어 있으며, 당업자라면 구체적 실험목적에 따라 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다.
본원에 따른 일 구현예에서 상기 엑소뉴클리아제는 교정기능이 있는 DNA 폴리머라제이며 이에 관하여는 앞서 언급한 바와 같다.
본원의 방법에서 클로닝에 사용되는 dsDNA는 PCR 산물 또는 화학적 합성법으로 제작된 올리고뉴클레오타이드와 같은 합성 DNA, 또는 세포 또는 조직 유래의 유전체 DNA 또는 벡터이다. 이러한 dsDNA는 선형이 아닌 경우 제한효소 처리 등과 같은 적절한 공지된 방법에 의해 선형화될 수 있다.
두 개 이상의 본원 방법에 사용되는 dsDNA는 결합을 위해 각각 그 말단에 서로 상보적인 특정 길이의 서열을 포함한다. 상보적 서열은 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 도입될 수 있으며, 이러한 상보적 서열은 제한효소 처리, 특정 서열을 갖는 프라이머를 이용한 PCR, inverse PCR 등으로 생성될 수 있다.
이러한 상보적 말단을 갖는 두 개 이상의 dsDNA는 dNTP의 부재하에서, 엑소뉴클리아제 활성을 갖는 폴리머라제 및 상기 폴리머라제와 동일 또는 상이한 것으로 엑소뉴클리아제 활성이 일부 또는 전부 상실된 폴리머라제의 혼합물로 처리시 오버행이 생성되고, 말단의 상보적 결합에 의해 연결된다. 결합 후 오버행의 길이, 상보성이 있는 부분의 정도에 따라 갭이 생성될 수 있으며, 갭은 형질전환으로 박테리아에 도입시 복제과정에서 갭부위에 상응하는 상보적 서열로 메꾸어지게 된다.
본원의 방법에 사용될 수 있는 엑소뉴클리에이즈의 종류 및 혼합비, 반응 조건은 앞서 설명한 바와 같다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 경쟁적 억제 방식을 통한 5' 오버행 길이 조절
경쟁적 억제를 통한 오버행 길이 조절여부를 다음과 같이 수행하였다. 야생형 3'→5' 엑소뉴클리아제로 Thermococcus kodakaraensis KOD1 유래 KOD 및 야생형과 동일하나 3'→5' 엑소뉴클리아제 활성만이 특이적으로 불활성화된 exo- KOD 폴리머라제 돌연변이(N210D, 210번째 아미노산을 아스파라진이 아스파르트산으로 치환)를 다음 문헌에 기재된 바와 같이 제작하여 대장균에서 발현하여 사용하였다. (Nishioka M, et al., 2001. Long and accurate PCR with a mixture of KOD DNA polymerase and its exonuclease deficient mutant enzyme. J Biotechnol. 2001 Jun 15;88(2):141-9.)
경쟁적 억제 실험을 위해 우선 야생형 KOD 폴리머라제를 10 fmol 로 고정한 다음 여기에 exo- 돌연변이 KOD 폴리머라제를 5 fmol부터 40 fmol 까지 서서히 증가시키면서 DNA 단편과 37에서 15분간 반응시켰다. 사용한 DNA 단편은 다음과 같이 준비하였다. 사용한 DNA 서열: Forward strand 5'-CGAACAATTCAGCGGCTTTAACCGGACGCTCGACGCCATTAATAATGTTTTC-3' 52 nt, Reverse strand 5'-GAAAACATTATTAATGGCGTCGAGCGTCCGGTTAAAGCCGCTGAATTGTTCG-3' 52 nt, Fowrard strand의 5에 [32P] 로 표지한 다음 Reverse strand와 섞어서 100에서 5 분간 변성시킨 다음 서서히 식히면서 어닐링시켜서 dsDNA를 제작하였다. 상기 두 가닥 DNA는 완벽히 상보적이기 때문에 말단의 형태는 블런트이다. 버퍼는 50 mM Tris-HCl pH 7.9, 70 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 5 mM MgCl2, 0.01 mg/ml BSA, 1 mM dithiothreitol을 포함한다.
결과는 도 3에 기재되어 있다. 도 3에 나타난 바와 같이 야생형 KOD 만 넣어준 경우에는 3' 말단으로부터 14 nt 가 잘려진 산물 (upper product, 38 nt)의 비율이 28% 에 불과했지만 exo- 돌연변이 KOD 폴리머라제를 추가한 경우 최대 46% 까지 약 2배 증가한 것을 확인 할 수 있었다.
대조적으로 3' 말단으로부터 15nt ~ 40nt 정도 잘려진 산물 (lower product, 12~32 nt)의 양은 돌연변이를 사용하지 않은 경우와 비교하여 약 절반가량으로 감소한 것으로 나타났다.
모든 반응에서 exo- 돌연변이 KOD 폴리머라제의 첨가는 전체 생성 산물의 양에 큰 영향을 주지 않았다 (도 3의 A, Total cleaved).
이러한 결과는 야생형 KOD 폴리머라제와 exo- 돌연변이 KOD 폴리머라제를 함께 사용한 경우, 야생형 KOD 폴리머라제의 활성을 경쟁적으로 억제하여 최적 길이의 5' 오버행을 생성할 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 2 경쟁적 억제방법에 의한 클로닝 효율 향상
야생형 KOD 폴리머라제와 exo- 돌연변이 KOD 폴리머라제를 함께 사용하여 5' 오버행을 최적의 길이로 조절한 경우 실제로 클로닝 효율을 증대시키는지 알아보기 위해 다음의 같이 실험을 수행하였다.
야생형 KOD 폴리머라제 0.5 pmol을 기준으로, 야생형 KOD 폴리머라제와 exo- 돌연변이 KOD 폴리머라제 효소는 1:0, 1:1, 및 1:4 의 몰비로 사용하였다. 상기 각 비율의 혼합 효소를 2 kb의 블런트 말단을 갖는 PCR 단편 40 ng과 SmaI으로 선형화된 pUC19 벡터 80 ng와 함께 37에서 15분간 DNA 연결 반응을 수행하였으며, 버퍼는 실시예 1과 동일하다.
반응 후 산물을 E. coli DH5 알파에 칼슘포스페이트 방법으로 형질전환 한 후 암피실린을 포함하는 플레이트에 도말한 후 37℃에서 콜로니가 형성될 때가지 배양하였다.
결과는 도 4에 기재되어 있다. 도 4에 나타난 바와 같이, 야생형 KOD 폴리머라제와 exo- 돌연변이 KOD 폴리머라제의 비율을 1:0, 1:1, 그리고 1:4 비율로 사용한 결과 exo- 돌연변이 KOD 폴리머라제를 첨가한 경우 콜로니의 수가 최대 2배 이상 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 사용한 세 가지 조건에서 모두 90% 이상의 클로닝 성공률을 나타내었다. 또한 4℃, 25℃, 37℃, 및 50℃에서 동일한 실험을 수행한 결과 다른 온도에서 보다 37℃에서 2~3배 이상 콜로니가 생성되었다.
이러한 결과는 경쟁적 억제 방식을 통해, 5' 오버행의 길이를 최적으로 조절하여 클로닝 효율을 향상시킬 수 있음을 나타내는 것이다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (15)

  1. 선형 이중가닥 DNA를 제공하는 단계; 및
    상기 DNA를, 엑소뉴클리아제 활성을 갖는 폴리머라제 및 상기 폴리머라제와 동일 또는 상이한 것으로 엑소뉴클리아제 활성이 일부 또는 전부 상실된 폴리머라제로 처리하는 단계를 포함하며, 상기 이중가닥 DNA의 말단은 블런트, 5오버행 또는 3' 오버행인, 경쟁적 억제 방식에 의한 DNA 오버행 길이 조절 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 엑소뉴클리아제 활성은 5' 또는 3' 방향의 활성을 갖는 것인, 경쟁적 억제 방식에 의한 DNA 오버행 길이 조절 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 엑소뉴클리아제는 교정기능이 있는 DNA 폴리머라제인, 경쟁적 억제 방식에 의한 DNA 오버행 길이 조절 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 엑소뉴클리아제 활성을 갖는 폴리머라제는 Taq 폴리머라제, Phi29 DNA 폴리머라제, Pyrococcus-유사 폴리머라제, Vent DNA 폴리머라제, Pfx DNA 폴리머라제, Pfu DNA 폴리머라제, E. coli DNA 폴리머라제, T7 DNA 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제, Pyrococcus species GB-D 유래의 DNA 폴리머라제, Thermococcus litoralis 유래의 DNA 폴리머라제, 또는 Thermococcus kodakaraensis KOD1 유래의 DNA 폴리머라제를 포함하는 것인, 경쟁적 억제 방식에 의한 DNA 오버행 길이 조절 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 엑소뉴클리아제 활성을 갖는 폴리머라제는 백시니아바이러스, 폭스바이러스, 허피스바이러스, 아데노바이러스, 이리도바이러스, 바큘로바이러스를 포함하는 바이러스 유래 또는 사카로마이세스 서레비시에 (S. cerevisiae)를 포함하는 진균류 유래인, 경쟁적 억제 방식에 의한 DNA 오버행 길이 조절 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 엑소뉴클리아제 활성을 갖는 폴리머라제 및 엑소뉴클리아제 활성이 일부 또는 전부 상실된 폴리머라제는 상기 DNA의 말단에 5 내지 100 nt 길이의 오버행이 형성될 수 있는 비로 혼합되는 것인, 경쟁적 억제 방식에 의한 DNA 오버행 길이 조절 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 엑소뉴클리아제 활성을 갖는 폴리머라제 및 엑소뉴클리아제 활성이 일부 또는 전부 상실된 폴리머라제는 1~100 대 1~100의 몰비로 사용되는 것인, 경쟁적 억제 방식에 의한 DNA 오버행 길이 조절 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 4 ~ 72℃에서 1 내지 60분간 수행되는 것인, 경쟁적 억제 방식에 의한 DNA 오버행 길이 조절 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용되는 엑소뉴클리아제 활성을 갖는 폴리머라제 및 엑소뉴클리아제 활성이 일부 또는 전부 상실된 폴리머라제를 포함하는, 라이게이즈 비의존성 DNA 연결용 키트.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 엑소뉴클리아제 활성을 갖는 폴리머라제 및 엑소뉴클리아제 활성이 일부 또는 전부 상실된 폴리머라제는 별개로 또는 혼합된 상태로 포함되는 것인, 라이게이즈 비의존성 DNA 연결용 키트.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 엑소뉴클리아제 활성을 갖는 폴리머라제 및 엑소뉴클리아제 활성이 일부 또는 전부 상실된 폴리머라제는 1~100 대 1~100의 몰비로 혼합되는 것인, 라이게이즈 비의존성 DNA 연결용 키트.
  12. 이중가닥 DNA (dsDNA) 연결 방법으로, 상기 방법은
    상보적 말단을 갖는 두 개 이상의 선형 dsDNA 제공하는 단계;
    상기 선형 dsDNA를 엑소뉴클리아제 활성을 갖는 폴리머라제 및 상기 폴리머라제와 동일 또는 상이한 것으로 엑소뉴클리아제 활성이 일부 또는 전부 상실된 폴리머라제의 혼합물과 반응하는 단계;
    상기 두 개 이상의 선형 dsDNA는 상기 혼합물로의 처리에 의해 그 말단에 5-100nt의 오버행이 생성되고, 상기 오버행간의 상보적 결합에 의해 상기 두 개 이상의 선형 dsDNA가 서로 결합되는 단계를 포함하는, 이중가닥 DNA 연결방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 두 개 중 하나의 dsDNA는 클로닝 벡터이고, 상기 방법은 상기 dsDNA 결합 단계 후에, 상기 결합물을 박테리아에 형질전환하는 단계를 포함하는 것인, 이중가닥 DNA 연결방법.
  14. 제 12 항에 있어서,
    상기 엑소뉴클리아제는 교정기능이 있는 DNA 폴리머라제인, 이중가닥 DNA 연결방법.
  15. 제 12 항에 있어서,
    상기 엑소뉴클리아제 활성을 갖는 폴리머라제 및 엑소뉴클리아제 활성이 일부 또는 전부 상실된 폴리머라제는 1~100 대 1~100의 몰비로 사용되는 것인, 이중가닥 DNA 연결방법.
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