JP6028109B2 - 二本鎖dna末端の一本鎖の長さ調節方法 - Google Patents
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Description
(実施例)
[実施例1:競争的抑制方式による5’オーバーハング長さの調節]
競争的抑制によるオーバーハング長さ調節の有無を次の通り行った。野生型3’→5’エキソヌクレアーゼでThermococcus kodakaraensis KOD1由来KOD及び野生型と同じであるが3’→5’エキソヌクレアーゼ活性だけが特異的に不活性化されたexo−KODポリメラーゼ突然変異(N210D、210番目アミノ酸をアスパラギンがアスパラギン酸に置換)を次の文献に記載された通り製作して大腸菌で発現して用いた。(Nishioka M,et al.,2001.Long and accurate PCR with a mixture of KODDNA polymerase and its exonuclease deficient mutant enzyme.J Biotechnol.2001Jun 15;882:141-9.)
競争的抑制実験のために、まず野生型KODポリメラーゼを10fmolで固定した後、そこにexo−突然変異KODポリメラーゼを5fmolから40fmolまで徐々に増加させながらDNA断片と37で15分間反応させた。用いられたDNA断片は次の通り準備した。用いられたDNA配列:Forward strand
5’−CGAACAATTCAGCGGCTTTAACCGGACGCTCGACGCCATTAATAATGTTTTC−3’52 nt,Reverse strand
5’−GAAAACATTATTAATGGCGTCGAGCGTCCGGTTAAAGCCGCTGAATTGTTCG−3’52 nt,Fowrard strandの5に[32P]と標識した後、Reverse strandと混ぜて100℃で5分間変成させた後、徐々に冷ましながらアニーリングしてdsDNAを作製した。前記二本鎖DNAは、完全に相補的であるため、末端の形態は平滑である。バッファーは、50mMのTris−HCl pH7.9、70mMのNaCl、0.1%のTriton X−100、5mMのMgCl2、0.01mg/mlのBSA、1mMのジチオトレイトール(DTT)を含む。
野生型KODポリメラーゼと、exo−突然変異KODポリメラーゼとを共に用いて、5’オーバーハングを最適な長さに調節した場合、実際クローニング効率を増大させるかを調べるために次のように実験を行った。
Claims (15)
- 線形二本鎖DNAを提供する工程と、前記DNAを、エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ及び、前記ポリメラーゼと同じか異なるものでありエキソヌクレアーゼ活性が全部失われたポリメラーゼにより処理する工程と、を含み、
前記二本鎖DNAの末端は、平滑(blunt)、5オーバーハング(overhang)または3’オーバーハングであることを特徴とする、競争的抑制方式によるDNAオーバーハング長さ調節方法。 - 前記エキソヌクレアーゼ活性は、5’または3’方向の活性を持つことを特徴とする、請求項1に記載の競争的抑制方式によるDNAオーバーハング長さ調節方法。
- 前記エキソヌクレアーゼは、校正機能があるDNAポリメラーゼであることを特徴とする、請求項1に記載の競争的抑制方式によるDNAオーバーハング長さ調節方法。
- 前記エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼは、Taqポリメラーゼ、Phi29 DNAポリメラーゼ、Pyrococcus−類似ポリメラーゼ、Vent DNAポリメラーゼ、Pfx DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、E.coli DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、Pyrococcus species GB−D由来のDNAポリメラーゼ、Thermococcus litoralis由来のDNAポリメラーゼ、またはThermococcus kodakaraensis KOD1由来のDNAポリメラーゼを含むことを特徴とする、請求項1に記載の競争的抑制方式によるDNAオーバーハング長さ調節方法。
- 前記エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼは、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、イリドウイルス、バキュロウイルスを含むウイルス由来またはサッカロマイセス・セレビシエ(S.cerevisiae)を含む真菌類由来であることを特徴とする、請求項1に記載の競争的抑制方式によるDNAオーバーハング長さ調節方法。
- 前記エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性が全部失われたポリメラーゼは、前記DNAの末端に5乃至100nt長さのオーバーハングが形成されることができる比で混合されることを特徴とする、請求項1に記載の競争的抑制方式によるDNAオーバーハング長さ調節方法。
- 前記エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性が全部失われたポリメラーゼは、1〜100:1〜100のモル比で用いられることを特徴とする、請求項1に記載の競争的抑制方式によるDNAオーバーハング長さ調節方法。
- 前記方法は、4℃〜72℃で1乃至60分間実行されることを特徴とする、請求項1乃至7のうちいずれか一つに記載の競争的抑制方式によるDNAオーバーハング長さ調節方法。
- 請求項1乃至7のうちいずれか一つに記載の方法に用いられるエキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性が全部失われたポリメラーゼを含むことを特徴とする、リガーゼ非依存性DNA連結用キット。
- 前記エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性が全部失われたポリメラーゼは、別々にまたは混合された状態で含まれることを特徴とする、請求項9に記載のリガーゼ非依存性DNA連結用キット。
- 前記エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性が全部失われたポリメラーゼは、1〜100:1〜100のモル比で混合されることを特徴とする、請求項10に記載のリガーゼ非依存性DNA連結用キット。
- 二本鎖DNA(dsDNA)連結方法において、
前記方法は、相補的末端を持つ二つ以上の線形dsDNAを提供する工程と、
前記線形dsDNAを、エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ及び、前記ポリメラーゼと同じか異なるものでありエキソヌクレアーゼ活性が全部失われたポリメラーゼの混合物と反応する工程と、
前記二つ以上の線形dsDNAは前記混合物での処理によってその末端に5−100ntのオーバーハングが生成されて、前記オーバーハング間の相補的結合によって前記二つ以上の線形dsDNAが互いに結合する工程と、
を含むことを特徴とする、二本鎖DNA連結方法。 - 前記二つの中一つのdsDNAは、クローニングベクターであり、前記方法は、前記dsDNA結合工程後に、前記結合物をバクテリアに形質転換する工程を含むことを特徴とする、請求項12に記載の二本鎖DNA連結方法。
- 前記エキソヌクレアーゼは、校正機能があるDNAポリメラーゼであることを特徴とする、請求項12に記載の二本鎖DNA連結方法。
- 前記エキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性が全部失われたポリメラーゼは、1〜100:1〜100のモル比で用いられることを特徴とする、請求項12に記載の二本鎖DNA連結方法。
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