JP6594955B2 - シントン形成 - Google Patents
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Description
別段の定めがない限り、本明細書中で使用されている技術用語及び科学用語はすべて本発明が属する業界の当業者が一般的に理解しているのと同じ意味を有する。Singletonら,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY,第2版,John Wiley and Sons,New York(1994)及びHale & Markham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,N.Y.(1991)は当業者に本明細書中で使用されている多くの用語の一般的意味を定めている。また、言及を明確及び容易にするために特定の用語を以下に定義する。
各種実施形態をより詳細に説明する前に、本開示内容の教示は記載されている具体的実施形態に限定されず、よってもちろん変更し得ることを理解すべきである。本教示内容の範囲は添付されている特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書中で使用されている用語は具体的実施形態を説明する目的だけであり、限定的であると意図されないことも理解すべきである。
本発明により、上記した本方法を実施するためのキットをも提供する。ある実施形態では、本キットは、i.5’−3’エキソヌクレアーゼ、ii.任意成分のリガーゼ、iii.鎖置換ポリメラーゼ;及びiv.ss DNA結合タンパク質を含み得る。キットの成分は1つの容器中で組み合わされ得、または各成分がそれ自体の容器中に存在し得る。例えば、キットの成分を1つの反応チューブ中で、または1つ以上の異なる反応チューブ中で組み合わせてもよい。このキットの成分の更なる詳細は上記されている。キットは例えば実行しようとする方法に依存して方法で使用され得る上記した及び下記する他の試薬、ミスマッチ修復酵素、例えばmutHLS、cel−1ヌクレアーゼ、T7エンド1、uvrD、T4 EndoVII、E.coliEndoV、緩衝剤、dNTPs、シントンを挿入するプラスミド及び/またはプラスミドを受け取るためのコンピテント細胞、コントロール等も含み得る。幾つかの実施形態では、キットは非鎖置換ポリメラーゼ及び/またはクラウディング剤を含まない。
鎖置換ポリメラーゼと非鎖置換ポリメラーゼを区別するためにアッセイを開発した。10nM FAMプライマー/テンプレート/遮断オリゴヌクレオチド、1×THERMOPOL(R)緩衝液(New England Biolabs,マサチューセッツ州イプスウイッチ)(図1A)及び0.1mM dNTPを含有する10μlの反応物を調製した。図1Bは、ポリメラーゼを欠くFAM標識プライマーである対照である。反応物に鎖置換DNAポリメラーゼを添加し、1μlの10倍希釈したサンプルと50℃で30分間インキュベートし、キャピラリー電気泳動により分析すると、FAMプライマーが置換された遮断オリゴヌクレオチドを介して延長した。結果を図1D〜1Eに示す。確認された鎖置換ポリメラーゼであるBstポリメラーゼについて図2D中のピークの位置は非天然ポリメラーゼのSPB49Fについて観察されたピークに相当する。Bstポリメラーゼ複製の産物は3’dAを有するように、Bstポリメラーゼ中に存在しない3’−5’エキソヌクレアーゼ活性から生ずるSPB49Fにより生じた平滑末端から、小さいサイズシフトが得られる。図1Cは、合成が遮断プライマーで停止する非鎖置換ポリメラーゼ−T4DNAポリメラーゼの産物を示す。
プラスミドA、B、C、D及びEは、PCR産物(一緒にLacI遺伝子及びLacZ遺伝子の領域をカバーする断片(Frag.)1、2、3、4、5)からNEB(R)PCRクローニングキット(New England Biolabs,マサチューセッツ州イプスウイッチ)を用いて別々に構築した。
ヒト(H.sapiens)由来の遺伝子を標的化するためにsgRNAに対応するオリゴヌクレオチドを以下のように設計した:
1. PAM配列を所望標的配列についてスキャンした。例えば、
Claims (26)
- (i)5’−3’エキソヌクレアーゼ;及び
(ii)ポリメラーゼ融合タンパク質
を含む、シントンを集合させるための組成物であって、
前記ポリメラーゼ融合タンパク質は、
(a)配列番号2又は56〜96のいずれかに少なくとも90%同一であるアミノ酸配列、及び、異種鎖置換ポリメラーゼを含む、又は、
(b)配列番号1、33〜55又は102のいずれかに少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するポリメラーゼドメイン、及び、異種DNA結合ドメインを含む、
組成物。 - ポリメラーゼ融合タンパク質が、(a)に定義されるものであり、配列番号2に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
- ポリメラーゼ融合タンパク質が、(a)に定義されるものであり、鎖置換ポリメラーゼが、耐熱性である、請求項1又は2に記載の組成物。
- ポリメラーゼ融合タンパク質が、(a)に定義されるものであり、鎖置換ポリメラーゼはファミリーBポリメラーゼである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- ポリメラーゼ融合タンパク質が、(b)に定義されるものであり、配列番号1又は配列番号102に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するポリメラーゼドメインを含む、請求項1に記載の組成物。
- ポリメラーゼ融合タンパク質は、配列番号3に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。
- 5’−3’エキソヌクレアーゼは、一本鎖エンドヌクレアーゼ活性を有し、及び/又は、5’−3’エキソヌクレアーゼは配列番号98に少なくとも90%の同一性を有し、及び/又は、5’−3’エキソヌクレアーゼはT5エキソヌクレアーゼである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
- 一本鎖DNA結合タンパク質をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
- 一本鎖DNA結合タンパク質は、超耐熱性一本鎖DNA結合タンパク質(ET SSB)、E.coli recA、T7遺伝子2.5産物、ファージλRedB、又はRacプロファージRecTである、請求項8に記載の組成物。
- リガーゼをさらに含む、請求項1〜9に記載の組成物。
- リガーゼが、耐熱性である、請求項10に記載の組成物。
- dNTP及び/又は少なくとも7mMの濃度を有するカリウム塩をさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の組成物。
- クラウディング剤及び/又は非鎖置換ポリメラーゼを含まない、請求項1〜12のいずれか一項に記載の組成物。
- ポリヌクレオチドのセットをさらに含み、前記セット中の少なくとも1つのポリヌクレオチドは、セット中の別のポリヌクレオチドと重複する配列を有し、前記ポリヌクレオチドは、
(i)二本鎖ポリヌクレオチド、
(ii)一本鎖オリゴヌクレオチド、
(iii)少なくとも1つの二本鎖ポリヌクレオチド及び少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチド、並びに
(iv)亜集団のメンバー間で異なる配列を除いて相互に同一であるポリヌクレオチドの亜集団
から選択される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物。 - (a)請求項1〜6のいずれか一項に定義されるポリメラーゼ融合タンパク質、
(b)5’−3’エキソヌクレアーゼ、及び
(c)一本鎖DNA結合タンパク質
を含む、ポリヌクレオチド集合のためのキットであって、前記(a)〜(c)は、同じ容器中、又は異なる容器中に存在する、キット。 - 5’−3’エキソヌクレアーゼは、T5エキソヌクレアーゼであり、及び/又は、一本鎖DNA結合タンパク質は、超耐熱性一本鎖DNA結合タンパク質(ET SSB)、E.coli recA、T7遺伝子2.5産物、ファージλRedB、又はRacプロファージRecTである、請求項15に記載のキット。
- リガーゼ及び/又はdNTPs及び/又は緩衝剤をさらに含む、請求項15又は16に記載のキット。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物と、ポリヌクレオチドのセットをインキュベートする工程と、ここで、個々のポリヌクレオチドは、他のポリヌクレオチド中の配列と重複する配列を含み、異なるポリヌクレオチドの重複する配列は、適切な反応条件下でクロスハイブリダイジングすることができる、
前記ポリヌクレオチドを結合してシントンを産生する工程と
を含むシントンの産生方法。 - セット中の1つ以上のポリヌクレオチドは、二本鎖である、又は、
ポリヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチドである、又は、
ポリヌクレオチドのセットは、少なくとも1つの二本鎖ポリヌクレオチド及び少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドを含む、
請求項18に記載の方法。 - ポリヌクレオチドのセットは、請求項14に定義されるものである、請求項18又は19に記載の方法。
- 一又は複数の二本鎖ポリヌクレオチドは、重複PCR産物若しくは重複制限断片である、又は一本鎖オリゴヌクレオチドから集合している、請求項19又は20に記載の方法。
- ヌクレオチドのセットの少なくとも1つのメンバーは、定義された配列末端の間にランダム配列を含む、請求項18〜21のいずれか一項に記載の方法。
- ゲノムDNAとのハイブリダイズ活性についてランダム配列をスクリーニングする工程と、前記ハイブリダイズ活性によってランダム配列を同定する工程とをさらに含む、及び/又は、
RNAを形成するためにハイブリダイズ活性によるランダム配列の転写によって遺伝子編集を行う工程と、Casタンパク質の存在下で遺伝子編集のために前記RNAを用いる工程とをさらに含む、
請求項22に記載の方法。 - 重複している配列は、2キロベース未満の長さである、請求項18〜23のいずれか一項に記載の方法。
- ポリメラーゼ融合タンパク質が、配列番号3に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項18〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 組成物は、リガーゼ及び/又は一本鎖DNA結合タンパク質を含む、請求項18〜25のいずれか一項に記載の方法。
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