JP2017525376A - シントン形成 - Google Patents
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Abstract
Description
別段の定めがない限り、本明細書中で使用されている技術用語及び科学用語はすべて本発明が属する業界の当業者が一般的に理解しているのと同じ意味を有する。Singletonら,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY,第2版,John Wiley and Sons,New York(1994)及びHale & Markham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,N.Y.(1991)は当業者に本明細書中で使用されている多くの用語の一般的意味を定めている。また、言及を明確及び容易にするために特定の用語を以下に定義する。
各種実施形態をより詳細に説明する前に、本開示内容の教示は記載されている具体的実施形態に限定されず、よってもちろん変更し得ることを理解すべきである。本教示内容の範囲は添付されている特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書中で使用されている用語は具体的実施形態を説明する目的だけであり、限定的であると意図されないことも理解すべきである。
本発明により、上記した本方法を実施するためのキットをも提供する。ある実施形態では、本キットは、i.5’−3’エキソヌクレアーゼ、ii.任意成分のリガーゼ、iii.鎖置換ポリメラーゼ;及びiv.ss DNA結合タンパク質を含み得る。キットの成分は1つの容器中で組み合わされ得、または各成分がそれ自体の容器中に存在し得る。例えば、キットの成分を1つの反応チューブ中で、または1つ以上の異なる反応チューブ中で組み合わせてもよい。このキットの成分の更なる詳細は上記されている。キットは例えば実行しようとする方法に依存して方法で使用され得る上記した及び下記する他の試薬、ミスマッチ修復酵素、例えばmutHLS、cel−1ヌクレアーゼ、T7エンド1、uvrD、T4 EndoVII、E.coliEndoV、緩衝剤、dNTPs、シントンを挿入するプラスミド及び/またはプラスミドを受け取るためのコンピテント細胞、コントロール等も含み得る。幾つかの実施形態では、キットは非鎖置換ポリメラーゼ及び/またはクラウディング剤を含まない。
鎖置換ポリメラーゼと非鎖置換ポリメラーゼを区別するためにアッセイを開発した。10nM FAMプライマー/テンプレート/遮断オリゴヌクレオチド、1×THERMOPOL(R)緩衝液(New England Biolabs,マサチューセッツ州イプスウイッチ)(図1A)及び0.1mM dNTPを含有する10μlの反応物を調製した。図1Bは、ポリメラーゼを欠くFAM標識プライマーである対照である。反応物に鎖置換DNAポリメラーゼを添加し、1μlの10倍希釈したサンプルと50℃で30分間インキュベートし、キャピラリー電気泳動により分析すると、FAMプライマーが置換された遮断オリゴヌクレオチドを介して延長した。結果を図1D〜1Eに示す。確認された鎖置換ポリメラーゼであるBstポリメラーゼについて図2D中のピークの位置は非天然ポリメラーゼのSPB49Fについて観察されたピークに相当する。Bstポリメラーゼ複製の産物は3’dAを有するように、Bstポリメラーゼ中に存在しない3’−5’エキソヌクレアーゼ活性から生ずるSPB49Fにより生じた平滑末端から、小さいサイズシフトが得られる。図1Cは、合成が遮断プライマーで停止する非鎖置換ポリメラーゼ−T4DNAポリメラーゼの産物を示す。
プラスミドA、B、C、D及びEは、PCR産物(一緒にLacI遺伝子及びLacZ遺伝子の領域をカバーする断片(Frag.)1、2、3、4、5)からNEB(R)PCRクローニングキット(New England Biolabs,マサチューセッツ州イプスウイッチ)を用いて別々に構築した。
ヒト(H.sapiens)由来の遺伝子を標的化するためにsgRNAに対応するオリゴヌクレオチドを以下のように設計した:
1. PAM配列を所望標的配列についてスキャンした。例えば、
Claims (64)
- (a)5’−3’エキソヌクレアーゼ;
(b)鎖置換ポリメラーゼ;
(c)場合により、一本鎖DNA結合タンパク質;
(d)非天然緩衝剤
を含み、クラウディング剤及び/または非鎖置換ポリメラーゼを含まない、シントンを集合させるための組成物。 - 更にリガーゼ及び/または一本鎖結合ドメインを含む、請求項1に記載の組成物。
- 更に少なくとも2つのポリヌクレオチドのセットを含む、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記鎖置換ポリメラーゼは非天然である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記鎖置換ポリメラーゼは変異体または融合タンパク質である、請求項4に記載の組成物。
- 前記鎖置換ポリメラーゼは耐熱性である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記鎖置換ポリメラーゼはファミリーBポリメラーゼであり、前記組成物は非鎖置換ポリメラーゼを除外している、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
- 9°N、Phusion、Vent、またはPfu DNAポリメラーゼを含まない、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記鎖置換ポリメラーゼが、ポリメラーゼ部分は配列番号1、配列番号102、または配列番号33〜55のいずれかに対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する融合タンパク質である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記融合タンパク質は配列番号1及び配列番号2に対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有している、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記鎖置換ポリメラーゼは配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性を有している、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記一本鎖DNA結合タンパク質は超耐熱性一本鎖DNA結合タンパク質(ET SSB)、E.colirecA、T7遺伝子2.5産物、ファージλRedB、またはRacプロファージRecTである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記5’−3’エキソヌクレアーゼは一本鎖エンドヌクレアーゼ活性を有している、請求項1〜12のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記5’−3’エキソヌクレアーゼは配列番号98と少なくとも90%の配列同一性を有している、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物。
- 更に少なくとも7mMの濃度を有するカリウム塩を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の組成物。
- 更にポリヌクレオチドのセットを含み、前記セット中の少なくとも1つのポリヌクレオチドはセット中の別のポリヌクレオチドと重複する配列を有し、前記ポリヌクレオチドは(i)二本鎖ポリヌクレオチド、(ii)一本鎖オリゴヌクレオチド、(iii)少なくとも1つの二本鎖ポリヌクレオチド及び少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチド、及び(iv)亜集団のメンバー間で異なる配列を除いて相互に同一であるポリヌクレオチドの亜集団から選択される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチドのセットの少なくとも1つのメンバーは第2の一本鎖ゲノムポリヌクレオチドにハイブリダイズするために各末端の限定配列間に位置するランダム配列を含む、請求項の1〜16のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ランダム配列は一本鎖であり、遺伝子編集のために標的ゲノム核酸に対してCasタンパク質をガイドするために標的ゲノム配列にハイブリダイズし得る、請求項17に記載の組成物。
- 請求項1〜15のいずれか一項に記載の組成物を適当な反応条件下でハイブリダズし得る重複配列を有する請求項16〜18のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのセットとインキュベートし、ポリヌクレオチドの少なくとも幾つかを他のポリヌクレオチドに結合してシントンを産生させることを含むシントンの形成方法。
- 前記セット中のポリヌクレオチドの全部または一部は二本鎖である、請求項19に記載の方法。
- 前記二本鎖ポリヌクレオチドは重複PCR産物、重複制限断片、または相補性一本鎖オリゴヌクレオチドから集合した合成二本鎖分子である、請求項20に記載の方法。
- 前記セット中のポリヌクレオチドの全部または一部は一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項19に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドのセットは少なくとも1つの二本鎖ポリヌクレオチド及び少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドを含む、請求項19に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドのセットは亜集団のメンバー間で異なる配列を除いて相互に同一であるポリヌクレオチドの亜集団を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドの重複配列は2キロベース未満の長さを有する、請求項19〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記鎖置換ポリメラーゼは配列番号1、2、3、33〜96、または102のいずれかに対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項19〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドのセットの少なくとも1つのメンバーは限定配列末端間にランダム配列を含む、請求項19〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 更にゲノムDNAとのハイブリダイズ活性についてランダム配列をスクリーニングし、前記ハイブリダイズ活性を有するランダム配列を同定することを含む、請求項27に記載の方法。
- 更に前記ハイブリダイズ活性を有するランダム配列を転写してRNAを形成し、前記RNAをCasタンパク質の存在下で遺伝子編集のために使用することにより遺伝子編集を実施することを含む、請求項27〜28に記載の方法。
- (a)5’−3’エキソヌクレアーゼ;
(b)鎖置換ポリメラーゼ;及び
(c)場合により、一本鎖DNA結合タンパク質
を含むキットであって、前記キットは場合によりクラウディング剤及び/または非鎖置換ポリメラーゼを含まないポリヌクレオチド集合のための前記キット。 - 更にリガーゼを含む、請求項30に記載のキット。
- 更にdNTPsを含む、請求項30または31に記載のキット。
- 更に緩衝剤を含む、請求項30〜32のいずれか一項に記載のキット。
- (a)〜(c)は1つ以上の異なる容器、例えば1つ以上の異なるストレージまたは反応容器中に存在している、請求項30〜33のいずれか一項に記載のキット。
- ポリメラーゼ融合タンパク質を含む組成物であって、前記ポリメラーゼ融合タンパク質は、
i.配列番号2、56〜96のいずれかに対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配列、及び
ii.異種ポリメラーゼドメイン
を含む前記組成物。 - 前記ポリメラーゼ融合タンパク質は
i.配列番号2に対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配列、及び
ii.異種ポリメラーゼドメイン
を含む、請求項35に記載の組成物。 - ポリメラーゼ融合タンパク質を含む組成物であって、前記ポリメラーゼ融合タンパク質は、
(a)配列番号1、33〜55、または102のいずれかに対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するポリメラーゼドメイン、及び
(b)異種DNA結合ドメイン
を含む前記組成物。 - ポリメラーゼ融合タンパク質を含み、前記ポリメラーゼ融合タンパク質は
(a)配列番号1に対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するポリメラーゼドメイン、及び
(b)異種DNA結合ドメイン
を含む、請求項37に記載の組成物 - ポリメラーゼ融合タンパク質を含み、前記ポリメラーゼ融合タンパク質は
(a)配列番号102に対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するポリメラーゼドメイン、及び
(b)異種DNA結合ドメイン
を含む、請求項37に記載の組成物。 - 前記ポリメラーゼ融合タンパク質は配列番号3に対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項35〜39のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物は更に5’−3’エキソヌクレアーゼを含む、請求項35〜40のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記5’−3’エキソヌクレアーゼはT5エキソヌクレアーゼである、請求項41に記載の組成物。
- 更に一本鎖DNA結合タンパク質を含む、請求項35〜42のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記一本鎖DNA結合タンパク質は超耐熱性一本鎖DNA結合タンパク質(ET SSB)、E.colirecA、T7遺伝子2.5産物、ファージλRedB、またはRacプロファージRecTである、請求項43に記載の組成物。
- 更にリガーゼを含む、請求項35〜44のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記リガーゼは耐熱性である、請求項45に記載の組成物。
- 前記組成物はクラウディング剤及び/または非鎖置換ポリメラーゼを含まない、請求項35〜46のいずれか一項に記載の組成物。
- 更にdNTPsを含む、請求項35〜47のいずれか一項に記載の組成物。
- 更に少なくとも7mMの濃度を有するカリウム塩を含む、請求項35〜48のいずれか一項に記載の組成物。
- 更にポリヌクレオチドのセットを含み、前記セット中の少なくとも1つのポリヌクレオチドはセット中の別のポリヌクレオチドと重複する配列を有し、前記ポリヌクレオチドは(i)二本鎖ポリヌクレオチド、(ii)一本鎖オリゴヌクレオチド、(iii)少なくとも1つの二本鎖ポリヌクレオチド及び少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチド、及び(iv)亜集団のメンバー間で異なる配列を除いて相互に同一であるポリヌクレオチドの亜集団から選択される、請求項35〜49のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項1〜18、35〜50のいずれか一項に記載のポリメラーゼを含み、更に5’−3’エキソヌクレアーゼ、及び場合によりリガーゼ及び一本鎖DNA結合タンパク質を含む組成物とポリヌクレオチドのセットをインキュベートし、前記ポリヌクレオチドを結合してシントンを産生することを含むシントンの産生方法であって、前記ポリヌクレオチドの各々が他のポリヌクレオチド中の配列と重複する配列を含み、前記異なるポリヌクレオチドの重複配列は適当な反応条件下でクロスハイブリダイジングし得る前記方法。
- 前記組成物は更にリガーゼを含む、請求項51に記載の方法。
- 前記組成物は更に一本鎖DNA結合タンパク質を含む、請求項51または52に記載の方法。
- 前記セット中の1つ以上のポリヌクレオチドは二本鎖である、請求項51〜53のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二本鎖ポリヌクレオチドは重複PCR産物、重複制限断片であり、または一本鎖オリゴヌクレオチドから集合している、請求項54に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドは一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項51〜53のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドのセットは少なくとも1つの二本鎖ポリヌクレオチド及び少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドを含む、請求項51〜56のいずれか一項に記載の方法。
- 重複している前記配列は2キロベース未満の長さを有する、請求項51〜57のいずれか一項に記載の方法。
- (a)請求項35〜40のいずれか一項に記載のポリメラーゼ融合タンパク質、
(b)5’−3’エキソヌクレアーゼ、及び
(c)場合により、一本鎖DNA結合タンパク質
を含むポリヌクレオチド集合のためのキット。 - 更にリガーゼを含む、請求項59に記載のキット。
- 更にdNTPsを含む、請求項59〜60のいずれかに記載のキット。
- 更に緩衝剤を含む、請求項59〜61のいずれか一項に記載のキット。
- (a)〜(c)は同一の容器中に存在している、請求項59〜62のいずれか一項に記載のキット。
- (a)〜(c)は異なる容器中に存在している、請求項59〜62のいずれか一項に記載のキット。
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