JP2003533979A

JP2003533979A - Ｄｎａの連結方法

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Publication number: JP2003533979A
Application number: JP2001565378A
Authority: JP
Inventors: デイビッドエイチ．エバンス; デイビッドオー．ウィラー; クシャオ−ダンヤオ
Original assignee: ユニバーシティーオブゲルフ
Priority date: 2000-03-07
Filing date: 2001-03-07
Publication date: 2003-11-18
Anticipated expiration: 2021-03-07
Also published as: JP4854160B2; ATE335827T1; EP1263973A2; CA2317865A1; WO2001066775A2; DE60122118D1; EP1263973B1; DE60122118T2; WO2001066775A3; AU2001242128A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、任意の線状鋳型DNA分子を任意の線状化ベクター中に指向的にクローニングするための方法を提供する。ベクター末端は任意の制限酵素切断によって作製しうる。本方法は連結段階を必要とせず、特定のエキソヌクレアーゼのみを伴う方法で必要とされるような、慎重に調節される条件を用いる必要もない。特定のDNAポリメラーゼが、適切な相補性のある末端を共有する1つまたは複数の線状DNA分子を効率的に連結しうることが明らかになった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、組換えDNA技術の分野におけるものである。具体的には、本発明はD
NAポリメラーゼを用いて1つまたは複数のDNA分子を指向的に連結する方法、およ
びPCR産物のクローニングへの本方法の応用に関する。

【０００２】発明の背景ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（MullisおよびFaloona 1987；Saiki, Gelfand
ら、1988）は科学研究に不可欠な手法である。PCR産物のクローニングはしばし
ば、研究目標に到達するために必須の段階である。PCRクローニングは数々の課
題を提示し、その制限を最小限にするために何年にもわたってさまざまな手法が
考案されてきた。PCR産物のクローニングは一般に以下の方法のうちの一つであ
る；i）制限酵素およびリガーゼを用いる従来のPCRクローニング、ii）Tベクタ
ーまたはTAクローニング、iii）ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）に基づくク
ローニング、iv）PCRに基づく手法、v）インビボ・リコンビナーゼ法、およびvi
）エキソヌクレアーゼを介したクローニング。これらの方法のそれぞれを以下に
説明する。

【０００３】 i）従来のPCRクローニング PCRで増幅したDNAのクローニングは従来、後にPCR産物を適切な酵素で消化し
た上で適合性のあるベクター中に挿入することが可能なように、PCRプライマー
に制限エンドヌクレアーゼ（RE）部位を組み込むことによって容易となった（Sh
arfら、1990）。この方法にしばしば起こる一つの問題は、REの認識配列がDNA基
質の末端に近い場合には公知であるように、REによる切断がうまく行われないこ
とである（KaufmanおよびEvans 1990）。第2の問題は、同じREに対する第2の制
限酵素部位が気付かれずに存在する場合、PCRで増幅した領域内部の配列が失わ
れる可能性がある点である。このため、どのREを用いるかを選択する前にPCR産
物の完全な配列が知られている必要がある。ひとたびベクターおよびDNA挿入物
を同じREで消化すれば、2つのDNA分子をDNAリガーゼによって一般に4時間〜12時
間かかる反応で共有結合させることができる。任意の連結反応の際にベクターお
よび挿入物が適切な比で存在することが重要であることに注意すべきであるが、
これはしばしば決定が困難である。次にこの反応産物を用いてコンピテント大腸
菌（E.coli）細胞を形質転換する。この主題をわずかに変更した、後に連結反応
を行う必要のない「重複伸長による連結」と呼ばれる変法が考案されているが、
これはさらに2つのプライマーを必要とし、全ベクター配列自体も増幅しなけれ
ばならない（Shuldiner、Tannerら 1991）。

【０００４】 PCR断片の平滑末端クローニングも広く用いられているが、2つの平滑末端DNA
分子を共に連結する場合にDNAリガーゼに問題が生じるため、この手法の効率は
比較的低い。この手法も、Taqポリメラーゼ（原型のPCR増幅酵素）がそのターミ
ナルトランスフェラーゼ活性によって、3'末端にアデニン残基を付加する傾向が
あるという事実により複雑になる（Clark 1988；Mole、Iggoら 1989）。Taqポリ
メラーゼを用いて生成される全PCR産物の約50％は、これらの3'伸長物を含む（C
lark、1988）。この問題に関する方法の一つは、プロトコールにもう1つ段階を
加えて、これらの付加されたアデニン残基をクレノー酵素（Hemsley、Arnheimら
1989）またはT4 DNAポリメラーゼ（CostaおよびWeiner 1994）で「研磨」また
は除去することである。

【０００５】パイロコッカス・フリオーシス（Pyrococcus furiosis）由来のPfuポリメラー
ゼおよび古細菌サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来の
Vent_Rポリメラーゼを含む、最近発見されたさまざまな耐熱性ポリメラーゼは、
固有の3'-5'エキソヌクレアーゼ活性により、3'アデニン残基の伸長を生じない
。増幅ポリメラーゼによって生じる問題に加えて、この手法では指向性クローニ
ングは可能ではなく、組換えDNAにおける挿入物の向きをあらかじめ定めること
はできないことを意味する。

【０００６】 ii）TベクターおよびTAクローニング Taqポリメラーゼのターミナルトランスフェラーゼ活性は、TAクローニングと
して現在一般的に知られている手法において、多くの研究者によって活用されて
きた。PCRで増幅したDNA上に見出される3'突出アデノシン残基に対する天然の相
補物である、チミジン残基が突出した末端が得られるように、選択したベクター
を適切なREで消化する。この手法の最も重大な欠点は、適合性のある末端が生じ
るようにベクターを特別に操作しなければならないことである。この目標を達成
する唯一の簡単な方法は、平滑末端が生じるようにベクターを制限処理した後に
、それをdTTPのみの存在下でTaqポリメラーゼで処理することである。数多くの
企業がこの手法に基づくキットを開発しており、これにはストラタジーン（Stra
tagene）社のpCR-Script（商標）SK(S) キット、プロメガ（Promega）社のpGEM
（登録商標）-T、ファルマシア（Pharmacia）社のSureClone（商標）連結キット
およびノバジェン（Novagen）社のpT7Blue Tベクターキットが含まれる。これら
の方法に対する主な制限は、製造者が供給するベクターを使わねばならず、クロ
ーニングしたDNA断片を選択したベクターに移行させる第2のサブクローニング段
階がしばしば必要なことである。これらのキットを購入する代わりとなる、安価
な選択肢の一つは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type
Culture Collection（ATCC））からわずかな費用または無料で入手しうる、Tベ
クターpGEM（登録商標）5fZ(+)を用いることである。このベクターをXcmIで消化
すると、TAクローニングに用いるT突出部が得られる（Kovalic、Kwakら 1991；M
ead、Peyら 1991）。適切なRE消化の後に適した末端が得られる、他のTベクター
が数多く独立に開発されている（Cha、Bishaiら 1993；IchiharaおよびKurosawa
1993）。しかし、このようなベクターを作製するためには多くの操作が必要で
あった。最近、これらのキットに伴う可能性のある他の問題も報告されている（
Hengen 1995）。pCR-Scriptベクターを単独で試験した場合に、高いバックグラ
ウンド値が観察されており、PCRIIはpBR322の複製起点を含み、したがって複製
されるコピー数が少なく、かつ-20℃での凍結解凍サイクルの繰り返しにより、T
尾部の不安定化および損失がもたらされる。すべてのTベクター法には、指向的
でなく、連結段階を要するという欠点がある。

【０００７】インビトロゲン（Invitrogen）社は、連結段階の必要性を回避することにより
、従来のTAクローニング法を改良した。TOPO TAクローニングと呼ばれるこの方
法では、トポイソメラーゼIと呼ばれるワクシニアウイルス酵素によって触媒さ
れる反応を利用する（Shuman、1994および米国特許第5,766,891号）。トポイソ
メラーゼは二本鎖DNAと結合して、二重鎖のうち一方のホスホジエステル骨格を
切断することができる。本酵素は配列特異的で、主として認識配列5'-(C/T)CCTT
↓-3'で切断する（ShumanおよびPrescott 1990；Shuman 1991）。本酵素は元の
鎖を逆に再連結することができるか、または組換え種の形成に際して2つの異種D
NAを連結することができる（Shuman 1992；Shuman 1992）。本反応は非常に効率
が良く、実験台上でのわずか5分のインキュベートしか要しない。本方法には、
リガーゼが必要でなく、挿入物の全配列に関する情報が必要でなく、PCRプライ
マーに別のヌクレオチドを付加する必要がないという利点もある。しかし、TOPO
認識配列を含むように操作された、特定のプラスミドしか使用できない。これら
のベクターは、ベクターを制限処理した後に特定のリンカーまたはアダプターを
付加することによって作製されるが、これは容易な作業ではない。この手法のも
う1つの制限は、TOPO認識配列はベクターの3'末端から10bp以内に位置しなけれ
ばならず、さらに挿入物に5-OH基がなければならない点である。増幅されるDNA
内の内部認識配列により、問題が起こりうるという問題点も提起されているが、
これらの部位は単に再連結されるだけであり、この手法に何ら制限を課すもので
はない（Shuman 1994；Stivers、Shumanら 1994）。一般的な使用に際して、イ
ンビトロゲン（Invitrogen）社のキットは別の潜在的な問題を提供した（未発表
の結果）。クローンのスクリーニングのための、青／白選択（blue-white selec
tion）と呼ばれる従来の方法では、インビトロゲン（Invitrogen）社のキットを
用いると確定的な結果が得られない。このため、正しい構築物が得られることを
確認するためには、白色および淡青色のコロニーの両方をアッセイする必要があ
る。

【０００８】 iii）ウラシルDNA-グリコシラーゼ（UDG）に基づくクローニングラシュトチアン（Rashtchian）ら（1992）は、細胞での通常の役割がDNA修復
酵素である酵素、ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）を用いるリガーゼ非依存的
なPCRクローニング法を開発した。この手法はPCRプライマーの5'末端に12bpの付
加を必要とする。本グリコシラーゼは適切な塩基対合を妨げて一本鎖の3'突出部を
生じさせる（DuncanおよびChambers 1984；Longo、Berningerら1990）、PCR産物
の末端のdUMP残基を選択的に除去する。これらの3'突出部はベクターの適切に調
製された一本鎖末端にアニールすることができる。ウラシルグリコシラーゼは、
DNAでのウラシル残基の相手であるチミン残基に対する活性はなく（Duncanおよ
びChambers、1984）、かつ最末端のまさに近くにあるdUMP残基を除去することが
できる（Varshneyおよびvan de Sande 1991）。この方法にはベクターが適切な
相補配列を含むことが必要であり、PfuポリメラーゼまたはVent_Rポリメラーゼの
ような校正ポリメラーゼの使用には適用されない（Sakaguchi、Sedlakら1996）
。このため、研究者は誤りの頻度が著しく高いTaqポリメラーゼを用いなければ
ならない。UDGに基づくクローニングは、ライフテクノロジーズ（Life Technolo
gies）社がClone Amp（登録商標）pUCシステムとして製品化している。

【０００９】 UDGクローニングの変法の一つは、dUMP残基でのUDG切断によって生じる塩基喪
失（abasic）部位（AP）を利用する。これらのAP部位は、T4エンドヌクレアーゼ
VまたはヒトAPエンドヌクレアーゼIなどのAPエンドヌクレアーゼの基質である。
これらの修復酵素のいずれかで処理することにより、適切なベクター中に続いて
連結するのに適した5-Pが得られる。この方法の欠点の一つはプライマー内に修
飾塩基（デオキシウリジン）を必要とすることであり、成功の可否はリガーゼ処
理に加えて2つの酵素に依拠する。UDGクローニングのあまり知られていない第2
の変法では、プライマー内の所定の位置に1,3-プロパンジオールと呼ばれる非塩
基性残基を用い、クローニング用の適合性のある5'末端が得られるが、この方法
は他のリガーゼ非依存的なクローニング法よりもはるかに効率が低い（Kaluzお
よびFlint 1994）。

【００１０】 iv）PCR誘導型クローニング PCR特異的なクローニング法はしばしば、組換えDNAが増幅手順それ自体の間に
産生される、一段階の手順である。この主題には多くの変法があり、リガーゼ依
存的なものもあればそうでないものもある。これらの方法は主としてクローニン
グされる遺伝子に位置特異的な変異を作製するために用いられる。以下に現在の
手法を簡単に記載する。

【００１１】リガーゼ依存的な方法 a）ストラタジーン（Stratagene）社は平滑末端PCR断片のクローニングのため
の手法を製品化しており（Weiner 1993）、これは当初リュウ（Liu）およびシュ
ワルツ（Schwartz）（1992）によって記載された。彼らの方法では、PCRプライ
マーの5'末端をリン酸化することが必要である。受容側のベクターを線状化し、
子ウシ腸アルカリホスファターゼ（CIAP）で処理した後に、第2の制限酵素で消
化して適合性のある末端を得る。これはかなり複雑な手法であるが、この結果得
られるベクターは一リン酸化されており、指向性クローニングを可能にする。指
向性クローニングの成功率は95％と報告されたが、それらの手法にはエタノール
沈殿が必要であり、やはりリガーゼの作用に依拠している。

【００１２】 b）「ヘテロスタッガークローニング（hetero-stagger cloning）」は、もう1
つのリガーゼ依存的な方法であり、計4つのPCRプライマーを必要とする（Liu 19
96）。プライマーの1組は従来のPCRプライマー対であり、第2の組は最初のもの
と同等であるが、5'-GGG残基をさらに含む。DNAを通常のPCR条件下で増幅し、そ
の産物を熱変性させ、次に冷却によってゆっくりと再度アニールさせる。再アニ
ーリングの結果、4つの異なる種が形成される。理論的にクローニング可能なの
は産物の50％のみであり、指向性クローンが首尾良く得られるのは産物の25％に
過ぎない。この手法に関して主張されている唯一の利点は、最新の校正ポリメラ
ーゼを増幅時に用いることが可能になることである。

【００１３】 c）プライマー対が1つしか必要としない、スタッガード・再アニーリング法（
staggered re-annealing）の変法も用いられている（AilenbergおよびSilverman
1996）。

【００１４】 d）さらに最近では、ガル（Gal）ら（1999）が、「オートスティッキー（auto
sticky）PCR」（AS-PCR）（特許出願HU9801320号）と呼ばれる手法を考案した。
この手法は、DNAに存在する塩基喪失部位がDNAポリメラーゼを引き止めることが
できるという所見を利用している。この方法では、増幅しているポリメラーゼを
引き止める塩基喪失部位を含むようにPCRプライマーを設計し、その結果、5'突
出部が生じて、適切な消化処理を行ったベクター中に連結することが可能となる
。塩基喪失部位は、2-デオキシリボースの安定な構造類似体であるテトラヒドロ
フランを所定の位置に組み込むことによって作製する。この方法は指向性クロー
ニングのために提供されるが、通常とは異なる試薬を必要とし、連結を一晩行わ
せることが推奨される。

【００１５】リガーゼ非依存的なクローニング法（LIC） a）最初のリガーゼPCRクローニング法はシュルディナー（Shuldiner）ら（199
1）によって記載された。それ以来、この手法の数多くの適応が開発されている
。本明細書に記載された手法（TemesgenおよびEschrich 1996）には、3つのPCR
プライマーが必要であり、そのプライマーの1つにはさらに24ヌクレオチドが付
加されている。この過程は2つの異なるPCR増幅を伴い、従って産物にPCRの誤り
が入り込む確率が高くなる。しかし、リガーゼの必要性を回避して、線状の産物
を大腸菌（E.coli）に直接形質転換することが可能である。コンピテント大腸菌
（E.coli）TG2株の細胞が必要であり、JM105またはDH5αなどの古典的な株で代
用できるかどうかは不明である。この手法は指向性クローニングのために提供さ
れるが、成功は第2のPCR段階におけるPCRパラメーターに関係している。この手
法には任意のベクターを用いることができ、制限酵素は必要でない。

【００１６】 b）ガルセス（Garces）およびラボーダ（Laborda）（1995）は、2つのPCRプラ
イマーのみを必要とし、その一方が20bpの5'伸長部を持つ、同様の手法を報告し
ている。反応は一本のチューブ内での反応として起こり、任意のベクターの使用
に適合させることができるが、効率はPCRパラメーターにより大きく影響される
。

【００１７】 v）インビボ組換えに基づくクローニング PCRクローニングは従来、研究室の試験管環境内で完結するが、インビボ系を
用いたクローニングの報告が少なくとも2件ある。以下の手法は、酵母を線状鋳
型およびギャップ含有プラスミドを用いて共トランスフェクトすると、相同組換
えによって2つの種を「はぎ合わせる（patch）」ことが可能であるという所見に
基づいた（GuthrieおよびFink、1991）。それ以来、酵母ではこの方法を用いてP
CR産物のクローニングが行われている（ScharerおよびIggo 1992）。同様の現象
は大腸菌（E.coli）でも報告されている（Oliner、Kinzlerら 1993）。この手法
はおそらく宿主によってコードされる内因性エキソヌクレアーゼ活性またはポリ
メラーゼ活性を利用しているが、実際に何が起こっているかに関する推測はなさ
れていない。PCRプライマーは、選択したRE部位に隣接する配列と同一である5'
配列を含むように設計する。線状化ベクターおよびPCR産物を大腸菌（E.coli）J
C8679株に共トランスフェクトする。DH5α細胞は分子内ギャップ修復を触媒でき
ず、このため分子間の組換えも触媒できないと考えられることが独立した複数の
報告によって示されるため、この手法は通常の大腸菌（E.coli）株との使用には
適さない可能性がある（Hanahan、1985）。ブベック（Bubeck）ら（1993）によ
って記載された同様の方法では、CaCl_２法により形質転換した場合のみであるが
、DH5α細胞における組換えの成功が報告された。熱ショックおよびエレクトロ
ポレーションとして知られる、細菌の形質転換により一般的に用いられる手法は
、上記の実験に用いて失敗した。

【００１８】 vi）エキソヌクレアーゼに基づくPCRクローニング PCR断片のクローニングのための完全に異なる一つのアプローチには、種々の
エキソヌクレアーゼの活性による一本鎖突出部の生成を伴う。エキソヌクレアー
ゼに基づく方法はすべてリガーゼ非依存性であり、アスラニディス（Aslanidis
）およびディヨング（deJong）（1990）により最初に報告された手法に基づく。
この手法に数多くの修正が加えられたことによって、この方法は改良され（Haun
、Serventiら 1992；Kuijper、Wirenら 1992）、これはいずれもT4 DNAポリメラ
ーゼの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を用いる。PCRプライマーは、ベクター内の
選択したRE部位に隣接する配列に対して、相補的な5'伸長部を含むように設計す
る。T4ポリメラーゼによる外ヌクレオチド鎖分解消化によって一本鎖突出部を生
成し、ベクターと挿入物の間の一本鎖領域のアニーリングは直接細菌を形質転換
できるまでに十分に安定である。これらの手法では、酵素が極めて効率的である
ために、インキュベーション期間を精密に調節する必要があり、慎重に行わない
とDNAが過剰に消化される可能性がある。クジパー（Kuijper）ら（1992）は、酵
素標品間に大きな変動があるため、酵素の新しいバッチ毎に時間条件を微調整す
る必要があることも報告した。これらの特定の方法の第2の欠点は、酵素を適切
な時点で停止させるためにエキソヌクレアーゼ反応物にdTTPまたはdATPを添加す
る必要があることである。

【００１９】上記で報告されたものと同様の方法では、エキソヌクレアーゼIIIと呼ばれる
異なる酵素を用いており（Hsiao 1993）、これは1992年にクローニング用として
最初に用いられた（Kaluz、Kolbleら 1992）。この制限は、効率的にクローニン
グされるのが平滑末端または5'突出型の基質のみである点である。3'突出部を有
する基質をこの方法によってクローニングすることはできない。

【００２０】さらに最近では、ファージT7 Gene6エキソヌクレアーゼがPCRクローニングに
用いられている（ZhouおよびHatahet 1995）。この手法では、プライマーの中央
側に向かって位置する内部ホスホロチオエート結合を含むように、PCRプライマ
ーを設計する。プライマーの3'末端は標準的なPCRプライマーであるが、一方、5
'末端は特定のRE部位に隣接する配列に対して相補的であるように設計する。こ
の方法は指向性クローンを産生し、リガーゼ非依存性であるが、標準的でないPC
Rプライマーを用いる必要がある。米国特許第5,580,759号（Yangら）も、エキソ
ヌクレアーゼ陥入（recession）による組換えDNAの構築方法を開示している。

【００２１】以上をまとめると、PCR産物のクローニングに関しては非常にさまざまな方法
が存在し、それぞれに利点および欠点がある。以下の特徴を有する最適なクロー
ニング法は依然として必要とされている：任意のベクターおよび制限酵素の使用に適合する；天然塩基のみからなる2つのPCRプライマーのみを必要とする；リガーゼ非依存性である；時間効率が優れている；ほぼ完全に指向性クローニングのみを提供する；認識する必要があるのは増幅領域の末端配列だけである； PCR産物の内部消化の可能性がない；任意の種類の増幅用ポリメラーゼを用いることができる；容易に入手可能な種々の大腸菌（E.coli）株に適合する；さまざまな手法によって細菌の形質転換を行うことができる；明確な選択；およびコンビナトリアルクローニングのような他の手法に適応可能である。

【００２２】発明の概要本発明者らは、ワクシニアDNAポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼが、1つま
たは複数の線状DNA分子を効率的に連結しうることを明らかにした。本方法は、
一連のDNA分子の末端に存在する、配列要素間の組換えを用いて接合部を指定し
、特定のDNAポリメラーゼを分子の連結のために用いる。本方法を、1つまたは複
数の線状DNA分子を単一の手順で正確に連結するために用いることもできる。こ
の新たな方法は主に組換えDNA分子の構築に適用され、特にPCR産物を任意の所望
のベクター中にクローニングするために適用される。本方法は、上記に列挙した
最適なクローニング法のすべての特徴を提供する。

【００２３】したがって、本発明は、以下の段階を含む2つの線状DNA分子を連結する方法を
提供する：第1の末端および第2の末端を有する第1の線状DNA分子を提供する段階；第1の末端および第2の末端を有する第2の線状DNA分子を提供する段階；ここで、第1の線状DNA分子は、第2の線状DNA分子の第1の末端または第2の末端
のいずれかにあるヌクレオチド配列に対して、相補的なヌクレオチド配列を第1
の末端または第2の末端のいずれかに有し、ならびに 2つの線状DNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの存在下において2
つの線状DNA分子をインキュベートする段階。

【００２４】 1つの態様において、本発明は、以下の段階を含む2つまたはそれ以上の線状DN
A分子を連結する方法を提供する： 1つの線状DNA分子のx'鎖の5'末端が、それに連結させようとする別の線状DNA
分子のx鎖の5'末端に対して相補的なヌクレオチド配列を有する、反対の極性を
もちそれぞれx鎖およびx'鎖を有する、2つまたはそれ以上の線状DNA分子を提供
する段階；ならびに 2つまたはそれ以上の線状DNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの
存在下において2つまたはそれ以上の線状DNA分子をインキュベートする段階であ
って、ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、本発明のDNA
連結反応を行うことができる段階。

【００２５】本方法を、任意の数のDNA分子を連結するために用いてもよい。重要な点は、
各DNA分子の末端が、それに連結させようとする分子に対する相補領域を持つよ
うに分子を確実に選択することである。内部分子は両端に相補領域を持たなけれ
ばならない。この手法の特別な用途には、DNAカセットのコンビナトリアル融合
および合成遺伝子の調製がある。この手法は断片化されたクローンの再構築にも
有用である。

【００２６】また、本発明の方法を、両端が実質的に相補的な核酸配列を有する、単一のDN
A分子の再環状化に応用してもよい。この手法は部位特異的変異誘発の分野に適
応しうる。

【００２７】本発明の方法に用いうるDNAポリメラーゼには、本発明のDNA連結反応を行うこ
とができる、内在性エキソヌクレアーゼ活性、好ましくは3'-5'エキソヌクレア
ーゼ活性を有する、すべてのDNAポリメラーゼが含まれる。このようなポリメラ
ーゼは、本明細書に記載する通り、相補的なヌクレオチド配列を持つ末端を有す
る、2つの線状DNA分子を連結する能力に関してアッセイすることによって同定し
うる。好ましくは、DNAポリメラーゼは、ワクシニアウイルスDNAポリメラーゼ、
T4 DNAポリメラーゼ、および大腸菌（E.coli）DNAポリメラーゼIのクレノー断片
からなる群より選択される。最も好ましくは、DNAポリメラーゼはワクシニアウ
イルスDNAポリメラーゼである。各線状DNA分子の相補的ヌクレオチド配列の長さ
は、約5から約100ヌクレオチドの間、好ましくは約8から約50ヌクレオチドの間
、最も好ましくは約10から35ヌクレオチドの間でありうる。インキュベーション
混合物に公知の種々の刺激因子を加えてもよい。このような刺激因子は、反応の
効率を向上させ、かつ所望の反応産物、例えば一本鎖DNA結合タンパク質を安定
化させるものである。

【００２８】もう1つの態様において、本発明は以下の段階を含む、組換えDNA分子を構築す
る方法を伴う：それぞれ第1および第2の末端を有する、線状化ベクターDNA分子および鋳型DNA
分子を提供する段階；線状化ベクター分子の第1の末端に対して相補的なヌクレオチド配列を、鋳型D
NA分子の第1の末端上に組み入れると考えられるヌクレオチド配列を含む5'末端
、および鋳型DNA分子の第1の末端上の適した位置にハイブリダイズするように設
計された3'末端を有する、第1のプライマーDNA分子を提供する段階；線状化ベクター分子の第2の末端に対して相補的なヌクレオチド配列を、鋳型D
NA分子の第2の末端上に組み入れると考えられるヌクレオチド配列を含む5'末端
、および鋳型DNA分子の第2の末端上の適した位置にハイブリダイズするように設
計された3'末端を有する、第2のプライマーDNA分子を提供する段階；第1および第2のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて鋳型DNA分
子を増幅して、PCR増幅産物を得る段階；ならびに DNAポリメラーゼの存在下でPCR増幅産物を線状化ベクターDNA分子とともにイ
ンキュベートして、組換えDNA分子を生成する段階であって、ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、本発明のDNA
連結反応を行うことができる段階。

【００２９】本発明の方法に用いうるDNAポリメラーゼには、本発明のDNA連結反応を行うこ
とができる、内在性エキソヌクレアーゼ活性、好ましくは3'-5'エキソヌクレア
ーゼ活性を有する、すべてのDNAポリメラーゼが含まれる。このようなポリメラ
ーゼは、本明細書に記載する通り、相補的なヌクレオチド配列を持つ末端を有す
る2つの線状DNA分子を連結する能力に関してアッセイすることによって同定しう
る。好ましくは、DNAポリメラーゼは、ワクシニアウイルスDNAポリメラーゼ、T4
DNAポリメラーゼ、および大腸菌（E.coli）DNAポリメラーゼIのクレノー断片か
らなる群より選択される。最も好ましくは、DNAポリメラーゼはワクシニアウイ
ルスDNAポリメラーゼである。インキュベーション混合物に、公知の種々の刺激
因子を加えてもよい。このような刺激因子は、反応の効率を向上させ、かつ所望
の反応産物、例えば一本鎖DNA結合タンパク質を安定化させるものである。

【００３０】鋳型DNA分子の第1および第2の末端上に組み入れられる、相補的ヌクレオチド
の数は、約5から約100ヌクレオチドの間、好ましくは約8から約50ヌクレオチド
の間、最も好ましくは約10から35ヌクレオチドの間でありうる。

【００３１】本方法は、2つまたはそれ以上のDNA分子のベクターへの挿入に容易に応用しう
る。追加する各分子毎に、隣接分子の適当な末端に対して相補的なPCR伸長の用
意をする（prime）第1の部分、および増幅させるDNA分子の適当な末端に対して
相補的な第2の部分をそれぞれが有する、二連型（bipartite）PCRプライマーが
さらに2つ必要になると考えられる。

【００３２】本発明の方法を用いて線状化ベクターに挿入しようとする線状DNA分子を、PCR
増幅によって入手する必要はない。このため本発明は、以下の段階を含む、組換
えDNA分子を構築する方法をさらに伴う：線状化ベクターDNA分子を提供する段階；連結させようとする線状化ベクターDNA分子の末端に対して、実質的に相補的
な末端を有する線状の挿入DNA分子を提供する段階；ならびに 2つのDNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの存在下において線状
化ベクターDNA分子および線状の挿入DNA分子をインキュベートする段階であって
、ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、DNA分子を連
結する段階。線状の挿入DNA分子は任意の公知の手段、例えば、化学合成、連結
、またはアニーリングによって入手しうる。

【００３３】本発明は、任意の鋳型DNA分子を、任意のベクターの単一の制限酵素部位中に
指向的にクローニングする方法を提供する。ベクター末端は任意の制限酵素切断
によって生成しうる。本方法は連結段階を必要とせず、特定のエキソヌクレアー
ゼのみを伴う方法で必要とされるような、慎重に調節される条件を使用する必要
もない。

【００３４】本発明はまた、本方法を行うための試薬を含むキットにも向けられる。

【００３５】本発明のこれらのおよびその他の局面を以下にさらに詳細に説明する。

【００３６】発明の詳細な説明定義本明細書で用いる「相補的な」という用語は、別のDNA分子におけるヌクレオ
チド配列の鎖に対して、特異的に（無作為的ではなく）ハイブリダイズして、結
果として水素結合を生じるのに十分に相補的な、一本鎖DNA分子におけるヌクレ
オチド配列を指す。

【００３７】本明細書で用いる「線状DNA分子」という用語は、分子の塩基対に存在する各
相補的塩基の間の、1つまたは複数の水素結合によって合わされた、実質的に相
補的なポリヌクレオチドの極性が反対の2つの鎖（センスおよびアンチセンス）
を含む、二本鎖（二重鎖）核酸分子を指す。

【００３８】本明細書で用いる「組換えDNA分子」という用語は、自然界で通常は一緒には
見出されない少なくとも2つのヌクレオチド配列を含む、ハイブリッドDNA分子を
指す。

【００３９】本明細書で用いる「ヌクレオチド」という用語は、糖部分（五炭糖）、リン酸
基および含窒素複素環式塩基からなるDNAの単量体単位を指す。塩基は配糖体炭
素（五炭糖の1'炭素）を介して糖部分と結合しており、この塩基と糖の組み合わ
せがヌクレオシドである。ヌクレオシドが五炭糖の3'位または5'位に結合したリ
ン酸基を含む場合、これはヌクレオチドと呼ばれる。機能的に結合したヌクレオ
チドの配列を、本明細書では一般に「ヌクレオチド配列」およびそれらの文法的
等価物として称し、これは左から右の方向が5'末端から3'末端への通常の向きで
あるような定則によって表される。

【００４０】DNAの連結方法本発明は、特定のDNAポリメラーゼを用いて2つまたはそれ以上の線状DNA分子
を連結するための方法に関する。本方法は、特定のDNAポリメラーゼが、共通の
相補的ヌクレオチドを共有する末端を有する、線状DNA分子の組換えを促進しう
ることに依拠している。

【００４１】したがって、本発明は、以下を含む2つの線状DNA分子を連結する方法を提供す
る：第1の末端および第2の末端を有する第1の線状DNA分子を提供する段階；第1の末端および第2の末端を有する第2の線状DNA分子を提供する段階であって
、ここで、第1の線状DNA分子が、第2の線状DNA分子の第1の末端または第2の末端
のいずれかにあるヌクレオチド配列に対して、相補的なヌクレオチド配列を第1
の末端または第2の末端のいずれかに有する段階；ならびに 2つの線状DNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの存在下において2
つの線状DNA分子をインキュベートする段階。

【００４２】第1および／または第2の線状DNA分子は、1つまたは複数の線状DNA分子からな
りうる。例えば、第1の線状DNA分子は、本発明の方法を用いてすでに連結された
、2つの線状DNA分子からなってもよい。

【００４３】 1つの態様において、本発明は以下の段階を含む、2つまたはそれ以上の線状DN
A分子を連結する方法を提供する：各線状DNA分子のx'鎖の5'末端が、それに連結させようとする線状DNA分子のx
鎖の5'末端のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する、極性が反
対であるx鎖およびx'鎖をそれぞれが有する、2つまたはそれ以上の線状DNA分子
を提供する段階；ならびに 2つまたはそれ以上の線状DNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの
存在下において2つまたはそれ以上の線状DNA分子をインキュベートする段階であ
って、ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、本発明のDNA
連結反応を行うことができる段階。

【００４４】本発明の方法において働くDNAポリメラーゼは、本発明のDNA連結反応を行うこ
とができる、内在性エキソヌクレアーゼ活性、好ましくは3'-5'エキソヌクレア
ーゼ活性を有するものである。このようなポリメラーゼは、本明細書の実施例2
（実験の項）に記載する通り、相補的なヌクレオチド配列を持つ末端を有する、
2つの線状DNA分子を連結する能力に関してアッセイすることによって同定しうる
。本明細書で提示した実施例では精製ワクシニアDNAポリメラーゼを用いた。ま
た、T4 DNAポリメラーゼ、および大腸菌（E.coli）DNAポリメラーゼIのクレノー
断片を用いても反応が進むことが示されている。本発明のDNAポリメラーゼは市
販のものでもよく、標準的な組換えDNA技術を用いて調製してもよい。例えば、
マクドナルド（McDonald）およびトラクトマン（Traktman）（1994）ならびにウ
ィラー（Willer）、マン（Mann）ら（1999）に記載された通りに、ワクシニアDN
Aポリメラーゼをワクシニアに感染したBSC-40細胞から精製してもよい。または
、ワクシニアDNAポリメラーゼを野生型ワクシニアウイルスに感染した細胞から
精製してもよい。本発明者らは、相補的なヌクレオチド配列を持つ末端を有する
、2つの線状DNA分子を連結する能力を測定するために、ポリメラーゼをアッセイ
する。これらには、バクテリオファージ（例えば、T4、T7）、細菌（例えば、大
腸菌（E.coli））、真菌（例えば、S. セレビシエ（S. cerevisiae））ならびに
ウイルス（例えば、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ア
フリカブタコレラウイルスおよび他のイリドウイルスならびにバキュロウイルス
）によってコードされるものが含まれるが、限定されない。本発明に有用なDNA
ポリメラーゼは、好ましくは内在性3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を持つ。本発
明は、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を持つDNAポリメラーゼを含むように拡張さ
れる。

【００４５】反応の効率を高めるため、および／または反応産物を安定化するために、さま
ざまな公知の刺激因子をインキュベーション混合物に加えてもよい。適した刺激
因子には一本鎖DNA結合タンパク質が含まれる。用いうる一本鎖DNA結合タンパク
質の中には、ワクシニアおよび大腸菌（E.coli）の一本鎖結合タンパク質、単純
ヘルペスウイルスICP8タンパク質、ならびに酵母およびヒトの複製プロテインA
（例えば、yRPAおよびhRPA）を含むが、これらに限定されないものもある。当業
者は、本発明の方法においてDNAポリメラーゼと組み合わせて有用に用いうる、
他の適した刺激因子を容易に同定しうると考えられる。本発明の1つの面におい
て、ワクシニア一本鎖結合タンパク質を用いて、ワクシニアDNAポリメラーゼを
用いるDNA連結反応の収率を高める。

【００４６】線状DNA分子の末端間の相補性の程度は、約5から約100ヌクレオチドの間、好
ましくは約8から約50ヌクレオチドの間、最も好ましくは約10から35ヌクレオチ
ドの間を変動しうる。本発明の方法を用いて連結されうる線状DNA分子は、制限
酵素切断を用いて、原核生物または真核生物のゲノムのゲノムDNA、ならびにプ
ラスミド、コスミド、ファージ、BACなどを含む種々のベクターから入手しても
よい。または、線状DNA分子を、例えば自動合成などを用いる化学的手法によっ
て合成してもよい。DNA分子は任意の種由来のmRNA、tRNAおよびrRNAなどのRNA種
に由来してもよく、サムブルック（Sambrook）ら（1989）に記載された通りに、
まず逆転写酵素によってcDNAに変換して増幅することができる。

【００４７】最も一般的な応用として、本発明は、2つまたはそれ以上の線状DNA分子を連結
する方法を提供する。図1は、2つの線状DNA分子の連結のためのこの反応の概略
図を示している（パネルA）。これは、左端および右端上に相補配列を共有する2
つの基質を、どのように特定のDNAポリメラーゼの存在下でインキュベートして
二量体を形成させるかを例示している。図1のパネルCは、左端および右端に35bp
の相補配列を共有する2つの基質の1：1の混合物を、さまざまな量のワクシニアD
NAポリメラーゼとインキュベートし、その産物をアガロースゲルを用いてサイズ
別に分離した実験の結果を示している。ポリメラーゼを加えなかった場合は反応
は全く観察されず（レーン2）、ポリメラーゼの量を増やしながら添加すると産
物の収量が増加した（レーン3〜9）。

【００４８】図2のパネルAは、3つの線状DNA分子の連結による三量体の産生を示している。
この場合に「中間」分子は、2つの隣接分子の末端に対して相補的なDNA配列を両
端に持たなければならない。中間分子が各末端に2つの隣接分子を有し、相補的
な約20bpのDNA配列をもつ場合の、実際の実験結果を図2のパネルBに示している
。図2のパネルBには重要な対照も例示されている（レーン5）。同一分子の末端
には適切な種類の共通した相補性がないため、ポリメラーゼは3つの基質のうち
の1つだけを与えた場合にはコンカテマーを形成しないと考えられる。この特異
性は、ほとんど無数の種々の末端配列重複部を単に調節するだけで、2つまたは
それ以上の分子をどのように融合させるかを正確に指示できることを意味する。

【００４９】したがって、本発明は以下の段階を含む、3つの線状DNA分子を連結する方法を
提供する：第1の末端および第2の末端を有する第1の線状DNA分子を提供する段階；第1の末端および第2の末端を有する第2の線状DNA分子を提供する段階；第1の末端および第2の末端を有する第3の線状DNA分子を提供する段階；ここで、第1の線状DNA分子は、第2の線状DNA分子の第1の末端または第2の末端
のいずれかにあるヌクレオチド配列に対して、相補的なヌクレオチド配列を第1
の末端に有し、第1の線状DNA分子は、第3の線状DNA分子の第1の末端または第2の
末端のいずれかにあるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を第
2の末端に有し、かつ 3つの線状DNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの存在下において3
つの線状DNA分子をインキュベートする段階。

【００５０】当業者は、DNA分子が1つの分子を別の分子に連結させるための適当な相補配列
を含むならば、上記の方法を用いて任意の数のDNA分子を連結させうることを認
識すると考えられる。例えば、上記の3つの分子に第4のDNA分子を連結させるた
めには、第2または第3のDNA分子のいずれかが遊離端（すなわち、第1のDNA分子
に連結していない末端）に第4のDNA分子の一方の端にある配列に対して相補的な
ヌクレオチド配列を持つ必要がある。

【００５１】本発明のもう1つの応用は、図3に示すような、DNAカセットのコンビナトリア
ル融合である。この例では、3つの異なるDNA分子のプールを調製する。分子のプ
ール内では、末端は同一であるが各分子の中央部の配列はさまざまである。例え
ば、図3に示す通り、A1〜A5はすべて約5から約100ヌクレオチド、好ましくは約8
から約50ヌクレオチド、より好ましくは約10から約35ヌクレオチドの同じヌクレ
オチド配列を右端に有するが、分子の残りの部分の配列はさまざまである。「B
」プール内の分子の左端は「A」プール内の分子の右端との適合性がある。同様
に、「C」プール内の分子の左端は「B」プール内の分子の右端と適合性がある。
適合性があるとは、それらが約5から約100ヌクレオチド、好ましくは約8から約5
0ヌクレオチド、より好ましくは約10から約35ヌクレオチドの範囲である、適当
な相補配列を共有していることを意味する。プールA、BおよびCからの分子の混
合物を、本発明の方法で有用なDNAポリメラーゼとインキュベートすることによ
り、A、BおよびCプールから選択された各分子の1つからなる三量体が生じると考
えられる。この結果得られる三量体のプールは、「A」、「B」および「C」変種
の無作為な組み合わせを表すはずである。「プール」および各プール内の分子の
数は、何百万もの異なるDNA分子の無作為な組み合わせが生じる可能性があるよ
うに、変動しうる。本発明の方法を用いるDNAカセットのコンビナトリアル融合
は、異なるタンパク質構造ドメインをコードするDNA分子のコンビナトリアル融
合による、新規タンパク質をコードするDNA配列の構築に応用しうる。これらの
タンパク質ライブラリーを新規な結合特異性に関してスクリーニングしてもよい
。

【００５２】本発明の方法を、末端に実質的に相補的な核酸配列を有する単一のDNA分子の
組換え（環状化）に用いることもできる。したがって、本発明は以下の段階を含
む、線状DNA分子を環状化する方法にも関する：線状DNA分子の各末端上に実質的に相補的な核酸配列を導入すると考えられる
プライマーの存在下で、線状DNA分子のPCR増幅を行う段階；および PCR増幅がなされた線状DNA分子を、線状DNA分子が環状化される条件下でDNAポ
リメラーゼの存在下においてインキュベートする段階であって、ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、DNA分子を環
状化する段階。

【００５３】本発明の方法を単一DNA分子の環状化に応用する用途の一つは、部位特異的変
異誘発の分野にある。例えば、実質的に相補的な核酸配列が各末端に組み入れら
れるように設計したプライマーを用いて、関心対象の遺伝子を含むプラスミドの
PCR増幅を行うことができる。プラスミド中の関心対象の遺伝子の内部に変異が
導入されるようにプライマーを設計すれば、変異型の遺伝子が得られる。

【００５４】反応の特徴をさらにいくつか調査した。最も重要な点は、ワクシニアポリメラ
ーゼが、2つの組換え中の分子上に存在する末端の種類に左右されないように見
られるという事実であるかもしれない。5'突出部、3'突出部または平滑末端を有
する分子は、任意の2つ1組の組み合わせにおいて、2つの分子が適当な配列相補
性を共有している限りは基質であった。

【００５５】DNAのクローニング法もう1つの態様において、本発明は任意の二本鎖PCR産物を任意の望ましいベク
ター中にクローニングする方法を提供する。したがって、以下の段階を含む、組
換えDNA分子を構築する方法が提供される：それぞれ第1および第2の末端を有する、線状化ベクターDNA分子および鋳型DNA
分子を提供する段階；線状化ベクター分子の第1の末端に対して相補的なヌクレオチド配列を、鋳型D
NA分子の第1の末端上に組み入れると考えられるヌクレオチド配列を含む5'末端
、および鋳型DNA分子の第1の末端上の適した位置にハイブリダイズするように設
計された3'末端を有する、第1のプライマーDNA分子を提供する段階；線状化ベクター分子の第2の末端に対して相補的なヌクレオチド配列を、鋳型D
NA分子の第2の末端上に組み入れると考えられるヌクレオチド配列を含む5'末端
、および鋳型DNA分子の第2の末端上の適した位置にハイブリダイズするように設
計された3'末端を有する、第2のプライマーDNA分子を提供する段階；第1および第2のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて鋳型DNA分
子を増幅して、PCR増幅産物を得る段階；ならびに DNAポリメラーゼの存在下でPCR増幅産物を線状化ベクターDNA分子とともにイ
ンキュベートして、組換えDNA分子を生成する段階であって、ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、本発明のDNA
連結反応を行うことができる段階。

【００５６】本方法に必要なのは、PCRプライマーを伸長して、ベクター中の選択したクロ
ーニング部位に隣接する塩基配列を複製する、いくつかのヌクレオチドを組み入
れることだけである。提案するアプローチを図4に示している。一組の二連型プ
ライマーを設計する。第1のプライマー分子の3'末端は鋳型DNA分子の第1の末端
にハイブリダイズするように設計され、第1のプライマー分子の5'末端は、ベク
ターDNA分子の第1の末端に対して相補的な配列を最終PCR産物に組み入れるよう
に設計された、約5から約100ヌクレオチド、好ましくは約8から約50ヌクレオチ
ド、より好ましくは約10から約35ヌクレオチドの配列を有する。第2のプライマ
ーの3'末端は鋳型DNA分子の第2の末端にハイブリダイズするように設計され、第
2のプライマー分子の5'末端は、ベクターDNA分子の第2の末端に対して相補的な
配列を最終PCR産物に組み入れるように設計された、約5から約100ヌクレオチド
、好ましくは約8から約50ヌクレオチド、より好ましくは約10から約35ヌクレオ
チドの配列を有する。次に2つのプライマーを鋳型DNA分子にアニールさせ、その
後にPCR増幅産物が生じる標準的な条件を用いてPCR増幅を行う。ベクターは、標
準的な条件を用いてそれを選択した挿入部位で切断するために、適切な制限酵素
で処理することによって調製する。

【００５７】本明細書で用いるプライマーという用語は、二連型プライマー、または第1お
よび第2の部分を有するプライマーを説明するものとする。プライマーの第1の部
分は鋳型DNA分子の適当な末端に対して相補的であるように設計し、プライマー
の第2の部分はベクターの選択した制限酵素部位の片側のヌクレオチド配列に対
して相補的であるように設計する。本発明の二連型オリゴヌクレオチドプライマ
ーを、関心対象のDNA分子に対して相補的であり、DNA分子をベクター中に組み入
れることを可能とするような一本鎖オリゴヌクレオチドとして、広義に定義して
もよい。二連型プライマーは一般に、最小限の長さが約18ヌクレオチドであって
最大限の長さが約200ヌクレオチドであると考えられ、好ましくは約25ヌクレオ
チドから約100ヌクレオチド、より好ましくは約30ヌクレオチドから約40ヌクレ
オチドと考えられる。本方法は、2つまたはそれ以上のDNA分子をベクター中へ挿
入するのに容易に応用しうると考えられる。追加する各分子は、隣接分子の適当
な末端に対して相補的なPCR伸長の用意をする第1の部分、および増幅させるDNA
分子の適当な末端に対して相補的な第2の部分をそれぞれ有する、二連型PCRプラ
イマーをさらに2つ必要とすると考えられる。

【００５８】次に、PCR増幅産物および線状化ベクターを、本発明のDNA連結反応を行うこと
ができる、内在性エキソヌクレアーゼ活性、好ましくは3'-5'エキソヌクレアー
ゼ活性を有するDNAポリメラーゼの存在下において、適した反応緩衝液中で約5分
〜約60分間、好ましくは約10分〜約40分間、最も好ましくは約15分〜約30分間イ
ンキュベートする。本明細書に提示した実施例では、精製ワクシニアDNAポリメ
ラーゼを用いた。T4 DNAポリメラーゼ、および大腸菌（E.coli）DNAポリメラー
ゼIのクレノー断片を用いて反応が進むことが示されている。反応緩衝液はDNAア
ニーリング反応に用いられる任意の緩衝液でよい。温度は約35℃〜40℃の範囲で
よく、より好ましくは約37℃である。

【００５９】本発明の方法において働くDNAポリメラーゼは、本明細書の実施例2（実験の項
）に記載する通り、適切な相補配列を持つ末端を有する、2つの線状DNA分子を連
結する能力に関してアッセイすることによって同定しうる。本発明のDNAポリメ
ラーゼは市販のものでもよく、または標準的な組換えDNA技術を用いて調製して
もよい。例えば、マクドナルド（McDonald）およびトラクトマン（Traktman）（
1994）ならびにウィラー（Willer）、マン（Mann）ら（1999）に記載された通り
に、ワクシニアDNAポリメラーゼをワクシニアに感染したBSC-40細胞から精製し
てもよい。または、ワクシニアDNAポリメラーゼを野生型ワクシニアウイルスに
感染した細胞から精製してもよい。本発明者らは、ポリメラーゼのアッセイを行
い、相補的なヌクレオチド配列を持つ末端を有する、2つの線状DNA分子を連結す
る能力を測定する。これらには、バクテリオファージ（例えば、T4、T7）、細菌
（例えば、大腸菌（E.coli））、真菌（例えば、S. セレビシエ（S. cerevisiae
））ならびにウイルス（例えば、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ
ウイルス、アフリカブタコレラウイルスおよび他のイリドウイルスならびにバキ
ュロウイルス）によってコードされるものが含まれるが、限定されない。本発明
において有用なDNAポリメラーゼは、好ましくは内在性3'-5'エキソヌクレアーゼ
活性を持つ。本発明はまた、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を持つDNAポリメラー
ゼも含むように拡張される。

【００６０】反応の効率を高めるため、および／または反応産物を安定化するために、さま
ざまな公知の刺激因子をインキュベーション混合物に加えてもよい。適した刺激
因子には一本鎖DNA結合タンパク質が含まれる。用いうる一本鎖DNA結合タンパク
質の中には、ワクシニアおよび大腸菌（E.coli）の一本鎖結合タンパク質、単純
ヘルペスウイルスICP8タンパク質、ならびに酵母およびヒトの複製プロテインA
（例えば、yRPAおよびhRPA）が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、
本発明の方法においてDNAポリメラーゼと組み合わせて有用に用いうる、他の適
した刺激因子を容易に同定しうると考えられる。本発明の1つの局面においては
、ワクシニア一本鎖結合タンパク質を用いて、ワクシニアDNAポリメラーゼを用
いる本発明のDNAクローニング法の収率を高める。

【００６１】本発明の方法を用いて、任意の種類または数の標的DNA分子のPCRクローニング
を行うことができる。サイズに関する唯一の制限は、宿主細胞内での形質転換お
よび複製において、ベクター分子が挿入物を保持しうる収容能である。プラスミ
ド、コスミド、ファージ、BACなどの、原核生物または真核生物の細胞内で複製
可能な任意のベクターを、本発明に用いることができる。ベクターの選択は、例
えばタンパク質発現などの所望の機能特性、および形質転換を行う宿主細胞に依
存する。好ましくは、ベクターは約5から約100ヌクレオチド、好ましくは約8か
ら約50ヌクレオチド、最も好ましくは約10から約35ヌクレオチドの公知の配列を
、選択した制限酵素部位の一方の側に有する。本発明の方法を用いて組換えDNA
分子に組み入れられるDNA分子は、制限酵素切断を用いて、原核生物または真核
生物のゲノムのゲノムDNA、ならびにプラスミド、コスミド、ファージ、BACなど
を含む種々のベクターから入手してもよい。または、DNA分子を自動合成などに
より合成してもよい。核酸は任意の種由来のmRNA、tRNAおよびrRNAなどのRNA種
に由来してもよく、サムブルック（Sambrook）ら（1989）に記載された通りに、
まず逆転写酵素によってcDNAに変換して増幅してもよい。

【００６２】本発明の方法を用いて線状化ベクターに挿入しようとする線状DNA分子は、PCR
増幅によって入手する必要はない。このような分子は、制限酵素消化によって環
状二本鎖DNA分子を線状化し、続いて合成オリゴマーリンカーを末端に接着させ
ることにより、またはすでに線状のDNA分子を制限酵素で二次消化し、続いてア
ダプター／リンカーを末端に付加することにより、またはアニールして完全な二
重鎖DNA分子を形成しうる、2つの適切に設計された合成一本鎖DNAオリゴマーの
アニーリングにより、または任意の他の関連した方法によって、調製してもよい
。このような方法によって得られた線状DNA分子を、内在性エキソヌクレアーゼ
活性を有するDNAポリメラーゼの存在下で、線状化ベクターDNA分子とインキュベ
ートすることにより、所望の組換えDNA分子が得られると考えられる。したがっ
て、本発明はまた、以下の段階を含む、組換えDNA分子を構築する方法に関する
：線状化ベクターDNA分子を提供する段階；連結させようとする線状化ベクターDNA分子の末端に対して、実質的に相補的
な末端を有する線状の挿入DNA分子を提供する段階；ならびに 2つのDNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの存在下において線状
化ベクターDNA分子および線状の挿入DNA分子をインキュベートする段階であって
、ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、DNA分子を連
結する段階。

【００６３】組換えDNA分子の形質転換線状化ベクターおよびPCR増幅産物とのDNAポリメラーゼのインキュベーション
によって得られる反応混合物を、標準的な形質転換手順を用いて任意の宿主細胞
の形質転換を行うために直接用いてもよい。したがって、本発明は以下の段階を
含む、組換えDNA産物を作製する方法も提供する：それぞれ第1および第2の末端を有する、線状化ベクターDNA分子および鋳型DNA
分子を提供する段階；線状化ベクター分子の第1の末端に対して相補的なヌクレオチド配列を、鋳型D
NA分子の第1の末端上に組み入れると考えられるヌクレオチド配列を含む5'末端
、および鋳型DNA分子の第1の末端上の適した位置にハイブリダイズするように設
計された3'末端を有する、第1のプライマーDNA分子を提供する段階；線状化ベクター分子の第2の末端に対して相補的なヌクレオチド配列を、鋳型D
NA分子の第2の末端上に組み入れると考えられるヌクレオチド配列を含む5'末端
、および鋳型DNA分子の第2の末端上の適した位置にハイブリダイズするように設
計された3'末端を有する、第2のプライマーDNA分子を提供する段階；第1および第2のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて鋳型DNA分
子を増幅して、PCR増幅産物を提供する段階； DNAポリメラーゼの存在下でPCR増幅産物を線状化ベクターDNA分子とともにイ
ンキュベートして、組換えDNA分子を生成する段階；組換えDNA分子を宿主細胞へ形質転換する段階；ならびに組換えDNA産物を単離する段階であって、ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、本発明のDNA
連結反応を行うことができる段階。選択的には、適した刺激因子を本発明の方法
に用いてもよい。例えば、組換えDNA分子を生成するために、DNAポリメラーゼお
よび一本鎖DNA結合タンパク質の存在下で、PCR増幅産物を線状化ベクターDNA分
子とともにインキュベートしてもよい。

【００６４】大腸菌（E.coli）SURE、JM105、DH5α、HB101、XL1-blueなどの、形質転換を
行うことができる任意の種類の細胞が宿主細胞として役立つ。その他の細菌宿主
には桿菌またはシュードモナス属などが含まれうる。例えば、真核宿主細胞には
サッカロミセス属が含まれうる。本発明の利点の一つは、本方法が挿入DNAの正
しい方向に関して選択的であることである。このため、組換えベクターにより形
質転換された宿主細胞は、そのベクター中に挿入DNAを正しい向きで有すると考
えられる。

【００６５】本発明は、本発明の方法を用いて任意の線状DNA分子を線状化ベクター分子内
にクローニングすることによって得られた、反応産物による宿主細胞の形質転換
も含むように拡張される。クローニングしようとする線状DNA分子は、上記のよ
うにPCRを用いて調製してもよく、または制限酵素消化によって環状二本鎖DNA分
子を線状化し、続いて合成オリゴマーリンカーを末端に結合させることにより、
またはすでに線状のDNA分子を制限酵素により二次消化した後、アダプター／リ
ンカーを末端に付加することにより、またはアニーリングによって完全な二重鎖
DNA分子を形成しうる2つの適切に設計された合成一本鎖DNAオリゴマーのアニー
リングにより、または任意の他の関連した方法によって、調製してもよい。

【００６６】キット本発明は、PCR産物（または末端に適当な相同ヌクレオチドを有する、任意の
他の線状DNA分子）を線状化ベクター中に指向的にクローニングするのに適した
キットも提供する。本キットは、別々の容器内に、本発明のDNA連結反応を行う
ことができる内在性エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼのアリコ
ート、および反応緩衝液のアリコートを含んでもよい。アリコートとは、少なく
とも1回のクローニングのプログラムを行うのに十分な成分量を指す。DNAポリメ
ラーゼは公知の濃度の溶液として、選択的に適した安定化剤を含む緩衝液中で提
供してもよく、または適した緩衝液に溶解するための凍結乾燥産物の所定のアリ
コートとして提供してもよい。本キットは選択的には、一本鎖DNA結合タンパク
質などの刺激因子のアリコートを含みうる。本キットはまた、陽性対照反応を行
うために必要な試薬も含みうる。このような試薬には、別々の容器内に、線状化
ベクターのアリコート、適当な相補配列を有する第1および第2の末端を持つ挿入
DNAのアリコート、本発明のDNA連結反応を行うことができる内在性エキソヌクレ
アーゼ活性を有するDNAポリメラーゼのアリコート、選択的に、一本鎖DNA結合タ
ンパク質などの刺激因子のアリコート、および反応緩衝液のアリコートが含まれ
うる。

【００６７】以下の実施例で本発明をさらに例示する。しかし、これらの実施例は例示のみ
を目的としたものであり、いかなる形でも本発明の範囲を制限するために用いら
れるべきではないことが理解されるべきである。

【００６８】実験に基づく実施例材料および方法線状基質は、プラスミドpDW101の制限酵素消化の後にフェノール抽出およびエ
タノール沈殿を行うことによって調製した。pDW101は、ヌクレオチド618位、619
位および621位の自然欠失によってpBluescript（KS+）（Stratagene）から得ら
れる。いくつかの実験では、線状基質をアガロース電気泳動によって精製し、ジ
ーンクリーンII（Geneclean II）キット（New England Biolabs）を用いてアガ
ロースから抽出した。[α-³²P]dCTPおよび[γ-³²P]dATPは、NEN／マンデルサイ
エンティフィック（Mandel Scientific）社から購入した。末端標識がなされた
基質は、小エビアルカリホスファターゼ（United States Biochemical、Clevela
nd）で処理した後に、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよび［γ-³²P］dATP（3000
Ci/mmol）、またはクレノー酵素および［α-³²P］dCTP（3000Ci/mmol）のいずれ
かとともにインキュベートすることによって作製した。取り込まれなかった放射
性ヌクレオチドをG-25スピンカラム（Pharmacia）によって除去し、放射能をチ
ェレンコフ（Cherenkov）（Schneider、1971）によって定量した。HindIIIで消
化したλファージDNA、およびHaeIIIで消化したΦX174 DNAマーカーは、ニュー
イングランドバイオラボ（New England Biolabs）社から購入した。ルシフェラ
ーゼアッセイキットはプロメガ（Promega）社から購入した。

【００６９】細胞およびウイルス培養 BSC-40細胞はE. ナイルズ（E. Niles）博士（SUNY、Buffalo）から寄贈を受け
たものであり、1％非必須アミノ酸および5％ウシ胎仔血清を添加したDMEM（Gibc
o BRL）中で、5％CO2環境において37℃で増殖させた。ワクシニアウイルス（WR
株）はATCCから購入した。

【００７０】実験1：ワクシニアDNAポリメラーゼの精製ワクシニアに感染したBSC-40細胞からのワクシニアDNAポリメラーゼの精製は
記載されている（McDonaldおよびTraktman 1994；Willer、Mannら 1999）。簡潔
に述べると、vTMPOLおよびVTF7.5に共感染させた、150cm²培養皿60枚分のBSC40
細胞由来の粗溶解物を、DEAEセルロース、ホスホセルロース、セラミックヒドロ
キシアパタイトおよびハイトラップ（HiTrap）ヘパリンカラムによる精製にかけ
た。各クロマトグラフィー段階で溶出する活性画分を、DNAポリメラーゼアッセ
イ法によって決定した（Willer、Mannら 1999）。タンパク質の純度は変性ポリ
アクリルアミドゲルの銀染色によって決定した。タンパク質濃度は色素結合アッ
セイ法（Biorad）およびウシ血清アルブミン標準を用いてアッセイした。

【００７１】実験2：正確なDNAポリメラーゼ活性のアッセイ法本発明者らは、バクテリオファージ（例えば、T4、T7）、細菌（例えば、大腸
菌（E.coli））、真菌（例えば、S. セレビシエ（S. cerevisiae））およびウイ
ルス（例えば、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アフリ
カブタコレラウイルスおよび他のイリドウイルスならびにバキュロウイルス）に
よってコードされるものなどの、DNAポリメラーゼの内在性の鎖連結活性を測定
する。ポリメラーゼは、30mM Tris-HCl（pH 7.9）、5mM MgCl_２、70mM NaCl、1.
8mMジチオスレイトール、88μg/mLのアセチル化BSA、各350ngの第1および第2の
線状DNA基質、ならびにアッセイしようとするポリメラーゼを含む、反応混合物
をインキュベートすることにより、DNA連結反応におけるその活性を測定するた
めにアッセイした。第1および第2の線状DNA基質は、それぞれ右端および左端に
相補的ヌクレオチド配列を持たなければならず、これらは化学合成、および制限
エンドヌクレアーゼ消化などによる、遺伝子または遺伝子の部分としてゲノム、
プラスミドまたは他のベクター中に存在する天然の核酸配列からの核酸断片の導
出を含む、さまざまな方法によって入手しうる（例えば、上記の材料および方法
の項に述べた線状基質の調製を参照のこと）。臭化エチジウムで染色したアガロ
ースゲル上で二量体の形成が検出されれば、ポリメラーゼには必要な活性がある
。好ましいポリメラーゼであれば、約1％を上回る二量体産物の形成が可能にな
ると考えられる。

【００７２】実験3：DNA連結反応標準的なDNA連結反応液（20μL）には、30mM Tris-HCl（pH 7.9）、5mM MgCl
_２、70mM NaCl、1.8mMジチオスレイトール、88μg/mLのアセチル化BSA、各350ng
の線状基質、および種々の量（通常0.1μg）の精製ワクシニアDNAポリメラーゼ
が含まれた。一本鎖結合タンパク質を用いるDNA連結反応物にはまた、25μg/mL
の組換えワクシニア一本鎖結合タンパク質（IL3遺伝子産物と考えられる、Tseng
ら1999）も反応混合物に含まれた。以前の記載の通りに（ZhangおよびEvans、19
93）、反応液を37℃で20分間インキュベートし、タンパク質を除去し、反応産物
を0.8％アガロースゲルによって分離した。エチジウムで染色したゲルは、ポラ
ロイド（登録商標）（Polaroid）６６５フィルムを用いてUV照明下で撮影した。
DNAの定量は濃度測定によって行った。

【００７３】 2つの線状基質の連結：ワクシニアDNAポリメラーゼが鎖連結反応を触媒しうることを示すため、分子
の末端に少量の重複した配列相同性を共有する2つの線状二重鎖基質を調製した
。これは、pDW101（配列番号1）をEcoRI（配列番号2）およびXhoI（配列番号3）
（図1A）で切断し、正しい方向に向いた33bpの配列を残すことによってなされた
。次にDNAポリメラーゼをこれらのDNAとともにインキュベートし、ゲル電気泳動
を用いてコンカテマー形成活性に関してアッセイした。ポリメラーゼが投入した
DNAの45％を10分間で二量体産物に変換し、同時に単量体分子が減少することが
観察された（図1B）。二量体の収率はその後はわずかに低下し、分子の約35％が
産物に変換されて安定した。反応収率はまた、タンパク質濃度にも依存した（図
1C）。

【００７４】二重鎖アニーリングによって選択的に相同末端が対合される：この対合反応には、少量の重複した末端相同性を共有する2つの異なるDNA基質
が必要であった。対照では、利用しうる基質のみが同一の二重鎖のプールである
場合には、反応によって連結分子が産生されないことが示された（図5、レーン1
〜6）。2つの基質のどちらの末端が連結されるかを明らかにするために、EcoRI
およびXhoIで切断した分子をさらにScaIで消化し、サイズによる区別が可能なDN
A断片を作製した（図5、挿入図）。長さが4.2kbp、4.8kbpおよび3.0kbpの組換え
体（図5、それぞれレーン9、11および13）の出現によって判定された通り、ワク
シニアDNAポリメラーゼはXhoIおよびEcoRI部位を境界とするDNA部分を共有する
、2つの分子を選択的に連結した。このような産物のサイズは、XhoI-EcoRI区間
をコードする3.0kbp＋1.2kbp、3.0kbp＋1.8kbpおよび1.2kbp＋1.8kbpのDNA断片
からなるこれらの分子に一致する。

【００７５】図1および図5に示した相互作用性末端の調製に用いる制限酵素により、4ヌク
レオチドの突出部を有する5'突出末端が残る。末端が反応効率に影響を及ぼすか
否かを試験するために、pDW101を種々の制限酵素で切断することによってさまざ
まな基質を調製した。次に、5'突出末端、平滑末端または5'陥入末端を有する分
子の、すべての可能な組み合わせを、それらが依然として基質であるか否かに関
して試験した。ワクシニアポリメラーゼには末端選好性がないことが見出された
。また、共有する末端相同性の長さが18bp〜84bpの範囲である場合には、二重鎖
産物の収率と配列重複長との間にも明らかな相関はなかった。

【００７６】その他の反応： 84bpの重複相同性を共有する、KpnIおよびNotIで切断した基質を用いて、反応
効率に対するMgCl_２、スペルミジンまたはワクシニアウイルス一本鎖結合タンパ
ク質（SSB）の影響を検査した。マグネシウムの至適反応濃度は約10mMであった
。しかし21mMを超えるスペルミジン濃度と同様に、0mMのMgCl_２は反応を抑制し
た。組換えワクシニアSSB（Tsengら、1999）添加の影響を調べた。主な複製性の
高親和性一本鎖DNA結合タンパク質（SSB）は、13L遺伝子産物と考えられている
（RochesterおよびTraktman、1998；Tsengら、1999）。ワクシニアSSBは25μg/m
Lから100μg/mLの間の濃度で添加すると、連結分子の収率を2〜3倍に高めた（図
6）。最終的な結果として、これらの至適反応条件下では80％を超える基質DNAを
二量体に変換することができた。

【００７７】多数の基質の連結：本DNA連結反応により、多数の基質の組換えを行って高次コンカテマーにする
ことが可能であり、これを利用して反応機構に関してさらなる洞察を提供するこ
とができる。「中間」基質（図7、分子「B」）がその他の2つの分子（「A」およ
び「C」）のいずれかの末端と共通の配列を共有するように、プラスミドpDW101
を制限酵素で切断した。中間の二重鎖は単独ではポリメラーゼ触媒反応の基質で
はなかった（図7、レーン1および4）。しかし、標準的なアッセイ法において3つ
の基質をワクシニアポリメラーゼとインキュベートした場合には、それらは二量
体および三量体の混合物へと急速に変換された（図7、レーン3および6）。少量
のDNA（約2％）は、構造が不明な高次多量体にも変換された。

【００７８】線状三量体に組み入れられた中間分子の場合、分子の両端は酵素処理を受けた
に違いない。これらの分子の末端に導入された可能性のある修飾について検討す
るため、HindIIIで制限処理を行った基質（配列番号4）を標識し、オートラジオ
グラフィーを用いて³²P標識をモニターした。3'末端または5'末端の標識が異な
る結果を受ける否かを調べるために、T4ポリヌクレオチドキナーゼまたはクレノ
ーポリメラーゼを用いて、³²P標識を中間基質に組み込ませた。電気泳動および
エチジウム染色の後にゲルを固定して、オートラジオグラフィーによって標識の
位置を特定した。エチジウム染色ゲルの観察から、二重鎖「B」は3'末端または5
'末端のいずれを標識したかにかかわらずコンカテマーに効率的に組み込まれた
ことが明らかであった（図7、レーン3および6）。しかし、5'標識の大部分は三
量体コンカテマーに組み込まれた一方（図7、レーン3）、3'末端標識はこれらの
分子（図7、レーン6）、またはポリメラーゼで処理した未反応の基質において、
保持されなかった（図7、レーン4）。これらのデータは、MgCl_２の影響と合わせ
て、ワクシニアポリメラーゼの3'-5'エキソヌクレアーゼがインビトロでの連結
分子の産生に重要な役割を果たしていることを示唆する。本明細書に記載のDNA
連結反応において中心的な役割を果たすのはワクシニアDNAポリメラーゼの3'-5'
エキソヌクレアーゼ活性であるが、反応は5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を有す
るDNAポリメラーゼを用いて同様に進行すると考えられる。

【００７９】この反応がワクシニアDNAポリメラーゼの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性に依存
するならば、dNTPはヌクレアーゼを阻害することによって末端連結を阻害すると
予想される。実験によりこの予想が確認された。4種の全dNTPを1μM（総濃度）
添加すると収率は約50％低下し、5μMを上回るdNTPを含む反応液中では連結分子
はほとんど形成されなかった。ジデオキシリボヌクレオチドも阻害性であったが
、これははるかに高い濃度（＞50μM）の場合であった。

【００８０】実施例4：PCR段階無作為に選択した、ショープ線維腫ウイルス（Wills、Delangeら 1983；Delan
ge、Macaulayら 1984）由来のBamHIクローン由来の約800bpの領域を、以下に示
すPCRプライマーを用いて増幅した。大文字はベクター（pDW101）に対して相補
的な配列を表し、小文字はウイルスDNA配列に対して相補的な配列を表す。PCRプ
ライマーは、制限酵素NotIの認識部位に隣接するベクター由来の、相補配列を含
むように設計した。

【００８１】実施例5：ベクターの調製ベクターpDW101を以下に示すようにNotIで消化した：

【００８２】実施例6：組換え分子の作製 PCR増幅断片（320ng）および線状化ベクター（600ng）の両方を、材料および
方法の項で記載したアニーリングアッセイ法により、精製ワクシニアDNAポリメ
ラーゼ（150ng）の存在下で20分間一緒にインキュベートした。反応産物をアガ
ロース電気泳動によって視覚化した（図8）。アガロースゲルにより、これらの
条件下で形成された分子の大半が以前に観察された線状二量体であることが示さ
れた（図8、レーン5）。しかし、PCR増幅がなされた挿入物の両端にはベクター
と共有する相同性があることから、反応産物のごく一部は切れ目の入った環状型
およびより高次のコンカテマー型に特有な位置に移動すると予想され、実際にそ
うであった（図8、レーン6）。これらの反応のいずれも5μMのdNTPの存在下では
起こらなかった（図8、レーン7）。

【００８３】実施例7：コンピテント細胞の形質転換実施例6の反応混合物のアリコート（1〜2μL）を用いて、3種の異なる大腸菌
（E.coli）株（SURE、JM105およびDH5α）を標準的な手順を用いて（SUREおよび
DH5αはエレクトロポレーションにより、JM105は熱ショックにより）形質転換し
た。100μg/mLアンピシリン、40μg/mL X-gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリ
ル-β-D-ガラクトシド）、0.5mM IPTG（イソプロピルチオ-β-ガラクトシド）お
よび50μg/mLチミンを含むLB＋Tプレートに適当な希釈物を播き、37℃で一晩イ
ンキュベートした。以前の記載の通りに（Wilier、McFaddenおよびEvans、1999
）、形質転換コロニーからDNAを単離して配列を決定した。

【００８４】表1は多重組換え不全SURE細胞を用いて得たデータを示しているが、3種の株全
てでいずれも同様の結果が得られた（1μg当たり0.5〜2×10^５の形質転換体）。
白色（W）のコロニーは正しい可能性がある構築物による形質転換を示す。青色
（B）のコロニーはベクター基質のみによる形質転換を示す。安定な形質転換体
の収率が、反応混合物へのワクシニアDNAポリメラーゼの添加に大きく依存する
ことは明らかであった。NotIで切断したベクターは脱リン酸化されていなかった
が、組換え（白色）コロニーは最も豊富な産物であった（この特定の実験におけ
る形質転換体の83％）。13個の推定の組換えプラスミドを精製し、SURE細胞から
回収した13個のプラスミドはすべて、単一のDNA挿入物が組み込まれた単量体で
あることが観察された。DNA配列決定により、13個の分子がすべて、挿入物を正
しい方向で予想された位置にコードしていることも示された。プライマー結合部
位の1つの内部に3つの塩基置換があり、他に2つの変異がTaqポリメラーゼで増幅
したDNAの内部にあった。融合点は相同末端のアニーリングによって形成される
と予想される点であった。ワクシニアウイルスポリメラーゼによって会合された
コンカテマーは、従来のクローニング方法に匹敵する適合度で安定な形質転換体
へと処理されうると結論づけた。

【００８５】

【表１】組換え連結分子による大腸菌（E.coli）の形質転換連結分子は表記の反応成分を含む反応において調製した。大腸菌（E.coli）SU
RE細胞は1μlの反応産物を用いてエレクトロポレーションを行った。細胞（100
μLまたはその等価物）を播き、翌日にコロニーを計数した。細胞のコンピテン
シー（competency）は、制限処理を行っていないpDW101を用いて1μg当たり6×1
0¹⁰の形質転換体と概算された。

【００８６】実施例8：最小限の配列重複連結分子の産生に必要な最小限の相同性の量を決定するために、さらに7つの
プライマー対を合成し、次に8組のオリゴヌクレオチド対を用いて、SFV DNAの約
800bp断片のPCR増幅を再び行った。これらの14個の新規PCRプライマーは、NotI
で切断したベクター中でNotI部位に隣接するヌクレオチドに相同な配列の量がそ
のとき4bp〜18bpの範囲であった点を除いて、構造の点では上記のプライマーと
同様であった。ワクシニアDNAポリメラーゼおよびgpI3L（別の方法では微量の環
状反応産物の検出能を高める）の両方を含む至適アッセイ法において、これらの
基質をベクターDNAとともにインキュベートし、かつ線状および環状の連結分子
の両方を濃度測定によって定量した。これらのおよび他の実験により、基質間の
配列相同性がわずか10bpほどでもワクシニアポリメラーゼによる鎖連結が可能で
あり、至適反応条件は約14bpであることが示された（図9、パネルB）。これらの
反応産物をSURE細胞の形質転換にも用い、白色形質転換体産生の絶対効率には実
験間でいくらか変動があったため、3連で行った。すべての実験において、白色
（組換え）細菌形質転換体の割合は、ゲル電気泳動によって検出された連結分子
の収率と密接に対応した（図9A）。

【００８７】実施例9-ワクシニアウイルスDNAポリメラーゼによる組換えプラスミドDNAのクローニング本発明の方法を利用して、組換えDNA pRP406-SFVのクローニングを首尾良く行
うことができた（図10、11）。

【００８８】本発明のクローニング法を従来のクローニング法と比較した。全体的に、本発
明の方法の方が簡便かつ迅速であった（表2）。

【００８９】ベクター：pRP406（配列番号8）をPacIおよびBstEIIで切断し、より大きな断
片を精製してより小さな介在断片を除去した。

【００９０】挿入物：PCR-SFVQ（約800bp、配列番号9）、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてシ
ョープ線維腫ウイルスDNAの断片を増幅した。PCRプライマーは、切断したベクタ
ーの末端に位置する配列と相同な16bpの配列をDNA末端に付加した（図10）。pRP
406によるDNAの組換えに用いたプライマーを配列番号10および11に示している。

【００９１】

【表２】クローニング手順の比較

【００９２】現時点で好ましい実施例と考えられるものを参照して本出願を説明してきたが
、本発明は開示した実施例に限定されないことが理解されるべきである。反対に
、本発明は添付した特許請求の趣旨および範囲に含まれるさまざまな修正および
等価物も含む。

【００９３】すべての刊行物、特許および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許また
は特許出願の全体が参照として組み入れられるように、具体的および個別に示さ
れている場合と同程度に、それらの全体が参照として本明細書に組み入れられる
。

【００９４】図面の詳細な説明図1. ワクシニアDNAポリメラーゼによって触媒されるDNAアニーリング pDW101をEcoRIまたはXhoIで切断し、33bpの重複する配列相同性を共有する2.9
6kbpの分子を作製した（パネルA）。次に、各0.35μgのDNA基質＋0.1μgのワク
シニアウイルスポリメラーゼを含む、アニーリング反応液（20μL）を調製した
。指定の時間インキュベーションを行った後に、アガロースゲル電気泳動を用い
て反応産物を分画し、臭化エチジウム染色によって視覚化した（パネルB）。ま
たは、各0.35μgのDNA基質＋表記量のDNAポリメラーゼを含む反応液を調製し、3
7℃で20分間インキュベートした（パネルC）。パネルBおよびCでは6kbpの反応産
物が形成された。

【００９５】図2. 三量体の形成パネルAは反応の概略を示している。3つの線状分子の連結は、挿入DNAをベク
ター分子の2つの隣接アームに連結するのに必要な反応と、本質的に同じである
ことに注意されたい。パネルBは、エチジウム染色を行ったアガロースゲル上で
分析した反応産物を示している。3つの基質の1つのみをポリメラーゼに提供した
場合は、連結分子は形成されない。このことは、反応には反応分子の末端におけ
る正しい相補配列が必要であることを示している。

【００９６】図3. DNAカセットのコンビナトリアル融合この単純な概要では、3つの異なるDNA二重鎖のプールを調製する。分子の1つ
のプールでは、各分子の中央部の配列は異なるが、末端は同一である。例えば、
A1〜A5はすべて約20ヌクレオチドの同じ配列を右端に有するが、これらの分子の
中間部分の配列は異なる。「B」プール内の分子の左端は「A」プール内の分子の
右端と適合性がある。同様に、「C」プール内の分子の左端は「B」プール内の分
子の右端と適合性がある。ワクシニアポリメラーゼとの反応により、「A」、「B
」、および「C」プールから選択された分子の1つからなる三量体が生じると考え
られる。この結果得られる三量体のプールは、「A」、「B」、および「C」変種
の無作為な取り合わせを表すはずである。

【００９７】図4. 提案するクローニング法 PCRプライマーは、ベクター挿入部位に隣接する配列に対して相補的な、10個
〜20個の付加的なヌクレオチドをコードする。

【００９８】図5. 基質の必要条件 20μL中に、ワクシニアDNAポリメラーゼ（0.1μg）を加えたまたは加えていな
い、表記の基質DNAを含む反応液を調製した。ポリメラーゼは、いくらかの重複
する末端相同性を共有する2つの基質を与えない限り、連結分子の形成を促進し
ないと考えられる（レーン1〜6）。DNA断片をサイズによって区別しうる場合、
反応産物はXhoI-EcoRI重複領域をコードするDNAを含む（レーン8〜13）。

【００９９】図6. 連結分子の形成に対するワクシニアSSB（gpI3L）の影響標準的な反応液（20μL）には、0.1μgのワクシニアウイルスDNAポリメラーゼ
（E）、または0.1μgのポリメラーゼ＋0.5μgのワクシニアSSB（●）が含まれる
。反応液を表記の時間インキュベートし停止して、ゲル電気泳動（挿入図）およ
び濃度測定によって連結分子の収率を決定した。ワクシニアSSBは反応の程度を
高め、産物を安定化した。

【０１００】図7. ワクシニアウイルスDNAポリメラーゼによって触媒される三量体形成 3つの基質を上のパネルに表記した通りに調製し、ポリヌクレオチドキナーゼ
またはクレノーポリメラーゼを用いて中間の基質（「B」）を標識した。反応液
を表記の通りに調製し、37℃で20分間インキュベートした後に、アガロースゲル
電気泳動を用いて分画した。反応産物はまず臭化エチジウム、次にオートラジオ
グラフィーによって視覚化した。ポリメラーゼ＋単一のDNA基質のみを含む反応
液では連結分子は形成されなかった（レーン1および4）。5'標識のみがポリメラ
ーゼとのインキュベーションを切り抜け、二量体および三量体分子に組み込まれ
た（レーン3）。

【０１０１】図8. ワクシニアウイルスDNAポリメラーゼを用いた、PCR増幅DNAのクローニング約800bpのPCR増幅を行ったDNA断片（「A」）を、表記の通り、NotIで線状化し
たpDW101（「B」）およびワクシニアウイルスDNAポリメラーゼを伴ってまたは伴
わずにインキュベートした。反応産物を電気泳動によって分離し、臭化エチジウ
ムで視覚化した。連結分子はレーン6のみに観察された。これらの連結分子の大
部分は線状二量体と予想される位置に移動したが（レーン6）、反応産物のごく
一部は切れ目の入った環状分子に典型的な位置に移動した（矢印）。5μM dNTP
の添加によって反応は完全に停止した（レーン7）。これらの反応産物を用いる
大腸菌（E.coli）の形質転換の影響を表1にまとめた。

【０１０２】図9. 連結分子の形成に対する相同性の長さの影響 pBluescriptベクター中のNotI部位に隣接して見出される配列と同一の、4、6
、8…18bpの末端配列を含む、PCR増幅を行ったDNAを調製した。PCR増幅を行った
DNA＋NotIで切断したベクターの混合物を0.1μgのワクシニアDNAポリメラーゼお
よび0.5μgのgpI3Lとともに10分間インキュベートした後に、アガロースゲル電
気泳動によって分離した（パネルB、挿入図）。各反応における線状二重鎖（○
）および環状連結分子の収率を濃度測定によって決定した（パネルB）。ポリメ
ラーゼを加えない場合は連結分子が生じなかった（△）。反応産物（＋2つの他
の実験で調製した連結分子）を細菌SURE細胞に形質転換し、組換え体の収量を表
Iの通りに決定した（パネルA）。

【０１０３】図10は、本発明の方法を用いて組換えDNA pRP406-SFVをクローニングするため
に組換え操作を行う、DNA地図を提供する。

【０１０４】図11は、図10（0.8％アガロースゲル上に示す）に示した線状DNAのインビトロ
組換えの結果を示している。連結反応の後に、1ulの反応液を形質転換に用いた
。残りの溶液はタンパク質を除去して電気泳動を行った。

【０１０５】本明細書に参照される参考文献の全引用

【図面の簡単な説明】

本発明の特徴は、添付の図面に関して言及した以下の説明によってさらに明ら
かになると考えられる：

【図１】本発明の方法を用いた、2つの線状DNA分子の連結に関する概略図
（パネルA）および実験結果（パネルBおよびC）を示す。

【図２】本発明の方法を用いた、3つの線状DNA分子の連結に関する概略図
（パネルA）および実験結果（パネルB）を示す。

【図３】本発明の方法の、DNAカセットのコンビナトリアル融合への応用
に関する概略図を示す。

【図４】本発明の方法の、PCR産物のクローニングへの応用を示す概略図
を示す。

【図５】本発明のDNA連結法における、重複末端および非重複末端の相同
性の影響を調査するアッセイ法に関する概略図および実験結果を示している。

【図６】本発明の方法を用いた、連結分子形成に対するワクシニア一本鎖
結合タンパク質の影響を示すグラフおよび実験結果（挿入図）である。

【図７】本発明の方法を用いた3つの線状DNA分子の連結時における3つの
線状DNA基質の連結、ならびに5'および3'末端標識の結果を示す概略図および実
験結果を提供する。

【図８】本発明の方法を用いた、PCR増幅DNAのクローニングに関する概略
図および実験結果を提供する。

【図９】本発明の方法における、連結分子形成に対する相同性の長さの影
響をグラフとして示す。

【図１０】本発明の方法を用いて、組換えDNA pRP406-SFVをクローニング
するために組換え操作を行うDNAの地図を提供する。

【図１１】図10に示した線状DNAのインビトロ組換えの結果を示す（0.8％
アガロースゲル）。

【配列表】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１４年７月２日（２００２．７．２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号６０／２６３，７７１ (32)優先日平成13年１月25日(2001．1．25) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ヤオクシャオ−ダンカナダ国オンタリオ州ゲルフストーンロードウェスト 45−252 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA04 CA10 EA04 HA08 HA14 HA19

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 2つの線状DNA分子を連結する方法であって、第1の末端および第2の末端を有する第1の線状DNA分子を提供する段階；第1の末端および第2の末端を有する第2の線状DNA分子を提供する段階；ここで、第1の線状DNA分子は、第2の線状DNA分子の第1の末端または第2の末端
のいずれかにあるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を、第1
の末端または第2の末端のいずれかに有し；ならびに 2つの線状DNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの存在下において2
つの線状DNA分子をインキュベートする段階を含む方法。
【請求項２】 3つの線状DNA分子を連結する方法であって、第1の末端および第2の末端を有する第1の線状DNA分子を提供する段階；第1の末端および第2の末端を有する第2の線状DNA分子を提供する段階；第1の末端および第2の末端を有する第3の線状DNA分子を提供する段階；ここで、第1の線状DNA分子は、第2の線状DNA分子の第1の末端または第2の末端
のいずれかにあるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を第1の
末端に有し、第1の線状DNA分子は、第3の線状DNA分子の第1の末端または第2の末
端のいずれかにあるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を第2
の末端に有し、ならびに 3つの線状DNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの存在下において3
つの線状DNA分子をインキュベートする段階を含む方法。
【請求項３】 2つまたはそれ以上の線状DNA分子を連結する方法であって、 1つの線状DNA分子のx'鎖の5'末端が、それに連結させようとする線状DNA分子
のx鎖の5'末端に対して相補的なヌクレオチド配列を有する、反対の極性をもつx
鎖およびx'鎖をそれぞれ有する、2つまたはそれ以上の線状DNA分子を提供する段
階；ならびに 2つまたはそれ以上の線状DNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの
存在下において2つまたはそれ以上の線状DNA分子をインキュベートする段階を含み、ここで、DNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、DNA分子を
連結する方法。
【請求項４】 DNAポリメラーゼが3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する、
請求項1、2または3記載の方法。
【請求項５】 DNAポリメラーゼが、ワクシニアウイルスDNAポリメラーゼ、
T4 DNAポリメラーゼ、および大腸菌（E.coli）DNAポリメラーゼIのクレノー断片
からなる群より選択されるポリメラーゼを含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】 DNAポリメラーゼがワクシニアウイルスDNAポリメラーゼを含
む、請求項5記載の方法。
【請求項７】 2つまたはそれ以上の線状DNA分子をDNAポリメラーゼおよび
刺激因子の存在下でインキュベートする、請求項1から6のいずれか一項記載の方
法。
【請求項８】刺激因子が一本鎖DNA結合タンパク質である、請求項7記載の
方法。
【請求項９】一本鎖DNA結合タンパク質がワクシニア一本鎖DNA結合タンパ
ク質である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】各線状DNA分子上の相補的ヌクレオチドの配列の長さが、
約5から約100ヌクレオチドの間である、請求項1から9のいずれか一項記載の方法
。
【請求項１１】各線状DNA分子上の相補的ヌクレオチドの配列の長さが、
約8から約50ヌクレオチドの間である、請求項1から9のいずれか一項記載の方法
。
【請求項１２】各線状DNA分子上の相補的ヌクレオチドの配列の長さが、
約10から約35ヌクレオチドの間である、請求項1から9のいずれか一項記載の方法
。
【請求項１３】線状DNA分子を環状化する方法であって、線状DNA分子の各末端上に実質的に相補的な核酸配列を導入すると考えられる
プライマーの存在下で、線状DNA分子のPCR増幅を行う段階；および PCR増幅がなされた線状DNA分子を、線状DNA分子が環状化される条件下で、DNA
ポリメラーゼの存在下においてインキュベートする段階を含み、ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、DNA分子を環
状化する方法。
【請求項１４】組換え分子を構築する方法であって、それぞれ第1および第2の末端を有する、線状化ベクターDNA分子および鋳型DNA
分子を提供する段階；線状化ベクター分子の第1の末端に対して相補的なヌクレオチド配列を、鋳型D
NA分子の第1の末端上に組み入れると考えられるヌクレオチド配列を含む5'末端
、および鋳型DNA分子の第1の末端上の適した位置にハイブリダイズする3'末端を
有する、第1のプライマーDNA分子を提供する段階；線状化ベクター分子の第2の末端に対して相補的なヌクレオチド配列を、鋳型D
NA分子の第2の末端上に組み入れると考えられるヌクレオチド配列を含む5'末端
、および鋳型DNA分子の第2の末端上の適した位置にハイブリダイズする3'末端を
有する、第2のプライマーDNA分子を提供する段階；第1および第2のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて鋳型DNA分
子を増幅して、PCR増幅産物を提供する段階；ならびに組換えDNA分子を生成する条件下で、DNAポリメラーゼの存在下でPCR増幅産物
を線状化ベクターDNA分子とともにインキュベートする段階を含み、ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、DNA分子を連
結する方法。
【請求項１５】 PCR増幅産物および線状化ベクターDNA分子を、3'-5'エキ
ソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼの存在下でインキュベートする、
請求項13記載の方法。
【請求項１６】 DNAポリメラーゼが、ワクシニアウイルスDNAポリメラーゼ
、T4 DNAポリメラーゼ、および大腸菌（E.coli）DNAポリメラーゼIのクレノー断
片からなる群より選択されるポリメラーゼを含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】 DNAポリメラーゼがワクシニアウイルスDNAポリメラーゼを
含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】 PCR増幅産物および線状化ベクターDNA分子をDNAポリメラ
ーゼおよび刺激因子の存在下でインキュベートする、請求項15から17のいずれか
一項記載の方法。
【請求項１９】刺激因子が一本鎖DNA結合タンパク質である、請求項18記
載の方法。
【請求項２０】一本鎖DNA結合タンパク質がワクシニア一本鎖DNA結合タン
パク質である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】各線状DNA分子上の相補的ヌクレオチドの配列が約5から約
100ヌクレオチドの間である、請求項15から20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】各線状DNA分子上の相補的ヌクレオチドの配列が約8から約
50ヌクレオチドの間である、請求項15から20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】相補的ヌクレオチドDNA分子の配列が約10から約35ヌクレ
オチドの間である、請求項15から20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】ベクターが原核生物または真核生物の宿主細胞をトランス
フェクトすることができる、請求項15から23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】ベクターがプラスミド、コスミド、ファージおよびBACか
らなる群より選択されるベクターを含む、請求項24記載の方法。
【請求項２６】ベクターがプラスミドを含む、請求項25記載の方法。
【請求項２７】ベクターがpDW101を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】組換えDNA分子を構築する方法であって、線状化ベクターDNA分子を提供する段階；連結させようとする線状化ベクターDNA分子の末端に対して実質的に相補的な
末端を有する、線状の挿入DNA分子を提供する段階；ならびに 2つのDNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの存在下において線状
化ベクターDNA分子および線状の挿入DNA分子をインキュベートする段階を含み、ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、DNA分子を連
結する方法。
【請求項２９】線状の挿入DNA分子が、制限酵素消化による環状二本鎖DNA
分子の線状化に続いて、末端に合成オリゴマーリンカーを接着させることにより
得られるか；またはすでに線状のDNA分子を制限酵素で二次的に消化した後に、
アダプター／リンカーを末端に付加することにより得られるか；または完全な二
重鎖DNA分子を形成するために、2つの適切に設計された合成一本鎖DNAオリゴマ
ーをアニーリングすることにより得られる、請求項28記載の方法。
【請求項３０】組換えDNA産物を産生する方法であって、それぞれ第1および第2の末端を有する、線状化ベクターDNA分子および鋳型DNA
分子を提供する段階；線状化ベクター分子の第1の末端に対して相補的なヌクレオチド配列を、鋳型D
NA分子の第1の末端上に組み入れると考えられるヌクレオチド配列を含む5'末端
、および鋳型DNA分子の第1の末端上の適した位置にハイブリダイズする3'末端を
有する、第1のプライマーDNA分子を提供する段階；線状化ベクター分子の第2の末端に対して相補的なヌクレオチド配列を、鋳型D
NA分子の第2の末端上に組み入れると考えられるヌクレオチド配列を含む5'末端
、および鋳型DNA分子の第2の末端上の適した位置にハイブリダイズする3'末端を
有する、第2のプライマーDNA分子を提供する段階；第1および第2のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて鋳型DNA分
子を増幅して、PCR増幅産物を提供する段階；組換えDNA分子を生成する条件下で、DNAポリメラーゼの存在下でPCR増幅産物
を線状化ベクターDNA分子とともにインキュベートする段階；宿主細胞に組換えDNA分子を形質転換する段階；ならびに組換えDNA産物を単離する段階を含み、ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、DNAを連結す
る方法。
【請求項３１】線状DNA分子の直接的なクローニングのためのキットであ
って、別々の容器にDNAポリメラーゼおよび反応緩衝液を含み、ここでDNAポリメ
ラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、DNA連結反応を行うことができ
るキット。
【請求項３２】刺激因子をさらに含む、請求項31記載のキット。
【請求項３３】刺激因子が一本鎖DNA結合タンパク質である、請求項32記
載のキット。
【請求項３４】陽性対照反応を行うための試薬をさらに含む、請求項31か
ら33のいずれか一項記載のキット。
【請求項３５】陽性対照を行うための試薬が、線状化ベクター、適当な相
補配列を有する第1および第2の末端を持つ挿入DNA、DNA連結反応を行うことがで
きる、内在性エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼ、および反応緩
衝液を含む、請求項34記載のキット。
【請求項３６】陽性対照を行うための試薬が刺激因子をさらに含む、請求
項35記載のキット。
【請求項３７】挿入DNAがPCR増幅産物である、請求項36記載のキット。
【請求項３８】請求項1から30のいずれか一項記載の方法に従って調製さ
れるDNA分子。
【請求項３９】エキソヌクレアーゼ活性を有し、かつDNA分子を連結する
ことができる、DNA分子のクローニングのためのDNAポリメラーゼ分子の使用。
【請求項４０】 DNA分子がPCRによって産生される、請求項39記載の使用。
【請求項４１】 DNAポリメラーゼが、ワクシニアウイルスDNAポリメラーゼ
、T4 DNAポリメラーゼ、および大腸菌（E.coli）DNAポリメラーゼIのクレノー断
片からなる群より選択されるポリメラーゼを含む、請求項39または40のいずれか
一項記載の使用。
【請求項４２】部位特異的（site-directed）変異誘発のための、請求項1
3記載の方法の使用。
【請求項４３】担体、およびエキソヌクレアーゼ活性を有し、かつ線状DN
A分子を連結することができるDNAポリメラーゼを含む、DNA分子のクローニング
のための組成物。