JP4854160B2 - Ｄｎａの連結方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
発明の分野
本発明は、組換えDNA技術の分野におけるものである。具体的には、本発明はDNAポリメラーゼを用いて1つまたは複数のDNA分子を指向的に連結する方法、およびPCR産物のクローニングへの本方法の応用に関する。
【０００２】
発明の背景
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（MullisおよびFaloona 1987；Saiki, Gelfandら、1988）は科学研究に不可欠な手法である。PCR産物のクローニングはしばしば、研究目標に到達するために必須の段階である。PCRクローニングは数々の課題を提示し、その制限を最小限にするために何年にもわたってさまざまな手法が考案されてきた。PCR産物のクローニングは一般に以下の方法のうちの一つである；i）制限酵素およびリガーゼを用いる従来のPCRクローニング、ii）TベクターまたはTAクローニング、iii）ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）に基づくクローニング、iv）PCRに基づく手法、v）インビボ・リコンビナーゼ法、およびvi）エキソヌクレアーゼを介したクローニング。これらの方法のそれぞれを以下に説明する。
【０００３】
i）従来のPCRクローニング
PCRで増幅したDNAのクローニングは従来、後にPCR産物を適切な酵素で消化した上で適合性のあるベクター中に挿入することが可能なように、PCRプライマーに制限エンドヌクレアーゼ（RE）部位を組み込むことによって容易となった（Sharfら、1990）。この方法にしばしば起こる一つの問題は、REの認識配列がDNA基質の末端に近い場合には公知であるように、REによる切断がうまく行われないことである（KaufmanおよびEvans 1990）。第2の問題は、同じREに対する第2の制限酵素部位が気付かれずに存在する場合、PCRで増幅した領域内部の配列が失われる可能性がある点である。このため、どのREを用いるかを選択する前にPCR産物の完全な配列が知られている必要がある。ひとたびベクターおよびDNA挿入物を同じREで消化すれば、2つのDNA分子をDNAリガーゼによって一般に4時間〜12時間かかる反応で共有結合させることができる。任意の連結反応の際にベクターおよび挿入物が適切な比で存在することが重要であることに注意すべきであるが、これはしばしば決定が困難である。次にこの反応産物を用いてコンピテント大腸菌（E.coli）細胞を形質転換する。この主題をわずかに変更した、後に連結反応を行う必要のない「重複伸長による連結」と呼ばれる変法が考案されているが、これはさらに2つのプライマーを必要とし、全ベクター配列自体も増幅しなければならない（Shuldiner、Tannerら 1991）。
【０００４】
PCR断片の平滑末端クローニングも広く用いられているが、2つの平滑末端DNA分子を共に連結する場合にDNAリガーゼに問題が生じるため、この手法の効率は比較的低い。この手法も、Taqポリメラーゼ（原型のPCR増幅酵素）がそのターミナルトランスフェラーゼ活性によって、3'末端にアデニン残基を付加する傾向があるという事実により複雑になる（Clark 1988；Mole、Iggoら 1989）。Taqポリメラーゼを用いて生成される全PCR産物の約50％は、これらの3'伸長物を含む（Clark、1988）。この問題に関する方法の一つは、プロトコールにもう1つ段階を加えて、これらの付加されたアデニン残基をクレノー酵素（Hemsley、Arnheimら 1989）またはT4 DNAポリメラーゼ（CostaおよびWeiner 1994）で「研磨」または除去することである。
【０００５】
パイロコッカス・フリオーシス（Pyrococcus furiosis）由来のPfuポリメラーゼおよび古細菌サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来のVentRポリメラーゼを含む、最近発見されたさまざまな耐熱性ポリメラーゼは、固有の3'-5'エキソヌクレアーゼ活性により、3'アデニン残基の伸長を生じない。増幅ポリメラーゼによって生じる問題に加えて、この手法では指向性クローニングは可能ではなく、組換えDNAにおける挿入物の向きをあらかじめ定めることはできないことを意味する。
【０００６】
ii）TベクターおよびTAクローニング
Taqポリメラーゼのターミナルトランスフェラーゼ活性は、TAクローニングとして現在一般的に知られている手法において、多くの研究者によって活用されてきた。PCRで増幅したDNA上に見出される3'突出アデノシン残基に対する天然の相補物である、チミジン残基が突出した末端が得られるように、選択したベクターを適切なREで消化する。この手法の最も重大な欠点は、適合性のある末端が生じるようにベクターを特別に操作しなければならないことである。この目標を達成する唯一の簡単な方法は、平滑末端が生じるようにベクターを制限処理した後に、それをdTTPのみの存在下でTaqポリメラーゼで処理することである。数多くの企業がこの手法に基づくキットを開発しており、これにはストラタジーン（Stratagene）社のpCR-Script（商標）SK(S) キット、プロメガ（Promega）社のpGEM（登録商標）-T、ファルマシア（Pharmacia）社のSureClone（商標）連結キットおよびノバジェン（Novagen）社のpT7Blue Tベクターキットが含まれる。これらの方法に対する主な制限は、製造者が供給するベクターを使わねばならず、クローニングしたDNA断片を選択したベクターに移行させる第2のサブクローニング段階がしばしば必要なことである。これらのキットを購入する代わりとなる、安価な選択肢の一つは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection（ATCC））からわずかな費用または無料で入手しうる、TベクターpGEM（登録商標）5fZ(+)を用いることである。このベクターをXcmIで消化すると、TAクローニングに用いるT突出部が得られる（Kovalic、Kwakら 1991；Mead、Peyら 1991）。適切なRE消化の後に適した末端が得られる、他のTベクターが数多く独立に開発されている（Cha、Bishaiら 1993；IchiharaおよびKurosawa 1993）。しかし、このようなベクターを作製するためには多くの操作が必要であった。最近、これらのキットに伴う可能性のある他の問題も報告されている（Hengen 1995）。pCR-Scriptベクターを単独で試験した場合に、高いバックグラウンド値が観察されており、PCRIIはpBR322の複製起点を含み、したがって複製されるコピー数が少なく、かつ-20℃での凍結解凍サイクルの繰り返しにより、T尾部の不安定化および損失がもたらされる。すべてのTベクター法には、指向的でなく、連結段階を要するという欠点がある。
【０００７】
インビトロゲン（Invitrogen）社は、連結段階の必要性を回避することにより、従来のTAクローニング法を改良した。TOPO TAクローニングと呼ばれるこの方法では、トポイソメラーゼIと呼ばれるワクシニアウイルス酵素によって触媒される反応を利用する（Shuman、1994および米国特許第5,766,891号）。トポイソメラーゼは二本鎖DNAと結合して、二重鎖のうち一方のホスホジエステル骨格を切断することができる。本酵素は配列特異的で、主として認識配列5'-(C/T)CCTT↓-3'で切断する（ShumanおよびPrescott 1990；Shuman 1991）。本酵素は元の鎖を逆に再連結することができるか、または組換え種の形成に際して2つの異種DNAを連結することができる（Shuman 1992；Shuman 1992）。本反応は非常に効率が良く、実験台上でのわずか5分のインキュベートしか要しない。本方法には、リガーゼが必要でなく、挿入物の全配列に関する情報が必要でなく、PCRプライマーに別のヌクレオチドを付加する必要がないという利点もある。しかし、TOPO認識配列を含むように操作された、特定のプラスミドしか使用できない。これらのベクターは、ベクターを制限処理した後に特定のリンカーまたはアダプターを付加することによって作製されるが、これは容易な作業ではない。この手法のもう1つの制限は、TOPO認識配列はベクターの3'末端から10bp以内に位置しなければならず、さらに挿入物に5-OH基がなければならない点である。増幅されるDNA内の内部認識配列により、問題が起こりうるという問題点も提起されているが、これらの部位は単に再連結されるだけであり、この手法に何ら制限を課すものではない（Shuman 1994；Stivers、Shumanら 1994）。一般的な使用に際して、インビトロゲン（Invitrogen）社のキットは別の潜在的な問題を提供した（未発表の結果）。クローンのスクリーニングのための、青／白選択（blue-white selection）と呼ばれる従来の方法では、インビトロゲン（Invitrogen）社のキットを用いると確定的な結果が得られない。このため、正しい構築物が得られることを確認するためには、白色および淡青色のコロニーの両方をアッセイする必要がある。
【０００８】
iii）ウラシルDNA-グリコシラーゼ（UDG）に基づくクローニング
ラシュトチアン（Rashtchian）ら（1992）は、細胞での通常の役割がDNA修復酵素である酵素、ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）を用いるリガーゼ非依存的なPCRクローニング法を開発した。この手法はPCRプライマーの5'末端に12bpの付加
を必要とする。本グリコシラーゼは適切な塩基対合を妨げて一本鎖の3'突出部を生じさせる（DuncanおよびChambers 1984；Longo、Berningerら1990）、PCR産物の末端のdUMP残基を選択的に除去する。これらの3'突出部はベクターの適切に調製された一本鎖末端にアニールすることができる。ウラシルグリコシラーゼは、DNAでのウラシル残基の相手であるチミン残基に対する活性はなく（DuncanおよびChambers、1984）、かつ最末端のまさに近くにあるdUMP残基を除去することができる（Varshneyおよびvan de Sande 1991）。この方法にはベクターが適切な相補配列を含むことが必要であり、PfuポリメラーゼまたはVentRポリメラーゼのような校正ポリメラーゼの使用には適用されない（Sakaguchi、Sedlakら1996）。このため、研究者は誤りの頻度が著しく高いTaqポリメラーゼを用いなければならない。UDGに基づくクローニングは、ライフテクノロジーズ（Life Technologies）社がClone Amp（登録商標）pUCシステムとして製品化している。
【０００９】
UDGクローニングの変法の一つは、dUMP残基でのUDG切断によって生じる塩基喪失（abasic）部位（AP）を利用する。これらのAP部位は、T4エンドヌクレアーゼVまたはヒトAPエンドヌクレアーゼIなどのAPエンドヌクレアーゼの基質である。これらの修復酵素のいずれかで処理することにより、適切なベクター中に続いて連結するのに適した5-Pが得られる。この方法の欠点の一つはプライマー内に修飾塩基（デオキシウリジン）を必要とすることであり、成功の可否はリガーゼ処理に加えて2つの酵素に依拠する。UDGクローニングのあまり知られていない第2の変法では、プライマー内の所定の位置に1,3-プロパンジオールと呼ばれる非塩基性残基を用い、クローニング用の適合性のある5'末端が得られるが、この方法は他のリガーゼ非依存的なクローニング法よりもはるかに効率が低い（KaluzおよびFlint 1994）。
【００１０】
iv）PCR誘導型クローニング
PCR特異的なクローニング法はしばしば、組換えDNAが増幅手順それ自体の間に産生される、一段階の手順である。この主題には多くの変法があり、リガーゼ依存的なものもあればそうでないものもある。これらの方法は主としてクローニングされる遺伝子に位置特異的な変異を作製するために用いられる。以下に現在の手法を簡単に記載する。
【００１１】
リガーゼ依存的な方法
a）ストラタジーン（Stratagene）社は平滑末端PCR断片のクローニングのための手法を製品化しており（Weiner 1993）、これは当初リュウ（Liu）およびシュワルツ（Schwartz）（1992）によって記載された。彼らの方法では、PCRプライマーの5'末端をリン酸化することが必要である。受容側のベクターを線状化し、子ウシ腸アルカリホスファターゼ（CIAP）で処理した後に、第2の制限酵素で消化して適合性のある末端を得る。これはかなり複雑な手法であるが、この結果得られるベクターは一リン酸化されており、指向性クローニングを可能にする。指向性クローニングの成功率は95％と報告されたが、それらの手法にはエタノール沈殿が必要であり、やはりリガーゼの作用に依拠している。
【００１２】
b）「ヘテロスタッガークローニング（hetero-stagger cloning）」は、もう1つのリガーゼ依存的な方法であり、計4つのPCRプライマーを必要とする（Liu 1996）。プライマーの1組は従来のPCRプライマー対であり、第2の組は最初のものと同等であるが、5'-GGG残基をさらに含む。DNAを通常のPCR条件下で増幅し、その産物を熱変性させ、次に冷却によってゆっくりと再度アニールさせる。再アニーリングの結果、4つの異なる種が形成される。理論的にクローニング可能なのは産物の50％のみであり、指向性クローンが首尾良く得られるのは産物の25％に過ぎない。この手法に関して主張されている唯一の利点は、最新の校正ポリメラーゼを増幅時に用いることが可能になることである。
【００１３】
c）プライマー対が1つしか必要としない、スタッガード・再アニーリング法（staggered re-annealing）の変法も用いられている（AilenbergおよびSilverman 1996）。
【００１４】
d）さらに最近では、ガル（Gal）ら（1999）が、「オートスティッキー（autosticky）PCR」（AS-PCR）（特許出願HU9801320号）と呼ばれる手法を考案した。この手法は、DNAに存在する塩基喪失部位がDNAポリメラーゼを引き止めることができるという所見を利用している。この方法では、増幅しているポリメラーゼを引き止める塩基喪失部位を含むようにPCRプライマーを設計し、その結果、5'突出部が生じて、適切な消化処理を行ったベクター中に連結することが可能となる。塩基喪失部位は、2-デオキシリボースの安定な構造類似体であるテトラヒドロフランを所定の位置に組み込むことによって作製する。この方法は指向性クローニングのために提供されるが、通常とは異なる試薬を必要とし、連結を一晩行わせることが推奨される。
【００１５】
リガーゼ非依存的なクローニング法（LIC）
a）最初のリガーゼPCRクローニング法はシュルディナー（Shuldiner）ら（1991）によって記載された。それ以来、この手法の数多くの適応が開発されている。本明細書に記載された手法（TemesgenおよびEschrich 1996）には、3つのPCRプライマーが必要であり、そのプライマーの1つにはさらに24ヌクレオチドが付加されている。この過程は2つの異なるPCR増幅を伴い、従って産物にPCRの誤りが入り込む確率が高くなる。しかし、リガーゼの必要性を回避して、線状の産物を大腸菌（E.coli）に直接形質転換することが可能である。コンピテント大腸菌（E.coli）TG2株の細胞が必要であり、JM105またはDH5αなどの古典的な株で代用できるかどうかは不明である。この手法は指向性クローニングのために提供されるが、成功は第2のPCR段階におけるPCRパラメーターに関係している。この手法には任意のベクターを用いることができ、制限酵素は必要でない。
【００１６】
b）ガルセス（Garces）およびラボーダ（Laborda）（1995）は、2つのPCRプライマーのみを必要とし、その一方が20bpの5'伸長部を持つ、同様の手法を報告している。反応は一本のチューブ内での反応として起こり、任意のベクターの使用に適合させることができるが、効率はPCRパラメーターにより大きく影響される。
【００１７】
v）インビボ組換えに基づくクローニング
PCRクローニングは従来、研究室の試験管環境内で完結するが、インビボ系を用いたクローニングの報告が少なくとも2件ある。以下の手法は、酵母を線状鋳型およびギャップ含有プラスミドを用いて共トランスフェクトすると、相同組換えによって2つの種を「はぎ合わせる（patch）」ことが可能であるという所見に基づいた（GuthrieおよびFink、1991）。それ以来、酵母ではこの方法を用いてPCR産物のクローニングが行われている（ScharerおよびIggo 1992）。同様の現象は大腸菌（E.coli）でも報告されている（Oliner、Kinzlerら 1993）。この手法はおそらく宿主によってコードされる内因性エキソヌクレアーゼ活性またはポリメラーゼ活性を利用しているが、実際に何が起こっているかに関する推測はなされていない。PCRプライマーは、選択したRE部位に隣接する配列と同一である5'配列を含むように設計する。線状化ベクターおよびPCR産物を大腸菌（E.coli）JC8679株に共トランスフェクトする。DH5α細胞は分子内ギャップ修復を触媒できず、このため分子間の組換えも触媒できないと考えられることが独立した複数の報告によって示されるため、この手法は通常の大腸菌（E.coli）株との使用には適さない可能性がある（Hanahan、1985）。ブベック（Bubeck）ら（1993）によって記載された同様の方法では、CaCl２法により形質転換した場合のみであるが、DH5α細胞における組換えの成功が報告された。熱ショックおよびエレクトロポレーションとして知られる、細菌の形質転換により一般的に用いられる手法は、上記の実験に用いて失敗した。
【００１８】
vi）エキソヌクレアーゼに基づくPCRクローニング
PCR断片のクローニングのための完全に異なる一つのアプローチには、種々のエキソヌクレアーゼの活性による一本鎖突出部の生成を伴う。エキソヌクレアーゼに基づく方法はすべてリガーゼ非依存性であり、アスラニディス（Aslanidis）およびディヨング（deJong）（1990）により最初に報告された手法に基づく。この手法に数多くの修正が加えられたことによって、この方法は改良され（Haun、Serventiら 1992；Kuijper、Wirenら 1992）、これはいずれもT4 DNAポリメラーゼの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を用いる。PCRプライマーは、ベクター内の選択したRE部位に隣接する配列に対して、相補的な5'伸長部を含むように設計する。T4ポリメラーゼによる外ヌクレオチド鎖分解消化によって一本鎖突出部を生成し、ベクターと挿入物の間の一本鎖領域のアニーリングは直接細菌を形質転換できるまでに十分に安定である。これらの手法では、酵素が極めて効率的であるために、インキュベーション期間を精密に調節する必要があり、慎重に行わないとDNAが過剰に消化される可能性がある。クジパー（Kuijper）ら（1992）は、酵素標品間に大きな変動があるため、酵素の新しいバッチ毎に時間条件を微調整する必要があることも報告した。これらの特定の方法の第2の欠点は、酵素を適切な時点で停止させるためにエキソヌクレアーゼ反応物にdTTPまたはdATPを添加する必要があることである。
【００１９】
上記で報告されたものと同様の方法では、エキソヌクレアーゼIIIと呼ばれる異なる酵素を用いており（Hsiao 1993）、これは1992年にクローニング用として最初に用いられた（Kaluz、Kolbleら 1992）。この制限は、効率的にクローニングされるのが平滑末端または5'突出型の基質のみである点である。3'突出部を有する基質をこの方法によってクローニングすることはできない。
【００２０】
さらに最近では、ファージT7 Gene6エキソヌクレアーゼがPCRクローニングに用いられている（ZhouおよびHatahet 1995）。この手法では、プライマーの中央側に向かって位置する内部ホスホロチオエート結合を含むように、PCRプライマーを設計する。プライマーの3'末端は標準的なPCRプライマーであるが、一方、5'末端は特定のRE部位に隣接する配列に対して相補的であるように設計する。この方法は指向性クローンを産生し、リガーゼ非依存性であるが、標準的でないPCRプライマーを用いる必要がある。米国特許第5,580,759号（Yangら）も、エキソヌクレアーゼ陥入（recession）による組換えDNAの構築方法を開示している。
【００２１】
以上をまとめると、PCR産物のクローニングに関しては非常にさまざまな方法が存在し、それぞれに利点および欠点がある。以下の特徴を有する最適なクローニング法は依然として必要とされている：
任意のベクターおよび制限酵素の使用に適合する；
天然塩基のみからなる2つのPCRプライマーのみを必要とする；
リガーゼ非依存性である；
時間効率が優れている；
ほぼ完全に指向性クローニングのみを提供する；
認識する必要があるのは増幅領域の末端配列だけである；
PCR産物の内部消化の可能性がない；
任意の種類の増幅用ポリメラーゼを用いることができる；
容易に入手可能な種々の大腸菌（E.coli）株に適合する；
さまざまな手法によって細菌の形質転換を行うことができる；
明確な選択；および
コンビナトリアルクローニングのような他の手法に適応可能である。
【００２２】
発明の概要
本発明者らは、ワクシニアDNAポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼが、1つまたは複数の線状DNA分子を効率的に連結しうることを明らかにした。本方法は、一連のDNA分子の末端に存在する、配列要素間の組換えを用いて接合部を指定し、特定のDNAポリメラーゼを分子の連結のために用いる。本方法を、1つまたは複数の線状DNA分子を単一の手順で正確に連結するために用いることもできる。この新たな方法は主に組換えDNA分子の構築に適用され、特にPCR産物を任意の所望のベクター中にクローニングするために適用される。本方法は、上記に列挙した最適なクローニング法のすべての特徴を提供する。
【００２３】
したがって、本発明は、以下の段階を含む2つの線状DNA分子を連結する方法を提供する：
第1の末端および第2の末端を有する第1の線状DNA分子を提供する段階；
第1の末端および第2の末端を有する第2の線状DNA分子を提供する段階；
ここで、第1の線状DNA分子は、第2の線状DNA分子の第1の末端または第2の末端のいずれかにあるヌクレオチド配列に対して、相補的なヌクレオチド配列を第1の末端または第2の末端のいずれかに有し、ならびに
2つの線状DNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの存在下において2つの線状DNA分子をインキュベートする段階。
【００２４】
1つの態様において、本発明は、以下の段階を含む2つまたはそれ以上の線状DNA分子を連結する方法を提供する：
1つの線状DNA分子のx'鎖の5'末端が、それに連結させようとする別の線状DNA分子のx鎖の5'末端に対して相補的なヌクレオチド配列を有する、反対の極性をもちそれぞれx鎖およびx'鎖を有する、2つまたはそれ以上の線状DNA分子を提供する段階；ならびに
2つまたはそれ以上の線状DNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの存在下において2つまたはそれ以上の線状DNA分子をインキュベートする段階であって、
ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、本発明のDNA連結反応を行うことができる段階。
【００２５】
本方法を、任意の数のDNA分子を連結するために用いてもよい。重要な点は、各DNA分子の末端が、それに連結させようとする分子に対する相補領域を持つように分子を確実に選択することである。内部分子は両端に相補領域を持たなければならない。この手法の特別な用途には、DNAカセットのコンビナトリアル融合および合成遺伝子の調製がある。この手法は断片化されたクローンの再構築にも有用である。
【００２６】
また、本発明の方法を、両端が実質的に相補的な核酸配列を有する、単一のDNA分子の再環状化に応用してもよい。この手法は部位特異的変異誘発の分野に適応しうる。
【００２７】
本発明の方法に用いうるDNAポリメラーゼには、本発明のDNA連結反応を行うことができる、内在性エキソヌクレアーゼ活性、好ましくは3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する、すべてのDNAポリメラーゼが含まれる。このようなポリメラーゼは、本明細書に記載する通り、相補的なヌクレオチド配列を持つ末端を有する、2つの線状DNA分子を連結する能力に関してアッセイすることによって同定しうる。好ましくは、DNAポリメラーゼは、ワクシニアウイルスDNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、および大腸菌（E.coli）DNAポリメラーゼIのクレノー断片からなる群より選択される。最も好ましくは、DNAポリメラーゼはワクシニアウイルスDNAポリメラーゼである。各線状DNA分子の相補的ヌクレオチド配列の長さは、約5から約100ヌクレオチドの間、好ましくは約8から約50ヌクレオチドの間、最も好ましくは約10から35ヌクレオチドの間でありうる。インキュベーション混合物に公知の種々の刺激因子を加えてもよい。このような刺激因子は、反応の効率を向上させ、かつ所望の反応産物、例えば一本鎖DNA結合タンパク質を安定化させるものである。
【００２８】
もう1つの態様において、本発明は以下の段階を含む、組換えDNA分子を構築する方法を伴う：
それぞれ第1および第2の末端を有する、線状化ベクターDNA分子および鋳型DNA分子を提供する段階；
線状化ベクター分子の第1の末端に対して相補的なヌクレオチド配列を、鋳型DNA分子の第1の末端上に組み入れると考えられるヌクレオチド配列を含む5'末端、および鋳型DNA分子の第1の末端上の適した位置にハイブリダイズするように設計された3'末端を有する、第1のプライマーDNA分子を提供する段階；
線状化ベクター分子の第2の末端に対して相補的なヌクレオチド配列を、鋳型DNA分子の第2の末端上に組み入れると考えられるヌクレオチド配列を含む5'末端、および鋳型DNA分子の第2の末端上の適した位置にハイブリダイズするように設計された3'末端を有する、第2のプライマーDNA分子を提供する段階；
第1および第2のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて鋳型DNA分子を増幅して、PCR増幅産物を得る段階；ならびに
DNAポリメラーゼの存在下でPCR増幅産物を線状化ベクターDNA分子とともにインキュベートして、組換えDNA分子を生成する段階であって、
ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、本発明のDNA連結反応を行うことができる段階。
【００２９】
本発明の方法に用いうるDNAポリメラーゼには、本発明のDNA連結反応を行うことができる、内在性エキソヌクレアーゼ活性、好ましくは3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する、すべてのDNAポリメラーゼが含まれる。このようなポリメラーゼは、本明細書に記載する通り、相補的なヌクレオチド配列を持つ末端を有する2つの線状DNA分子を連結する能力に関してアッセイすることによって同定しうる。好ましくは、DNAポリメラーゼは、ワクシニアウイルスDNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、および大腸菌（E.coli）DNAポリメラーゼIのクレノー断片からなる群より選択される。最も好ましくは、DNAポリメラーゼはワクシニアウイルスDNAポリメラーゼである。インキュベーション混合物に、公知の種々の刺激因子を加えてもよい。このような刺激因子は、反応の効率を向上させ、かつ所望の反応産物、例えば一本鎖DNA結合タンパク質を安定化させるものである。
【００３０】
鋳型DNA分子の第1および第2の末端上に組み入れられる、相補的ヌクレオチドの数は、約5から約100ヌクレオチドの間、好ましくは約8から約50ヌクレオチドの間、最も好ましくは約10から35ヌクレオチドの間でありうる。
【００３１】
本方法は、2つまたはそれ以上のDNA分子のベクターへの挿入に容易に応用しうる。追加する各分子毎に、隣接分子の適当な末端に対して相補的なPCR伸長の用意をする（prime）第1の部分、および増幅させるDNA分子の適当な末端に対して相補的な第2の部分をそれぞれが有する、二連型（bipartite）PCRプライマーがさらに2つ必要になると考えられる。
【００３２】
本発明の方法を用いて線状化ベクターに挿入しようとする線状DNA分子を、PCR増幅によって入手する必要はない。このため本発明は、以下の段階を含む、組換えDNA分子を構築する方法をさらに伴う：
線状化ベクターDNA分子を提供する段階；
連結させようとする線状化ベクターDNA分子の末端に対して、実質的に相補的な末端を有する線状の挿入DNA分子を提供する段階；ならびに
2つのDNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの存在下において線状化ベクターDNA分子および線状の挿入DNA分子をインキュベートする段階であって、
ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、DNA分子を連結する段階。線状の挿入DNA分子は任意の公知の手段、例えば、化学合成、連結、またはアニーリングによって入手しうる。
【００３３】
本発明は、任意の鋳型DNA分子を、任意のベクターの単一の制限酵素部位中に指向的にクローニングする方法を提供する。ベクター末端は任意の制限酵素切断によって生成しうる。本方法は連結段階を必要とせず、特定のエキソヌクレアーゼのみを伴う方法で必要とされるような、慎重に調節される条件を使用する必要もない。
【００３４】
本発明はまた、本方法を行うための試薬を含むキットにも向けられる。
【００３５】
本発明のこれらのおよびその他の局面を以下にさらに詳細に説明する。
【００３６】
発明の詳細な説明
定義
本明細書で用いる「相補的な」という用語は、別のDNA分子におけるヌクレオチド配列の鎖に対して、特異的に（無作為的ではなく）ハイブリダイズして、結果として水素結合を生じるのに十分に相補的な、一本鎖DNA分子におけるヌクレオチド配列を指す。
【００３７】
本明細書で用いる「線状DNA分子」という用語は、分子の塩基対に存在する各相補的塩基の間の、1つまたは複数の水素結合によって合わされた、実質的に相補的なポリヌクレオチドの極性が反対の2つの鎖（センスおよびアンチセンス）を含む、二本鎖（二重鎖）核酸分子を指す。
【００３８】
本明細書で用いる「組換えDNA分子」という用語は、自然界で通常は一緒には見出されない少なくとも2つのヌクレオチド配列を含む、ハイブリッドDNA分子を指す。
【００３９】
本明細書で用いる「ヌクレオチド」という用語は、糖部分（五炭糖）、リン酸基および含窒素複素環式塩基からなるDNAの単量体単位を指す。塩基は配糖体炭素（五炭糖の1'炭素）を介して糖部分と結合しており、この塩基と糖の組み合わせがヌクレオシドである。ヌクレオシドが五炭糖の3'位または5'位に結合したリン酸基を含む場合、これはヌクレオチドと呼ばれる。機能的に結合したヌクレオチドの配列を、本明細書では一般に「ヌクレオチド配列」およびそれらの文法的等価物として称し、これは左から右の方向が5'末端から3'末端への通常の向きであるような定則によって表される。
【００４０】
DNA の連結方法
本発明は、特定のDNAポリメラーゼを用いて2つまたはそれ以上の線状DNA分子を連結するための方法に関する。本方法は、特定のDNAポリメラーゼが、共通の相補的ヌクレオチドを共有する末端を有する、線状DNA分子の組換えを促進しうることに依拠している。
【００４１】
したがって、本発明は、以下を含む2つの線状DNA分子を連結する方法を提供する：
第1の末端および第2の末端を有する第1の線状DNA分子を提供する段階；
第1の末端および第2の末端を有する第2の線状DNA分子を提供する段階であって、
ここで、第1の線状DNA分子が、第2の線状DNA分子の第1の末端または第2の末端のいずれかにあるヌクレオチド配列に対して、相補的なヌクレオチド配列を第1の末端または第2の末端のいずれかに有する段階；ならびに
2つの線状DNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの存在下において2つの線状DNA分子をインキュベートする段階。
【００４２】
第1および／または第2の線状DNA分子は、1つまたは複数の線状DNA分子からなりうる。例えば、第1の線状DNA分子は、本発明の方法を用いてすでに連結された、2つの線状DNA分子からなってもよい。
【００４３】
1つの態様において、本発明は以下の段階を含む、2つまたはそれ以上の線状DNA分子を連結する方法を提供する：
各線状DNA分子のx'鎖の5'末端が、それに連結させようとする線状DNA分子のx鎖の5'末端のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する、極性が反対であるx鎖およびx'鎖をそれぞれが有する、2つまたはそれ以上の線状DNA分子を提供する段階；ならびに
2つまたはそれ以上の線状DNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの存在下において2つまたはそれ以上の線状DNA分子をインキュベートする段階であって、
ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、本発明のDNA連結反応を行うことができる段階。
【００４４】
本発明の方法において働くDNAポリメラーゼは、本発明のDNA連結反応を行うことができる、内在性エキソヌクレアーゼ活性、好ましくは3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するものである。このようなポリメラーゼは、本明細書の実施例2（実験の項）に記載する通り、相補的なヌクレオチド配列を持つ末端を有する、2つの線状DNA分子を連結する能力に関してアッセイすることによって同定しうる。本明細書で提示した実施例では精製ワクシニアDNAポリメラーゼを用いた。また、T4 DNAポリメラーゼ、および大腸菌（E.coli）DNAポリメラーゼIのクレノー断片を用いても反応が進むことが示されている。本発明のDNAポリメラーゼは市販のものでもよく、標準的な組換えDNA技術を用いて調製してもよい。例えば、マクドナルド（McDonald）およびトラクトマン（Traktman）（1994）ならびにウィラー（Willer）、マン（Mann）ら（1999）に記載された通りに、ワクシニアDNAポリメラーゼをワクシニアに感染したBSC-40細胞から精製してもよい。または、ワクシニアDNAポリメラーゼを野生型ワクシニアウイルスに感染した細胞から精製してもよい。本発明者らは、相補的なヌクレオチド配列を持つ末端を有する、2つの線状DNA分子を連結する能力を測定するために、ポリメラーゼをアッセイする。これらには、バクテリオファージ（例えば、T4、T7）、細菌（例えば、大腸菌（E.coli））、真菌（例えば、S. セレビシエ（S. cerevisiae））ならびにウイルス（例えば、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アフリカブタコレラウイルスおよび他のイリドウイルスならびにバキュロウイルス）によってコードされるものが含まれるが、限定されない。本発明に有用なDNAポリメラーゼは、好ましくは内在性3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を持つ。本発明は、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を持つDNAポリメラーゼを含むように拡張される。
【００４５】
反応の効率を高めるため、および／または反応産物を安定化するために、さまざまな公知の刺激因子をインキュベーション混合物に加えてもよい。適した刺激因子には一本鎖DNA結合タンパク質が含まれる。用いうる一本鎖DNA結合タンパク質の中には、ワクシニアおよび大腸菌（E.coli）の一本鎖結合タンパク質、単純ヘルペスウイルスICP8タンパク質、ならびに酵母およびヒトの複製プロテインA（例えば、yRPAおよびhRPA）を含むが、これらに限定されないものもある。当業者は、本発明の方法においてDNAポリメラーゼと組み合わせて有用に用いうる、他の適した刺激因子を容易に同定しうると考えられる。本発明の1つの面において、ワクシニア一本鎖結合タンパク質を用いて、ワクシニアDNAポリメラーゼを用いるDNA連結反応の収率を高める。
【００４６】
線状DNA分子の末端間の相補性の程度は、約5から約100ヌクレオチドの間、好ましくは約8から約50ヌクレオチドの間、最も好ましくは約10から35ヌクレオチドの間を変動しうる。本発明の方法を用いて連結されうる線状DNA分子は、制限酵素切断を用いて、原核生物または真核生物のゲノムのゲノムDNA、ならびにプラスミド、コスミド、ファージ、BACなどを含む種々のベクターから入手してもよい。または、線状DNA分子を、例えば自動合成などを用いる化学的手法によって合成してもよい。DNA分子は任意の種由来のmRNA、tRNAおよびrRNAなどのRNA種に由来してもよく、サムブルック（Sambrook）ら（1989）に記載された通りに、まず逆転写酵素によってcDNAに変換して増幅することができる。
【００４７】
最も一般的な応用として、本発明は、2つまたはそれ以上の線状DNA分子を連結する方法を提供する。図1は、2つの線状DNA分子の連結のためのこの反応の概略図を示している（パネルA）。これは、左端および右端上に相補配列を共有する2つの基質を、どのように特定のDNAポリメラーゼの存在下でインキュベートして二量体を形成させるかを例示している。図1のパネルCは、左端および右端に35bpの相補配列を共有する2つの基質の1：1の混合物を、さまざまな量のワクシニアDNAポリメラーゼとインキュベートし、その産物をアガロースゲルを用いてサイズ別に分離した実験の結果を示している。ポリメラーゼを加えなかった場合は反応は全く観察されず（レーン2）、ポリメラーゼの量を増やしながら添加すると産物の収量が増加した（レーン3〜9）。
【００４８】
図2のパネルAは、3つの線状DNA分子の連結による三量体の産生を示している。この場合に「中間」分子は、2つの隣接分子の末端に対して相補的なDNA配列を両端に持たなければならない。中間分子が各末端に2つの隣接分子を有し、相補的な約20bpのDNA配列をもつ場合の、実際の実験結果を図2のパネルBに示している。図2のパネルBには重要な対照も例示されている（レーン5）。同一分子の末端には適切な種類の共通した相補性がないため、ポリメラーゼは3つの基質のうちの1つだけを与えた場合にはコンカテマーを形成しないと考えられる。この特異性は、ほとんど無数の種々の末端配列重複部を単に調節するだけで、2つまたはそれ以上の分子をどのように融合させるかを正確に指示できることを意味する。
【００４９】
したがって、本発明は以下の段階を含む、3つの線状DNA分子を連結する方法を提供する：
第1の末端および第2の末端を有する第1の線状DNA分子を提供する段階；
第1の末端および第2の末端を有する第2の線状DNA分子を提供する段階；
第1の末端および第2の末端を有する第3の線状DNA分子を提供する段階；
ここで、第1の線状DNA分子は、第2の線状DNA分子の第1の末端または第2の末端のいずれかにあるヌクレオチド配列に対して、相補的なヌクレオチド配列を第1の末端に有し、第1の線状DNA分子は、第3の線状DNA分子の第1の末端または第2の末端のいずれかにあるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を第2の末端に有し、かつ
3つの線状DNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの存在下において3つの線状DNA分子をインキュベートする段階。
【００５０】
当業者は、DNA分子が1つの分子を別の分子に連結させるための適当な相補配列を含むならば、上記の方法を用いて任意の数のDNA分子を連結させうることを認識すると考えられる。例えば、上記の3つの分子に第4のDNA分子を連結させるためには、第2または第3のDNA分子のいずれかが遊離端（すなわち、第1のDNA分子に連結していない末端）に第4のDNA分子の一方の端にある配列に対して相補的なヌクレオチド配列を持つ必要がある。
【００５１】
本発明のもう1つの応用は、図3に示すような、DNAカセットのコンビナトリアル融合である。この例では、3つの異なるDNA分子のプールを調製する。分子のプール内では、末端は同一であるが各分子の中央部の配列はさまざまである。例えば、図3に示す通り、A1〜A5はすべて約5から約100ヌクレオチド、好ましくは約8から約50ヌクレオチド、より好ましくは約10から約35ヌクレオチドの同じヌクレオチド配列を右端に有するが、分子の残りの部分の配列はさまざまである。「B」プール内の分子の左端は「A」プール内の分子の右端との適合性がある。同様に、「C」プール内の分子の左端は「B」プール内の分子の右端と適合性がある。適合性があるとは、それらが約5から約100ヌクレオチド、好ましくは約8から約50ヌクレオチド、より好ましくは約10から約35ヌクレオチドの範囲である、適当な相補配列を共有していることを意味する。プールA、BおよびCからの分子の混合物を、本発明の方法で有用なDNAポリメラーゼとインキュベートすることにより、A、BおよびCプールから選択された各分子の1つからなる三量体が生じると考えられる。この結果得られる三量体のプールは、「A」、「B」および「C」変種の無作為な組み合わせを表すはずである。「プール」および各プール内の分子の数は、何百万もの異なるDNA分子の無作為な組み合わせが生じる可能性があるように、変動しうる。本発明の方法を用いるDNAカセットのコンビナトリアル融合は、異なるタンパク質構造ドメインをコードするDNA分子のコンビナトリアル融合による、新規タンパク質をコードするDNA配列の構築に応用しうる。これらのタンパク質ライブラリーを新規な結合特異性に関してスクリーニングしてもよい。
【００５２】
本発明の方法を、末端に実質的に相補的な核酸配列を有する単一のDNA分子の組換え（環状化）に用いることもできる。したがって、本発明は以下の段階を含む、線状DNA分子を環状化する方法にも関する：
線状DNA分子の各末端上に実質的に相補的な核酸配列を導入すると考えられるプライマーの存在下で、線状DNA分子のPCR増幅を行う段階；および
PCR増幅がなされた線状DNA分子を、線状DNA分子が環状化される条件下でDNAポリメラーゼの存在下においてインキュベートする段階であって、
ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、DNA分子を環状化する段階。
【００５３】
本発明の方法を単一DNA分子の環状化に応用する用途の一つは、部位特異的変異誘発の分野にある。例えば、実質的に相補的な核酸配列が各末端に組み入れられるように設計したプライマーを用いて、関心対象の遺伝子を含むプラスミドのPCR増幅を行うことができる。プラスミド中の関心対象の遺伝子の内部に変異が導入されるようにプライマーを設計すれば、変異型の遺伝子が得られる。
【００５４】
反応の特徴をさらにいくつか調査した。最も重要な点は、ワクシニアポリメラーゼが、2つの組換え中の分子上に存在する末端の種類に左右されないように見られるという事実であるかもしれない。5'突出部、3'突出部または平滑末端を有する分子は、任意の2つ1組の組み合わせにおいて、2つの分子が適当な配列相補性を共有している限りは基質であった。
【００５５】
DNA のクローニング法
もう1つの態様において、本発明は任意の二本鎖PCR産物を任意の望ましいベクター中にクローニングする方法を提供する。したがって、以下の段階を含む、組換えDNA分子を構築する方法が提供される：
それぞれ第1および第2の末端を有する、線状化ベクターDNA分子および鋳型DNA分子を提供する段階；
線状化ベクター分子の第1の末端に対して相補的なヌクレオチド配列を、鋳型DNA分子の第1の末端上に組み入れると考えられるヌクレオチド配列を含む5'末端、および鋳型DNA分子の第1の末端上の適した位置にハイブリダイズするように設計された3'末端を有する、第1のプライマーDNA分子を提供する段階；
線状化ベクター分子の第2の末端に対して相補的なヌクレオチド配列を、鋳型DNA分子の第2の末端上に組み入れると考えられるヌクレオチド配列を含む5'末端、および鋳型DNA分子の第2の末端上の適した位置にハイブリダイズするように設計された3'末端を有する、第2のプライマーDNA分子を提供する段階；
第1および第2のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて鋳型DNA分子を増幅して、PCR増幅産物を得る段階；ならびに
DNAポリメラーゼの存在下でPCR増幅産物を線状化ベクターDNA分子とともにインキュベートして、組換えDNA分子を生成する段階であって、
ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、本発明のDNA連結反応を行うことができる段階。
【００５６】
本方法に必要なのは、PCRプライマーを伸長して、ベクター中の選択したクローニング部位に隣接する塩基配列を複製する、いくつかのヌクレオチドを組み入れることだけである。提案するアプローチを図4に示している。一組の二連型プライマーを設計する。第1のプライマー分子の3'末端は鋳型DNA分子の第1の末端にハイブリダイズするように設計され、第1のプライマー分子の5'末端は、ベクターDNA分子の第1の末端に対して相補的な配列を最終PCR産物に組み入れるように設計された、約5から約100ヌクレオチド、好ましくは約8から約50ヌクレオチド、より好ましくは約10から約35ヌクレオチドの配列を有する。第2のプライマーの3'末端は鋳型DNA分子の第2の末端にハイブリダイズするように設計され、第2のプライマー分子の5'末端は、ベクターDNA分子の第2の末端に対して相補的な配列を最終PCR産物に組み入れるように設計された、約5から約100ヌクレオチド、好ましくは約8から約50ヌクレオチド、より好ましくは約10から約35ヌクレオチドの配列を有する。次に2つのプライマーを鋳型DNA分子にアニールさせ、その後にPCR増幅産物が生じる標準的な条件を用いてPCR増幅を行う。ベクターは、標準的な条件を用いてそれを選択した挿入部位で切断するために、適切な制限酵素で処理することによって調製する。
【００５７】
本明細書で用いるプライマーという用語は、二連型プライマー、または第1および第2の部分を有するプライマーを説明するものとする。プライマーの第1の部分は鋳型DNA分子の適当な末端に対して相補的であるように設計し、プライマーの第2の部分はベクターの選択した制限酵素部位の片側のヌクレオチド配列に対して相補的であるように設計する。本発明の二連型オリゴヌクレオチドプライマーを、関心対象のDNA分子に対して相補的であり、DNA分子をベクター中に組み入れることを可能とするような一本鎖オリゴヌクレオチドとして、広義に定義してもよい。二連型プライマーは一般に、最小限の長さが約18ヌクレオチドであって最大限の長さが約200ヌクレオチドであると考えられ、好ましくは約25ヌクレオチドから約100ヌクレオチド、より好ましくは約30ヌクレオチドから約40ヌクレオチドと考えられる。本方法は、2つまたはそれ以上のDNA分子をベクター中へ挿入するのに容易に応用しうると考えられる。追加する各分子は、隣接分子の適当な末端に対して相補的なPCR伸長の用意をする第1の部分、および増幅させるDNA分子の適当な末端に対して相補的な第2の部分をそれぞれ有する、二連型PCRプライマーをさらに2つ必要とすると考えられる。
【００５８】
次に、PCR増幅産物および線状化ベクターを、本発明のDNA連結反応を行うことができる、内在性エキソヌクレアーゼ活性、好ましくは3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼの存在下において、適した反応緩衝液中で約5分〜約60分間、好ましくは約10分〜約40分間、最も好ましくは約15分〜約30分間インキュベートする。本明細書に提示した実施例では、精製ワクシニアDNAポリメラーゼを用いた。T4 DNAポリメラーゼ、および大腸菌（E.coli）DNAポリメラーゼIのクレノー断片を用いて反応が進むことが示されている。反応緩衝液はDNAアニーリング反応に用いられる任意の緩衝液でよい。温度は約35℃〜40℃の範囲でよく、より好ましくは約37℃である。
【００５９】
本発明の方法において働くDNAポリメラーゼは、本明細書の実施例2（実験の項）に記載する通り、適切な相補配列を持つ末端を有する、2つの線状DNA分子を連結する能力に関してアッセイすることによって同定しうる。本発明のDNAポリメラーゼは市販のものでもよく、または標準的な組換えDNA技術を用いて調製してもよい。例えば、マクドナルド（McDonald）およびトラクトマン（Traktman）（1994）ならびにウィラー（Willer）、マン（Mann）ら（1999）に記載された通りに、ワクシニアDNAポリメラーゼをワクシニアに感染したBSC-40細胞から精製してもよい。または、ワクシニアDNAポリメラーゼを野生型ワクシニアウイルスに感染した細胞から精製してもよい。本発明者らは、ポリメラーゼのアッセイを行い、相補的なヌクレオチド配列を持つ末端を有する、2つの線状DNA分子を連結する能力を測定する。これらには、バクテリオファージ（例えば、T4、T7）、細菌（例えば、大腸菌（E.coli））、真菌（例えば、S. セレビシエ（S. cerevisiae））ならびにウイルス（例えば、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アフリカブタコレラウイルスおよび他のイリドウイルスならびにバキュロウイルス）によってコードされるものが含まれるが、限定されない。本発明において有用なDNAポリメラーゼは、好ましくは内在性3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を持つ。本発明はまた、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を持つDNAポリメラーゼも含むように拡張される。
【００６０】
反応の効率を高めるため、および／または反応産物を安定化するために、さまざまな公知の刺激因子をインキュベーション混合物に加えてもよい。適した刺激因子には一本鎖DNA結合タンパク質が含まれる。用いうる一本鎖DNA結合タンパク質の中には、ワクシニアおよび大腸菌（E.coli）の一本鎖結合タンパク質、単純ヘルペスウイルスICP8タンパク質、ならびに酵母およびヒトの複製プロテインA（例えば、yRPAおよびhRPA）が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、本発明の方法においてDNAポリメラーゼと組み合わせて有用に用いうる、他の適した刺激因子を容易に同定しうると考えられる。本発明の1つの局面においては、ワクシニア一本鎖結合タンパク質を用いて、ワクシニアDNAポリメラーゼを用いる本発明のDNAクローニング法の収率を高める。
【００６１】
本発明の方法を用いて、任意の種類または数の標的DNA分子のPCRクローニングを行うことができる。サイズに関する唯一の制限は、宿主細胞内での形質転換および複製において、ベクター分子が挿入物を保持しうる収容能である。プラスミド、コスミド、ファージ、BACなどの、原核生物または真核生物の細胞内で複製可能な任意のベクターを、本発明に用いることができる。ベクターの選択は、例えばタンパク質発現などの所望の機能特性、および形質転換を行う宿主細胞に依存する。好ましくは、ベクターは約5から約100ヌクレオチド、好ましくは約8から約50ヌクレオチド、最も好ましくは約10から約35ヌクレオチドの公知の配列を、選択した制限酵素部位の一方の側に有する。本発明の方法を用いて組換えDNA分子に組み入れられるDNA分子は、制限酵素切断を用いて、原核生物または真核生物のゲノムのゲノムDNA、ならびにプラスミド、コスミド、ファージ、BACなどを含む種々のベクターから入手してもよい。または、DNA分子を自動合成などにより合成してもよい。核酸は任意の種由来のmRNA、tRNAおよびrRNAなどのRNA種に由来してもよく、サムブルック（Sambrook）ら（1989）に記載された通りに、まず逆転写酵素によってcDNAに変換して増幅してもよい。
【００６２】
本発明の方法を用いて線状化ベクターに挿入しようとする線状DNA分子は、PCR増幅によって入手する必要はない。このような分子は、制限酵素消化によって環状二本鎖DNA分子を線状化し、続いて合成オリゴマーリンカーを末端に接着させることにより、またはすでに線状のDNA分子を制限酵素で二次消化し、続いてアダプター／リンカーを末端に付加することにより、またはアニールして完全な二重鎖DNA分子を形成しうる、2つの適切に設計された合成一本鎖DNAオリゴマーのアニーリングにより、または任意の他の関連した方法によって、調製してもよい。このような方法によって得られた線状DNA分子を、内在性エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼの存在下で、線状化ベクターDNA分子とインキュベートすることにより、所望の組換えDNA分子が得られると考えられる。したがって、本発明はまた、以下の段階を含む、組換えDNA分子を構築する方法に関する：
線状化ベクターDNA分子を提供する段階；
連結させようとする線状化ベクターDNA分子の末端に対して、実質的に相補的な末端を有する線状の挿入DNA分子を提供する段階；ならびに
2つのDNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの存在下において線状化ベクターDNA分子および線状の挿入DNA分子をインキュベートする段階であって、
ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、DNA分子を連結する段階。
【００６３】
組換え DNA 分子の形質転換
線状化ベクターおよびPCR増幅産物とのDNAポリメラーゼのインキュベーションによって得られる反応混合物を、標準的な形質転換手順を用いて任意の宿主細胞の形質転換を行うために直接用いてもよい。したがって、本発明は以下の段階を含む、組換えDNA産物を作製する方法も提供する：
それぞれ第1および第2の末端を有する、線状化ベクターDNA分子および鋳型DNA分子を提供する段階；
線状化ベクター分子の第1の末端に対して相補的なヌクレオチド配列を、鋳型DNA分子の第1の末端上に組み入れると考えられるヌクレオチド配列を含む5'末端、および鋳型DNA分子の第1の末端上の適した位置にハイブリダイズするように設計された3'末端を有する、第1のプライマーDNA分子を提供する段階；
線状化ベクター分子の第2の末端に対して相補的なヌクレオチド配列を、鋳型DNA分子の第2の末端上に組み入れると考えられるヌクレオチド配列を含む5'末端、および鋳型DNA分子の第2の末端上の適した位置にハイブリダイズするように設計された3'末端を有する、第2のプライマーDNA分子を提供する段階；
第1および第2のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて鋳型DNA分子を増幅して、PCR増幅産物を提供する段階；
DNAポリメラーゼの存在下でPCR増幅産物を線状化ベクターDNA分子とともにインキュベートして、組換えDNA分子を生成する段階；
組換えDNA分子を宿主細胞へ形質転換する段階；ならびに
組換えDNA産物を単離する段階であって、
ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、本発明のDNA連結反応を行うことができる段階。選択的には、適した刺激因子を本発明の方法に用いてもよい。例えば、組換えDNA分子を生成するために、DNAポリメラーゼおよび一本鎖DNA結合タンパク質の存在下で、PCR増幅産物を線状化ベクターDNA分子とともにインキュベートしてもよい。
【００６４】
大腸菌（E.coli）SURE、JM105、DH5α、HB101、XL1-blueなどの、形質転換を行うことができる任意の種類の細胞が宿主細胞として役立つ。その他の細菌宿主には桿菌またはシュードモナス属などが含まれうる。例えば、真核宿主細胞にはサッカロミセス属が含まれうる。本発明の利点の一つは、本方法が挿入DNAの正しい方向に関して選択的であることである。このため、組換えベクターにより形質転換された宿主細胞は、そのベクター中に挿入DNAを正しい向きで有すると考えられる。
【００６５】
本発明は、本発明の方法を用いて任意の線状DNA分子を線状化ベクター分子内にクローニングすることによって得られた、反応産物による宿主細胞の形質転換も含むように拡張される。クローニングしようとする線状DNA分子は、上記のようにPCRを用いて調製してもよく、または制限酵素消化によって環状二本鎖DNA分子を線状化し、続いて合成オリゴマーリンカーを末端に結合させることにより、またはすでに線状のDNA分子を制限酵素により二次消化した後、アダプター／リンカーを末端に付加することにより、またはアニーリングによって完全な二重鎖DNA分子を形成しうる2つの適切に設計された合成一本鎖DNAオリゴマーのアニーリングにより、または任意の他の関連した方法によって、調製してもよい。
【００６６】
キット
本発明は、PCR産物（または末端に適当な相同ヌクレオチドを有する、任意の他の線状DNA分子）を線状化ベクター中に指向的にクローニングするのに適したキットも提供する。本キットは、別々の容器内に、本発明のDNA連結反応を行うことができる内在性エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼのアリコート、および反応緩衝液のアリコートを含んでもよい。アリコートとは、少なくとも1回のクローニングのプログラムを行うのに十分な成分量を指す。DNAポリメラーゼは公知の濃度の溶液として、選択的に適した安定化剤を含む緩衝液中で提供してもよく、または適した緩衝液に溶解するための凍結乾燥産物の所定のアリコートとして提供してもよい。本キットは選択的には、一本鎖DNA結合タンパク質などの刺激因子のアリコートを含みうる。本キットはまた、陽性対照反応を行うために必要な試薬も含みうる。このような試薬には、別々の容器内に、線状化ベクターのアリコート、適当な相補配列を有する第1および第2の末端を持つ挿入DNAのアリコート、本発明のDNA連結反応を行うことができる内在性エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼのアリコート、選択的に、一本鎖DNA結合タンパク質などの刺激因子のアリコート、および反応緩衝液のアリコートが含まれうる。
【００６７】
以下の実施例で本発明をさらに例示する。しかし、これらの実施例は例示のみを目的としたものであり、いかなる形でも本発明の範囲を制限するために用いられるべきではないことが理解されるべきである。
【００６８】
実験に基づく実施例
材料および方法
線状基質は、プラスミドpDW101の制限酵素消化の後にフェノール抽出およびエタノール沈殿を行うことによって調製した。pDW101は、ヌクレオチド618位、619位および621位の自然欠失によってpBluescript（KS+）（Stratagene）から得られる。いくつかの実験では、線状基質をアガロース電気泳動によって精製し、ジーンクリーンII（Geneclean II）キット（New England Biolabs）を用いてアガロースから抽出した。[α-32P]dCTPおよび[γ-32P]dATPは、NEN／マンデルサイエンティフィック（Mandel Scientific）社から購入した。末端標識がなされた基質は、小エビアルカリホスファターゼ（United States Biochemical、Cleveland）で処理した後に、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよび［γ-32P］dATP（3000Ci/mmol）、またはクレノー酵素および［α-32P］dCTP（3000Ci/mmol）のいずれかとともにインキュベートすることによって作製した。取り込まれなかった放射性ヌクレオチドをG-25スピンカラム（Pharmacia）によって除去し、放射能をチェレンコフ（Cherenkov）（Schneider、1971）によって定量した。HindIIIで消化したλファージDNA、およびHaeIIIで消化したΦX174 DNAマーカーは、ニューイングランドバイオラボ（New England Biolabs）社から購入した。ルシフェラーゼアッセイキットはプロメガ（Promega）社から購入した。
【００６９】
細胞およびウイルス培養
BSC-40細胞はE. ナイルズ（E. Niles）博士（SUNY、Buffalo）から寄贈を受けたものであり、1％非必須アミノ酸および5％ウシ胎仔血清を添加したDMEM（Gibco BRL）中で、5％CO2環境において37℃で増殖させた。ワクシニアウイルス（WR株）はATCCから購入した。
【００７０】
実験 1 ：ワクシニア DNA ポリメラーゼの精製
ワクシニアに感染したBSC-40細胞からのワクシニアDNAポリメラーゼの精製は記載されている（McDonaldおよびTraktman 1994；Willer、Mannら 1999）。簡潔に述べると、vTMPOLおよびVTF7.5に共感染させた、150cm2培養皿60枚分のBSC40細胞由来の粗溶解物を、DEAEセルロース、ホスホセルロース、セラミックヒドロキシアパタイトおよびハイトラップ（HiTrap）ヘパリンカラムによる精製にかけた。各クロマトグラフィー段階で溶出する活性画分を、DNAポリメラーゼアッセイ法によって決定した（Willer、Mannら 1999）。タンパク質の純度は変性ポリアクリルアミドゲルの銀染色によって決定した。タンパク質濃度は色素結合アッセイ法（Biorad）およびウシ血清アルブミン標準を用いてアッセイした。
【００７１】
実験 2 ：正確な DNA ポリメラーゼ活性のアッセイ法
本発明者らは、バクテリオファージ（例えば、T4、T7）、細菌（例えば、大腸菌（E.coli））、真菌（例えば、S. セレビシエ（S. cerevisiae））およびウイルス（例えば、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アフリカブタコレラウイルスおよび他のイリドウイルスならびにバキュロウイルス）によってコードされるものなどの、DNAポリメラーゼの内在性の鎖連結活性を測定する。ポリメラーゼは、30mM Tris-HCl（pH 7.9）、5mM MgCl２、70mM NaCl、1.8mMジチオスレイトール、88μg/mLのアセチル化BSA、各350ngの第1および第2の線状DNA基質、ならびにアッセイしようとするポリメラーゼを含む、反応混合物をインキュベートすることにより、DNA連結反応におけるその活性を測定するためにアッセイした。第1および第2の線状DNA基質は、それぞれ右端および左端に相補的ヌクレオチド配列を持たなければならず、これらは化学合成、および制限エンドヌクレアーゼ消化などによる、遺伝子または遺伝子の部分としてゲノム、プラスミドまたは他のベクター中に存在する天然の核酸配列からの核酸断片の導出を含む、さまざまな方法によって入手しうる（例えば、上記の材料および方法の項に述べた線状基質の調製を参照のこと）。臭化エチジウムで染色したアガロースゲル上で二量体の形成が検出されれば、ポリメラーゼには必要な活性がある。好ましいポリメラーゼであれば、約1％を上回る二量体産物の形成が可能になると考えられる。
【００７２】
実験 3 ： DNA 連結反応
標準的なDNA連結反応液（20μL）には、30mM Tris-HCl（pH 7.9）、5mM MgCl２、70mM NaCl、1.8mMジチオスレイトール、88μg/mLのアセチル化BSA、各350ngの線状基質、および種々の量（通常0.1μg）の精製ワクシニアDNAポリメラーゼが含まれた。一本鎖結合タンパク質を用いるDNA連結反応物にはまた、25μg/mLの組換えワクシニア一本鎖結合タンパク質（IL3遺伝子産物と考えられる、Tsengら1999）も反応混合物に含まれた。以前の記載の通りに（ZhangおよびEvans、1993）、反応液を37℃で20分間インキュベートし、タンパク質を除去し、反応産物を0.8％アガロースゲルによって分離した。エチジウムで染色したゲルは、ポラロイド（Polaroid）665フィルムを用いてUV照明下で撮影した。DNAの定量は濃度測定によって行った。
【００７３】
2つの線状基質の連結：
ワクシニアDNAポリメラーゼが鎖連結反応を触媒しうることを示すため、分子の末端に少量の重複した配列相同性を共有する2つの線状二重鎖基質を調製した。これは、pDW101（配列番号1）をEcoRI（配列番号2）およびXhoI（配列番号3）（図1A）で切断し、正しい方向に向いた33bpの配列を残すことによってなされた。次にDNAポリメラーゼをこれらのDNAとともにインキュベートし、ゲル電気泳動を用いてコンカテマー形成活性に関してアッセイした。ポリメラーゼが投入したDNAの45％を10分間で二量体産物に変換し、同時に単量体分子が減少することが観察された（図1B）。二量体の収率はその後はわずかに低下し、分子の約35％が産物に変換されて安定した。反応収率はまた、タンパク質濃度にも依存した（図1C）。
【００７４】
二重鎖アニーリングによって選択的に相同末端が対合される：
この対合反応には、少量の重複した末端相同性を共有する2つの異なるDNA基質が必要であった。対照では、利用しうる基質のみが同一の二重鎖のプールである場合には、反応によって連結分子が産生されないことが示された（図5、レーン1〜6）。2つの基質のどちらの末端が連結されるかを明らかにするために、EcoRIおよびXhoIで切断した分子をさらにScaIで消化し、サイズによる区別が可能なDNA断片を作製した（図5、挿入図）。長さが4.2kbp、4.8kbpおよび3.0kbpの組換え体（図5、それぞれレーン9、11および13）の出現によって判定された通り、ワクシニアDNAポリメラーゼはXhoIおよびEcoRI部位を境界とするDNA部分を共有する、2つの分子を選択的に連結した。このような産物のサイズは、XhoI-EcoRI区間をコードする3.0kbp＋1.2kbp、3.0kbp＋1.8kbpおよび1.2kbp＋1.8kbpのDNA断片からなるこれらの分子に一致する。
【００７５】
図1および図5に示した相互作用性末端の調製に用いる制限酵素により、4ヌクレオチドの突出部を有する5'突出末端が残る。末端が反応効率に影響を及ぼすか否かを試験するために、pDW101を種々の制限酵素で切断することによってさまざまな基質を調製した。次に、5'突出末端、平滑末端または5'陥入末端を有する分子の、すべての可能な組み合わせを、それらが依然として基質であるか否かに関して試験した。ワクシニアポリメラーゼには末端選好性がないことが見出された。また、共有する末端相同性の長さが18bp〜84bpの範囲である場合には、二重鎖産物の収率と配列重複長との間にも明らかな相関はなかった。
【００７６】
その他の反応：
84bpの重複相同性を共有する、KpnIおよびNotIで切断した基質を用いて、反応効率に対するMgCl２、スペルミジンまたはワクシニアウイルス一本鎖結合タンパク質（SSB）の影響を検査した。マグネシウムの至適反応濃度は約10mMであった。しかし21mMを超えるスペルミジン濃度と同様に、0mMのMgCl２は反応を抑制した。組換えワクシニアSSB（Tsengら、1999）添加の影響を調べた。主な複製性の高親和性一本鎖DNA結合タンパク質（SSB）は、13L遺伝子産物と考えられている（RochesterおよびTraktman、1998；Tsengら、1999）。ワクシニアSSBは25μg/mLから100μg/mLの間の濃度で添加すると、連結分子の収率を2〜3倍に高めた（図6）。最終的な結果として、これらの至適反応条件下では80％を超える基質DNAを二量体に変換することができた。
【００７７】
多数の基質の連結：
本DNA連結反応により、多数の基質の組換えを行って高次コンカテマーにすることが可能であり、これを利用して反応機構に関してさらなる洞察を提供することができる。「中間」基質（図7、分子「B」）がその他の2つの分子（「A」および「C」）のいずれかの末端と共通の配列を共有するように、プラスミドpDW101を制限酵素で切断した。中間の二重鎖は単独ではポリメラーゼ触媒反応の基質ではなかった（図7、レーン1および4）。しかし、標準的なアッセイ法において3つの基質をワクシニアポリメラーゼとインキュベートした場合には、それらは二量体および三量体の混合物へと急速に変換された（図7、レーン3および6）。少量のDNA（約2％）は、構造が不明な高次多量体にも変換された。
【００７８】
線状三量体に組み入れられた中間分子の場合、分子の両端は酵素処理を受けたに違いない。これらの分子の末端に導入された可能性のある修飾について検討するため、HindIIIで制限処理を行った基質（配列番号4）を標識し、オートラジオグラフィーを用いて32P標識をモニターした。3'末端または5'末端の標識が異なる結果を受ける否かを調べるために、T4ポリヌクレオチドキナーゼまたはクレノーポリメラーゼを用いて、32P標識を中間基質に組み込ませた。電気泳動およびエチジウム染色の後にゲルを固定して、オートラジオグラフィーによって標識の位置を特定した。エチジウム染色ゲルの観察から、二重鎖「B」は3'末端または5'末端のいずれを標識したかにかかわらずコンカテマーに効率的に組み込まれたことが明らかであった（図7、レーン3および6）。しかし、5'標識の大部分は三量体コンカテマーに組み込まれた一方（図7、レーン3）、3'末端標識はこれらの分子（図7、レーン6）、またはポリメラーゼで処理した未反応の基質において、保持されなかった（図7、レーン4）。これらのデータは、MgCl２の影響と合わせて、ワクシニアポリメラーゼの3'-5'エキソヌクレアーゼがインビトロでの連結分子の産生に重要な役割を果たしていることを示唆する。本明細書に記載のDNA連結反応において中心的な役割を果たすのはワクシニアDNAポリメラーゼの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性であるが、反応は5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いて同様に進行すると考えられる。
【００７９】
この反応がワクシニアDNAポリメラーゼの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性に依存するならば、dNTPはヌクレアーゼを阻害することによって末端連結を阻害すると予想される。実験によりこの予想が確認された。4種の全dNTPを1μM（総濃度）添加すると収率は約50％低下し、5μMを上回るdNTPを含む反応液中では連結分子はほとんど形成されなかった。ジデオキシリボヌクレオチドも阻害性であったが、これははるかに高い濃度（＞50μM）の場合であった。
【００８０】
実施例 4 ： PCR 段階
無作為に選択した、ショープ線維腫ウイルス（Wills、Delangeら 1983；Delange、Macaulayら 1984）由来のBamHIクローン由来の約800bpの領域を、以下に示すPCRプライマーを用いて増幅した。大文字はベクター（pDW101）に対して相補的な配列を表し、小文字はウイルスDNA配列に対して相補的な配列を表す。PCRプライマーは、制限酵素NotIの認識部位に隣接するベクター由来の、相補配列を含むように設計した。
【００８１】
実施例 5 ：ベクターの調製
ベクターpDW101を以下に示すようにNotIで消化した：
【００８２】
実施例 6 ：組換え分子の作製
PCR増幅断片（320ng）および線状化ベクター（600ng）の両方を、材料および方法の項で記載したアニーリングアッセイ法により、精製ワクシニアDNAポリメラーゼ（150ng）の存在下で20分間一緒にインキュベートした。反応産物をアガロース電気泳動によって視覚化した（図8）。アガロースゲルにより、これらの条件下で形成された分子の大半が以前に観察された線状二量体であることが示された（図8、レーン5）。しかし、PCR増幅がなされた挿入物の両端にはベクターと共有する相同性があることから、反応産物のごく一部は切れ目の入った環状型およびより高次のコンカテマー型に特有な位置に移動すると予想され、実際にそうであった（図8、レーン6）。これらの反応のいずれも5μMのdNTPの存在下では起こらなかった（図8、レーン7）。
【００８３】
実施例 7 ：コンピテント細胞の形質転換
実施例6の反応混合物のアリコート（1〜2μL）を用いて、3種の異なる大腸菌（E.coli）株（SURE、JM105およびDH5α）を標準的な手順を用いて（SUREおよびDH5αはエレクトロポレーションにより、JM105は熱ショックにより）形質転換した。100μg/mLアンピシリン、40μg/mL X-gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド）、0.5mM IPTG（イソプロピルチオ-β-ガラクトシド）および50μg/mLチミンを含むLB＋Tプレートに適当な希釈物を播き、37℃で一晩インキュベートした。以前の記載の通りに（Wilier、McFaddenおよびEvans、1999）、形質転換コロニーからDNAを単離して配列を決定した。
【００８４】
表1は多重組換え不全SURE細胞を用いて得たデータを示しているが、3種の株全てでいずれも同様の結果が得られた（1μg当たり0.5〜2×10５の形質転換体）。白色（W）のコロニーは正しい可能性がある構築物による形質転換を示す。青色（B）のコロニーはベクター基質のみによる形質転換を示す。安定な形質転換体の収率が、反応混合物へのワクシニアDNAポリメラーゼの添加に大きく依存することは明らかであった。NotIで切断したベクターは脱リン酸化されていなかったが、組換え（白色）コロニーは最も豊富な産物であった（この特定の実験における形質転換体の83％）。13個の推定の組換えプラスミドを精製し、SURE細胞から回収した13個のプラスミドはすべて、単一のDNA挿入物が組み込まれた単量体であることが観察された。DNA配列決定により、13個の分子がすべて、挿入物を正しい方向で予想された位置にコードしていることも示された。プライマー結合部位の1つの内部に3つの塩基置換があり、他に2つの変異がTaqポリメラーゼで増幅したDNAの内部にあった。融合点は相同末端のアニーリングによって形成されると予想される点であった。ワクシニアウイルスポリメラーゼによって会合されたコンカテマーは、従来のクローニング方法に匹敵する適合度で安定な形質転換体へと処理されうると結論づけた。
【００８５】
【表１】
組換え連結分子による大腸菌（E.coli）の形質転換
連結分子は表記の反応成分を含む反応において調製した。大腸菌（E.coli）SURE細胞は1μlの反応産物を用いてエレクトロポレーションを行った。細胞（100μLまたはその等価物）を播き、翌日にコロニーを計数した。細胞のコンピテンシー（competency）は、制限処理を行っていないpDW101を用いて1μg当たり6×1010の形質転換体と概算された。
【００８６】
実施例 8 ：最小限の配列重複
連結分子の産生に必要な最小限の相同性の量を決定するために、さらに7つのプライマー対を合成し、次に8組のオリゴヌクレオチド対を用いて、SFV DNAの約800bp断片のPCR増幅を再び行った。これらの14個の新規PCRプライマーは、NotIで切断したベクター中でNotI部位に隣接するヌクレオチドに相同な配列の量がそのとき4bp〜18bpの範囲であった点を除いて、構造の点では上記のプライマーと同様であった。ワクシニアDNAポリメラーゼおよびgpI3L（別の方法では微量の環状反応産物の検出能を高める）の両方を含む至適アッセイ法において、これらの基質をベクターDNAとともにインキュベートし、かつ線状および環状の連結分子の両方を濃度測定によって定量した。これらのおよび他の実験により、基質間の配列相同性がわずか10bpほどでもワクシニアポリメラーゼによる鎖連結が可能であり、至適反応条件は約14bpであることが示された（図9、パネルB）。これらの反応産物をSURE細胞の形質転換にも用い、白色形質転換体産生の絶対効率には実験間でいくらか変動があったため、3連で行った。すべての実験において、白色（組換え）細菌形質転換体の割合は、ゲル電気泳動によって検出された連結分子の収率と密接に対応した（図9A）。
【００８７】
実施例 9- ワクシニアウイルス DNA ポリメラーゼによる組換えプラスミド DNA のクローニング
本発明の方法を利用して、組換えDNA pRP406-SFVのクローニングを首尾良く行うことができた（図10、11）。
【００８８】
本発明のクローニング法を従来のクローニング法と比較した。全体的に、本発明の方法の方が簡便かつ迅速であった（表2）。
【００８９】
ベクター：pRP406（配列番号8）をPacIおよびBstEIIで切断し、より大きな断片を精製してより小さな介在断片を除去した。
【００９０】
挿入物：PCR-SFVQ（約800bp、配列番号9）、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてショープ線維腫ウイルスDNAの断片を増幅した。PCRプライマーは、切断したベクターの末端に位置する配列と相同な16bpの配列をDNA末端に付加した（図10）。pRP406によるDNAの組換えに用いたプライマーを配列番号10および11に示している。
【００９１】
【表２】
クローニング手順の比較
【００９２】
現時点で好ましい実施例と考えられるものを参照して本出願を説明してきたが、本発明は開示した実施例に限定されないことが理解されるべきである。反対に、本発明は添付した特許請求の趣旨および範囲に含まれるさまざまな修正および等価物も含む。
【００９３】
すべての刊行物、特許および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願の全体が参照として組み入れられるように、具体的および個別に示されている場合と同程度に、それらの全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００９４】
図面の詳細な説明
図1. ワクシニアDNAポリメラーゼによって触媒されるDNAアニーリング
pDW101をEcoRIまたはXhoIで切断し、33bpの重複する配列相同性を共有する2.96kbpの分子を作製した（パネルA）。次に、各0.35μgのDNA基質＋0.1μgのワクシニアウイルスポリメラーゼを含む、アニーリング反応液（20μL）を調製した。指定の時間インキュベーションを行った後に、アガロースゲル電気泳動を用いて反応産物を分画し、臭化エチジウム染色によって視覚化した（パネルB）。または、各0.35μgのDNA基質＋表記量のDNAポリメラーゼを含む反応液を調製し、37℃で20分間インキュベートした（パネルC）。パネルBおよびCでは6kbpの反応産物が形成された。
【００９５】
図2. 三量体の形成
パネルAは反応の概略を示している。3つの線状分子の連結は、挿入DNAをベクター分子の2つの隣接アームに連結するのに必要な反応と、本質的に同じであることに注意されたい。パネルBは、エチジウム染色を行ったアガロースゲル上で分析した反応産物を示している。3つの基質の1つのみをポリメラーゼに提供した場合は、連結分子は形成されない。このことは、反応には反応分子の末端における正しい相補配列が必要であることを示している。
【００９６】
図3. DNAカセットのコンビナトリアル融合
この単純な概要では、3つの異なるDNA二重鎖のプールを調製する。分子の1つのプールでは、各分子の中央部の配列は異なるが、末端は同一である。例えば、A1〜A5はすべて約20ヌクレオチドの同じ配列を右端に有するが、これらの分子の中間部分の配列は異なる。「B」プール内の分子の左端は「A」プール内の分子の右端と適合性がある。同様に、「C」プール内の分子の左端は「B」プール内の分子の右端と適合性がある。ワクシニアポリメラーゼとの反応により、「A」、「B」、および「C」プールから選択された分子の1つからなる三量体が生じると考えられる。この結果得られる三量体のプールは、「A」、「B」、および「C」変種の無作為な取り合わせを表すはずである。
【００９７】
図4. 提案するクローニング法
PCRプライマーは、ベクター挿入部位に隣接する配列に対して相補的な、10個〜20個の付加的なヌクレオチドをコードする。
【００９８】
図5. 基質の必要条件
20μL中に、ワクシニアDNAポリメラーゼ（0.1μg）を加えたまたは加えていない、表記の基質DNAを含む反応液を調製した。ポリメラーゼは、いくらかの重複する末端相同性を共有する2つの基質を与えない限り、連結分子の形成を促進しないと考えられる（レーン1〜6）。DNA断片をサイズによって区別しうる場合、反応産物はXhoI-EcoRI重複領域をコードするDNAを含む（レーン8〜13）。
【００９９】
図6. 連結分子の形成に対するワクシニアSSB（gpI3L）の影響
標準的な反応液（20μL）には、0.1μgのワクシニアウイルスDNAポリメラーゼ（E）、または0.1μgのポリメラーゼ＋0.5μgのワクシニアSSB（●）が含まれる。反応液を表記の時間インキュベートし停止して、ゲル電気泳動（挿入図）および濃度測定によって連結分子の収率を決定した。ワクシニアSSBは反応の程度を高め、産物を安定化した。
【０１００】
図7. ワクシニアウイルスDNAポリメラーゼによって触媒される三量体形成
3つの基質を上のパネルに表記した通りに調製し、ポリヌクレオチドキナーゼまたはクレノーポリメラーゼを用いて中間の基質（「B」）を標識した。反応液を表記の通りに調製し、37℃で20分間インキュベートした後に、アガロースゲル電気泳動を用いて分画した。反応産物はまず臭化エチジウム、次にオートラジオグラフィーによって視覚化した。ポリメラーゼ＋単一のDNA基質のみを含む反応液では連結分子は形成されなかった（レーン1および4）。5'標識のみがポリメラーゼとのインキュベーションを切り抜け、二量体および三量体分子に組み込まれた（レーン3）。
【０１０１】
図8. ワクシニアウイルスDNAポリメラーゼを用いた、PCR増幅DNAのクローニング
約800bpのPCR増幅を行ったDNA断片（「A」）を、表記の通り、NotIで線状化したpDW101（「B」）およびワクシニアウイルスDNAポリメラーゼを伴ってまたは伴わずにインキュベートした。反応産物を電気泳動によって分離し、臭化エチジウムで視覚化した。連結分子はレーン6のみに観察された。これらの連結分子の大部分は線状二量体と予想される位置に移動したが（レーン6）、反応産物のごく一部は切れ目の入った環状分子に典型的な位置に移動した（矢印）。5μM dNTPの添加によって反応は完全に停止した（レーン7）。これらの反応産物を用いる大腸菌（E.coli）の形質転換の影響を表1にまとめた。
【０１０２】
図9. 連結分子の形成に対する相同性の長さの影響
pBluescriptベクター中のNotI部位に隣接して見出される配列と同一の、4、6、8…18bpの末端配列を含む、PCR増幅を行ったDNAを調製した。PCR増幅を行ったDNA＋NotIで切断したベクターの混合物を0.1μgのワクシニアDNAポリメラーゼおよび0.5μgのgpI3Lとともに10分間インキュベートした後に、アガロースゲル電気泳動によって分離した（パネルB、挿入図）。各反応における線状二重鎖（○）および環状連結分子の収率を濃度測定によって決定した（パネルB）。ポリメラーゼを加えない場合は連結分子が生じなかった（△）。反応産物（＋2つの他の実験で調製した連結分子）を細菌SURE細胞に形質転換し、組換え体の収量を表Iの通りに決定した（パネルA）。
【０１０３】
図10は、本発明の方法を用いて組換えDNA pRP406-SFVをクローニングするために組換え操作を行う、DNA地図を提供する。
【０１０４】
図11は、図10（0.8％アガロースゲル上に示す）に示した線状DNAのインビトロ組換えの結果を示している。連結反応の後に、1ulの反応液を形質転換に用いた。残りの溶液はタンパク質を除去して電気泳動を行った。
【０１０５】
本明細書に参照される参考文献の全引用
【図面の簡単な説明】
本発明の特徴は、添付の図面に関して言及した以下の説明によってさらに明らかになると考えられる：
【図１】 本発明の方法を用いた、2つの線状DNA分子の連結に関する概略図（パネルA）および実験結果（パネルBおよびC）を示す。
【図２】 本発明の方法を用いた、3つの線状DNA分子の連結に関する概略図（パネルA）および実験結果（パネルB）を示す。
【図３】 本発明の方法の、DNAカセットのコンビナトリアル融合への応用に関する概略図を示す。
【図４】 本発明の方法の、PCR産物のクローニングへの応用を示す概略図を示す。
【図５】 本発明のDNA連結法における、重複末端および非重複末端の相同性の影響を調査するアッセイ法に関する概略図および実験結果を示している。
【図６】 本発明の方法を用いた、連結分子形成に対するワクシニア一本鎖結合タンパク質の影響を示すグラフおよび実験結果（挿入図）である。
【図７】 本発明の方法を用いた3つの線状DNA分子の連結時における3つの線状DNA基質の連結、ならびに5'および3'末端標識の結果を示す概略図および実験結果を提供する。
【図８】 本発明の方法を用いた、PCR増幅DNAのクローニングに関する概略図および実験結果を提供する。
【図９】 本発明の方法における、連結分子形成に対する相同性の長さの影響をグラフとして示す。
【図１０】 本発明の方法を用いて、組換えDNA pRP406-SFVをクローニングするために組換え操作を行うDNAの地図を提供する。
【図１１】 図10に示した線状DNAのインビトロ組換えの結果を示す（0.8％アガロースゲル）。
【配列表】
発明の分野
本発明は、組換えDNA技術の分野におけるものである。具体的には、本発明はDNAポリメラーゼを用いて1つまたは複数のDNA分子を指向的に連結する方法、およびPCR産物のクローニングへの本方法の応用に関する。
【０００２】
発明の背景
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（MullisおよびFaloona 1987；Saiki, Gelfandら、1988）は科学研究に不可欠な手法である。PCR産物のクローニングはしばしば、研究目標に到達するために必須の段階である。PCRクローニングは数々の課題を提示し、その制限を最小限にするために何年にもわたってさまざまな手法が考案されてきた。PCR産物のクローニングは一般に以下の方法のうちの一つである；i）制限酵素およびリガーゼを用いる従来のPCRクローニング、ii）TベクターまたはTAクローニング、iii）ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）に基づくクローニング、iv）PCRに基づく手法、v）インビボ・リコンビナーゼ法、およびvi）エキソヌクレアーゼを介したクローニング。これらの方法のそれぞれを以下に説明する。
【０００３】
i）従来のPCRクローニング
PCRで増幅したDNAのクローニングは従来、後にPCR産物を適切な酵素で消化した上で適合性のあるベクター中に挿入することが可能なように、PCRプライマーに制限エンドヌクレアーゼ（RE）部位を組み込むことによって容易となった（Sharfら、1990）。この方法にしばしば起こる一つの問題は、REの認識配列がDNA基質の末端に近い場合には公知であるように、REによる切断がうまく行われないことである（KaufmanおよびEvans 1990）。第2の問題は、同じREに対する第2の制限酵素部位が気付かれずに存在する場合、PCRで増幅した領域内部の配列が失われる可能性がある点である。このため、どのREを用いるかを選択する前にPCR産物の完全な配列が知られている必要がある。ひとたびベクターおよびDNA挿入物を同じREで消化すれば、2つのDNA分子をDNAリガーゼによって一般に4時間〜12時間かかる反応で共有結合させることができる。任意の連結反応の際にベクターおよび挿入物が適切な比で存在することが重要であることに注意すべきであるが、これはしばしば決定が困難である。次にこの反応産物を用いてコンピテント大腸菌（E.coli）細胞を形質転換する。この主題をわずかに変更した、後に連結反応を行う必要のない「重複伸長による連結」と呼ばれる変法が考案されているが、これはさらに2つのプライマーを必要とし、全ベクター配列自体も増幅しなければならない（Shuldiner、Tannerら 1991）。
【０００４】
PCR断片の平滑末端クローニングも広く用いられているが、2つの平滑末端DNA分子を共に連結する場合にDNAリガーゼに問題が生じるため、この手法の効率は比較的低い。この手法も、Taqポリメラーゼ（原型のPCR増幅酵素）がそのターミナルトランスフェラーゼ活性によって、3'末端にアデニン残基を付加する傾向があるという事実により複雑になる（Clark 1988；Mole、Iggoら 1989）。Taqポリメラーゼを用いて生成される全PCR産物の約50％は、これらの3'伸長物を含む（Clark、1988）。この問題に関する方法の一つは、プロトコールにもう1つ段階を加えて、これらの付加されたアデニン残基をクレノー酵素（Hemsley、Arnheimら 1989）またはT4 DNAポリメラーゼ（CostaおよびWeiner 1994）で「研磨」または除去することである。
【０００５】
パイロコッカス・フリオーシス（Pyrococcus furiosis）由来のPfuポリメラーゼおよび古細菌サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来のVentRポリメラーゼを含む、最近発見されたさまざまな耐熱性ポリメラーゼは、固有の3'-5'エキソヌクレアーゼ活性により、3'アデニン残基の伸長を生じない。増幅ポリメラーゼによって生じる問題に加えて、この手法では指向性クローニングは可能ではなく、組換えDNAにおける挿入物の向きをあらかじめ定めることはできないことを意味する。
【０００６】
ii）TベクターおよびTAクローニング
Taqポリメラーゼのターミナルトランスフェラーゼ活性は、TAクローニングとして現在一般的に知られている手法において、多くの研究者によって活用されてきた。PCRで増幅したDNA上に見出される3'突出アデノシン残基に対する天然の相補物である、チミジン残基が突出した末端が得られるように、選択したベクターを適切なREで消化する。この手法の最も重大な欠点は、適合性のある末端が生じるようにベクターを特別に操作しなければならないことである。この目標を達成する唯一の簡単な方法は、平滑末端が生じるようにベクターを制限処理した後に、それをdTTPのみの存在下でTaqポリメラーゼで処理することである。数多くの企業がこの手法に基づくキットを開発しており、これにはストラタジーン（Stratagene）社のpCR-Script（商標）SK(S) キット、プロメガ（Promega）社のpGEM（登録商標）-T、ファルマシア（Pharmacia）社のSureClone（商標）連結キットおよびノバジェン（Novagen）社のpT7Blue Tベクターキットが含まれる。これらの方法に対する主な制限は、製造者が供給するベクターを使わねばならず、クローニングしたDNA断片を選択したベクターに移行させる第2のサブクローニング段階がしばしば必要なことである。これらのキットを購入する代わりとなる、安価な選択肢の一つは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection（ATCC））からわずかな費用または無料で入手しうる、TベクターpGEM（登録商標）5fZ(+)を用いることである。このベクターをXcmIで消化すると、TAクローニングに用いるT突出部が得られる（Kovalic、Kwakら 1991；Mead、Peyら 1991）。適切なRE消化の後に適した末端が得られる、他のTベクターが数多く独立に開発されている（Cha、Bishaiら 1993；IchiharaおよびKurosawa 1993）。しかし、このようなベクターを作製するためには多くの操作が必要であった。最近、これらのキットに伴う可能性のある他の問題も報告されている（Hengen 1995）。pCR-Scriptベクターを単独で試験した場合に、高いバックグラウンド値が観察されており、PCRIIはpBR322の複製起点を含み、したがって複製されるコピー数が少なく、かつ-20℃での凍結解凍サイクルの繰り返しにより、T尾部の不安定化および損失がもたらされる。すべてのTベクター法には、指向的でなく、連結段階を要するという欠点がある。
【０００７】
インビトロゲン（Invitrogen）社は、連結段階の必要性を回避することにより、従来のTAクローニング法を改良した。TOPO TAクローニングと呼ばれるこの方法では、トポイソメラーゼIと呼ばれるワクシニアウイルス酵素によって触媒される反応を利用する（Shuman、1994および米国特許第5,766,891号）。トポイソメラーゼは二本鎖DNAと結合して、二重鎖のうち一方のホスホジエステル骨格を切断することができる。本酵素は配列特異的で、主として認識配列5'-(C/T)CCTT↓-3'で切断する（ShumanおよびPrescott 1990；Shuman 1991）。本酵素は元の鎖を逆に再連結することができるか、または組換え種の形成に際して2つの異種DNAを連結することができる（Shuman 1992；Shuman 1992）。本反応は非常に効率が良く、実験台上でのわずか5分のインキュベートしか要しない。本方法には、リガーゼが必要でなく、挿入物の全配列に関する情報が必要でなく、PCRプライマーに別のヌクレオチドを付加する必要がないという利点もある。しかし、TOPO認識配列を含むように操作された、特定のプラスミドしか使用できない。これらのベクターは、ベクターを制限処理した後に特定のリンカーまたはアダプターを付加することによって作製されるが、これは容易な作業ではない。この手法のもう1つの制限は、TOPO認識配列はベクターの3'末端から10bp以内に位置しなければならず、さらに挿入物に5-OH基がなければならない点である。増幅されるDNA内の内部認識配列により、問題が起こりうるという問題点も提起されているが、これらの部位は単に再連結されるだけであり、この手法に何ら制限を課すものではない（Shuman 1994；Stivers、Shumanら 1994）。一般的な使用に際して、インビトロゲン（Invitrogen）社のキットは別の潜在的な問題を提供した（未発表の結果）。クローンのスクリーニングのための、青／白選択（blue-white selection）と呼ばれる従来の方法では、インビトロゲン（Invitrogen）社のキットを用いると確定的な結果が得られない。このため、正しい構築物が得られることを確認するためには、白色および淡青色のコロニーの両方をアッセイする必要がある。
【０００８】
iii）ウラシルDNA-グリコシラーゼ（UDG）に基づくクローニング
ラシュトチアン（Rashtchian）ら（1992）は、細胞での通常の役割がDNA修復酵素である酵素、ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）を用いるリガーゼ非依存的なPCRクローニング法を開発した。この手法はPCRプライマーの5'末端に12bpの付加
【０００９】
UDGクローニングの変法の一つは、dUMP残基でのUDG切断によって生じる塩基喪失（abasic）部位（AP）を利用する。これらのAP部位は、T4エンドヌクレアーゼVまたはヒトAPエンドヌクレアーゼIなどのAPエンドヌクレアーゼの基質である。これらの修復酵素のいずれかで処理することにより、適切なベクター中に続いて連結するのに適した5-Pが得られる。この方法の欠点の一つはプライマー内に修飾塩基（デオキシウリジン）を必要とすることであり、成功の可否はリガーゼ処理に加えて2つの酵素に依拠する。UDGクローニングのあまり知られていない第2の変法では、プライマー内の所定の位置に1,3-プロパンジオールと呼ばれる非塩基性残基を用い、クローニング用の適合性のある5'末端が得られるが、この方法は他のリガーゼ非依存的なクローニング法よりもはるかに効率が低い（KaluzおよびFlint 1994）。
【００１０】
iv）PCR誘導型クローニング
PCR特異的なクローニング法はしばしば、組換えDNAが増幅手順それ自体の間に産生される、一段階の手順である。この主題には多くの変法があり、リガーゼ依存的なものもあればそうでないものもある。これらの方法は主としてクローニングされる遺伝子に位置特異的な変異を作製するために用いられる。以下に現在の手法を簡単に記載する。
【００１１】
リガーゼ依存的な方法
a）ストラタジーン（Stratagene）社は平滑末端PCR断片のクローニングのための手法を製品化しており（Weiner 1993）、これは当初リュウ（Liu）およびシュワルツ（Schwartz）（1992）によって記載された。彼らの方法では、PCRプライマーの5'末端をリン酸化することが必要である。受容側のベクターを線状化し、子ウシ腸アルカリホスファターゼ（CIAP）で処理した後に、第2の制限酵素で消化して適合性のある末端を得る。これはかなり複雑な手法であるが、この結果得られるベクターは一リン酸化されており、指向性クローニングを可能にする。指向性クローニングの成功率は95％と報告されたが、それらの手法にはエタノール沈殿が必要であり、やはりリガーゼの作用に依拠している。
【００１２】
b）「ヘテロスタッガークローニング（hetero-stagger cloning）」は、もう1つのリガーゼ依存的な方法であり、計4つのPCRプライマーを必要とする（Liu 1996）。プライマーの1組は従来のPCRプライマー対であり、第2の組は最初のものと同等であるが、5'-GGG残基をさらに含む。DNAを通常のPCR条件下で増幅し、その産物を熱変性させ、次に冷却によってゆっくりと再度アニールさせる。再アニーリングの結果、4つの異なる種が形成される。理論的にクローニング可能なのは産物の50％のみであり、指向性クローンが首尾良く得られるのは産物の25％に過ぎない。この手法に関して主張されている唯一の利点は、最新の校正ポリメラーゼを増幅時に用いることが可能になることである。
【００１３】
c）プライマー対が1つしか必要としない、スタッガード・再アニーリング法（staggered re-annealing）の変法も用いられている（AilenbergおよびSilverman 1996）。
【００１４】
d）さらに最近では、ガル（Gal）ら（1999）が、「オートスティッキー（autosticky）PCR」（AS-PCR）（特許出願HU9801320号）と呼ばれる手法を考案した。この手法は、DNAに存在する塩基喪失部位がDNAポリメラーゼを引き止めることができるという所見を利用している。この方法では、増幅しているポリメラーゼを引き止める塩基喪失部位を含むようにPCRプライマーを設計し、その結果、5'突出部が生じて、適切な消化処理を行ったベクター中に連結することが可能となる。塩基喪失部位は、2-デオキシリボースの安定な構造類似体であるテトラヒドロフランを所定の位置に組み込むことによって作製する。この方法は指向性クローニングのために提供されるが、通常とは異なる試薬を必要とし、連結を一晩行わせることが推奨される。
【００１５】
リガーゼ非依存的なクローニング法（LIC）
a）最初のリガーゼPCRクローニング法はシュルディナー（Shuldiner）ら（1991）によって記載された。それ以来、この手法の数多くの適応が開発されている。本明細書に記載された手法（TemesgenおよびEschrich 1996）には、3つのPCRプライマーが必要であり、そのプライマーの1つにはさらに24ヌクレオチドが付加されている。この過程は2つの異なるPCR増幅を伴い、従って産物にPCRの誤りが入り込む確率が高くなる。しかし、リガーゼの必要性を回避して、線状の産物を大腸菌（E.coli）に直接形質転換することが可能である。コンピテント大腸菌（E.coli）TG2株の細胞が必要であり、JM105またはDH5αなどの古典的な株で代用できるかどうかは不明である。この手法は指向性クローニングのために提供されるが、成功は第2のPCR段階におけるPCRパラメーターに関係している。この手法には任意のベクターを用いることができ、制限酵素は必要でない。
【００１６】
b）ガルセス（Garces）およびラボーダ（Laborda）（1995）は、2つのPCRプライマーのみを必要とし、その一方が20bpの5'伸長部を持つ、同様の手法を報告している。反応は一本のチューブ内での反応として起こり、任意のベクターの使用に適合させることができるが、効率はPCRパラメーターにより大きく影響される。
【００１７】
v）インビボ組換えに基づくクローニング
PCRクローニングは従来、研究室の試験管環境内で完結するが、インビボ系を用いたクローニングの報告が少なくとも2件ある。以下の手法は、酵母を線状鋳型およびギャップ含有プラスミドを用いて共トランスフェクトすると、相同組換えによって2つの種を「はぎ合わせる（patch）」ことが可能であるという所見に基づいた（GuthrieおよびFink、1991）。それ以来、酵母ではこの方法を用いてPCR産物のクローニングが行われている（ScharerおよびIggo 1992）。同様の現象は大腸菌（E.coli）でも報告されている（Oliner、Kinzlerら 1993）。この手法はおそらく宿主によってコードされる内因性エキソヌクレアーゼ活性またはポリメラーゼ活性を利用しているが、実際に何が起こっているかに関する推測はなされていない。PCRプライマーは、選択したRE部位に隣接する配列と同一である5'配列を含むように設計する。線状化ベクターおよびPCR産物を大腸菌（E.coli）JC8679株に共トランスフェクトする。DH5α細胞は分子内ギャップ修復を触媒できず、このため分子間の組換えも触媒できないと考えられることが独立した複数の報告によって示されるため、この手法は通常の大腸菌（E.coli）株との使用には適さない可能性がある（Hanahan、1985）。ブベック（Bubeck）ら（1993）によって記載された同様の方法では、CaCl２法により形質転換した場合のみであるが、DH5α細胞における組換えの成功が報告された。熱ショックおよびエレクトロポレーションとして知られる、細菌の形質転換により一般的に用いられる手法は、上記の実験に用いて失敗した。
【００１８】
vi）エキソヌクレアーゼに基づくPCRクローニング
PCR断片のクローニングのための完全に異なる一つのアプローチには、種々のエキソヌクレアーゼの活性による一本鎖突出部の生成を伴う。エキソヌクレアーゼに基づく方法はすべてリガーゼ非依存性であり、アスラニディス（Aslanidis）およびディヨング（deJong）（1990）により最初に報告された手法に基づく。この手法に数多くの修正が加えられたことによって、この方法は改良され（Haun、Serventiら 1992；Kuijper、Wirenら 1992）、これはいずれもT4 DNAポリメラーゼの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を用いる。PCRプライマーは、ベクター内の選択したRE部位に隣接する配列に対して、相補的な5'伸長部を含むように設計する。T4ポリメラーゼによる外ヌクレオチド鎖分解消化によって一本鎖突出部を生成し、ベクターと挿入物の間の一本鎖領域のアニーリングは直接細菌を形質転換できるまでに十分に安定である。これらの手法では、酵素が極めて効率的であるために、インキュベーション期間を精密に調節する必要があり、慎重に行わないとDNAが過剰に消化される可能性がある。クジパー（Kuijper）ら（1992）は、酵素標品間に大きな変動があるため、酵素の新しいバッチ毎に時間条件を微調整する必要があることも報告した。これらの特定の方法の第2の欠点は、酵素を適切な時点で停止させるためにエキソヌクレアーゼ反応物にdTTPまたはdATPを添加する必要があることである。
【００１９】
上記で報告されたものと同様の方法では、エキソヌクレアーゼIIIと呼ばれる異なる酵素を用いており（Hsiao 1993）、これは1992年にクローニング用として最初に用いられた（Kaluz、Kolbleら 1992）。この制限は、効率的にクローニングされるのが平滑末端または5'突出型の基質のみである点である。3'突出部を有する基質をこの方法によってクローニングすることはできない。
【００２０】
さらに最近では、ファージT7 Gene6エキソヌクレアーゼがPCRクローニングに用いられている（ZhouおよびHatahet 1995）。この手法では、プライマーの中央側に向かって位置する内部ホスホロチオエート結合を含むように、PCRプライマーを設計する。プライマーの3'末端は標準的なPCRプライマーであるが、一方、5'末端は特定のRE部位に隣接する配列に対して相補的であるように設計する。この方法は指向性クローンを産生し、リガーゼ非依存性であるが、標準的でないPCRプライマーを用いる必要がある。米国特許第5,580,759号（Yangら）も、エキソヌクレアーゼ陥入（recession）による組換えDNAの構築方法を開示している。
【００２１】
以上をまとめると、PCR産物のクローニングに関しては非常にさまざまな方法が存在し、それぞれに利点および欠点がある。以下の特徴を有する最適なクローニング法は依然として必要とされている：
任意のベクターおよび制限酵素の使用に適合する；
天然塩基のみからなる2つのPCRプライマーのみを必要とする；
リガーゼ非依存性である；
時間効率が優れている；
ほぼ完全に指向性クローニングのみを提供する；
認識する必要があるのは増幅領域の末端配列だけである；
PCR産物の内部消化の可能性がない；
任意の種類の増幅用ポリメラーゼを用いることができる；
容易に入手可能な種々の大腸菌（E.coli）株に適合する；
さまざまな手法によって細菌の形質転換を行うことができる；
明確な選択；および
コンビナトリアルクローニングのような他の手法に適応可能である。
【００２２】
発明の概要
本発明者らは、ワクシニアDNAポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼが、1つまたは複数の線状DNA分子を効率的に連結しうることを明らかにした。本方法は、一連のDNA分子の末端に存在する、配列要素間の組換えを用いて接合部を指定し、特定のDNAポリメラーゼを分子の連結のために用いる。本方法を、1つまたは複数の線状DNA分子を単一の手順で正確に連結するために用いることもできる。この新たな方法は主に組換えDNA分子の構築に適用され、特にPCR産物を任意の所望のベクター中にクローニングするために適用される。本方法は、上記に列挙した最適なクローニング法のすべての特徴を提供する。
【００２３】
したがって、本発明は、以下の段階を含む2つの線状DNA分子を連結する方法を提供する：
第1の末端および第2の末端を有する第1の線状DNA分子を提供する段階；
第1の末端および第2の末端を有する第2の線状DNA分子を提供する段階；
ここで、第1の線状DNA分子は、第2の線状DNA分子の第1の末端または第2の末端のいずれかにあるヌクレオチド配列に対して、相補的なヌクレオチド配列を第1の末端または第2の末端のいずれかに有し、ならびに
2つの線状DNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの存在下において2つの線状DNA分子をインキュベートする段階。
【００２４】
1つの態様において、本発明は、以下の段階を含む2つまたはそれ以上の線状DNA分子を連結する方法を提供する：
1つの線状DNA分子のx'鎖の5'末端が、それに連結させようとする別の線状DNA分子のx鎖の5'末端に対して相補的なヌクレオチド配列を有する、反対の極性をもちそれぞれx鎖およびx'鎖を有する、2つまたはそれ以上の線状DNA分子を提供する段階；ならびに
2つまたはそれ以上の線状DNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの存在下において2つまたはそれ以上の線状DNA分子をインキュベートする段階であって、
ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、本発明のDNA連結反応を行うことができる段階。
【００２５】
本方法を、任意の数のDNA分子を連結するために用いてもよい。重要な点は、各DNA分子の末端が、それに連結させようとする分子に対する相補領域を持つように分子を確実に選択することである。内部分子は両端に相補領域を持たなければならない。この手法の特別な用途には、DNAカセットのコンビナトリアル融合および合成遺伝子の調製がある。この手法は断片化されたクローンの再構築にも有用である。
【００２６】
また、本発明の方法を、両端が実質的に相補的な核酸配列を有する、単一のDNA分子の再環状化に応用してもよい。この手法は部位特異的変異誘発の分野に適応しうる。
【００２７】
本発明の方法に用いうるDNAポリメラーゼには、本発明のDNA連結反応を行うことができる、内在性エキソヌクレアーゼ活性、好ましくは3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する、すべてのDNAポリメラーゼが含まれる。このようなポリメラーゼは、本明細書に記載する通り、相補的なヌクレオチド配列を持つ末端を有する、2つの線状DNA分子を連結する能力に関してアッセイすることによって同定しうる。好ましくは、DNAポリメラーゼは、ワクシニアウイルスDNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、および大腸菌（E.coli）DNAポリメラーゼIのクレノー断片からなる群より選択される。最も好ましくは、DNAポリメラーゼはワクシニアウイルスDNAポリメラーゼである。各線状DNA分子の相補的ヌクレオチド配列の長さは、約5から約100ヌクレオチドの間、好ましくは約8から約50ヌクレオチドの間、最も好ましくは約10から35ヌクレオチドの間でありうる。インキュベーション混合物に公知の種々の刺激因子を加えてもよい。このような刺激因子は、反応の効率を向上させ、かつ所望の反応産物、例えば一本鎖DNA結合タンパク質を安定化させるものである。
【００２８】
もう1つの態様において、本発明は以下の段階を含む、組換えDNA分子を構築する方法を伴う：
それぞれ第1および第2の末端を有する、線状化ベクターDNA分子および鋳型DNA分子を提供する段階；
線状化ベクター分子の第1の末端に対して相補的なヌクレオチド配列を、鋳型DNA分子の第1の末端上に組み入れると考えられるヌクレオチド配列を含む5'末端、および鋳型DNA分子の第1の末端上の適した位置にハイブリダイズするように設計された3'末端を有する、第1のプライマーDNA分子を提供する段階；
線状化ベクター分子の第2の末端に対して相補的なヌクレオチド配列を、鋳型DNA分子の第2の末端上に組み入れると考えられるヌクレオチド配列を含む5'末端、および鋳型DNA分子の第2の末端上の適した位置にハイブリダイズするように設計された3'末端を有する、第2のプライマーDNA分子を提供する段階；
第1および第2のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて鋳型DNA分子を増幅して、PCR増幅産物を得る段階；ならびに
DNAポリメラーゼの存在下でPCR増幅産物を線状化ベクターDNA分子とともにインキュベートして、組換えDNA分子を生成する段階であって、
ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、本発明のDNA連結反応を行うことができる段階。
【００２９】
本発明の方法に用いうるDNAポリメラーゼには、本発明のDNA連結反応を行うことができる、内在性エキソヌクレアーゼ活性、好ましくは3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有する、すべてのDNAポリメラーゼが含まれる。このようなポリメラーゼは、本明細書に記載する通り、相補的なヌクレオチド配列を持つ末端を有する2つの線状DNA分子を連結する能力に関してアッセイすることによって同定しうる。好ましくは、DNAポリメラーゼは、ワクシニアウイルスDNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、および大腸菌（E.coli）DNAポリメラーゼIのクレノー断片からなる群より選択される。最も好ましくは、DNAポリメラーゼはワクシニアウイルスDNAポリメラーゼである。インキュベーション混合物に、公知の種々の刺激因子を加えてもよい。このような刺激因子は、反応の効率を向上させ、かつ所望の反応産物、例えば一本鎖DNA結合タンパク質を安定化させるものである。
【００３０】
鋳型DNA分子の第1および第2の末端上に組み入れられる、相補的ヌクレオチドの数は、約5から約100ヌクレオチドの間、好ましくは約8から約50ヌクレオチドの間、最も好ましくは約10から35ヌクレオチドの間でありうる。
【００３１】
本方法は、2つまたはそれ以上のDNA分子のベクターへの挿入に容易に応用しうる。追加する各分子毎に、隣接分子の適当な末端に対して相補的なPCR伸長の用意をする（prime）第1の部分、および増幅させるDNA分子の適当な末端に対して相補的な第2の部分をそれぞれが有する、二連型（bipartite）PCRプライマーがさらに2つ必要になると考えられる。
【００３２】
本発明の方法を用いて線状化ベクターに挿入しようとする線状DNA分子を、PCR増幅によって入手する必要はない。このため本発明は、以下の段階を含む、組換えDNA分子を構築する方法をさらに伴う：
線状化ベクターDNA分子を提供する段階；
連結させようとする線状化ベクターDNA分子の末端に対して、実質的に相補的な末端を有する線状の挿入DNA分子を提供する段階；ならびに
2つのDNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの存在下において線状化ベクターDNA分子および線状の挿入DNA分子をインキュベートする段階であって、
ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、DNA分子を連結する段階。線状の挿入DNA分子は任意の公知の手段、例えば、化学合成、連結、またはアニーリングによって入手しうる。
【００３３】
本発明は、任意の鋳型DNA分子を、任意のベクターの単一の制限酵素部位中に指向的にクローニングする方法を提供する。ベクター末端は任意の制限酵素切断によって生成しうる。本方法は連結段階を必要とせず、特定のエキソヌクレアーゼのみを伴う方法で必要とされるような、慎重に調節される条件を使用する必要もない。
【００３４】
本発明はまた、本方法を行うための試薬を含むキットにも向けられる。
【００３５】
本発明のこれらのおよびその他の局面を以下にさらに詳細に説明する。
【００３６】
発明の詳細な説明
定義
本明細書で用いる「相補的な」という用語は、別のDNA分子におけるヌクレオチド配列の鎖に対して、特異的に（無作為的ではなく）ハイブリダイズして、結果として水素結合を生じるのに十分に相補的な、一本鎖DNA分子におけるヌクレオチド配列を指す。
【００３７】
本明細書で用いる「線状DNA分子」という用語は、分子の塩基対に存在する各相補的塩基の間の、1つまたは複数の水素結合によって合わされた、実質的に相補的なポリヌクレオチドの極性が反対の2つの鎖（センスおよびアンチセンス）を含む、二本鎖（二重鎖）核酸分子を指す。
【００３８】
本明細書で用いる「組換えDNA分子」という用語は、自然界で通常は一緒には見出されない少なくとも2つのヌクレオチド配列を含む、ハイブリッドDNA分子を指す。
【００３９】
本明細書で用いる「ヌクレオチド」という用語は、糖部分（五炭糖）、リン酸基および含窒素複素環式塩基からなるDNAの単量体単位を指す。塩基は配糖体炭素（五炭糖の1'炭素）を介して糖部分と結合しており、この塩基と糖の組み合わせがヌクレオシドである。ヌクレオシドが五炭糖の3'位または5'位に結合したリン酸基を含む場合、これはヌクレオチドと呼ばれる。機能的に結合したヌクレオチドの配列を、本明細書では一般に「ヌクレオチド配列」およびそれらの文法的等価物として称し、これは左から右の方向が5'末端から3'末端への通常の向きであるような定則によって表される。
【００４０】
DNA の連結方法
本発明は、特定のDNAポリメラーゼを用いて2つまたはそれ以上の線状DNA分子を連結するための方法に関する。本方法は、特定のDNAポリメラーゼが、共通の相補的ヌクレオチドを共有する末端を有する、線状DNA分子の組換えを促進しうることに依拠している。
【００４１】
したがって、本発明は、以下を含む2つの線状DNA分子を連結する方法を提供する：
第1の末端および第2の末端を有する第1の線状DNA分子を提供する段階；
第1の末端および第2の末端を有する第2の線状DNA分子を提供する段階であって、
ここで、第1の線状DNA分子が、第2の線状DNA分子の第1の末端または第2の末端のいずれかにあるヌクレオチド配列に対して、相補的なヌクレオチド配列を第1の末端または第2の末端のいずれかに有する段階；ならびに
2つの線状DNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの存在下において2つの線状DNA分子をインキュベートする段階。
【００４２】
第1および／または第2の線状DNA分子は、1つまたは複数の線状DNA分子からなりうる。例えば、第1の線状DNA分子は、本発明の方法を用いてすでに連結された、2つの線状DNA分子からなってもよい。
【００４３】
1つの態様において、本発明は以下の段階を含む、2つまたはそれ以上の線状DNA分子を連結する方法を提供する：
各線状DNA分子のx'鎖の5'末端が、それに連結させようとする線状DNA分子のx鎖の5'末端のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する、極性が反対であるx鎖およびx'鎖をそれぞれが有する、2つまたはそれ以上の線状DNA分子を提供する段階；ならびに
2つまたはそれ以上の線状DNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの存在下において2つまたはそれ以上の線状DNA分子をインキュベートする段階であって、
ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、本発明のDNA連結反応を行うことができる段階。
【００４４】
本発明の方法において働くDNAポリメラーゼは、本発明のDNA連結反応を行うことができる、内在性エキソヌクレアーゼ活性、好ましくは3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するものである。このようなポリメラーゼは、本明細書の実施例2（実験の項）に記載する通り、相補的なヌクレオチド配列を持つ末端を有する、2つの線状DNA分子を連結する能力に関してアッセイすることによって同定しうる。本明細書で提示した実施例では精製ワクシニアDNAポリメラーゼを用いた。また、T4 DNAポリメラーゼ、および大腸菌（E.coli）DNAポリメラーゼIのクレノー断片を用いても反応が進むことが示されている。本発明のDNAポリメラーゼは市販のものでもよく、標準的な組換えDNA技術を用いて調製してもよい。例えば、マクドナルド（McDonald）およびトラクトマン（Traktman）（1994）ならびにウィラー（Willer）、マン（Mann）ら（1999）に記載された通りに、ワクシニアDNAポリメラーゼをワクシニアに感染したBSC-40細胞から精製してもよい。または、ワクシニアDNAポリメラーゼを野生型ワクシニアウイルスに感染した細胞から精製してもよい。本発明者らは、相補的なヌクレオチド配列を持つ末端を有する、2つの線状DNA分子を連結する能力を測定するために、ポリメラーゼをアッセイする。これらには、バクテリオファージ（例えば、T4、T7）、細菌（例えば、大腸菌（E.coli））、真菌（例えば、S. セレビシエ（S. cerevisiae））ならびにウイルス（例えば、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アフリカブタコレラウイルスおよび他のイリドウイルスならびにバキュロウイルス）によってコードされるものが含まれるが、限定されない。本発明に有用なDNAポリメラーゼは、好ましくは内在性3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を持つ。本発明は、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を持つDNAポリメラーゼを含むように拡張される。
【００４５】
反応の効率を高めるため、および／または反応産物を安定化するために、さまざまな公知の刺激因子をインキュベーション混合物に加えてもよい。適した刺激因子には一本鎖DNA結合タンパク質が含まれる。用いうる一本鎖DNA結合タンパク質の中には、ワクシニアおよび大腸菌（E.coli）の一本鎖結合タンパク質、単純ヘルペスウイルスICP8タンパク質、ならびに酵母およびヒトの複製プロテインA（例えば、yRPAおよびhRPA）を含むが、これらに限定されないものもある。当業者は、本発明の方法においてDNAポリメラーゼと組み合わせて有用に用いうる、他の適した刺激因子を容易に同定しうると考えられる。本発明の1つの面において、ワクシニア一本鎖結合タンパク質を用いて、ワクシニアDNAポリメラーゼを用いるDNA連結反応の収率を高める。
【００４６】
線状DNA分子の末端間の相補性の程度は、約5から約100ヌクレオチドの間、好ましくは約8から約50ヌクレオチドの間、最も好ましくは約10から35ヌクレオチドの間を変動しうる。本発明の方法を用いて連結されうる線状DNA分子は、制限酵素切断を用いて、原核生物または真核生物のゲノムのゲノムDNA、ならびにプラスミド、コスミド、ファージ、BACなどを含む種々のベクターから入手してもよい。または、線状DNA分子を、例えば自動合成などを用いる化学的手法によって合成してもよい。DNA分子は任意の種由来のmRNA、tRNAおよびrRNAなどのRNA種に由来してもよく、サムブルック（Sambrook）ら（1989）に記載された通りに、まず逆転写酵素によってcDNAに変換して増幅することができる。
【００４７】
最も一般的な応用として、本発明は、2つまたはそれ以上の線状DNA分子を連結する方法を提供する。図1は、2つの線状DNA分子の連結のためのこの反応の概略図を示している（パネルA）。これは、左端および右端上に相補配列を共有する2つの基質を、どのように特定のDNAポリメラーゼの存在下でインキュベートして二量体を形成させるかを例示している。図1のパネルCは、左端および右端に35bpの相補配列を共有する2つの基質の1：1の混合物を、さまざまな量のワクシニアDNAポリメラーゼとインキュベートし、その産物をアガロースゲルを用いてサイズ別に分離した実験の結果を示している。ポリメラーゼを加えなかった場合は反応は全く観察されず（レーン2）、ポリメラーゼの量を増やしながら添加すると産物の収量が増加した（レーン3〜9）。
【００４８】
図2のパネルAは、3つの線状DNA分子の連結による三量体の産生を示している。この場合に「中間」分子は、2つの隣接分子の末端に対して相補的なDNA配列を両端に持たなければならない。中間分子が各末端に2つの隣接分子を有し、相補的な約20bpのDNA配列をもつ場合の、実際の実験結果を図2のパネルBに示している。図2のパネルBには重要な対照も例示されている（レーン5）。同一分子の末端には適切な種類の共通した相補性がないため、ポリメラーゼは3つの基質のうちの1つだけを与えた場合にはコンカテマーを形成しないと考えられる。この特異性は、ほとんど無数の種々の末端配列重複部を単に調節するだけで、2つまたはそれ以上の分子をどのように融合させるかを正確に指示できることを意味する。
【００４９】
したがって、本発明は以下の段階を含む、3つの線状DNA分子を連結する方法を提供する：
第1の末端および第2の末端を有する第1の線状DNA分子を提供する段階；
第1の末端および第2の末端を有する第2の線状DNA分子を提供する段階；
第1の末端および第2の末端を有する第3の線状DNA分子を提供する段階；
ここで、第1の線状DNA分子は、第2の線状DNA分子の第1の末端または第2の末端のいずれかにあるヌクレオチド配列に対して、相補的なヌクレオチド配列を第1の末端に有し、第1の線状DNA分子は、第3の線状DNA分子の第1の末端または第2の末端のいずれかにあるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を第2の末端に有し、かつ
3つの線状DNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの存在下において3つの線状DNA分子をインキュベートする段階。
【００５０】
当業者は、DNA分子が1つの分子を別の分子に連結させるための適当な相補配列を含むならば、上記の方法を用いて任意の数のDNA分子を連結させうることを認識すると考えられる。例えば、上記の3つの分子に第4のDNA分子を連結させるためには、第2または第3のDNA分子のいずれかが遊離端（すなわち、第1のDNA分子に連結していない末端）に第4のDNA分子の一方の端にある配列に対して相補的なヌクレオチド配列を持つ必要がある。
【００５１】
本発明のもう1つの応用は、図3に示すような、DNAカセットのコンビナトリアル融合である。この例では、3つの異なるDNA分子のプールを調製する。分子のプール内では、末端は同一であるが各分子の中央部の配列はさまざまである。例えば、図3に示す通り、A1〜A5はすべて約5から約100ヌクレオチド、好ましくは約8から約50ヌクレオチド、より好ましくは約10から約35ヌクレオチドの同じヌクレオチド配列を右端に有するが、分子の残りの部分の配列はさまざまである。「B」プール内の分子の左端は「A」プール内の分子の右端との適合性がある。同様に、「C」プール内の分子の左端は「B」プール内の分子の右端と適合性がある。適合性があるとは、それらが約5から約100ヌクレオチド、好ましくは約8から約50ヌクレオチド、より好ましくは約10から約35ヌクレオチドの範囲である、適当な相補配列を共有していることを意味する。プールA、BおよびCからの分子の混合物を、本発明の方法で有用なDNAポリメラーゼとインキュベートすることにより、A、BおよびCプールから選択された各分子の1つからなる三量体が生じると考えられる。この結果得られる三量体のプールは、「A」、「B」および「C」変種の無作為な組み合わせを表すはずである。「プール」および各プール内の分子の数は、何百万もの異なるDNA分子の無作為な組み合わせが生じる可能性があるように、変動しうる。本発明の方法を用いるDNAカセットのコンビナトリアル融合は、異なるタンパク質構造ドメインをコードするDNA分子のコンビナトリアル融合による、新規タンパク質をコードするDNA配列の構築に応用しうる。これらのタンパク質ライブラリーを新規な結合特異性に関してスクリーニングしてもよい。
【００５２】
本発明の方法を、末端に実質的に相補的な核酸配列を有する単一のDNA分子の組換え（環状化）に用いることもできる。したがって、本発明は以下の段階を含む、線状DNA分子を環状化する方法にも関する：
線状DNA分子の各末端上に実質的に相補的な核酸配列を導入すると考えられるプライマーの存在下で、線状DNA分子のPCR増幅を行う段階；および
PCR増幅がなされた線状DNA分子を、線状DNA分子が環状化される条件下でDNAポリメラーゼの存在下においてインキュベートする段階であって、
ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、DNA分子を環状化する段階。
【００５３】
本発明の方法を単一DNA分子の環状化に応用する用途の一つは、部位特異的変異誘発の分野にある。例えば、実質的に相補的な核酸配列が各末端に組み入れられるように設計したプライマーを用いて、関心対象の遺伝子を含むプラスミドのPCR増幅を行うことができる。プラスミド中の関心対象の遺伝子の内部に変異が導入されるようにプライマーを設計すれば、変異型の遺伝子が得られる。
【００５４】
反応の特徴をさらにいくつか調査した。最も重要な点は、ワクシニアポリメラーゼが、2つの組換え中の分子上に存在する末端の種類に左右されないように見られるという事実であるかもしれない。5'突出部、3'突出部または平滑末端を有する分子は、任意の2つ1組の組み合わせにおいて、2つの分子が適当な配列相補性を共有している限りは基質であった。
【００５５】
DNA のクローニング法
もう1つの態様において、本発明は任意の二本鎖PCR産物を任意の望ましいベクター中にクローニングする方法を提供する。したがって、以下の段階を含む、組換えDNA分子を構築する方法が提供される：
それぞれ第1および第2の末端を有する、線状化ベクターDNA分子および鋳型DNA分子を提供する段階；
線状化ベクター分子の第1の末端に対して相補的なヌクレオチド配列を、鋳型DNA分子の第1の末端上に組み入れると考えられるヌクレオチド配列を含む5'末端、および鋳型DNA分子の第1の末端上の適した位置にハイブリダイズするように設計された3'末端を有する、第1のプライマーDNA分子を提供する段階；
線状化ベクター分子の第2の末端に対して相補的なヌクレオチド配列を、鋳型DNA分子の第2の末端上に組み入れると考えられるヌクレオチド配列を含む5'末端、および鋳型DNA分子の第2の末端上の適した位置にハイブリダイズするように設計された3'末端を有する、第2のプライマーDNA分子を提供する段階；
第1および第2のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて鋳型DNA分子を増幅して、PCR増幅産物を得る段階；ならびに
DNAポリメラーゼの存在下でPCR増幅産物を線状化ベクターDNA分子とともにインキュベートして、組換えDNA分子を生成する段階であって、
ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、本発明のDNA連結反応を行うことができる段階。
【００５６】
本方法に必要なのは、PCRプライマーを伸長して、ベクター中の選択したクローニング部位に隣接する塩基配列を複製する、いくつかのヌクレオチドを組み入れることだけである。提案するアプローチを図4に示している。一組の二連型プライマーを設計する。第1のプライマー分子の3'末端は鋳型DNA分子の第1の末端にハイブリダイズするように設計され、第1のプライマー分子の5'末端は、ベクターDNA分子の第1の末端に対して相補的な配列を最終PCR産物に組み入れるように設計された、約5から約100ヌクレオチド、好ましくは約8から約50ヌクレオチド、より好ましくは約10から約35ヌクレオチドの配列を有する。第2のプライマーの3'末端は鋳型DNA分子の第2の末端にハイブリダイズするように設計され、第2のプライマー分子の5'末端は、ベクターDNA分子の第2の末端に対して相補的な配列を最終PCR産物に組み入れるように設計された、約5から約100ヌクレオチド、好ましくは約8から約50ヌクレオチド、より好ましくは約10から約35ヌクレオチドの配列を有する。次に2つのプライマーを鋳型DNA分子にアニールさせ、その後にPCR増幅産物が生じる標準的な条件を用いてPCR増幅を行う。ベクターは、標準的な条件を用いてそれを選択した挿入部位で切断するために、適切な制限酵素で処理することによって調製する。
【００５７】
本明細書で用いるプライマーという用語は、二連型プライマー、または第1および第2の部分を有するプライマーを説明するものとする。プライマーの第1の部分は鋳型DNA分子の適当な末端に対して相補的であるように設計し、プライマーの第2の部分はベクターの選択した制限酵素部位の片側のヌクレオチド配列に対して相補的であるように設計する。本発明の二連型オリゴヌクレオチドプライマーを、関心対象のDNA分子に対して相補的であり、DNA分子をベクター中に組み入れることを可能とするような一本鎖オリゴヌクレオチドとして、広義に定義してもよい。二連型プライマーは一般に、最小限の長さが約18ヌクレオチドであって最大限の長さが約200ヌクレオチドであると考えられ、好ましくは約25ヌクレオチドから約100ヌクレオチド、より好ましくは約30ヌクレオチドから約40ヌクレオチドと考えられる。本方法は、2つまたはそれ以上のDNA分子をベクター中へ挿入するのに容易に応用しうると考えられる。追加する各分子は、隣接分子の適当な末端に対して相補的なPCR伸長の用意をする第1の部分、および増幅させるDNA分子の適当な末端に対して相補的な第2の部分をそれぞれ有する、二連型PCRプライマーをさらに2つ必要とすると考えられる。
【００５８】
次に、PCR増幅産物および線状化ベクターを、本発明のDNA連結反応を行うことができる、内在性エキソヌクレアーゼ活性、好ましくは3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼの存在下において、適した反応緩衝液中で約5分〜約60分間、好ましくは約10分〜約40分間、最も好ましくは約15分〜約30分間インキュベートする。本明細書に提示した実施例では、精製ワクシニアDNAポリメラーゼを用いた。T4 DNAポリメラーゼ、および大腸菌（E.coli）DNAポリメラーゼIのクレノー断片を用いて反応が進むことが示されている。反応緩衝液はDNAアニーリング反応に用いられる任意の緩衝液でよい。温度は約35℃〜40℃の範囲でよく、より好ましくは約37℃である。
【００５９】
本発明の方法において働くDNAポリメラーゼは、本明細書の実施例2（実験の項）に記載する通り、適切な相補配列を持つ末端を有する、2つの線状DNA分子を連結する能力に関してアッセイすることによって同定しうる。本発明のDNAポリメラーゼは市販のものでもよく、または標準的な組換えDNA技術を用いて調製してもよい。例えば、マクドナルド（McDonald）およびトラクトマン（Traktman）（1994）ならびにウィラー（Willer）、マン（Mann）ら（1999）に記載された通りに、ワクシニアDNAポリメラーゼをワクシニアに感染したBSC-40細胞から精製してもよい。または、ワクシニアDNAポリメラーゼを野生型ワクシニアウイルスに感染した細胞から精製してもよい。本発明者らは、ポリメラーゼのアッセイを行い、相補的なヌクレオチド配列を持つ末端を有する、2つの線状DNA分子を連結する能力を測定する。これらには、バクテリオファージ（例えば、T4、T7）、細菌（例えば、大腸菌（E.coli））、真菌（例えば、S. セレビシエ（S. cerevisiae））ならびにウイルス（例えば、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アフリカブタコレラウイルスおよび他のイリドウイルスならびにバキュロウイルス）によってコードされるものが含まれるが、限定されない。本発明において有用なDNAポリメラーゼは、好ましくは内在性3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を持つ。本発明はまた、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を持つDNAポリメラーゼも含むように拡張される。
【００６０】
反応の効率を高めるため、および／または反応産物を安定化するために、さまざまな公知の刺激因子をインキュベーション混合物に加えてもよい。適した刺激因子には一本鎖DNA結合タンパク質が含まれる。用いうる一本鎖DNA結合タンパク質の中には、ワクシニアおよび大腸菌（E.coli）の一本鎖結合タンパク質、単純ヘルペスウイルスICP8タンパク質、ならびに酵母およびヒトの複製プロテインA（例えば、yRPAおよびhRPA）が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、本発明の方法においてDNAポリメラーゼと組み合わせて有用に用いうる、他の適した刺激因子を容易に同定しうると考えられる。本発明の1つの局面においては、ワクシニア一本鎖結合タンパク質を用いて、ワクシニアDNAポリメラーゼを用いる本発明のDNAクローニング法の収率を高める。
【００６１】
本発明の方法を用いて、任意の種類または数の標的DNA分子のPCRクローニングを行うことができる。サイズに関する唯一の制限は、宿主細胞内での形質転換および複製において、ベクター分子が挿入物を保持しうる収容能である。プラスミド、コスミド、ファージ、BACなどの、原核生物または真核生物の細胞内で複製可能な任意のベクターを、本発明に用いることができる。ベクターの選択は、例えばタンパク質発現などの所望の機能特性、および形質転換を行う宿主細胞に依存する。好ましくは、ベクターは約5から約100ヌクレオチド、好ましくは約8から約50ヌクレオチド、最も好ましくは約10から約35ヌクレオチドの公知の配列を、選択した制限酵素部位の一方の側に有する。本発明の方法を用いて組換えDNA分子に組み入れられるDNA分子は、制限酵素切断を用いて、原核生物または真核生物のゲノムのゲノムDNA、ならびにプラスミド、コスミド、ファージ、BACなどを含む種々のベクターから入手してもよい。または、DNA分子を自動合成などにより合成してもよい。核酸は任意の種由来のmRNA、tRNAおよびrRNAなどのRNA種に由来してもよく、サムブルック（Sambrook）ら（1989）に記載された通りに、まず逆転写酵素によってcDNAに変換して増幅してもよい。
【００６２】
本発明の方法を用いて線状化ベクターに挿入しようとする線状DNA分子は、PCR増幅によって入手する必要はない。このような分子は、制限酵素消化によって環状二本鎖DNA分子を線状化し、続いて合成オリゴマーリンカーを末端に接着させることにより、またはすでに線状のDNA分子を制限酵素で二次消化し、続いてアダプター／リンカーを末端に付加することにより、またはアニールして完全な二重鎖DNA分子を形成しうる、2つの適切に設計された合成一本鎖DNAオリゴマーのアニーリングにより、または任意の他の関連した方法によって、調製してもよい。このような方法によって得られた線状DNA分子を、内在性エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼの存在下で、線状化ベクターDNA分子とインキュベートすることにより、所望の組換えDNA分子が得られると考えられる。したがって、本発明はまた、以下の段階を含む、組換えDNA分子を構築する方法に関する：
線状化ベクターDNA分子を提供する段階；
連結させようとする線状化ベクターDNA分子の末端に対して、実質的に相補的な末端を有する線状の挿入DNA分子を提供する段階；ならびに
2つのDNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの存在下において線状化ベクターDNA分子および線状の挿入DNA分子をインキュベートする段階であって、
ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、DNA分子を連結する段階。
【００６３】
組換え DNA 分子の形質転換
線状化ベクターおよびPCR増幅産物とのDNAポリメラーゼのインキュベーションによって得られる反応混合物を、標準的な形質転換手順を用いて任意の宿主細胞の形質転換を行うために直接用いてもよい。したがって、本発明は以下の段階を含む、組換えDNA産物を作製する方法も提供する：
それぞれ第1および第2の末端を有する、線状化ベクターDNA分子および鋳型DNA分子を提供する段階；
線状化ベクター分子の第1の末端に対して相補的なヌクレオチド配列を、鋳型DNA分子の第1の末端上に組み入れると考えられるヌクレオチド配列を含む5'末端、および鋳型DNA分子の第1の末端上の適した位置にハイブリダイズするように設計された3'末端を有する、第1のプライマーDNA分子を提供する段階；
線状化ベクター分子の第2の末端に対して相補的なヌクレオチド配列を、鋳型DNA分子の第2の末端上に組み入れると考えられるヌクレオチド配列を含む5'末端、および鋳型DNA分子の第2の末端上の適した位置にハイブリダイズするように設計された3'末端を有する、第2のプライマーDNA分子を提供する段階；
第1および第2のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて鋳型DNA分子を増幅して、PCR増幅産物を提供する段階；
DNAポリメラーゼの存在下でPCR増幅産物を線状化ベクターDNA分子とともにインキュベートして、組換えDNA分子を生成する段階；
組換えDNA分子を宿主細胞へ形質転換する段階；ならびに
組換えDNA産物を単離する段階であって、
ここでDNAポリメラーゼが内在性エキソヌクレアーゼ活性を有し、本発明のDNA連結反応を行うことができる段階。選択的には、適した刺激因子を本発明の方法に用いてもよい。例えば、組換えDNA分子を生成するために、DNAポリメラーゼおよび一本鎖DNA結合タンパク質の存在下で、PCR増幅産物を線状化ベクターDNA分子とともにインキュベートしてもよい。
【００６４】
大腸菌（E.coli）SURE、JM105、DH5α、HB101、XL1-blueなどの、形質転換を行うことができる任意の種類の細胞が宿主細胞として役立つ。その他の細菌宿主には桿菌またはシュードモナス属などが含まれうる。例えば、真核宿主細胞にはサッカロミセス属が含まれうる。本発明の利点の一つは、本方法が挿入DNAの正しい方向に関して選択的であることである。このため、組換えベクターにより形質転換された宿主細胞は、そのベクター中に挿入DNAを正しい向きで有すると考えられる。
【００６５】
本発明は、本発明の方法を用いて任意の線状DNA分子を線状化ベクター分子内にクローニングすることによって得られた、反応産物による宿主細胞の形質転換も含むように拡張される。クローニングしようとする線状DNA分子は、上記のようにPCRを用いて調製してもよく、または制限酵素消化によって環状二本鎖DNA分子を線状化し、続いて合成オリゴマーリンカーを末端に結合させることにより、またはすでに線状のDNA分子を制限酵素により二次消化した後、アダプター／リンカーを末端に付加することにより、またはアニーリングによって完全な二重鎖DNA分子を形成しうる2つの適切に設計された合成一本鎖DNAオリゴマーのアニーリングにより、または任意の他の関連した方法によって、調製してもよい。
【００６６】
キット
本発明は、PCR産物（または末端に適当な相同ヌクレオチドを有する、任意の他の線状DNA分子）を線状化ベクター中に指向的にクローニングするのに適したキットも提供する。本キットは、別々の容器内に、本発明のDNA連結反応を行うことができる内在性エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼのアリコート、および反応緩衝液のアリコートを含んでもよい。アリコートとは、少なくとも1回のクローニングのプログラムを行うのに十分な成分量を指す。DNAポリメラーゼは公知の濃度の溶液として、選択的に適した安定化剤を含む緩衝液中で提供してもよく、または適した緩衝液に溶解するための凍結乾燥産物の所定のアリコートとして提供してもよい。本キットは選択的には、一本鎖DNA結合タンパク質などの刺激因子のアリコートを含みうる。本キットはまた、陽性対照反応を行うために必要な試薬も含みうる。このような試薬には、別々の容器内に、線状化ベクターのアリコート、適当な相補配列を有する第1および第2の末端を持つ挿入DNAのアリコート、本発明のDNA連結反応を行うことができる内在性エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼのアリコート、選択的に、一本鎖DNA結合タンパク質などの刺激因子のアリコート、および反応緩衝液のアリコートが含まれうる。
【００６７】
以下の実施例で本発明をさらに例示する。しかし、これらの実施例は例示のみを目的としたものであり、いかなる形でも本発明の範囲を制限するために用いられるべきではないことが理解されるべきである。
【００６８】
実験に基づく実施例
材料および方法
線状基質は、プラスミドpDW101の制限酵素消化の後にフェノール抽出およびエタノール沈殿を行うことによって調製した。pDW101は、ヌクレオチド618位、619位および621位の自然欠失によってpBluescript（KS+）（Stratagene）から得られる。いくつかの実験では、線状基質をアガロース電気泳動によって精製し、ジーンクリーンII（Geneclean II）キット（New England Biolabs）を用いてアガロースから抽出した。[α-32P]dCTPおよび[γ-32P]dATPは、NEN／マンデルサイエンティフィック（Mandel Scientific）社から購入した。末端標識がなされた基質は、小エビアルカリホスファターゼ（United States Biochemical、Cleveland）で処理した後に、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよび［γ-32P］dATP（3000Ci/mmol）、またはクレノー酵素および［α-32P］dCTP（3000Ci/mmol）のいずれかとともにインキュベートすることによって作製した。取り込まれなかった放射性ヌクレオチドをG-25スピンカラム（Pharmacia）によって除去し、放射能をチェレンコフ（Cherenkov）（Schneider、1971）によって定量した。HindIIIで消化したλファージDNA、およびHaeIIIで消化したΦX174 DNAマーカーは、ニューイングランドバイオラボ（New England Biolabs）社から購入した。ルシフェラーゼアッセイキットはプロメガ（Promega）社から購入した。
【００６９】
細胞およびウイルス培養
BSC-40細胞はE. ナイルズ（E. Niles）博士（SUNY、Buffalo）から寄贈を受けたものであり、1％非必須アミノ酸および5％ウシ胎仔血清を添加したDMEM（Gibco BRL）中で、5％CO2環境において37℃で増殖させた。ワクシニアウイルス（WR株）はATCCから購入した。
【００７０】
実験 1 ：ワクシニア DNA ポリメラーゼの精製
ワクシニアに感染したBSC-40細胞からのワクシニアDNAポリメラーゼの精製は記載されている（McDonaldおよびTraktman 1994；Willer、Mannら 1999）。簡潔に述べると、vTMPOLおよびVTF7.5に共感染させた、150cm2培養皿60枚分のBSC40細胞由来の粗溶解物を、DEAEセルロース、ホスホセルロース、セラミックヒドロキシアパタイトおよびハイトラップ（HiTrap）ヘパリンカラムによる精製にかけた。各クロマトグラフィー段階で溶出する活性画分を、DNAポリメラーゼアッセイ法によって決定した（Willer、Mannら 1999）。タンパク質の純度は変性ポリアクリルアミドゲルの銀染色によって決定した。タンパク質濃度は色素結合アッセイ法（Biorad）およびウシ血清アルブミン標準を用いてアッセイした。
【００７１】
実験 2 ：正確な DNA ポリメラーゼ活性のアッセイ法
本発明者らは、バクテリオファージ（例えば、T4、T7）、細菌（例えば、大腸菌（E.coli））、真菌（例えば、S. セレビシエ（S. cerevisiae））およびウイルス（例えば、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アフリカブタコレラウイルスおよび他のイリドウイルスならびにバキュロウイルス）によってコードされるものなどの、DNAポリメラーゼの内在性の鎖連結活性を測定する。ポリメラーゼは、30mM Tris-HCl（pH 7.9）、5mM MgCl２、70mM NaCl、1.8mMジチオスレイトール、88μg/mLのアセチル化BSA、各350ngの第1および第2の線状DNA基質、ならびにアッセイしようとするポリメラーゼを含む、反応混合物をインキュベートすることにより、DNA連結反応におけるその活性を測定するためにアッセイした。第1および第2の線状DNA基質は、それぞれ右端および左端に相補的ヌクレオチド配列を持たなければならず、これらは化学合成、および制限エンドヌクレアーゼ消化などによる、遺伝子または遺伝子の部分としてゲノム、プラスミドまたは他のベクター中に存在する天然の核酸配列からの核酸断片の導出を含む、さまざまな方法によって入手しうる（例えば、上記の材料および方法の項に述べた線状基質の調製を参照のこと）。臭化エチジウムで染色したアガロースゲル上で二量体の形成が検出されれば、ポリメラーゼには必要な活性がある。好ましいポリメラーゼであれば、約1％を上回る二量体産物の形成が可能になると考えられる。
【００７２】
実験 3 ： DNA 連結反応
標準的なDNA連結反応液（20μL）には、30mM Tris-HCl（pH 7.9）、5mM MgCl２、70mM NaCl、1.8mMジチオスレイトール、88μg/mLのアセチル化BSA、各350ngの線状基質、および種々の量（通常0.1μg）の精製ワクシニアDNAポリメラーゼが含まれた。一本鎖結合タンパク質を用いるDNA連結反応物にはまた、25μg/mLの組換えワクシニア一本鎖結合タンパク質（IL3遺伝子産物と考えられる、Tsengら1999）も反応混合物に含まれた。以前の記載の通りに（ZhangおよびEvans、1993）、反応液を37℃で20分間インキュベートし、タンパク質を除去し、反応産物を0.8％アガロースゲルによって分離した。エチジウムで染色したゲルは、ポラロイド（Polaroid）665フィルムを用いてUV照明下で撮影した。DNAの定量は濃度測定によって行った。
【００７３】
2つの線状基質の連結：
ワクシニアDNAポリメラーゼが鎖連結反応を触媒しうることを示すため、分子の末端に少量の重複した配列相同性を共有する2つの線状二重鎖基質を調製した。これは、pDW101（配列番号1）をEcoRI（配列番号2）およびXhoI（配列番号3）（図1A）で切断し、正しい方向に向いた33bpの配列を残すことによってなされた。次にDNAポリメラーゼをこれらのDNAとともにインキュベートし、ゲル電気泳動を用いてコンカテマー形成活性に関してアッセイした。ポリメラーゼが投入したDNAの45％を10分間で二量体産物に変換し、同時に単量体分子が減少することが観察された（図1B）。二量体の収率はその後はわずかに低下し、分子の約35％が産物に変換されて安定した。反応収率はまた、タンパク質濃度にも依存した（図1C）。
【００７４】
二重鎖アニーリングによって選択的に相同末端が対合される：
この対合反応には、少量の重複した末端相同性を共有する2つの異なるDNA基質が必要であった。対照では、利用しうる基質のみが同一の二重鎖のプールである場合には、反応によって連結分子が産生されないことが示された（図5、レーン1〜6）。2つの基質のどちらの末端が連結されるかを明らかにするために、EcoRIおよびXhoIで切断した分子をさらにScaIで消化し、サイズによる区別が可能なDNA断片を作製した（図5、挿入図）。長さが4.2kbp、4.8kbpおよび3.0kbpの組換え体（図5、それぞれレーン9、11および13）の出現によって判定された通り、ワクシニアDNAポリメラーゼはXhoIおよびEcoRI部位を境界とするDNA部分を共有する、2つの分子を選択的に連結した。このような産物のサイズは、XhoI-EcoRI区間をコードする3.0kbp＋1.2kbp、3.0kbp＋1.8kbpおよび1.2kbp＋1.8kbpのDNA断片からなるこれらの分子に一致する。
【００７５】
図1および図5に示した相互作用性末端の調製に用いる制限酵素により、4ヌクレオチドの突出部を有する5'突出末端が残る。末端が反応効率に影響を及ぼすか否かを試験するために、pDW101を種々の制限酵素で切断することによってさまざまな基質を調製した。次に、5'突出末端、平滑末端または5'陥入末端を有する分子の、すべての可能な組み合わせを、それらが依然として基質であるか否かに関して試験した。ワクシニアポリメラーゼには末端選好性がないことが見出された。また、共有する末端相同性の長さが18bp〜84bpの範囲である場合には、二重鎖産物の収率と配列重複長との間にも明らかな相関はなかった。
【００７６】
その他の反応：
84bpの重複相同性を共有する、KpnIおよびNotIで切断した基質を用いて、反応効率に対するMgCl２、スペルミジンまたはワクシニアウイルス一本鎖結合タンパク質（SSB）の影響を検査した。マグネシウムの至適反応濃度は約10mMであった。しかし21mMを超えるスペルミジン濃度と同様に、0mMのMgCl２は反応を抑制した。組換えワクシニアSSB（Tsengら、1999）添加の影響を調べた。主な複製性の高親和性一本鎖DNA結合タンパク質（SSB）は、13L遺伝子産物と考えられている（RochesterおよびTraktman、1998；Tsengら、1999）。ワクシニアSSBは25μg/mLから100μg/mLの間の濃度で添加すると、連結分子の収率を2〜3倍に高めた（図6）。最終的な結果として、これらの至適反応条件下では80％を超える基質DNAを二量体に変換することができた。
【００７７】
多数の基質の連結：
本DNA連結反応により、多数の基質の組換えを行って高次コンカテマーにすることが可能であり、これを利用して反応機構に関してさらなる洞察を提供することができる。「中間」基質（図7、分子「B」）がその他の2つの分子（「A」および「C」）のいずれかの末端と共通の配列を共有するように、プラスミドpDW101を制限酵素で切断した。中間の二重鎖は単独ではポリメラーゼ触媒反応の基質ではなかった（図7、レーン1および4）。しかし、標準的なアッセイ法において3つの基質をワクシニアポリメラーゼとインキュベートした場合には、それらは二量体および三量体の混合物へと急速に変換された（図7、レーン3および6）。少量のDNA（約2％）は、構造が不明な高次多量体にも変換された。
【００７８】
線状三量体に組み入れられた中間分子の場合、分子の両端は酵素処理を受けたに違いない。これらの分子の末端に導入された可能性のある修飾について検討するため、HindIIIで制限処理を行った基質（配列番号4）を標識し、オートラジオグラフィーを用いて32P標識をモニターした。3'末端または5'末端の標識が異なる結果を受ける否かを調べるために、T4ポリヌクレオチドキナーゼまたはクレノーポリメラーゼを用いて、32P標識を中間基質に組み込ませた。電気泳動およびエチジウム染色の後にゲルを固定して、オートラジオグラフィーによって標識の位置を特定した。エチジウム染色ゲルの観察から、二重鎖「B」は3'末端または5'末端のいずれを標識したかにかかわらずコンカテマーに効率的に組み込まれたことが明らかであった（図7、レーン3および6）。しかし、5'標識の大部分は三量体コンカテマーに組み込まれた一方（図7、レーン3）、3'末端標識はこれらの分子（図7、レーン6）、またはポリメラーゼで処理した未反応の基質において、保持されなかった（図7、レーン4）。これらのデータは、MgCl２の影響と合わせて、ワクシニアポリメラーゼの3'-5'エキソヌクレアーゼがインビトロでの連結分子の産生に重要な役割を果たしていることを示唆する。本明細書に記載のDNA連結反応において中心的な役割を果たすのはワクシニアDNAポリメラーゼの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性であるが、反応は5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いて同様に進行すると考えられる。
【００７９】
この反応がワクシニアDNAポリメラーゼの3'-5'エキソヌクレアーゼ活性に依存するならば、dNTPはヌクレアーゼを阻害することによって末端連結を阻害すると予想される。実験によりこの予想が確認された。4種の全dNTPを1μM（総濃度）添加すると収率は約50％低下し、5μMを上回るdNTPを含む反応液中では連結分子はほとんど形成されなかった。ジデオキシリボヌクレオチドも阻害性であったが、これははるかに高い濃度（＞50μM）の場合であった。
【００８０】
実施例 4 ： PCR 段階
無作為に選択した、ショープ線維腫ウイルス（Wills、Delangeら 1983；Delange、Macaulayら 1984）由来のBamHIクローン由来の約800bpの領域を、以下に示すPCRプライマーを用いて増幅した。大文字はベクター（pDW101）に対して相補的な配列を表し、小文字はウイルスDNA配列に対して相補的な配列を表す。PCRプライマーは、制限酵素NotIの認識部位に隣接するベクター由来の、相補配列を含むように設計した。
実施例 5 ：ベクターの調製
ベクターpDW101を以下に示すようにNotIで消化した：
実施例 6 ：組換え分子の作製
PCR増幅断片（320ng）および線状化ベクター（600ng）の両方を、材料および方法の項で記載したアニーリングアッセイ法により、精製ワクシニアDNAポリメラーゼ（150ng）の存在下で20分間一緒にインキュベートした。反応産物をアガロース電気泳動によって視覚化した（図8）。アガロースゲルにより、これらの条件下で形成された分子の大半が以前に観察された線状二量体であることが示された（図8、レーン5）。しかし、PCR増幅がなされた挿入物の両端にはベクターと共有する相同性があることから、反応産物のごく一部は切れ目の入った環状型およびより高次のコンカテマー型に特有な位置に移動すると予想され、実際にそうであった（図8、レーン6）。これらの反応のいずれも5μMのdNTPの存在下では起こらなかった（図8、レーン7）。
【００８３】
実施例 7 ：コンピテント細胞の形質転換
実施例6の反応混合物のアリコート（1〜2μL）を用いて、3種の異なる大腸菌（E.coli）株（SURE、JM105およびDH5α）を標準的な手順を用いて（SUREおよびDH5αはエレクトロポレーションにより、JM105は熱ショックにより）形質転換した。100μg/mLアンピシリン、40μg/mL X-gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド）、0.5mM IPTG（イソプロピルチオ-β-ガラクトシド）および50μg/mLチミンを含むLB＋Tプレートに適当な希釈物を播き、37℃で一晩インキュベートした。以前の記載の通りに（Wilier、McFaddenおよびEvans、1999）、形質転換コロニーからDNAを単離して配列を決定した。
【００８４】
表1は多重組換え不全SURE細胞を用いて得たデータを示しているが、3種の株全てでいずれも同様の結果が得られた（1μg当たり0.5〜2×10５の形質転換体）。白色（W）のコロニーは正しい可能性がある構築物による形質転換を示す。青色（B）のコロニーはベクター基質のみによる形質転換を示す。安定な形質転換体の収率が、反応混合物へのワクシニアDNAポリメラーゼの添加に大きく依存することは明らかであった。NotIで切断したベクターは脱リン酸化されていなかったが、組換え（白色）コロニーは最も豊富な産物であった（この特定の実験における形質転換体の83％）。13個の推定の組換えプラスミドを精製し、SURE細胞から回収した13個のプラスミドはすべて、単一のDNA挿入物が組み込まれた単量体であることが観察された。DNA配列決定により、13個の分子がすべて、挿入物を正しい方向で予想された位置にコードしていることも示された。プライマー結合部位の1つの内部に3つの塩基置換があり、他に2つの変異がTaqポリメラーゼで増幅したDNAの内部にあった。融合点は相同末端のアニーリングによって形成されると予想される点であった。ワクシニアウイルスポリメラーゼによって会合されたコンカテマーは、従来のクローニング方法に匹敵する適合度で安定な形質転換体へと処理されうると結論づけた。
【００８５】
【表１】
組換え連結分子による大腸菌（E.coli）の形質転換
【００８６】
実施例 8 ：最小限の配列重複
連結分子の産生に必要な最小限の相同性の量を決定するために、さらに7つのプライマー対を合成し、次に8組のオリゴヌクレオチド対を用いて、SFV DNAの約800bp断片のPCR増幅を再び行った。これらの14個の新規PCRプライマーは、NotIで切断したベクター中でNotI部位に隣接するヌクレオチドに相同な配列の量がそのとき4bp〜18bpの範囲であった点を除いて、構造の点では上記のプライマーと同様であった。ワクシニアDNAポリメラーゼおよびgpI3L（別の方法では微量の環状反応産物の検出能を高める）の両方を含む至適アッセイ法において、これらの基質をベクターDNAとともにインキュベートし、かつ線状および環状の連結分子の両方を濃度測定によって定量した。これらのおよび他の実験により、基質間の配列相同性がわずか10bpほどでもワクシニアポリメラーゼによる鎖連結が可能であり、至適反応条件は約14bpであることが示された（図9、パネルB）。これらの反応産物をSURE細胞の形質転換にも用い、白色形質転換体産生の絶対効率には実験間でいくらか変動があったため、3連で行った。すべての実験において、白色（組換え）細菌形質転換体の割合は、ゲル電気泳動によって検出された連結分子の収率と密接に対応した（図9A）。
【００８７】
実施例 9- ワクシニアウイルス DNA ポリメラーゼによる組換えプラスミド DNA のクローニング
本発明の方法を利用して、組換えDNA pRP406-SFVのクローニングを首尾良く行うことができた（図10、11）。
【００８８】
本発明のクローニング法を従来のクローニング法と比較した。全体的に、本発明の方法の方が簡便かつ迅速であった（表2）。
【００８９】
ベクター：pRP406（配列番号8）をPacIおよびBstEIIで切断し、より大きな断片を精製してより小さな介在断片を除去した。
【００９０】
挿入物：PCR-SFVQ（約800bp、配列番号9）、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてショープ線維腫ウイルスDNAの断片を増幅した。PCRプライマーは、切断したベクターの末端に位置する配列と相同な16bpの配列をDNA末端に付加した（図10）。pRP406によるDNAの組換えに用いたプライマーを配列番号10および11に示している。
【００９１】
【表２】
クローニング手順の比較
現時点で好ましい実施例と考えられるものを参照して本出願を説明してきたが、本発明は開示した実施例に限定されないことが理解されるべきである。反対に、本発明は添付した特許請求の趣旨および範囲に含まれるさまざまな修正および等価物も含む。
【００９３】
すべての刊行物、特許および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願の全体が参照として組み入れられるように、具体的および個別に示されている場合と同程度に、それらの全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００９４】
図面の詳細な説明
図1. ワクシニアDNAポリメラーゼによって触媒されるDNAアニーリング
pDW101をEcoRIまたはXhoIで切断し、33bpの重複する配列相同性を共有する2.96kbpの分子を作製した（パネルA）。次に、各0.35μgのDNA基質＋0.1μgのワクシニアウイルスポリメラーゼを含む、アニーリング反応液（20μL）を調製した。指定の時間インキュベーションを行った後に、アガロースゲル電気泳動を用いて反応産物を分画し、臭化エチジウム染色によって視覚化した（パネルB）。または、各0.35μgのDNA基質＋表記量のDNAポリメラーゼを含む反応液を調製し、37℃で20分間インキュベートした（パネルC）。パネルBおよびCでは6kbpの反応産物が形成された。
【００９５】
図2. 三量体の形成
パネルAは反応の概略を示している。3つの線状分子の連結は、挿入DNAをベクター分子の2つの隣接アームに連結するのに必要な反応と、本質的に同じであることに注意されたい。パネルBは、エチジウム染色を行ったアガロースゲル上で分析した反応産物を示している。3つの基質の1つのみをポリメラーゼに提供した場合は、連結分子は形成されない。このことは、反応には反応分子の末端における正しい相補配列が必要であることを示している。
【００９６】
図3. DNAカセットのコンビナトリアル融合
この単純な概要では、3つの異なるDNA二重鎖のプールを調製する。分子の1つのプールでは、各分子の中央部の配列は異なるが、末端は同一である。例えば、A1〜A5はすべて約20ヌクレオチドの同じ配列を右端に有するが、これらの分子の中間部分の配列は異なる。「B」プール内の分子の左端は「A」プール内の分子の右端と適合性がある。同様に、「C」プール内の分子の左端は「B」プール内の分子の右端と適合性がある。ワクシニアポリメラーゼとの反応により、「A」、「B」、および「C」プールから選択された分子の1つからなる三量体が生じると考えられる。この結果得られる三量体のプールは、「A」、「B」、および「C」変種の無作為な取り合わせを表すはずである。
【００９７】
図4. 提案するクローニング法
PCRプライマーは、ベクター挿入部位に隣接する配列に対して相補的な、10個〜20個の付加的なヌクレオチドをコードする。
【００９８】
図5. 基質の必要条件
20μL中に、ワクシニアDNAポリメラーゼ（0.1μg）を加えたまたは加えていない、表記の基質DNAを含む反応液を調製した。ポリメラーゼは、いくらかの重複する末端相同性を共有する2つの基質を与えない限り、連結分子の形成を促進しないと考えられる（レーン1〜6）。DNA断片をサイズによって区別しうる場合、反応産物はXhoI-EcoRI重複領域をコードするDNAを含む（レーン8〜13）。
【００９９】
図6. 連結分子の形成に対するワクシニアSSB（gpI3L）の影響
標準的な反応液（20μL）には、0.1μgのワクシニアウイルスDNAポリメラーゼ（E）、または0.1μgのポリメラーゼ＋0.5μgのワクシニアSSB（●）が含まれる。反応液を表記の時間インキュベートし停止して、ゲル電気泳動（挿入図）および濃度測定によって連結分子の収率を決定した。ワクシニアSSBは反応の程度を高め、産物を安定化した。
【０１００】
図7. ワクシニアウイルスDNAポリメラーゼによって触媒される三量体形成
3つの基質を上のパネルに表記した通りに調製し、ポリヌクレオチドキナーゼまたはクレノーポリメラーゼを用いて中間の基質（「B」）を標識した。反応液を表記の通りに調製し、37℃で20分間インキュベートした後に、アガロースゲル電気泳動を用いて分画した。反応産物はまず臭化エチジウム、次にオートラジオグラフィーによって視覚化した。ポリメラーゼ＋単一のDNA基質のみを含む反応液では連結分子は形成されなかった（レーン1および4）。5'標識のみがポリメラーゼとのインキュベーションを切り抜け、二量体および三量体分子に組み込まれた（レーン3）。
【０１０１】
図8. ワクシニアウイルスDNAポリメラーゼを用いた、PCR増幅DNAのクローニング
約800bpのPCR増幅を行ったDNA断片（「A」）を、表記の通り、NotIで線状化したpDW101（「B」）およびワクシニアウイルスDNAポリメラーゼを伴ってまたは伴わずにインキュベートした。反応産物を電気泳動によって分離し、臭化エチジウムで視覚化した。連結分子はレーン6のみに観察された。これらの連結分子の大部分は線状二量体と予想される位置に移動したが（レーン6）、反応産物のごく一部は切れ目の入った環状分子に典型的な位置に移動した（矢印）。5μM dNTPの添加によって反応は完全に停止した（レーン7）。これらの反応産物を用いる大腸菌（E.coli）の形質転換の影響を表1にまとめた。
【０１０２】
図9. 連結分子の形成に対する相同性の長さの影響
pBluescriptベクター中のNotI部位に隣接して見出される配列と同一の、4、6、8…18bpの末端配列を含む、PCR増幅を行ったDNAを調製した。PCR増幅を行ったDNA＋NotIで切断したベクターの混合物を0.1μgのワクシニアDNAポリメラーゼおよび0.5μgのgpI3Lとともに10分間インキュベートした後に、アガロースゲル電気泳動によって分離した（パネルB、挿入図）。各反応における線状二重鎖（○）および環状連結分子の収率を濃度測定によって決定した（パネルB）。ポリメラーゼを加えない場合は連結分子が生じなかった（△）。反応産物（＋2つの他の実験で調製した連結分子）を細菌SURE細胞に形質転換し、組換え体の収量を表Iの通りに決定した（パネルA）。
【０１０３】
図10は、本発明の方法を用いて組換えDNA pRP406-SFVをクローニングするために組換え操作を行う、DNA地図を提供する。
【０１０４】
図11は、図10（0.8％アガロースゲル上に示す）に示した線状DNAのインビトロ組換えの結果を示している。連結反応の後に、1ulの反応液を形質転換に用いた。残りの溶液はタンパク質を除去して電気泳動を行った。
【０１０５】
本明細書に参照される参考文献の全引用
【図面の簡単な説明】
本発明の特徴は、添付の図面に関して言及した以下の説明によってさらに明らかになると考えられる：
【図１】 本発明の方法を用いた、2つの線状DNA分子の連結に関する概略図（パネルA）および実験結果（パネルBおよびC）を示す。
【図２】 本発明の方法を用いた、3つの線状DNA分子の連結に関する概略図（パネルA）および実験結果（パネルB）を示す。
【図３】 本発明の方法の、DNAカセットのコンビナトリアル融合への応用に関する概略図を示す。
【図４】 本発明の方法の、PCR産物のクローニングへの応用を示す概略図を示す。
【図５】 本発明のDNA連結法における、重複末端および非重複末端の相同性の影響を調査するアッセイ法に関する概略図および実験結果を示している。
【図６】 本発明の方法を用いた、連結分子形成に対するワクシニア一本鎖結合タンパク質の影響を示すグラフおよび実験結果（挿入図）である。
【図７】 本発明の方法を用いた3つの線状DNA分子の連結時における3つの線状DNA基質の連結、ならびに5'および3'末端標識の結果を示す概略図および実験結果を提供する。
【図８】 本発明の方法を用いた、PCR増幅DNAのクローニングに関する概略図および実験結果を提供する。
【図９】 本発明の方法における、連結分子形成に対する相同性の長さの影響をグラフとして示す。
【図１０】 本発明の方法を用いて、組換えDNA pRP406-SFVをクローニングするために組換え操作を行うDNAの地図を提供する。
【図１１】 図10に示した線状DNAのインビトロ組換えの結果を示す（0.8％アガロースゲル）。
【配列表】
Claims (17)
- 2つまたはそれ以上の線状DNA分子を連結する単一工程の方法であって、2つまたはそれ以上の線状DNA分子が連結される条件下で、DNAポリメラーゼの存在下において2つまたはそれ以上の線状DNA分子をインキュベートする段階
を含み、
ここで、各線状DNA分子は反対の極性をもつx鎖およびx'鎖を有し、1つの線状DNA分子のx'鎖の5'末端が、それに連結させようとする線状DNA分子のx鎖の5'末端に対して相補的なヌクレオチド配列を有し、
ここで、DNAポリメラーゼが内在性3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有し、DNA分子を連結する方法。 - 線状DNA分子を環状化する方法であって、
線状DNA分子の各末端上への相補的な核酸配列の組み入れの用意をするプライマーの存在下で、線状DNA分子のPCR増幅を行う段階；および
PCR増幅がなされた線状DNA分子を、線状DNA分子が環状化される条件下で、DNAポリメラーゼの存在下において単一工程でインキュベートする段階
を含み、
ここでDNAポリメラーゼが内在性3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有し、DNA分子を環状化する方法。 - 2つの線状DNA分子が
i) 線状化ベクターDNA分子；および
ii) 連結させようとする線状化ベクターDNA分子の末端に対して相補的な末端を有する、線状の挿入DNA分子
である、請求項1記載の方法。 - 線状の挿入DNA分子が、
i) 制限酵素消化による環状二本鎖DNA分子の線状化に続いて、末端に合成オリゴマーリンカーを接着させることにより得られるか；または
ii) すでに線状のDNA分子を制限酵素で二次的に消化した後に、アダプター／リンカーを末端に付加することにより得られるか；または
iii) 完全な二重鎖DNA分子を形成するために、2つの適切に設計された合成一本鎖DNAオリゴマーをアニーリングすることにより得られるか、または
iv) 以下を含む方法において、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて鋳型DNA分子を増幅することにより得られる、
- 第1および第2の末端を有する鋳型DNA分子を提供する段階；
- 線状化ベクターDNA分子の第1の末端に対して相補的なヌクレオチド配列の、鋳型DNA分子の第1の末端上への組み入れの用意をするヌクレオチド配列を含む5'末端、および鋳型DNA分子の第1の末端上の適した位置にハイブリダイズする3'末端を有する、第1のプライマーDNA分子を提供する段階；
- 線状化DNAベクター分子の第2の末端に対して相補的なヌクレオチド配列の、鋳型DNA分子の第2の末端上への組み入れの用意をするヌクレオチド配列を含む5'末端、および鋳型DNA分子の第2の末端上の適した位置にハイブリダイズする3'末端を有する、第2のプライマーDNA分子を提供する段階；および
- 第1および第2のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて鋳型DNA分子を増幅して、連結させようとする線状化ベクターDNA分子の末端に対して相補的な末端を有する挿入DNA分子を提供する段階、
請求項3記載の方法。 - DNAポリメラーゼが、ワクシニアウイルスDNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、および大腸菌（E.coli）DNAポリメラーゼIのクレノー断片からなる群より選択されるポリメラーゼを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- DNAポリメラーゼがワクシニアウイルスDNAポリメラーゼを含む、請求項5記載の方法。
- 2つまたはそれ以上の線状DNA分子をDNAポリメラーゼおよび一本鎖DNA結合タンパク質の存在下でインキュベートする、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 一本鎖DNA結合タンパク質がワクシニアウイルス一本鎖DNA結合タンパク質、大腸菌（E.coli）の一本鎖DNA結合タンパク質、単純ヘルペスウイルスICP8タンパク質、酵母複製プロテインA（yRPA）およびヒトの複製プロテインA（hRPA）から選択される、請求項7記載の方法。
- 一本鎖DNA結合タンパク質がワクシニア一本鎖DNA結合タンパク質である、請求項8記載の方法。
- 各線状DNA分子上の相補的ヌクレオチドの配列の長さが、5から100ヌクレオチドの間である、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
- 各線状DNA分子上の相補的ヌクレオチドの配列の長さが、8から50ヌクレオチドの間である、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
- 各線状DNA分子上の相補的ヌクレオチドの配列の長さが、10から35ヌクレオチドの間である、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
- 請求項1〜12のいずれか一項記載の方法による線状DNA分子の直接的なクローニングのためのキットであって、別々の容器にDNAポリメラーゼおよび反応緩衝液を含み、ここでDNAポリメラーゼが内在性3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有し、単一工程でDNA連結反応を行うことができるキット。
- 一本鎖DNA結合タンパク質をさらに含む、請求項13記載のキット。
- 一本鎖DNA結合タンパク質がワクシニアウイルス一本鎖DNA結合タンパク質、大腸菌（E.coli）の一本鎖DNA結合タンパク質、単純ヘルペスウイルスICP8タンパク質、酵母複製プロテインA（yRPA）およびヒトの複製プロテインA（hRPA）から選択される、請求項14記載のキット。
- 担体、および内在性3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有し、かつ線状DNA分子を単一工程で連結することができるDNAポリメラーゼを含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法によるDNA分子のクローニングのための組成物。
- DNA分子が5'突出部、3'突出部および／または平滑末端を有する、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
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