ES2716402T3 - ADN polimerasas quiméricas - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

ADN polimerasas quiméricas

Antecedentes de la invención

Las ADN polimerasas son enzimas que usan ADN monocatenario como molde para sintetizar la hebra de ADN complementaria. En particular, las ADN polimerasas pueden añadir nucleótidos libres al extremo 3' de una hebra recién formada, dando como resultado el alargamiento de la nueva hebra en sentido 5'-3'. Algunas ADN polimerasas pueden corregir errores en el ADN recién sintetizado. Este proceso es conocido como corrección de errores. Estas polimerasas pueden reconocer un nucleótido incorporado incorrectamente y la actividad exonucleasa 3'->5' de la enzima permite que se escinda el nucleótido incorrecto (esta actividad es conocida como corrección de errores ("proofreading")). Después de la escisión de bases, la polimerasa puede reinsertar la base correcta y la replicación puede continuar. Esta función de corrección de errores da a la replicación de ADN mucha mayor fidelidad de la que tendría si la síntesis fuera el resultado solo de una etapa de selección de emparejamiento de bases. Brutlag, D. y Kornberg, A., J. Biol. Chem., 247:241-248 (1972). Las ADN polimerasas con actividad exonucleasa de corrección de errores 3'-5' tienen una tasa de error sustancialmente menor en comparación con una polimerasa que posee exonucleasa sin corrección de errores. Chang, L. M. S., J. Biol. Chem., 252:1873-1880 (1977). Sin embargo, a veces, la ventaja de estas polimerasas se compensa por su procesividad relativamente baja que reduce el rendimiento de los productos de amplificación de ADN.

El documento US 2002/119461 divulga la construcción de determinadas ADN polimerasas, incluyendo una "polimerasa Taq híbrida donde el dominio exonucleasa 3'-5' inactivo de polimerasa Taq se reemplazó por un dominio exonucleasa 3'-5' activo de otra ADN polimerasa termoestable" (véase [0016] del documento US2002/119471). El documento WO 01/61015 divulga polimerasas de ácido nucleico quiméricas "obtenidas combinando al menos dos dominios enzimáticamente activos de diferentes proteínas por medio de técnicas de ADN recombinante" (véase el primer párrafo del Sumario de la invención del documento WO 01/61015). El documento WO 2005/113760 divulga determinadas ADN polimerasas quiméricas obtenidas por intercambio de dominio de polimerasas Dpo4 de familia Y novedosas de Acidianus infernus Dpo4, Stygiolobu azoricus, Sulfurisphaera ohwakuensis, Sulfolobus shibatae y Sulfolobus tengchongensis (véase la sección V., titulada "Cloning Novel Y-family Polymerases"). DATABASE Geneseq [en línea] 19 November 1998 (1998-11-19), "Heatresistant Pfu DNA synthetase I", recuperado de EBI con n.° de acceso GSP:AAW77017 base de datos con n.° de acceso AAW77017; y documento WO 98/33900 muestra la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa Pfu. DATABASE Geneseq [en línea] 23 de febrero de 2006 (2006-02-23), "DNA polymerase SEQ ID NO:5.", recuperado de EBI con n.° de acceso GSP:AEE871 02 base de datos con n.° de acceso AEE871 02; y documento WO 2005/118866 muestra la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa KOD.

Sumario de la invención

La presente invención engloba el descubrimiento de que el intercambio de dominio puede combinar características funcionales deseadas (por ejemplo, alta procesividad, alta tasa de alargamiento, termoestabilidad, resistencia a la sal, aditivos de POR (por ejemplo, potenciadores de POR) y otras impurezas, y alta fidelidad) de diferentes ADN polimerasas en una enzima quimérica. Por tanto, la presente invención proporciona, entre otras cosas, ADN polimerasas resistentes, rápidas y exactas para amplificación, síntesis detección, secuenciación de ADN y otras técnicas de ADN recombinante importantes.

En un aspecto, la presente invención proporciona una polimerasa quimérica como se define en las reivindicaciones adjuntas a la misma. Como se usa en el presente documento, el término "alta procesividad" se refiere a una procesividad mayor de 20 nts (por ejemplo, mayor de 40 nts, 60 nts, 80 nts, 100 nts, 120 nts, 140 nts, 160 nts, 180 nts, 200 nts, 220 nts, 240 nts, 260 nts, 280 nts, 300 nts, 320 nts, 340 nts, 360 nts, 380 nts, 400 nts, o mayor) por asociación/disociación con el molde. Como se usa en el presente documento, el término "alta tasa de alargamiento" se refiere a una tasa de alargamiento mayor de 25 nt/s (por ejemplo, mayor de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140 nt/s). Como se usa en el presente documento, el término "alta resistencia a la sal" se refiere a la capacidad de una ADN polimerasa para mantener sustancialmente su actividad enzimática a una concentración de sal mayor de 30 mM (por ejemplo, mayor de 35 mM, 40 mM, 45 mM o 50 mM). Como se usa en el presente documento, el término "alta fidelidad" se refiere a una tasa de error menor de 4,45 X 10'® (por ejemplo, menor de 4,0 X 10 ® 3,5 X 10 ®, 3,0 X 10 ®, 2,5 X 10 ®, 2,0 X 10 ®, 1,5 X 10 ®, 1,0 X 10 ®, 0,5 X 10 ®) mutaciones/nt/duplicación. Como se usa en el presente documento, el término "alta tolerancia a TMAC" se refiere a la capacidad de una ADN polimerasa para mantener sustancialmente su actividad enzimática aúna concentración de TMAC (cloruro de tetrametilamonio) mayor de 10 mM (por ejemplo, mayor de 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM). Como se usa en el presente documento, el término "alta termoestabilidad" se refiere a la capacidad de una ADN polimerasa para mantener sustancialmente su actividad enzimática después de una incubación de más de 30 minutos a 98 °C (por ejemplo, 45 min, 60 min, 90 min, 180 min, 210 min, 240 min). Los términos de "procesividad", "tasa de alargamiento", "fidelidad", "resistencia a la sal", "tolerancia a TMAC" y "termoestabilidad" se definen además en la sección Definiciones.

En el presente documento se describen ADN polimerasas que incluyen polimerasa KOD, polimerasa TNA1, Thermococcus sp. 9 grados N-7, T4, T7 o ph¡29. Otras ADN polimerasas descritas en el presente documento incluyen polimerasas aisladas de Pyrococcus furiosus, P. abyssi, T. gorgonarius, T. litoralis, T. zilligii, T. sp. GT, o P. sp. GB-D.

Los dominios de ADN polimerasa incluyen dominios exonucleasa, dominios N terminales, dominios pulgar y dominios palma y/o dedos.

También se describen en el presente documento secuencias de aminoácidos encontradas en una primera ADN polimerasa correspondientes a los residuos aminoacídicos 26 a 105 de polimerasa KOD (SEQ ID NO:11), residuos aminoacídicos 156 a 301 de polimerasa KOD (SEQ ID NO:11), y/o residuos aminoacídicos 612 a 749 de polimerasa KOD (SEQ ID NO: 11).

También se describen en el presente documento secuencias de aminoácidos encontradas en una segunda ADN polimerasa correspondientes a los residuos aminoacídicos 394 a 563 de polimerasa Pfu (SEQ ID NO:9).

También se describen en el presente documento polimerasas quiméricas que incluyen un primer dominio que tiene una secuencia consenso seleccionada del grupo que consiste en XXl.XXXXXXXItGXRXXXXXXVXXXXXDXXXTXXXXXXXXXXVVKXXXXXVUX XXXXNXXXAXXKXXCXXXXXNFALXXXXXXXXXXXXIXXMXXRFXXXXXXXXX X X X X P X X R X X X X XXXXXXXXXXXXVXXQXXXXXXXEXXTTXXXT (SEQ |D NO 30) en la que X es cualquier aminoácido o un enlace peptídico;

XX CX XXX Y x x x x n x x r x x X X EX x x a x XXXXXXXAXXXXT V XT V K R X XXX Q XXX XXRXVEXXXXXFTXXXXXXAXXDX1XXXXX (SEQ |D N0;31). en la que x es cualquier aminoácido o un enlace peptídico;

XXXXXXXXXXXXXXXXAI.XXDXXXXKXXXXXXXXTF.XXSKXXVXXXXXVXIIX XXXXDXKDXXXTXXXXXXXXRXXXRXXXXRXXTXXSXXXXFCXSXRXGDXXXPF D X FXX T XXXXXXXXXX XXXXXXXXE XX X RAXX (SEQ ID NO:32), en la que X es cualquier aminoácido o un enlace peptídico;

NGXiFKIEX2DRrKX5PYX4YAI.I.X5DDSX6lh:EVKKHX7ERHGXíiX1jVXioXiiXi2Xi3VKK VXMKKR,GXi5PXir,Xi7V\VKI.YXisXi9llPQnVPX2rjIRX2iKX22RnilPA (SEQ ,D N033) en ,a que Xi no es K; X2 no es H; X3 no es R; X4 no es I; X5 no es R; X@ no es K; X7 no es G; Xs no es K; Xg no es I; X 10 no es R; Xn no es I; X12 no es V; X 13 no es D; X-m no es E; X 15 no es K; X16 no es I; X17 no es T; X-is no es L; X-ig no es E; X20 no es T; X21 no es E; y X22 no es V;

PIXiMlSYAÍ)i;X2X2iAX4VIT\VKNX5l)I.PYVX6VVSX7ERnMIKRI'I.RXRX9XioEKI)mXii X i2Xi3TYTS*GDXhFDFXi5YLXioKRXi7EKLGTXi»Xi9X2oX2iGRDGSEPKX22QRX2‘GDX¿4 X¿5A\7EV7KGRIHFDLYX2<5VTX27RTINLPTYTLEA\rYEAX¿8FGX2<>PKEKVrYAX3í.EIXMX.;

A \ \ E X 1' (gEQ |q NO:34), en la que X 1 no es I; X2 no es N; X3 no es E; X4 no es K; X5 no es I; X@ no es E; X7 no es S; Xs no es I; Xg no es I; X10 no es R; Xn no es I; X12 no es I; X13 no es V; ^{X - m} no es S; X15 no es P; X 16 no es A; X17 no es A; X-is no es K; X-ig no es L; X20 no es T; X21 no es I; X22 no es M; X23 no es I; X24 no es M; X25 no es T; X26 no es H; X27 no es T; X28 no es I; X2g no es K; X30 no es D; X31 no es A; X32 no es K; y X33 no es S; RDWSEIAKETQARVLEXiX>LKX>GDVEX4AVRIVKEVX^Xr,KLX7XxYEXvPPEKLXK.IX iiEQlTRXnLXnXHYKAXisGPllVAVAICXK.LA.AXi7GVKiXisPGXi9VlX2r)YlVLX2iGX22 GX^IX^X«RAIX7r;X;7X;*EX^DPXxr,KHKYDAEYYIENQVLPAVXtiRILXwXwFG (SEG ID NO:35), en la que Xi no es T; X2 no es I; X3 no es H; X4 no es E; X5 no es I; X@ no es Q; X7 no es A; Xs no es N Xg no es I; X10 no es A; Xn no es Y; X12 no es P; X13 no es H; X14 no es E; X15 no es I; Xie no es K; X17 no es K X18 no es K; X19 no es M; X20 no es G; X21 no es R; X22 no es D; X23 no es P; X24 no es S; X25 no es N; X26 no es L X27 no es A; X28 no es E; X29 no es Y; X30 no es K; X31 no es L; X32 no es E; y X33 no es G;

y combinaciones de las mismas;

y un segundo dominio que tiene una secuencia consenso seleccionada del grupo que consiste en XKXXXXXXXXXXXXAXXXXXXXXXXXXXXXXXLXXXXNXXIXXXXXXKXXXXI XXXXXXXXXHXXXXXXXXXTXXXEXQXXXXKIXXXXXXKXXXLXXXXFXXXXX XXKXXXXXXXXXXXXXXXXXKXXELV WXXLXXXFXXXXLX1XXXXLY XXXXXG ESXELX ^{X X} XI ..X ^{(5 e q iq n o :36), en la que X es cualquier aminoácido o un enlace peptídico;}

E X iG L W E K íW L D F R X ¿ L Y P S IIT T H N V S P D T L N X . iE G C K X 4Y T )X íA P Q V G H X o F C K D X -P G F IP S L L G X sL L E E R Q K IK X í K M K X ioT X 11D P IE X i > X i « L L D Y R Q X i iA I K X i « L A K S X i« Y G

Y Y G Y A X i? A R W Y C K h C A E S V T A W G R X u {Y IX i!> X M X 2 iX 22 K H X 23 H b K X 24 G K K V X 25 Y X 26 D I L)CjX j -X¿ sA 111 G X K lX 3a X 3 iC X 33X 3. tK K K A X .M E (SEQ ID NO:37), en la que X1 no es R; X2 no es S; X3 no es R; X4 no es E; X5 no es V; X@ no es R; X7 no es F; Xs no es D; Xg no es K; X10 no es A; Xn no es I; X12 no es R; X13 no es K; X14 no es R; X15 no es I; Xie no es Y; X17 no es R; Xis no es E; X 19 no es T; X20 no es M; X21 no es T; X22 no es I; X23 no es I; X24 no es Y; X25 no es I; X26 no es S; X27 no es F; X28 no es F; X29 no es A; X30 no es D; X31 no es A; X32 no es T; X33 no es V; X34 no es M,

y combinaciones de las mismas,

en las que la polimerasa quimérica se caracteriza con alta fidelidad y alta procesividad, tasa de alargamiento, resistencia a la sal, tolerancia a TMAC u otros potenciadores de PCR o termoestabilidad.

También se describen en el presente documento polimerasas quiméricas definidas por la secuencia consenso XXXXTXXXXXD XXXXXXIXXXXXXEXXXXYXXXXEXXFXXXXKXXXAXXXXXX XXAXXXXTVXTVKRXXXXQXXXXXRXVEXXXXXFTXXXXXXAXXDXIXXXXXXI XXYXXXXXXXXXXXXXXXXVXXXXDXXXXM XXXXXXXXXXXXXXXAEXXXLX XXXXXXEGXRXXXXXXVXXXXXDXXXTXXXXXXXXXXVVKXXXXXVLIXXXXX NXXXAXX KXXCXXXXXN FALXXXXXXXXXXIXXM XXRFXXXXXXXXXXXXXPX XRXXXXXXXXXXXXXXXXVXXQXXXXXXXEXXTTXXXTXXXXXXXXRXXXXX XXV XXXXXXXXXXXXAXXXXXVXXPXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXV XXXXXSXEXYQXXXXEXXTXXFXXXXXKXXXXXXXXXXXXAXXXXXXXXXXXX

XXXKIXXXXXXKXXXI.XXXXIXXXXXXXKXXXXXXXXXXXXXXXXXKXXELVW XX L XXX F XXXX L XIXXXX L Y XXXXXG E SX EIXXXX L XX L XXXXAXXXX AXXXXX XXXXXXXXXXXXXKXXXXXXXXXITXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXA LX XDXXXXKXXXXXXXXTEXXSKXXVXXXXXVXHXXXXXDXKDXXX I'XXXXXXX XRXXXRXXXXRXXTXXSXXXXKXSXRXGDXXXPFDXFXXTXXXXXXXXXXXXX XXXXXEXXXRAXXXXXXXXXXXXXXXXXXSAXXKPXGT _{(SEQ ID NO:38),}

en la que X es cualquier aminoácido o un enlace peptídico, y en la que la polimerasa quimérica tiene una fidelidad mayor que la de KOD y una procesividad, una tasa de alargamiento, una resistencia a la sal, una tolerancia a TMAC u otros potenciadores de PCR o una termoestabilidad mayor que la de Pfu.

También se describen en el presente documento polimerasas quiméricas definidas por la secuencia consenso XJ XDT D Y XTXDG XP XXR1F XKXXG E F XXX Y D XXF E P Y E Y AL L KJ3 D S A1XXXXXXXA XR1J G T VXT V KRX XXXQX KF LXRX VE V WXLX FTI IPQDVP.AXXDXIXX11XXVID1 YE YDIPFAKRYLIDXGLVPMEGDEXLXMXXXDIETXYHEGXEFAEGXXLM1SYADXEG ARVITWKXVDLPYVDVVSTEXEMIKRXXXVVKEKDPDVLIXYXGDKFDXAYLKXR CEXLGXNKALXRXXXXXEPKIXXVIGXRFAVEXKGRXHEDLXPXXRX l'XNLP l'YXL XXVYEXVXGQXKXKXXXEE1TTXWETXXXXXXXARYSMEDAXVTXELGXEFXPM EAXLXXLVGXPXUT)VXRSST GNLVE WXLLXXAYXRNE VAPNKPSXEEY QXRXXE XYTGXFVXF-PEKGl.WXXXXXI.nXXAl.YPSlIXXHNVSPDTI.Xl.F.XCXNYDIAPXVG XKJFCKDIPGFIPSXLXHLXXXRQXXKTXMXEXQDPXEK.IXLDYRQKAXKLLXNSFY GYXGYXKARWYXXECAESVTXWGRKYIELVWXELEXXFGFKXLYIDIDGLYATIP GGESXEIKXXXLXFLXYINAXLPGALELEYEXFYXRGFFVXKKKYAXIDEEXXITTR GLEXVRRDWSXXAKETXAXVLEAI.I.XDXXVXKAVXXVXXXTEXXSKYXVPXEKT. V1HEQITRDXKDYXATGPHVAXAKRLXXRGXXXRPGTX1SYXXLKGSGRXGDRX1PF DEFXXTKHXYDXXYYIENQVLPAVERXLRAFGYXXXXLXXQXXXQXGLSAWXKP

y p T

1 (SEQ ID NO:39), en la que X es cualquier aminoácido o un enlace peptídico.

También se describen en el presente documento polimerasas quiméricas que contienen un primer dominio que tiene una secuencia al menos un 80 % (por ejemplo, al menos un 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %) idéntica a una secuencia de aminoácidos encontrada en un dominio exonucleasa, un dominio N terminal y/o un dominio pulgar de una primera ADN polimerasa; y un segundo dominio que tiene una secuencia al menos un 80 % (por ejemplo, al menos un 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %) idéntica a una secuencia de aminoácidos encontrada en un dominio palma y/o dedos de una segunda ADN polimerasa. En algunos modos de realización, la polimerasa quimérica se caracteriza con una mayor fidelidad que la polimerasa KOD y mayor procesividad, tasa de alargamiento, resistencia a la sal, termoestabilidad o tolerancia a TMAC que la polimerasa Pfu.

También se describen en el presente documento procedimientos de genomanipulación de polimerasas quiméricas. Dichos procedimientos pueden incluir las etapas de: (a) proporcionar un dominio N terminal, un dominio exonucleasa y/o un dominio pulgar basado en una primera ADN polimerasa; (b) proporcionar un dominio palma y/o dedos basado en una segunda ADN polimerasa; (c) combinar los dominios de la etapa (a) y la etapa (b) para formar una polimerasa quimérica; en los que la polimerasa quimérica tiene una fidelidad mayor que la de la primera ADN polimerasa y una procesividad, una tasa de alargamiento, una resistencia a la sal, una tolerancia a TMAC u otros potenciadores de PCR o una termoestabilidad mayor que la de la segunda ADN polimerasa. En algunos modos de realización, la polimerasa quimérica se caracteriza con una mayor fidelidad que la polimerasa KOD y mayor procesividad, tasa de alargamiento, resistencia a la sal, termoestabilidad o tolerancia a TMAC que la polimerasa Pfu.

En el presente documento se describen ADN polimerasas que incluyen polimerasa KOD, polimerasa TNA1, Thermococcus sp. 9 grados N-7, T4, T7 y ph¡29. Otras ADN polimerasas divulgadas en el presente documento incluyen polimerasas aisladas de Pyrococcus furiosus, P. abyssi, T. gorgonarius, T. litoralis, T. zilligii, T. sp. GT, o P. sp. GB-D.

Como se describe en el presente documento, la primera ADN polimerasa puede ser la polimerasa KOD y la segunda ADN polimerasa puede ser la polimerasa Pfu. En algunos modos de realización, la primera ADN polimerasa es la polimerasa Pfu y la segunda ADN polimerasa es la polimerasa KOD.

También se describen en el presente documento procedimientos de mejora de la fidelidad de una ADN polimerasa. Dichos procedimientos pueden incluir una etapa de reemplazar una secuencia dentro del dominio palma y/o dedos de la ADN polimerasa de interés con una secuencia correspondiente de una ADN polimerasa diferente que se caracteriza con mayor fidelidad con relación a la ADN polimerasa de interés.

También se describen en el presente documento procedimientos de mejora de la procesividad, tasa de alargamiento, resistencia a la sal, tolerancia a TMAC u otros potenciadores de PCR o termoestabilidad de una ADN polimerasa. Dichos procedimientos pueden incluir una etapa de reemplazo de una secuencia dentro del dominio N terminal, el dominio exonucleasa y/o el dominio pulgar de la ADN polimerasa de interés con una secuencia correspondiente de una ADN polimerasa diferente que se caracteriza con mayor procesividad, tasa de alargamiento, resistencia a la sal, tolerancia a TMAC u otros potenciadores de PCR o termoestabilidad con relación a la ADN polimerasa de interés.

Por tanto, se describen en el presente documento diversas polimerasas quiméricas que incluyen polimerasas quiméricas genomanipuladas y/o mejoradas usando procedimientos como se describe en el presente documento. Las polimerasas quiméricas como se describe en el presente documento pueden contener una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % idéntica a SEQ ID NO:16 (la secuencia de aminoácidos de Kofu como se muestra en la sección Secuencias). Otras polimerasas quiméricas descritas en el presente documento contienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. Aún otras polimerasas quiméricas descritas en el presente documento contienen una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % idéntica a SEQ ID NO: 15 (la secuencia de aminoácidos de Pod como se muestra en la sección Secuencias). Aún otras polimerasas quiméricas descritas en el presente documento contienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.

La presente invención también proporciona kits y composiciones que contienen diversas polimerasas quiméricas descritas en el presente documento y usos de las mismas (por ejemplo, procedimientos de amplificación de fragmentos de ADN usando las ADN polimerasas quiméricas de la invención). Además, la presente invención proporciona secuencias de nucleótidos que codifican diversas polimerasas quiméricas descritas en el presente documento y vectores y/o células que contienen las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención.

Breve descripción de los dibujos

Los dibujos son solo para propósitos de ilustración, no para limitación.

La figura 1 representa una alineación de dominios en ADN polimerasas de tipo B naturales ejemplares y ADN polimerasas quiméricas ejemplares, Kofu y Pod. Los dominios de las polimerasas KOD y Pfu que se intercambiaron en las quimeras Kofu y Pod se indican por encima de la alineación.

La figura 2 representa que una polimerasa Pod quimérica ejemplar contiene el dominio N terminal, el dominio exonucleasa 3'-5' y el dominio pulgar de Pfu y el dominio palma y dedos de KOD y la polimerasa quimérica Kofu recíproca contiene el dominio N terminal, el dominio exonucleasa 3'-5' y el dominio pulgar de KOD y el dominio palma y dedos de Pfu.

La figura 3 representa resultados ejemplares que muestran la termoestabilidad de KOD, Pfu, Kofu y Pod.

La figura 4 representa resultados ejemplares que muestran la resistencia a la sal de KOD, Pfu, Kofu y Pod.

La figura 5 representa resultados ejemplares que muestran la tolerancia a TMAC de KOD, Pfu, Kofu y Pod.

Definiciones

Aminoácido'. Como se usa en el presente documento, el término "aminoácido," en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que se puede incorporar en una cadena polipeptídica. En algunos modos de realización, un aminoácido tiene la estructura general H2N-C(H)(R)-COOH. En algunos modos de realización, un aminoácido es un aminoácido natural. En algunos modos de realización, el aminoácido es un aminoácido sintético; en algunos modos de realización, un aminoácido es un D-aminoácido; en algunos modos de realización, un aminoácido es un L-aminoácido. "Aminoácido estándar" se refiere a cualquiera de los veinte L-aminoácidos estándar encontrados comúnmente en péptidos naturales. "Aminoácido no estándar" se refiere a cualquier aminoácido, distinto de los aminoácidos estándar, independientemente de si se prepara sintéticamente o se obtiene de una fuente natural. Como se usa en el presente documento, "aminoácido sintético" engloba aminoácido modificados químicamente, incluyendo pero sin limitarse a sales, derivados de aminoácidos (tales como amidas) y/o sustituciones. Los aminoácidos, incluyendo aminoácidos carboxi y/o aminoterminales en péptidos, se pueden modificar por metilación, amidación, acetilación y/o sustitución con otros grupos químicos. Los aminoácidos pueden participar en un enlace disulfuro. El término "aminoácido" se usa de manera intercambiable con "residuo aminoacídico" y se puede referir a un aminoácido libre y/o a un residuo aminoacídico de un péptido. Será evidente a partir del contexto en el que se usa el término si se refiere a un aminoácido libre o un residuo de un péptido. Cabe destacar que todas las secuencias de aminoácidos se representan en el presente documento por fórmulas con una orientación izquierda y derecha que está en el sentido convencional del extremo aminoterminal al carboxiterminal.

Par de bases (pb)\ Como se usa en el presente documento, par de bases se refiere a una asociación de adenina (A) con timina (T), o de citosina (C) con guanina (G) en una molécula de ADN bicatenario.

Polimerasa quimérica'. Como se usa en el presente documento, el término "polimerasa quimérica" (también denominada "quimera") se refiere a cualquier polimerasa que contiene dos o más dominios heterólogos, secuencias de aminoácidos, péptidos y/o proteínas unidos de forma covalente o bien no covalente para producir una polimerasa que no se produzca en la naturaleza. Típicamente, una polimerasa quimérica contiene un primer dominio unido a un segundo dominio, en el que el primer y segundo dominios no se encuentran en la misma relación en la naturaleza. Típicamente, el primer dominio se deriva de una primera ADN polimerasa y un segundo dominio se deriva de una segunda ADN polimerasa. Típicamente, la primera y segunda ADN polimerasas se caracterizan con al menos una característica funcional distinta (por ejemplo, procesividad, tasa de alargamiento, fidelidad, tolerancia a la sal, tolerancia a aditivos de PCR o termoestabilidad). Como se usa en el presente documento, una secuencia derivada de una ADN polimerasa de interés se refiere a cualquier secuencia encontrada en la ADN polimerasa de interés, o cualquier secuencia que es al menos un 70 % (por ejemplo, al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %) idéntica a una secuencia de aminoácidos encontrada en la ADN polimerasa de interés. Una "polimerasa quimérica" de acuerdo con la invención puede contener dos o más secuencias de aminoácidos de polimerasas relacionadas o similares (por ejemplo, proteínas que comparten secuencias y/o estructuras similares), unidas para formar una nueva proteína funcional. Una "polimerasa quimérica" de acuerdo con la invención puede contener dos o más secuencias de aminoácidos de polimerasas no relacionadas, unidas para formar una nueva proteína funcional. Por ejemplo, una polimerasa quimérica de la invención puede ser una fusión "entre especies" o "intergénica" de estructuras de proteína expresada por diferentes tipos de organismos.

Complementario'. Como se usa en el presente documento, el término "complementario" se refiere al concepto amplio de complementariedad de secuencia entre regiones de dos hebras polinucleotídicas o entre dos nucleótidos a través de emparejamiento de bases. Es conocido que un nucleótido adenina puede formar enlaces de hidrógeno específicos ("emparejamiento de bases") con un nucleótido que sea timina o uracilo. De forma similar, es conocido que un nucleótido citosina puede realizar emparejamiento de bases con un nucleótido guanina.

Afinidad de unión a ADN'. Como se usa en el presente documento, el término "afinidad de unión a ADN" típicamente se refiere a la actividad de una ADN polimerasa en la unión al ácido nucleico ADN. En algunos modos de realización, la actividad de unión a ADN se puede medir en un ensayo de desplazamiento de dos bandas. Por ejemplo, en algunos modos de realización (basados en el ensayo de Guagliardi et al. (1997) J. Mol. Biol. 267:841-848), se marca ácido nucleico bicatenario (el fragmento HindIII-EcoRV de 452 pb del gen lacS de S. solfataricus) con 32P a una actividad específica de al menos aproximadamente 2,5 X 107 cpm/pg (o al menos aproximadamente 4000 cpm/fmol) usando procedimientos estándar. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3.a ed., Coid Spring Harbor Laboratory Press, NY) en 9.63-9.75 (que describe el mareaje terminal de ácidos nucleicos). Se prepara una mezcla de reacción que contiene al menos aproximadamente 0,5 pg del polipéptido en aproximadamente 10 pl detampón de unión (tampón fosfato de sodio 50 mM (pH 8,0), glicerol al 10 %, KCI 25 mM, MgCI225 mM). Se calienta la mezcla de reacción hasta 37 °C durante 10 min. Se añaden de aproximadamente 1 X 104 a 5 X 104 cpm (o aproximadamente 0,5-2 ng) del ácido nucleico bicatenario marcado a la mezcla de reacción y se incuba durante 10 min adicionales. Se carga la mezcla de reacción en un gel de poliacrilamida natural en tampón Tris-borato 0,5 X. Se somete la mezcla de reacción a electroforesis a temperatura ambiente. Se seca el gel y se somete a autorradiografía usando procedimientos estándar. Cualquier disminución detectable en la movilidad del ácido nucleico bicatenario marcado indica la formación de un complejo de unión entre el polipéptido y el ácido nucleico bicatenario. Dicha actividad de unión a ácido nucleico se puede cuantificar usando procedimientos densitométricos estándar para medir la cantidad de radioactividad en el complejo de unión con relación a la cantidad total de radioactividad en la mezcla de reacción inicial. Otros procedimientos de medición de la afinidad de unión a ADN son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Kong et al. (1993) J. Biol. Chem.

268(3): 1965-1975).

Dominio'. Como se usa en el presente documento, el término "dominio" como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de aminoácidos de un polipéptido (por ejemplo, polimerasa) que comprende una o más funciones o propiedades definidas.

Tasa de alargamiento'. Como se usa en el presente documento, el término "tasa de alargamiento" se refiere al promedio de la velocidad a la que una ADN polimerasa extiende una cadena polimérica. Como se usa en el presente documento, una alta tasa de alargamiento se refiere a una tasa de alargamiento mayor de 25 nt/s (por ejemplo, mayor de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140 nt/s).

Actividad enzimática'. Como se usa en el presente documento, el término "actividad enzimática" se refiere a la especificidad y eficacia de una ADN polimerasa. La actividad enzimática de una ADN polimerasa también se denomina "actividad polimerasa", lo que se refiere típicamente a la actividad de una ADN polimerasa al catalizar la síntesis dirigida a molde de un polinucleótido. La actividad enzimática de una polimerasa se puede medir usando diversas técnicas y procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden preparar diluciones en serie de polimerasa en tampón de dilución (por ejemplo, Tris.CI 20 mM, pH 8,0, KCI 50 mM, NP 40 al 0,5 % y Tween-20 al 0,5 %). Para cada dilución, se pueden retirar 5 pl y añadirse a 45 pl de una mezcla de reacción que contiene TAPS 25 mM (pH 9,25), KCI 50 mM, MgCI22 mM, dATP 0,2 mM, dGTP 0,2 mM, dTTP 0,2 mM, dCTP 0,1 mM, 12,5 pg de ADN activado, [a-32P]dCTP 100 pM (0,05 pCi/nmol) y agua desionizada estéril. Las mezclas de reacción se pueden incubar a 37 °C (o 74 °C para ADN polimerasas termoestables) durante 10 minutos y a continuación detener por enfriamiento inmediato de la reacción a 4 °C y añadir 10 pl de EDTA 60 mM helado. Se puede retirar una alícuota de 25 pl de cada mezcla de reacción. Se puede retirar dCTP marcado radioactivamente no incorporado de cada alícuota por filtración en gel (Centri-Sep, Princeton Separations, Adelphia, N.J.). El eluido de columna se puede mezclar con líquido de centelleo (1 mi). Se cuantifica la radioactividad en el eluido de columna con un contador de centelleo para determinar la cantidad de producto sintetizado por la polimerasa. Una unidad de actividad polimerasa se puede definir como la cantidad de polimerasa necesaria para sintetizar 10 nmol de producto en 30 minutos (Lawyer et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:6427-647). Otros procedimientos de medición de la actividad polimerasa son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3.a ed., Coid Spring Harbor Laboratory Press, NY)).

Fidelidad'. Como se usa en el presente documento, el término "fidelidad" se refiere a la exactitud de la polimerización de ADN por la ADN polimerasa dependiente de molde. La fidelidad de una ADN polimerasa se mide típicamente por la tasa de error (la frecuencia de incorporar un nucleótido inexacto, es decir, un nucleótido que no es complementario al nucleótido del molde). La exactitud o fidelidad de la polimerización de ADN se mantiene tanto para la actividad polimerasa como para la actividad 3'-5' exonucleasa de una ADN polimerasa. El término "alta fidelidad" se refiere a una tasa de error menor de 4,45 X 10'® (por ejemplo, menor de 4,0 X 10 ® 3,5 X 10 ®, 3,0 X 10 ®, 2,5 X 10 ®, 2,0 X 10 ®, 1,5 X 10 ®, 1,0 X 10 ®, 0,5 X 10 ®) mutaciones/nt/duplicación. La fidelidad o tasa de error de una ADN polimerasa se puede medir usando ensayos conocidos para la técnica. Por ejemplo, las tasas de error de las ADN polimerasas se pueden someter a prueba usando el ensayo de fidelidad de PCR con lacl descrito en Cline, J. et al. (1996) NAR 24: 3546-3551. En resumen, se amplifica un fragmento de 1,9 kb que codifica el gen diana laclOlacZa a partir de ADN plasmídico de pPRIAZ usando 2,5 U de ADN polimerasa (es decir, cantidad de enzima necesaria para incorporar 25 nmoles de dNTP totales en 30 min a 72 °C) en el tampón de PCR apropiado. A continuación se clonan los productos de PCR que contienen lacl en brazos GT10 lambda, y se determina el porcentaje de mutantes lacl (MF, frecuencia de mutación) en un ensayo de cribado por color, como se describe (Lundberg, K. S., Shoemaker, D. D., Adams, M. W. W., Short, J. M., Sorge, J. A. y Mathur, E. J. (1991) Gene 180: 1-8). Las tasas de error se expresan como frecuencia de mutación por pb por duplicación (MF/pb/d), donde pb es el número de sitios detectables en la secuencia génica lacl (349) y d es el número de duplicaciones de diana eficaces. Similar a lo anterior, se puede usar cualquier plásmido que contiene el gen diana laclOlacZa como molde para la PCR. El producto de PCR se puede clonar en un vector diferente de lambda GT (por ejemplo, plásmido) que permita el cribado por color azul/blanco.

Unido'. Como se usa en el presente documento, "unido" se refiere a cualquier procedimiento conocido en la técnica para conectar funcionalmente dominios de polipéptidos, incluyendo sin limitación fusión recombinante con o sin dominios intermedios, fusión intermedia, asociación no covalente, y enlace covalente, incluyendo enlace disulfuro, enlace de hidrógeno, enlace electrostático y enlace conformacional.

Nucleótido'. Como se usa en el presente documento, una unidad monomérica de ADN o ARN que consiste en un resto glucídico (pentosa), un fosfato y una base heterocíclica nitrogenada. La base se une al resto glucídico por el carbono glucosídico (carbono 1' de la pentosa) y esa combinación de base y glúcido es un nucleósido. Cuando el nucleósido contiene un grupo fosfato unido a la posición 3' o 5' de la pentosa se denomina nucleótido. Una secuencia de nucleótidos unidos de forma funcional se denomina típicamente en el presente documento "secuencia de bases" o "secuencia de nucleótidos," y se representa en el presente documento por una fórmula con una orientación de izquierda a derecha que está en el sentido convencional del extremo 5' al extremo 3'.

Oligonucleótido o polinucleótido'. Como se usa en el presente documento, el término "oligonucleótido" se define como una molécula que incluye dos o más desoxirribonucleótidos y/o ribonucleótidos, preferentemente más de tres. Su tamaño exacto dependerá de muchos factores, que a su vez dependen de la función definitiva o el uso del oligonucleótido. El oligonucleótido se puede derivar sintéticamente o por clonación. Como se usa en el presente documento, el término "polinucleótido" se refiere a una molécula de polímero compuesta de monómeros nucleotídicos unidos de forma covalente en una cadena. ADN (ácido desoxirribonucleico) y ARN (ácido ribonucleico) son ejemplos de polinucleótidos.

Polimerasa'. Como se usa en el presente documento, una "polimerasa" se refiere a una enzima que cataliza la polimerización de nucleótido (es decir, la actividad polimerasa). En general, la enzima iniciará la síntesis en el extremo 3' del cebador hibridado a una secuencia molde de polinucleótido, y avanzará hacia el extremo 5' de la hebra molde. Una "ADN polimerasa" cataliza la polimerización de desoxinucleótidos.

Procesividad'. Como se usa en el presente documento, "procesividad" se refiere a la capacidad de una polimerasa para mantenerse unida al molde y realizar múltiples reacciones de modificación. Las "reacciones de modificación" incluyen pero no se limitan a polimerización y escisión exonucleolítica. En algunos modos de realización, "procesividad" se refiere a la capacidad de una ADN polimerasa para realizar una secuencia de etapas de polimerización sin disociación intermedia de la enzima de las cadenas de ADN crecientes. Típicamente, la "procesividad" de una ADN polimerasa se mide por la longitud de nucleótidos (por ejemplo 20 nts, 300 nts, 0,5-1 kb, o más) que se polimerizan o se modifican sin disociación intermedia de la ADN polimerasa de la cadena de ADN creciente. La "procesividad" puede depender de la naturaleza de la polimerasa, la secuencia de un molde de ADN, y condiciones de reacción, por ejemplo, concentración de sal, temperatura o presencia de proteínas específicas. Como se usa en el presente documento, el término "alta procesividad" se refiere a una procesividad mayor de 20 nts (por ejemplo, mayor de 40 nts, 60 nts, 80 nts, 100 nts, 120 nts, 140 nts, 160 nts, 180 nts, 200 nts, 220 nts, 240 nts, 260 nts,280 nts, 300 nts, 320 nts, 340 nts, 360 nts, 380 nts, 400 nts, o mayor) por asociación/disociación con el molde. La procesividad se puede medir de acuerdo con los procedimientos definidos en el presente documento y en el documento WO 01/92501 A1.

Cebador. Como se usa en el presente documento, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido, ya sea natural o producido sintéticamente, que puede actuar como punto de inicio de la síntesis de ácido nucleico cuando se dispone en condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión del cebador que es complementario a una hebra de ácido nucleico, por ejemplo, en presencia de cuatro nucleótidos trifosfatos diferentes y enzima termoestable en un tampón apropiado ("tampón" incluye pH, fuerza iónica, cofactores, etc., apropiados) y a una temperatura adecuada. El cebador es preferentemente monocatenario para eficacia máxima en la amplificación, pero puede ser de forma alternativa bicatenario. Si es bicatenario, en primer lugar se trata el cebador para separar sus hebras antes de usarse para preparar productos de extensión. Preferentemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de los productos de extensión en presencia de la enzima termoestable. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores, incluyendo temperatura, fuente de cebador y uso del procedimiento. Por ejemplo, dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, el cebador oligonucleotídico contiene típicamente 15-25 nucleótidos, aunque puede contener más o menos nucleótidos. En general, las moléculas cebadoras cortas requieren menores temperaturas para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde.

Resistencia a la sal'. Como se usa en el presente documento, el término "resistencia a la sal" (también denominado tolerancia a la sal) se refiere a la capacidad de una ADN polimerasa para mantener sustancialmente su actividad enzimática en presencia de sal o aditivos de PCR (por ejemplo, TMAC). En algunos modos de realización, la resistencia a la sal o aditivos de PCR se mide por la concentración de sal máxima a la que todavía está activa una ADN polimerasa. La concentración de sal máxima difiere para cada polimerasa y es conocida en la técnica, o se puede determinar experimentalmente de acuerdo con procedimientos en la técnica. Por ejemplo, Pfu se inhibe a 30 mM de sal (en una reacción PCR).

Síntesis'. Como se usa en el presente documento, el término "síntesis" se refiere a cualquier procedimiento in vitro para preparar una nueva hebra de polinucleótido o alargar un polinucleótido existente (es decir, ADN o ARN) de manera dependiente del molde. La síntesis, de acuerdo con la invención, incluye amplificación, lo que incrementa el número de copias de una secuencia molde de polinucleótido con el uso de una polimerasa. La síntesis de polinucleótidos (por ejemplo, amplificación) da como resultado la incorporación de nucleótidos en un polinucleótido (es decir, un cebador) formando de este modo una nueva molécula de polinucleótido complementaria al molde de polinucleótido. La molécula de polinucleótido formada y su molde se pueden usar como moldes para sintetizar moléculas de polinucleótidos adicionales. "Síntesis de ADN," como se usa en el presente documento, incluye, pero no se limita a, PCR, el mareaje de polinucleótido (es decir, para sondas y cebadores oligonucleotídicos), secuenciación de polinucleótidos.

Molécula de ADN molde'. Como se usa en el presente documento, el término "molécula de ADN molde" se refiere a una hebra de un ácido nucleico a partir de la que se sintetiza una hebra de ácido nucleico complementaria por una ADN polimerasa, por ejemplo, en una reacción de extensión de cebador.

Manera dependiente de molde'. Como se usa en el presente documento, el término "manera dependiente de molde" se refiere a un procedimiento que implica la extensión dependiente de molde de una molécula cebadora (por ejemplo, síntesis de ADN por ADN polimerasa). El término "manera dependiente de molde" se refiere típicamente a síntesis de polinucleótidos de ARN o ADN en la que la secuencia de la hebra de polinucleótido recién sintetizada se dicta por las normas bien conocidas del emparejamiento de bases complementarias (véase, por ejemplo, Watson, J. D. et al., en: Molecular Biology of the Gene, 4.a ed., W. A. Benjamín, Inc., Menlo Park, Calif. (1987)).

Enzima termoestable'. Como se usa en el presente documento, el término "enzima termoestable" se refiere a una enzima que es estable al calor (también denominada termorresistente) y cataliza (facilita) la polimerización de nucleótidos para formar productos de extensión de cebadores que son complementarios con una secuencia molde de polinucleótido. Típicamente, las polimerasas estables termoestables son preferentes en un procedimiento de termociclado donde se desnaturalizan ácidos nucleicos bicatenarios por exposición a una alta temperatura (por ejemplo, aproximadamente 95 °C) durante el ciclo de PCR. Una enzima termoestable descrita en el presente documento eficaz para una reacción de amplificación de PCR satisface al menos un criterio, es decir, la enzima no se desnaturaliza de forma irreversible (se inactiva) cuando se somete a las temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de los ácidos nucleicos bicatenarios. La desnaturalización irreversible para los propósitos del presente documento se refiere a la pérdida permanente y completa de actividad enzimática. Las condiciones de calentamiento necesarias para la desnaturalización dependerán, por ejemplo, de la concentración de sal del tampón y la longitud y composición nucleotídica de los ácidos nucleicos que se están desnaturalizando, pero típicamente varía de aproximadamente 90 °C a aproximadamente 98 °C durante un tiempo que depende principalmente de la temperatura y la longitud del ácido nucleico, típicamente de aproximadamente 0,2 a cuatro minutos. Se pueden tolerar temperaturas mayores a medida que se incrementa la concentración de sal del tampón y/o composición GC del ácido nucleico. En algunos modos de realización, las enzimas termoestables no se desnaturalizarán de forma irreversible a aproximadamente 90 °C-100 °C. Típicamente, una enzima termoestable adecuada para la invención tiene una temperatura óptima a la que funciona que es mayor de aproximadamente 40 °C, que es la temperatura por debajo de la que se promueve la hibridación del cebador al molde, aunque, dependiendo de (1) las concentraciones de sal y magnesio y (2) la composición y longitud del cebador, la hibridación se puede producir a mayor temperatura (por ejemplo, 45 °C - 70 °C). Cuanto mayor sea la temperatura óptima para la enzima, mayor será la especificidad y/o selectividad del procedimiento de extensión de cebador. Sin embargo, las enzimas que son activas por debajo de 40 °C (por ejemplo, a 37 °C) también están en el alcance de la presente invención siempre que sean termoestables. En algunos modos de realización, la temperatura óptima varía de aproximadamente 50 °C a 90 °C (por ejemplo, 60 °C - 80 °C).

Tolerancia a TMAC u otros potenciadores de PCR'. Como se usa en el presente documento, el término "tolerancia a TMAC u otros potenciadores de PCR" (también denominado resistencia a TMAC u otros potenciadores de PCR) se refiere a la capacidad de una ADN polimerasa para mantener sustancialmente su actividad enzimática en presencia de TMAC u otros potenciadores de PCR (por ejemplo, glicerol, DMSO, betaína, amidas, otras sales de tetrametilamonio).

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona, entre otras cosas, ADN polimerasas quiméricas.

ADN polimerasas

Se pueden genomanipular ADN polimerasas quiméricas a partir de cualquier ADN polimerasa, en particular, polimerasas termoestables. Típicamente, las ADN polimerasas se agrupan en seis familias: A, B, C, D, X e Y. Las familias A, B, C se agrupan en base a sus homologías de secuencia de aminoácidos con las polimerasas I, II, y III de E. coli, respectivamente. La familia X no tiene polimerasas de E. coli homologas. Las polimerasas de la familia B incluyen, pero no se limitan a, pol II de E. coli, polimerasas de arqueas, PRD1, ph¡29, M2, ADN polimerasas de bacteriófago T4, polimerasas a, A, s de eucariotas, y muchas polimerasas víricas. Otras ADN polimerasas incluyen polimerasas de arqueas (por ejemplo, polimerasas de euriarqueotas).

Las polimerasas de arqueas incluyen, pero no se limitan a, ADN polimerasas de Archaea (por ejemplo, Thermococcus litoralis (Vent™, GenBank: AAA72101), Pyrococcus furiosus (Pfu, GenBank: D12983, BAA02362), Pyrococcus woesii, Pyrococcus GB-D (Deep Vent™, GenBank: AAA67131), Thermococcus kodakaraensis KODI (KOD, GenBank: BD175553, BAA06142; Thermococcus sp. cepa KOD (Pfx, GenBank: AAE68738)), Thermococcus gorgonarius (Tgo, Pdb: 4699806), Sulfolobus solataricus (GenBank: NC002754, P26811), Aeropyrum pernix (GenBank: BAA81109), Archaeglobus fulgidus (GenBank: 029753), Pyrobaculum aerophilum (GenBank: AAL63952), Pyrodictium occultum (GenBank: BAA07579, BAA07580), Thermococcus 9 grados Nm (GenBank: AAA88769, Q56366), Thermococcus fumicolans (GenBank: CAA93738, P74918), Thermococcus hydrothermalis (GenBank: CAC18555), Thermococcus sp. GE8 (GenBank: CAC12850), Thermococcus sp. JDF-3 (GenBank: AX135456; WO0132887), Thermococcus sp. TY (GenBank: CAA73475), Pyrococcus abyssi (GenBank: P77916), Pyrococcus glycovorans (GenBank: CAC12849), Pyrococcus horikoshii (GenBank: NP 143776), Pyrococcus sp. GE23 (GenBank: CAA90887), Pyrococcus sp. ST700 (GenBank: CAC12847), Thermococcus pacificus (GenBank: AX411312.1), Thermococcus zilligii (GenBank: DQ3366890), Thermococcus aggregans, Thermococcus barossii, Thermococcus celer (GenBank: DD259850.1), Thermococcus profundus (GenBank: E14137), Thermococcus siculi (GenBank: DD259857.1), Thermococcus thioreducens, Thermococcus ormurineus NA1, Sulfolobus acidocaldarium, Sulfolobus tokodaii, Pyrobaculum calidifontis, Pyrobaculum islandicum (GenBank: AAF27815), Methanococcus jarmaschii (GenBank: Q58295), Desulforococcus species TOK, Desulfurococcus, Pyrolobus, Pyrodictium, Staphylothermus, Vulcanisaetta, Methanococcus (GenBank: P52025) y otras polimerasas de arqueas B, tales como GenBank AAC62712, P956901, BAAA07579)). Las polimerasas de la familia A y B estables a la temperatura representativas adicionales incluyen, por ejemplo, polimerasas extraidas de las bacterias termófilas de la especie Thermus (por ejemplo, flavus, ruber, thermophilus, lacteus, rubens, aquaticus), Bacillus stearothermophilus, Thermotoga marítima, Methanothermus fervidus.

También se describen en el presente documento ADN polimerasas que aún no se han aislado. Dichas polimerasas incluyen polimerasas de fusión. En general, las polimerasas de fusión contienen un dominio de proteína adicional en el extremo N o C terminal que cambia el fenotipo de la polimerasa de fusión en comparación con la polimerasa sin el dominio adicional. Las polimerasas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, polimerasas con dominios de unión a ADN bicatenario fusionados en el extremo C o N terminal. Otros ejemplos de polimerasas de fusión incluyen las que tienen dUTPasa fusionada en el extremo No C terminal (solicitud de patente de EE. UU. 20070190538).

Las ADN polimerasas pueden contener secuencias derivadas de dos o más ADN polimerasas que tienen al menos una característica funcional distinta. Las características funcionales ejemplares incluyen, pero no se limitan a, procesividad, tasa de alargamiento, fidelidad, resistencia a la sal o aditivo de PCR (por ejemplo, potenciadores de PCR), termoestabilidad, actividad de desplazamiento de hebra, actividad exonucleasa, función de lectura previa de uracilo, selectividad de nucleótido, capacidad para incorporar análogos modificados, y actividad transcriptasa inversa. Por ejemplo, algunas ADN polimerasas se caracterizan con alta fidelidad. Como se usa en el presente documento, el término "alta fidelidad" se refiere a una tasa de error menor de 4,45 X 10'® (por ejemplo, menor de 4,0X10-®, 3,5X10-®, 3,0X10'®, 2,5X10'®, 2,0X10'®, 1,5X10'®, 1,0X10'®, 0 ,5X 10®) mutaciones/nt/duplicación. Algunas ADN polimerasas se caracterizan con alta procesividad. Como se usa en el presente documento, el término "alta procesividad" se refiere a una procesividad mayor de 20 nts (por ejemplo, mayor de 40 nts, 60 nts, 80 nts, 100 nts, 120 nts, 140 nts, 160 nts, 180 nts, 200 nts, 220 nts, 240 nts, 260 nts,280 nts, 300 nts, 320 nts, 340 nts, 360 nts, 380 nts, 400 nts, o mayor) por asociación/disociación con el molde. Algunas ADN polimerasas se caracterizan con alta tasa de alargamiento. Como se usa en el presente documento, el término "alta tasa de alargamiento" se refiere a una tasa de alargamiento mayor de 25 nt/s (por ejemplo, mayor de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140 nt/s). Algunas enzimas se caracterizan con alta resistencia a la sal (también denominada tolerancia a la sal). Como se usa en el presente documento, el término "alta resistencia a la sal" (también denominada alta tolerancia a la sal) se refiere a la capacidad de una ADN polimerasa para mantener sustancialmente su actividad a una concentración de sal mayor de 30 mM (por ejemplo, mayor de 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM). Además, algunas enzimas se caracterizan con resistencia a aditivos de PCR. Determinados aditivos de PCR son potenciadores de PCR. Por ejemplo, Kovarova et al. mostró que las sales de TMA, DMSO, betaína y formamida actúan como potenciadores de PCR (Kovarova y Draber. (2000) Nucí. Acids. Res. 28(13), e70). Otro ejemplo de potenciadores de PCR es glicerol. Algunas enzimas se caracterizan con resistencia a potenciadores de PCR, en particular, TMAC (también denominada tolerancia a TMAC). Como se usa en el presente documento, el término "alta tolerancia a TMAC" se refiere a la capacidad de una ADN polimerasa para mantener sustancialmente su actividad enzimática a una concentración de TMAC (cloruro de tetrametilamonio) mayor de 10 mM (por ejemplo, mayor de 15 mM, 20 mM). Determinadas características de ADN polimerasas ejemplares se muestran en la tabla 1.

Tabla 1. Características de ADN polimerasas ejemplares

Típicamente, las enzimas con alta tolerancia a la sal también se caracterizan con alta procesividad y/o tasa de alargamiento. Sin quedar vinculado a ninguna teoría, se cree que la tolerancia a la sal afecta a la afinidad de unión entre polimerasa y ADN que, a su vez, afecta a la procesividad o tasa de alargamiento. Típicamente, la unión de polimerasas a ADN implica la interacción entre residuos aminoacídicos cargados positivamente y ADN cargado negativamente. A altas concentraciones de sal, la competición de los aniones de la sal por los residuos aminoacídicos cargados positivamente por las polimerasas da lugar a una disminución en la afinidad de unión a ADN. Véase, Pavlovef al. (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. 99(21): 13510-13515. Por otra parte, el incremento en los puntos de contacto entre ADN y polimerasa puede incrementar la resistencia a la sal de la polimerasa así como la procesividad o tasa de alargamiento debido a que los puntos de contacto adicionales entre ADN y polimerasa pueden incrementar la afinidad de unión de la polimerasa por ADN y disminuir la tasa de disociación de modo que la polimerasa permanecerá asociada con ADN más tiempo, lo que a su vez da lugar a un incremento en la procesividad. Por ejemplo, Pavlov et al. añadieron motivos de hélice-horquilla-hélice (HhH) de la topoisomerasa V a Taq y Pfu. Estos motivos están implicados en la unión a ADN en la topoisomerasa V. Pavlov et al. mostraron que ambas Pfu y Taq se vuelven más resistentes a la sal cuando se fusionan a los motivos HhH. Pavlov et al. también mostraron que la fusión a HhH para ambas Taq y Pfu incrementó la procesividad de las polimerasas. Como otro ejemplo, las proteínas de unión a ADNbc, por ejemplo, Sso7d, se pueden fusionar a ADN polimerasas para incrementar el número de puntos de contacto entre ADN y polimerasas (Wang et al. (2004) Nucí. Acids Res. 32(3): 1197-1207. Sso7d es una secuencia proteína de unión a ADNbc inespecífica implicada en garantizar la estabilidad de ADN y/o empaquetamiento de ADN en Sulfolobus solfataricus. La fusión de Sso7d a ambas Taq y Pfu incrementó la resistencia a la sal y procesividad de las polimerasas.

Las ADN polimerasas ejemplares caracterizadas con alta procesividad, tasa de alargamiento, termoestabilidad, tolerancia a la sal o potenciadores de PCR incluyen, pero no se limitan a, polimerasa KOD, polimerasa TNA1, Thermococcus sp. 9 grados N-7, T4, T7 o ph¡29. Las ADN polimerasas ejemplares caracterizadas con alta fidelidad incluyen, pero no se limitan a, polimerasas aisladas de Pyrococcus furiosus, P. abyssi, T. gorgonarius, T. litoralis, T. zilligii, T. sp. GT o P. sp. GB-D.

Las polimerasas KOD y Pfu se usan para genomanipular las ADN polimerasas quiméricas (véanse las secciones de Ejemplos).

Dominios de las ADN polimerasas

Típicamente, las ADN polimerasas de arqueas incluyen al menos los siguientes dominios: dominio N terminal, dominio exonucleasa (por ejemplo, dominio exonucleasa 3' -> 5'), dominio palma, dedos y pulgar (véase la figura 1). El conocimiento de la estructura, función y coordinación de los dominios se basa principalmente en estudios de la estructura cristalina y mutagénesis dirigida a sitio de diversas ADN polimerasas, en particular, ADN polimerasas de arqueas. Por ejemplo, entre las estructuras cristalinas de las ADN polimerasas de la familia B obtenidas está la de la ADN polimerasa del bacteriófago RB69 (Wang et al. (1997) Cell, 89:1087-1099). Entre las estructuras cristalinas de las ADN polimerasas de arqueas resueltas está la ADN polimerasa Tgo (véase, Hopfher et al. 1999 Proc. Nati. Acad. Sci. 96(7), 3600-3605). Recientemente, se ha informado de las estructuras cristalinas de las siguientes ADN polimerasas de la familia B de arqueas: ADN polimerasa de Thermococcus sp. 9°N-7 (Rodríguez et al. (2000) J. Mol. Biol. 299:447-462), ADN polimerasa KOD1 (Hashimoto et al. 2001 J. Mol. Biol. 306(3), 469-477), ADN polimerasa Pfu (véanse las patentes de EE. UU. n.° 5.948.663; 5.866.395; 5.545.552; 5.556.772 y Kim et al. (2008) Int. J. Biol. Macromol. 42(4), 356-61).

Se han asignado diversas funciones, tales como unión a sustrato, transferencia de nucleótido, actividad catalítica, corrección de errores, a diversos dominios en base al análisis estructural-funcional de las ADN polimerasas. También se ha sugerido que los dominios se coordinan rigurosamente entre sí para completar el proceso de replicación de ADN.

Por ejemplo, la actividad polimerasa se ha asociado con los dominios palma, dedos y pulgar. En particular, se cree que el subdominio palma es el sitio catalítico de la polimerasa. La polimerasa cataliza una reacción de transferencia de fosforilo en la que un fosfato alfa del dNTP entrante sufre un ataque nucleófilo desde el extremo de cebador OH. Típicamente, tres cadenas laterales de carboxilato son importantes para este sitio activo. Estos residuos se pueden unir a dos iones metálicos (Mg++) lo que puede facilitar la desprotonación del extremo OH y la formación de un estado de transición en el fosfato alfa del dNTP. Se cree que el dominio pulgar interactúa con el surco menor del ADNbc recién sintetizado y también con el nucleótido entrante. El dominio pulgar está menos conservado pero típicamente tiene una estructura principalmente helicoidal. El dominio dedos puede desempeñar un papel en la fijación del molde y la especificidad nucleotídica. Al igual que el dominio pulgar, es probable que interactúe con el nucleótido entrante. El dominio pulgar puede contener hélices a y/o hebras (3. Se cree que las ADN polimerasas no unidas forman conformaciones abiertas de los dominios dedos y pulgar, y cuando se une el ADN, los dos dominios se mueven hacia el dominio palma para sujetar el molde de ADN y cebador más fuertemente y a la sonda para el emparejamiento de bases de Watson-Crick entre el nucleótido entrante y el nucleótido del molde. La presencia de un nucleótido que forma un par de bases de Watson-Crick con el molde facilita la formación de una conformación apropiada del sitio activo de la polimerasa y la posterior incorporación de este nucleótido. Para revisión, véase Hamilton et al. (2001) BioTechniques 31:370-383. Se informó de que la mutagénesis en el dominio palma/dedos puede afectar a la selectividad y afinidad nucleotídica y que la mutagénesis en el dominio pulgar puede afectar a la afinidad de unión a ADNbc. Los aminoácidos importantes en el dominio palma, dedos y pulgar se describen en la publicación de la solicitud de EE. UU. n.° 20060281109.

La función de lectura previa de uracilo se ha asociado con el dominio N terminal. Por ejemplo, las ADN polimerasas de la familia B de arqueas pueden reconocer uracilo no reparado en una hebra molde y parar la polimerización secuencia arriba de la lesión para evitar la mutación A-T. Se identificó un "bolsillo" en los dominios N terminales de las ADN polimerasas de arqueas que estaba posicionado para interactuar con la hebra molde y proporcionar esta función de lectura previa de uracilo (Fogg et al. (2002) Nature Structural Biology 9(12), 922-927).

El dominio exonucleasa es asocia con actividad exonucleasa 5'-> 3', actividad exonucleasa 3'-> 5' o ambas, lo que se requiere para retirar el nucleótido insertado incorrectamente. Cuando se incorpora un nucleótido emparejado erróneamente, la hebra de molde/cebador se une a la polimerasa más débilmente y/o se alinea erróneamente con respecto al sitio activo de la polimerasa lo que provoca que el nucleótido emparejado erróneamente se mueva al sitio activo del dominio exonucleasa y se escinda.

Se cree que la fidelidad se ve afectada por la proporción de la actividad polimerasa y exonucleasa, lo que se ve influenciado por la tasa de disociación, cambio conformacional y la tasa de incorporación de nucleótidos en presencia de nucleótidos emparejados erróneamente. También se ha sugerido que el equilibrio entre la actividad exonucleasa 3' -> 5' y la actividad polimerasa está mediado por un bucle flexible que contiene el motivo Y-GG/A situado entre los dominios N terminal y exonucleasa y los dominios polimerasa C-terminal (es decir, los dominios palma, dedos y pulgar). Véase, Bohlke etal. (2000) Nucí. Acids Res. 28(20), 3910-3917. Un único bucle del dominio exonucleasa, y la punta del pulgar son importantes para la coordinación de la corrección de errores y las actividades polimerasa en las ADN polimerasas. La mutagénesis dirigida a sitio en este bucle, en especial en H147 en la ADN polimerasa KOD, sugirió que las interacciones electrostáticas e hidrófobas entre este bucle y el pulgar afectan a la proporción entre actividad exonucleasa y actividad polimerasa y por tanto a la fidelidad. Véase, Kuroita et al. J. Mol. Biol. (2005) 351, 291-298.

Intercambio de dominio

Los dominios heterólogos de diferentes ADN polimerasas (por ejemplo, polimerasas con al menos una característica funcional distinta) se pueden combinar para formar una polimerasa quimérica. Los dominios adecuados incluyen dominios N terminales naturales, dominios exonucleasa, dominios palma, dedos y/o pulgar encontrados en diversas ADN polimerasas. Los dominios N terminales naturales, dominios exonucleasa, dominios palma, dedos y/o pulgar en diversas ADN polimerasas están bien definidos. Por ejemplo, un dominio N terminal puede incluir una secuencia correspondiente a los residuos aminoacídicos 26 a 105 de la polimerasa KOD (SEQ ID NO: 11); un dominio exonucleasa puede incluir una región correspondiente a los residuos aminoacídicos 156 a 301 de la polimerasa KOD (SEQ ID NO: 11); un dominio pulgar puede incluir una región correspondiente a los residuos aminoacídicos 612 a 749 de la polimerasa KOD (SEQ ID NO: 11); y un dominio palma y dedos puede incluir una región correspondiente a los residuos aminoacídicos 394 a 563 de la polimerasa Pfu (SEQ ID NO:9).

Los correspondientes dominios o posiciones en diversas ADN polimerasas se pueden determinar por alineación de secuencias de aminoácidos. Se puede lograr la alineación de secuencias de aminoácidos de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático públicamente disponible, tal como el programa informático BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr una alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Preferentemente, se usa el programa informático WU-BLAST-2 para determinar la identidad de secuencia de aminoácidos (Altschul et al., Methodsin Enzymology 266, 460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.html). WU-BLAST-2 usa varios parámetros de búsqueda, de los que la mayoría se establecen como los valores predeterminados. Los parámetros ajustables se establecen con los siguientes valores: intervalo de solapamiento = 1, fracción de solapamiento = 0,125, valor umbral de palabra (T) = 11. Los parámetros de puntuación HSP (S) y HSP S2 son valores dinámicos y se establecen por el propio programa, dependiendo de la composición de la secuencia particular, sin embargo, los valores mínimos se pueden ajustar y se fijan como se indica anteriormente. Un ejemplo de una alineación se muestra en la figura 1.

En algunos modos de realización, un dominio adecuado puede ser una variante (por ejemplo, mutante o fragmento) de una secuencia de dominio natural. Por ejemplo, un dominio adecuado puede tener una secuencia que es al menos un 70 % (por ejemplo, al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %) idéntica a una secuencia de aminoácidos de un dominio natural encontrado en una ADN polimerasa de interés.

Se contempla además que las secuencias que definen el dominio N terminal, dominio exonucleasa, dominios palma, dedos y/o pulgar se pueden correlacionar con determinadas características enzimáticas de las ADN polimerasas, tales como, fidelidad o tasa de error, tasa de alargamiento, procesividad y resistencia a la sal. Por ejemplo, como se describe en la sección de Ejemplos, los autores de la presente invención han demostrado que las secuencias que definen el dominio N terminal, exonucleasa, y/o pulgar se pueden correlacionar con las características asociadas con tasa de alargamiento, procesividad, termoestabilidad, tolerancia a TMAC y/o resistencia a la sal; y que las secuencias que definen el dominio palma y/o dedos se pueden correlacionar con las características asociadas con fidelidad o tasa de error de las ADN polimerasas.

Además, en base a alineaciones de secuencia entre diversas ADN polimerasas (véase, por ejemplo, la figura 1), se contempla además que los dominios que se correlacionan con alta procesividad, tasa de alargamiento, termoestabilidad, tolerancia a TMAC y/o resistencia a la sal se pueden definir por una o más de las siguientes secuencias consenso positivas:

Secuencia consenso positiva 1 íaue define un dominio N terminal)

XXL XXXXXXXE C XRXXXXXX V XXXXX D XXX TXXXXXXXXXX V V KXX XXX V L1X

XXXXNXXXAXXKXXCXXXXXNFALXXXXXXXXXXXXTXXM XXRFXXXXXXXXX

XXXXPXXRXXXXXXXXXXXXXXXXVXXQXXXXXXXEXXTTXXXT (SEQ |D NQ 30) en la que X es cualquier aminoácido o un enlace peptídico;

Secuencia consenso positiva 2 íaue define un dominio exonucleasa)

XXEXXXX Y XXXXEXXFXXXX KXXXAXXXXXXXXAXXXXT V XT V KRXXXXQXXX

XXRXVEXXXXXFTXXXXXXAXXDXIXXXXX (SEQ |D NO:31)i en la que x es cualquier aminoácido o un enlace peptídico; y

Secuencia consenso positiva 3 íaue define un dominio pulgar)

XXXXXXXXXXXXXXXXALXXD XXXXKXXXXXXXXT EXXSKXX VXXXXX V XIIX

XXXXDXKDXXXTXXXXXXXXRXXXRXXXXRXXTXXSXXXXKXSXRXGDXXXPF

DXFXXTXXXXXXXXXXXXXXXXXXEXXXRAXX (SEQ ID NO:32); en la que x es cualquier aminoácido o un enlace peptídico.

De forma adicional o alternativa, un dominio o dominios que se correlacionan con alta procesividad, tasa de alargamiento, termoestabilidad, tolerancia a TMAC y/o resistencia a la sal se pueden definir por una o más de las siguientes secuencias consenso negativas:

Secuencia consenso negativa 1 íaue define un dominio N terminal)

NGXlFKJEX ⁷ .DRTFXlPYXjYALLX ⁵ DDSXr.lEEVKKlTX ⁷ ERHGXsX ⁹ VXi ⁰ X l ¹ X ¹⁷ Xl.lVEK.

V X n KKFL^{GX 1 jPXi<X 1 yVWKLYX 1 sXiuHPQDVPXzuIRX.»iKXz>REHP} A ^{(SEQ |D NO:33) en |a} que X1 no es K; X2 no es H; X3 no es R; X4 no es I; X5 no es R; X@ no es K; X7 no es G; Xs no es K; Xg no es I; X 10 no es R; Xn no es I; X12 no es V; X 13 no es D; X-m no es E; X 15 no es K; X16 no es I; X17 no es T; X-is no es L; X-ig no es E; X20 no es T; X21 no es E; y X22 no es V;

Secuencia consenso negativa 2 íaue define un dominio exonucleasa)

P I X i M I S Y A D E X í X í A X í V I T W K N X ^ D L P Y V X gW S X t E R E M I K R F L R X sX ^ X u . E K D P D X í i

^{X i} 2^{X i VT Y N G D X m F D F X i s Y L X i gK R X i ? E K JL G L X i rX i} 9^X 20^X 21^{G R JD G S C P K X} 22 ^{Q R X} 23^{G D X} 24

X 25 A V H V K G R I H K I ) I . Y X 26 V I X 27 R N N L P I Y I [ ,b ;A V Y H A X 28 F G X 2í> P K E K V Y A X 5 ü K I X 3 iX 3

'^w’ ' (SEQ ID NO:34), en la que X1 no es I; X2 no es N; X3 no es E; X4 no es K; X5 no es I; X6 no es E; X7 no es S; Xs no es I; X9 no es I; X10 no es R; Xn no es I; X12 no es I; X13 no es V; X14 no es S; X15 no es P; X16 no es A; X17 no es A; X-is no es K; X19 no es L; X20 no es T; X21 no es I; X22 no es M; X23 no es I; X24 no es M; X25 no es T; X26 no es H; X27 no es T; X28 no es I; X29 no es K; X30 no es D; X31 no es A; X32 no es K; y X33 no es S; y

Secuencia consenso negativa 3 íaue define un dominio pulgar)

R D W S E I A K E T Q A R V L E X i X ? L K X * G D V E X 4 A V R I V K E V X < X (íK L X - X * Y E X vP P E K L X k, I X

íiEQlTRXijLXiíXMYKAXisGPllVAVAKXifiLAAXnGVKlXuvPGXiíVlXznYlVLXjiGXzj

^{G X 23 lX 24 X 25 R A ÍX 26 X 27 X 2 s E X 29 D P X » K H K Y D A E Y Y IE N Q V L P A V X jiR IL X j2 X j2 F G (SEQ} ID NO:35), en la que X1 no es T; X2 no es I; X3 no es H; X4 no es E; X5 no es I; X@ no es Q; X7 no es A; Xs no es N; Xg no es I; X10 no es A; Xn no es Y; X12 no es P; X13 no es H; X-^m no es E; X15 no es I; X16 no es K; X17 no es K; X18 no es K; X-ig no es M; X20 no es G; X21 no es R; X22 no es D; X23 no es P; X24 no es S; X25 no es N; X26 no es L; X27 no es A; X28 no es E; X29 no es Y; X30 no es K; X31 no es L; X32 no es E; y X33 no es G.

En algunos modos de realización, un dominio que se correlaciona con alta fidelidad se puede definir por la siguiente secuencia consenso positiva (que define un dominio palma y dedos):

X K X X X X X X X X X X X X A X X X X X X X X X X X X X X X X X L X X X X N X X E X X X X X X K X X X X 1

X X X X X X X X X H X X X X X X X X X T X X X E X Q X X X X K I X X X X X X K X X X E X X X X F X X X X X

X X K X X X X X X X X X X X X X X X X X K X X E L V W X X L X X X F X X X X L X T X X X X L Y X X X X X G

h S X H I X X X X I X (SEQ ID NO:36), en la que X es cualquier aminoácido o un enlace peptídico.

De forma adicional o alternativa, un dominio que se correlaciona con alta fidelidad se puede definir por la siguiente secuencia consenso negativa (que define un dominio palma y dedos):

E X i G L \ V E M V Y L D F R X ,\ L Y P S I I U H N V S P D T L N X 'E G C K X 4 Y D X < A P Q V G H X r . F C K D X 7 P

G F l P S L L G X í ! L L E E R Q K I K X 9 K M K X i o T X i i D P l E X i 2 X i 3 L L D Y R Q X i 4 A l l C X i 5 L A l M S X i f i Y G

YYGYAXⁱ7AR\VTCKECAESVTAWGRX^isYLXⁱ!)X2(^jX2ⁱX^j2KEX2:^jEEKX2‘»GFKVX25YX26

I) I DGX ²⁷ X ² RAI IPGX ²⁹ X ³⁰ XJIEX ³² X. ¹³ KJCKAX ³⁴ E ^{(SEQ ID NO:37), en la que X1 no es R; X2 no es} S; X3 no es R; X4 no es E; X5 no es V; X@ no es R; X7 no es F; Xs no es D; Xg no es K; X10 no es A; Xn no es I; X12 no es R; X13 no es K; X-^m no es R; X15 no es I; X16 no es Y; X17 no es R; X-is no es E; X-ig no es T; X20 no es M; X21 no es T; X22 no es I; X23 no es I; X24 no es Y; X25 no es I; X26 no es S; X27 no es F; X28 no es F; X29 no es A; X30 no es D; X31 no es A; X32 no es T; X33 no es V; X34 no es M.

Por lo tanto, los dominios apropiados se pueden tomar o derivar de ADN polimerasas con distintas características funcionales para genomanipular una ADN polimerasa quimérica con combinaciones deseables de rasgos funcionales. Los procedimientos pueden incluir las etapas de: (a) proporcionar un dominio N terminal, un dominio exonucleasa, y/o un dominio pulgar en base a una primera ADN polimerasa; (b) proporcionar un dominio palma y/o dedos en base a una segunda ADN polimerasa; (c) combinar los dominios de la etapa (a) y etapa (b) para formar una polimerasa quimérica. La primera y la segunda ADN polimerasas descritas en el presente documento se pueden caracterizar con al menos una característica distinta. Por ejemplo, la primera ADN polimerasa se puede caracterizar con alta procesividad, tasa de alargamiento, termoestabilidad, tolerancia a TMAC y/o resistencia a la sal y la segunda ADN polimerasa se puede caracterizar con alta fidelidad. La primera ADN polimerasa como se describe en el presente documento se puede caracterizar con alta fidelidad y la segunda ADN polimerasa se puede caracterizar con alta procesividad, tasa de alargamiento, termoestabilidad, tolerancia a TMAC y/o resistencia a la sal. Las polimerasas quiméricas descritas en el presente documento se pueden genomanipular para tener una procesividad, tasa de alargamiento, termoestabilidad, tolerancia a TMAC o resistencia a la sal sustancialmente similar a la de la primera ADN polimerasa y una fidelidad sustancialmente similar a la de la segunda ADN polimerasa. Las polimerasas quiméricas genomanipuladas como se describe en el presente documento tienen una fidelidad mayor que la de la primera ADN polimerasa y la procesividad, tasa de alargamiento o resistencia a la sal mayor que la de la segunda ADN polimerasa.

También se describen procedimientos de mejora de la fidelidad, procesividad, tasa de alargamiento, termoestabilidad, tolerancia a TMAC y/o resistencia a la sal de una ADN polimerasa. Dichos procedimientos pueden incluir una etapa de reemplazar una secuencia dentro del dominio palma-dedos de la ADN polimerasa de interés con una secuencia correspondiente de una ADN polimerasa diferente que se caracteriza con mayor fidelidad con relación a la ADN polimerasa de interés.

También se describen procedimientos que incluyen una etapa de reemplazo de una secuencia dentro del dominio N terminal, el dominio exonucleasa y/o el dominio pulgar de la ADN polimerasa de interés con una secuencia correspondiente de una ADN polimerasa diferente que se caracteriza con mayor procesividad, tasa de alargamiento, termoestabilidad, tolerancia a TMAC o resistencia a la sal con relación a la ADN polimerasa de interés.

Como ejemplo no limitante, los autores de la presente invención han genomanipulado una ADN polimerasa quimérica Kofu y su quimera recíproca POD en base a la polimerasa KOD y la polimerasa Pfu (véase la sección Ejemplos). Como se analiza en la sección de ejemplos, Kofu contiene el dominio N terminal, el dominio exonucleasa y el dominio pulgar de la polimerasa KOD y el dominio palma-dedos de la polimerasa Pfu. La secuencia de la polimerasa Kofu se proporciona en SEQ ID NO:16. La quimera recíproca POD contiene el dominio N terminal, el dominio exonucleasa y el dominio pulgar de la polimerasa Pfu y el dominio palma-dedos de la polimerasa KOD. La secuencia de la polimerasa POD se proporciona en SEQ ID NO:15.

Como se analiza en la sección de ejemplos, la polimerasa quimérica Kofu presenta la fidelidad de replicación aproximada de Pfu pero la velocidad de alargamiento, procesividad, termoestabilidad, tolerancia a TMAC y rendimiento de PCR similar a KOD. De forma alternativa, la polimerasa quimérica Pod presenta la fidelidad de replicación aproximada de KOD pero la velocidad de alargamiento, procesividad, termoestabilidad, tolerancia a TMAC y rendimiento de PCR similar a Pfu.

Se describen en el presente documento variantes de Kofu polimerasa quimérica que contienen una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % (por ejemplo, al menos un 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %) idéntica a SEQ ID NO:16 (secuencia de aminoácidos de Kofu). En modos de realización particulares, las variantes de la polimerasa quimérica Kofu tienen procesividad, tasa de alargamiento, termoestabilidad, tolerancia a TMAC y/o fidelidad sustancialmente similares a Kofu.

Se describen en el presente documento variantes de las polimerasas quiméricas Kofu definidas por la secuencia consenso XXXXTXXXXXDXXXXXXIXXXXXXEXXXXYXXXXEXXFXXXXKXXXAXXXXXX XXAXXXXTVXTVKRXXXXQXXXXXRXVEXXXXXFTXXXXXXAXXDXIXXXXXXI XXY XXXX XXXXXXX XXXXX V XXXXDXXXXM XXXXXXXXXXX XXXXAEXXXLX XXXXXXEGXRXXXXXXVXXXXXDXXXTXXXXXXXXXXVVKXXXXXVLIXXXXX NXXXAXXKXXCXXXXXNFALXXXXXXXXXXIXXM XXRFXXXXXXXXXXXXXPX XRXXXXXXXXXXXXXXXXVXXQXXXXXXXEXX TTXXXTXXXXXXXXRXXXXX XXV XXXXXXXXXXXXA XXXXXVXXPXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXV XXXXXSXEXY QXXXXEXXTXXFXXXXXKXXXXXXXXXXXXAXXXXXXXXXXXX XXXXX LXXXXNXXIXXXXXXK.XXXXIXXXXXXXXXHXXXXXXXXXTXXXEXQX XXXKIXXXXXXKXXXLXXXXFXXXXXXXKXXXXXXXXXXXXXXXXXKXXELVVV XXLXXXFXXXXLXIXXXXLYXXXXXGESXEIXXXXLXXLXXXXAXXXXAXXXXX XXXXXXXXXXXXXKXXXXXXXXXITXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXAI.X X DXXXX KXXXXXXXXTEX XS KXX VXXXXX VX H XXXXX DX KDXXXTX XXXXXX X RXXX RXXXX RXX T X X S XXX X KX S X RX GDXXXPFDXF XXT XXXXXX XXXXXXX XXXXXEXXXRAXXXXXXXXXXXXXXXXXXSAXXKPXCT _{(SEQ ID NO:38),} en la que X es cualquier aminoácido o un enlace peptídico.

Se describen en el presente documento variantes de las polimerasas quiméricas Kofu definidas por la secuencia consenso XIXDTDYXTXDGXPXXRIFXKXXGEFXXXYDXXFEPYFYALLKDDSAIXXXXXXXA XRHGTVXTVKRXXXXQXKFLXRXVEVWXLXFTHPQDVPAXXDXIXXHXXVIDIYE YDIPFAKRYLIDXGLVPMEGDEXLXMXXXDIETXYHEGXEFAEGXXLMISYADXEG ARVITWKXVDLPYVDWSTEXEMIKRXXXVVKEKDPDVLIXYXGDNFDXAYLKXR CEXLGXNFALXRXXXXXEPKIXXMGXRFAVEXKGRXHFDLXPXXRXTXNLPTYXL XXVYEXVXGQXKXKXXXEEITTXWETXXXXXXXARYSMEDAXVTXELGXEFXPM EAXLXXLVGXPXWDVXRSSTGNLVEWXLLXXAYXRNEVAPNKPSXEEYQXRXXE XYTGXFVXEPEKGLWXXXXXLDXXALYPSIIXXHNVSPDTLXLEXCXNYDIAPXVG XKFCKDIPGFIPSXLXHLXXXRQXXKIXMXEXQDPXEKIXLDYRQKAXKLLXNSFY GYXGYXKARWYXXECAESVTXWGRKYIELVWXELEXXFGFKXLYIDTDGLYAT1P GGESXEIKXXXLXFLXYINAXLPGALELEYEXFYXRGFFVXKKKYAXTDEEXXITTR GLEXVRRDWSXXAKETXAXVLEALLXDXXVXKAVXXVXXXTEXXSKYXVPXEKL VIHEQITRDXKDYXATGPHVAXAKRLXXRGXXXRPGTXISYXXLKGSGRXGDRXIPF DEFXXTKHXYDXXYYIENQVLPAVERXLRAFGYXXXXLXXQXXXQXGLSAWXKP

Y r T

(SEQ ID NO:39), en la que X es cualquier aminoácido o un enlace peptídico

Las presentes divulgaciones proporcionan variantes de las polimerasas quiméricas POD que contienen una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % (por ejemplo, al menos un 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ) idéntica a SEQ ID NO:15 (secuencia de aminoácidos de Pod). En modos de realización particulares, las variantes de las polimerasas quiméricas POD tienen procesividad, tasa de alargamiento, termoestabilidad, tolerancia a TMAC y/o fidelidad sustancialmente similares a POD.

Expresión de las ADN polimerasas quiméricas de la invención

Se pueden usar técnicas de ADN recombinante estándar (por ejemplo, digestión con enzima de restricción, fijación, PCR) para genomanipular ADN polimerasas quiméricas de acuerdo con la presente invención. Se pueden aplicar procedimientos bien conocidos en la técnica para expresar y aislar ADN polimerasas quiméricas. Muchos vectores de expresión bacteriana contienen elementos de secuencia o combinaciones de elementos de secuencia que permiten una expresión inducible de alto nivel de la proteína codificada por una secuencia exógena. Los vectores de expresión están comercialmente disponibles de, por ejemplo, Novagen (http://www.emdbiosciences. com/html/NVG/AIIT ables. html#).

Además, las bacterias que expresan una forma inducible integrada del gen de la ARN polimerasa de T7 se pueden transformar con un vector de expresión que porta un gen de la ADN polimerasa quimérica conectado al promotor de T7. La inducción de la ARN polimerasa de T7 por adición de un inductor apropiado, por ejemplo, isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG) para un promotor inducible de lac, induce la expresión de alto nivel del gen quimérico del promotor de T7.

Se pueden seleccionar cepas huésped apropiadas de bacterias a partir de las disponibles en la técnica por un experto en la técnica. Como ejemplo no limitante, se usa comúnmente la cepa BL-21 de £ coli para la expresión de proteínas exógenas puesto que carece de proteasas con relación a otras cepas de E. coli. Para situaciones en las que el uso de codón para el gen de polimerasa particular difiere de lo que se observa normalmente en genes de £ coli, existen cepas de BL-21 que se modifican para portar genes de ARNt que codifican ARNt con anticodones más raros (por ejemplo, genes de ARNt argU, ileY, leuW y proL), lo que permite una expresión de alta eficacia de los genes quiméricos clonados (varias cepas celulares BL21-CODON PLUSTM que portan ARNt con codón raro están disponibles de Stratagene, por ejemplo). De forma adicional o alternativa, los genes que codifican las ADN polimerasas se pueden optimizar con codón para facilitar la expresión en E. coli. Se pueden sintetizar químicamente secuencias optimizadas con codón.

Existen muchos procedimientos conocidos por los expertos en la técnica que son adecuados para la purificación de una ADN polimerasa quimérica de la invención. Por ejemplo, el procedimiento de Lawyer et al. (1993, PCR Meth. & App. 2: 275) es adecuado para el aislamiento de ADN polimerasas expresadas en E. coli, como se diseñó originalmente para el aislamiento de la polimerasa Taq. De forma alternativa, se puede usar el procedimiento de Kong et al. (1993, J. Biol. Chem. 268: 1965, incorporado en el presente documento), que emplea una etapa de desnaturalización térmica para destruir proteínas huésped, y dos etapas de purificación en columna (sobre columnas DEAE-Sepharose y Heparin-Sepharose) para aislar la ADN polimerasa altamente activa y pura aproximadamente en un 80 %.

Además, se pueden aislar mutantes de ADN polimerasa por fraccionamiento con sulfato de amonio, seguido de columnas Q Sepharose y celulosa-ADN, o por adsorción de contaminantes en una columna HiTrap Q, seguido de elución de gradiente de una columna de heparina HiTrap.

Usos de ADN polimerasas quiméricas de la invención

Se pueden usar ADN polimerasas quiméricas de la presente invención para cualquier procedimiento que implique síntesis de polinucleótidos. Los procedimientos de síntesis de polinucleótidos son bien conocidos para un experto en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Molecular Cloning, segunda edición, Sambrook et al., Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N. Y. (1989). Por ejemplo, las ADN polimerasas quiméricas de la presente invención tienen una variedad de usos en tecnología de ADN recombinante incluyendo, pero sin limitarse a, mareaje de ADN por desplazamiento de mella, síntesis de ADNc bicatenario en clonación de ADNc, secuenciación de ADN, y amplificación, detección y/o clonación de secuencias de ácido nucleico usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

En algunos modos de realización, la invención proporciona enzimas resistentes, rápidas y exactas para PCR. PCR se refiere a un procedimiento in vitro para amplificar una secuencia molde de polinucleótido específica. La técnica de PCR se describe en numerosas publicaciones, incluyendo, PCR: A Practical Approach, M. J. McPherson, et al., IRL Press (1991), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, por Innis, et al., Academic Press (1990), y PCR Technology: Principáis and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich, Stockton Press (1989). La PCR también se describe en muchas patentes de EE. UU., incluyendo las patentes de EE. UU. n.° 4.683.195; 4.683.202; 4.800.159; 4.965.188; 4.889.818; 5.075.216; 5.079.352; 5.104.792; 5.023.171; 5.091.310; y 5.066.584.

Se espera que las ADN polimerasas quiméricas con mayor procesividad, tasa de alargamiento y/o fidelidad reduzcan la tasa de alargamiento, mejoren la eficacia y la tasa de éxito de amplificación de largo alcance (mayor rendimiento, dianas más largas amplificadas), y/o reduzcan la cantidad de molde de ADN requerido.

Diversas aplicaciones de amplificación de PCR específica están disponibles en la técnica (para revisiones, véanse por ejemplo, Erlich, 1999, Rev Immunogenet., 1: 127-34; Prediger 2001, Methods Mol. Biol. 160: 49-63; Jurecic et al., 2000, Curr. Opin. Microbio!. 3: 316-21; Triglia, 2000, Methods Mol. Biol. 130: 79-83; MaClelland et al., 1994, PCR Methods Appl. 4: S66-81; Abramson y Myers, 1993, Current Opinión in Biotechnology 4: 41-47; de los que cada uno se incorpora en el presente documento por referencia).

Como ejemplos no limitantes, la presente invención se puede usaren aplicaciones de PCR incluyendo, pero no se limitan a, i) PCR de inicio en caliente ("hot-start')que reduce la amplificación inespecífica; ii) PCR con temperatura decreciente ("touch-down") que comienza a alta temperatura de hibridación, a continuación disminuye la temperatura de hibridación en etapas para reducir el producto de PCR inespecífico; iii) PCR con cebadores internos ("nested') que sintetiza un producto más fiable usando un conjunto externo de cebadores y un conjunto interno de cebadores; iv) PCR inversa para amplificación de regiones que flanquean una secuencia conocida. En este procedimiento, el ADN se digiere, el fragmento deseado se circulariza por fijación, a continuación PCR usando un cebador complementario para la secuencia conocida que se extiende hacia fuera; v) AP-PCR (cebado arbitrario) /RAPD (ADN polimórfico amplificado aleatorio). Estos procedimientos crean huellas genéticas genómicas de especies con secuencias diana poco conocidas por amplificación usando oligonucleótidos arbitrarios; vi) RT-PCR que usa ADN polimerasa dirigida a ARN (por ejemplo, transcriptasa inversa) para sintetizar ADNc que a continuación se usa para PCR. Este procedimiento es extremadamente sensible para detectar la expresión de una secuencia específica en un tejido o células. También se puede usar para cuantificar los transcritos de ARNm; vii) RACE (rápida amplificación de extremos de ADNc). Esto se usa cuando la información sobre la secuencia proteica/ADN es limitada. El procedimiento amplifica los extremos 3' o 5' de ADNc que generan fragmentos de ADNc con solo un cebador específico cada uno (más un cebador adaptador). A continuación se pueden combinar los productos de RACE solapantes para producir ADNc de longitud completa; viii) DD-PCR (PCR con presentación diferencial) que se usa para identificar genes expresados diferencialmente en diferentes tejidos. La primera etapa en DD-PCR implica RT-PCR, a continuación se realiza la amplificación usando cebadores cortos intencionadamente inespecíficos; ix) PCR múltiple en la que dos o más dianas únicas de secuencias de ADN en el mismo espécimen se amplifican simultáneamente. Se puede usar una secuencia de ADN como control para verificar la calidad de la PCR; x) Q/C-PCR (cuantitativa comparativa) que usa una secuencia de ADN control interna (pero de diferente tamaño) que compite con el ADN diana (PCR competitiva) para el mismo conjunto de cebadores; xi) PCR recursiva que se usa para sintetizar genes. Los oligonucleótidos usados en este procedimiento son complementarios con tramos de un gen (>80 bases), alternativamente a las hebras sentido y antisentido con extremos solapantes (-20 bases); xii) PCR asimétrica; xiii) PCR in situ] xiv) mutagénesis por PCR dirigida a sitio; xv) DOP-PCR que usa cebadores parcialmente degenerados para amplificación de genoma completo; xvi) PCR cuantitativa usando SYBR Green o sondas de oligonucleótidos para detectar la amplificación; xvii) amplificación de genoma completo usando colecciones de fragmentos de ADN fijadas a adaptador como molde, y xviii) PCR propensa a error en la que se optimizan las condiciones para dar un incremento en el número de mutaciones en el producto de PCR.

Se debe entender que la presente invención no se limita a ningún sistema de amplificación particular. Como se desarrollan otros sistemas, esos sistemas se pueden beneficiar por la práctica de la presente invención.

Kits

La invención también contempla formatos de kit que incluyen una unidad de envase que tiene uno o más recipientes que contienen ADN polimerasas quiméricas de la invención y composiciones de las mismas. En algunos modos de realización, la presente invención proporciona kits que incluyen además recipientes de diversos reactivos usados para la síntesis de polinucleótidos, incluyendo síntesis en PCR.

Los kits inventivos de acuerdo con la presente invención también pueden contener uno o más de los siguientes elementos: precursores de polinucleótidos, cebadores, tampones, instrucciones y controles. Los kits pueden incluir recipientes de reactivos mezclados conjuntamente en proporciones adecuadas para realizar los procedimientos de acuerdo con la invención. Los recipientes de reactivos preferentemente contienen reactivos en cantidades unitarias que obvian las etapas de medición cuando se realizan los procedimientos objeto.

Ejemplos

Ejemplo 1. Diseños de quimeras de las ADN polimerasas KOD v Pfu

Las dos enzimas que se eligieron para incluirse en este experimento fueron la ADN polimerasa de Pyroccocus furiosus {Pfu) y las ADN polimerasas de Thermococcus Kodarensis (KOD). Las dos enzimas tienen una enzimas de dominio similar y tiene un 79 % de identidad al nivel de aminoácido usando alineaciones blastP (véase la tabla 2). Las estructuras de dominio de Pfu y KOD se ¡lustran en la figura 1.

Tabla 2. Alineación ClustalW de Pfu y KOD

PFU 1 ^{K T ' .DVD Y T T R ?GK =>V T R " A1 X XRN'} xtr-wrt^r^yiyatrrddsk^rrvkk 3RRF< 6C KOD i ____T ........... D ..............1.............. ... Y ... . 3 .. ? .. .. K . . . A ............... 6C

PFU 61 KTVRTVRVSKVRXXR'.CX^TTVwX'.Y" RX^QDV^TTRRXVRR-RAWmPRYD7PPAKRY ' ?C KOD 61 •1V.1VKR. ^C. n . .A..U.1, :2C

PFU 121 LIDKGLI?K2GSí2L:<I1ATD12T1YH3o33Jo:<3?11M1£YA.D3M3A:<V:”WKM:DLPY -3C KOD 121 .....V ___ D___ M.............. 7V3...I...... 33.S..... V ___ ISO

PFU 181 VEVVSSEREHIKRrLRIIREKDPDIIVTYNGDSF2FPYLAKRAEKLGIKLTIGRDG5EPK 240 KOD 181 .D...T.........W K .... VLI.... . . .A . . K. . C......KFA1........ 240

PFU 241 MQRIGDHTAVEVKGRIHFDLYHVITRTINLFTYTLEAVYEAIFGKFKEKVYADEIAKAWE 300 KOD 241 I..M..RF............P..R............... V..Q...... E..TT... 300

PFU 301 SGENLERVAKYSMEDAKATYELGKEFLPt'ÍElOLSKLVGQl-LWDVSRSSTGNLVEWFLLRK 360 KOD 301 T .................. R ................ V .............................A ........... I .. S .................................................. 360

PFU 361 AYERNEVAPNKPSEEEYORRLRESYTGGFVKEPEKGI/aEKIVYLDFRALYPSIIITHNVS 420 KOD 361 ............. L ........... D .K .L A . . - .0. .E . . Y ........... R .............................5 ............................. 41<

Pfu y KOD tienen distintas características fenotípicas, en particular, con respecto a la tasa de alargamiento, procesividad y tasa de error (véase la tabla 3):

Tabla 3

T P

T

Por tanto, el objetivo fue encontrar combinaciones quiméricas de estas dos enzimas que inhibían la tasa de error comparable a Pfu (2,0x10-6) con la procesividad y/o tasa de alargamiento comparable a KOD (-300 nt/s y 106-138 nt/s respectivamente). Una enzima con las características mencionadas anteriormente tiene utilidad como enzima resistente, rápida y exacta para POR.

Se insertaron sitios de restricción en la secuencia de nucleótidos optimizada con codón de las polimerasas KOD y Pfu en posiciones que flanquean aproximadamente el dominio polimerasa de las enzimas (véase el ejemplo 2). Por ejemplo, se usaron los sitios Pvull y EcoRI que flanquean el dominio polimerasa (el dominio palma y dedos) para reemplazar el dominio polimerasa de Pfu con el de KOD para generar la considerada quimera Pod (figura 2). Esta quimera contiene el dominio N terminal, el dominio exonucleasa 3'-5' y el dominio pulgar de Pfu y el dominio palma y dedos de KOD. Se generó el intercambio recíproco, que proporcionó la quimera Kofu, reemplazando el dominio polimerasa (palma y dedos) de KOD con el de Pfu.

Ejemplo 2. Optimización de codón v síntesis de las ADN polimerasas de Pvrococcus furiosus v Thermococcus kodakarensis

Se recuperaron secuencias de ADN naturales para la polimerasa I de Pyrococcus furiosus (SEQ ID NO:1) y la polimerasa I de Thermococcus kodakarensis (SEQ ID NO:2) de Genbank. Estas dos secuencias de ADN se optimizaron con codón in silico por Codon Devices (Cambridge, Massachusetts) para la expresión en E. Coli dando como resultado SEQ ID NO:3 para la secuencia de ADN del gen optimizado con codón de la polimerasa I Pfu y SEQ ID NO:4 para la secuencia de ADN del gen optimizado con codón de la polimerasa I KOD. Los dos genes optimizados con codón se sintetizaron químicamente y se clonaron en pUC19 por Codon Devices (Cambridge, Massachusetts) dando como resultado SEQ ID NO:7 para la polimerasa I Pfu y SEQ ID NO:8 para la polimerasa I KOD.

Ejemplo 3: Clonación de las secuencias de las polimerasas I KOD v Pfu optimizadas con codón en el vector de expresión pKBexp.

Se clonaron construcciones de pUC 19 optimizadas con codón de polimerasa KOD (SEQ ID NO:8) y Pfu (SEQ ID NO:7) en el vector pKBexp como sigue:

El vector pKBexp contiene dos sitios Eco31l con salientes no complementarios que permiten la clonación direccional de insertos usando una única enzima de restricción. Se diseñaron genes de polimerasa KOD y Pfu con dos sitios flanqueantes Eco31l que permiten la clonación direccional y sin cambio de pauta de lectura en pKBexp.

Se digirió el ADN purificado del vector pKBexp con Eco31l y se purificó a partir de gel de agarosa. Asimismo se digirieron las construcciones de ADN de pUC optimizadas con codón de KOD y Pfu (SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:7) con Eco311 y se cortaron los fragmentos de inserto de aproximadamente 2,3 kilobase a partir de un gel de agarosa y se purificaron. Se fijaron 30 ng de los genes de polimerasa KOD o Pfu con 15 ng de pKBexp digerido y usando la ADN ligasa T4. Se purificaron las reacciones de fijación y se usaron para transformar DH10B competente de E. coli. Se realizaron minipreparaciones de ADN de clones resistentes a ampicilina. Se confirmó la presencia de insertos por digestión de las minipreparaciones con Xbal y Hindlll, dos enzimas que flanquean el inserto. La clonación de la secuencia del gen de la polimerasa KOD en el considerado pKBexp pKB11 y el gen de la polimerasa Pfu en el considerado pKBexp pKB14 se confirmaron por secuenciación de ADN.

Ejemplo 4: Intercambio de dominio de secuencias de ADN de los genes de las polimerasas I KOD v Pfu

Se diseñaron las secuencias optimizadas con codón de los genes de las polimerasas I KOD (SEQ ID NO:5) y Pfu (SEQ ID NO:3) con los sitios de restricción que flanquean aproximadamente los dominios dedos y palma de las polimerasas KOD y Pfu. La secuencia optimizada con codón de KOD contiene un sitio de restricción Pvull y un sitio de restricción EcoRI. La secuencia optimizada con codón de Pfu contiene un sitio de restricción Pvull y un sitio de restricción EcoRI.

El ADN purificado de pKB11 y pKB14 se digirió cada uno con las enzimas de restricción EcoRI y Pvull. El fragmento grande (4,7 kb) y el fragmento pequeño (0,7 kb) de cada digestión se extrajeron por separado y se purificaron a partir de gel de agarosa. Los fragmentos pequeños de cada digestión de restricción contenían los dominios dedos y palma de KOD y Pfu respectivamente. Los fragmentos grandes digeridos y purificados (que contenían el vector de expresión y los fragmentos de polimerasas restantes) se desfosforilaron usando fosfatasa alcalina de gamba. Se creó la considerada construcción POD por fijación de 30 ng del fragmento grande de Pfu de 4,7 kb (residuos aa 1 a 335 y 567 a 778 de la ADN polimerasa Pfu con 10 ng del fragmento pequeño de KOD de 0,7 kb (correspondiente a los residuos aminoacídicos 336 a 565 de la ADN polimerasa KOD SEQ ID NO:11). Por tanto, POD incluye los dominios N terminal, exonucleasa y pulgar de la ADN polimerasa Pfu y los dominios palma y dedos de KOD. La considerada construcción Kofu se realizó por fijación de 30 ng del fragmento grande de KOD de 4,7 kb (correspondiente a los residuos aminoacídicos 1 a 335 y 566 a 777 de la ADN polimerasa KOD SEQ ID NO:11) con 10 ng del fabrica pequeño de Pfu de 0,7 kb (correspondiente a los residuos aminoacídicos 336 a 566 de la ADN polimerasa Pfu SEQ ID NO: 11). Por tanto, Kofu incluye los dominios N terminal, exonucleasa y pulgar de la ADN polimerasa KOD y los dominios palma y dedos de Pfu. Se usaron las reacciones de fijación para transformar DH10B de E. coli. Se confirmó la construcción de Pod (SEQ ID NO:13) y Kofu (SEQ ID NO:14) por secuenciación de ADN. Las estructuras de dominio de POD y Kofu se ilustran en la figura 1. La expresión y purificación de polimerasas quiméricas se realizan usando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se revisa en la "Descripción detallada de la invención".

Ejemplo 5. Termoestabilidad de KOD. Pfu. Kofu v Pod

Se incubaron 10 ng de cada enzima a 98 °C durante 240, 120, 60, 30, 15, 8, 4, 2, 1 o 0 min en un volumen de 10 pl que contenía los siguiente: Tris-HCI 20 mM pH 8,0, MgCI22 mM, (NH4)2S04 6 mM, KCI 25 o 50 mM (25 mM para Pfu y Pod, 50 mM para KOD y Kofu). Se añadieron 10 pl de mezcla cebador/molde a cada tubo después de la incubación térmica. La mezcla cebador/molde contenía lo siguiente: Tris-HCI 20 mM pH 8,0, MgCI22 mM, (NH4)2S 046 mM, dNTP 0,6 mM, 0,6 pM de cada uno de los cebadores HPRT1-F1 (5 '-l l í SSaaacatCtgg»glCCl_3. (SEQ ID NO:40)) y HPRT1-R1 (S'.gCCCaaagggaaClgaUlglC.g. (SEQ |D Nq :41 )), 2 ng de ADN genómico humano por pl, y KCI 25 o 50 mM (25 mM para Pfu y Pod, 50 mM para KOD y Kofu). Se realizaron las amplificaciones con el siguiente protocolo de ciclado: 3 minutos a 95 °C, 35 x (20 segundos a 98 °C, 20 segundos a 60 °C, 20 segundos a 72 °C), 20 segundos a 72 °C. Se analizaron los productos de PCR en un gel de agarosa (véase la figura 3). Como se ilustra en la figura 3, no se observó amplificación para Pfu después de la preincubación de la enzima durante 4 horas a 98 °C. Por el contrario, KOD, Kofu y Pod pudieron amplificar un producto de PCR para todos los puntos temporales sometidos a prueba.

Ejemplo 6. Ensayos de fidelidad

Se determinó la fidelidad de enzimas por un procedimiento similar al descrito por Cline et al. y referencias en el mismo (Nucí. Acids Res., 1996, 24(18): 3546-3551). Se amplificó por PCR Lacl a partir de E. coli y se clonó en pUC19 para degenerar el plásmido pKB-LacIQZalpha (SEQ ID NO: 17). pKB-LacIQZalpha sirvió tanto como molde para amplificó por PCR de Lacl en los ensayos de fidelidad como de vector para clonar el Lacl amplificado para cribado de colonias en azul/blanco.

Se establecieron reacciones de PCR de 2 x 50 |jl (para cada enzima), usando 70 ng de molde de plásmido pKB-LacIQZalfa (equivalente a 25 ng de diana lacl) y 2,5 U de cada enzima para amplificar el fragmento laclOZalpha de 1.386 Kb. Las condiciones de PCR fueron como sigue: se realizó la con Pfu y Pod en tampón Pfu (Fermentas); KOD y Kofu en tampón 1 KOD de Novagen. Concentraciones finales de MgCh 2 mM, 0,4 pM de cada uno de los ^{cebadores M13-40} (GTTTTCCCAGTCACCAC ^{(SEQ ID NO:42)) y PKBIac-1R (} GG I A IC I I I A I AG I ( X I G I C G ^{(SEQ ID NO:43)) y 0,2 mM de cada dNTP. Los parámetros de ciclado} para Pfu y Pod fueron: 94 °C 4 minutos, 30 x (94 °C 15 segundos, 55 °C 15 segundos, 72 °C 3 minutos), 72 °C 6 minutos. Los parámetros de ciclado para KOD y Kofu fueron: 94 °C 2 minutos, 30 x (98 °C 15 segundos, 55 °C 2 segundos, 72 °C 20 segundos), 72 °C 30 segundos.

Se cuantificaron los rendimientos de producto de PCR por medio de electroforesis en gel y se calculó el número de duplicaciones de molde. Se digirieron productos de PCR con Xbal, Ncol y Dpnl, se purificó con gel (sin exposición a luz UV) y se fijó en pKB-LacIQZalpha digerido con Xbal-Ncol. Se transformó E.coli con las mezclas de fijación y se plaquearon las células en placas de LB-Amp-X-gal. Se registró el número de colonias azules, colonias blancas y el número total de colonias. Se calculó la tasa de error f como f = -ln(F)/(d x (pb)), donde F = fracción de colonias blancas ((colonias totales menos colonias azules)/colonias totales), d = número de duplicaciones de molde y b = 349 (se puntúan solo 349 pb del amplicón lacl). Los resultados ejemplares se resumen en la tabla 4. Como se muestra en la tabla 4, Pfu y Kofu tienen fidelidad similar y su fidelidad es mayor que la de KOD y Pod.

Tabla 4: Fidelidad de KOD, Pfu, Kofu y Pod

Ejemplo 7. Ensayos de procesividad

La procesividad se puede determinar y calcular usando ensayos descritos en (Wang et al. Nucí. Acids Res, 2004, 32(3): 1197-1207; y Von Hippel et al. NY Acad Sci 1994; 726:118-131). En resumen, se añaden 0,8 pmoles de un cebador marcado con 5'FAM (-40M13LFF, 5'FAM-GrnTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCC-3' ^{(SEQ ID NO:44)) a 1,6 pmoles de ADN} ssM13mp18 en presencia de Tris-HCI 20 mM pH 8,0, KCI 25 mM, MgCh 2,5 mM, dNTP 0,3 mM en un volumen de 16 microlitros. Se hibrida el cebador con el calentando a 95 °C durante 2 minutos seguido de lento enfriamiento hasta 72 °C en un termociclador a una tasa de 0,1 °C/segundo, incubación durante 10 minutos a 72 °C y enfriamiento adicional a 0,1 °C/segundo hasta 4 °C. Se diluyen las polimerasas en Tris-HCI 20 mM pH 8,0, KCI 25 mM. Se calientan el molde cebado y las polimerasas diluidas hasta 72 °C y se inicia la reacción añadiendo 4 pl de polimerasa diluida a 16 pl de molde cebado. Se diluyen las polimerasas para dar proporciones polimerasa:molde de 1:10 - 1:10000. Se finalizan las reacciones después de diversos puntos temporales añadiendo EDTA hasta una concentración final de 10 mM.

Se analizan las reacciones de extensión en un analizador ABI 3130XL Genetic Analyzer. Se determina la mediana de la longitud de producto para cada reacción. Se define la mediana de la longitud de producto como la longitud del producto a la que la intensidad de fluorescencia total de todos los productos hasta esa longitud iguala un 50 % de la suma de intensidades de fluorescencia de todos los productos detectables. Se usan las trazas para las muestras donde la mediana de la longitud de producto no cambia con un cambio en la concentración de polimerasa o tiempo de incubación para calcular la procesividad de acuerdo con Von Hippel et al. (Von Hippel et al. NY Acad Sci 1994; 726:118-131). Se integra cada pico (I) con un nivel de fluorescencia significativamente superior al nivel de fondo para dar la intensidad de fluorescencia de ese pico (ni). La intensidad de fluorescencia total (nT) es la suma de la fluorescencia de todos los picos. Los datos de integración se representan como log(ni/nT) frente a n-1, donde n es el número de nucleótidos incorporados. Se ajustan los datos a la siguiente ecuación: log(ni/nT) = (n-1)logP¡ log(1-P¡). Pi, el factor de procesividad microscópico, se define como la probabilidad de no finalizar la extensión en la posición i. El promedio de la longitud de extensión de cebador se determina a partir de 1/(1 -Pi).

Ejemplo 8. Resistencia a la sal de KOD. Pfu. Kofu v Pod

Estudios previos (Pavlov et al. (2002) Proc Nati Acad Sci. 99(21), 13510-13515; Wang et al. (2004) Nucí Acids Res.

32(3), 1197-1207) han mostrado que existe una correlación directa entre el incremento en la tolerancia a la sal y la procesividad de las polimerasas. Para todas las polimerasas sometidas a prueba (de la familia A o familia B), se descubrió que las polimerasas con incremento en la tolerancia a la sal también tenían un incremento en la procesividad. Por lo tanto, se comparó la tolerancia a la sal de estas quimeras con la de las polimerasas originales como representantes para la procesividad.

Se determinó la concentración de proteína de las KOD, Pfu, Kofu y Pod purificadas usando un Bioanalyzer 2100 (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.) con el kit Protein 230 Kit del mismo proveedor. Se sometieron a prueba las polimerasas en PCR en tiempo real con cantidades crecientes de KCI añadido. Se realizaron las reacciones en un volumen de 20 pl que contenía Tris-HCI 20 mM pH 8, (NhU^SCU 0,6 mM, MgCh 2 mM, DMSO al 3 %, 10 ng de polimerasa, 20 ng de ADN genómico humano, 0,3 mM de cada dNTP, 0,25X SYBR Green (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Se realizó una reserva diluida 20X SYBR Green en DMSO), 0,3 pM de cebador directo HPRT1-F1 (5 '-t t t gSaaaca,cto » aotc c t-3 ' (SEQ ID NO:40)) y 0,3 pM de cebador inverso HPRT1-R1(5'-gCCCaaagggaaotgalagtC g. (SEQ ID NO:41)). Se añadió KCI hasta concentraciones finales de 10, 25, 50, 75, 100 o 125 mM. Se realizó la amplificación de PCR en un termociclador en tiempo real Corbett 6000 HRM (Corbett Life Science, Sidney, Australia) con el siguiente protocolo de ciclado: 3 minutos a 95 °C, 40 ciclos de (10 segundos a 95 °C, 20 segundos a 60 °C, 20 segundos a 72 °C, adquisición de datos), seguido de una etapa de análisis de curva de fusión de: aumento de 72 °C a 95 °C etapas de 1 °C, espera durante 5 segundos antes de la adquisición de datos al final de cada etapa. Se analizaron 8 pl de cada muestra en un gel de agarosa al 1,5 %. Se cargaron 5 pl de Fermentas GeneRuler™ Mix, n.° cat. SM0333 (Fermentas, Vilnius, Lituania) en el gel como marcador de ADN. Los resultados ejemplares se muestran en la figura 4.

Ejemplo 9. Tolerancia a TMAC de KOD. Pfu. Kofu v Pod

Las sales que contienen tetrametilamonio potencian las reacciones PCR como se muestra por Kovarova et al. (Kovarova, M. y Draber, P.; Nucí. Acids Res. (2000) 28(13) e70-). Una sal de este tipo es cloruro de tetrametilamonio (TMAC). Por lo tanto, se comparó la tolerancia a TMAC de estas quimeras con la de las polimerasas originales.

Se sometieron a prueba las polimerasas en PCR en tiempo real con cantidades crecientes de TMAC añadido. Se realizaron las reacciones en un volumen de 20 pl que contenía Tris-HCI 20 mM pH 8, (NH4)2S04 0,6 mM, MgCh 2 mM, KCI 25 mM, 10 ng de polimerasa, 20 ng de ADN genómico humano, 0,3 mM de cada dNTP, 0,25X SYBR Green (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Se realizó una reserva diluida 20XSYBR Green en DMSO), 0,3 pM de cebador directo HPRT1-F1 (S '-W g g ^ ^ ^ C tg g ílg tC C t 3, (SEQ |D NO:40)) y 0,3 pM de cebador inverso HPRT1-R1(5'-gcccaaagggaactgatagtc_3' (SEQ ID NO:41)). Se añadió TMAC hasta concentraciones finales de 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100 o 120 mM. Se realizó la amplificación de PCR en un termociclador en tiempo real Corbett 6000 HRM (Corbett Life Science, Sidney, Australia) con el siguiente protocolo de ciclado: 3 minutos a 95 °C, 40 ciclos de (10 segundos a 95 °C, 20 segundos a 50 °C, 20 segundos a 72 °C, adquisición de datos), seguido de una etapa de análisis de curva de fusión de: aumento de 72 °C a 95 °C etapas de 1 °C, espera durante 5 segundos antes de la adquisición de datos al final de cada etapa. Se analizaron 8 pl de cada muestra en un gel de agarosa al 1,5 %. Se cargaron 5 pl de Fermentas GeneRuler™ Mix, n.° cat. SM0333 (Fermentas, Vilnius, Lituania) en el gel como marcador de ADN. Los resultados ejemplares se muestran en la figura 5.

Ejemplo 10. Quimeras adicionales de las polimerasas KOD v Pfu

Se diseña este ejemplo para mostrar que las posiciones donde tiene lugar el intercambio entre dominios puede variar.

Se preparan quimeras adicionales intercambiando los dominios palma y dedos de las polimerasas KOD y Pfu donde la posición exacta del intercambio varía ligeramente en comparación con las posiciones para Kofu y Pod. Se prepara Kofu-ll (SEQ ID NO:26) reemplazando los residuos aminoacídicos 305 a 615 de KOD (SEQ ID NO: 12) con los aminoácidos 305 a 616 de Pfu (SEQ ID NO:10). Se prepara Pod-ll (SEQ ID NO:27) reemplazando los aminoácidos 305 a 616 de Pfu (SEQ ID NO:10) con los aminoácidos 305 a 615 de KOD (SEQ ID NO:12).

Se prepara Kofu-lll (SEQ ID NO:28) reemplazando los residuos aminoacídicos 396 a 564 de KOD (SEQ ID NO: 12) con los aminoácidos 397 a 565 de Pfu (SEQ ID NO:10). Se prepara Pod-lll (SEQ ID NO:29) reemplazando los aminoácidos 397 a 565 de Pfu (SEQ ID NO:10) con los aminoácidos 396 a 564 de KOD (SEQ ID NO:12).

La secuencia de aminoácidos de las quimeras Kofu-ll, Pod-ll, Kofu-lll y Pod-lll se traduce de forma inversa y se optimiza con codón para la expresión en E.coli. Se añaden secuencias de nucleótidos adicionales que contienen sitios de restricción Eco31l a los extremos 5' y 3' de la construcción para facilitar la clonación en un vector de expresión. Más específicamente, se pueden diseñar las secuencias 5' y 3' de modo que los salientes, después de la digestión del ADN con Eco31l, sean complementarios a los salientes en un vector de expresión particular (por ejemplo, pKB). La optimización de codón y síntesis génica se realizan por GeneArt Gmbh. La expresión y purificación de polimerasas quiméricas se realizan usando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se revisa en la "Descripción detallada de la invención". La termoestabilidad, fidelidad, procesividad, resistencia a la sal y resistencia a TMAC de las polimerasas quiméricas se determinan como se describe en los ejemplos 5 a 9.

Ejemplo 11. Quimeras de polimerasas de T. litoralis v 9 arados N-7

Se diseñan las quimeras 9NI¡ y L¡9N en base a la alineación en la figura 1. Se preparan intercambiando los dominios palma y dedos entre las ADN polimerasas de T. litoralis y Thermococcus sp. 9 grados N-7. La identidad de secuencia global entre estas dos polimerasas es de un 77 % sobre el nivel de aminoácidos.

Se puede preparar la quimera 9NI¡ reemplazando la región palma y dedos de la polimerasa 9N con la región palma y dedos de la polimerasa de T. litoralis. En este ejemplo particular, se prepara 9NI¡ reemplazando los aminoácidos 347 a 580 de 9N polimerasa (SEQ ID NO: 18) con los aminoácidos 349 a 583 de la polimerasa de T. litoralis (SEQ ID NO:19). La secuencia de la región codificante de 9NI¡ se proporciona como SEQ ID NO:20.

Se puede preparar la quimera L¡N9 reemplazando el dominio palma y dedos de la ADN polimerasa de T. litoralis con el dominio dedo de la ADN polimerasa de 9 grados Norte. En este ejemplo particular, se prepara L¡N9 reemplazando los aminoácidos 349 a 583 de la polimerasa de T. litoralis (SEQ ID NO: 19) con los aminoácidos 347 a 580 de la polimerasa de 9 grados N-7 (SEQ ID NO: 18). La secuencia de la región codificante de L¡N9 se proporciona como SEQ ID NO:21.

Ejemplo 12. Quimeras de las ADN polimerasas de tipo B de T. ooroonarius v T. ziHiaii

Se diseñan las quimeras GoZi y ZiGo en base a la alineación en la figura 1. Se preparan intercambiando los dominios palma y dedos entre las ADN polimerasas de T. gorgonarius y T. zHligii. La identidad de secuencia global entre estas dos polimerasas es de un 94% sobre el nivel de aminoácidos.

Se puede preparar la quimera GoZi reemplazando la región palma y dedos de la polimerasa de T. gorgonarius con la región palma y dedos de la polimerasa de T.zHIigii. En este ejemplo particular, se prepara GoZi reemplazando los aminoácidos 391 a 559 de la polimerasa de T. gorgonarius (SEQ ID NO:22) con los aminoácidos 391 a 559 de la polimerasa de T. zilligü (SEQ ID NO:23). La secuencia de la quimera GoZi resultante se proporciona como SEQ ID NO:24.

Se puede preparar la quimera ZiGo reemplazando el dominio palma y dedos de la ADN polimerasa de T. zilligü con el dominio dedos de la ADN polimerasa de T. gorgonarius. En este ejemplo particular, se prepara ZiGo reemplazando los aminoácidos 391 a 559 de la polimerasa de T. zHligii (SEQ ID NO:23) con los aminoácidos 391 a 559 de la polimerasa de T. gorgonarius (SEQ ID NO:22). La secuencia de la región codificante de ZiGo se proporciona como SEQ ID NO:25.

Tabla 5. Secuencias

Secuencias de ADN naturales de Pfu y KOD

Secuencia 1 (SEQ ID NO: 11

>Secuencia de nucleótidos de Pfu natural a partir de secuencia genómica (n.° acc. AE010147)

Secuencia 2 (SEQ ID NO:2)

>Secuencia de nucleótidos de KOD natural (a partir de secuencia genómica, n.° acc. AP006878)

Secuencias optimizadas con codón de Pfu y KOD

Secuencia 3 (SEQ ID NO:3)

>Secuencia de nucleótidos optimizada con codón de Pfu

Secuencia 4 (SEQ ID NO:4)

>Secuencia de nucleótidos optimizada con codón de Pfu, 9 nt adicionales en área 5'.

Secuencia 5 (SEQ ID NO:5)

>Secuencia de nucleótidos optimizada con codón de KOD

Secuencia 6 (SEQ ID NO:6)

>Secuencia de nucleótidos optimizada con codón de KOD, 9 nt adicionales en área 5'.

Secuencia 7 (SEQ ID NO:7)

>Secuencia de nucleótidos optimizada con codón de Pfu - pKB13 en vector pUC19

Secuencia 8 (SEQ ID NO:8)

>Secuencia de nucleótidos optimizada con codón de KOD - pKB8 en vector pUC19

Secuencias de aminoácidos de Pfu y KOD

Secuencia 9 (SEQ ID NO:9)

>Secuencia de aminoácidos de Pfu

Secuencia 10 (SEQ ID NO: 10)

>Secuencia de aminoácidos de Pfu, 3 aa adicionales en área 5'.

Secuencia 11 (SEQ ID NO: 11)

>Secuencia de aminoácidos de KOD

Secuencia 12 (SEQ ID NO: 12)

>Secuencia de aminoácidos de KOD, 3 aa adicionales en área 5'.

Secuencias de ADN de las quimeras Pod y Kofu

Secuencia 13 (SEQ ID NO: 13)

>Secuencia de nucleótidos optimizada con codón de Pod

Secuencia 14 (SEQ ID NO:14)

>Secuencia de nucleótidos optimizada con codón de Kofu

Secuencias de aminoácidos de las quimeras Pod y Kofu

Secuencia 15 (SEQ ID NO: 15)

>Secuencia de aminoácidos de Pod

Secuencia 16 (SEQ ID NO: 161

>Secuencia de aminoácidos de Kofu

Secuencia 17 (SEQ ID NO: 17)

>pLACIQZa

Secuencias de aminoácidos de las ADN polimerasas de T. litoralis, Therm ococcus sp. 9 grados N-7 y quimeras de las mismas.

Secuencia 18 (SEQ ID NO: 18)

Secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa de Thermococcus sp. 9 grados N-7 (n.° acc. U47108)

S e cu e n c ia 19 (S E Q ID NO: 19)

S e cu e n c ia de a m in o á c id o s d e la A D N po lim e rasa d e T. lito ra lis (n .° acc. M 74198.1 )

Secuencia 20 (SEQ ID NQ:20)

Secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa quimérica 9NI¡

Secuencia 21 (SEQ ID NO:21)

Secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa quimérica L¡9N

Secuencias de aminoácidos de las ADN polimerasas de T. gorgonaríus, T. zillig ii y quimeras de las mismas.

S e cu e n c ia 22 (S E Q ID N O :22)

S e cu e n c ia de a m in o á c id o s d e la A D N po lim e rasa d e T. g o rg o n a ríu s (n .° acc. 4699806 )

Secuencia 23 (SEQ ID NO:23)

Secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa de T. zilligii

Secuencia 24 (SEQ ID NO:24)

Secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa quimérica GoZi

Secuencia 25 (SEQ ID NO:25)

Secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa quimérica ZiGo

Secuencias de aminoácidos de quimeras adicionales de las ADN polimerasas KOD y Pfu.

Secuencia 26 (SEQ ID NO: 26)

Secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa quimérica Kofu-ll.

Secuencia 27 (SEQ ID NO: 27)

Secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa quimérica Pod-ll.

S e cu e n c ia 28 (SEQ ID NO: 28)

S e cu e n c ia de a m in o á c id o s d e la A D N po lim e rasa q u im é rica K o fu -llI.

Secuencia 29 (SEQ ID NO:29)

Secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa quimérica Pod-lll.

Equivalentes

Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán determinar usando no más que experimentación rutinaria, muchos equivalentes a los modos de realización específicos de la invención descrita en el presente documento. El alcance de la presente Invención no pretende limitarse a la anterior Descripción, sino más bien es como se expone en las reivindicaciones adjuntas. Los artículos "un", "una" y "el/la" como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, a menos que se Indique claramente lo contrario, se debe entender que Incluyen los referentes en plural. Las reivindicaciones o descripciones que Incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes en, se emplean en, o son pertinentes de otro modo para un producto o procedimiento dado a menos que se Indique lo contrario o sea evidente de otro modo a partir del contexto. La Invención Incluye modos de realización en los que exactamente un miembro del grupo está presente en, se emplea en, o es pertinente de otro modo para un producto o procedimiento dado. La Invención también Incluye modos de realización en los que más de uno, o todos los miembros del grupo están presenten en, se emplean en, o son pertinentes de otro modo para un producto o procedimiento dado. Cuando los elementos se presentan como listas, por ejemplo, en formato de grupo de Markush o similar, se debe entender que también se divulga cada subgrupo de los elementos, y cualquier elemento se puede retirar del grupo. Se debe entender que, en general, cuando la invención, o aspectos de la invención, se reflera(n) a comprender elementos, rasgos, etc., particulares, determinados modos de realización de la Invención o aspectos de la Invención consisten, o consisten esencialmente en, dichos elementos, rasgos, etc. Para los propósitos de simplicidad, esos modos de realización no se han expuesto específicamente en cada caso en el presente documento.

También se debe entender que, a menos que se Indique claramente lo contrario, en cualquier procedimiento reivindicado en el presente documento que Incluya más de un acto, el orden de los actos del procedimiento no se limita necesariamente al orden en el que se enumeran los actos del procedimiento, sino que la Invención incluye modos de realización en los que el orden está así limitado.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Una ADN polimerasa quimérica que comprende:

una primera secuencia al menos un 90 % idéntica a los residuos aminoacídicos 156 a 301 de SEQ ID NO: 11^;

una segunda secuencia al menos un 90 % idéntica a los residuos aminoacídicos 394 a 563 de SEQ ID NO: 9;

una tercera secuencia al menos un 90 % idéntica a los residuos aminoacídicos 26 a 105 de SEQ ID NO: 11; y

una cuarta secuencia al menos un 90 % idéntica a los residuos aminoacídicos 612 a 749 de SEQ ID NO: 11^,

en la que la ADN polimerasa quimérica se caracteriza por

(a) una tasa de error menor de 4,45 x 10® mutaciones/nt/duplicación,

(b) una procesividad mayor de 20 nucleótidos,

(c) una tasa de alargamiento de más de 25 nts,

(d) una capacidad para mantener la actividad enzimática a una concentración de sal mayor de 30 mM, (e) una capacidad para mantener la actividad enzimática después de una incubación de más de 30 minutos a 98 °C, y

(f) una capacidad para mantener la actividad enzimática a una concentración de cloruro de tetrametilamonio (TMAC) mayor de 10 mM.

2. Una secuencia de nucleótidos que codifica una ADN polimerasa quimérica de la reivindicación 1.

3. Un kit que comprende una ADN polimerasa quimérica de la reivindicación 1.

4. Un vector o célula que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 2.

5. Uso de una ADN polimerasa quimérica de la reivindicación 1 en un procedimiento de síntesis de ADN.

6. Uso de una ADN polimerasa quimérica de la reivindicación 1 en un procedimiento de amplificación de un fragmento de ADN.