JPH09220087A - プルーフリーディング３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する新規ｄｎａポリメラーゼ - Google Patents
プルーフリーディング３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する新規ｄｎａポリメラーゼInfo
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- JPH09220087A JPH09220087A JP8160402A JP16040296A JPH09220087A JP H09220087 A JPH09220087 A JP H09220087A JP 8160402 A JP8160402 A JP 8160402A JP 16040296 A JP16040296 A JP 16040296A JP H09220087 A JPH09220087 A JP H09220087A
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- dna polymerase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Abstract
(57)【要約】
【課 題】 ＤＮＡクローンのＤＮＡ配列決定研究等
に際して起こる可能性のある塩基対のミスマッチを回避
する． 【解決手段】 ＤＮＡポリメラーゼとくに熱安定性ＤＮ
Ａポリメラーゼであって，鋳型からのＤＮＡ鎖のＤＮＡ
配列の決定時にＤＮＡ鎖の３’末端からミスマッチした
ヌクレオチドをそのＤＮＡポリメラーゼが鋳型ヌクレオ
チドと正しくマッチしたヌクレオチドを除去する機能の
速度より速い速度で切除するように機能してプルーフリ
ーディング３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を発揮す
ることが可能でありまた５’−３’エキソヌクレアーゼ
活性を示さないＤＮＡポリメラーゼ，それを産生できる
生物体株，そのアミノ酸配列，それをコードするＤＮＡ
配列およびそれによってトランスフォームされた宿主細
胞，ならびにそのＤＮＡポリメラーゼの使用を包含す
る．
に際して起こる可能性のある塩基対のミスマッチを回避
する． 【解決手段】 ＤＮＡポリメラーゼとくに熱安定性ＤＮ
Ａポリメラーゼであって，鋳型からのＤＮＡ鎖のＤＮＡ
配列の決定時にＤＮＡ鎖の３’末端からミスマッチした
ヌクレオチドをそのＤＮＡポリメラーゼが鋳型ヌクレオ
チドと正しくマッチしたヌクレオチドを除去する機能の
速度より速い速度で切除するように機能してプルーフリ
ーディング３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を発揮す
ることが可能でありまた５’−３’エキソヌクレアーゼ
活性を示さないＤＮＡポリメラーゼ，それを産生できる
生物体株，そのアミノ酸配列，それをコードするＤＮＡ
配列およびそれによってトランスフォームされた宿主細
胞，ならびにそのＤＮＡポリメラーゼの使用を包含す
る．
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は，プルーフリーディ
ング３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を発揮し，また
５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を示さないＤＮＡポ
リメラーゼに関する．本発明はまた，Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ熱安定性ＤＮ
Ａポリメラーゼに由来する単離およびクローン化ＤＮＡ
配列ならびに発現されたポリメラーゼ自体に関する．
ング３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を発揮し，また
５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を示さないＤＮＡポ
リメラーゼに関する．本発明はまた，Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ熱安定性ＤＮ
Ａポリメラーゼに由来する単離およびクローン化ＤＮＡ
配列ならびに発現されたポリメラーゼ自体に関する．
【０００２】
【従来の技術】すべての既知の生存生物の遺伝子材料
は，リボ核酸（ＲＮＡ）を遺伝子材料とするある種のウ
ィルスを除いて，デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である．
ＤＮＡは特定の配列で化学的に連結した個々のデオキシ
ヌクレオチドの鎖から構成されている．各デオキシヌク
レオチドは，アデニン（Ａ），シトシン（Ｃ），グアニ
ン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）である４種類の含窒素塩基
の一つと，ペントースであってその３’位置に結合した
ヒドロキシル基およびその５’位置に結合したリン酸基
を有するデオキシリボースを含有する．ＤＮＡ鎖を形成
する隣接したデオキシヌクレオチドは互いに，一つのペ
ントース環の５’位置を次のペントース環の３’位置に
結合させるホスホジエステル結合により連結されてい
る．この場合，最初のＤＮＡ分子は常にデオキシリボー
スの５’炭素に結合したリン酸基を有する．最後のＤＮ
Ａ分子は常にデオキシリボースの３’炭素上にＯＨ（ヒ
ドロキシル）基を有する．
は，リボ核酸（ＲＮＡ）を遺伝子材料とするある種のウ
ィルスを除いて，デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である．
ＤＮＡは特定の配列で化学的に連結した個々のデオキシ
ヌクレオチドの鎖から構成されている．各デオキシヌク
レオチドは，アデニン（Ａ），シトシン（Ｃ），グアニ
ン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）である４種類の含窒素塩基
の一つと，ペントースであってその３’位置に結合した
ヒドロキシル基およびその５’位置に結合したリン酸基
を有するデオキシリボースを含有する．ＤＮＡ鎖を形成
する隣接したデオキシヌクレオチドは互いに，一つのペ
ントース環の５’位置を次のペントース環の３’位置に
結合させるホスホジエステル結合により連結されてい
る．この場合，最初のＤＮＡ分子は常にデオキシリボー
スの５’炭素に結合したリン酸基を有する．最後のＤＮ
Ａ分子は常にデオキシリボースの３’炭素上にＯＨ（ヒ
ドロキシル）基を有する．
【０００３】ＤＮＡは通常，二重鎖分子として存在し，
厳密にマッチした「ＡとＴ」および「ＣとＧ」が対を形
成する様式で，２つのＤＮＡ鎖の各ヌクレオチド塩基間
の水素結合によって，２本のアンチパラレルなＤＮＡ鎖
が互いに保持されている．遺伝子を決定しひいては合成
されるタンパク質の種類を決定するものは，ＤＮＡ鎖に
おける塩基の順序もしくは配列である．したがって，タ
ンパク質の遺伝子コードをも構成するＤＮＡ鎖内の塩基
配列を正確に決定することは，関連タンパク質の特性を
理解する上で基本的に重要である．
厳密にマッチした「ＡとＴ」および「ＣとＧ」が対を形
成する様式で，２つのＤＮＡ鎖の各ヌクレオチド塩基間
の水素結合によって，２本のアンチパラレルなＤＮＡ鎖
が互いに保持されている．遺伝子を決定しひいては合成
されるタンパク質の種類を決定するものは，ＤＮＡ鎖に
おける塩基の順序もしくは配列である．したがって，タ
ンパク質の遺伝子コードをも構成するＤＮＡ鎖内の塩基
配列を正確に決定することは，関連タンパク質の特性を
理解する上で基本的に重要である．
【０００４】ＤＮＡ分子中の塩基の配列の決定に用いら
れる方法はＤＮＡシークェンシングと呼ばれる．ＤＮＡ
シークェンシングの技術中では，Ｓａｎｇｅｒら（１）
によって開発された酵素法が最も一般的である．これ
は，ＤＮＡポリメラーゼが，配列を決定すべきＤＮＡ鋳
型にアニーリングしたプライマーを４種類の正常なデオ
キシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ），すなわちｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの存在下に延
長する能力，ならびにヌクレオチド類縁体であるジデオ
キシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ），すなわちｄ
ｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰおよびｄｄＴＴＰが
伸長したデオキシヌクレオチドポリマーの延長を様々な
長さで停止させる能力に基づくものである．
れる方法はＤＮＡシークェンシングと呼ばれる．ＤＮＡ
シークェンシングの技術中では，Ｓａｎｇｅｒら（１）
によって開発された酵素法が最も一般的である．これ
は，ＤＮＡポリメラーゼが，配列を決定すべきＤＮＡ鋳
型にアニーリングしたプライマーを４種類の正常なデオ
キシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ），すなわちｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの存在下に延
長する能力，ならびにヌクレオチド類縁体であるジデオ
キシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ），すなわちｄ
ｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰおよびｄｄＴＴＰが
伸長したデオキシヌクレオチドポリマーの延長を様々な
長さで停止させる能力に基づくものである．
【０００５】古典的な一段階Ｓａｎｇｅｒ法では，配列
決定は４つの別個の試験管のセット内で行われ，それぞ
れが４種類のすべての正常なｄＮＴＰを含有するがその
１種類だけはオートラジオグラフィーによる位置決定の
ために放射性同位元素３２Ｐまたは３５Ｓで標識されて
いて，さらに４種類のｄｄＮＴＰ中の一つの制限量，Ｄ
ＮＡポリメラーゼ，プライマーおよび配列を決定すべき
ＤＮＡ鋳型を含有する．ＤＮＡポリメラーゼの活性の結
果として個々のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体
が新たなＤＮＡ鎖に付加され，この場合，すべてプライ
マーの３’末端から５’−３’方向に開始され，それぞ
れが鋳型のＤＮＡ配列に相補性の塩基配列でホスホジエ
ステル結合により隣接ヌクレオチドと連結する．反応混
合物中にヌクレオチド類縁体が存在する限り，各試験管
は最終的にすべてがＡ，Ｃ，ＧまたはＴターミネーター
と呼ばれる特定のｄｄＮＴＰで終結する多数の新たに形
成された様々の長さのＤＮＡ鎖を含有する．
決定は４つの別個の試験管のセット内で行われ，それぞ
れが４種類のすべての正常なｄＮＴＰを含有するがその
１種類だけはオートラジオグラフィーによる位置決定の
ために放射性同位元素３２Ｐまたは３５Ｓで標識されて
いて，さらに４種類のｄｄＮＴＰ中の一つの制限量，Ｄ
ＮＡポリメラーゼ，プライマーおよび配列を決定すべき
ＤＮＡ鋳型を含有する．ＤＮＡポリメラーゼの活性の結
果として個々のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体
が新たなＤＮＡ鎖に付加され，この場合，すべてプライ
マーの３’末端から５’−３’方向に開始され，それぞ
れが鋳型のＤＮＡ配列に相補性の塩基配列でホスホジエ
ステル結合により隣接ヌクレオチドと連結する．反応混
合物中にヌクレオチド類縁体が存在する限り，各試験管
は最終的にすべてがＡ，Ｃ，ＧまたはＴターミネーター
と呼ばれる特定のｄｄＮＴＰで終結する多数の新たに形
成された様々の長さのＤＮＡ鎖を含有する．
【０００６】４セットの反応産物を高分解ポリアクリル
アミド／尿素ゲル電気泳動によって分割したのち，新た
に形成されたＤＮＡ鎖の集団をそれらの分子量に応じて
分離しグループ化する．ゲルのオートラジオグラフィー
像が，すべて同一プライマーを有し，特定のｄｄＮＴＰ
（Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ）で停止されたこれらのＤＮＡ鎖
の相対的位置を，１ヌクレオチドずつの長さで測定され
る距離で互いに異なるバンドとして示すことになる．こ
れらのバンドの相対的位置をオートラジオグラフの「ラ
ダー」内で読み取ることによって，鋳型のＤＮＡ配列を
推定することができる．
アミド／尿素ゲル電気泳動によって分割したのち，新た
に形成されたＤＮＡ鎖の集団をそれらの分子量に応じて
分離しグループ化する．ゲルのオートラジオグラフィー
像が，すべて同一プライマーを有し，特定のｄｄＮＴＰ
（Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ）で停止されたこれらのＤＮＡ鎖
の相対的位置を，１ヌクレオチドずつの長さで測定され
る距離で互いに異なるバンドとして示すことになる．こ
れらのバンドの相対的位置をオートラジオグラフの「ラ
ダー」内で読み取ることによって，鋳型のＤＮＡ配列を
推定することができる．
【０００７】反応混合物中に使用されるＤＮＡポリメラ
ーゼはＤＮＡの配列決定分析において中心的な役割を果
たす．ＤＮＡの配列決定に有用であるためには，ＤＮＡ
ポリメラーゼはある種の必須の性質をもっていなければ
ならない．たとえば，それは天然の５’−３’エキソヌ
クレアーゼ活性が突然変異誘発または酵素消化のような
翻訳後修飾によって除去されていなければならず，また
ｄｄＮＴＰに対する過度の識別性を示さず，ＤＮＡ鎖か
ら除去されることなく連続的にその鎖上にヌクレオチド
を重合させる酵素の能力を意味する十分に高い連続処理
能と，十分に高い伸長速度によってｄＮＴＰおよびｄｄ
ＮＴＰを取り込むことができるものでなければならな
い．ＤＮＡポリメラーゼに伴う５’−３’エキソヌクレ
アーゼ活性はプライマーからヌクレオチドを除去し，し
たがって，新たに形成されたＤＮＡ鎖の異種５’末端の
原因となり，配列決定ゲル上の鎖長の誤った読みを生じ
ることになる．連続処理能が低く伸長速度が遅いＤＮＡ
ポリメラーゼでは，誤った長さおよび不適当な終結で形
成されるＤＮＡ鎖の存在により，放射能をもつ多くの望
ましくないバックグランドバンドのノイズが生じること
になる．一般的によく使用されるＤＮＡポリメラーゼの
中では，シークェナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）が，他
のたとえばクレノウフラグメント，Ｔａｑ，およびＶｅ
ｎｔポリメラーゼ（２）よりも高い連続処理能および高
い伸長速度を有し，したがって現在のところＤＮＡの配
列決定に選択される最も一般的なＤＮＡポリメラーゼで
ある．
ーゼはＤＮＡの配列決定分析において中心的な役割を果
たす．ＤＮＡの配列決定に有用であるためには，ＤＮＡ
ポリメラーゼはある種の必須の性質をもっていなければ
ならない．たとえば，それは天然の５’−３’エキソヌ
クレアーゼ活性が突然変異誘発または酵素消化のような
翻訳後修飾によって除去されていなければならず，また
ｄｄＮＴＰに対する過度の識別性を示さず，ＤＮＡ鎖か
ら除去されることなく連続的にその鎖上にヌクレオチド
を重合させる酵素の能力を意味する十分に高い連続処理
能と，十分に高い伸長速度によってｄＮＴＰおよびｄｄ
ＮＴＰを取り込むことができるものでなければならな
い．ＤＮＡポリメラーゼに伴う５’−３’エキソヌクレ
アーゼ活性はプライマーからヌクレオチドを除去し，し
たがって，新たに形成されたＤＮＡ鎖の異種５’末端の
原因となり，配列決定ゲル上の鎖長の誤った読みを生じ
ることになる．連続処理能が低く伸長速度が遅いＤＮＡ
ポリメラーゼでは，誤った長さおよび不適当な終結で形
成されるＤＮＡ鎖の存在により，放射能をもつ多くの望
ましくないバックグランドバンドのノイズが生じること
になる．一般的によく使用されるＤＮＡポリメラーゼの
中では，シークェナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）が，他
のたとえばクレノウフラグメント，Ｔａｑ，およびＶｅ
ｎｔポリメラーゼ（２）よりも高い連続処理能および高
い伸長速度を有し，したがって現在のところＤＮＡの配
列決定に選択される最も一般的なＤＮＡポリメラーゼで
ある．
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら，ＤＮＡ
ポリメラーゼが上に挙げたすべての必須の性質を備えて
いた場合でさえなお，配列決定ゲル中に放射能をもつ誤
ったまたは紛らわしいバンドパターンを発生することが
ある．これらのアーチファクトによるパターンは配列を
決定すべき鋳型の真のヌクレオチド配列を忠実に反映し
ない．これらは，たとえば回文配列を含有する領域また
はＧおよびＣ塩基に富む領域における「ヘアピン」のよ
うな鋳型に沿って形成される二次構造の存在による伸長
鎖の熟成前の終結によって起こることがあり（３），ま
た伸長鎖の３’末端に誤って導入されたヌクレオチドの
除去を可能にするＤＮＡポリメラーゼの「プルーフリー
ディング」機能が不適当であった結果として起こること
がある．
ポリメラーゼが上に挙げたすべての必須の性質を備えて
いた場合でさえなお，配列決定ゲル中に放射能をもつ誤
ったまたは紛らわしいバンドパターンを発生することが
ある．これらのアーチファクトによるパターンは配列を
決定すべき鋳型の真のヌクレオチド配列を忠実に反映し
ない．これらは，たとえば回文配列を含有する領域また
はＧおよびＣ塩基に富む領域における「ヘアピン」のよ
うな鋳型に沿って形成される二次構造の存在による伸長
鎖の熟成前の終結によって起こることがあり（３），ま
た伸長鎖の３’末端に誤って導入されたヌクレオチドの
除去を可能にするＤＮＡポリメラーゼの「プルーフリー
ディング」機能が不適当であった結果として起こること
がある．
【０００９】ＤＮＡ配列決定の分野の研究者は，これら
のあり得る誤った配列データによる間違いを回避するた
め，彼らの知見を確認する幾つかのアプローチを用いな
ければならないことが多い．たとえば別のＤＮＡポリメ
ラーゼによって同じ配列決定実験を反復するかまたは最
初の一本鎖ＤＮＡ鋳型に相補性の鋳型によって別の配列
決定反応を実施し不一致がないか結果を比較することに
よる場合がある．
のあり得る誤った配列データによる間違いを回避するた
め，彼らの知見を確認する幾つかのアプローチを用いな
ければならないことが多い．たとえば別のＤＮＡポリメ
ラーゼによって同じ配列決定実験を反復するかまたは最
初の一本鎖ＤＮＡ鋳型に相補性の鋳型によって別の配列
決定反応を実施し不一致がないか結果を比較することに
よる場合がある．
【００１０】酵素的配列決定に理想的なＤＮＡポリメラ
ーゼ，すなわち配列決定反応に要求される必須の性質を
すべてもつのみでなく．二次ヘアピン構造を解消し，配
列決定される鋳型と非相補性のヌクレオチドを含有する
鎖の形成を防止できるＤＮＡポリメラーゼの発見が多く
の研究者によって試みられてきた．
ーゼ，すなわち配列決定反応に要求される必須の性質を
すべてもつのみでなく．二次ヘアピン構造を解消し，配
列決定される鋳型と非相補性のヌクレオチドを含有する
鎖の形成を防止できるＤＮＡポリメラーゼの発見が多く
の研究者によって試みられてきた．
【００１１】Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓから単離されたＤＮＡポリメラーゼの
熱安定性大フラグメント，２５℃〜７５℃の温度範囲で
機能性を有するが６５℃で最も活性が高く，ＤＮＡの配
列決定に必須の性質すべてを有する酵素のＹｅ＆Ｈｏｎ
ｇ（３）による発見は，配列決定反応を６５℃で実施し
た場合これらの二次構造は不安定化されるので，鋳型内
の二次構造によって起こる問題をほとんど解決した．こ
の酵素がＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの商品名（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で市販されて以
来過去５年間に，この酵素によって触媒される配列決定
反応時にはｄＣＴＰを含む４つのすべてのｄＮＴＰおよ
び他のヌクレオチド類縁体たとえばｄＩＴＰおよび７−
デアザ−ｄＧＴＰが鎖の延長内に同様に効率的に取り込
まれ，したがって，他のＤＮＡポリメラーゼが用いられ
た場合にしばしば認められる弱い「Ｃ」バンド現象が消
失し，配列決定ゲル上にきわめて良好なバンドの均質性
を生じることが独立の複数の報告によって確認されてき
た．さらに，この高温におけるＢｓｔＤＮＡポリメラー
ゼ系は，古典的なＳａｎｇｅｒ一段階反応，ならびに
「標識／ターミネーション」配列決定反応，二重鎖ＤＮ
Ａ配列決定の両者に，また３５Ｓ標識ヌクレオチドおよ
び３２Ｐ標識ヌクレオチドの導入に使用できることも確
立された．この系はその酵素活性の有意な喪失なく少な
くとも２週間室温に保存することができるので，蛍光染
料または放射性同位元素標識を用いて，安定なＤＮＡポ
リメラーゼを要求するＤＮＡ配列決定の自動化に適用さ
れてきた．
ｍｏｐｈｉｌｕｓから単離されたＤＮＡポリメラーゼの
熱安定性大フラグメント，２５℃〜７５℃の温度範囲で
機能性を有するが６５℃で最も活性が高く，ＤＮＡの配
列決定に必須の性質すべてを有する酵素のＹｅ＆Ｈｏｎ
ｇ（３）による発見は，配列決定反応を６５℃で実施し
た場合これらの二次構造は不安定化されるので，鋳型内
の二次構造によって起こる問題をほとんど解決した．こ
の酵素がＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの商品名（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で市販されて以
来過去５年間に，この酵素によって触媒される配列決定
反応時にはｄＣＴＰを含む４つのすべてのｄＮＴＰおよ
び他のヌクレオチド類縁体たとえばｄＩＴＰおよび７−
デアザ−ｄＧＴＰが鎖の延長内に同様に効率的に取り込
まれ，したがって，他のＤＮＡポリメラーゼが用いられ
た場合にしばしば認められる弱い「Ｃ」バンド現象が消
失し，配列決定ゲル上にきわめて良好なバンドの均質性
を生じることが独立の複数の報告によって確認されてき
た．さらに，この高温におけるＢｓｔＤＮＡポリメラー
ゼ系は，古典的なＳａｎｇｅｒ一段階反応，ならびに
「標識／ターミネーション」配列決定反応，二重鎖ＤＮ
Ａ配列決定の両者に，また３５Ｓ標識ヌクレオチドおよ
び３２Ｐ標識ヌクレオチドの導入に使用できることも確
立された．この系はその酵素活性の有意な喪失なく少な
くとも２週間室温に保存することができるので，蛍光染
料または放射性同位元素標識を用いて，安定なＤＮＡポ
リメラーゼを要求するＤＮＡ配列決定の自動化に適用さ
れてきた．
【００１２】現在本技術分野において知られているＢｓ
ｔ ＤＮＡポリメラーゼの一つの問題は，それが３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くこと（５），とくに
プルーフリーディング３’−５’エキソヌクレアーゼ活
性を欠くことである．このＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを
１２０を越えるＤＮＡクローンのＤＮＡ配列決定研究に
使用してきた１４の研究センターから収集した配列決定
データを調査したところ，塩基対のミスマッチは統計的
に約１．５Ｘ１０−５の割合で起こることが明らかにさ
れた．すなわち，この酵素によって触媒されるヌクレオ
チドの重合時には，１００，０００回のヌクレオチド導
入について約１．５回の誤りが期待される．
ｔ ＤＮＡポリメラーゼの一つの問題は，それが３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くこと（５），とくに
プルーフリーディング３’−５’エキソヌクレアーゼ活
性を欠くことである．このＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを
１２０を越えるＤＮＡクローンのＤＮＡ配列決定研究に
使用してきた１４の研究センターから収集した配列決定
データを調査したところ，塩基対のミスマッチは統計的
に約１．５Ｘ１０−５の割合で起こることが明らかにさ
れた．すなわち，この酵素によって触媒されるヌクレオ
チドの重合時には，１００，０００回のヌクレオチド導
入について約１．５回の誤りが期待される．
【００１３】ＤＮＡ配列の決定に際しての，鋳型と成長
するヌクレオチド鎖の間の塩基対のミスマッチによる正
しくないＤＮＡ配列の形成は，ヌクレオチド鎖を「プル
ーフリーディング」を行う３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性によって防止できることは一般的に知られてい
る．しかしながら，ＤＮＡポリメラーゼがインビトロに
おいて３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示したとし
ても，そのポリメラーゼが適切に「プルーフリーディン
グ」をしない場合が多い．すなわち，ポリメラーゼは鋳
型のヌクレオチドと正しくマッチしたヌクレオチドの場
合と同様に効率的には新たに形成されたＤＮＡ鎖からミ
スマッチしたヌクレオチドを除去できない．換言すれ
ば，３’−５’エキソヌクレアーゼは，３’末端からミ
スマッチしたヌクレオチドよりも速い速度で正しくマッ
チしたヌクレオチドを切断するか，あるいは正しくマッ
チしたヌクレオチドとミスマッチしたヌクレオチドの両
者を同じ速度で切断する．その結果，ＤＮＡポリメラー
ゼが３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をもっている場
合でも，ＤＮＡの重合時に有用なプルーフリーディング
機能が発揮されないのである．
するヌクレオチド鎖の間の塩基対のミスマッチによる正
しくないＤＮＡ配列の形成は，ヌクレオチド鎖を「プル
ーフリーディング」を行う３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性によって防止できることは一般的に知られてい
る．しかしながら，ＤＮＡポリメラーゼがインビトロに
おいて３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示したとし
ても，そのポリメラーゼが適切に「プルーフリーディン
グ」をしない場合が多い．すなわち，ポリメラーゼは鋳
型のヌクレオチドと正しくマッチしたヌクレオチドの場
合と同様に効率的には新たに形成されたＤＮＡ鎖からミ
スマッチしたヌクレオチドを除去できない．換言すれ
ば，３’−５’エキソヌクレアーゼは，３’末端からミ
スマッチしたヌクレオチドよりも速い速度で正しくマッ
チしたヌクレオチドを切断するか，あるいは正しくマッ
チしたヌクレオチドとミスマッチしたヌクレオチドの両
者を同じ速度で切断する．その結果，ＤＮＡポリメラー
ゼが３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をもっている場
合でも，ＤＮＡの重合時に有用なプルーフリーディング
機能が発揮されないのである．
【００１４】また，ＤＮＡポリメラーゼに伴う３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性は，低濃度のｄＮＴＰの存
在下には，ポリメラーゼによって触媒される正規の鎖伸
長過程に反作用することが多く，鋳型の同じセグメント
上でヌクレオチドの環状の取り込みや減成を誘発する
か，もしくはプライマーの分解を起こす程度にポリメラ
ーゼ活性自体より効率的に機能することさえあることが
知られている．したがって，ネイティブなＤＮＡポリメ
ラーゼから，化学的手段または遺伝子操作技術によって
５’−３’エキソヌクレアーゼ活性とともに３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性を除去することは，配列決定用
のＤＮＡポリメラーゼの製造においては標準的な操作と
なっている．これはＤＮＡポリメラーゼの必須の性質を
保存するための共通した戦略である．
５’エキソヌクレアーゼ活性は，低濃度のｄＮＴＰの存
在下には，ポリメラーゼによって触媒される正規の鎖伸
長過程に反作用することが多く，鋳型の同じセグメント
上でヌクレオチドの環状の取り込みや減成を誘発する
か，もしくはプライマーの分解を起こす程度にポリメラ
ーゼ活性自体より効率的に機能することさえあることが
知られている．したがって，ネイティブなＤＮＡポリメ
ラーゼから，化学的手段または遺伝子操作技術によって
５’−３’エキソヌクレアーゼ活性とともに３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性を除去することは，配列決定用
のＤＮＡポリメラーゼの製造においては標準的な操作と
なっている．これはＤＮＡポリメラーゼの必須の性質を
保存するための共通した戦略である．
【００１５】たとえば，主要な市販の配列決定用酵素
［最初から３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くネ
イティブなＴａｑ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕ
ｓ）ＤＮＡポリメラーゼ以外］の中では，５’−３’エ
キソヌクレアーゼ活性を欠くネイティブなＴ７ＤＮＡポ
リメラーゼから３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が，
エキソヌクレアーゼ活性に必須のアミノ酸残基を酸化す
る化学反応により（シークェナーゼ１型）または３’
５’エキソヌクレアーゼ活性に必須の２８アミノ酸を欠
失させる遺伝子操作により（シークェナーゼ２型）除去
されている．
［最初から３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くネ
イティブなＴａｑ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕ
ｓ）ＤＮＡポリメラーゼ以外］の中では，５’−３’エ
キソヌクレアーゼ活性を欠くネイティブなＴ７ＤＮＡポ
リメラーゼから３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が，
エキソヌクレアーゼ活性に必須のアミノ酸残基を酸化す
る化学反応により（シークェナーゼ１型）または３’
５’エキソヌクレアーゼ活性に必須の２８アミノ酸を欠
失させる遺伝子操作により（シークェナーゼ２型）除去
されている．
【００１６】Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼの配列決定
用に好ましい型として推奨されているＶｅｎｔＲ（ｅｘ
ｏ−）ＤＮＡポリメラーゼもまた，その３’−５’エキ
ソヌクレアーゼ活性が遺伝子修飾により除去されてい
る．ネイティブなＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼおよび
ネイティブな大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩから単離され
るクレノウフラグメントは３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性をもっているが，これらの酵素はもうＤＮＡ配列
決定に選択される酵素として考慮されることはない．
用に好ましい型として推奨されているＶｅｎｔＲ（ｅｘ
ｏ−）ＤＮＡポリメラーゼもまた，その３’−５’エキ
ソヌクレアーゼ活性が遺伝子修飾により除去されてい
る．ネイティブなＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼおよび
ネイティブな大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩから単離され
るクレノウフラグメントは３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性をもっているが，これらの酵素はもうＤＮＡ配列
決定に選択される酵素として考慮されることはない．
【００１７】Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓの細胞から配列決定用に単離精製され
た，最近知られたＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（たとえ
ばＢｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって製
造されている）は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を
もっていない（５）．
ｍｏｐｈｉｌｕｓの細胞から配列決定用に単離精製され
た，最近知られたＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（たとえ
ばＢｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって製
造されている）は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を
もっていない（５）．
【００１８】Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ（１４０２ Ｅｍｉｌ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉ
ｓｏｎ，ＷＩ ５３７１３）によって市場に出され，市
販品を入手できるＤＮＡ配列決定用Ｂｓｔ ＤＮＡポリ
メラーゼであるＩｓｏＴｅｒｍ（登録商標）も３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性が酵素的に除去されたＢｓ
ｔ ＤＮＡポリメラーゼ（６）に基づくものである．
ｉｅｓ（１４０２ Ｅｍｉｌ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｍａｄｉ
ｓｏｎ，ＷＩ ５３７１３）によって市場に出され，市
販品を入手できるＤＮＡ配列決定用Ｂｓｔ ＤＮＡポリ
メラーゼであるＩｓｏＴｅｒｍ（登録商標）も３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性が酵素的に除去されたＢｓ
ｔ ＤＮＡポリメラーゼ（６）に基づくものである．
【００１９】Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ のＤＮＡ ｐｏｌＩ遺伝子の産物で
あり，大腸菌内で過剰発現組み換えクローンから産生さ
れるｒＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼのみが，５’−３’
エキソヌクレアーゼ活性に加えて３’−５’エキソヌク
レアーゼ活性を有する．しかしながら，望ましくない
５’−３’エキソヌクレアーゼ活性と性質不明の３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性の存在のために，後者の製
品はその会社によりＤＮＡ配列決定用としては推薦され
ていない（６）．
ｍｏｐｈｉｌｕｓ のＤＮＡ ｐｏｌＩ遺伝子の産物で
あり，大腸菌内で過剰発現組み換えクローンから産生さ
れるｒＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼのみが，５’−３’
エキソヌクレアーゼ活性に加えて３’−５’エキソヌク
レアーゼ活性を有する．しかしながら，望ましくない
５’−３’エキソヌクレアーゼ活性と性質不明の３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性の存在のために，後者の製
品はその会社によりＤＮＡ配列決定用としては推薦され
ていない（６）．
【００２０】
【課題を解決するための手段】本発明は，プルーフリー
ディング３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が作動可能
な新規ＤＮＡポリメラーゼを提供することによって，本
技術分野における上述の問題を処理するものである．本
発明において「プルーフリーディング」の語は，ＤＮＡ
配列決定時にＤＮＡポリメラーゼが，新たに形成された
ＤＮＡ鎖の３’末端からミスマッチしたヌクレオチド
を，鋳型のヌクレオチドと正しくマッチしたヌクレオチ
ドが除去される速度より速い速度で除去できることを意
味する．とくに本発明はこの機能を有する単離および精
製されたＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡおよびアミノ酸配
列，ならびにこの機能を有するクローン化および発現Ｄ
ＮＡポリメラーゼのＤＮＡおよびアミノ酸配列を提供す
る
ディング３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が作動可能
な新規ＤＮＡポリメラーゼを提供することによって，本
技術分野における上述の問題を処理するものである．本
発明において「プルーフリーディング」の語は，ＤＮＡ
配列決定時にＤＮＡポリメラーゼが，新たに形成された
ＤＮＡ鎖の３’末端からミスマッチしたヌクレオチド
を，鋳型のヌクレオチドと正しくマッチしたヌクレオチ
ドが除去される速度より速い速度で除去できることを意
味する．とくに本発明はこの機能を有する単離および精
製されたＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡおよびアミノ酸配
列，ならびにこの機能を有するクローン化および発現Ｄ
ＮＡポリメラーゼのＤＮＡおよびアミノ酸配列を提供す
る
【００２１】本発明はまた，上述のＤＮＡ配列の少なく
とも１つおよびベクター（たとえばクローニングベクタ
ーまたは発現ベクター）からなる，そのＤＮＡ構築体を
真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞（たとえば大
腸菌宿主細胞）内に導入するためのＤＮＡ構築体を提供
する．さらに本発明は，そのＤＮＡ構築体により，その
構築体中のＤＮＡセグメントによってコードされたペプ
チドの産生が可能な様式で安定にトランスフォームされ
た宿主細胞を提供する．
とも１つおよびベクター（たとえばクローニングベクタ
ーまたは発現ベクター）からなる，そのＤＮＡ構築体を
真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞（たとえば大
腸菌宿主細胞）内に導入するためのＤＮＡ構築体を提供
する．さらに本発明は，そのＤＮＡ構築体により，その
構築体中のＤＮＡセグメントによってコードされたペプ
チドの産生が可能な様式で安定にトランスフォームされ
た宿主細胞を提供する．
【００２２】本発明はまた，本発明の上述のＤＮＡポリ
メラーゼを用いて，ＤＮＡの複製およびＤＮＡの配列決
定の改良方法を提供する．
メラーゼを用いて，ＤＮＡの複製およびＤＮＡの配列決
定の改良方法を提供する．
【００２３】好ましくは，ＤＮＡ鎖の配列決定方法は， ｉ）プライマーを配列を決定するＤＮＡ鋳型にハイブリ
ダイズさせ， ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼとして，ＤＮＡ鎖の３’末端
からミスマッチしたヌクレオチドをそのＤＮＡポリメラ
ーゼが鋳型のヌクレオチドと正しくマッチしたヌクレオ
チドを除去する機能の速度より速い速度で切除するよう
に機能してプルーフリーディング３’−５’エキソヌク
レアーゼ活性を発揮することが可能で，またそのＤＮＡ
ポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を示
さないＤＮＡポリメラーゼを使用して，ヌクレオチド塩
基ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰまたは
それらの類縁体ならびにｄｄＮＴＰチェーンターミネー
ターの存在下に，プライマーを延長させ，ついで ｉｉｉ）ＤＮＡ鎖の配列を決定する工程からなる方法を
提供する．
ダイズさせ， ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼとして，ＤＮＡ鎖の３’末端
からミスマッチしたヌクレオチドをそのＤＮＡポリメラ
ーゼが鋳型のヌクレオチドと正しくマッチしたヌクレオ
チドを除去する機能の速度より速い速度で切除するよう
に機能してプルーフリーディング３’−５’エキソヌク
レアーゼ活性を発揮することが可能で，またそのＤＮＡ
ポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を示
さないＤＮＡポリメラーゼを使用して，ヌクレオチド塩
基ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰまたは
それらの類縁体ならびにｄｄＮＴＰチェーンターミネー
ターの存在下に，プライマーを延長させ，ついで ｉｉｉ）ＤＮＡ鎖の配列を決定する工程からなる方法を
提供する．
【００２４】本発明はまた，各種の起源から単離される
異なる細菌株，たとえば好熱生物体（すなわち Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）
において本発明のＤＮＡポリメラーゼをスクリーニング
する試験を提供する．
異なる細菌株，たとえば好熱生物体（すなわち Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）
において本発明のＤＮＡポリメラーゼをスクリーニング
する試験を提供する．
【００２５】本発明のその他の目的および利点は，以下
の説明および実施例から明らかであろう．
の説明および実施例から明らかであろう．
【００２６】
【発明の実施の態様】本発明のＤＮＡポリメラーゼは，
ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ鎖の３’末端からミスマッ
チしたヌクレオチドを，鋳型のヌクレオチドと正しくマ
ッチしたヌクレオチドが除去される速度より速い速度で
切除するように機能してプルーフリーディング３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を発揮することが作動可能
であり，またそのＤＮＡポリメラーゼは５’−３’エキ
ソヌクレアーゼ活性を示さない．
ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ鎖の３’末端からミスマッ
チしたヌクレオチドを，鋳型のヌクレオチドと正しくマ
ッチしたヌクレオチドが除去される速度より速い速度で
切除するように機能してプルーフリーディング３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を発揮することが作動可能
であり，またそのＤＮＡポリメラーゼは５’−３’エキ
ソヌクレアーゼ活性を示さない．
【００２７】本発明は，その一実施態様においては，Ｄ
ＮＡポリメラーゼの以下のＤＮＡ配列およびアミノ酸配
列を包含する．ＤＮＡ配列
ＮＡポリメラーゼの以下のＤＮＡ配列およびアミノ酸配
列を包含する．ＤＮＡ配列
【化２０】
【化２１】
【００２８】本発明はまた，それらに相補性であるＤＮ
Ａ配列，たとえば上記ＤＮＡに緊縮条件下にハイブリダ
イズするＤＮＡ配列を包含する（本技術分野の熟練者に
は明らかなように，このＤＮＡ配列は開始コドンを示さ
ない）．
Ａ配列，たとえば上記ＤＮＡに緊縮条件下にハイブリダ
イズするＤＮＡ配列を包含する（本技術分野の熟練者に
は明らかなように，このＤＮＡ配列は開始コドンを示さ
ない）．
【００２９】アミノ酸配列
【化２２】
【化２３】 式中， Ａ：アラニン（Ａｌａ） Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ） Ｃ：システイン（Ｃｙｓ） Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ） Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ） Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ） Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ） Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ） Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ） Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ） Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ） Ｓ：セリン（Ｓｅｒ） Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ） Ｔ：スレオニン（Ｔｈｒ） Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ） Ｖ：バリン（Ｖａｌ） Ｋ：リジン（Ｌｙｓ） Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ） Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ） Ｙ：チロシン（Ｔｙｒ） である．
【００３０】このＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は，た
とえば，上述のようにプルーフリーディング３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性を発揮できるが，５’−３’エ
キソヌクレアーゼ活性は示さないＤＮＡポリメラーゼを
産生可能な熱安定性Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ （または Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから別の方法
で誘導される細菌株もしくは他の好熱菌株）から，ＤＮ
Ａポリメラーゼを単離および精製することによって得ら
れる．本技術分野の一部の熟練者には理解されるよう
に，本発明はまた，これらの特徴および性質を有するペ
プチドをコードする任意のＤＮＡ（縮重ＤＮＡコードを
含む）をも意図するものである．
とえば，上述のようにプルーフリーディング３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性を発揮できるが，５’−３’エ
キソヌクレアーゼ活性は示さないＤＮＡポリメラーゼを
産生可能な熱安定性Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ （または Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから別の方法
で誘導される細菌株もしくは他の好熱菌株）から，ＤＮ
Ａポリメラーゼを単離および精製することによって得ら
れる．本技術分野の一部の熟練者には理解されるよう
に，本発明はまた，これらの特徴および性質を有するペ
プチドをコードする任意のＤＮＡ（縮重ＤＮＡコードを
含む）をも意図するものである．
【００３１】他の実施態様においては，本発明はＤＮＡ
ポリメラーゼの以下のようなＤＮＡ配列およびアミノ酸
配列を包含する．ＤＮＡ配列
ポリメラーゼの以下のようなＤＮＡ配列およびアミノ酸
配列を包含する．ＤＮＡ配列
【化２４】
【化２５】
【化２６】 本発明はまた，それらに相補性であるＤＮＡ配列，たと
えば上記ＤＮＡに緊縮条件下にハイブリダイズするＤＮ
Ａ配列を包含する．
えば上記ＤＮＡに緊縮条件下にハイブリダイズするＤＮ
Ａ配列を包含する．
【００３２】アミノ酸配列
【化２７】
【００３３】このＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は，た
とえば，上述のようにプルーフリーディング３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性を発揮できるが，５’−３’エ
キソヌクレアーゼ活性は示さない，クローン化され，発
現されたＤＮＡポリメラーゼから得ることができる．本
技術分野の一部の熟練者には理解されるように，本発明
のこの実施態様はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからクローン化および発現させる
かまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓから別の方法で誘導されるＤＮＡ配列およ
びアミノ酸配列のみを意図するものではなく，上述のよ
うに，ＤＮＡポリメラーゼであって，ＤＮＡ鎖の３’末
端からミスマッチしたヌクレオチドを，そのＤＮＡポリ
メラーゼが鋳型のヌクレオチドと正しくマッチしたヌク
レオチドを除去する機能の速度より速い速度で切除する
ように機能してプルーフリーディング３’−５’エキソ
ヌクレアーゼ活性を発揮することが可能であり，また
５’−３’エキソヌクレアーゼ活性は示さないＤＮＡポ
リメラーゼをコードする任意のアミノ酸配列も意図する
ものである．本発明はまた，これらの特徴および性質を
有するペプチドをコードする任意のＤＮＡ（縮重ＤＮＡ
コードを含む）も意図するものである．
とえば，上述のようにプルーフリーディング３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性を発揮できるが，５’−３’エ
キソヌクレアーゼ活性は示さない，クローン化され，発
現されたＤＮＡポリメラーゼから得ることができる．本
技術分野の一部の熟練者には理解されるように，本発明
のこの実施態様はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからクローン化および発現させる
かまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓから別の方法で誘導されるＤＮＡ配列およ
びアミノ酸配列のみを意図するものではなく，上述のよ
うに，ＤＮＡポリメラーゼであって，ＤＮＡ鎖の３’末
端からミスマッチしたヌクレオチドを，そのＤＮＡポリ
メラーゼが鋳型のヌクレオチドと正しくマッチしたヌク
レオチドを除去する機能の速度より速い速度で切除する
ように機能してプルーフリーディング３’−５’エキソ
ヌクレアーゼ活性を発揮することが可能であり，また
５’−３’エキソヌクレアーゼ活性は示さないＤＮＡポ
リメラーゼをコードする任意のアミノ酸配列も意図する
ものである．本発明はまた，これらの特徴および性質を
有するペプチドをコードする任意のＤＮＡ（縮重ＤＮＡ
コードを含む）も意図するものである．
【００３４】上述の２つのＤＮＡ配列を比較することに
より明らかなように，第一のＤＮＡ配列（熱安定性Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
からＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを単離および精製する
ことにより得られる）は開始コドンを包含しないが，開
始コドンは過度に複雑な実験によらないで容易に付加す
ることができる．しかしながら，第二のＤＮＡ配列（熱
安定性 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓからＢｓｔＤＮＡポリメラーゼをクローン
化および発現させて得られる）は開始コドンを包含して
いる．さらに，第二のＤＮＡ配列は位置１０にヌクレオ
チドＡ（アデニン）を有し［第一のＤＮＡ配列における
位置４のヌクレオチドＧ（グアニン）に対して］，これ
によりＤＮＡポリメラーゼの高発現を生じる．
より明らかなように，第一のＤＮＡ配列（熱安定性Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
からＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを単離および精製する
ことにより得られる）は開始コドンを包含しないが，開
始コドンは過度に複雑な実験によらないで容易に付加す
ることができる．しかしながら，第二のＤＮＡ配列（熱
安定性 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓからＢｓｔＤＮＡポリメラーゼをクローン
化および発現させて得られる）は開始コドンを包含して
いる．さらに，第二のＤＮＡ配列は位置１０にヌクレオ
チドＡ（アデニン）を有し［第一のＤＮＡ配列における
位置４のヌクレオチドＧ（グアニン）に対して］，これ
によりＤＮＡポリメラーゼの高発現を生じる．
【００３５】本発明の精製およびクローン化ＤＮＡポリ
メラーゼいずれにも，上述のＤＮＡポリメラーゼの機能
またはそれらの性質には変化を生じない対立変異および
突然変異（たとえば，ヌクレオチドもしくはアミノ酸の
付加もしくは欠失，配列組換えもしくは置換または変
化）をも意図するものである．たとえば，ＤＮＡポリメ
ラーゼには，その機能性は変化しないヌクレオチドもし
くはアミノ酸の非臨界的置換（すなわち，トランスフォ
ームされた宿主細胞によって起こされるような変化）が
包含される．さらに，本発明は，本発明の独特なＤＮＡ
ポリメラーゼの融合タンパク質および突然変異タンパク
質を包含する意図である．
メラーゼいずれにも，上述のＤＮＡポリメラーゼの機能
またはそれらの性質には変化を生じない対立変異および
突然変異（たとえば，ヌクレオチドもしくはアミノ酸の
付加もしくは欠失，配列組換えもしくは置換または変
化）をも意図するものである．たとえば，ＤＮＡポリメ
ラーゼには，その機能性は変化しないヌクレオチドもし
くはアミノ酸の非臨界的置換（すなわち，トランスフォ
ームされた宿主細胞によって起こされるような変化）が
包含される．さらに，本発明は，本発明の独特なＤＮＡ
ポリメラーゼの融合タンパク質および突然変異タンパク
質を包含する意図である．
【００３６】本発明はまた，ＤＮＡポリメラーゼの機能
またはそれらの性質に変化を生じる変異体および突然変
異体も意図する．
またはそれらの性質に変化を生じる変異体および突然変
異体も意図する．
【００３７】本発明はまた，宿主細胞にＤＮＡ構築体を
導入するための，少なくとも１つの上述のＤＮＡ配列と
ベクター（たとえば，クローニングベクターまたは発現
ベクター）からなるＤＮＡ構築体を提供する．適当なベ
クターの例には以下に説明するｐＹＺ３４／ＬＦがあ
る．
導入するための，少なくとも１つの上述のＤＮＡ配列と
ベクター（たとえば，クローニングベクターまたは発現
ベクター）からなるＤＮＡ構築体を提供する．適当なベ
クターの例には以下に説明するｐＹＺ３４／ＬＦがあ
る．
【００３８】宿主細胞は，ＤＮＡ構築体中のＤＮＡセグ
メントによってコードされるペプチドの産生（好ましく
は大量生産）を可能にする様式で，その構築体により安
定にトランスフォームできることのみが必要である．宿
主細胞は真核生物または原核生物起源（たとえば大腸菌
宿主細胞）とすることができる．たとえば，宿主細胞は
好熱性生物体とすることができるが，これは宿主細胞が
有効であるために必須の要求ではない．
メントによってコードされるペプチドの産生（好ましく
は大量生産）を可能にする様式で，その構築体により安
定にトランスフォームできることのみが必要である．宿
主細胞は真核生物または原核生物起源（たとえば大腸菌
宿主細胞）とすることができる．たとえば，宿主細胞は
好熱性生物体とすることができるが，これは宿主細胞が
有効であるために必須の要求ではない．
【００３９】本発明はまた，上述のＤＮＡポリメラーゼ
を使用するＤＮＡ複製の改良方法を提供する．これらの
方法は慣用のプロトコールにより，ヌクレオチドｄＡＴ
Ｐ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰまたはそれらの
類縁体ならびにｄｄＮＴＰチェーンターミネーターの存
在下に上述のＤＮＡポリメラーゼを用いる点を改変した
ＤＮＡ複製を包含する．
を使用するＤＮＡ複製の改良方法を提供する．これらの
方法は慣用のプロトコールにより，ヌクレオチドｄＡＴ
Ｐ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰまたはそれらの
類縁体ならびにｄｄＮＴＰチェーンターミネーターの存
在下に上述のＤＮＡポリメラーゼを用いる点を改変した
ＤＮＡ複製を包含する．
【００４０】本発明はまた，上述のＤＮＡポリメラーゼ
を用いるＤＮＡ配列決定の改良方法を提供する．これら
の方法は慣用のプロトコールにより，以下の改変，すな
わち ｉ）プライマーを配列を決定するＤＮＡ鋳型にハイブリ
ダイズさせ， ｉｉ）ヌクレオチドｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰおよ
びｄＴＴＰまたはそれらの類縁体，ならびにｄｄＮＴＰ
チェーンターミネーターの存在下，上述のＤＮＡポリメ
ラーゼを用いてプライマーを延長させ，ついで ｉｉｉ）ＤＮＡ鎖の配列を決定することによるＤＮＡ鎖
の配列の決定方法を包含する．
を用いるＤＮＡ配列決定の改良方法を提供する．これら
の方法は慣用のプロトコールにより，以下の改変，すな
わち ｉ）プライマーを配列を決定するＤＮＡ鋳型にハイブリ
ダイズさせ， ｉｉ）ヌクレオチドｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰおよ
びｄＴＴＰまたはそれらの類縁体，ならびにｄｄＮＴＰ
チェーンターミネーターの存在下，上述のＤＮＡポリメ
ラーゼを用いてプライマーを延長させ，ついで ｉｉｉ）ＤＮＡ鎖の配列を決定することによるＤＮＡ鎖
の配列の決定方法を包含する．
【００４１】さらに，本発明はＤＮＡポリメラーゼの他
の使用を意図する．たとえば，このＤＮＡポリメラーゼ
は（１）ＤＮＡフラグメントの５’オーバーハングの充
填，（２）ランダムプライマー標識法によるＤＮＡプロ
ーブの合成，および（３）部位特異的突然変異誘発に使
用することができる．
の使用を意図する．たとえば，このＤＮＡポリメラーゼ
は（１）ＤＮＡフラグメントの５’オーバーハングの充
填，（２）ランダムプライマー標識法によるＤＮＡプロ
ーブの合成，および（３）部位特異的突然変異誘発に使
用することができる．
【００４２】本発明のＤＮＡポリメラーゼは，ＤＮＡ配
列決定のための，プルーフリーディング３’−５’エキ
ソヌクレアーゼ活性を有する細菌性ＤＮＡポリメラーゼ
をスクリーニングし同定する本技術分野における慣用方
法を用いて得ることができる．好ましくは，本発明のＤ
ＮＡポリメラーゼは Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから抽出するか，または Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ もしくは他の好熱性生物体から他の方法で誘導され
る．たとえば，ポリメラーゼは Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの株をそれらの各
ＤＮＡポリメラーゼのプルーフリーディングエキソヌク
レアーゼ活性に従って異なる群に分離することによって
得ることができる．
列決定のための，プルーフリーディング３’−５’エキ
ソヌクレアーゼ活性を有する細菌性ＤＮＡポリメラーゼ
をスクリーニングし同定する本技術分野における慣用方
法を用いて得ることができる．好ましくは，本発明のＤ
ＮＡポリメラーゼは Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから抽出するか，または Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ もしくは他の好熱性生物体から他の方法で誘導され
る．たとえば，ポリメラーゼは Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの株をそれらの各
ＤＮＡポリメラーゼのプルーフリーディングエキソヌク
レアーゼ活性に従って異なる群に分離することによって
得ることができる．
【００４３】本技術分野の一部の熟練者には理解される
ように，本発明のＤＮＡポリメラーゼは Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ 以外の
他の細菌株とくに好熱菌からも取得または製造すること
ができた．たとえば，本明細書に記載のプライマーおよ
びスクリーニング方法を用いれば，本技術分野の一部の
熟練者には同じ性質および機能を有するＤＮＡポリメラ
ーゼを他の株から単離することができよう．
ように，本発明のＤＮＡポリメラーゼは Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ 以外の
他の細菌株とくに好熱菌からも取得または製造すること
ができた．たとえば，本明細書に記載のプライマーおよ
びスクリーニング方法を用いれば，本技術分野の一部の
熟練者には同じ性質および機能を有するＤＮＡポリメラ
ーゼを他の株から単離することができよう．
【００４４】一例として本発明者らは，Ｂｓｔ株（分類
の目的ではＢｓｔ３２０と呼ばれる）の細胞から熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼの精製に成功し，これからズブチ
リシン消化によって５’−３’エキソヌクレアーゼ活性
が除去された．得られた酵素は，伸長中のＤＮＡ鎖から
ミスマッチしたヌクレオチドを，鋳型と正しくマッチし
たヌクレオチドの場合より速い速度で除去するプルーフ
リーディング３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をもっ
ていた．この新しい酵素は３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性をもたない本技術分野で既知のＢｓｔ ＤＮＡポ
リメラーゼとは識別可能である．Ｂｓｔ３２０は１９９
５年１０月３０日付でＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１２３０１ Ｐａ
ｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａ
ｒｙｌａｎｄ ２０８５２）に寄託され，ＡＴＣＣ寄託
番号５５７１９号が付与されている．
の目的ではＢｓｔ３２０と呼ばれる）の細胞から熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼの精製に成功し，これからズブチ
リシン消化によって５’−３’エキソヌクレアーゼ活性
が除去された．得られた酵素は，伸長中のＤＮＡ鎖から
ミスマッチしたヌクレオチドを，鋳型と正しくマッチし
たヌクレオチドの場合より速い速度で除去するプルーフ
リーディング３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をもっ
ていた．この新しい酵素は３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性をもたない本技術分野で既知のＢｓｔ ＤＮＡポ
リメラーゼとは識別可能である．Ｂｓｔ３２０は１９９
５年１０月３０日付でＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１２３０１ Ｐａ
ｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａ
ｒｙｌａｎｄ ２０８５２）に寄託され，ＡＴＣＣ寄託
番号５５７１９号が付与されている．
【００４５】本発明者らの一人によって明確に特徴づけ
られた既知のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（４）と同
様，本発明のＤＮＡポリメラーゼ（大フラグメント）は
見掛けの分子量約７５，０００ダルトンで，５’−３’
エキソヌクレアーゼ活性をもたない．本発明のポリメラ
ーゼは２５℃〜７５℃の間の温度で機能し，６５℃で最
も活性が高い．したがって，これらのポリメラーゼによ
れば，ＤＮＡの配列決定に際して一本鎖ＤＮＡ鋳型に伴
う二次構造の妨害を克服することができる．
られた既知のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（４）と同
様，本発明のＤＮＡポリメラーゼ（大フラグメント）は
見掛けの分子量約７５，０００ダルトンで，５’−３’
エキソヌクレアーゼ活性をもたない．本発明のポリメラ
ーゼは２５℃〜７５℃の間の温度で機能し，６５℃で最
も活性が高い．したがって，これらのポリメラーゼによ
れば，ＤＮＡの配列決定に際して一本鎖ＤＮＡ鋳型に伴
う二次構造の妨害を克服することができる．
【００４６】ｄＣＴＰを含む４つのすべてのｄＮＴＰ
が，高い連続処理能および高い伸長速度を有する本発明
のＤＮＡポリメラーゼによって触媒される配列決定反応
時に，鎖の伸長に同様に効率的に取り込まれる．他のＤ
ＮＡポリメラーゼを使用した場合にしばしば認められる
「薄いＣバンド」現象はない．さらに，この酵素は，ヌ
クレオチド類縁体，たとえばｄｄＮＴＰ，ｄＩＴＰおよ
び７−デアザｄＧＴＰを過度の識別性を示さずに取り込
むことが可能で，配列決定ゲルにきわめて良好なバンド
の均質性を生じる．
が，高い連続処理能および高い伸長速度を有する本発明
のＤＮＡポリメラーゼによって触媒される配列決定反応
時に，鎖の伸長に同様に効率的に取り込まれる．他のＤ
ＮＡポリメラーゼを使用した場合にしばしば認められる
「薄いＣバンド」現象はない．さらに，この酵素は，ヌ
クレオチド類縁体，たとえばｄｄＮＴＰ，ｄＩＴＰおよ
び７−デアザｄＧＴＰを過度の識別性を示さずに取り込
むことが可能で，配列決定ゲルにきわめて良好なバンド
の均質性を生じる．
【００４７】本発明のＤＮＡポリメラーゼは古典的なＳ
ａｎｇｅｒ一段階反応ならびに「標識／ターミネーショ
ン」配列決定反応，二重鎖ＤＮＡ配列決定の両者に，ま
た３ ５Ｓ標識ヌクレオチドおよび３２Ｐ標識ヌクレオチ
ドの導入に使用することができる．この酵素はその酵素
活性の有意な喪失を伴うことなく室温で少なくとも２週
間保存できるので，蛍光染料または放射性同位元素標識
を用いて，安定なＤＮＡポリメラーゼを要求するＤＮＡ
配列決定のロボットによる自動化に適用することが可能
である．
ａｎｇｅｒ一段階反応ならびに「標識／ターミネーショ
ン」配列決定反応，二重鎖ＤＮＡ配列決定の両者に，ま
た３ ５Ｓ標識ヌクレオチドおよび３２Ｐ標識ヌクレオチ
ドの導入に使用することができる．この酵素はその酵素
活性の有意な喪失を伴うことなく室温で少なくとも２週
間保存できるので，蛍光染料または放射性同位元素標識
を用いて，安定なＤＮＡポリメラーゼを要求するＤＮＡ
配列決定のロボットによる自動化に適用することが可能
である．
【００４８】本発明はまた，精製ＤＮＡポリメラーゼの
プルーフリーディング３’−５’エキソヌクレアーゼ活
性を測定するための方法を包含する．この方法は，高い
プルーフリーディング３’−５’エキソヌクレアーゼ活
性を有するＤＮＡポリメラーゼを産生する株を選択する
ために，多数の細菌株，たとえばＢａｃｉｌｌｕｓｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよび他の好熱菌株
をスクリーニングするのに有用である．たとえば，ＤＮ
Ａポリメラーゼのプルーフリーディング３’−５’エキ
ソヌクレアーゼ活性を試験する方法は，以下のように実
施された．
プルーフリーディング３’−５’エキソヌクレアーゼ活
性を測定するための方法を包含する．この方法は，高い
プルーフリーディング３’−５’エキソヌクレアーゼ活
性を有するＤＮＡポリメラーゼを産生する株を選択する
ために，多数の細菌株，たとえばＢａｃｉｌｌｕｓｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよび他の好熱菌株
をスクリーニングするのに有用である．たとえば，ＤＮ
Ａポリメラーゼのプルーフリーディング３’−５’エキ
ソヌクレアーゼ活性を試験する方法は，以下のように実
施された．
【００４９】以下の配列を有するＤＮＡプライマーおよ
び２種のＤＮＡ鋳型を，ＤＮＡシンセサイザーを用いて
化学的に合成した．
び２種のＤＮＡ鋳型を，ＤＮＡシンセサイザーを用いて
化学的に合成した．
【化２８】
【００５０】放射標識プライマーの製造には１μｌ（１
μｇ）のプライマー，５μｌ（５０μｇ）の鋳型
（ａ），１μｌ［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰ（８００ Ｃｉ
／ｍｍｏｌｅ）， １μｌ（７）ｄＧＴＰ（０．５ｍ
Ｍ），１μｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（１単
位），および１μｌの緩衝液（組成：５００ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−Ｃｌ， ｐＨ ９．０，および１５０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２）を試験管中で混合し，６５℃の水浴中で５分間
インキュベートした．混合物をアルカリ性変性ゲル電気
泳動に付した．２０−塩基ヌクレオチドを含む放射性バ
ンドを単離し，１ｍＭ ＥＤＴＡ含有１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−Ｃｌ緩衝液，ｐＨ８．０，１２μｌに溶解した．最
終生成物は以下の２０−塩基プライマーである．
μｇ）のプライマー，５μｌ（５０μｇ）の鋳型
（ａ），１μｌ［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰ（８００ Ｃｉ
／ｍｍｏｌｅ）， １μｌ（７）ｄＧＴＰ（０．５ｍ
Ｍ），１μｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（１単
位），および１μｌの緩衝液（組成：５００ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−Ｃｌ， ｐＨ ９．０，および１５０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２）を試験管中で混合し，６５℃の水浴中で５分間
インキュベートした．混合物をアルカリ性変性ゲル電気
泳動に付した．２０−塩基ヌクレオチドを含む放射性バ
ンドを単離し，１ｍＭ ＥＤＴＡ含有１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−Ｃｌ緩衝液，ｐＨ８．０，１２μｌに溶解した．最
終生成物は以下の２０−塩基プライマーである．
【化２９】
【００５１】放射標識プライマー−鋳型複合体の製造に
は，５μｌの標識プライマーをそれぞれ１０μｌの鋳型
（ａ）または鋳型（ｂ）と混合して，以下の複合体を形
成させた．
は，５μｌの標識プライマーをそれぞれ１０μｌの鋳型
（ａ）または鋳型（ｂ）と混合して，以下の複合体を形
成させた．
【化３０】 遊離の放射標識プライマーはＧ−５０ Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ カラムを通して除去した．
ｘ カラムを通して除去した．
【００５２】プライマーの３’末端に２個の正しくマッ
チした放射標識Ａ★を有した複合体（ａ）のアリコー
ト，およびプライマーの３’末端に２個のミスマッチし
たＡ★を有した複合体（ｂ）のアリコートを，ついでピ
ペットで別個の２つのバイアルのシンチレーション液に
取り，それらの放射能をシンチレーションカウンターで
測定し，両複合体を導入された［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰ
を同モル含有する濃度に緩衝液で調整した．
チした放射標識Ａ★を有した複合体（ａ）のアリコー
ト，およびプライマーの３’末端に２個のミスマッチし
たＡ★を有した複合体（ｂ）のアリコートを，ついでピ
ペットで別個の２つのバイアルのシンチレーション液に
取り，それらの放射能をシンチレーションカウンターで
測定し，両複合体を導入された［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰ
を同モル含有する濃度に緩衝液で調整した．
【００５３】プルーフリーディング３’−５’エキソヌ
クレアーゼ活性を調べるには，２０μｌ複合体（ａ）ま
たは（ｂ），１５ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌおよび１５ｍＭ
ＭｇＣｌ２，ｐＨ８．５からなる反応緩衝液８μｌ，４
単位のＤＮＡポリメラーゼおよび十分の水で総容量を４
０μｌとし，ピペットで試験管に取り，十分混合した．
混合物を各３μｌのアリコートに分割して０．５ｍｌの
微小遠沈管に取り，ついで各管を３μｌのパラフィンで
覆った．微小遠沈管を６５℃の水浴中でインキュベート
した．１，２，３，５，１０および２０分後に，一対の
微小遠沈管を水浴から取り出し，各微小遠沈管の内容物
をＤＥ−８１ Ｗｈａｔｍａｎｎ ろ紙上にスポットし
た．それぞれ一対のろ紙の一方はそのままシンチレーシ
ョン液に入れてその放射能をシンチレーションカウンタ
ーによってｃｐｍ値でカウントし，他方は０．３Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．８中で３回洗浄したのちシ
ンチレーション液に入れてカウントした．
クレアーゼ活性を調べるには，２０μｌ複合体（ａ）ま
たは（ｂ），１５ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌおよび１５ｍＭ
ＭｇＣｌ２，ｐＨ８．５からなる反応緩衝液８μｌ，４
単位のＤＮＡポリメラーゼおよび十分の水で総容量を４
０μｌとし，ピペットで試験管に取り，十分混合した．
混合物を各３μｌのアリコートに分割して０．５ｍｌの
微小遠沈管に取り，ついで各管を３μｌのパラフィンで
覆った．微小遠沈管を６５℃の水浴中でインキュベート
した．１，２，３，５，１０および２０分後に，一対の
微小遠沈管を水浴から取り出し，各微小遠沈管の内容物
をＤＥ−８１ Ｗｈａｔｍａｎｎ ろ紙上にスポットし
た．それぞれ一対のろ紙の一方はそのままシンチレーシ
ョン液に入れてその放射能をシンチレーションカウンタ
ーによってｃｐｍ値でカウントし，他方は０．３Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．８中で３回洗浄したのちシ
ンチレーション液に入れてカウントした．
【００５４】各対の洗浄したろ紙と洗浄しなかったろ紙
の間のｃｐｍ値で表した放射能の差をプライマーの３’
末端から３’−５’エキソヌクレアーゼ活性によって切
断された標識ヌクレオチドの相対量を表すものと解釈し
た．複合体（ａ）からよりも複合体（ｂ）から多量に放
射標識ヌクレオチドＡ★を切断したＤＮＡポリメラーゼ
は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有した．複合体
（ｂ）からからよりも複合体（ａ）からより速やかにま
たは両者ほぼ同速度で，放射標識ヌクレオチドＡ★を切
断したＤＮＡポリメラーゼは，ＤＮＡ配列決定には不適
当と考えられる非特異的な３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性を有するものと解釈された．
の間のｃｐｍ値で表した放射能の差をプライマーの３’
末端から３’−５’エキソヌクレアーゼ活性によって切
断された標識ヌクレオチドの相対量を表すものと解釈し
た．複合体（ａ）からよりも複合体（ｂ）から多量に放
射標識ヌクレオチドＡ★を切断したＤＮＡポリメラーゼ
は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有した．複合体
（ｂ）からからよりも複合体（ａ）からより速やかにま
たは両者ほぼ同速度で，放射標識ヌクレオチドＡ★を切
断したＤＮＡポリメラーゼは，ＤＮＡ配列決定には不適
当と考えられる非特異的な３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性を有するものと解釈された．
【００５５】これらの方法を用いて，各種起源の Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
株中からその速い増殖速度で優れた細菌株が単離され
た．この株はＤＮＡポリメラーゼの産生に至適な対数増
殖期に３時間以内に到達した．この株はまた，３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラー
ゼを産生する能力においても新規である．この Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株
はＢｓｔ Ｎｏ．３２０と命名した．
ｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
株中からその速い増殖速度で優れた細菌株が単離され
た．この株はＤＮＡポリメラーゼの産生に至適な対数増
殖期に３時間以内に到達した．この株はまた，３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラー
ゼを産生する能力においても新規である．この Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株
はＢｓｔ Ｎｏ．３２０と命名した．
【００５６】本技術分野の熟練者には明らかなように．
本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを得ることができ
る細菌株は，また Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株でも，Ｂｓｔ Ｎｏ．３２０
に限定されるものではない．それどころか，ポリメラー
ゼは上述の方法または本技術分野において既知の他の方
法を用いて，野生株または自然突然変異を含む様々な手
段で得られる突然変異株を包含する Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株または他の
細菌株（とくに好熱菌株）から誘導することができる．
本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを得ることができ
る細菌株は，また Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株でも，Ｂｓｔ Ｎｏ．３２０
に限定されるものではない．それどころか，ポリメラー
ゼは上述の方法または本技術分野において既知の他の方
法を用いて，野生株または自然突然変異を含む様々な手
段で得られる突然変異株を包含する Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株または他の
細菌株（とくに好熱菌株）から誘導することができる．
【００５７】本発明の好ましい精製されたＢｓｔ ＤＮ
Ａポリメラーゼを製造するためにはＢｓｔＮｏ．３２０
の細胞を１％ポリペプトン，０．５％酵母エキスおよび
０．５％ＮａＣｌからなる液体培地．ｐＨ７．０〜７．
２中５５℃で増殖させた．３時間齢の細胞を遠心分離に
よって収集し，１００ｍｌのリゾチームおよび２３ｍｇ
／ｍｌのフェニルメチルスルホニルフルオリドを含有す
るＴＭＥ緩衝液（組成：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，
ｐＨ７．５，１０ｍＭ β−メルカプトエタノール，お
よび２ｍＭ ＥＤＴＡ）４容に懸濁した．細胞を氷中で
超音波処理して破壊した．Ｓｐｉｎｃｏ Ｌ３０ ロー
ターにより２８，０００ｒｐｍで遠心分離したのち，上
清をプールした．
Ａポリメラーゼを製造するためにはＢｓｔＮｏ．３２０
の細胞を１％ポリペプトン，０．５％酵母エキスおよび
０．５％ＮａＣｌからなる液体培地．ｐＨ７．０〜７．
２中５５℃で増殖させた．３時間齢の細胞を遠心分離に
よって収集し，１００ｍｌのリゾチームおよび２３ｍｇ
／ｍｌのフェニルメチルスルホニルフルオリドを含有す
るＴＭＥ緩衝液（組成：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，
ｐＨ７．５，１０ｍＭ β−メルカプトエタノール，お
よび２ｍＭ ＥＤＴＡ）４容に懸濁した．細胞を氷中で
超音波処理して破壊した．Ｓｐｉｎｃｏ Ｌ３０ ロー
ターにより２８，０００ｒｐｍで遠心分離したのち，上
清をプールした．
【００５８】本発明の精製Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ
はＯｋａｚａｋｉ＆Ｋｏｒｎｂｅｒｇ（７）の方法を適
宜わずかに改変して調製し，そのＤＮＡポリメラーゼの
大フラグメントは全ＤＮＡポリメラーゼを基本的にはＪ
ａｃｏｂｓｅｎら（８）に従い，プロテナーゼのズブチ
リシン（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ型）で部分消化して得られ
た．
はＯｋａｚａｋｉ＆Ｋｏｒｎｂｅｒｇ（７）の方法を適
宜わずかに改変して調製し，そのＤＮＡポリメラーゼの
大フラグメントは全ＤＮＡポリメラーゼを基本的にはＪ
ａｃｏｂｓｅｎら（８）に従い，プロテナーゼのズブチ
リシン（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ型）で部分消化して得られ
た．
【００５９】酵素の精製操作はＹｅ＆Ｈｏｎｇ（４）の
記載に従った．このＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼはプル
ーフリーディング３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を
有した．同定の目的で，これは本発明者らによりＨｉＨ
ｉ Ｂｓｔと命名された．
記載に従った．このＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼはプル
ーフリーディング３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を
有した．同定の目的で，これは本発明者らによりＨｉＨ
ｉ Ｂｓｔと命名された．
【００６０】ＨｉＨｉ Ｂｓｔは，上述のように，プル
ーフリーディングおよび非特異的３’−５’エキソヌク
レアーゼ活性を試験した．結果は，ＨｉＨｉ Ｂｓｔが
二重鎖ＤＮＡの３’末端からミスマッチで取り込まれた
ヌクレオチドを高速度で切断し，約３分で加水分解のプ
ラトーに達し，反応の初期３分には鋳型ヌクレオチドと
正しくマッチした場合より約８倍効率的であることを示
した（図１）．
ーフリーディングおよび非特異的３’−５’エキソヌク
レアーゼ活性を試験した．結果は，ＨｉＨｉ Ｂｓｔが
二重鎖ＤＮＡの３’末端からミスマッチで取り込まれた
ヌクレオチドを高速度で切断し，約３分で加水分解のプ
ラトーに達し，反応の初期３分には鋳型ヌクレオチドと
正しくマッチした場合より約８倍効率的であることを示
した（図１）．
【００６１】
【実施例】以下の非限定的実施例は本発明を例示するも
のである．
のである．
【００６２】本発明のＤＮＡポリメラーゼの遺伝子を含
有するＤＮＡ配列の単離 １．本発明のホロ酵素ＤＮＡポリメラーゼおよびＢｓｔ
ＤＮＡポリメラーゼの部分アミノ酸配列の決定：ホロ
酵素ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔホロ）は Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株 Ｂ
ｓｔ Ｎｏ．３２０から精製した．ＢｓｔＤＮＡポリメ
ラーゼは上述の操作によりＢｓｔホロから調製した．精
製されたＢｓｔホロおよびＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ
のＮ末端は Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
４７７Ａ タンパク質シークェンサーによって決定し
た．得られたＮ末端配列は次の通りであった．
有するＤＮＡ配列の単離 １．本発明のホロ酵素ＤＮＡポリメラーゼおよびＢｓｔ
ＤＮＡポリメラーゼの部分アミノ酸配列の決定：ホロ
酵素ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔホロ）は Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株 Ｂ
ｓｔ Ｎｏ．３２０から精製した．ＢｓｔＤＮＡポリメ
ラーゼは上述の操作によりＢｓｔホロから調製した．精
製されたＢｓｔホロおよびＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ
のＮ末端は Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
４７７Ａ タンパク質シークェンサーによって決定し
た．得られたＮ末端配列は次の通りであった．
【化３１】
【００６３】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって
得られたＢｓｔホロの遺伝子の５’ＤＮＡ配列：５’正
プライマーおよび３’逆プライマーの縮重プールをそれ
ぞれＢｓｔホロおよびＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼのＮ
末端アミノ酸配列に従って合成した．それらは次の通り
であった．
得られたＢｓｔホロの遺伝子の５’ＤＮＡ配列：５’正
プライマーおよび３’逆プライマーの縮重プールをそれ
ぞれＢｓｔホロおよびＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼのＮ
末端アミノ酸配列に従って合成した．それらは次の通り
であった．
【化３２】
【００６４】鋳型は，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株 Ｂｓｔ Ｎｏ．３２０か
ら精製されたクロモゾームＤＮＡとした． 反応系： ５０ ｍＭ ＫＣｌ １０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝９．０室
温） ２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン ０．０１％（ｗ／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ５０ μＭ 各ｄＮＴＰ １０ ｎｇ クロモゾームＤＮＡ ５０ ｐｍｏｌ 各プライマー ２ 単位 Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ 総容量＝１００μｌ 反応操作： ５分間９４℃で変性 ａ．９４℃で３０秒間変性 ｂ．３７℃で２分間アニーリング ｃ．７２℃で３分間重合 ａ〜ｃ５サイクル ｄ．９４℃で３０秒間変性 ｅ．４６℃で１分間アニーリング ｆ．７２℃で２分間重合 ｄ〜ｆ２５サイクル ７２℃で５分間延長．
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ株 Ｂｓｔ Ｎｏ．３２０か
ら精製されたクロモゾームＤＮＡとした． 反応系： ５０ ｍＭ ＫＣｌ １０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝９．０室
温） ２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン ０．０１％（ｗ／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ５０ μＭ 各ｄＮＴＰ １０ ｎｇ クロモゾームＤＮＡ ５０ ｐｍｏｌ 各プライマー ２ 単位 Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ 総容量＝１００μｌ 反応操作： ５分間９４℃で変性 ａ．９４℃で３０秒間変性 ｂ．３７℃で２分間アニーリング ｃ．７２℃で３分間重合 ａ〜ｃ５サイクル ｄ．９４℃で３０秒間変性 ｅ．４６℃で１分間アニーリング ｆ．７２℃で２分間重合 ｄ〜ｆ２５サイクル ７２℃で５分間延長．
【００６５】反応混合物を１％アガロースゲル電気泳動
によって精製し，分析した．生成物は長さ約１．０ ｋ
ｂで，これはＢｓｔホロの小フラグメントのサイズと一
致した．精製された生成物を Ｂａｍ ＨＩ および
ＳａｌＩ で消化し，ついで同じ制限酵素で予め消化し
たｐＵＣ１９プラスミドにクローン化した．このように
して得られた組換えプラスミドを大腸菌ＴＧｌにトラン
スフォームした．
によって精製し，分析した．生成物は長さ約１．０ ｋ
ｂで，これはＢｓｔホロの小フラグメントのサイズと一
致した．精製された生成物を Ｂａｍ ＨＩ および
ＳａｌＩ で消化し，ついで同じ制限酵素で予め消化し
たｐＵＣ１９プラスミドにクローン化した．このように
して得られた組換えプラスミドを大腸菌ＴＧｌにトラン
スフォームした．
【００６６】本発明のＤＮＡポリメラーゼの遺伝子を含
有するＤＮＡ配列の取得：操作２で調製されたＢｓｔホ
ロの遺伝子の５’配列のセグメントを使用して，本発明
のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの全遺伝子を含有するＤ
ＮＡ配列の単離のためのプローブを製造した．操作２で
得られたクローン化された組換えプラスミドＤＮＡを最
初にＳａｌＩ と ＤｒａＩ の混合物で消化した．消
化されたＤＮＡフラグメントを８％アガロースゲル電気
泳動により精製し，長さ約１００ｂｐのＤＮＡセグメン
トを選択し，ランダムプライマー標識によって放射性同
位元素で標識した．標識された１００ｂｐフラグメント
をプローブに用いた．
有するＤＮＡ配列の取得：操作２で調製されたＢｓｔホ
ロの遺伝子の５’配列のセグメントを使用して，本発明
のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの全遺伝子を含有するＤ
ＮＡ配列の単離のためのプローブを製造した．操作２で
得られたクローン化された組換えプラスミドＤＮＡを最
初にＳａｌＩ と ＤｒａＩ の混合物で消化した．消
化されたＤＮＡフラグメントを８％アガロースゲル電気
泳動により精製し，長さ約１００ｂｐのＤＮＡセグメン
トを選択し，ランダムプライマー標識によって放射性同
位元素で標識した．標識された１００ｂｐフラグメント
をプローブに用いた．
【００６７】Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓのクロモゾームＤＮＡを，ＣｌａＩ，
ＰｖｕＩＩおよびＤｒａＩで個々に完全に消化して，消
化物を０．７％アガロースゲル上電気泳動に付した．サ
ザンブロッティングを用い，エチジウムブロミドによっ
て染色したゲル上のＤＮＡを ＶａｃｕＧｅｎｅＴＭＸ
Ｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋
膜に移し，標識された放射性プローブとハイブリダイズ
させた．
ｍｏｐｈｉｌｕｓのクロモゾームＤＮＡを，ＣｌａＩ，
ＰｖｕＩＩおよびＤｒａＩで個々に完全に消化して，消
化物を０．７％アガロースゲル上電気泳動に付した．サ
ザンブロッティングを用い，エチジウムブロミドによっ
て染色したゲル上のＤＮＡを ＶａｃｕＧｅｎｅＴＭＸ
Ｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋
膜に移し，標識された放射性プローブとハイブリダイズ
させた．
【００６８】サザンブロッティングの結果によれば，Ｃ
ｌａＩでの消化によって生成した長さ約２．５ｋｂのＤ
ＮＡフラグメントのバンドは放射性プローブとハイブリ
ダイズすることが見出された．このバンドを，予め Ａ
ｃｃＩで消化したプラスミドｐＵＣ１８にライゲート
し，アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で脱リン酸化し
た．このようにして得られた組換えプラスミドはｐＵＣ
１８／ＬＦと命名し，ついで，大腸菌ＴＧｌにトランス
フォームした．ｐＵＣ１８／ＬＦプラスミドを含有する
トランスフォームされた大腸菌のクローン候補を上述の
放射性プローブとのハイブリダイゼーションによってス
クリーニングした．
ｌａＩでの消化によって生成した長さ約２．５ｋｂのＤ
ＮＡフラグメントのバンドは放射性プローブとハイブリ
ダイズすることが見出された．このバンドを，予め Ａ
ｃｃＩで消化したプラスミドｐＵＣ１８にライゲート
し，アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で脱リン酸化し
た．このようにして得られた組換えプラスミドはｐＵＣ
１８／ＬＦと命名し，ついで，大腸菌ＴＧｌにトランス
フォームした．ｐＵＣ１８／ＬＦプラスミドを含有する
トランスフォームされた大腸菌のクローン候補を上述の
放射性プローブとのハイブリダイゼーションによってス
クリーニングした．
【００６９】プラスミドｐＵＣ１８／ＬＦ中にクローン
化されたＤＮＡ配列は連続的なオリゴヌクレオチドプラ
イマーでのＳａｎｇｅｒ配列決定法によって決定した．
ｐＵＣ１８／ＬＦプラスミドに挿入された２．５ｋｂフ
ラグメント内に本発明のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの
全配列が存在することが最終的に決定された．決定され
た総配列は長さ ２，３６３ｂｐで，Ｂｓｔ ＤＮＡポ
リメラーゼの遺伝子は長さ１，７６４ｂｐであった．
化されたＤＮＡ配列は連続的なオリゴヌクレオチドプラ
イマーでのＳａｎｇｅｒ配列決定法によって決定した．
ｐＵＣ１８／ＬＦプラスミドに挿入された２．５ｋｂフ
ラグメント内に本発明のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの
全配列が存在することが最終的に決定された．決定され
た総配列は長さ ２，３６３ｂｐで，Ｂｓｔ ＤＮＡポ
リメラーゼの遺伝子は長さ１，７６４ｂｐであった．
【００７０】本発明のＤＮＡポリメラーゼのクローン化
された遺伝子の単離 ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子の単離には，Ｂｓｔ ＤＮ
ＡポリメラーゼのＮおよびＣ末端両者に由来する既知の
ＤＮＡ配列に従って２つのオリゴヌクレオチドプライマ
ーを合成した．以後の遺伝子クローニングおよび発現の
目的で，２つのプライマーには制限酵素部位を導入し
た．翻訳のためのＡＴＧ開始コドンも５’−正プライマ
ーに導入した．このようにしてデザインされた２つのプ
ライマーは次の通りであった．
された遺伝子の単離 ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子の単離には，Ｂｓｔ ＤＮ
ＡポリメラーゼのＮおよびＣ末端両者に由来する既知の
ＤＮＡ配列に従って２つのオリゴヌクレオチドプライマ
ーを合成した．以後の遺伝子クローニングおよび発現の
目的で，２つのプライマーには制限酵素部位を導入し
た．翻訳のためのＡＴＧ開始コドンも５’−正プライマ
ーに導入した．このようにしてデザインされた２つのプ
ライマーは次の通りであった．
【化３３】
【００７１】 反応系： ５０ ｍＭ ＫＣｌ １０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝９．０室
温） １ ｍＭ ＭｇＣｌ２ ０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン ０．０１％（ｗ／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ５０ μＭ 各ｄＮＴＰ １０ ｎｇ 鋳型としてｐＵＣ１８／ＬＦ ５０ ｐｍｏｌ 各プライマー ２ 単位 Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ 総容量＝１００μｌ 反応操作： ５分間９４℃で変性 ａ．９４℃で３０秒間変性 ｂ．５０℃で３０秒間アニーリング ｃ．７２℃で１．５分間重合 ａ〜ｃ３０サイクル ７２℃で５分間延長．
温） １ ｍＭ ＭｇＣｌ２ ０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン ０．０１％（ｗ／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ５０ μＭ 各ｄＮＴＰ １０ ｎｇ 鋳型としてｐＵＣ１８／ＬＦ ５０ ｐｍｏｌ 各プライマー ２ 単位 Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ 総容量＝１００μｌ 反応操作： ５分間９４℃で変性 ａ．９４℃で３０秒間変性 ｂ．５０℃で３０秒間アニーリング ｃ．７２℃で１．５分間重合 ａ〜ｃ３０サイクル ７２℃で５分間延長．
【００７２】このようにして得られた本発明のＤＮＡポ
リメラーゼの遺伝子を含有する反応生成物を１％アガロ
ースゲル電気泳動によって精製した．
リメラーゼの遺伝子を含有する反応生成物を１％アガロ
ースゲル電気泳動によって精製した．
【００７３】ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子，および強力
なλＰＬプロモーターを含有する発現ベクターｐＹＺ２
３をＥｃｏ ＲＩ および Ｂａｍ ＨＩ の両者で消
化し，消化物を１％低融点アガロースゲル電気泳動によ
り精製し，回収した．消化されたＤＮＡとベクターをラ
イゲートして組換えプラスミドはｐＹＺ２３／ＬＦを形
成させ，ついでこれを大腸菌 ＪＦ１１２５ にトラン
スフォームした．所望のクローンは制限酵素消化分析に
よってさらに確認した．
なλＰＬプロモーターを含有する発現ベクターｐＹＺ２
３をＥｃｏ ＲＩ および Ｂａｍ ＨＩ の両者で消
化し，消化物を１％低融点アガロースゲル電気泳動によ
り精製し，回収した．消化されたＤＮＡとベクターをラ
イゲートして組換えプラスミドはｐＹＺ２３／ＬＦを形
成させ，ついでこれを大腸菌 ＪＦ１１２５ にトラン
スフォームした．所望のクローンは制限酵素消化分析に
よってさらに確認した．
【化３４】
【００７４】本発明のＤＮＡポリメラーゼのクローン化
された遺伝子の発現 ｐＹＺ２３／ＬＦを含有する大腸菌 ＪＦ１１２５を１
００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中に接種
し，一夜３０℃でインキュベートした．一夜培養物を大
容量の新鮮な培地に接種し，培養液のＯＤ６００が０．
７に達するまで３０℃でインキュベートした．ついで培
養液を４１℃に加熱し，３時間インキュベートして誘導
した．細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥは発現したＢｓｔ
ＤＮＡポリメラーゼの量が細胞の総可溶性タンパク質
の約４５．８％を構成することを示した．すなわち本発
明のＤＮＡポリメラーゼのクローン化された遺伝子は過
剰発現可能なことが確認された．
された遺伝子の発現 ｐＹＺ２３／ＬＦを含有する大腸菌 ＪＦ１１２５を１
００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中に接種
し，一夜３０℃でインキュベートした．一夜培養物を大
容量の新鮮な培地に接種し，培養液のＯＤ６００が０．
７に達するまで３０℃でインキュベートした．ついで培
養液を４１℃に加熱し，３時間インキュベートして誘導
した．細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥは発現したＢｓｔ
ＤＮＡポリメラーゼの量が細胞の総可溶性タンパク質
の約４５．８％を構成することを示した．すなわち本発
明のＤＮＡポリメラーゼのクローン化された遺伝子は過
剰発現可能なことが確認された．
【００７５】本発明のＤＮＡポリメラーゼのクローン化
された遺伝子の産物の精製 上述の条件下に増殖させたｐＹＺ２３／ＬＦ含有大腸菌
の２Ｌ培養液を４℃において５，０００ｒｐｍで２０分
間遠心分離した．ペレットを緩衝液［１０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ （ｐＨ＝７．５室温），１０ｍＭβ−メルカ
プトエタノール，２ｍＭ ＥＤＴＡ，０．９％ＮａＣ
ｌ］に懸濁洗浄し，再遠心分離した．ペレット（約８．
６８ ｇ）をついで３５ｍｌの緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ＝７．５室温），１０ｍＭ β−
メルカプトエタノール，２ｍＭＥＤＴＡ，１００μｇ／
ｍｌリゾチーム，２３μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ］に懸濁
し，Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ Ｗ−３７５ （Ｈｅａｔ Ｓ
ｙｓｔｅｍ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）で超
音波処理した．細胞抽出物を４℃，１８，０００ｒｐｍ
で２０分間の遠心分離によって集めついで順次以下の
ように処理した． （Ａ）細胞抽出物を６０℃で３０分間加熱し，ついで４
℃，１５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離した． （Ｂ）上清に５％ポリミンＰを０．６％になるように加
え，３０分間速やかに混合し，ついで４℃，１５，００
０ｒｐｍで２０分間の遠心分離した． （Ｃ）ペレットを３０ｍｌの緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５室温），１ｍＭ ＥＤＴＡ，
１ｍＭβ−メルカプトエタノール，８００ｍＭＮａＣ
ｌ，５％グリセロール］に４℃で再懸濁し，ついで４
℃，１５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離した． （Ｄ）上清に４℃で硫酸アンモニウムを６０％飽和まで
加え，３０分間混合し，ついで４℃，１５，０００ｒｐ
ｍで２０分間の遠心分離した． （Ｅ）硫酸アンモニウムペレットを３０ｍｌの６０％飽
和硫酸アンモニウムに４℃で再懸濁し，ついで４℃，１
５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離した． （Ｆ）ペレットを１５ｍｌの緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５室温），１ｍＭ ＥＤＴＡ，
１ｍＭ β−メルカプトエタノール，および５％グリセ
ロール］に懸濁し，同一の緩衝液に対して数時間透析
し，４℃，１５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離し
た．不溶のタンパク質は捨てた． （Ｇ）得られた溶液をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ３０で最小容
量まで濃縮し，グリセロールを５０％まで加えた．
された遺伝子の産物の精製 上述の条件下に増殖させたｐＹＺ２３／ＬＦ含有大腸菌
の２Ｌ培養液を４℃において５，０００ｒｐｍで２０分
間遠心分離した．ペレットを緩衝液［１０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ （ｐＨ＝７．５室温），１０ｍＭβ−メルカ
プトエタノール，２ｍＭ ＥＤＴＡ，０．９％ＮａＣ
ｌ］に懸濁洗浄し，再遠心分離した．ペレット（約８．
６８ ｇ）をついで３５ｍｌの緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ＝７．５室温），１０ｍＭ β−
メルカプトエタノール，２ｍＭＥＤＴＡ，１００μｇ／
ｍｌリゾチーム，２３μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ］に懸濁
し，Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ Ｗ−３７５ （Ｈｅａｔ Ｓ
ｙｓｔｅｍ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）で超
音波処理した．細胞抽出物を４℃，１８，０００ｒｐｍ
で２０分間の遠心分離によって集めついで順次以下の
ように処理した． （Ａ）細胞抽出物を６０℃で３０分間加熱し，ついで４
℃，１５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離した． （Ｂ）上清に５％ポリミンＰを０．６％になるように加
え，３０分間速やかに混合し，ついで４℃，１５，００
０ｒｐｍで２０分間の遠心分離した． （Ｃ）ペレットを３０ｍｌの緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５室温），１ｍＭ ＥＤＴＡ，
１ｍＭβ−メルカプトエタノール，８００ｍＭＮａＣ
ｌ，５％グリセロール］に４℃で再懸濁し，ついで４
℃，１５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離した． （Ｄ）上清に４℃で硫酸アンモニウムを６０％飽和まで
加え，３０分間混合し，ついで４℃，１５，０００ｒｐ
ｍで２０分間の遠心分離した． （Ｅ）硫酸アンモニウムペレットを３０ｍｌの６０％飽
和硫酸アンモニウムに４℃で再懸濁し，ついで４℃，１
５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離した． （Ｆ）ペレットを１５ｍｌの緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５室温），１ｍＭ ＥＤＴＡ，
１ｍＭ β−メルカプトエタノール，および５％グリセ
ロール］に懸濁し，同一の緩衝液に対して数時間透析
し，４℃，１５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離し
た．不溶のタンパク質は捨てた． （Ｇ）得られた溶液をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ３０で最小容
量まで濃縮し，グリセロールを５０％まで加えた．
【００７６】得られたＤＮＡポリメラーゼはポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により，均一であることが証明さ
れた．発現したＤＮＡポリメラーゼを含む溶液は−２０
℃で保存した．
ルアミドゲル電気泳動により，均一であることが証明さ
れた．発現したＤＮＡポリメラーゼを含む溶液は−２０
℃で保存した．
【００７７】実験により，本発明のクローン化され発現
されたＤＮＡポリメラーゼは，ＢｓｔＮｏ．３２０から
精製されたＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼのすべての性質
をもっていることが明らかにされた．
されたＤＮＡポリメラーゼは，ＢｓｔＮｏ．３２０から
精製されたＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼのすべての性質
をもっていることが明らかにされた．
【００７８】本発明のクローン化され発現されたＤＮＡ
ポリメラーゼのＤＮＡ配列決定のための使用例 以下の例は一本鎖ＤＮＡ配列決定の標準的 Ｓａｎｇｅ
ｒ プロトコールに基づき，酵素としては本発明のＤＮ
Ａポリメラーゼを使用する． １．１．５ｍｌの遠沈管中に，配列５’−ＧＴＡＡＡＡ
ＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号：１５）を有
するＤＮＡ２．５〜５ｎｇを含有するユニバーサルＤＮ
Ａ配列決定プライマー１．０μｌ，２５０〜５００ｎｇ
のＤＮＡを含むｓｓＤＮＡ鋳型７．０μｌならびに１０
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．５，および１００ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ２からなる５×反応緩衝液２．０μｌをピ
ペットで加えた． ２．この混合物を７５℃の水浴中に５分間置き，ついで
５分間を要して徐々に室温まで放冷した． ３．試験管中に１．５μｌの［α−３５Ｓ］ｄＡＴＰ
（１０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）ならびに２０ｍＭのＫ
Ｈ２ＰＯ４，ｐＨ６．８，１０ｍＭのβメルカプトエタ
ノール，５０％グリセロール中１．０単位の酵素を含む
本発明のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを添加した．内容物
を混合し，２〜３秒間微小遠心分離に付した． ４．上記混合物の２．５μｌアリコートを，予め６５℃
に加温した以下の混合溶液の一つ，すなわちＡ．１．５
ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，０．１５ ｍＭ ＥＤＴＡ，
ｐＨ８．０中，６２０ｎＭのｄＡＴＰ，６２μＭのｄＣ
ＴＰ，６２μＭのｄＧＴＰ，６２μＭのｄＴＴＰ，２５
μＭのｄｄＡＴＰ，Ｃ．１．５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃ
ｌ，０．１５ｍＭ ＥＤＴＡ， ｐＨ ８．０中，８０
０ｎＭのｄＡＴＰ，８μＭのｄＣＴＰ，８０μＭのｄＧ
ＴＰ，８０μＭのｄＴＴＰ，５０μＭのｄｄＣＴＰ，
Ｇ．１．５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，０．１５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ，ｐＨ８．０中，８００ｎＭのｄＡＴＰ，８０μ
ＭのｄＣＴＰ，４μＭのｄＧＴＰ，８０μＭのｄＴＴ
Ｐ，７５μＭのｄｄＧＴＰまたは，Ｔ．１．５ ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，０．１５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ ８．
０中，８００ｎＭのｄＡＴＰ，８０μＭのｄＣＴＰ，８
０μＭのｄＧＴＰ，８μＭのｄＴＴＰ，１５０μＭのｄ
ｄＴＴＰ，２．０μｌを含有する４つの試験管のそれぞ
れにピペットで添加した． ５．混合し，２〜３秒間微小遠心分離を行ったのち，そ
れぞれＡ，Ｃ，ＧおよびＴとラベルされた４つの試験管
すべてを６５℃の水浴中に２分間置いた（伸長−終結反
応）． ６．４つの試験管のそれぞれに，水に溶解した４種類の
ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴ
Ｐ）各０．５ｍＭを含む追跡溶液２μｌを添加した．混
合後，試験管を微小遠心分離に付し，６５℃の水浴中に
置いてさらに２分間インキュベートした． ７．４つの試験管中のすべての反応を，９５％脱イオン
化ホルムアミド，１０ｍＭＥＤＴＡ，０．０５％キシレ
ンシアノールＦＦ，および０．０５％ブロモフェノール
ブルーを含有する停止溶液４μｌを添加して停止させ
た．混合物を微小遠心分離に付し，変性高分割ポリアク
リルアミドゲルに負荷して電気泳動を行った． ８．配列決定ゲルのオートラジオグラフィー像を得た
（図２）．
ポリメラーゼのＤＮＡ配列決定のための使用例 以下の例は一本鎖ＤＮＡ配列決定の標準的 Ｓａｎｇｅ
ｒ プロトコールに基づき，酵素としては本発明のＤＮ
Ａポリメラーゼを使用する． １．１．５ｍｌの遠沈管中に，配列５’−ＧＴＡＡＡＡ
ＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号：１５）を有
するＤＮＡ２．５〜５ｎｇを含有するユニバーサルＤＮ
Ａ配列決定プライマー１．０μｌ，２５０〜５００ｎｇ
のＤＮＡを含むｓｓＤＮＡ鋳型７．０μｌならびに１０
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．５，および１００ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ２からなる５×反応緩衝液２．０μｌをピ
ペットで加えた． ２．この混合物を７５℃の水浴中に５分間置き，ついで
５分間を要して徐々に室温まで放冷した． ３．試験管中に１．５μｌの［α−３５Ｓ］ｄＡＴＰ
（１０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）ならびに２０ｍＭのＫ
Ｈ２ＰＯ４，ｐＨ６．８，１０ｍＭのβメルカプトエタ
ノール，５０％グリセロール中１．０単位の酵素を含む
本発明のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを添加した．内容物
を混合し，２〜３秒間微小遠心分離に付した． ４．上記混合物の２．５μｌアリコートを，予め６５℃
に加温した以下の混合溶液の一つ，すなわちＡ．１．５
ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，０．１５ ｍＭ ＥＤＴＡ，
ｐＨ８．０中，６２０ｎＭのｄＡＴＰ，６２μＭのｄＣ
ＴＰ，６２μＭのｄＧＴＰ，６２μＭのｄＴＴＰ，２５
μＭのｄｄＡＴＰ，Ｃ．１．５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃ
ｌ，０．１５ｍＭ ＥＤＴＡ， ｐＨ ８．０中，８０
０ｎＭのｄＡＴＰ，８μＭのｄＣＴＰ，８０μＭのｄＧ
ＴＰ，８０μＭのｄＴＴＰ，５０μＭのｄｄＣＴＰ，
Ｇ．１．５ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，０．１５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ，ｐＨ８．０中，８００ｎＭのｄＡＴＰ，８０μ
ＭのｄＣＴＰ，４μＭのｄＧＴＰ，８０μＭのｄＴＴ
Ｐ，７５μＭのｄｄＧＴＰまたは，Ｔ．１．５ ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，０．１５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ ８．
０中，８００ｎＭのｄＡＴＰ，８０μＭのｄＣＴＰ，８
０μＭのｄＧＴＰ，８μＭのｄＴＴＰ，１５０μＭのｄ
ｄＴＴＰ，２．０μｌを含有する４つの試験管のそれぞ
れにピペットで添加した． ５．混合し，２〜３秒間微小遠心分離を行ったのち，そ
れぞれＡ，Ｃ，ＧおよびＴとラベルされた４つの試験管
すべてを６５℃の水浴中に２分間置いた（伸長−終結反
応）． ６．４つの試験管のそれぞれに，水に溶解した４種類の
ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴ
Ｐ）各０．５ｍＭを含む追跡溶液２μｌを添加した．混
合後，試験管を微小遠心分離に付し，６５℃の水浴中に
置いてさらに２分間インキュベートした． ７．４つの試験管中のすべての反応を，９５％脱イオン
化ホルムアミド，１０ｍＭＥＤＴＡ，０．０５％キシレ
ンシアノールＦＦ，および０．０５％ブロモフェノール
ブルーを含有する停止溶液４μｌを添加して停止させ
た．混合物を微小遠心分離に付し，変性高分割ポリアク
リルアミドゲルに負荷して電気泳動を行った． ８．配列決定ゲルのオートラジオグラフィー像を得た
（図２）．
【００７９】本発明のＤＮＡポリメラーゼをさらに試験
したところ，この酵素により触媒されるＤＮＡ重合時の
ミスマッチ塩基対の取り込みの割合は７．８×１０−７
のオーダーであることが明らかにされた．これは，ＤＮ
Ａ配列決定時における従来から既知の通常のＢｓｔ Ｄ
ＮＡポリメラーゼのエラー率約１．５×１０−５に対し
てほぼ２０倍の正確度の改善である．
したところ，この酵素により触媒されるＤＮＡ重合時の
ミスマッチ塩基対の取り込みの割合は７．８×１０−７
のオーダーであることが明らかにされた．これは，ＤＮ
Ａ配列決定時における従来から既知の通常のＢｓｔ Ｄ
ＮＡポリメラーゼのエラー率約１．５×１０−５に対し
てほぼ２０倍の正確度の改善である．
【００８０】さらに，本発明のＤＮＡポリメラーゼは既
知のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの他の利点のすべてを
保持している．それは２５℃〜７５℃の温度範囲内で機
能し，６５℃で最も活性が高い．ｄＣＴＰを含む４つの
すべてのｄＮＴＰ，ならびに他のヌクレオチド類縁体，
たとえばｄＩＴＰおよび７−デアザｄＧＴＰが，鎖の伸
長に同様に効率的に取り込まれ（したがって，薄い
「Ｃ」バンド現象はない），配列決定ゲル上にバンドの
優れた均質性を生じる（図２）．
知のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの他の利点のすべてを
保持している．それは２５℃〜７５℃の温度範囲内で機
能し，６５℃で最も活性が高い．ｄＣＴＰを含む４つの
すべてのｄＮＴＰ，ならびに他のヌクレオチド類縁体，
たとえばｄＩＴＰおよび７−デアザｄＧＴＰが，鎖の伸
長に同様に効率的に取り込まれ（したがって，薄い
「Ｃ」バンド現象はない），配列決定ゲル上にバンドの
優れた均質性を生じる（図２）．
【００８１】本発明のポリメラーゼは，古典的な Ｓａ
ｎｇｅｒ 一段階反応ならびに「標識／ターミネーショ
ン」配列決定反応，二重鎖ＤＮＡ配列決定方法の両者
に，さらにまた３５Ｓ標識ヌクレオチドおよび３２Ｐ標
識ヌクレオチドの導入に使用することができる（９）．
それはナノグラム量の鋳型を用いる迅速な配列決定分析
に（１０），また安定なＤＮＡポリメラーゼを要求する
ＤＮＡ配列決定の自動化に（１１），蛍光染料または放
射性同位元素標識を用いて（１２）使用することが可能
でである．
ｎｇｅｒ 一段階反応ならびに「標識／ターミネーショ
ン」配列決定反応，二重鎖ＤＮＡ配列決定方法の両者
に，さらにまた３５Ｓ標識ヌクレオチドおよび３２Ｐ標
識ヌクレオチドの導入に使用することができる（９）．
それはナノグラム量の鋳型を用いる迅速な配列決定分析
に（１０），また安定なＤＮＡポリメラーゼを要求する
ＤＮＡ配列決定の自動化に（１１），蛍光染料または放
射性同位元素標識を用いて（１２）使用することが可能
でである．
【００８２】ここに挙げた引用文献はすべてその全体が
参考として導入される．引用文献 １．Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ｓ．＆ Ｃ
ｏｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７，１９
７７． ２．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，
Ｆ．Ｍ．ら編，Ｉ巻，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎ
ｓ，Ｉｎｃ．１９９５，７．４．１７−７．４．２４
頁． ３．同書，７．４．３１頁． ４．Ｙｅ，Ｓ．Ｙ．＆ Ｈｏｎｇ，Ｇ．Ｆ．，Ｓｃｉｅ
ｎｔｉａ Ｓｉｎｉｃａ（Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ）３０：５
０３−５０６，１９８７． ５．引用文献２の７．４．１８頁，表７．４．２． ６．Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
カタログ １９９４／１９９５，Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆ
ｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，１頁，”Ｗｈａｔ’ｓ ｎｅｗ ｉｎ ｔ
ｈｉｓ Ｃａｔａｌｏｇ？”． ７．Ｏｋａｚａｋｉ，Ｔ．＆ Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．
Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３９： ２５９−２
６８，１９６４． ８．Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｈ．，Ｋｌｅｎｏｗ，Ｈ．＆
Ｏｖｅｒｇａｒｄ−Ｈａｎｓｅｎ，Ｋ．，Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．４５：６２３−６２７，１９７４． ９．ＭｃＣｌａｒｙ，Ｊ．，Ｙｅ，Ｓ．Ｙ．，Ｈｏｎ
ｇ，Ｇ．Ｆ．＆ Ｗｉｔｎｅｙ，Ｆ．，ＤＮＡ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ １：６２３−６２７，１９７４． １０．Ｍｅａｄ，Ｄ．Ａ．，ＭｃＣｌａｒｙ，Ｊ．
Ａ．，Ｌｕｃｋｅｙ，Ｊ．Ａ．ら．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ １１：７６−８７，１９９１． １１．Ｅａｒｌｅｙ，Ｊ．Ｊ．，Ｋｕｉｖａｎｉｅｍ
ｉ，Ｈ．，Ｐｒｏｃｋｏｐ，Ｄ．Ｊ．＆ Ｔｒｏｍｐ，
Ｇ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：１５６−１
６５，１９９４． １２．Ｍａｒｄｉｓ，Ｅ．Ｒ．＆ Ｂｒｕｃｅ，Ａ．
Ｒ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：８４０−８５
０，１９８９．
参考として導入される．引用文献 １．Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ｓ．＆ Ｃ
ｏｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７，１９
７７． ２．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，
Ｆ．Ｍ．ら編，Ｉ巻，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎ
ｓ，Ｉｎｃ．１９９５，７．４．１７−７．４．２４
頁． ３．同書，７．４．３１頁． ４．Ｙｅ，Ｓ．Ｙ．＆ Ｈｏｎｇ，Ｇ．Ｆ．，Ｓｃｉｅ
ｎｔｉａ Ｓｉｎｉｃａ（Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ）３０：５
０３−５０６，１９８７． ５．引用文献２の７．４．１８頁，表７．４．２． ６．Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
カタログ １９９４／１９９５，Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆ
ｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，１頁，”Ｗｈａｔ’ｓ ｎｅｗ ｉｎ ｔ
ｈｉｓ Ｃａｔａｌｏｇ？”． ７．Ｏｋａｚａｋｉ，Ｔ．＆ Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．
Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３９： ２５９−２
６８，１９６４． ８．Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｈ．，Ｋｌｅｎｏｗ，Ｈ．＆
Ｏｖｅｒｇａｒｄ−Ｈａｎｓｅｎ，Ｋ．，Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．４５：６２３−６２７，１９７４． ９．ＭｃＣｌａｒｙ，Ｊ．，Ｙｅ，Ｓ．Ｙ．，Ｈｏｎ
ｇ，Ｇ．Ｆ．＆ Ｗｉｔｎｅｙ，Ｆ．，ＤＮＡ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ １：６２３−６２７，１９７４． １０．Ｍｅａｄ，Ｄ．Ａ．，ＭｃＣｌａｒｙ，Ｊ．
Ａ．，Ｌｕｃｋｅｙ，Ｊ．Ａ．ら．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ １１：７６−８７，１９９１． １１．Ｅａｒｌｅｙ，Ｊ．Ｊ．，Ｋｕｉｖａｎｉｅｍ
ｉ，Ｈ．，Ｐｒｏｃｋｏｐ，Ｄ．Ｊ．＆ Ｔｒｏｍｐ，
Ｇ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：１５６−１
６５，１９９４． １２．Ｍａｒｄｉｓ，Ｅ．Ｒ．＆ Ｂｒｕｃｅ，Ａ．
Ｒ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：８４０−８５
０，１９８９．
【００８３】
配列番号：１ 配列の長さ：１７６４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列
【００８４】配列番号：２ 配列の長さ：５８７アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【００８５】配列番号：３ 配列の長さ：１７７０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） 配列
【００８６】配列番号：４ 配列の長さ：５８９アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【００８７】配列番号：５ 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列
【００８８】配列番号：６ 配列の長さ：２０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列
【００８９】配列番号：７ 配列の長さ：２０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列
【００９０】配列番号：８ 配列の長さ：１９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列
【００９１】配列番号：９ 配列の長さ：１５アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００９２】配列番号：１０ 配列の長さ：１３アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【００９３】配列番号：１１ 配列の長さ：５２塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列
【００９４】配列番号：１２ 配列の長さ：４４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列
【００９５】配列番号：１３ 配列の長さ：４７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列
【００９６】配列番号：１４ 配列の長さ：３４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列
【００９７】配列番号：１５ 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列
【図１】ミスマッチしておよび正しくマッチして取り込
まれた放射標識ヌクレオチドのＨｉＦｉ Ｂｓｔ ＤＮ
Ａポリメラーゼによる３’末端からの切除をＣＰＭ（カ
ウント／分）で示すグラフ（ＨｉＦｉ Ｂｓｔ ＤＮＡ
ポリメラーゼについては本文中に記載）．
まれた放射標識ヌクレオチドのＨｉＦｉ Ｂｓｔ ＤＮ
Ａポリメラーゼによる３’末端からの切除をＣＰＭ（カ
ウント／分）で示すグラフ（ＨｉＦｉ Ｂｓｔ ＤＮＡ
ポリメラーゼについては本文中に記載）．
【図２】本発明のＤＮＡポリメラーゼを用いて得られた
配列決定ゲルのラジオオートグラフ．分離して均一に標
識されたバンドによる配列パターンを明瞭に見ることが
できる．
配列決定ゲルのラジオオートグラフ．分離して均一に標
識されたバンドによる配列パターンを明瞭に見ることが
できる．
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 フェング ザイ 中華人民共和国 シャンハイ，シャンハイ インスチチュート オブ バイオケミス トリィ 気付 (72)発明者 ウエイ − フア フアング 中華人民共和国 ツエジオング プロビン ス，ニンボ，ユン − シ ストリート, レイン 35，ナンバー ５，ルーム 704
Claims (31)
- 【請求項１】 以下のアミノ酸配列 【化１】 を有するペプチドを産生できるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの株． - 【請求項２】 ペプチドは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
であり，そのＤＮＡポリメラーゼは，鋳型からのＤＮＡ
鎖のＤＮＡ配列の決定時に，ＤＮＡ鎖の３’末端からミ
スマッチしたヌクレオチドを，そのＤＮＡポリメラーゼ
が鋳型のヌクレオチドと正しくマッチしたヌクレオチド
を除去する機能の速度より速い速度で切除するように機
能してプルーフリーディング３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性を発揮することが可能であり，またそのＤＮＡ
ポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を示
さない「請求項１」に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅ
ａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの株． - 【請求項３】 Ｂｓｔ ３２０である「請求項１」に記
載のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓの株． - 【請求項４】 ペプチドは以下のヌクレオチド配列 【化２】 【化３】 を有するＤＮＡセグメントによってコードされる「請求
項１」のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓの株． - 【請求項５】 以下のヌクレオチド配列 【化４】 【化５】 またはそれと相補性の配列を有するＤＮＡセグメント．
- 【請求項６】 「請求項５」のＤＮＡセグメントによ
ってコードされるペプチド． - 【請求項７】 以下のアミノ酸配列 【化６】 【化７】 を有するペプチド．
- 【請求項８】 「請求項７」のペプチドをコードする
ＤＮＡ配列． - 【請求項９】 以下のアミノ酸配列 【化８】 を有するペプチドを産生できる宿主細胞．
- 【請求項１０】 ペプチドは熱安定性ＤＮＡポリメラー
ゼであり，そのＤＮＡポリメラーゼは，鋳型からのＤＮ
Ａ鎖のＤＮＡ配列の決定時に，ＤＮＡ鎖の３’末端から
ミスマッチしたヌクレオチドを，そのＤＮＡポリメラー
ゼが鋳型のヌクレオチドと正しくマッチしたヌクレオチ
ドを除去する機能の速度より速い速度で切除するように
機能してプルーフリーディング３’−５’エキソヌクレ
アーゼ活性を発揮することが可能であり，またそのＤＮ
Ａポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を
示さない「請求項９」の宿主細胞． - 【請求項１１】 大腸菌である「請求項９」の宿主細
胞． - 【請求項１２】 大腸菌ＪＦ１１２５である「請求項１
１」の宿主細胞． - 【請求項１３】 ペプチドは以下のヌクレオチド配列 【化９】 【化１０】 を有するＤＮＡセグメントによってコードされる「請求
項９」の宿主細胞． - 【請求項１４】 以下のヌクレオチド配列 【化１１】 【化１２】 を有するＤＮＡセグメント．
- 【請求項１５】 「請求項１４」のＤＮＡセグメント
によってコードされるペプチド． - 【請求項１６】 以下のアミノ酸配列 【化１３】 【化１４】 を有するペプチド．
- 【請求項１７】 「請求項１６」のペプチドをコード
するＤＮＡ配列． - 【請求項１８】 ＤＮＡ構築体であって，（ｉ） 「請
求項１４」のＤＮＡセグメント，および（ｉｉ）そのＤ
ＮＡ構築体を真核宿主細胞または原核宿主細胞内に導入
するためのベクターからなるＤＮＡ構築体． - 【請求項１９】 ベクターはクローニングベクターまた
は発現ベクターである「請求項１８」のＤＮＡ構築体． - 【請求項２０】 「請求項１８」のＤＮＡ構築体によ
り，その構築体中のＤＮＡセグメントによってコードさ
れたペプチドの発現が可能な様式で安定にトランスフォ
ームされた宿主細胞． - 【請求項２１】 ペプチドは熱安定性ＤＮＡポリメラー
ゼであり，そのＤＮＡポリメラーゼは，鋳型からのＤＮ
Ａ鎖のＤＮＡ配列の決定時に，ＤＮＡ鎖の３’末端から
ミスマッチしたヌクレオチドを，そのＤＮＡポリメラー
ゼが鋳型のヌクレオチドと正しくマッチしたヌクレオチ
ドを除去する機能の速度より速い速度で切除するように
機能してプルーフリーディング３’−５’エキソヌクレ
アーゼ活性を発揮することが可能であり，またそのＤＮ
Ａポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を
示さない「請求項２０」の宿主細胞． - 【請求項２２】 ＤＮＡ構築体であって，（ｉ）「請求
項１６」のペプチドをコードするＤＮＡセグメント，お
よび（ｉｉ）そのＤＮＡ構築体を真核宿主細胞または原
核宿主細胞内に導入するためのベクターからなるＤＮＡ
構築体． - 【請求項２３】 ベクターはクローニングベクターまた
は発現ベクターである「請求項２２」のＤＮＡ構築体． - 【請求項２４】 「請求項２２」のＤＮＡ構築体によ
り，その構築体中のＤＮＡセグメントによってコードさ
れたペプチドの発現が可能な様式で安定にトランスフォ
ームされた宿主細胞． - 【請求項２５】 「請求項１」のＢａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの株によって産
生される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ． - 【請求項２６】 ＤＮＡポリメラーゼとして，ＤＮＡ鎖
の３’末端からミスマッチしたヌクレオチドをそのＤＮ
Ａポリメラーゼが鋳型のヌクレオチドと正しくマッチし
たヌクレオチドを除去する機能の速度より速い速度で切
除するように機能してプルーフリーディング３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性を発揮することが可能であり，
またそのＤＮＡポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレ
アーゼ活性を示さないＤＮＡポリメラーゼを用いて，ヌ
クレオチド塩基ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰおよびｄ
ＴＴＰまたはそれらの類縁体ならびにｄｄＮＴＰチェー
ンターミネーターの存在下にＤＮＡ鎖を複製させる工程
からなるＤＮＡ鎖の複製方法． - 【請求項２７】 ＤＮＡポリメラーゼは以下のアミノ酸
配列 【化１５】 を有する「請求項２６」のＤＮＡ鎖の複製方法． - 【請求項２８】 ＤＮＡポリメラーゼは以下のアミノ酸
配列 【化１０】 【化１６】 を有する「請求項２６」のＤＮＡ鎖の複製方法． - 【請求項２９】 ＤＮＡ鎖の配列を決定する方法におい
て， ｉ）プライマーを配列を決定するＤＮＡ鋳型にハイブリ
ダイズさせ， ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼとして，ＤＮＡ鎖の３’末端
からミスマッチしたヌクレオチドをそのＤＮＡポリメラ
ーゼが鋳型のヌクレオチドと正しくマッチしたヌクレオ
チドを除去する機能の速度より速い速度で切除するよう
に機能してプルーフリーディング３’−５’エキソヌク
レアーゼ活性を発揮することが可能で，またそのＤＮＡ
ポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を示
さないＤＮＡポリメラーゼを使用して，ヌクレオチド塩
基ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰまたは
それらの類縁体ならびにｄｄＮＴＰチェーンターミネー
ターの存在下に，ＤＮＡ鎖が配列決定されるような条件
下にプライマーを延長させる工程からなる方法． - 【請求項３０】 ＤＮＡポリメラーゼは以下のアミノ酸
配列 【化１７】 【化１８】 を有する「請求項２９」のＤＮＡ鎖の配列の決定方法． - 【請求項３１】 ＤＮＡポリメラーゼは以下のアミノ酸
配列 【化１９】 を有する「請求項２９」のＤＮＡ鎖の配列の決定方法．
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/544,643 US5747298A (en) | 1994-11-17 | 1995-10-18 | DNA polymerase with proof-reading 3'-5' exonuclease activity Bacillus stearothermophilus |
| US544643 | 1996-05-03 | ||
| US642684 | 1996-05-03 | ||
| US08/642,684 US5834253A (en) | 1994-11-17 | 1996-05-03 | Bacillus stearothermophilus DNA polymerase with proof-reading 3'-5' exonuclease activity |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09220087A true JPH09220087A (ja) | 1997-08-26 |
Family
ID=24577593
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8160402A Pending JPH09220087A (ja) | 1995-10-18 | 1996-05-17 | プルーフリーディング３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する新規ｄｎａポリメラーゼ |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5834253A (ja) |
| EP (1) | EP0810288A3 (ja) |
| JP (1) | JPH09220087A (ja) |
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| US6436677B1 (en) | 2000-03-02 | 2002-08-20 | Promega Corporation | Method of reverse transcription |
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| CN1384203A (zh) * | 2001-04-30 | 2002-12-11 | 香港科技创业股份有限公司 | 具有高度延伸专一性的dna低温循环延伸反应方法 |
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| US8993298B1 (en) | 2012-08-31 | 2015-03-31 | New England Biolabs, Inc. | DNA polymerases |
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| US5814506A (en) * | 1995-08-02 | 1998-09-29 | New England Biolabs, Inc. | Over-expression and purification of a truncated thermostable DNA polymerase by protein fusion |
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1996
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- 1996-05-14 EP EP96303375A patent/EP0810288A3/en not_active Withdrawn
- 1996-05-17 JP JP8160402A patent/JPH09220087A/ja active Pending
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0810288A2 (en) | 1997-12-03 |
| US5834253A (en) | 1998-11-10 |
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