JP2005514003A

JP2005514003A - 高いプライミング特異性を有するｄｎａの低温サイクル伸長

Info

Publication number: JP2005514003A
Application number: JP2003503756A
Authority: JP
Inventors: ファンホン，ゴウ; ヤン，ユンジェ; ズゥー，ジャー
Original assignee: シャンハイメンデルディーエヌエーセンターシーオー．，エルティーディー
Priority date: 2001-06-08
Filing date: 2002-06-05
Publication date: 2005-05-19
Also published as: WO2002101004A3; RU2004100107A; EP1436391A4; CA2449560A1; WO2002101004A2; EP1436391A2

Abstract

本発明はサイクルシークエンシングおよびＰＣＲのための低温サイクルＤＮＡ増幅においてプライマーまたはプライマー対を伸長する方法に関する。とりわけ方法は、ＤＮＡの融点（すなわち二本鎖ＤＮＡが変性する温度）を低下させる作用物質として低濃度のグリセロールもしくはエチレングリコールまたはその混合物の存在下での中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせ使用を企図する。直ぐ使用するために準備されたキットにおいて室温で数週間安定である、予め分配された、高忠実度および高プロセッシビティーＤＮＡポリメラーゼの反応混合物もまた本発明により企図される。

Description

その遺伝物質がリボ核酸（ＲＮＡ）である特定のウイルスを除いて、全ての公知の生存生物の遺伝物質はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。ＤＮＡは特定の配列で化学的に連結された個々のデオキシヌクレオチドの鎖からなる。各デオキシヌクレオチドはアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）でよい４つの窒素含有塩基、およびその３’位にヒドロキシル基が結合し、そしてその５’位にリン酸塩基が結合した五炭糖であるデオキシリボースを含有する。ＤＮＡ鎖を形成する近接するデオキシヌクレオチドは、ＤＮＡ分子の開始部がいつもデオキシリボースの５’炭素に結合したリン酸塩基を有しているように、１つのペントース環の５’位を隣のペントース環の３’位に連結するリン酸ジエステル結合により互いに連結されている。ＤＮＡ分子の末端はいつもデオキシリボースの３’炭素上でＯＨ（ヒドロキシル）基を有している。

ＤＮＡは通常、２つの逆並行ＤＮＡ鎖が厳密に対応した「Ａ−Ｔ」および「Ｃ−Ｇ」対合の様式で２つのＤＮＡ鎖の個々のヌクレオチドの塩基間の水素結合により維持されている二本鎖分子として存在する。遺伝子を決定するのはＤＮＡの鎖における塩基の順序すなわち配列であり、今度は遺伝子が合成されるタンパク質の型を決定する。従って、タンパク質の遺伝子コードをも構成するＤＮＡ鎖における塩基の配列の正確な決定は、関係するタンパク質の特性を理解する基礎として重要である。

ＤＮＡ分子の塩基の配列を決定するのに用いられる方法をＤＮＡシークエンシングと称する。ＤＮＡシークエンシングの技術の中でもＳａｎｇｅｒら（１）により開発された酵素的方法が最も一般的である。これはＤＮＡポリメラーゼが、４つの正常なデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの存在下でシークエンシングすべきＤＮＡ鋳型にアニーリングしたプライマーを伸長させる能力、ならびにヌクレオチドアナログ、ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）、すなわちｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＴＴＰが種々の長さで伸張するデオキシヌクレオチド重合体の伸長を停止させる能力に基づく。

二本鎖ＤＮＡ鋳型を用いる酵素的重合反応では、標的ＤＮＡフラグメントを変性させる必要がある。そのために、二本鎖ＤＮＡを通常９５℃まで加熱することにより分子を変性させ、２つの相補的一本鎖ＤＮＡフラグメントを生成する。酵素的ＤＮＡ重合反応では、プライマーがその相補的配列にアニーリングした後、一本鎖鋳型が伸長して新たなＤＮＡ鎖を形成したとき、その融点を越える９５℃まで加熱するとその鋳型から新たなＤＮＡ鎖を分離することができる。機能的ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下、酵素的ＤＮＡ合成の別のサイクルに備えて冷却したときに、一本鎖鋳型を再びオリゴヌクレオチドプライマーとのアニーリングに利用する。高温で変性させた後、ＤＮＡ合成の各サイクルを開始するために新たな酵素を添加する必要がないように、通常９５℃までの加熱に耐え、そして５５℃から７２℃の温度で活性である熱抵抗性ＤＮＡポリメラーゼをその系に用いる。過剰のプライマーを鋳型と混合し、複数回温度サイクルを繰り返す場合、伸長した一本鎖標的フラグメントの数はサイクル毎に１倍増加する。Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ塩基の４つ全てを含むｄｄＮＴＰのセットまたはそのアナログが反応系の連鎖ターミネーターとして存在する場合、全てがその５’末端で同一のプライマーを有し、そして特異的ｄｄＮＴＰまたはそのアナログで終止し、レポーターとして蛍光色素で標識され得る種々の長さの多くの一本鎖ＤＮＡフラグメントが３’末端で生成される。これが蛍光色素標識ＤＮＡターミネーターを用いる自動化ＤＮＡサイクルシークエンシングの基本となる。

二本鎖ＤＮＡ鋳型の標的配列の２つの末端に相補的な２つのプライマーのセット（１つは順行性、もう１つは逆行性）を前記のＤＮＡサイクルシークエンシング系に用いる場合、新たに伸長したＤＮＡ鎖を次のＤＮＡ合成のサイクルにおけるさらなる鋳型として提供することができる。従って、加熱サイクルが複数回繰り返されると、標的配列フラグメントのコピー数が指数的に増幅される。これがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の基本となる。
米国特許第５４３２０６５号米国特許第５７４７２９８号米国特許第５８３４２５３号米国特許第６１６５７６５号米国特許出願第０９／７３５６７７号米国特許第５８３４２５４号

実際には、蛍光色素標識ターミネーターおよびＰＣＲを用いる自動化サイクルシークエンシングは双方共に、９５℃の加熱温度に耐え得る熱抵抗性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）およびその等価物の使用に依存している。しかしながら、熱抵抗性ポリメラーゼは通常低プロセッシビティーに随伴され、そして特定の予測不能な条件下で、とりわけ鋳型のＧＣ富化ＤＮＡセグメント（すなわちチミンおよびアデニンの含量に相対して有意に高含量のグアニンおよびシトシンを含有するセグメント）が増幅されるかまたはシークエンシングされる場合、配列特異的ポリメラーゼ活性を喪失し得る。従って、一般に熱抵抗性ＤＮＡポリメラーゼよりも忠実度が高く、そしてプロセッシビティーが高い、熱不安定性のＤＮＡポリメラーゼを用いる低温サイクルシークエンシングおよび低温ＰＣＲサイクルに適した条件を開発するための試みが為されている。例えば、米国特許第５４３２０６５号では、鋳型ＤＮＡの融点を低下させ、そしてサイクルプライマー伸長反応において８０℃以下の温度でプライマーを伸長する、最終濃度４０（容量／容量）％のグリセロールまたはエチレングリコールの、ＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘおよびＫｌｅｎｏｗフラグメントに由来するＤＮＡポリメラーゼと組み合わせた使用について記載されている。しかしながら、グリセロールがかかる高濃度であってもＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼが低温サイクルプライマー伸長に有用でないことが後になって見出された。反応混合物にプロリンを添加してグリセロール濃度を１７（容量／容量）％まで低下させると、７０℃から３７℃の範囲の温度でＰＣＲサイクルにおけるＫｌｅｎｏｗポリメラーゼ活性を保護するようであった。（ＩａｋｏｂａｓｈｖｉｌｉおよびＬａｐｉｄｏｔ）。低温サイクルプライマー伸長に関するこれらの手順により、高品質の配列特異的ＰＣＲ産物が作成されず、またＤＮＡシークエンシングに適した反応産物が作成されないことが有意に示されている。ＩａｋｏｂａｓｈｖｉｌｉおよびＬａｐｉｄｏｔは、とりわけ２０から２５塩基対（ｂｐ）の長さのプライマーを使用した場合、低温サイクルプライマー伸長で生成されたＰＣＲ産物が配列特異的ではないことが解っていると報告している。出願では低温範囲でＫｌｅｎｏｗポリメラーゼを用いる長いプライマー（例えば３０から３５ｂｐの長さ）のサイクル伸長に成功した記載されていたが、系がかかる長いプライマーから有用な配列特異的増幅産物を作成することは示されていない。ＤＮＡサイクルシークエンシングおよびＰＣＲで用いられるたいていのプライマーが３０ｂｐの長さよりも短いので、シークエンシングおよびさらなる分子分析に有用な増幅ＤＮＡ産物を作成するために３０ｂｐよりも短い（好ましくは約２０ｂｐ）プライマーの配列特異的伸長を達成することができる低温サイクル系が希求される。

この出願で記載する発明はかかる系を提供している。前記の問題点を考慮して、本発明者は自動化サイクルシークエンシングおよびＰＣＲのためのサイクルＤＮＡ増幅においてプライマーまたはプライマー対を伸長する方法を開発した。とりわけ該方法はＤＮＡの融点（すなわちＤＮＡの二本鎖を変性させる温度）を低下させる作用物質として低濃度のグリセロールもしくはエチレングリコール、またはその混合物の存在下での中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを企図している。本発明者は特定の濃度範囲でグリセロールおよび／またはエチレングリコールがＤＮＡ鋳型の融点を低下させるのみならず、中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの重合活性を増強することを観察した。これらの酵素的反応系では、循環温度範囲は、通常ＤＮＡを変性するのに必要とされる温度よりもかなり低い７０℃から３７℃の間である。加えて、該方法は高プロセッシビティーで、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘまたはＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓに由来する中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用する。これらのポリメラーゼは６５℃の最適反応温度を有するが、７０℃を超えると急速に不活性化される；従って熱抵抗性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑおよびその対応する変種、並びに熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＫｌｅｎｏｗフラグメントのいくつかの欠点を打破するためのサイクルプライマー伸長の重合酵素として非常に有用である。中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはその天然の状態（例えば生物から精製されている）か、または修飾されていてよい。

従って、広範な態様では、本発明は、中程度の熱安定性（中等温度好性とも称する）ＤＮＡポリメラーゼの存在下、約１０（容量／容量）％から約２０（容量／容量）％（および好ましくは約１５（容量／容量）％）グリセロール、エチレングリコール、またはその混合物を含む反応混合物において低い循環温度（すなわち約８０℃以下の温度）で酵素的サイクルプライマー伸長反応を用いるプライマー（またはプライマー対）を伸長する方法を企図する。（「酵素的サイクルプライマー伸長反応」とは、反応混合物の温度がサイクルの変性、アニーリングおよびプライマー伸長に必要なレベルの間で繰り返し変動する場合、鋳型よりも過剰のプライマーの下で、限定数の鋳型分子を機能的なＤＮＡポリメラーゼにより触媒されるＤＮＡ重合に繰り返し使用することができることを意味する。「中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ」とは、６５℃の最適反応温度を有するポリメラーゼであって、７０℃を超えると急速に不活性化するポリメラーゼを意味する。）例えば約１０（容量／容量）％から約２０（容量／容量）％（および好ましくは約１５（容量／容量）％）グリセロール、エチレングリコール、またはその混合物を含む反応混合物中でＤＮＡ鋳型を、プライマー（またはプライマー対）およびＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘまたはＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓの１つに由来する中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの天然または修飾形態と混合することができる。ＤＮＡポリメラーゼが約４０℃から５０℃の間でプライマーまたはプライマー対を繰り返し伸長するように、サイクル反応温度が約７０℃の融点および約３７℃の冷却（またはアニーリング）温度の間で変動する条件下で反応を実施することができる。方法は望ましい回数だけサイクルプライマー伸長反応を繰り返すさらなる工程を含むことができる。

別の態様では、鋳型に対して順行性プライマーおよび逆行性プライマー（この場合双方ともに種々の長さでよい）の存在下、（例えばＰＣＲにおいて）加熱および冷却（またはアニーリング）サイクルを繰り返すことにより、二本鎖ＤＮＡの選択されたセグメントのコピーを増幅する。ここで再度、約１０（容量／容量）％から約２０（容量／容量）％（および好ましくは約１５（容量／容量）％）グリセロール、エチレングリコール、またはその混合物を含む反応混合組成物中、前記した中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの存在下、反応を低温（すなわち約８０℃以下の温度）で進行させる。ＤＮＡポリメラーゼが約４０℃から５０℃の間で順行性および逆行性プライマーを繰り返し伸長するように、反応温度が約７０℃の融点および約３７℃の冷却（またはアニーリング）温度の間で変動する条件下で反応を実施することができる。方法は望ましい（例えばサイクル）回数だけ反応を繰り返すさらなる工程を含むことができる。

好ましい態様では、ＤＮＡポリメラーゼは米国特許第５７４７２９８号、米国特許第５８３４２５３号または米国特許第６１６５７６５号に記載されたもののうちの１つである。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼはＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘまたはＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓから単離されたＤＮＡポリメラーゼの９５％以上の相同性を共有するアミノ酸配列を有する。

別の態様では、種々の長さの単一のプライマーの分子はｄｄＮＴＰまたはそのアナログの存在下、サイクルシークエンシングに特異的なヌクレオチド終止を伴って伸長する。

本発明はまた直接的なサイクルシークエンシングのために事前に単離または精製されることなくインビトロで増幅された二本鎖ＤＮＡ産物の一本鎖コピーにアニーリングした一本鎖プライマーの分子を伸長する方法をも企図する。例えば、希釈した粗製増幅反応産物（好ましくは前記した中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される低温ＰＣＲ反応で生成される）を鋳型として使用し、そして過剰量のシークエンシングプライマー、蛍光標識された４つの標準的なターミネーター（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰおよびｄｄＣＴＰ）（または蛍光標識されたその対応するアナログ）、中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは色素標識されたｄｄＮＴＰのサブセットの組み込みに対して本来の選択的識別が低減されているもの）、適当な濃度のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ）、および約１０（容量／容量）％から約２０（容量／容量）％（および好ましくは約１５（容量／容量）％）グリセロール、エチレングリコール、またはその混合物を含有する溶液中にバッファーを含む組成物と混合する。ついで（複数の）標準的なサイクルプライマー伸長反応を８０℃以下の温度で十分な回数進行させて、望ましい種々の長さまでシークエンシングプライマー分子を伸長することができ、その伸長された分子は蛍光標識されたｄｄＮＴＰまたはその対応するアナログにより特異的に終止する。好ましくは、サイクル反応温度は約７０℃の融点および約３７℃の冷却（またはアニーリング）温度の間で変動する。

１つの好ましい態様では、ＤＮＡ鎖をシークエンシングする方法は：
ｉ）プライマーをシークエンシングすべきＤＮＡ鋳型にハイブリダイズさせる工程と；および
ｉｉ）それによりサイクル反応温度は約７０℃の融点および約３７℃の冷却（またはアニーリング）温度の間で変動する、約１０（容量／容量）％から約２０（容量／容量）％（および好ましくは約１５（容量／容量）％）グリセロール、エチレングリコール、またはその混合物を含有する溶液、十分量のデオキシヌクレオチド塩基、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、ならびに４つのジデオキシヌクレオチドターミネーターまたはそのアナログの存在下で、そしてＤＮＡ鎖がシークエンシングされる条件下で、前記したＤＮＡポリメラーゼの１つを用いてプライマーを伸長させる工程と；
を含むことができる。好ましくは、デオキシヌクレオチドの１つは放射性同位元素で標識されているか、またはプライマー分子が蛍光色素標識されており、さらに好ましくは、全てのジデオキシヌクレオチドターミネーターは蛍光色素標識されている。

別の態様では、本発明は約８０℃以下の温度で低温サイクルプライマー伸長反応での使用に適した、直ぐ使用できるように準備された乾燥または液体の反応混合物またはキットを必要とする。この反応混合物またはキットは、ＤＮＡ増幅における使用またはジデオキシリボヌクレオチドアナログでの特異的伸長終止に適した、少なくとも１つの酵素的ＤＮＡプライマー伸長反応成分と予め混合された中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば前記したものの１つ）を含む。好ましくは、反応混合物はマイクロ遠心チューブに、またはマルチプルウェルプレート、例えば大規模な自動化ＰＣＲまたは大規模な自動化ＤＮＡシークエンシングに適したものに予め分配されている。この直ぐ使用できるように準備された反応混合物またはキットを約２２℃から約２５℃の室温で、少なくとも８週間、ＤＮＡプライマー増幅または伸長終止に特異的なその重合活性を喪失することなく保存することができる。

本発明のさらなる目的および利点は以下の記載および実施例から明らかになろう。

図１−６についてのさらなる詳細は以下の記載および実施例に含まれる。

前記したように、本発明は、グリセロール、エチレングリコールおよびその混合物からなる群から選択される作用物質の低濃度の存在下、中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘまたはＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ）の独特な組み合わせを必要として、８０℃以下の温度で自動化サイクルシークエンシングおよびＰＣＲのためのサイクルＤＮＡ増幅においてプライマー（またはプライマー対）を伸長させる方法を提供する。本発明者はグリセロールおよびエチレングリコールの双方が低濃度で中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの配列特異的ＤＮＡ重合活性をインビトロで増強することを見出した。高濃度、例えば３５％以上では、グリセロールおよびエチレングリコールの双方がこれらの酵素のＤＮＡ重合活性に有害な阻止効果を呈する。しかしながら本発明者は、二本鎖ＤＮＡ鋳型が７０℃で変性するが、低温配列特異的サイクルプライマー伸長の間、中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの重合活性を保存することができる最適濃度のグリセロールおよびエチレングリコールの反応混合物を達成した。

例えば、本発明者は最初に６５℃の最適酵素反応温度、約２０％までのグリセロール最終濃度により、中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’重合活性が増強されることを観察した（例えば図１参照）。しかしながら、グリセロールの濃度を約３５％以上まで上昇させた場合、この酵素活性が定常的に抑制された。グリセロールの濃度を４０（容量／容量）％まで上昇させた場合、この群のＤＮＡポリメラーゼは通常元来の重合活性の３分の２（２／３）以上を喪失した。４０％グリセロールを含有する溶液中での中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いる低温サイクル伸長により、種々のフラグメントサイズの不明瞭な非特異的増幅産物が生成される（例えば図２参照）。

本発明者は３５％グリセロールの存在下、中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＢｓｔ変異体またはＢｃａにより触媒される低温サイクルプライマー伸長反応により、２５０ｂｐおよび４００ｂｐの長さの標的産物を全く増幅しないという結果に至ることを見出した。ＤＮＡのさらに長いセグメント、例えば１ｋｂおよび２ｋｂの長さが増幅標的である場合、明白に増幅される；しかし反応産物は非特異的である（例えば図３参照）。

低濃度、例えば１５（容量／容量）％のグリセロール、およびＢｓｔ変異体またはＢｃａＤＮＡポリメラーゼを用いて、２５０ｂｐ未満から２ｋｂ以上の長さの配列特異的増幅産物を生成することができることがさらに見出された（例えば図３参照）。

例えば約１０（容量／容量）％から約２０（容量／容量）％、好ましくは約１５（容量／容量）％の低濃度のグリセロールを用いて、中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせたサイクルプライマー伸長のＤＮＡ融点を低下させて配列特異的増幅産物を生成することができる。

この低温サイクル伸長系では、３０塩基対未満、２０塩基対よりも短いものさえ含む広範な長さのＤＮＡフラグメントを配列特異的伸長のためのプライマーとして使用することができる（例えば図４参照）。熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＫｌｅｎｏｗフラグメントはさらなる分析に有用な、なんらかの有意な量の増幅産物を生成することができない（例えば図４参照）。双方ともに熱抵抗性ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの修飾された形態であるＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ^ＴＭおよびＡｍｐｌｉＴａｑ^ＴＭは低温サイクル伸長系のさらなる分析に有用な配列特異的産物を生成することができない。しかしながら、最適高温（９５℃で溶融）サイクル伸長条件下では、これらの２つの酵素はたいていのＤＮＡ鋳型にアニーリングしたプライマーをＧＣ富化セグメントに遭遇するまで伸長することができる。低温サイクル伸長のための、中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用した結果と比較して、高温サイクル伸長の下での熱抵抗性ＤＮＡポリメラーゼの低プロセッシビティーが、公知のＧＣ富化の鋳型の自動化サイクルシークエンシングに使用した場合に明白になる。熱抵抗性ＤＮＡポリメラーゼは鋳型のＧＣ富化セグメントの下流で配列特異的ｄｄＮＴＰ終止を生成しないが、一方中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば変異Ｂｓｔ−ＩＩはＤＮＡポリメラーゼサイクル伸長の間のＧＣ富化の妨害を打破に成功することができる（例えば図５参照）。

前記したように、中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの使用は本発明の方法に非常に重要である。「中程度の熱安定性」とはこれらのポリメラーゼが６５℃の最適反応温度を有するが、７０℃を超えると急速に不活性化されることを意味する。そのためには、本発明はＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘ（Ｂｃａ）またはＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ（Ｂｃｙ）の１つまたはそれ以上のから得られる、または誘導されるＤＮＡポリメラーゼを企図する。これらの生物の３つ全ては、そのＤＮＡポリメラーゼが熱安定性（６５℃で最も活性）と称されているが、７０℃またはそれを超えると不活性化されるので、中等温度好性微生物として分類される。これはその他の酵素、例えば真の好熱性であるＴａｑと対照的であり、すなわちＴａｑＤＮＡポリメラーゼは９５℃以上の高温に耐え、そして依然活性である。これらの中等温度好性バシラス株、とりわけＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓは、ＤＮＡサイクルシークエンシングおよびＰＣＲ適用に有用なＤＮＡポリメラーゼを生成する。

好ましい態様では、鋳型上のＤＮＡプライマー伸長の間、ＤＮＡポリメラーゼが鋳型のヌクレオチドに正確に対合するヌクレオチドを除去するように機能するよりも早い速度で、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ鎖の３’末端から誤対合ヌクレオチドを切除するように機能するように、中程度の熱安定性（しばしば中等温度好性とも称される）ＤＮＡポリメラーゼがプルーフリーディング３’−５’エクソヌクレアーゼ活性を有し得る。本発明者は米国特許第５８３４２５３号、米国特許第５７４７２９８号および米国特許第６１６５７６５号においてもかかるＤＮＡポリメラーゼについて記載している（その全ての内容を出展明示により全て本明細書の一部とする）。Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの１つの株（識別目的でＮｏ．３２０株と称する；米国特許第５７４７２９８号にて記載）はプルーフリーディング３’−５’エクソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ３２０と称する）を生成し、この活性はＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのその他の株から単離されたＤＮＡポリメラーゼでは存在しない。（本発明では「プルーフリーディング」なる用語は、ＤＮＡシークエンシング中に鋳型のヌクレオチドに正確に対合するヌクレオチドが除去される速度よりも速い速度で、ＤＮＡポリメラーゼが新たに形成されたＤＮＡ鎖の３’末端から誤対合ヌクレオチドを除去できることを意図している。）Ｂｓｔ３２０株は１９９５年１０月３０日に、１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｅｒｙｌａｎｄ２０８５２に位置するＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、ＡＴＣＣ表示番号５５７１９が与えられている。Ｂｓｔ３２０から単離されるＤＮＡポリメラーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのその他の公知の株、例えばＲｉｇｇｓら（ジェンバンク受け入れ番号Ｌ４２１１１）およびＰｈａｎｇら（ジェンバンク受け入れ番号Ｕ２３１４９）により寄託された株のＤＮＡポリメラーゼと同様に５８７個のアミノ酸から成る。しかしながら、Ｂｓｔ３２０はＲｉｇｇｓらにより寄託されたＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡポリメラーゼとタンパク質レベルで８９．１％の配列同一性しか共有せず、そしてＰｈａｎｇらにより寄託されたＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡポリメラーゼとタンパク質レベルで８７．４％の配列同一性しか共有しない。ちなみにＲｉｇｇｓらにより寄託された前記の参照酵素およびＰｈａｎｇらにより寄託された酵素はそのアミノ酸配列同一性を９６．９％共有する。

本発明者は異なる種であるＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘ（Ｂｃａ）から単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼについて研究し、これもまた６５℃で最適な活性温度を有している。本発明者は、Ｂｓｔ３２０ＤＮＡポリメラーゼがＢｃａＤＮＡポリメラーゼと８８．４％のアミノ酸配列同一性を共有することを見出した（Ｕｅｍｏｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｅｈｅｍ．１１３：４０１−４１９（１９９３））。アミノ酸配列相同性に基づいて、Ｂｓｔ３２０ＤＮＡポリメラーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから単離されたＤＮＡポリメラーゼに対するのと同様に、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、すなわちバシラスの別の種から単離されたＤＮＡポリメラーゼに近い。Ｂｓｔ３２０ＤＮＡポリメラーゼおよびＢｃａＤＮＡポリメラーゼの双方が機能的に３’−５’エクソヌクレアーゼ活性を呈し、これは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩモデルまたはその他の公知のＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼにあるような公知のアミノ酸配列エクソヌクレアーゼモチーフＩ、ＩＩおよびＩＩＩに随伴されないこともまた見出された。

以下のアミノ酸配列を有する１つの好ましいＢｓｔＤＮＡポリメラーゼが３２０株から単離される：

文字は以下のアミノ酸を表す：
Ａ：アラニン（Ａｌａ）Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）
Ｃ：システイン（Ｃｙｓ）Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）
Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）
Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）
Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）
Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）
Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）Ｔ：スレオニン（Ｔｈｒ）
Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）Ｖ：バリン（Ｖａｌ）
Ｋ：リジン（Ｌｙｓ）Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ）
Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）Ｙ：チロシン（Ｔｙｒ）
このＢｓｔ３２０ＤＮＡポリメラーゼはプルーフリーディング３’−５’エクソヌクレアーゼ活性を有することにより特徴づけられる。

Ｂｓｔ３２０ＤＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を以下の配列番号：１に示す：
ＤＮＡ配列（単離された／精製された）：

文字は以下のヌクレオチドを表す：
Ａ：アデノシン、Ｔ：チミジン、Ｃ：シチジン、Ｇ：グアノシン

しかしながら、本発明では非常に有用であるが、中等温度好性株であるＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘまたはＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓのＤＮＡポリメラーゼの欠点は、ＤＮＡシークエンシング中にこれら全てが蛍光色素標識ｄｄＮＴＰのある特定のメンバー、すなわち蛍光色素標識ｄｄＣＴＰおよび蛍光色素標識ｄｄＡＴＰの組み込みに対して、酵素反応中のＤＮＡフラグメント伸長の３’末端へのターミネーターとして高度に選択的な識別を呈するということである。この特有の特性である、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘから単離された天然ＤＮＡポリメラーゼの蛍光色素標識ｄｄＣＴＰおよびｄｄＡＴＰの組み込みに対する選択的識別は、最近本発明者により認識されただけであった。かかる選択的識別は明らかに配列関連性であり、そして単にｄＮＴＰの濃度の調整により修正または補正することはできない。

従って、別の好ましい態様では、使用したＤＮＡポリメラーゼは、色素標識ターミネーター自動化ＤＮＡサイクルシークエンシングの間に、別の２つの色素標識ｄｄＮＴＰターミネーター（ｄｄＴＴＰおよびｄｄＧＴＰ）の組み込み速度を過剰に上昇させることなく、蛍光色素標識ｄｄＣＴＰおよび蛍光色素標識ｄｄＡＴＰの組み込みに対して本来の選択的識別を低減させる中等温度好性バシラスＤＮＡポリメラーゼ（例えばＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘおよびＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ）である。かかるＤＮＡポリメラーゼについては、本発明者により米国特許第６１６５７６５号に記載されている（その全ての内容を出展明示により全て本明細書の一部とする）。

例えば、選択的識別を低減するこの能力を有するポリメラーゼを、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘおよびＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓの株から得るか、もしくはそうでなければ誘導するか、または合成することができ、この場合、天然発生ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は各々Ｂｓｔ３２０ＤＮＡポリメラーゼの３４２−３４４位置に相当する位置でロイシン−グルタミン酸―グルタミン酸を、およびＢｓｔ３２０ＤＮＡポリメラーゼの４２２位置に相当する位置でフェニルアラニンを有している。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘおよびＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓの別の株に由来するＤＮＡポリメラーゼを、前記で同定されたアミノ酸またはヌクレオチド置換を含むように慣用されるＤＮＡ修飾技術を用いて容易に修飾することができる。

以下のアミノ酸配列は、本発明の別の好ましい態様として、３４２−３４４位置でスレオニン、プロリンおよびロイシンを各々ロイシン、グルタミン酸およびグルタミン酸に、ならびに４２２位置でチロシンをフェニルアラニンに置換するように天然発生Ｂｓｔ３２０ＤＮＡポリメラーゼから修飾された、修飾Ｂｓｔ３２０ＤＮＡポリメラーゼ（本明細書で「ＢｓｔＩＩ」または「ＨｉＦｉＢｓｔＩＩ」とも称する）を表す。

下線を付したアミノ酸は天然発生Ｂｓｔ３２０ＤＮＡポリメラーゼの部位特異的変異により生成された置換アミノ酸である。

修飾されたＢｓｔ３２０ＤＮＡポリメラーゼは例えば以下（配列番号：３）のＤＮＡ配列によりコードされる：

下線を付したヌクレオチドＴＡＣは、天然発生Ｂｓｔ３２０ポリメラーゼの部位特異的変異により生成された置換ヌクレオチドである。（当業者には明らかなように、このＤＮＡ配列は出発コドンを示していない。）

ＤＮＡポリメラーゼはまたＢｓｔ３２０または修飾されたＢｓｔ３２０ＤＮＡ配列に相補的であるＤＮＡ配列、例えばストリンジェント条件下で前記のＤＮＡ配列の１つにハイブリダイズするＤＮＡ配列を有しているものでもよい。当業者には理解されるように、ＤＮＡ配列はまたこれらの特徴および特性を有しているペプチドをコードするもの（縮重ＤＮＡコードを含む）をも企図する。

企図されるＤＮＡ配列およびアミノ酸配列には、ＤＮＡポリメラーゼの機能またはその特徴における実質的な変化に至らないアレル変種および変異体（例えばヌクレオチドまたはアミノ酸配列の付加または欠失、配列組換えまたは置換または変化）などがある。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは機能的には変化（すなわち形質転換宿主細胞により引き起こされるこれらの変化）しないヌクレオチドまたはアミノ酸の重要でない置換を包含する。加えて、本発明はＤＮＡポリメラーゼの融合タンパク質およびムテインを含むことを意図する。

修飾されたおよび修飾されていないＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列はまた、例えばＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、またはＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するその他の細菌株、またはその他の中等温度好性バシラス株、例えばＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘおよびＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓからＤＮＡポリメラーゼを単離および精製することにより得ることができる。これらの生物から得られるＤＮＡポリメラーゼは、修飾されていないアミノ酸配列が、Ｂｓｔ３２０ＤＮＡポリメラーゼの３１２−３４４位置に各々相当する位置でロイシン−グルタミン酸を有し、そしてＢｓｔ３２０ＤＮＡポリメラーゼの４２２位置に相当する位置でフェニルアラニンを有している限り、慣用されるＤＮＡ修飾技術を用いて容易に修飾して、高忠実度で、高プロセッシビティーの熱安定性および蛍光色素標識ｄｄＣＴＰおよびｄｄＡＴＰ選択的識別の低減の特性を達成することができる。例えば本明細書に記載するプライマーおよびスクリーニング方法を用いて、当業者は同一の特性および機能を有しているＤＮＡポリメラーゼをその他の株から単離することができる。

別の好ましい態様では、高度に安定な、例えばＤＮＡシークエンシングの乾燥処理に耐えて生存し続けるのに十分安定な酵素活性を有しているＤＮＡポリメラーゼを使用する。かかるＤＮＡポリメラーゼは本発明者により米国特許出願第０９／７３５６７７号（その内容は出展明示によりその全てを本明細書の一部とする）に記載されている。これらの修飾ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼは安定性特性が増強されており、低温で凍結乾燥または乾燥できるか、または直ぐ使用できるように準備された液体反応混合物で、例えば溶液に再構成した場合に、長時間（例えば、少なくとも８週間）室温で、ｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰ、またはそのアナログの伸長したプライマーの３’末端への正確な組み込みのためにＤＮＡポリメラーゼとしてのその品質を有意に喪失することなく保存することができる。すなわち溶液に再構成し、そして標準的なＤＮＡシークエンシングにおいて使用する場合に、対照（例えば非凍結乾燥または非乾燥）ＤＮＡポリメラーゼと比較して、生成された配列の品質において有意な変動がない。凍結乾燥または乾燥および続く再構成の後、これらのポリメラーゼを公知のＤＮＡシークエンシングプロトコルに用いて優れた品質のＤＮＡ配列を生成することができる。これらのＤＮＡポリメラーゼ、はまた野生型ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼよりも熱安定性が高いことも実証されている。例えば、これらのポリメラーゼは典型的には６５℃で約１６分のポリメラーゼ活性の半減期を有しており、これは野生型ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼのおよそ２倍の長さである。

この開示全体で、「ＨｉＦｉＢｓｔ」または「Ｂｓｔ３２０」ＤＮＡポリメラーゼとは、ＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＮｏ．３２０と称する株の細胞から単離されるか、またはこの天然発生ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の過剰発現により生成されるプルーフリーディング３’−５’エクソヌクレアーゼ活性を有している修飾されていない天然発生ＤＮＡポリメラーゼを意味する。（前記したように、このＢｓｔ株Ｎｏ．３２０およびＤＮＡポリメラーゼは米国特許第５７４７２９８号および米国特許第５８３４２５３号に記載されている。）「ＨｉＦｉＢｓｔ−ＩＩ」とは、蛍光色素標識ｄｄＣＴＰおよびｄｄＡＴＰに対する選択的識別を低減させる能力を有している「ＨｉＦｉＢｓｔ」ＤＮＡポリメラーゼの修飾形態を意味する。ＨｉＦｉＢｓｔ−ＩＩは本発明の１つの好ましい態様の実例である。（Ｂｓｔ株およびＤＮＡポリメラーゼは米国特許第６１６５７６５号に記載されている。）Ｂｓｔ−ＩＩはまた乾燥もしくは凍結乾燥されるか、または直ぐ使用できるように準備された液体反応混合物で適当な溶液に再構成した場合に長時間（例えば、少なくとも８週間）室温で、ｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰまたはそのアナログの伸長されたプライマーの３’末端への正確な組み込みのためにＤＮＡポリメラーゼとしてのその品質を有意に喪失することなく保存されるのに十分な安定性をも有している。（このＢｓｔ株およびＤＮＡポリメラーゼは添付の米国特許出願第０９／７３５６７７号に記載されている。）

従って、本発明の方法の１つの態様では、本発明は低い循環温度（すなわち、約８０℃以下の温度）での酵素的サイクルプライマー伸長反応を用いるプライマー（またはプライマー対）を伸長する方法を企図する。反応混合組成物は約１０（容量／容量）％から約２０（容量／容量）％（好ましくは約１５（容量／容量）％）グリセロール、エチレングリコールまたはその混合物を含む。中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば前記したものの１つの存在下で反応を進行させる。理想的には、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーまたはプライマー対を繰り返し伸長するように、サイクル反応温度が約７０℃の融点および約３７℃の冷却（またはアニーリング）温度の間で変動する条件下で反応を実施する。望む回数だけサイクルプライマー伸長反応を繰り返すさらなる工程を方法に含めることができる。

別の態様では、ＰＣＲまたはＰＣＲ様反応物を８０℃以下の温度で進行させることができる。この方法では、加熱および冷却（またはアニーリング）サイクルを繰り返すことにより、鋳型に対して順行性プライマーおよび逆行性プライマー（この場合双方共に種々の長さでよい）の存在下で二本鎖ＤＮＡの選択されたセグメントのコピーを増幅させる。反応混合組成物は、前記した中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で約１０（容量／容量）％から約２０（容量／容量）％（好ましくは約１５（容量／容量）％）グリセロール、エチレングリコールまたはその混合物を含む。ＤＮＡポリメラーゼが順行性および逆行性プライマーを繰り返し伸長するように、サイクル反応温度が約７０℃の融点および約３７℃の冷却（またはアニーリング）温度の間で変動する条件下で反応を実施するのが好ましい。望む回数だけサイクルプライマー伸長反応を繰り返すさらなる工程を方法に含めることができる。

さらなる態様では、ｄｄＮＴＰまたはそのアナログの存在下、約８０℃以下の低温サイクルシークエンシングに特異的なヌクレオチド終止を有する中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにより種々の長さの単一のプライマー分子を伸長する。ｄｄＮＴＰアナログは、自動色素標識ターミネーターＤＮＡサイクルシークエンシングで用いられるものと同様に、ｄｄＮＴＰの各メンバーが異なる波長を放射するように蛍光色素標識されていてよい。またはその代わりに、蛍光色素標識プライマーＤＮＡサイクルシークエンシング技術と同様に、修飾Ｓａｎｇｅｒ反応のための対応するｄｄＮＴＰの未標識メンバーとのペアリングに用いられるシークエンシングプライマーを４つの異なる色素で標識する。また別に、先行してＰＣＲ増幅を行わずに、少量のＤＮＡ鋳型を手作業で直接シークエンシングするための、放射性同位元素で標識したｄＡＴＰを用いる古典的なＳａｎｇｅｒプロトコルに低温サイクルプライマー伸長終止反応を用いることができる。

別の態様は、直接サイクルシークエンシングのために先行して単離または精製を行わないで、インビトロで増幅された二本鎖ＤＮＡ産物の一本鎖コピーにアニーリングした単一のプライマーの分子を伸長する方法を企図する。例えば、希釈した粗製増幅反応産物（好ましくは本明細書で記載した中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される低温ＰＣＲ反応で生成される）を鋳型として用い、過剰量のシークエンシングプライマー、蛍光標識した標準的な４つのｄｄＮＴＰターミネーター（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰおよびｄｄＣＴＰ）（または蛍光標識されたその対応するアナログ）、中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは色素標識されたｄｄＮＴＰのサブセットの組み込みに対して本来の選択的識別が低減されているもの）、適当な濃度のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ）、および約１０（容量／容量）％から約２０（容量／容量）％（および好ましくは約１５（容量／容量）％）グリセロール、エチレングリコールまたはその混合物を含有する溶液中にバッファーを含む組成物と混合する。ついで（複数の）標準的なサイクルプライマー伸長反応を８０℃以下の温度で十分な回数進行させて、望ましい種々の長さまでシークエンシングプライマー分子を伸長することができ、その伸長された分子は蛍光標識されたｄｄＮＴＰまたはその対応するアナログにより特異的に終止する。好ましくは、サイクル反応温度は約７０℃の融点および約３７℃の冷却（またはアニーリング）温度の間で変動する。

１つの好ましい態様では、ＤＮＡ鎖をシークエンシングする方法は：
ｉ）プライマーをシークエンシングすべきＤＮＡ鋳型にハイブリダイズさせる工程と；および
ｉｉ）それによりサイクル反応温度は約７０℃の融点および約３７℃の冷却（またはアニーリング）温度の間で変動する、約１０（容量／容量）％から約２０（容量／容量）％（および好ましくは約１５（容量／容量）％）グリセロール、エチレングリコール、またはその混合物を含有する溶液、十分量のデオキシヌクレオチド塩基、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、ならびに４つのジデオキシヌクレオチドターミネーターまたはそのアナログの存在下で、そしてＤＮＡ鎖がシークエンシングされる条件下で、前記したＤＮＡポリメラーゼの１つを用いてプライマーを伸長させる工程と；
を含むことができる。好ましくは、デオキシヌクレオチドの１つは放射性同位元素で標識されているか、またはプライマー分子が蛍光色素標識されており、さらに好ましくは、全てが蛍光色素標識されている。

本発明の方法の実例として、中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを低温サイクルプライマー伸長に使用する場合、アニーリングおよびプライマー伸長の双方が４５℃で同時に起こり得る。また別に、３７℃をアニーリング温度として用い、そして４５から５０℃をプライマー伸長温度として用いることができる。（図６参照）。従って、以下のプロトコルＡおよびプロトコルＢの双方を効率のよい特異的増幅である低温循環工程に用いることができる：
（Ａ）７０℃で３０秒間、および４５℃で４分間、全部で３５サイクル；または
（Ｂ）７０℃で３０秒間、３７℃で２０秒間および５０℃で３分間、全部で３５サイクル。
しかしながら、自動化サイクルシークエンシングのために酵素的プライマー伸長により蛍光色素標識ｄｄＮＴＰ終止を有する反応産物を生成する場合には、プロトコルＢが好ましい。本発明の方法はプロトコルＡまたはＢのいずれかに限定しないが、これらの２つのプロトコルは、これらの方法で効率的に作動する温度およびサイクルの実例であることに留意される。例えば、特定の環境下では、長い標的セグメントの増幅のためには伸長時間を約１１分まで延長するのが望ましい。

別の実例では、本発明の方法をＤＮＡサイクルシークエンシングのための増幅産物を生成するために用いる場合、過剰の単一のプライマーを１５％グリセロールおよび中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含有する反応混合物に添加することができる。次いで一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドを、蛍光標識されていてもよいｄｄＮＴＰまたはそのアナログの存在下、特異的ヌクレオチド終止を有する種々の長さまで伸長することができる。サイクルシークエンシングに用いる鋳型は、先行して単離および精製されていない、標的配列を含有する精製されたいずれかの二本鎖または一本鎖ＤＮＡフラグメント、または本発明で記載した二本鎖ＤＮＡ鋳型の低温サイクル伸長されたプライマー鎖に由来する希釈された増幅産物のアリコートでよい。本発明で記載したように高忠実度および高プロセッシビティーを有する中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いる低温サイクルプライマー伸長に由来する増幅産物は配列特異性が非常に高いので、ＤＮＡサイクルシークエンシングの鋳型として使用する前に、反応混合物からＰＣＲ産物を先行して単離することは一般に不必要である。
以下の非限定的な実施例は本発明の説明である。

中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’重合活性に及ぼすグリセロールの影響
異なる濃度のグリセロールの存在下でのＢｓｔ−ＩＩＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第６１６５７６５号に従って生成）の残存活性を以下のように決定した：
（ａ）一連の番号を付した０．５ｍｌマイクロ遠心チューブに以下のものを添加した：

前記の混物を最初にＳｐｅｅｄ−Ｖａｃｕｍにより蒸発させ、次いで適量のグリセロール・ストック溶液を前記のマイクロ遠心チューブに以下に指示するように添加することにより、各反応混合物でグリセロールの異なる最終濃度を達成した。

（ｂ）これらのチューブ全てを６５℃で３０分間インキュベートした。次いで各反応混合物をＤＥ−８１フィルターにピペッティングした。液体を全て蒸発させた後、各フィルターの放射活性の量をシンチレーションで測定し、Ｘ_１として記録した。その後、室温で０．３ＭＮａ_２ＨＰＯ_４溶液でフィルターを各回１０分間で３回洗浄し、室温で乾燥させ、次いで各フィルターの放射活性の量を再度測定し、Ｘ_２として記録した。組み込み率＝Ｘ_２／Ｘ_１。
残存活性（％）＝
異なるグリセロール濃度における放射活性の組み込み率
グリセロール不含の放射活性の組み込み率

図１に示すように、２０（容量／容量）％を超えない低濃度グリセロールはＢｓｔ−ＩＩＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を増強させた。しかしながら、高濃度グリセロールは酵素に阻止効果を奏した。

中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いる低温サイクルプライマー伸長に及ぼす４０（容量／容量）％グリセロールの影響
Ｂｓｔ−ＩＩＤＮＡポリメラーゼを研究に使用した。
鋳型：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（＋）
順行性プライマー：５’ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’
逆行性プライマー：５’ＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ３’

実験手順：
（ａ）０．２ｍｌマイクロ遠心チューブに以下のものを添加した：
鋳型１ μｌ
（１６ｎｇ／μｌまたは１６０ｎｇ／μｌ）
順行性プライマー（１０ピコモル／μｌ）２．５μｌ
逆行性プライマー（１０ピコモル／μｌ）２．５μｌ
ｄＮＴＰ（各々２．５ｍＭ）４ μｌ
５ｘＲＢ５ μｌ
（ｂ）前記の混合物を最初にＳｐｅｅｄ−Ｖａｃｕｍにより蒸発させ、次いで以下のものを同一のマイクロ遠心チューブに添加した。
ｄｄＨ_２Ｏ１１．７５μｌ
８０％グリセロール１１．７５μｌ
Ｂｓｔ−ＩＩＤＮＡポリメラーゼ２ μｌ
（ｃ）最終混合物を以下の温度サイクルに供した。
７０℃で３０秒間
４５℃で４分間
３５サイクル

反応産物を電気泳動のために１％アガロースゲルに流し、そして臭化エチジウムで染色した。

図２で説明する結果は、サイクルプライマー伸長のための二本鎖ＤＮＡの融点を低下させるための試薬として４０％グリセロールの存在下、反応混合物中、低濃度または高濃度のいずれかの鋳型を用いる温度循環の間に種々の大きさの非特異的増幅産物を生成したことを示している。

中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いる低温サイクルプライマー伸長に及ぼすグリセロールの濃度低下の影響
この実験は、グリセロールの濃度を約１５％にまで低下させることは、中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いる特異的サイクルプライマー伸長のためのＤＮＡ融点の低下に有用であることを実証するために設計された。

材料および方法
Ｂｓｔ−ＩＩＤＮＡポリメラーゼを研究に使用した。
増幅すべきＤＮＡセグメントの種々の長さを表す鋳型およびプライマーの４つの異なるセットを選択した：
鋳型Ａ：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（＋）１０ｎｇ／μｌ
順行性プライマー：５’ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’
逆行性プライマー：５’ＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ３’
鋳型Ｂ：ライスゲノムＢＡＣＤＮＡ１０ｎｇ／μｌ
順行性プライマー：５’ＣＴＴＡＡＴＴＴＡＡＧＧＴＴＣＣＧＴＧ３’
逆行性プライマー：５’ＧＣＡＴＴＧＧＴＡＡＧＣＡＡＴＧＧ３’
鋳型Ｃ：ハイブリダイゼーションプローブ５０ｎｇ／μｌ
順行性プライマー：５’ＡＣＡＡＡＧＣＡＣＴＧＡＡＣＣＴＧ３’
逆行性プライマー：５’ＴＧＧＧＡＣＣＴＡＴＣＧＴＧＴＴＧ３’
鋳型Ｄ：ライスゲノムに由来するＢＡＣのサブクローン５０ｎｇ／μｌ
順行性プライマー：５’ＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣ３’
逆行性プライマー：５’ＧＡＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＣＣＣ３’

以下のとおりに低温サイクル伸長を実施した：
（ａ）０．２ｍｌマイクロ遠心チューブに以下のものを添加した：
鋳型Ａ、Ｂ、ＣまたはＤ１ μｌ
順行性プライマーＡ、Ｂ、ＣまたはＤ（１０ピコモル／μｌ）２．５μｌ
逆行性プライマーＡ、Ｂ、ＣまたはＤ（１０ピコモル／μｌ）２．５μｌ
ｄＮＴＰ（各々２．５ｍＭ）４ μｌ
５ｘＲＢ５ μｌ
（ｂ）前記の混合物を最初にＳｐｅｅｄ−Ｖａｃｕｍにより蒸発させ、次いで蒸発させた試薬を含有する各マイクロ遠心チューブに鋳型およびプライマーの異なるセットを添加して、反応混合物中各々最終濃度３５％グリセロールおよび１５％グリセロールを達成した。
１．混合物中３５％グリセロール２．混合物中１５％グリセロール
ｄｄＨ_２Ｏ１２．１μｌ１８．３μｌ
８０％グリセロール１０．９μｌ４．７μｌ
ポリメラーゼ（１Ｕ／μｌ）２ μｌ２ μｌ
（ｃ）反応混合物を含む全てのマイクロ遠心チューブを以下のとおり低温循環に供した。
７０℃で３０秒間
４５℃で４分間
全部で３５サイクル

反応産物を電気泳動のために１％アガロースゲルに流し、そして臭化エチジウムで染色した。３５％グリセロールを含有する混合物に由来する反応産物をレーン１に負荷し、そして１５％グリセロールを含有する混合物に由来する反応産物をレーン２に負荷した。

図３に説明する結果は、２５０ｂｐまたは４００ｂｐ長のＤＮＡの短いセグメントがサイクルプライマー伸長の標的産物である場合、ＤＮＡ融点を低下させるための試薬として３５％グリセロールを用いる低温循環の期間中増幅産物を全く生成しなかった（図３Ａ１およびＢ１）。例えば１Ｋｂおよび２Ｋｂの長さのより長い標的産物を理想的な条件下で増幅させる場合、融点を低下させるために３５％グリセロールを用いると特異的および非特異的増幅産物の双方の生成を伴う酵素的サイクルプライマー伸長が達成された（図３Ｃ１およびＤ１）。

ＤＮＡ融点を低下させるための試薬として１５％グリセロールを用いる場合、中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて低温循環中に２５０ｂｐから２ｋｂの長さの範囲にある特異的増幅産物が生成された（図３Ａ２、Ｂ２、Ｃ２およびＤ２）。

前記で示した実験結果に基づいて、反応混合物中低濃度、例えば最終約１５％のグリセロールを特異的サイクルプライマー伸長においてＤＮＡ融点を低下させるための好ましい試薬として採用した。

中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いる異なる長さのＤＮＡプライマーの低温サイクル伸長
この実施例では、本発明の中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いる低温サイクル伸長系を３０塩基対の長さまでのプライマーの配列特異的伸長に使用することができることを実証するために実験を設計した。

ポリメラーゼはＢｓｔ−Ｉ（米国特許第５８３４２５４号に従って生成された野生型）、Ｂｓｔ−ＩＩ、およびＢｃａ（ＴａＫａＲａＣｏ．）を使用した。比較のためにＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＳｉｇｍａＣｈｅｉｃａｌＣｏ．）を熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼとして使用した（ＩａｋｏｂａｓｈｖｉｌｉおよびＬａｐｉｄｏｔ）。
使用した鋳型はライスゲノムＢＡＣＢ４１４ｆ７であった。
使用した２つのプライマー対は：
Ａ：１７塩基長順行性プライマー：５’ＴＡＧＣＴＡＴＣＴＡＡＣＴＴＡＡＴ３’
１７塩基長逆行性プライマー：５’ＴＴＧＴＴＴＣＴＣＴＧＡＴＧＣＡＴ３’
Ｂ：３０塩基長順行性プライマー：５’ＴＡＧＣＴＡＴＣＴＡＡＣＴＴＡＡＴＴＴＡＡＧＧＴＴＣＣＧＴＧ３’
３０塩基長逆行性プライマー：５’ＴＴＧＴＴＴＣＴＣＴＧＡＴＧＣＡＴＴＧＧＴＡＡＧＣＡＡＴＧＧ３’
であった。

以下の反応系（以後Ｂｓｔ系と称する）を使用した。
（ａ）０．２ｍｌマイクロ遠心チューブに以下のものを添加した：
鋳型（５ｎｇ／μｌ）１ μｌ
順行性プライマー（１５ピコモル／μｌ）２．５μｌ
逆行性プライマー（１５ピコモル／μｌ）２．５μｌ
ｄＮＴＰ（各々２．５ｍＭ）４ μｌ
５ｘＲＢ５ μｌ
ｄｄＨ_２Ｏ３．３μｌ
８０％グリセロール４．７μｌ
ＤＮＡポリメラーゼ（４Ｕ／μｌ）２ μｌ
（ｂ）マイクロ遠心チューブを以下のとおり温度循環に供した。
７０℃で３０秒間
３７℃で２０秒間
５０℃で３分間
全部で３５サイクル

反応産物を電気泳動のために１％アガロースゲルに流し、そして臭化エチジウムで染色した。
加えて、（ＩａｋｏｂａｓｈｖｉｌｉおよびＬａｐｉｄｏｔにより推奨されるＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー中４．５Ｍプロリンおよび１７％グリセロールを含有する反応混合物を用いる方法を、ＤＮＡポリメラーゼとしてＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いる反応にも採用した（以後ＩａｋｏｂａｓｈｖｉｌｉおよびＬａｐｉｄｏｔ系と称する）。また反応産物をＢｓｔ系で得られたものと並行して流して図４のとおり説明した。

図４では、以下の反応産物が各々のレーンで示された：
Ａ：１７塩基長での反応産物：
Ａ１：ＩａｋｏｂａｓｈｖｉｌｉおよびＬａｐｉｄｏｔ系を用いるＫｌｅｎｏｗフラグメント
Ａ２：Ｂｓｔ系を用いるＫｌｅｎｏｗフラグメント
Ａ３：Ｂｓｔ系を用いるＢｓｔ−Ｉポリメラーゼ
Ａ４：Ｂｓｔ系を用いるＢｓｔ−ＩＩポリメラーゼ
Ａ５：Ｂｓｔ系を用いるＢｃａポリメラーゼ
Ｂ：３０塩基長での反応産物：
Ｂ１：ＩａｋｏｂａｓｈｖｉｌｉおよびＬａｐｉｄｏｔ系を用いるＫｌｅｎｏｗフラグメント
Ｂ２：Ｂｓｔ系を用いるＫｌｅｎｏｗフラグメント
Ｂ３：Ｂｓｔ系を用いるＢｓｔ−Ｉポリメラーゼ
Ｂ４：Ｂｓｔ系を用いるＢｓｔ−ＩＩポリメラーゼ
Ｂ５：Ｂｓｔ系を用いるＢｃａポリメラーゼ
分子リーダー：
Ｍ１：λＤＮＡ／ＨｉｎｄＩＩＩ
Ｍ２：ＤＬ２０００（ＴａＫａＲａＣｏ．、各々２０００、１０００、７５０、５００、２５０および１００ｂｐのＤＮＡフラグメントを有する）

図４は、低温循環に推奨されるように反応混合物中１５％グリセロールを含有するＢｓｔ系において、中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、すなわちＢｓｔ−Ｉの天然形態、変異Ｂｓｔ−ＩＩおよびＢｃａが１７塩基長プライマー伸長（Ａ３−Ａ５）および３０塩基長プライマー伸長（Ｂ３−Ｂ５）の結果として特異的増幅産物を生成した。しかしながら、熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼであるＫｌｅｎｏｗフラグメントは、ＩａｋｏｂａｓｈｖｉｌｉおよびＬａｐｉｄｏｔ系（Ａ１−Ｂ１）またはＢｓｔ系（Ａ２−Ｂ２）のいずれかで１７塩基長または３０塩基長プライマー伸長から特異的増幅産物を生成することができなかった。

保存された直ぐ使用するために準備された前混合物中のＢｓｔ−ＩＩＤＮＡポリメラーゼを用いる高忠実度低温直線性サイクルシークエンシング
本発明を用いて、一般的に用いられる低プロセッシビティーを伴う熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ^ＴＭまたはＡｍｐｌｉＴａｑ^ＴＭでは克服できない鋳型のＧＣ富化セグメント上でのプライマーの伸長のために、遺伝子修飾された中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ−ＩＩを用いてＤＮＡシークエンシングを実施することができる。さらに、予め添加されたプライマーを伴うかまたは伴わないで予め測定された全ての反応混合物の成分を予め混合し、そして少なくとも８週間、２３℃から２５℃の間の温度で個々のマイクロ遠心チューブまたは９６ウェルプレートに保存することができる。

Ｂｓｔ−ＩＩサイクルシークエンシング実験
ＤＮＡポリメラーゼとしてＢｓｔ−ＩＩを使用した。
鋳型：ｂｇ０．８。これはライスゲノムＢＡＣ１２９のサブクローンのＧＣ富化セグメントであった。
プライマー：５’ＧＡＡＴＴＧＧＡＧＣＴＣＣＡＣＣＧＣＧＧ３’
予め混合した色素−ｄｄＮＴＰ：最適化したＲ６Ｇ−ｄｄＡＴＰ、ＲＯＸ−ｄｄＣＴＰ、ＴＡＭＲＡ−ｄｄＵＴＰおよびＢｏｄｉｐｙＦ１−１４−ｄｄＧＴＰ、ＮＥＮ^ＴＭＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓＰｒｏｄｕｃｔｓから購入。
（ａ）０．２ｍｌマイクロ遠心チューブに以下のものを添加した：
ｄＮＴＰ（各々２．５ｍＭ）１ μｌ
５ｘＲＢ５ μｌ
予め混合した色素−ｄｄＮＴＰ４ μｌ
Ｂｓｔ−ＩＩＤＮＡポリメラーゼ（１０Ｕ／μｌ）１ μｌ
ｄｄＨ_２Ｏ５．３μｌ
８０％グリセロール４．７μｌ
マイクロ遠心チューブ中の反応前混合物を８週間以内の用時まで２３℃から２５℃の間の温度で保存した。
（ｂ）実験時に鋳型２．５μｌ（１５０ｎｇ／μｌ）およびプライマー１．５μｌを前記の前混合物が入ったマイクロ遠心チューブに添加した。
（ｃ）マイクロ遠心チューブ中の内容物を十分に混合し、そして以下の直線性低温循環に供した。
７０℃で３０秒間
３７℃で２０秒間
４５℃で３分間
全部で３５サイクル
（ｄ）各チューブに３ＭＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）２．５μｌおよび９５％エタノール５５μｌを加えた。チューブを数回逆さにし、そして室温で２０分間置いて伸長産物を沈殿させた。
（ｅ）混合物を室温で１２０００ｇで２０分間遠心した。
（ｆ）上澄を抜き取り、そしてペレットを７０％エタノール１２０μｌですすいだ。
（ｇ）チューブを数回逆さにし、室温で１５分間置き、そして１２０００ｇで１０分間遠心した。
（ｈ）ペレットを４５℃で乾燥させ、そして負荷バッファー（脱イオン化ホルムアミド：２５ｍＭＥＤＴＡ５：１、ｐＨ８．０、５０ｍｇ／ｍｌブルーデキストラン含有）１．２μｌに再懸濁した。
（ｉ）サンプルを９５℃で３分間変性し、次いで即座に氷上に置いた。
（ｊ）各サンプル全てを４．５％（６Ｍ尿素）シークエンシングゲルに負荷し、そしてＡＢＩＰＲＩＳＭ^ＴＭ３７７ＤＮＡシークエンサーによりシークエンシング情報を収集した。対応するインストゥルメント（マトリックス）ファイルでデータを分析した。

比較のために、２つの市販により入手可能なサイクルシークエンシングキット、すなわちＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ^ＴＭを用いるＤＹＥｎａｍｉｃ^ＴＭＥＴターミネーターサイクルシークエンシングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＡｍｐｌｉＴａｑ^ＴＭを用いるＡＢＩＰｒｉｓｍ^ＴＭＢｉｇＤｙｅ^ＴＭターミネーターサイクルシークエンシングキット（ＡＢＩ）を用いて、同一のプライマーを用いる理想的な鋳型のＤＮＡシークエンシングをも実施した。サイクルシークエンシング手順は各々の会社により提供された以下のプロトコルにより実施した。

ＤＮＡシークエンシングの結果を図５に示し、これはＡｍｐｌｉＴａｑ^ＴＭを用いるＡＢＩＰｒｉｓｍ^ＴＭＢｉｇＤｙｅ^ＴＭターミネーターサイクルシークエンシングキット（ＡＢＩ）（図５Ａ）が、ＤＮＡ鋳型のＧＣ富化セグメント上でのサイクルプライマー伸長の間に、有効な特異的蛍光色素標識ｄｄＮＴＰ終止を達成できなかったことを示している。比較として、Ｂｓｔ−ＩＩサイクルシークエンシング系はＢｓｔ−ＩＩＤＮＡポリメラーゼを２３から２５℃で８週間予め混合した形態で保存した後でさえも、鋳型におけるＧＣ富化バリヤを克服し、そしてＤＮＡシークエンシング分析に十分特異的な色素標識ｄｄＮＴＰ終止を生じた（図５Ｂ）。ＡＢＩＡｍｐｌｉＴａｑ^ＴＭキットに類似して、ＡｍｅｒｓｈａｍＤＹＥｎａｍｉｃ^ＴＭＥＴターミネーターサイクルシークエンシングキットで用いたＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ^ＴＭもまた、自動化蛍光ＤＮＡシークエンシングのためのサイクルプライマー伸長の間に、鋳型のＧＣ富化セグメントを克服することができなかった（追跡は本明細書では示していない）。

結論としては、直ぐ使用できるように準備された前混合物中、室温で少なくとも８週間安定性を維持するＢｓｔ−ＩＩサイクルシークエンシング系が大規模な高忠実度自動化蛍光ＤＮＡシークエンシングに、とりわけ鋳型がＧＣ富化セグメントを含有している場合に最も適している。

図５は、ＡＢＩＰｒｉｓｍ^ＴＭＢｉｇＤｙｅ^ＴＭターミネーターサイクルシークエンシングキットでのＡｍｐｌｉＴａｑ^ＴＭの成績（Ａ）と、Ｂｓｔ−ＩＩサイクルシークエンシング系の成績（Ｂ）の比較を含む、ＧＣ富化セグメント上でのＤＮＡシークエンシングを示している。図５ＡおよびＢは、サイクル伸長のための同一のプライマーを用いる同一鋳型のＧＣ富化セグメントの２つの自動化蛍光ＤＮＡシークエンシング追跡を示す。双方の配列をＡＢＩ３７７シークエンサーに流した。Ａで説明する影を付けたゾーンはコンピューターにより評価および報告される品質管理から外れた領域を表している。
Ａ＝ＡｍｐｌｉＴａｑ^ＴＭＢｉｇＤｙｅ^ＴＭキットで生成した；Ｂ＝Ｂｓｔ−ＩＩサイクルシークエンシングで生成した

中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いるサイクルプライマー伸長の最適温度工程
この実験は、ＤＮＡ融点を低下させる作用物質として１５％グリセロールを含有する反応混合物中、中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いるサイクルプライマー伸長のための最適温度を決定するために設計された。
Ｂｓｔ−ＩＩが使用したＤＮＡポリメラーゼであった。
鋳型：ＡライスゲノムＢＡＣＤＮＡ
順行性プライマー：５’ＣＴＴＡＡＴＴＴＡＡＧＧＴＴＣＣＧＴＧ３’
逆行性プライマー：５’ＧＣＡＴＴＧＧＴＡＡＧＣＡＡＴＧＧ３’
（ａ）０．２ｍｌマイクロ遠心チューブに以下のものを添加した：
鋳型（１０ｎｇ／μｌ）１ μｌ
順行性プライマー（１０ピコモル／μｌ）２．５μｌ
逆行性プライマー（１０ピコモル／μｌ）２．５μｌ
ｄＮＴＰ（各々２．５ｍＭ）４ μｌ
５ｘＲＢ５ μｌ
（ｂ）以下のものをマイクロ遠心チューブに加えて：
グリセロールの最終濃度（容量／容量）０％１５％
ｄｄＨ_２Ｏ８μｌ３．３μｌ
８０％グリセロール４．７μｌ
Ｂｓｔ−ＩＩポリメラーゼ（１Ｕ／μｌ）２μｌ２ μｌ
を達成した。
（ｃ）循環温度は以下のとおりであった。

反応産物を電気泳動のために１％アガロースゲルに流し、そして臭化エチジウムで染色した。結果を図６で説明し、ここでレーンには以下のものを負荷した：
１．グリセロールなし；７０℃で３０秒間、３７℃で４分間、３５サイクル。
２．グリセロールなし；７０℃で３０秒間、３７℃で２０秒間、４５℃で３分間、３５サイクル。
３．グリセロールなし；７０℃で３０秒間、３７℃で２０秒間、５０℃で３分間、３５サイクル。
４．グリセロールなし；７０℃で３０秒間、３７℃で２０秒間、６０℃で３分間、３５サイクル。
５．１５％グリセロール；７０℃で３０秒間、３７℃で４分間、３５サイクル。
６．１５％グリセロール；７０℃で３０秒間、３７℃で２０秒間、４５℃で３分間、３５サイクル。
７．１５％グリセロール；７０℃で３０秒間、３７℃で２０秒間、５０℃で３分間、３５サイクル。
８．１５％グリセロール；７０℃で３０秒間、３７℃で２０秒間、６０℃で３分間、３５サイクル。
９．１５％グリセロール；７０℃で３０秒間、４５℃で４分間、３５サイクル。

図６の結果は中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＢｓｔ−ＩＩを用いる最も有効なサイクルプライマー伸長が、融点低下物質として用いる１５％グリセロールの存在下、単一のアニーリングおよび４５℃の伸長温度（レーン９）、または３７℃でアニーリングおよび４５℃から５０℃で伸長により得られる。工程３および工程５の双方の温度循環プロトコルをＤＮＡ増幅の特異的プライマー伸長に用いることができるが、酵素的プライマー伸長を用いて自動化サイクルＤＮＡシークエンシングのための蛍光色素標識ｄｄＮＴＰターミネーターと共に反応産物を生成する場合、７０℃で３０秒間、３７℃で２０秒間、５０℃で３分間、３５サイクルの工程３の循環プロトコルが好ましい（レーン７）。

保存された、直ぐ使用できるように準備された反応前混合物における中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにより生成された増幅産物の直接低温サイクルシークエンシング
この実施例は、中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む低温プライマー伸長のために予め測定された全ての反応混合物の成分を予め添加されたプライマーを伴ってまたは伴わずに予め混合し、そして増幅反応で使用するまで少なくとも８週間、２３℃から２５℃の間の温度で個々のマイクロ遠心チューブまたは９６ウェルプレート中に保存した。加えて、予め精製することなく、増幅された反応産物を直接自動化ＤＮＡシークエンシングに使用することができる。
ＤＮＡポリメラーゼとしてＢｓｔ−ＩＩを使用した。
鋳型：Ｈ５２５ｄ９、ライスゲノムＢＡＣ
順行性プライマー：５’ＴＴＴＣＡＧＧＧＴＣＣＣＴＴＡＴＡＴＣＴＣ３’
逆行性プライマー：５’ＴＣＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＡＴＡＡＴＣＧＡＴ３’
予め混合した色素−ｄｄＮＴＰ：最適化したＲ６Ｇ−ｄｄＡＴＰ、ＲＯＸ−ｄｄＣＴＰ、ＴＡＭＲＡ−ｄｄＵＴＰおよびＢｏｄｉｐｙＦ１−１４−ｄｄＧＴＰ、ＮＥＮ^ＴＭＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓＰｒｏｄｕｃｔｓから購入。
（ａ）０．２ｍｌマイクロ遠心チューブに以下のものを添加した：
順行性プライマー（１０ピコモル／μｌ）２ μｌ
逆行性プライマー（１０ピコモル／μｌ）２ μｌ
ｄＮＴＰ（各々２．５ｍＭ）２ μｌ
５ｘＲＢ５ μｌ
予め混合した色素−ｄｄＮＴＰ４ μｌ
Ｂｓｔ−ＩＩＤＮＡポリメラーゼ（１０Ｕ／μｌ）１ μｌ
ｄｄＨ_２Ｏ４．３μｌ
８０％グリセロール４．７μｌ
マイクロ遠心チューブ中の反応前混合物を８週間以内の用時まで２３℃から２５℃の間の温度で保存した。

（ｂ）実験時に以下のものを前記の前混合物に添加した：
鋳型（２．５ｎｇ／μｌ）１μｌ
ｄｄＨ_２Ｏ３μｌ
（ｃ）マイクロ遠心チューブ中の内容物を十分に混合し、そして以下のプロトコルの低温循環に供した。
７０℃で３０秒間
３７℃で２０秒間
４５℃で３分間
全部で３５サイクル
（ｄ）精製後回収された増幅産物のサイクルシークエンシング
（１）温度循環が完了した後、電気泳動のために反応産物を１％低融点アガロースゲルに負荷した。
（２）電気泳動の後、標的アガロースのブロックをゲルから切除し、そして重量測定を行った。
（３）切除したアガロースのブロックに０．０４Ｖの２５ｘ濃バッファー（Ｒｏｃｈｅ）を添加し、そしてゲルを溶融するために６５℃で１５分間、混合物をインキュベートした。
（４）さらに４５℃で５分間インキュベートした後、適量のアガロース（１Ｕ／
μｌ、Ｒｏｃｈｅ）を１Ｕ／１００ｍｇアガロースゲルで添加した。
（５）４５℃で１時間、さらに消化した後、３ＭＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）１／１０Ｖを添加した。チューブを氷上に１５分間置き、そして次に１２０００ｇで４℃で１５分間回転させた。
（６）上澄を等量のフェノール−クロロホルムで２回、そしてクロロホルムで１回抽出した。各抽出の後、混合物を１２０００ｇで５分間遠心して上部水層を収集した。
（７）９５％エタノール３Ｖを抽出した水層に添加し；そして氷上で１５分間冷却した後、混合物を１２０００ｇで４℃で１５分間遠心した。ペレットを７０％エタノール２５０μｌで洗浄し、乾燥し、そしてｄｄＨ_２Ｏ２０μｌに溶解した。
（８）直ぐ使用できるように準備された反応前混合物中で、Ｂｓｔ−ＩＩＤＮＡポリメラーゼを用いる高忠実度低温直線性サイクルシークエンシングを使用して、順行性プライマーを用いる回収した増幅産物のシークエンシングを５（ｃ）−（ｋ）に前記するように実施した。

また別に、工程７．（ｃ）で生成した反応混合物中の増幅産物のアリコートを、回収および先行する精製を行うことなく、Ｂｓｔ−ＩＩシークエンシング系を用いて直接的にシークエンシングした。この直接サイクルシークエンシング手順の実例を以下に記載する。
（１）０．２ｍｌマイクロ遠心チューブに以下のものを添加した：
ｄＮＴＰ（各々２．５ｍＭ）１ μｌ
５ｘＲＢ５ μｌ
予め混合した色素−ｄｄＮＴＰ４ μｌ
Ｂｓｔ−ＩＩＤＮＡポリメラーゼ（１０Ｕ／μｌ）１ μｌ
ｄｄＨ_２Ｏ５．３μｌ
８０％グリセロール４．７μｌ
マイクロ遠心チューブ中の反応前混合物を８週間以内の用時まで２３℃から２５℃の間の温度で保存した。
（２）実験時に以下のものを各マイクロ遠心チューブに添加した：
１／２０希釈した反応産物混合物［７．（ｃ）］１ μｌ
順行性プライマー（１０ピコモル／μｌ）１．５μｌ
ｄｄＨ_２Ｏ１．５μｌ
（３）マイクロ遠心チューブ中の内容物を十分に混合し、そして以下の直線性低温循環に供した。
７０℃で３０秒間
３７℃で２０秒間
４５℃で３分間
全部で３５サイクル

反応混合物中のＤＮＡを沈殿させ、洗浄し、そして電気泳動のためのシークエンシングゲルに負荷し、そして前記の実施例５に記載したように分析した。シークエンシング追跡により、双方の方法により得られたＤＮＡ配列が理想的であることが示された。これは中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いる低温サイクルプライマー伸長により、さらに精製することなく直接シークエンシングに使用することができる高度に特異的な増幅ＤＮＡ産物を生成できることを示している。

図１はグリセロールのＢｓｔ−ＩＩＤＮＡポリメラーゼの５’−３’重合活性に及ぼす影響を説明しているグラフである。図２は４０％グリセロール中、中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いる低温増幅の結果を示す電気泳動ゲル（１％アガロース）の写真である。図３Ａは３５％グリセロール（レーン１）および１５％グリセロール（レーン２）中、２５０塩基対の長さを有する増幅産物での低温サイクルプライマー伸長の結果を示す電気泳動ゲル（１％アガロース）の写真である。図３Ｂは３５％グリセロール（レーン１）および１５％グリセロール（レーン２）中、４００塩基対の長さを有する増幅産物での低温サイクルプライマー伸長の結果を示す電気泳動ゲル（１％アガロース）の写真である。図３Ｃは３５％グリセロール（レーン１）および１５％グリセロール（レーン２）中、１キロ塩基対の長さを有する増幅産物での低温サイクルプライマー伸長の結果を示す電気泳動ゲル（１％アガロース）の写真である。図３Ｄは３５％グリセロール（レーン１）および１５％グリセロール（レーン２）中、２キロ塩基対の長さを有する増幅産物での低温サイクルプライマー伸長の結果を示す電気泳動ゲル（１％アガロース）の写真である。図４は中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよびＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いる１７塩基長および３０塩基長のプライマーの低温サイクルプライマー伸長の結果を示す電気泳動ゲル（１％アガロース）の写真である。１７塩基長のプライマーを用いた反応産物はＡ１（ＩａｋｏｂａｓｈｖｉｌｉおよびＬａｐｉｄｏｔの系を用いるＫｌｅｎｏｗフラグメント）、Ａ２（Ｂｓｔ系を用いるＫｌｅｎｏｗフラグメント）、Ａ３（Ｂｓｔ系を用いるＢｓｔ−Ｉポリメラーゼ）、Ａ４（Ｂｓｔ系を用いるＢｓｔ−ＩＩポリメラーゼ）、およびＡ５（Ｂｓｔ系を用いるＢｃａポリメラーゼ）である。３０塩基長のプライマーを用いた反応産物はＢ１（ＩａｋｏｂａｓｈｖｉｌｉおよびＬａｐｉｄｏｔの系を用いるＫｌｅｎｏｗフラグメント）、Ｂ２（Ｂｓｔ系を用いるＫｌｅｎｏｗフラグメント）、Ｂ３（Ｂｓｔ系を用いるＢｓｔ−Ｉポリメラーゼ）、Ｂ４（Ｂｓｔ系を用いるＢｓｔ−ＩＩポリメラーゼ）、およびＢ５（Ｂｓｔ系を用いるＢｃａポリメラーゼ）である。図５Ａおよび５Ｂは、ＡＢＩＰｒｉｓｍ^ＴＭＢｉｇＤｙｅ^ＴＭターミネーターサイクルシークエンシングキット（５Ａ）におけるＡｍｐｌｉＴａｑ^ＴＭの性能をＢｓｔ−ＩＩサイクルシークエンシング系（５Ｂ）の性能と比較する、ＧＣ富化セグメントの２つの自動化蛍光ＤＮＡシークエンシング追跡を表す。図６は、中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ−ＩＩ）を用い、グリセロール不含で、および１５％グリセロールを伴って、種々の温度工程で行われたサイクルプライマー伸長反応の結果を示す電気泳動ゲル（１％アガロース）の写真である。参照文献：１．Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．、Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ｓ．およびＣｏｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｒ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３−５４６７（１９７７）２．ＬｉｎｄａＧ．Ｌｅｅ、ＣｈａｒｌｅｓＲ．Ｃｏｎｎｅｌｌ、ＳａｍＬ．Ｗｏｏら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０（１０）：２４７１−２４８３（１９９２）３．ＭｏｌｌｙＣｒａｘｔｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＡＣｏｍｐａｎｉｏｎｔｏＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ３（１）：２０−２６（１９９１）４．ＨａｎｓｐｅｔｅｒＳａｌｕｚ，Ｊｅａｎ−ＰｉｅｒｒｅＪｏｓｔ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：２６０２−２６０６（１９８９）５．Ｙｅ，Ｓ．Ｙ．およびＨｏｎｇ，Ｇ．Ｆ．、ＳｃｉｅｎｔｉａＳｉｎｉｃａ（ＳｅｒｉｅｓＢ）３０：５０３−５０６（１９８７）６．Ｆｕｌｌｅｒ，Ｃ．Ｗ．、米国特許第５４３２０６５号（１９９５）７．ＲｏｂｅｒｔＩａｋｏｂａｓｈｖｉｌｉ、ＡｖｉｖａＬａｐｉｄｏｔ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２７（６）：１５６６−１５６８（１９９９）８．ＨｏｎｇおよびＨｕａｎｇに対する米国特許第６１６５７６５号。高い安定性および蛍光色素標識ジデオキシヌクレオチドに対する本来の選択的識別を低減させる能力を有しているＤＮＡポリメラーゼ。全ての参照文献を出展明示によりその全てを本明細書の一部とする。

Claims

ＤＮＡポリメラーゼがプライマーまたはプライマー対を繰り返し伸長するように約７０℃の融点および約３７℃のアニーリング温度の間でサイクル反応温度が変動する条件下で、約１０（容量／容量）％から約２０（容量／容量）％グリセロール、エチレングリコールまたはその混合物を含有する溶液中で鋳型ＤＮＡをプライマーまたはプライマー対ならびに、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘおよびＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓからなる群から選択される生物に由来する中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの天然または修飾形態と混合する工程を含む、約８０℃以下の温度での酵素的サイクルプライマー伸長反応を用いるプライマーまたはプライマー対を伸長する方法。
グリセロール、エチレングリコールまたはその混合物が約１５（容量／容量）％で存在する請求項１記載の方法。
ＤＮＡポリメラーゼが約６５℃で最適酵素活性を有する請求項１記載の方法。
ＤＮＡポリメラーゼがＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘまたはＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓから単離されるＤＮＡポリメラーゼと９５％以上の相同性を共有するアミノ酸配列を有している請求項１記載の方法。
サイクルプライマー伸長反応を繰り返すさらなる工程を含む請求項１記載の方法。
加熱および冷却サイクルを繰り返すことにより、二本鎖ＤＮＡの選択されたセグメントのコピーを鋳型に対する順行性プライマーおよび逆行性プライマーの存在下で増幅する請求項１記載の方法。
順行性プライマーおよび逆行性プライマーが種々の長さでよい請求項６記載の方法。
サイクルシークエンシングのために種々の長さの単一のプライマーの分子をｄｄＮＴＰまたはそのアナログの存在下で特異的ヌクレオチド終止を伴って伸長する請求項１記載の方法。
（ｉ）希釈した粗製増幅反応産物を過剰量のシークエンシングプライマー、４つの標準的なｄｄＮＴＰターミネーターまたはその対応するアナログ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘおよびＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓからなる群から選択される中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの元来のまたは修飾された形態、適当な濃度のｄＮＴＰ、ならびに約１０（容量／容量）％から約２０（容量／容量）％グリセロール、エチレングリコールまたはその混合物を含有する溶液中にバッファーを含む組成物と混合する工程と；ならびに
（ｉｉ）ｄｄＮＴＰまたはその対応するアナログにより特異的に終止した望ましい長さまでシークエンシングプライマー分子を伸長させるのに十分な回数、８０℃以下の温度で（複数の）サイクルプライマー伸長反応を行う工程を；
を含む、先行して単離または精製を行わずにインビトロで増幅された二本鎖ＤＮＡ産物の直接サイクルシークエンシングのために、ＤＮＡ鋳型にアリーリングしたプライマーの分子を伸長する方法。
ＤＮＡポリメラーゼがプライマーまたはプライマー対を繰り返し伸長するように約７０℃の融点および約３７℃のアニーリング温度の間でサイクル反応温度が変動する条件下で、約１０（容量／容量）％から約２０（容量／容量）％グリセロール、エチレングリコールまたはその混合物を含有する溶液中でＤＮＡの標的セグメントをプライマーまたはプライマー対ならびに、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘおよびＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓからなる群から選択される生物に由来する中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの天然または修飾形態と混合する工程を含む、約８０℃以下の温度での酵素的サイクルプライマー伸長反応を用いるプライマーまたはプライマー対を伸長することによりインビトロ増幅された二本鎖ＤＮＡ産物を生成する請求項９記載の方法。
中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘまたはＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓから単離されるＤＮＡポリメラーゼと９５％以上の相同性を共有するアミノ酸配列を有している請求項９記載の方法。
Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘまたはＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓからなる群から選択される生物に由来する中程度の熱安定性の天然または修飾ＤＮＡポリメラーゼを含む、すなわちＤＮＡ増幅における使用またはジデオキシリボヌクレオチドアナログでの特異的伸長終止に適した少なくとも１つの酵素的ＤＮＡプライマー伸長反応成分と予め混合された、約８０℃以下の温度での低温サイクルプライマー伸長反応において使用するのに適した、乾燥または直ぐ使用するために準備された反応混合物。
中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘまたはＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓからなる群から選択される生物に由来する天然または修飾ＤＮＡポリメラーゼであるか、またはＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘまたはＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓから単離されるＤＮＡポリメラーゼと９５％以上の相同性を共有するアミノ酸配列を有している中程度の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである請求項１２記載の直ぐ使用するために準備された反応混合物。
マイクロ遠心チューブまたはマルチプルウェルプレートに予め分配されている請求項１２記載の直ぐ使用するために準備された反応混合物。
マイクロ遠心チューブまたはマルチプルウェルプレートに予め分配されている請求項１３記載の直ぐ使用するために準備された反応混合物。
マイクロ遠心チューブまたはマルチプルウェルプレートに予め分配されており、そして２２℃から２５℃の間の温度で少なくとも８週間安定性を保持している請求項１４記載の直ぐ使用するために準備された反応混合物。
マイクロ遠心チューブまたはマルチプルウェルプレートに予め分配されており、そして２２℃から２５℃の間の温度で少なくとも８週間安定性を保持している請求項１５記載の直ぐ使用するために準備された反応混合物。