KR930005660B1 - T7-타입 dna 폴리머라제, 이를 이용하는 방법 및 신규의 dna서열 결정 방법 - Google Patents
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Description
제1도-제3도는 벡터 pTrx-2, mGP1-1, pGP5-5를 각각 도시화한 것이다.
제4도는 T7 DAN폴리머라제의 선택적인 산화를 그래프로 도시한 것이다.
제5도는 에테노-dATP존재하에 DNA를 합성하는 변형된 T7폴리머라제의 능력을 그래프로 도시한 것이다.
제6도는 변형된 T7 DNA폴리머라제를 사용하여 게놈 DNA를 증폭시키는 효소에 의한 증폭 방법을 도시화한 것이다.
제7도-제9도는 각각 pTrx-2, pGP5-5의 일부 및 mGP1-2의 뉴클레오티드 서열을 각각 도시한 것이다.
제10도는 pGP5-6를 도시화한 것이다.
본 발명은 T7-타입 DNA폴리머라제, 이를 이용하는 방법 및 신규의 DNA서열 결정 방법에 관한 것이다.
본 발명은 DNA서열결정(sequencing)방법에 적합하게 사용할 수 있는 DNA폴리머라제에 관한 것이다.
DNA서열결정방법은 하나의 확정된 말단(defined terminus)과 하나의 가변성 말단(variable terminus)을 갖는 4종류이 단일가닥 DNA단편을 생성하는 단계를 포함한다. 가변성 말단은 항성 소정의 특정 뉴클레오티드 염기(구아닌(G), 아데닌(A), 티민(T), 또는 시토신(C)중 하나)에서 종료된다. 상기 4종류의 상이한 단편 셋트는 높은 해상도를 갖는 폴리아크릴 아미드 겔상에서 그 길이에 따라 각각 분리된다.
이 겔상의 각각의 벤드는 DNA 서열내에 있는 특성 뉴클레오티드에 상응하므로, 이 소정이 뉴클레오티드 염기의 위치를 상기 서열내에서 확인할 수 있게된다.
DNA 서열결정방법에는 일반적으로 두가지 방법이 있다. 한가지 방법(Maxam and Gilbert서열결정방법)은 분리된 DNA단편을 화학적으로 분해하는 과정을 포함하며, 이때 분리된 DNA 단편을 화학적으로 분해하는 과정을 포함하며, 이때 분리된 DNA 단편 각각은 그것의 확정 발단이 하나의 방사성 라벨로 라벨되어 있고, 이 각 반응물들은 4개 염기(G, A, T 또는 C)중 하나 또는 그 이상의 염기에서 특이적으로 제한 절단된다. 다른 방법(디데옥시 서열결정방법)은 DNA가닥을 효소 합성하는 방법을 포함한다. 4개의 별도의 합성반응이 실시되며, 각 반응은 적절한 사슬종료 디데옥시 뉴클레오티드가 도입되면 특정 염기(G, A, T 또는 C)에서 종결된다. 후자의 방법은 DNA 단편이 일정하게 라벨되므로(말단라벨화 대신에) DNA단편의 길이가 길수록 많은 양의 방사능을 가진다는 점에서 바람직하다. 또한35S-라벨된 뉴클레오티드가 더욱 선명한 감응도를 나타내므로32P-라벨된 뉴클레오티드 대신에 사용될 수 있다.
이 반응 생성물들은 각 레인이 G, A, T 또는 C중 하나에만 해당하기 때문에 해독하기가 간편하다. 대부분의 디데옥시 서열결정방법에 사용되는 효소는 E, Coli DNA-폴리머라제 I의 커다란 단편(클레노우(Klenow))이다. 사용되는 다른 폴리머라제로는 AWV역전사효소(리버스 트랜스 크립타제)가 있다.
본 발명의 일차 목적은, 서열결정 하고자 하는 DNA 분자 및 이 DNA 분자에 하이브리드화할 수 있는 프라이머분자를 어닐링(annealing)시키는 단계, 4종류의 상이한 데옥시 뉴클레오시드 트리포스페이트, 진행성 DNA 폴리머라제(processive DNA polymerase)와 4종류의 DNA 합성 종료제 중 하나를 포함하고 있는 최소한 4개의 용기내에 상기의 어닐링시킨 혼합물을 분할하여 가하고 항온처리(incubation)하는 단계를 포함하는, 상기 DNA분자의 뉴클레오티드 염기 서열을 결정하는 방법을 제공하는 것으로서, 여기에서 상기 DNA폴리머라제는 DNA 서열 결정 반응의 신장 반응(extension reaction)에서 일반적으로 사용되는 환경조건에서, 분리되기 전에 적어도 500 염기동안은 DNA분자에 결합된 상태를 유지하며, 이 폴리머라제는 1mg의 폴리머라제당 500유니트 이하의 엑소뉴클레아제 활성도를 갖고, 상기 합성 종료제는 특정 뉴클레오티드 염기에서 DNA 합성을 종료시킨다. 이 종료제는 상기 4개의 용기중에서 각각 상이한 특정 뉴클레오티드 염기에서 합성 반응을 종료시킨다.
상기 항온처리 반응의 DNA생성물은 크기에 따라 분리되므로 상기 DNA분자의 뉴클레오티드 염기 서열 적어도 일부를 결정할 수 있다.
바람직한 구체화로서, 상기 폴리머라제는 분리되기 전에 적어도 100염기동안은 상기 DNA분자에 결합된 상태로 존재한다. 이 폴리머라제는 T7-타입 파지(즉 DNA폴리머라제가 서브유니트로서 숙주 티오레독신을 필요로하는 파지, 예를들면 T7-타입 파지는 T7, T3, ø, Ⅰ, øⅡ, H, W31, gh-1, Y, A1122 또는 SP6임. Studier, 95 Virology 70, 1979)로 감염된 세포내의 폴리머라제와 거의 동일한 것이다. 이 폴리머라제는 디데옥시 뉴클레오티드 유사물을 식별할 수 없다. 이 폴리머라제는 1mg의 폴리머라제당 50유니트 이하의 엑소뉴클레아제 활성도, 더욱 바람직하게는 1유니트 이하, 더욱 바람직하게는 0.1유니트 이하, 가장 바람직하게는 엑소뉴클레아제 활성이 없도록 변형된 것이다. 이 폴리머라제는 10 염기 또는 바람직하게는 4염기 길이정도의 짧은 프라이머를 이용할수 있다. 이 프라이머는 4 내지 40개의 뉴클레오티드 염기를 포함하여, 단일가닥 DNA 또는 RNA이다. 어닐링 단계는 상기 DNA분자와 상기 프라이머를 65℃이상, 바람직하게는 65-100℃로 가열하고, 이 가열된 혼합물을 65℃이하 바람직하게는 0-30℃로 냉각시키는 것을 포함하며, 항온처리 단계는 펄스(pulse) 및 체이스(chase)단계를 포함하는데, 여기서 펄스단계는 4종류의 상이한 데옥시 뉴클레오시드 트리포스페이트 모두(이 데옥시뉴클레오디드 트리포스페이트중 적어도 하는 라벨되어 있다)와 진행성 DNA폴리머라제를 상기 어닐링된 혼합물과 혼합하는 단계를 포함하며, 이 펄스단계는 상기 폴리머라제가 진행성(processivity)을 나타내지 않는 조건인 0-20℃에서 30초-20분간 실시되거나 또는 상기 뉴클레오티드 트리포스페이트중 적어도 하나가 제한된 조건에서 실시되며, 상기 체이스 단계는 상기 펄스단계 후에 상기 혼합물을 4개로 분할하고, 여기에 사슬 종료제중 하나를 첨가하는 것을 포함하며, 바람직하게는 이 체이스 단계를 30-50℃에서 1-60분간 실시한다. 상기 종료제는 디데옥시 뉴클레오티드이거나, 또는 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트중 하나를 제한 농도로 사용한다. 4개의 데옥시 뉴클레오티드 중 하나는 dITP 또는 데아자구 아노신이다. 라벨된 프라이머가 사용되면 펄스단계가 필요치 않으며, 상기 라벨은 방사성 또는 형광성이 있는 것이 바람직하다. 상기 폴리머라제는 DNA서열결정 반응의 펄스 반응에 통상 사용되는 2차 환경조건에서 그 자체의 진행성을 나타내지 못한다.
본 발명의 다른 목적은 a) 엑소뉴클레아제 활성이 없는 진행성 DNA폴리머라제를 사용하여, 3' 돌출말단을 갖고 있지 않은 선형 DNA분자로 부터 블런트 말단(blunt end)의 이중가닥 DNA분자를 제조하는 방법과, b) 이중가닥 DNA서열의 상반되는 가닥들에 일차 및 이차 플라이머를 어닐링시키고, 1mg의 폴리머라제당 500유니트 이하, 바람직하게는 1유니트 이하의 엑소뉴클라아제 활성을 갖는 진행성 DNA폴리머라제를 사용해 상기 어닐링된 혼합물을 항온처리하는 것을 포함하는 DNA서열의 증폭 방법으로서, 상기 일차 및 이차프라이머는 상기 DNA서열의 상반되는 가닥들에 어닐링되는 것을 특징으로 하는 방법으로서, 바람직한 구체예로, 상기 프라이머들은 서로에 대해 암호된 3' 말단을 갖으며, 본 발명은 또한 상기 항온처리단계 이후에 얻어진 DNA를 변성시키고, 이렇게 얻어진 DNA에 상기 일차 및 이차 프라이머를 어닐링시키며, 상기 폴리머라제로 상기 어닐링된 혼합물을 항온처리하는 단계를 추가로 포함하며, 바람직하게는 상기 변성, 어닐링 및 항온처리로 구성된 사이클을 10-40회 반복하는 것을 특징으로 하며, c)클로화된 단편들을 제공하고, 1mg의 폴리머라제당 1유니트 이하의 엑소뉴클레아제 활성도를 갖는 진행성 DNA폴리머라제를 사용하여 DNA가닥을 합성함으로서, 실험실적으로 클론화된 DNA단편의 돌연변이를 유발시키는 방법과, d)세포가 대수 증식기, 또는 정지시에 있을 때에만 유전자의 발현을 유도하고, 이 세포로부터 폴리머라제를 분리하는 것을 포함하는 동일 세포내에서 비누출성(non-leaky)프로모터(이하참고)의 조절하에 클론화된 DNA단편으로부터 활성 T7-타입의 DNA폴리머라제를 생산하는 방법과(여기서 바람직하게는 상기 클론화된 단편들이 발현되기 위해서 T7 RNA폴리머라제를 필요로 하는 프로모터의 조절하에 있다). e) T7-타입의 DNA폴리머라제를 암호하는 유전자(여기서 이 유전자는 천연발생의 엑소뉴클레아제 활성도를 감소시키기 위해 유전학적으로 변형되었으며, 더욱 바람직하게는 히스티딘(His)잔기가 변형되었고, 가장 바람직하게는 유전자 5의 His-123을 변형시킨 것임), f) 유전학적으로 변형된 폴리머라제를 암호하는 유전자의 생성물, g) T7 DNA폴리머라제를 발현시키는 벡터를 함유하고 있는 세포를 용해시키는 단계, 이온교환칼럼 및 DE52 DEAE 칼럼, 포스포셀룰로오스컬럼, 그리고 히드록시 아파타이트 칼럼상에 상기 폴리머라제를 통과시키는 단계를 포함하는, 상기 세포로부터 T7 DNA폴리머라제를 정제하는 방법으로서, 바람직하게는 상기 통과 단계 이전에 암모늄설페이트를 사용해 상기 폴리머라제를 침전시키는 단계를 포함하며, 또한 이 방법은 상기 폴리머라제를 세파덱스 DEAE A 50칼럼을 통과시키는 단계를 추가로 포함하며, 상기 이온교합 칼럼은 DE 52 DEAE 칼럼인 정제방법, h) DNA폴리머라제 용액내의 엑소뉴클레아제 활성을 불활성화시키는 방법으로서, 산소, 환원제와 전이금속을 포함하는 용기내에서 상기 용액을 항온처리하는 단계를 포함하는 방법, i) 폴리머라제 1mg당 엑소뉴클레아제 활성도가 500 유니트 이하인 상술된 진행성 DNA폴리머라제, 사슬 종료제중에서 선택된 서열결정에 필요한 시제 및 dITP를 포함하는 DNA 서열 결정용 키트로서, 여기서 상기 폴리머라제는 일차 환경 조건에서 그 자체의 진행성을 나타낼 수 없으며, 바람직하게는 이차환경 조건에서는 그 자체의 진행성을 나타내며, j) 1mg의 폴리머라제 당 500유니트 이하의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 진행성 DNA폴리머라제 및 라벨화된 데옥시뉴클레오티드와 함께 DNA단편을 항온처리하여 이 DNA 단편의 3' 말단을 라벨화시키는 방법과, k) 프라이머와 템플레이트(이 프라리머와 템플레이트는 특정의 잘못 짝지워진(=부정합)염기를 갖고 있다)를 제공하는 단계와 상기 프라이머를 진행성 DNA 폴리머라제를 사용해 신장시키는 단계를 포함하는 시험관내에서 클론화된 DNA 단편의 돌연변이를 유발시키는 방법과, 1) 클론화된 DNA단편을 제공하는 단계와 뉴클레오티드 염기가 잘못 삽입되도록 하는 조건하에서 50유니트 이하의 엑소뉴클레아제 활성도를 갖는 진행성 DNA폴리머라제를 사용하여 DNA가닥을 합성하는 단계를 포함하는 실험실적으로 상기 클론화된 DNA단편의 돌연변이를 유발시키는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 진행성이 있으며 식별능력이 없고, 짧은 프라이머를 이용할 수 있는 DNA폴리머라제를 제공한다. 또한 이 폴리머라제에는 엑소뉴클레아제 활성도가 결합되어 있지 않다. 이러한 폴리머라제는 상술한 방법을 실시하는데 특히 유용한 특성을 지니며, 특히 DNA서열결정 방법에 유용한데, 그 이유는 폴리아실아미드겔내의 방사성 활성도의 백그라운드 준위(background level)를 무시할 수 있기 때문에 가공밴드가 거의 없으며, 얻어진 밴드들이 명확하여 DNA서열을 해독하기가 용이하기 때문이다. 또한, 이러한 폴리머라제는 후술되는 것처럼 길이가 긴 DNA단편을 서열결정하는 신규의 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 특징과 잇점은 후술되는 바람직한 구체화와 특허 청구 범위에서 상세히 기술한다.
[DNA 폴리머라제]
일반적으로 본 발명의 DNA 폴리머라제는 진행성(processivity)이 있고 엑소뉴클레아제 활성이 결합되어 있지 않으며, 뉴클레오티드 유사물이 투입되는 것을 구별하지 못하고, 특정 프라이머로서 적은 올리고뉴클레오티 그(예를들면 테트라머, 헥사머 및 옥타머)를 이용할 수 있다.
[진행성]
진행성이란 상기 DNA 폴리머라제가, DNA 서열결정 신장반응(extension reactions)에 일반적으로 사용되는 조건하에서, 템플레이트로부터 분리됨(dissiciation)이 없이 동일한 프라이머-템플레이트를 사용하여 많은 수의 뉴클레오티드를 연속적으로 결합(incorparotion)시킬수 있는 특성을 의미한다.
진행성의 정도는 폴리머라제의 종류에 따라 다양하다. 일부 폴리머라제는 분리되기 전에 단지 몇개의 염기만을 결합시키며 [예를들면, 클레노우(약 15염기), T4 DNA 폴리머라제(약 10염기), T5 DNA 폴리머라제(약 180염기), 그리고 역전사 효소(약 200염기), (Das et al. J. Biol, Chem. 254 : 122 1979 ; Bambara et al., J. Biol. Chem. 253 : 413, 1978)], 반면에 본 발명의 것과 같은 다른 몇개의 폴리머라제는 적합한 환경조건하에 적어도 500염기, 바람직하게는 1,000염기동안은 결합된 상태로 분리되지 않고 유지된다. 이와같은 환경조건이라 10-50℃의 항온처리온도와 4종류의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트를 모두 적절하게 공급해 주는 것을 포함한다. 진행성은 E. Coli 단일가닥 결합(single stranded binding=ssb)단백질 존재하에 크게 향상된다.
진행성 효소를 사용할때, 서열결정방법은 디데옥시뉴클레오티드(dideoxy nucleotide)같은 사슬 종료제가 삽입된 염기에서만 종결 반응이 발생한다. DNA 폴리머라제가 진행성이 없다면, 이때는 이 폴리머라제가 분리되는 뉴클레오티드에 해당하는 위치에서 가공 밴드들이 생겨나게 될것이다. 빈번하게 분리가 발생하면 부정확한 위치에서 백그라운드 밴드들이 형성되기 때문에 진정한 DNA서열이 불분명하게 한다. 이러한 문제는 상기 반응 혼합물을 오랜시간(30-60분)동안 고농도의 기질과 함께 항온처리함으로서 부분적으로 보정할 수 있다. 즉 이렇게 함으로써 가공밴드들은 고분자량의 밴그가 되어 DNA서열이 해독되는 영역에서 멀리 떨어진 겔의 상단부로 “제거된다(chase)”.
이러한 컴팩트한 이차구조 또는 헤어핀 영역에서, 특히 비진행성 DNA폴리머라제가 템플레이트로부터 분리될 확률이 높기 때문에 상술한 방법은 바람직한 해결방안이 아니다. 이러한 부위에서 프라이머 신장반응을 재개시하는 것은 비효율적이며, 일반적으로 모든 4종류의 뉴클레오티드에 대해 동일한 위치에서 밴드가 형성되는 결과가 나타나므로 역시 DNA서열이 불분명해진다.
[유사물 식별력]
본 발명의 DNA 폴리머라제는 디데옥시-뉴클레오티드 유사물과 정상적인 뉴클레오티드를 정확히 식별하지 못한다. 즉 유사물이 삽입될 가능성은 정상의 뉴클레오티드가 삽입될 가능성과 동일하거나 또는 정상 유사물이 삽입될 효율의 최소한 1/10정도의 효율로 유사물이 삽입된다. 본 발명의 폴리머라제는 다른 종류의 유사물을 정확히 식별하지 못한다.
이와같은 사실은 서열결정 반응에서 4종류의 정상 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트(dGTP, dATP, dTTLP 및 dCTP)외에도, 다른 타입의 뉴클레오티드 유도체가 삽입되어야 하기 때문에 중요하다. 상술한 다른 타입의 뉴클레오티드 유도체란, 방사성 라벨 또는 형광 라벨된 뉴클레오시드 트리포스페이트로서, 통상 합성된 가닥들이35S,32P 또는 다른 화학시약으로 라벨링된 것들이다.
DNA 폴리머라제가 유사물을 식별하지 못하기 때문에 정상 뉴클레오티드가 삽입될 확률과 동일한 확률로 유사물이 삽입될 수 있다. 라벨된 뉴클레오시드 트리포스페이트의 경우, 이와같은 사실은 최소의 방사능을 사용하여 합성된 DNA가닥을 효율적으로 라벨시키기 위해서 중요하다. 또한, 이 같은 효소를 사용함으로써 유사물을 저농도로 사용할 수 있게 되므로, 본 서열결정 반응은 유사물을 명확히 식별할 수 있는 효소를 사용할때 보다 더 경제적이다.
식별성 폴리머라제는 합성중에 이차구조로 인한 장해를 극복하고저 멈추어 있는 경우와 진행 모드로 중합을 실시할때 그 식별 정도에서 차이를 나타낸다. 이러한 장해시에는 겔상에 존재하는 방사성 활성 밴드들의 세기가 상이하여 가변적이기 때문에 서열이 분명치 않게 될수도 있다.
[엑소뉴클레아제 활성]
본 발명의 DNA 폴리머라제는 정상 또는 고유준위의 결합된 엑소뉴클레아제 활성도(폴리머라제 분자당 활성도의 양)의 50%이하, 바람직하게는 1%이하, 가장 바람직하게는 0.1%이하를 갖고 있다. 상술한 정상 또는 고유준위란 변형되지 않은 T7-타입 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성을 의미한다. 일반적으로 결합된 활성도는 Chaes 등.(249 J. Biol. Chem. 4545, 1974)의 방법을 변형하여 후술되는 바와같이 측정하는 것으로서, 1mg의 폴리머라제당 약 5000유니트 엑소뉴클레아제 활성을 갖고 있다.
엑소뉴클레아제는 템플레이트에 대해 부정확한 염기쌍이 짝지워지는 경우, 새롭게 합성된 염기를 절단함으로서 DNA합성의 자가보존률(fidelity)을 증가시킨다. 이같이 결합된 엑소뉴클레아제 활성은 DNA서열결정 반응의 질을 향상시키는데 도움이 되지 못한다. 이러한 엑소뉴클레아제 활성은 서열결정 반응에 첨가되어야 하는 뉴클레오티드 전구체의 최소 필요 농도를 증가시키는 결과를 초래한다. 왜냐하면 뉴클레오티드 농도가 감소할 때 폴리머라제의 활성도는 엑소뉴클레아제 활성도에 비해 속도가 느려져서 순 DNA합성을 실시하지 못하거나 합성된 DNA분해를 초래하기 때문이다.
특히, 결합된 엑소뉴클레아제 활성은 이차 구조 방해현상이 나타나는 템플레이트내의 영역들에서 DNA폴리머라제가 작용하지 못하도록 한다.
폴리머라제가 이러한 구조에 접근하게 되면 그의 합성 속도는 그곳을 지나가는 동안 감소하게 된다. 결합상태의 엑소뉴클레아제는 폴리머라제가 작용을 멈추면 새롭게 합성된 DNA를 절단한다. 그 결과 합성과 절단으로 구성된 사이클이 수없이 발생한다. 이로써 폴리머라제가 헤어핀을 지나 실지합성을 실시한 결과가 얻어진다.(서열결정 반응의 질에 유해함이 없이) 또는 폴리머라제가 합성된 가닥으로부터 분리될 수도 있다.(그 결과 4개의 모든 서열결정 반응에서 동일 위치에 가공의 밴드가 나타남), 또는 사슬 종료제가 높은 빈도수로 삽입되어 서열결정용 겔내에 다양한 강도의 각종 단편들이 생산될 수도 있다. 이러한 현상은 소정 위치에서 사슬 종료제의 결합 빈도수가, 상기 폴리머라제가 사슬 종료성 뉴클레오티드를 결합시켜야 하는 기회의 빈도수가 증가하는 만큼 증가하고, 그 결과 DNA폴리머라제는 다른 위치에서 보다 지연부(idling sites)에서 더 높은 빈도로 사슬 종료제를 결합시키게 되기 때문에 발생된다.
이상적인 서열결정 반응은 겔 전반에 걸쳐 일정한 강도의 벤드들을 생산할 것이다. 이는 모든 반사성 활성 단면에 대해 X-레이 필름의 최적 노출을 얻는데 필수적인 것이다. 만일 방사성 활성밴드의 강도가 가변적이라면, 더 희미한 밴드는 검출되지 않을 가능성도 있다. 모두 일정한 방사성 활성 강도를 갖는 단편을 얻기위해서, DNA 폴리머라제는 DNA상의 각 위치에서 뉴클레오티드의 첨가 또는 제거중 어느 하나에 대해 특별히 선호하는 경향이 없이 DNA상의 모든 위치에서 동일한 시간 간격동안 머물러야 한다. 이러한 현상은 DNA 폴리머라제가 그와 결합된 엑소뉴클레아제가 결여된 경우에 일어나며, 이 경우 이 폴리머라제는 템플레이트를 따라가며 각 위치에서 단 한번의 사슬 종료 뉴클레오티드를 삽입할 수 있는 기회를 갖게된다.
[짧은 프라이머]
본 발명의 DNA 폴리머라제는 10염기 또는 그 이하뿐 아니라 더 긴것, 가장 바람직하게는 4-20 염기 길이를 갖는 프라이머를 이용할 수 있다. 짧은 프라이머를 이용할 수 있는 능력은 DNA서열 결정 방법에 여러가지의 중요한 잇점을 제공한다. 짧은 프라이머는 보통의 15-20-mer프라이머보다 합성하기 용이하며 값이 싸다. 이 프라이머들은 DNA템플레이트상의 상보적인 부위에 더 빨리 어닐링되므로 서열결정 반응을 더 빠르게 해준다. 또한 DNA 서열결정 방법에 작은(예, 6 또는 7개 염기)올리고 뉴클레오티드 프라이머를 이용할 수 있기 때문에 길다란 DNA단편을 서열결정할 수 있다. 예를들면 80개의 랜덤 핵사머를 갖는 키트가 생성될 수 있는데, 여기서 이들중 어느것도 클로닝 벡터내의 임의의 부위에 대해 상보적인 것은 없다. 통계적으로 80개의 헥사머 서열중 하나는 서열결정 되는 DNA단편을 따라 평균 50염기정도를 생성시킨다.
3000개 염기로 구성된 서열을 결정하는데는 단지 5회의 서열결정 사이클을 필요로 한다. 첫번째로, “유니버설”프라이머(예, New Englannd Biolabs #1211, 서열 5' GTAAAACGACGGCCAGT3')는 삽입체의 한쪽 말단에서 약 600 염기의 서열을 결정하는데 사용될 수 있다. 이 서열결정 반응으로부터 결과를 이용하여, 상기 결정된 서열 말단 근처에 있는 영역에 상동성이 있는 키트로부터 새로운 프라이머를 선택한다. 두번째 사이클에서, 이 프라이머를 사용하여 그 다음의 600염기 서열을 결정할 수 있다. 이러한 공정을 5회 반복하면 서브 클로닝할 필요없이 그리고 새로운 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 화학적으로 합성하지 않고도, 3000 염기의 완전 서열을 결정할 수 있다. 이와같이 서열결정 반응에서 짧은 프라이머를 사용하는 반응은 T7의 유전자 2.5 및 4단백질을 포함시킴으로서 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 DNA 폴리머라제(즉, 상기 특성을 지님)는 변형된 T7-타입의 폴리머라제를 포함한다. 즉, 이 DNA폴리머라제는 서브 유니트로서 숙주 티오레독신을 요구하며, 이 폴리머라제는 변형된 T7 DNA 폴리머라제 또는 T3, øI, øII, H, W31, gh-1, Y, A122 또는 SP6 같은 관련 파지로부터 분리된 상응하는 효소와 거의 동일하다. 이러한 각각의 효소들은 변형된 T7 효소와 비슷한 특성을 갖도록 변형시킬 수 있다. 파지로 감염된 세포로부터 상기 효소를 직접 분리하는 것이 가능하지만, 이 효소는 그것을 과량 생산하는 세포로부터 분리하는 것이 바람직하다. 거의 동일하다는 의미는 상기 요소가 그 효소의 전체 특성에 영향을 끼치지 않는 아미노산 치환체를 갖고 있을수도 있음을 의미한다. 특히 바람직한 아미노산 치환체의 예로는 엑소뉴클레아제 활성이 제거되도록 천연 효소를 변형시킨 경우이다. 이러한 변형은 유전학적 레벨 또는 화학적 레벨에서 실시할 수 있다(후술됨).
[T7 폴리머라제 클로닝]
본 발명의 예로서, 본 발명자들은 T7 DNA 폴리머라제의 클로닝, 과잉생산, 정제, 변형 및 용도를 기술한다. 이러한 진행성 효소는 1 : 1의 화학량론적 비율로 단단하게 복합된 두개의 폴리펩티드로 구성되어 있다.
하나는 84,000 달톤인 파지 T7-암호된 유전자 5단백질이고(Modrich et al. 150 J. Biol. Chem. 5515, 1975), 다른 하나는 12,000 달톤인 E. Coli암호된 티오레독신(Tabor et al., J. Biol, Chem. 262 ; 16, 216, 1987)이다. 이 티오레독신은 부속 단백질이며, 프라이머 템플레이트에 유전자 5단백질(실질상 비진행성 DNA폴리머라제)을 부착시킨다. 천연의 DNA 폴리머라제는 이것과 결합된 매우 활성이 있는 3'-5'엑소뉴클레아제를 갖고 있다. 이러한 활성은 이 폴리머라제가 DNA서열결정 방법에 있어서 효용성이 없도록 하는 요인이 되므로, 이 폴리머라제를 사용하기 전에 불활성화 시키거나 변형시켜야만 한다.
이것은 후술되는 바와 같이 엑소뉴클레아제도메인을 화학적으로 부분 산화시키거나 또는 유전학적으로 이러한 활성을 암호하고 있는 폴리머라제 유전자 내의 해당 암호 영역을 변형시킴으로서 쉽게 실시할 수 있다.
[pTrx-2]
E. Coli와일드 타입의 trx A(티오레독신)유전자를 클로닝 하기 위해서, E. Coli DNA를 Sau 3A를 사용해 부분적으로 절단한뒤, 그 단편들을 균주 T7 ST9에서 분리된 BamHI-절단된 T7 DNA에 결찰시켰다(Tabor et al., in Thioredxin and Glutaredoxin Systems ; Structure and Function(Holmgren et al., eds) pp.285-300, Raven Press, NY ; and Tabor et al., 상기 참조).
결찰된 DNA를 E. coli trxA-세포내로 형질감염(transfection)시키고, 이 혼합물을 trx A-세포상에 평판시킨 뒤, 얻어진 T7 플라크(Plaques)를 선별수거했다. T7은 활성 E. coli trxA 유전자 없이는 증식할 수 없기 때문에, trx A유전자를 함유한 파지들만이 플라크를 형성할 수 있다. 클론화된 trx A 유전자들은 470 염기쌍의 Hinc II 단편상에 위치하고 있었다.
티오레독신을 과잉 생산하기 위해서, 플라스미드인 pTrx-2를 작제했다.
간단히, trx A유전자를 포함하고 있는 470 염기쌍의 Hine Ⅱ 단편을 표준 방법으로 분리한 뒤(Maniatis et al., Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs., Cold Spring Harbor, N.Y.), 이것을 Ptac프로모터(ptac-12, Amann et al., 25 Gene 167, 1983)를 포함하고 있는 pBR 322유도체에 결찰시켰다. 제2도에 의하면, β-락타마제와 Clo El오리진을 포함하고 있는 ptac-12를 Pvu Ⅱ로 절단하여 2290 bp의 단편을 얻었고, 그후 이것을 두개의 trx A(Hine Ⅱ 단편)텐덤(tandem)복사체에 상업적으로 입수 용이한 링커(Sma I-Bam HI 폴리링커)를 사용하여 결찰시켜 pTrx-2를 제작했다. pTrx-2인 완전 뉴클레오티드 서열이 제7도에 도시되어 있다. 티오레독신 생산은 tac프로모터이 조절하에 있으므로, IPTG(이소프로필 β-D-티오갈락토시드)에 의해 특이적으로 생산을 유도시킬 수 있다.
[pGP 5-5 및 mGP 1-2]
T7의 몇몇 유전자가 생성물은 E. coli내에서 발현되면 치명적이다. T7 RNA폴리머라제의 유도성 발현 현상에 입각하여, 치사 유전자의 클로닝 및 발현을 촉진시키는 발현 시스템이 개발되었다. 유전자 5단백질은 몇몇 E.coli 균주내에서 치명적이며, 이러한 시스템의 예가 Tabor등에 의해 82 Proc, Nat. Acad. Sci. 1074(1985)에 제시되었는데, 여기서 T7유전자 5는 ø 10 프로모터의 조절하에 위치되어 있으며, T7 RNA폴리머라제가 세포내에 존재할 때만 발현된다.
간단히, pGP5-5(제3도)는 합성 Bam HI링커를 사용하여 유전자 5를 포함하고 있는 14306(Nde I) 내지 16869(Aha Ⅲ)에 이르는 T7 단편을, T7 RNA 폴리머라제에 의해 인지되는 ø 1.1 A 및 ø 1.1 B프로모터를 둘 모두 포함하는 5667(Hine Ⅱ)-6166(Fnu 4 H1)에 이르는 T7의 560bp단편과 pACYC 177의 3Kb Bam HI-Hine Ⅱ 단편(Chang등, 134 J. Bacteriol 1141, 1978)에 결합시켜 작제했다. 상기 T7 삽입체들과 링커들의 뉴클레오티드 서열은 제8도에 나타내었다. 이 플라스미드내에서, 유전자 5는 T7 RNA폴리머라제가 세포내에 제공될 때에만 발현된다.
제3도에 있어서, T7 RAN 폴리머라제를 파지 벡터 mGP1-2상에 제공한다.
이 백터는 pGP1-2(Tabor et al.)와 비슷하지만 링커들(각각 Bal Ⅱ 및 Sal I)을 사용하여, T7 RNA폴리머라제를 포함하고 있는 3133(Hae Ⅲ)-5840(Hin fl)에 이르는 T7 단편을 Bam HI-SalI으로 절단한 M13mp8에 결찰시켜 lac프로모터 조절하에 상기 폴리머라제 유전자를 위치시킨다는 점에서 상이하다. mGP1-2의 완전 뉴클레오티드 서열은 제9도에 나타내었다.
pGP5-5와 pTrx-2가 서로 다른 복제 오리진(각각 P 15A와 ColEl오리진)을 갖고 있기 때문에 이들을 동시에 하나의 세포내로 형질전환시킬 수 있다. pTrx-2는 IPTG존재하에 다량의 티오레독신을 발현한다. mGP1-2는 상기 두개의 플라스미드와 같은 동일 세포내에 함께 존재할 수 있으며, IPTG같은 것을 이용해 그 lac 프로모터를 유발시킴으로서 T7-RNA폴리머라제 생산을 간단히 유발시켜 pGP5-5로부터 T7-DNA폴리머라제의 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다.
[T7 DNA 폴리머라제의 과잉생산]
trx A 및 유전자 5의 두종류 유전자 생성물을 과잉 생산하고 재구성하기 위한 몇가지 방법이 있다. 이들 방법에서는 동일 세포주와 플라스미드가 이용될 수 있다. 바람직한 방법으로서 상기 두 종류의 유전자들을 동일 세포내에서 동시에 과잉 발현시킨다.(이것은 유전자 5가 티오레독신이 결합될 때까지는 프로테아제 민감하기 때문이다). 후술되는 바와같이, 한 방법은 동일 세포내에서 양립가능한 두개의 플라스미드 각각에 상기 두개의 유전자를 별도로 위치시키는 것이다. 대안적으로 상기 두개의 유전자는 동일 플라스미드상에 나란히 탠덤식으로 배치시킬수 있다. T7-유전자 5는 비누출성의 유도성 프로모터, 예를들면 T7의 ø 1.1 A 및 ø 1.1 B 및 ø10의 조절하에 배치되는 것이 중요하다. 왜냐하면 두개의 폴리펩티드가 비록 소량일지라도 함께 합성되는 경우 대부분의 E. coli세포내에서 독성을 나타내기 때문이다. “비누출성”이라는 의미는 유전자 발현을 조절하는 프로모터가 활성되지 않았을때 세포 세대 시간당 해당 유전자로부터 유전자 생성물이 500분자 이하로 생산된다는 것을 의미한다. 유도성 프로모터를 이용한 다른 발현시스템을 사용할 수도 있으나, T7 RAN폴리머라제 발현시스템을 사용하는 것이 바람직하다. 누출성 프로모터, 즉 plac는 유도되지 않았을 때라도 해당 단백질을 500분자 이상 합성할 수 있으므로, 이러한 프로모터 조절하에 있는 치사유전자를 함유하는 세포들은 증식이 불량하여, 본 발명에 적합치 않다.
물론 상기 생성물로 인해 치사하지 않는 세포내에서는 상기 생성물을 생산할 수 있으며, plac프로모터는 그러한 세포내에서 적합하다.
두번째 방법으로, 각 유전자를 별도로 클로닝시켜 각각 과잉 발현시킬 수 있다. 이러한 방법을 이용하여 별개로 과잉 생산된 폴리펩티드를 함유한 세포들을 그의 추출물들을 제조하기 전에 합하는데, 이때에 이 두개의 폴리펩티드가 활성 T7 DNA폴리머라제를 형성하게 된다.
[실시예 1 : T7 DNA 폴리머라제 생산]
E. coli 균주 71.18(Messing et al., Proc, Nat. Acad. Sci, 74 : 3642, 1977)을 mGP1-2의 스톡(stocks)을 제조하기 위해 사용한다. 71.18을 -80℃에서 50% 글리세롤중에서 저장한뒤, 표준 최소 배지아가 프레이트상에 획선(streak)배양시킨다. 단일 콜로니를 37℃에서 25㎖ 표준 M9 배지중에서 밤새 증식시키고, mGP1-2의 단일 플라크(plaque)는 새로 제조된 71.18 세포를 사용해 상기 스톡을 적정(titering)함으로써 수득했다. 이 플라크를 사용하여, A590=0.5로 증식시킨 JM103을 포함하는 10㎖의 2X LB(2%박토-트립톤, 1%이스트 추출물, 0.5% Nacl, 8mM NaOH)를 접종시킨다. 이 배양체는 다량의 mGP1-2의 배양체를 제조하기 위한 파지스톡을 제공한다. 3-12시간후에 10㎖배양체를 원심분리하고, 그 상청액을 다량(2L)배양체를 감염시키는데 사용한다.
다량 배양체에서 4x500㎖ 2X LB를 M9중에서 증식시킨 71.18 세포 5㎖로 4회 접종하고 37℃에서 진탕시킨다. 다량의 세포 배양체를 A590=1.0으로 증식시켰을때 (약 3시간), 이들을 mGP1-2의 발단 배양체(Starter) 용해물이 함유되어 있는 상청액 10㎖로 접종시킨다. 감염된 세포를 37℃에서 밤새도록 증식시킨다. 다음날, 세포를 원심분리하여 제거하고, 그 상청액은 K38/pGP5-5/pTrx-2를 유도하는데 사용한다(후술됨). 이 상청액은 4℃에서 약 6개월간 역가가 약 5x1011ø/㎖정도 되도록 저장할 수 있다. 이러한 역가에서 1ℓ의 파지는 A590=5에서 15정도의 감염 다중성으로 12ℓ의 세포를 감염시킨다.
역가가 낮으면, 상청액중에 NaCl(60gm/1)과 PEG-6000(65gm/1)을 용해시키고, 이 혼합물을 0℃에서 1-72시간동안 정치시킨 뒤 원심분리(7000rpm으로 20분간)함으로써 상기 상청액으로 부터 mGP1-2파이지를 농축시킬 수 있다.
mGP1-2파지를 포함하고 있는 침전물을 원래 부피의 약 1/20에 해당하는 M9배지중에 재현탁시킨다.
K38/pGP5-5/pTrx-2는 두개의 양립성 플라스미드 pGP5-5와 pTrx-2를 포함하고 있는 E.coli균주(유전자형 Hfrc(λ))이다. pGP5-5플라스미드는 P15A복제 오리진을 갖고 있으며, 카나마이신(Km)내성 유전자를 발현한다. pTrx-2는 ColEI복제오리진을 갖고 있으며 앰피실린(Ap)내성 유전자를 발현한다. 이 플라스미드들을 표준 방법으로 K38 내에 도입한 뒤 Km F 과 Ap R 을 각각 선택한다. 세포 K38/pGP5-5/pTrx-2를 -80℃에서 50%를 글리세롤중에 저장한다. 사용하기전에 그들을 37℃에서 밤새 50㎍/㎖ 앰피실린과 카나마이신을 함유하는 프레이트상에서 확선 배양한다. 50㎍/㎖ 앰피실린과 카나마이신을 함유한 10㎖ LB배지 중에서 37℃하의 4-6시간동안 단일 콜로니를 증식시킨다. 10㎖세포 배양체를 사용하여 50㎍/㎖ 앰피실린과 카나마이신을 함유하는 LB 배지 500㎖를 접종시키고, 37℃에서 밤새도록 진탕한다. 다음날, 500㎖ 배양체를 사용하여 2X LB-KPO4배지 12ℓ(2% 박토-트립톤, 1% 이스트 추출물, 0.5% NaCl, 20mM KPO4·0.2%덱스트로오즈, 0.2%카사미노산, pH7.4)를 접종시켜 37℃의 발효자에서 통기시키면서 증식시킨다. 세포가 A590=5.0(즉, 대수 또는 정지 상단계의 세포)에 도달할때, 이 세포들은 10의 감염다중도로 mGP1-2를 사용해 감염시켰으며, IPTG를 첨가한다(최종 농도 0.5mM), IPTG는 티오레독신 및 mGP1-2 내의 T7 RNA 폴리머라제의 생산을 유도하므로 클론화된 DNA폴리머라제의 생산을 유도한다. 세포를 2.5시간 동안 추가로 교반 및 통기시키면서 증식시킨 후 수거한다. 세포 펠릿을 1.5ℓ의 10%, 슈크로즈/20Mm 트리스-HCl, pH 8.0/25mM EDTA중에 재현착시키고 다시 회전시킨다. 마지막으로 세포 펠릿을 200㎖의 10% 슈크로즈/20mM 트리스-HCL, pH 8/1.0 mM EDTA에 재현탁시킨후 액체 N2중에서 동결 건조시킨다. 유도된 세포 12ℓ로부터 약 700mg의 유전자 5 단백질 및 100mg의 티오레독신을 함유하는 70gm의 세포 페이스트가 얻어진다.
K38/pTrx-2(pTrx-2만을 포함하는 K38)는 티오레독신을 과잉 생산하며, 이것을 증강제(booster)로서 K38/pGP 5-5/pTrx-2추출물을 첨가하면, 정제초기에 티오레독신이 유전자 5단백질의 양보다 많이 존재하게 한다.
K38/pTrx-2 세포를 -80℃에서 50% 글리세롤중에서 저장한다. 사용하기 전에 이 세포들을 50㎍/㎖ 엠피실린을 함유하고 있는 플레이트상에 스트리킹(Streaking)하고 24시간 동안 37℃에서 증식시킨다. 50㎍/㎖앰피실린을 함유하는 25㎖의 LB 배지중, 37℃에서 밤새도록 단일 콜로니를 증식시킨다.
2㎖ 배양체를 사용하여 2X LB 배지 2ℓ를 접종시키고, 이것을 37℃에서 진탕한다. 세포들이 A590=3.0에 도달하면 ptac 프로모터는 IPTG 첨가(최종 농도 0.5mM)에 의해 티오레독신 생산을 유도한다. 세포들을 12-16시간동안 37℃에서 추가로 진탕하여 증식시키고, 수거하며, 600㎖의 10%슈크로즈/20mM트리스-HCL, pH 8.0/25mM EDTA중에 재현탁시킨후 재회전시킨다. 마지막으로 세포들을 40㎖의 10% 슈크로즈/20mM 트리스-HCL, pH 8.0/0.5mM EDTA중에 재현탁시키고, 액체 N2중에 동결시킨다. 2ℓ의 세포로부터 150mg의 티오레독신을 함유하는 16gm의 세포 페이스트를 얻는다.
폴리머라제에 대한 분석 방법은, 기질로서 단일 가닥의 송아지 흉선 DNA(6mM)를 사용하여 실시한다. 이것은 20℃에서 15분간 50mM NaOH로 이중가닥 송아지 흉선 DNA를 변성시킨뒤 HCl로 중화시킴으로써 사용직전에 제조된다.
임의의 정제된 DNA를 폴리머라제 분석을 위한 템플레이트로서 사용하는데, 이 DNA는 1,000염기 이상의 길이를 지니고 있는 것이 바람직하다.
사용되는 표준 T7 DNA폴리머라제 분석법은 Grippo et al(246 J. Biol, Chem, 6867, 1971)에 기재된 방법의 변형 방법이다. 표준 반응 혼합물(200㎕ 최종부피)은 40mM트리스/HCl, pH=7.5, 10mmMg Cl2. 5mM디티오트레이톨, 100nmol알칼리로 변성시킨 송아지. 흉선, DAN, 0.3mM dGTP, dATP, dCTP 및 [3H]dTTP(20cpm/pm), 50㎍/㎖ BSA를 함유하며 T7 DNA폴리머라제의 양만 변화시킨 것을 사용한다. 항온처리 단계는 37℃(10℃-45℃)에서 30분(5분-60분)간 설치된다.
이 반응은 3㎖의 냉각된 (0℃) 1N HCl-0.1M피로포스페이트를 참가함으로써 종료시킨다. 산불용성 방사능활성은 Hinkle등의 방법에 의해 측정된다(250J. Biol. Chem. 5523, 1974).
DNA를 얼음에서 15분(5분-12시간)간 침전시킨뒤, 여과에 의해 유리섬유 필터상에 침전을 여과한다. 이 필터를 4㎖의 냉각시킨(0℃) 0.1M HCl-0.1M피로포스페이트로 5회 세척하고, 냉각시킨 (0℃)90%에탄올로 2회 세척한다.
건조시킨 후에, 상기 필터상의 방사능 활성을 비수성 신틸레이션 형석을 사용해 카운팅한다.
1유니트의 폴리머라제 활성도는 상기 제시한 조건하에 37℃에서 30분간 10nmol의 뉴클레오티드가 산용해성 형태로 도입되는 것을 촉매화한다.
천연 T7 DNA폴리머라제와 변형 T7 DNA폴리머라제(후술됨)은 동일한 폴리머라제 특이 활성도 ±20%를 지니고 있다. 이것은 상술된 표준분석 조건에 의한 제법에 따라 천연 폴리머라제의 경우 5,000-20,000유니트/mg, 변형 폴리머라제의 경우 5,000-50,000 유니트/mg사이의 범위이다.
T7 DNA폴리머라제는 침전방법과 크로마토그래피방법에 의해 상기 추출물로 부터 정제된다. 이러한 정제 방법의 예가 후술된다.
냉동시킨 세포의 추출물(200㎖ K 38/pGP5-5pTrx-2와 40㎖ K38/pTrx-2)를 0℃에서 밤새 해동시킨다. 이 세포들을 혼합하고 5㎖,의 라이소자임(15mg/㎖)과 10㎖의 NaCl(5M)을 첨가한다. 0℃에서 45분후에, 세포들을 37℃수욕에 담가두어 온도가 20℃에 도달하도록 한다. 세포를 액체 N2에서 동결시킨다.
50㎖의 NaCl(5M)을 더 첨가하고 세포를 37℃수욕에서 해동시킨다.
해동시킨후, 세포를 0℃에서 60분간 부드럽게 혼합한다. 용해물(1ysate)을 Beckman 45Ti로우터에 35,000rpm속도로 1시간 동안 원심분리한다.
상청액(250㎖)를 분취물(I)이라 한다. 이것은 약 700mg의 유전자 5단백질과 250mg의 티오레독신(티오레독신 : 유전자 5단백질이 2 : 1비율)을 함유하고 있다.
90gm의 암모늄 설페이트를 분취물(I) (250㎖)에 용해시켜 60분간 교반한다.
이 현탁액을 60분간 정치시키고, 얻어진 침전물을 60분간 8000rpm에서 원심분리하여 수거한다. 침전물을 300㎖의 20mM트리스-HCl, pH 7.5/5mM 2-메르캅토 에탄올/0.1mM EDTA/10%글리세롤(완충용액 A)에 재용해시킨다. 이것을 분취물(Ⅱ)라 한다.
와트만 DE52 DEAE칼럼(12.6㎠x18cm)을 준비하고 완충용액 A로 세척한다. 분취물(Ⅱ)는 완충용액 A를 1ℓ씩 2회 교환해 주면서 밤새도록 투석시키는데, 이때 분취물(Ⅱ)를 전도도가 10mM NaCl를 함유한 완충용액 A의 전도도와 동일한 전도도를 가질때까지 투석시킨다. 투석시킨 분취물(Ⅱ)를 100㎖/hr유속으로 상기 칼럼에 적용하고 100mM NaCl을 함유하는 완충용액 A 400㎖로 세척한다. 단백질을, 완충용액 A중에 100-400mM NaCl 그래디언트 3.51을 사용해 유속 60㎖/hr로 용출시켰다. T7 DNA폴리머라제를 함유한 분취물들은 200mM NaCl에서 용출되는데 이것을 푸울시킨다. 이것은 분취물(Ⅲ)이라 한다(190㎖).
와트만 P11포스포셀롤로오스 칼럼(12.6㎠x12cm)을 준비하고 20mM KPO4pH 7.4/5mM 2-메르캅토에탄올/0.1 mM EDTA/10%글리세롤(완충용액 B)로 세척한다. 분취물(Ⅲ)을 완충용액 B로 2배 희석한다(380㎖). 그후 이것을 60㎖/hr 유속에서 상기 칼럼에 적용하고, 100mM KCL을 함유하는 완충용액 B 200mL로 세척한다. 유속 60㎖/hr에서 완충용액 B중의 100-400mM KCL 그래디언트 1.8ℓ를 사용하여 단백질을 용출시킨다. 300mM KCl에서 용출되는 T7 DAN폴리머라제를 함유한 분취물을 푸울시킨다. 이것을 분취물(Ⅳ) (370㎖)라 한다.
DEAE-세라덱스 A-50칼럼(4.9㎠x15cm)을 준비하고, 20mM 트리스-HCl pH 7.0/0.1mM 디티오트레이톨/0.1 mM EDTA/10%글리세롤(완충용액 C)로 세척한다.
분취물(Ⅳ)는 완충용액 C를 1ℓ씩 2회 교환하면서 이 용액에 대해 투석시키고 최종 전도도가 100mM NaCl를 함유하는 완충용액 C의 전도도와 동일한 전도도가 될때까지 투석시킨다. 투석된 분취물(Ⅳ)를 40㎖/hr유속으로 상기 칼럼에 적용하고 100mM NaCl을 함유하는 완충용액 C 150㎖로 세척한다. 단백질은 40㎖/hr 유속하에 완충용액 C중의 100내지 300mM NaCl그래디언트 1ℓ를 사용해 용출한다. 210mM NaCl에서 용출되는 T7 DNA포릴머라제를 함유하는 분취물을 푸울시킨다. 이것을 분취물(Ⅴ) (120㎖)라 한다.
BioRad HTP히드록실 아파타이트 칼럼(4.9㎠x15cm)을 준비하고, 20mM KPO4pH 7.4/10mM 2-메르캅토 에탄올/2mM Na 시트레이트/10%글리세롤(완충용액 D)로 세척한다. 분취물(Ⅴ)를 각각 500㎖씩 완충용액 D를 2회 교환하면서 투석한다. 투석된 분취물(V)를 유속 30㎖/hr하에 상기 칼럼에 적용하고 완충용액 D 100㎖로 세척한다. 단백질은 유속 30㎖/hr에서 완충용액 D중의 0내지 180mM KPO4pH7.4그래디언트 900㎖를 사용해 용출시킨다. 50mM KPO4에서 용출되는 T7 DNA폴리머라제를 함유하는 분취물을 푸울시킨다. 이것을 분취물(Ⅵ) (130㎖)이라 한다. 이것은 동종의 T7 DNA폴리머라제 270mg을 함유하고 있다.
분취물(Ⅵ)를 20mM KPO4, pH 7.4/0.1mM 디티오트레이톨/0.1mM EDTA/50% 글리세롤에 대하여 투석시킨다. 이것은 농출된 분취물(Ⅵ) (~65㎖, 41mg/㎖)이며, 이것을 -20℃에서 보관한다. 이렇게 분리된 T7 폴리머라제는 이것과 결합된 엑소뉴클레아제 활성도를 지니고 있다. 상술한 것처럼 이것은 불활성화 시켜야만 한다. 화학적 변형방법에 의해 불활성화 반응의 예는 다음과 같다.
농축 분취물(Ⅵ)를 밤새도록 20mM KPO4, pH 7.4/0.1mM 디티오트레이톨/10% 글리세롤에 대하여 투석시켜, 저장용 완충용액 내에 존재하는 EDTA를 제거한다.
투석후에, 농도를 20mM KPO4, pH 7.4/0.1mM 디티오트레이톨/10% 글리세롤을 사용해 2mg/㎖로 조절한 뒤, 30㎖(20mg/㎖)의 표본 샘플을 50㎖폴리프로필렌 튜브 중에 넣는다(2mg/㎖에서 T7 DNA 폴리머라제의 물농도는 22μM이다).
디티오트레이톨(DTT)과 페로우스 암모늄 설페이트(Fe(NH4)2(SO4)26H2O)를 사용하기 바로전에 새롭게 제조하여, T7 DNA폴리머라제의 표본 샘플 30㎖에 DTT농도가 5mM(250mM 스톡 0.6㎖)그리고 20μM Fe(NH4)2(SO4)26H2O(1mM 스톡 0.6㎖)으로 첨가한다. 변형과정 동안, T7 DNA폴리머라제와 철의 농도는 각각 약 20μM이며, 반면에 DTT는 250Z몰 이상의 농도를 유지시킨다.
이 변형방법은 다음과 같이 포화된 산소 분위기하에 0℃ 온도에서 실시한다. 이 반응혼합물을 건조기내의 얼음상에 위치시키고, 이 건조기를 배기시킴으로써 공기를 퍼어지 시킨뒤, 100%산소로 충진시킨다. 이 사이클을 3회 반복한다. 이 반응은 공기(20%산소)중에서 실시할 수도 있지만, 이 경우 반응은 1/3의 속도로 진행된다.
엑소뉴클레아제 활성이 시간에 따라 소실되는 과정을 제4도에 나타내었다. Richardson에 의해 제시된 방법(15 J. Moleo. Biol. 49, 1966)에 따라 박테리오파지 T7로 부터3H-라벨된 이중가닥 DNA(6cpm/pmol)을 제조했다.3H-라벨된 단일가닥 T7 DNA는, 20℃에서 15분간 50mM NaOH를 사용해 이중가닥의3H-라벨된 T7 DNA를 변성시키고, 그후 HCl로 중화시킴으로써 사용하기 바로 직전에 제조되었다. 사용된 표준 엑소뉴클레아제 분석법은 Chase et al(상기 참조)에 의해 제시된 방법은 변형시킨 방법이다. 표준 반응 혼합물(100㎕ 최종부피)은 40mM트리스/HCl, pH 7.5, 100mM MgCl2, 10mM 디티오트레이톨, 60nmol3H-라벨된 단일가닥 T7 DNA(6cpm/pm)을 포함하며, T7 DNA 폴리머라제양만을 변화시킨 것이다.3H-라벨된 이중가닥 T7 DNA가 또한 기질로서 사용될 수 있다. 일정하게 방사능적으로 라벨시킨 임의의 DNA단일 가닥 또는 이중가닥이 이 분석법에 사용될 수 있다. 3' 말단이 라벨화된 단일가닥 또는 이중가닥 DNA가 이 분석법에 사용될 수 있다. 37℃에서 15분간 배양한후, 30㎕의 BSA(10mg/㎖)와 25㎕의 TCA(100% w/v)를 첨가하여 반응을 중지시킨다. 10℃-45℃에서 1-60분간 분석을 실행한다. 이 DNA를 15분 (1분-12시간)간 얼음상에서 침전시키고 그후 30분(5분-3시간)간 12,000g에서 원심분리한다. 얻어진 상청액 100㎕몰과 5㎖의 수성 신틸레이션 칵테일(scintillation cocktail)에 첨가함으로써 이 상청액의 산용해성 방사능을 측정한다.
1유니트의 엑소뉴클레아제 활성도는 상기 분석 조건하에 30분간 총뉴클레오티드 10nmol의 산용해 반응을 촉매화한다. 천연의 T7 DNA폴리머라제는 상술된 표분 분석 조건을 사용해 분석해 보면 5000 유니트/mg의 엑소뉴클레아제 특이 활성도를 갖고 있다. 변형된 T7 DNA폴리머라제의 엑소뉴클레아제 특이 활성도는 화학적 변형 정도에 따르지만 상술된 표준 분석 조건을 사용하여 분석해보면 천연 T7 DNA폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성도의 최소 10-100배 이하이거나 500-50 또는 그 이하의 유니트/mg인 것으로 나타났다. 이중가닥의 기질을 사용하는 경우, 엑소뉴클레아제 활성도는 약 7배 더 높다.
상기 개시한 조건하에서, 엑소뉴클레아제 활성도는 8시간의 분해 반감기를 갖으며 지수적으로(exponentially) 분해된다. 하루에 1회씩 반응용기를 혼합하여 용해성 산소를 분배시킨다. 그렇지 않으면 반응은 산소농도가 더 높은 표면에서 더 급속히 진행될 것이다. 하루에 한번 2.5mM DTT(30㎖반응액에 대해 새로운 250mM 스톡 0.3㎖)를 첨가하여 산회된 DTT를 보충해 준다.
8시간 이후에 T7 DNA폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성도는 50%로 감소하는데 이때 폴리머라제 활성의 손실정도는 무시할 수 있을 정도이다. 50%손실이란 모든 폴리머라제 분자내의 엑소뉴클레아제 활성도가 일반적으로 감소되었다기 보다는 총 폴리머라제 분자중 반에 해당하는 폴리머라제 분자의 엑소뉴클레아제 활성이 완전히 불활성화된 것을 의미한다. 그러므로 8시간 반응후에는 모든 분자는 정상의 폴리머라제 활성을 지니며, 그 분자중 1/2은 정상의 엑소뉴클레아제 활성을 지니는 반면 나머지 1/2은 최초의 엑소뉴클레아제 활성의 0.1%이하를 지니고 있게 된다.
상기 분자중 50%가 변형되었을때 (8시간 반응) 이 효소는 DNA서열결정 반응에 최적은 아니나, 적절하다. DNA 서열결정반응은 최적상태로 실시하기 위해서는, 상기 비활성화 반응을 99%이상의 변형이 이루어지도록 진행시켜야 한다(엑소뉴클레아제 활성이 50유니트 이하가 되도록) 이것은 4일이 걸린다.
4일후에 상기 반응 혼합물은 20mM KPO4pH 7.4/0.1mM디티오트레이톨/0.1mM EDTA/50%글리세롤로 구성된 용액을 250㎖씩 2회 교환하여 투석을 실시함으로써 철을 제거한다. 변형된 T7 DNA 폴리머라제(~4mg/㎖)를 -20℃에서 보관한다.
T7 DNA 폴리머라제의 화학 변형 반응 메카니즘은 Fe2+같은 환원된 전이 금속 존재에 의해 생성되는 반응성 산소종 및 산소에 의존한다. 히드록실 래디칼의 생성에 관한 가능한 반응 메카니즘은 하기와 같다.
(1) Fe2+ O2→ Fe3++O2·
(2) 2O2·+2H+→ H2O2+ O2
(3) Fe2++ H2O2→ Fe3++ OH· + OH-
제(1)방정식에서 환원된 금속이온이 산화되면 초산화물 래디칼 02·가 얻어진다. 이 초산화물 래디칼은 과산화수소를 생성하면서 불변환 반응을 겪는다(방정식 2). 마지막으로 과산화수소는 환원된 금속이온과 반응하여 히드록실 래디칼 OH·를 형성한다(Fenton반응 방정식 3). 산화된 금속이온은 디티오트레이 (DTT)같은 환원제에 의해 환원된 형태로 재순환된다.
이러한 반응성 산소종은 특정 아미노산 잔기를 비가역적인 화학적 방식으로 변형시킴으로써 단백질을 불활성화시킬 것으로 추정된다. 이러한 손상은 CNBr 또는 트립신을 사용해 제조한 유전자 5의 단편들을 SDS-PAGE시킨 결과 관찰된다. 몇가지 단편이 사라지고, 고분자량의 가교결합이 발생되었으며, 몇개의 단편은 두개의 더 작은 단편으로 분할되었다.
전술한 바와같이, 산소 환원제(예를 들면, DTT, 2-메르캅토 에탄올)및 전이금속(예를들면, 철)은 본 변형반응을 실시하기 위한 필수성분들이다.
본 반응이 공기중에서 일어나지만, 100%산소를 사용함으로써 3배 가량 더 촉진시킬 수 있다. 이 반응은 첨가된 전이 금속이 없는 상태에서는 대부분의 완충용액 제제내에 미량의 전이금속(1-2μM)이 존재하기 때문에 서서히 발생할 것이다.
예상했던 것처럼, 상기 변형반응을 억제하는 억제제로는 혐기성 조건(예, N2)과 금속 킬레이트 제 (예, EDTA, 시트레이트, 나트릴로트리아세테이트)등이 해당된다. 또한, 효소 카탈라제(Catalase)와 초산화물변이억제제(dismutase)가 상기 반응을 억제하는데, 이것은 변형된 T7 DNA폴리머라제가 생성되는데 있어서 반응성 산소중의 역할이 필수적이라는 사실과 관련된 것이다.
대안으로서, T7 유전자 5 단백질의 엑소뉴클레아제 도메인을 특이적으로 불활성화시키기 위해서 상기 T7 유전자 5를 유전학적으로 변형시킬수도 있다.
이러한 돌연변이체로 부터 정제된 T7 유전자 5단백질은 산화방법에 의해 엑소뉴클레아제를 화학적으로 불활성화시킬 필요없이, 그리고 이 화학적 변형시 단백질에 불가피하게 발생되는 이차적인 손상을 일으키지 않고도 DNA서열결정 반응에 사용할 수 있으므로 이상적이다.
유전학적으로 변형된 T7 DNA 폴리머라제는 유전자 5를 무작위적으로 돌연변이를 유발시킨 뒤, 폴리머라제 활성은 손실되지 않고 엑소뉴클레아제 활성을 잃어버린 돌연변이체를 스크리닝함으로서 분리할 수 있다. 돌연변이 유발은 다음과 같이 실시된다. T7 DNA폴리머라제 프로모터의 조절하에 유전자 5를 함유하고 있는 단일가닥 DNA(예를 들면, 단일가닥 DNA복제오리진을 포함하고 이는 폴라스미드인 pEMBL-8내에 클로닝됨)를 표준방법에 의해 제조되고, 두개의 서로 다른 화학적 돌연변이 유발원으로 처리한다. 화학적 돌연변이 유발원은 히드라진과 포름산으로서 히드라진은 C'와 T'를 돌연변이 시키며, 포름산은 G'와 A'를 돌연변이 시킨다 (Myers et al 229 Science 242, 1985). 상기 DNA는 폴라스미드 한 분자량 변형되는 염기가 평균 한개정도 되도록 돌연변이를 유발시킨다. 단일가닥의 돌연변이가 유발된 플라스미들을 유니버셜 17-mer프라이머(상기참조)로 프라임(Primed)시키고, 이것을 주형으로 사용하여 반대 가닥을 합성한다. 합성된 가닥들은 템플레이트내의 돌연변이된 염기와 상응하는 위치에 무작위적으로 투입된 염기를 포함하고 있다. 이중가닥의 돌연변이가 유발된 DNA는 균주 K38/pGP1-2를 형질 전환시키는데 사용한다. 상기 균주는 프라스미드 pGP1-2를 함유하는 균주 K38이다(Tabor et al., 상기참조).
열유도(heat induction)시에, 이 균주는 T7 RNA를 폴리머라제를 발현한다.
형질전환된 세포들을 30℃에서 1플레이트 당 약 200콜로니 정도를 평판시킨다.
엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 T7 DNA폴리머라제를 갖는 세포들을 스크리닝하는 방법은 다음의 발견에 기초한 것이다. DNA 폴리머라제의 3'-5' 엑소뉴클레아제는 교정작용을 한다. 염기가 잘못 도입되었을때, 엑소뉴클레아제는 새롭게 도입된 염기를 “비정상”으로 인지하고 이를 제거한다.
이 현상은 dATP대신에 T7 DNA폴리머라제에 의해 용이하게 도입되는 dATP유사물인 에테노-dAPT가 도입된 경우에 발생된다. 그러나, T7 DNA폴릴머라제의 3'-5' 엑소뉴클레아제 존재하에서는, 도입 즉시 쉽게 절단되므로 순 DNA합성은 일어나지 않는다. 제6도에서 도시한 바와같이, 템플레이트로서 공중합체 폴리 d(AT)를 사용하면, 천연 T7 DNA 폴리머라제는 에테노-dATP가 아닌 dATP 존재하에서만 광범위한 DNA 합성반응을 촉매한다. 대조적으로, 결합된 엑소뉴클레아제 활성이 부족하기 때문에 변현된 T7 DNA폴리머라제는 dATP에 필적할 만한 속도로 DNA 내에 에테노-dATP를 안전하게 도입시킨다.
따라서 템플레이트로 폴리 d(AT)를 사용하고, 전구체로 dTTP와 에테노-dATP를 사용하면, 천연 T7 DNA 폴리머라제는 상기 템플레이트로 부터 DNA를 합성할 수 없으나, 반면에 그 엑소뉴클레아제 활성을 잃어버린 T7 DNA 폴리머라제는 상기 템플레이트를 사용하여 DNA를 합성할 수 있을 것이다.
다수의 콜로니를 용해시키고 스크리닝 하는 방법은 Raetz에 의해 제시되었다(72 Proc. Nat. Acad. Sci. 2274, 1975). 간단히 기술하면, 돌연변이가 유발된 유전자 5를 함유하는 플라스미드로 형질전환된 K38/pGP1-2 세포를 페트리디쉬에서 필터페이퍼(“평판 반복법”)으로 옮긴다. 이때 상기 페트리 디쉬에는 1플레이트당 약 200개의 콜로니가 존재하고 있다. 필터 페이퍼 디스크를 42℃에서 60분간 방치하여 T7 DNA 폴리머라제를 유도하고, 차례로 유전자 5 단백질을 발현시킨다. 티오레독신은 구조적으로 염색체 유전자로부터 생산된다.
상기 필터 페이퍼에 라이소자임을 첨가하여 상기 세포들을 용해시킨다. 세포 용해을 확실히 하기 위해서 냉각 해동 단계후에, 필터 페이퍼 디스크들을 37℃에서 60분간 폴리 d(AT), [α32P]dTTP 및 에테노-dATP와 함께 항온 처리한다. 필터 페이퍼 디스크들을 산으로 세척하여 도입되지 않은 [32P]dATP를 제거한다. DNA는 산으로 인해 필터 페이퍼상에 침전되고, 뉴클로오티드는 용해된다. 세척된 필터페이퍼를 사용하여 X-레이 필름에 노출시킨다.
엑소뉴클레아제 활상이 부족한 활성 T7 DNA 폴리머라제를 유도하는 콜로니에는 산불용성32P가 도입되어 있을 것이며, 따라서 방사상 사진에 의해 육안으로 확인할 수 있을 것이다. 천연 T7 DNA 폴리머라제 또는 폴리머라제 활성에 결함이 있는 T7 DNA 폴리머라제를 발현하는 콜로니는 자동 방사성 사진상에 나타나지 않을 것이다.
양성으로 나타난 콜로니를 원래의 콜로니들을 함유하고 있는 마스터 페트리디쉬에서 회수한다. 각각의 강력한 양성 콜론을 함유하는 세포들이 대규모로 (1ℓ)유도되며, T7 DNA폴리머라제를 각 제재물로 정제하여 각 돌연변이체와 결합된 엑소뉴클레아제의 레벨을 확인한다. 엑소뉴클레아제의 레벨이 낮은 것이 서열결정 방법에 사용하기 적합하다.
직접 돌연변이를 유발시키는 방법은 T7 유전자 5단백질의 엑소뉴클레아제 도메인 중의 유전적 돌연변이체를 분리하는데 사용될 수 있다. 다음은 이러한 방법의 예이다.
엑소큐클레아제 활성이 감소된 T7 DNA 폴리머라제(변형된 T7 DNA 폴리머라제)는 이차 구조 영역을 지나 합성할 수 있는 능력이 있기 때문에 천연 T7 DNA폴리머라제로 부터 구별할 수 있다. 그러므로, 변형 DNA 폴리머라제를 사용하여, 이차 구조를 갖는 템플레이트상에서 라벨된 프라이머로부터 DNA를 합성하는 경우, 비변형 또는 천연의 DNA 폴리머라제를 사용하는 경우와 비교해볼때 상당히 긴 신장 반응을 얻을 수 있다. 이 분석법을 기초로 소량의 DNA 폴리머라제 분자가 변형된 형태로 전환하는 것을 스크리닝 할 수 있다.
상기 분석법을 이용하여, 다수의 화학제로 처리한후 변현된 T7 DNA 폴리머라제를 스크리닝하였다. 3가지 반응에 의해 상기 효소를 변형된 형태로 전환시켰다. 첫번째 방법은 상술한 것처럼, 철과 환원제로 처리하는 것이다.
다른 두가지 방법은 빛 존재하에 광산화성 염료, Rose Bengal 및 메틸렌 블루로 상기 효소를 처리하는 것이다. 이 염료를 조심스럽게 적정하여야만 하는데 그 이유는 폴리머라제 활성에 비해 엑소뉴클레아제 활성을 불활성화 시키는 특이성이 철로 인한 산화의 경우 매우 높은데 비해, 상기 염료를 사용하는 경우 최적 조건하에서 일지라도 매우 낮기 때문이다. 이러한 염료들은 히스티딘 잔기를 변형시키는데 상당히 특이적이며, 따라서 이 결과로부터 엑소뉴클레아제 활성부위 내에 필수적인 요소로서 히스티딘 잔기가 내포되어 있어야 효과가 있음을 알 수 있다.
T7 유전자 5 단백질 내에는 23개의 히스티딘 잔기들이 있다. 이 잔기들중 8개가 상기 단백질어 아미노측에 위치하고 있는데, 이 영역은 큰 단편인 E.coli DNA 폴리머라제 Ⅰ과의 상동성에 입각해 볼때 엑소뉴클레아제 도메인이 위치된 부위로 추정되는 곳이다(Ollis et al Nature 313, 818, 1984).
이하에 제시하는 바와같이 상기 8개 히스티딘 잔기중 7개는 적합한 올리고 뉴클레오티드를 합성함으로써 개별적으로 돌연변이 시켰고, 그후 유전자 5에 도입시켰다. 이것은 표 1의 돌연변이체 1 및 6-10에 해당하는 것이다.
이 돌연변이체(변형체)들은 먼저 벡터 M 13 mp 18의 Sma Ⅰ 및 Hind Ⅲ 부위내로 pGP 5-3으로 부터 얻은 T7 유전자 5(Tabor et al., J. Biol. Chem 282, 1987)를 클로닝시켜 mGP5-2를 얻음으로써 작제되었다(상기 사용된 벡터와 유전자 5의 제공원은 본 방법에서 중요하지 않다).
데옥시티미딘 대신에 데옥시우라실을 도입하는 균주로 부터 단일가닥 mGP 5-2 DNA를 제조했다(Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488, 1985).
이러한 방법은 우라실을 포함하고 있는 가닥이 우선적으로 분해 되기 때문에, 와일드 타입의 E. coli내로 형질 감염되었을때 상기의 합성된 가닥(돌연변이를 포함하고 있는것)만 존재하도록 하는 강력한 선별력을 제공한다.
표준 방법으로, 길이가 15-20염기인 돌연변이체 올리고 뉴클레오티드를 합성했다. 각각의 올리고 뉴클레오티드를 템플레이트에 어닐링시키고, 천연 T7 DNA폴리머라제를 사용하여 신장시키고, T7 DNA 리가제를 사용하여 결찰시켰다.
공유결합에 의해 폐색된 원형 분자들을 아가로즈 겔 전기 영동으로 분리했다. 이 전기 영동은 0.5μ/㎖ 에티디늄 브로마이드 존재하에 실시되었다. 얻어진 정제 분자를 사용하여 E. coli 71.18을 형질 전환시켰다. 얻어진 플라크에서 DNA를 분리하고 관련영역을 서열결정하여 돌연변이를 확인했다.
다음은 유전자 5 엑소뉴클레아제 내에 유전학적 돌연변이체를 생성시키는데 사용되는 올리고 뉴클레오티드를 요약한 것이다. 형성된 돌연변이는 밑줄로서 표시하였다. 아미노산 및 염기쌍의 번호는 Dunn et al., 166 J. Molec., Biol. 477, 1983의 방법으로 실시한 것이다. 또한 돌연변이된 유전자 5부위의 관련된 와일드 타입의 서열을 제시하고 있다.
각 돌연변체 유전자 5단백질은 다음과 같이 상기 돌연변이체 파지를 K38/pGP 1-2내로 감염시킴으로서 생산되었다. 세포들을 30℃에서 A590=1.0으로 증식시켰다. 온도를 30분간 42℃로 올려 T7 RNA 폴리머라제를 유도했다. IPTG를 0.5mM으로 첨가하고 각 파지 용해물을 MOI=10으로 첨가했다. 감염시킨 세포를 37℃에서 90분간 증식시켰다. 세포들을 수거하고 추출물을 T7 유전자 5단백질에 대한 표준 방법으로 제조했다.
포스포셀룰로오즈 칼럼과 DEAE A-50 칼럼상에 상기 추출물을 통과시켜 부분적으로 정제하고 상술한 것처럼 폴리머라제와 엑소뉴클레아제 활성을 직접 측정하여 분석했다.
그 결과를 표 1에 수록했다.
[표 1]
T7 유전자 5돌연변이체의 엑소뉴클레아제 활성 및 폴리머라제의 활성
a. 엑소뉴클레아제 활성은 단일가닥 〔3H〕 T7 DNA 상에서 측정되었다.
100%엑소뉴클레아제 활성은 5,000 유니트 /mg에 해당한다.
b. 폴리머라제 활성은 단일가닥의 송아지 흉선 DNA를 사용해 측정했다.
100% 폴리머라제 활성은 8,000 유니트/mg에 해당한다.
테스트된 7개 히스티단중에서 하나(His 123 : 돌연 변이체 1)만이 변형된 T7 DNA 폴리머라제의 특징적인 효소 활성을 지니고 있다. 이 돌연변이체로 부터 T7 유전자 5단백질을 DEAE-셀룰로오스, 포스포셀룰로오스, DEAE-세파덱스 및 히드록실 아파타이트 크로마토그래피를 사용하여 정제했다. 폴리머라제 활성은 거의 정상(천연 효소의 90%이상의 레벨을 유지)에 가까운 반면 엑소뉴클레아제 활성은 4-10배 감소되었다.
이 돌연변이체의 한가지 변종으로, His 123과 Ser 122를 둘 모두 결실시킨 변종을 제작하였다. 이 돌연변이체로 부터 정제된 유전자 5단백질은 90%이상의 폴리머라제 활성을 유지하면서 엑소뉴클레아제 활성은 200-500배 정도 더 낮았다.
상기 자료로 부터 His 123이 T7 유전자 5단백질의 엑소뉴클레아제 도메인의 활성 부위내에 위치하고 있다는 것을 알 수 있다. 또한 His 123은 철, 산소 및 환원제를 포함하는 산화반응에 의해 변형되는 잔기이다. 이러한 사실은 상기와 같은 산화반응이 다른 단백질내의 히스티딘 잔기를 변형시키는 것이 관찰되었기 때문에 알 수 있다(Levine, J. Biol. Chem. 258 : 11823, 1983 ; and Hodgson et al Biochemistry 14 : 5294, 1975). 돌연변이체 11 내에 잔류하고 있는 엑소뉴클레아제 레벨은 화학적 변형방법으로 얻을 수 있는 레벨과 유사하다.
His 잔기에서의 돌연변이체가 제시되어 있기는 하나, 근접 부위 또는 더 먼 부위에서의 돌연변이체, 예를들면 lys 및 arg(변이체 4 및 15)를 돌연변이시켜 얻어진 돌연변이체에서도 본 발명에 적합한 돌연변이체 효소를 얻을 수 있다.
이와 유사하게 몇몇 His 잔기에서 실시한 돌연변이가 엑소뉴클레아제 활성에 거의 영향을 주지 않는다 하더라도, 반드시 이 잔기들 근처에서의 돌연변이가 엑소뉴클레아제 활성에 영향을 주지 못할 것이라는 의미는 아니다. 특히 유효한 돌연변이체는 예를들면 His-123 근처 영역에 있는 2개 또는 그 이상의 아미노산, 바람직하게는 6-8개의 아미노산들이 결실된 돌연변이체들을 포함한다. 다른 돌연변이를 실시하면 엑소뉴클레아제활성이 추가로 또는 완전히 감소된다.
이들 돌연변이체 균주를 사용하는 예는 이하에 예시한다. pGP 5-6(돌연변이 11)-함유 균주는 ATCC에 기탁되어 있다(이하 참조). 이 균주를 상술한 바와 같이 증식시키고 Tabor등 J. Biol. Chem, 262 16212(1987)에 제시된 대로 유도한다. K38/pTrx-2 세포들을 첨가하여, 유전학적으로 변형된 T7 DNA 폴리머라제의 수득률을 증가시킬수도 있다.
상기 기탁된 균주는 또는 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 플라스미드 pGP1-2를 포함하고 있다. 이 플라즈미는 Tabor등, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 1074, 1985에 기재되어 있으며, 1985년 3월 22일자로 기탁번호 제40,175호 ATCC에 기탁되었다.
제10도에 있어서, pGP 5-6은 다음의 분제들(segments)을 포함한다.
1. M13 mp10으로 부터 얻어진 EcoRI-sacI-SacI-BamHI 플리링커 서열(21 bp).
2. 하기 변형부위와 함께 T7 유전자 5를 포함하고 있는 T7 bp 14309-16747 ; T7 bp 14703이 A에서 G로 변환되어 있어 SmaI 부위를 형성하고 있다.
T7 bp 14304-14321까지를 결실시켰다(18 bp).
3. M13 mp10으로 부터 얻어진 SalI-PstI-Hind Ⅲ 플리링커 서열(15 bp).
4. pBR322 bp 29(Hind Ⅲ 부위)-pBR322 bpk 375(BamHI 부위).
5. 각 말단에 삽입된 BamHI 링커를 지니며, T7 RNA 폴리머라제 프로모터 ø10을 포함하고 있는 T7 bp 22855-T7 bp 22927(82 bp).
6. pBR 322 bp 375(BamHI 부위)-pBR 322 bp 4361(EcoRI부위).
[변형된 T7-타입 DNA 폴리머라제를 이용한 DNA 서열결정 방법]
변형된 T7-타입의 DNA 폴리머라제를 사용하여 DNA 합성반응을 실시하면, 몇개의 염기 내지 수천개의 염기길이를 갖으며, 일정한 방사능 강도를 갖는 사슬-종료 단편들이 얻어진다. 사슬 종료제가 결합되지 않은 부위(예를들면, 휴지부위(pause site)또는 이차구조 방해부위)에서 종료되는 경우는 거의 없다.
변형된 T7-타입의 DNA폴리머라제를 이용한 서열결정 방법은 펄스(pulse)와 체이스(chase)로 구성되어 있다. 펄스란 라벨된 짧은 DNA단편을 합성하는 것을 의미하고 ; 체이스란 사슬 종료제가 유입될 때까지 상기에서 얻어진 짧은 단편의 길이가 신장되는 것을 의미한다. 각 단계의 이론적 해석은 통상의 DNA 서열결정 반응과는 다르다. 펄스단계에서, 반응은 고농도의 3종류 뉴클레오드 트리포스페이트(예, dGTP, dCTP 및 dTTP)와 제한된 농도의 캐리어가 없는 나머지 일종의 뉴클레오티드 트리포스페이트, 예를들면 [35S]dATP 존재하에 0℃-37℃에서 0.5-4분간 항은 처리하여 실시한다. 이러한 조건하에서 변형된 폴리머라제는 자체의 진행 특성 (processive character)을 나타낼 수 없으며, 수개의 염기로 부터 수백개의 염기 크기를 갖는 일군의 방사능활성 단편들이 합성될 것이다.
이 펄스단계의 목적은 최소농도의 방사능 활성 뉴클레오티드를 사용하여, 각 프라이머에 최대 방사능을 도입시켜 방사능적으로 상기 프라이머를 라벨하고자 하는 것이다. 이 예에서, 펄스 반응의 두가지 조건은 (저온, 예를들면 0-20℃, 그리고 제한농도의 dATP, 예를들면 0.1μM 내지 1μM) 변형된 T7-타입의 DNA 폴리머라제가 자체의 진행 특성을 나타내지 못하게 한다. 상기 혼합물의 기타 필수적 환경 성분을 변환시켜 유사한 효과를 얻을 수 있는데, 즉 반응의 이온강도를 증가시키거나 또는 하나이상의 뉴클레오티드 트리포스페이트를 제한하는 방법이 있다. 프라이머가 이미 라벨되어 있다면 (키나싱(Kinasing)에 의해)펄스 단계는 필요치 않는다.
체이스 단계에서, 반응은 4종류의 모든 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 다량(50-500μM)과 4종류의 사슬 종료제중 하나, 예를들면 디데옥시 뉴클레오시드 트리포스페이트 같은 것이 제한량(1-50μM) 존재하는 상태에서, 1-30분간 45℃에서 항온 처리하는 것인데, 이때 DNA 합성은 평균 50-600 염기후에 종료된다. 체이스 단계의 목적은 진행성 DNA 합성 조건하에서 방사능적으로 라벨된 각각의 프라이머를 신장시키는 것이며, 이때 4종류의 디데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 각각을 사용하여, 별도로 4종류의 반응을 실시하는 경우 상기 신장 반응은 정확한 부위에서 종료된다. 체이스 단계의 두가지 조건인 고온(예를들면, 30-50℃) 및 4종류의 모든 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트가 다량(50μM이상)존재하는 것 때문에 변형된 T7-타입의 DNA폴리머라제는 수만개 염기동안 그의 진행 특성을 발휘할 수 있다 : 그러므로 동일 폴리머라제 분자는 디데옥시 뉴클레오티드가 도입될 때까지 프라이머-템플레이트로 부터 합성을 실시할 것이다. 45℃의 체이스 온도하에서, 합성은 일초당 700 뉴클레오티드 이상으로 발생된다. 그러므로 서열결정 반응에서 체이스 단계는 일초이하의 시간으로 완결된다. ssb는 dITP를 사용하거나 또는 저온 또는 높은 이온강도를 사용했을때, 또는 서열결정 반응전반에 걸쳐 트리포스페이트의 농도가 낮을때 진행성을 증가시킨다. [α35S] dATP, [α32P]dATP 또는 형광학적으로 라벨된 뉴클레오티드중 하나가 T7-타입의 변형 DNA 폴리머라제를 이용한 DNA 서열결정 반응에 사용될 수 있다.
만일 상기 형광 유사물이 이 프라이머의 5' 말단에 있다면, 펄스단계는 필요치 않다.
두가지 성분이 상기 합성 반응의 평균 신장율을 결정한다. 첫째는 펄스 반응의 지속 시간이다. 펄스단계는 사슬 종료제가 없는 상태에서 행해지기 때문에, 펄스 반응 시간이 길면 길수록 프라이머 신장정도는 길어진다. 0℃에서 폴리머라제 신장율은 평균 10 뉴클레오티드/초이다. 두번째는 체이스 반응에서 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 : 사슬 종료제의 비율이다. 변형된 T7-타입의 DNA 폴리머라제는 이러한 유사물이 도입되는 것을 식별하지 못하므로 체이스 단계에서 신장되는 평균길이는 체이스 반응물내에 존재하는 데옥시 뉴클레오시드 트리포스페이트 농도 : 사슬 종료제비의 4배이다. 그러므로, 신장되는 평균 크기를 짧게 하기 위해서 펄스 시간은 30초 정도로 짧게 하거나 및/또는 체이스 반응에서 사슬 종료제 : 데옥시 뉴클레오시드 트리포스페이트의 농도비를 상승시키도록 한다. 이것은 사슬 종료제 농도를 올리거나 또는 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 농도를 낮춤으로서 실시할 수 있다.
신장되는 평균 길이를 증가시키기 위해서는, 펄스시간을 3-4분으로 증가시키며, 및/또는 체이스 반응에서 사슬 종료제의 농도를 낮춘다(20μM-2μM).
[실시예 2 : 변형된 T7 DNA 폴리머라제를 사용한 DNA 서열결정 방법]
다음은 종료제로서 디데옥시 뉴클레오티드를 사용한 서열결정 반응의 예이다.
0.7mM농도에서 9㎕의 단일가닥 M13 DNA(mGP 1-2, 표준 방법으로 제조한 것)를 1㎕의 상보적 서열결정 프라이머(표준 유니버설(17-mer, 0.5pmole프라이머/㎕)및 2.5㎕의 5X어닐링 완충용액(200mM 트리스-HCL, pH 7.5, 50mM MgCl2)와 함께 혼합하고, 65℃에서 3분 동안 가열한 뒤 실온에서 30분 이상 서서히 냉각하였다. 펄스 반응에서, 상기 어닐링된 혼합물 12.5㎕를 1㎕의 디티오트레이톨 0.1M, 2㎕의 3 dNTPs (dGTP, dCTP, dTTP)각각 30mM(P.L Biochemicals, in TE). 2.5㎕ [α35S]dATP, (1500 Ci/mmol, New England Nuclear), 및 실시예(1)에서 기술된 변형된 T7 DNA폴리머라제 1㎕(0.4mg/㎖, 2500 유니트/㎖ 즉 0.4ug, 2.5유니트)와 혼합하고 0℃에서 2분간 항온 처리하고, 진탕후 마이크로 원심분리기에 넣고 1초간 원심분리했다.
항온처리시간은 30초-20분간으로 다향하며 온도는 0℃-37℃로 변화시킬 수 있다. 프라이머로 부터 멀리 떨어진 서열을 결정하는데는 긴 시간이 필요하다.
상기 펄스 반응물 4.5㎕를 45℃로 예열한 체이스 혼합물을 함유하고 있는 4개의 튜브 각각에 첨가했다. G, A, T, C로 표시된 4개의 튜브 각각은 디데옥시(dd)G, A, T또는 C(P-L바이오케미칼스)중 하나를 극미량 포함하고 있다.
특정 체이스 용액은 후술된다. 각 튜브는 1.5㎕ 5x 어닐링 완충용액(200mM트리스-HCl 7.5, 50mM(12)와 1.0㎕의 dATP 1mM, 0.5㎕의 ddNTP 100μM(여기서 ddNTP는 각 튜브중에 있는 ddG, A, T 또는 C에 해당한다)을 포함하고 있다. 각 체이스 반응은 45℃(또는 30℃-50℃)에서 10분간 항온 처리한 뒤, 6㎕의 종료 용액 (90% 포름 아미드, 10mM EDTA, 0.1% 크실렌 시아놀)을 각 튜브에 첨가하고, 이 튜브를 얼음에 넣는다. 체이스 시간은 1-30분으로 변화시킬 수 있다.
서열결정 반응은 7M 우레아중의 표준 6% 플리아크릴 아미드 서열결정용 겔상에서 6시간동안 30와트하에서 실행된다. 겔상에서 반응을 실시하기 전에 상기 반응물을 2분간 75℃로 가열한다. 상기 겔을 10% 아세트산, 10% 메탄올로 고정시키고, 겔 건조기에서 건조시킨 뒤 코닥 OM1 고명암 자동방사능 필름에 밤새도록 노출시킨다.
[실시예 3 : 제한 농도의 dNTPs를 사용한 DNA 서열결정 방법]
본 실시예에서 mGP01-2DNA 의 DNA 서열분석은 펄스 반응에서 데옥시리 보뉴클레오시드 트리포스페이트 4종류 모두를 제한농도로 사용하여 수행된다. 이 방법은 실시예(2)의 방법에 비해 많은 장점을 가지고 있다. 첫째, 펄스 반응이 완결되도록 실시한다. 그러나 이와는 반대로 실시예(2)의 방법에서는 경과시간을 차단할 필요가 있다. 결국 본 반응이 실행이 더 용이하다. 둘째, 펄스 반응에서 사슬신장 정도를 조절하는 것이 용이하므로 프라이머 근처에 있는 서열(처음 50염기)의 라벨링 효율이 약 10배 증가된다.
0.75mM의 단일가닥 M13 DNA(mGP1-2) 7㎕를 1㎕의 상보적인 서열결정용 프라이머(17-mer, 0.5pmole 프라이머/㎕)의 2㎕의 5X어닐링 완충용액(200mM 트리스-HCl pH 7.5, 50mM MgCl2, 250mM NaCl)를 혼합하고, 65℃에서 2분간 가열한 후, 실온으로 30분간 서서히 냉각시켰다. 펄스 반응에서, 상기 어닐링된 혼합물 10㎕를 1㎕ 디티오트레이톨 0.1M, 3종류의 dNTPs(dGTP, dCTP, dTTP)각 1.5μM짜리 2μL, 0.5㎕[α35S] dATP, (α10μM)(약 10μM 1500Ci/mmol, New England Nuclear)및 2㎕의 변형 T7 DNA 폴리머라제 (0.11mg/㎖, 1000유니트/㎖, 즉 0.2㎍, 2 유니트)와 혼합하고 37℃에서 5분간 항온 처리했다.
(항온 처리 온도와 시간은 각각 20℃-45℃와 1-60분에서 변화시킬 수 있다.)
상기 펄스 반응물 3.5㎕를 상기 체이스 혼합물을 함유하는 4개 튜브 각각에 첨가하고, 이것을 37℃로 예열시켰다. G, A, T, C로 표시한 4개의 튜브 각각에 미량의 디데옥시 G, A, T, C중 하나를 가했다. 특정 체이스 용액은 다음과 같다. 각 튜브는 0.5㎕의 5X 어닐링 완충용액(200mM 트리스 -HCL, pH 7.5, 50mM MgCl2, 250mM NaCl)1㎕의 4 dNTPs(dGTP, dATP, dTTP, dCTP) 각각 200μM 및 1.0㎕ ddNTP 20μM을 포함한다. 각 체이스 반응물을 37℃에서 5분간 항온 처리하고 (또는 각각 20-45℃, 1-60분), 4㎕의 정지용액(95% 포름 아미드, 20mM EDTA, 0.05% 크실렌-시아놀)을 각 튜브에 가하고, 이를 얼음위에 방치했다가, 상술한 바와 같이 표준 폴리아크릴아미드 서열결정용 겔상에서 런(run)시켰다.
[실시예 4 : DNA서열결정 방법에 dGTP를 dITP로 대체하여 사용하는 방법.]
DNA에서 압축영역(regions of compression), 즉 밀접 이차 구조를 갖고 있는 영역들을 경유해 서열결정을 실시하기 위해서는 dITP(Mills et al., 76 Proc. Natl. Acad. Sci. 2232, 1979) 또는 디아지구아노신 트리포스페이트(디아자(GTP, Mizusawa et al., 14Nuc. Acid Res. 1319, 1986)를 사용하는 것이 보편적이다.
본 발명자들은 상기 두가지 유사물이 T7-타입의 폴리머라제와 잘 적용하는데, 특히 ssb 존재하에 dITP와 함께 사용했을 때 더 바람직하다는 것을 발견했다. 이러한 반응들은 상술한 유전학적으로 변형된 T7 폴리머라제를 사용하여 실시하는 것이 바람직하며, 또는 체이스 반응을 1-2분간 및/ 또는 20℃에서 실시하여 엑소뉴클레아제 분해를 감소시킨다.
변형된 T7 DNA 폴리머라제는 dGTP 대신에 dITP 또는 디아자-GTP(deaza-GTP)를 효과적으로 이용한다. dITP는 dGTP대신에 사용되며, 통상 사용되는 dGTP농도의 2-5배되는 농도로 펄스 및 체이스 혼합물 모두에 사용할 수 있다.
ddG체이스 혼합물 내에는 ddGTP가 여전히 사용된다(ddITP는 사용하지 않는다).
dITP를 사용하는 체이스 반응은 잔류된 낮은 준위의 (약 0.01유니트) 엑소뉴클레아제 활성에도 민감하다. 이러한 문제를 제거하기 위해서 체이스 반응 시간은 dITP를 사용하는 경우 5분을 넘지 않아야 한다. dGTP를 사용하는 4개의 반응을 실시하지 않는 것 보다는, 이들 반응과 함께 4개의 dITP반응을 수행하는 것이 바람직하다. 만일 dGTP와 dITP를 모두 통상적으로 사용한다면, 필요한 혼합물의 수를 최소화 시킬 수 있다 : (1) 체이스 혼합물(chase mixes)들 중에서 dGTP와 dITP를 남겨둔다(이것은 4개의 체이스 혼합물이 dGTP 및 dITP 체이스 반응에 모두 사용되는 것을 의미한다) ; (2) 고농도의 dGTP 또는 dITP(각각 0.5mM 및 1-2.5mM, 각 2㎕)를 적합한 펄스 혼합물에 첨가한다. 두개의 펄스 혼합물 각각은 저농도의 dCTP, dTTP 및 [α35S]-dATP와 고농도의 dGTP 또는 dITP중 하나를 포함한다. 이러한 변형방법은 서열결정 반응의 질을 높이는데 역으로 영향을 끼치지 않으면서 dGTP와 dITP 둘 모두를 사용하여 반응을 실시하는데 필요한 펄스 및 체이스 혼합물의 수를 6개로 감소시킨다.
서열결정 반응은 실시예(3)처럼 실시되지만, 단 펄스 혼합물 중 2개는 a) dGTP의 경우 3가지 dNTP 함유-혼합물 : 1.5μM dCTP, dTTP, 1mM dGTP ; b) dITP의 경우 3종류 dNTP 함유-혼합물 : 1.5μM dCTP, dTTP, 3mM dGTP를 포함한다. 체이스 반응에서 dGTP를 체이스 혼합물로 부터 제거하며(예를들면, 체이스 혼합물들은 30μM dATP, dTTP 및 dCTP를 포함하며 4개의 디데옥시 뉴클레오티드 중 하나를 8μM으로 포함한다), dOTP를 사용하는 체이스 반응시간은 5분을 초과하지 않는다.
[기탁물]
균주 K38/pGP 5-5/pTrx-2, K38/pTrx-2및 M13 mGP 1-2가 ATCC에 1987년 1월 13일자로 기탁번호 제67,287호 ; 제67,286호 ; 제40,303호로 각각 기탁되었다. 균주 K38/pGP 1-2/pGP 5-6은 1987년 12월 4일 자로 ATCC에 기탁번호 제67,571호로 기탁되었다. 또한 상기 균주 K38/pGP 5-5/pTrx-2, K38/pTrx-2 및 M13 mGP 1-2와 K38/pGP 5-6은 1988년 5월 19일자로 한국종균협회(KFCC)에 제10611호, 제10610호, 제10608호 및 제 10609호로 각각 기탁 완료되었다.
출원인과 그 양수인은 특허 만료일전, 배양물에 대한 마지막 분양 요청이 있은지 5년후 또는 30년내에, 필요시 그 이상 기간동안 배양물이 죽는 경우 이를 재기탁 해야되며, 해당 특허등록시 즉, 공중에게 당해 기탁물이 입수 용이한 상태가 된 싯점에서는 해당 기탁기관은 이를 알릴 책임이 있다. 이러한 싯점까지, 상기 기탁물은 37 CFR section 1-14dhk 35 USC section 112 하에 특허청장에게서만 입수할 수 있다.
기타 구체예가 이하의 청구범위에 제시되어 있다.
본 발명의 변형된 DNA 폴리머라제의 진행성 및 결핍된 엑소뉴클레아제 활성을 이용하는 다른 응용 용도로는 게놈 DNA 서열을 직접 효소적으로 증폭시키는 방법이 있다. 이러한 방법은 다른 종류의 폴리머라제를 사용한 예가 제시되어 있다. (Saiki et al 230 Science 1350, 1985 ; and Scharf, 233 Science 1076, 1986).
제6도와 관련하여, 특정 DNA영역을 효소적으로 증폭시키는 방법은, 2개의 프라이머를 사용하는 방법으로, 목적부위내의 이중가닥 DNA 서열을 구성하고 있는 상반 가닥들에 이 2개의 프라이머를 어닐링 시키는 방법이 있으며, 이때 이 프라이머의 3'말단 방향으로 확장이 진행되도록 하는 단계를 포함한다(검은 화살표 참고). 실제 방법은 변성, 어닐링 및 DNA 합성으로 이루어진 싸이클을 수회(10-40, 바람직하게는 16-20)반복하는 것으로 구성된다.
이러한 방법을 이용하여 인간 게놈 DNA의 특정 부위를 200,000배 이상으로 증폭시키는 것이 가능하다. 결과적으로 특정 유전자 단편은 1/백만부가 아닌 약 1/5부를 나타낸다. 이로써 게놈 DNA의 클로닝과 직접 분석이 더욱 용이하게 된다. 진단 용도로 사용할 때는, 수주일 걸리던 분석이 1-2일 간으로 가속화 된다.
증폭과정이 200개의 염기를 가진 단편으로 제한되는 클레노우 단편과는 달리, 변형된 T7-타입 DNA폴리머라제는 수천개의 염기 길이를 갖는 DNA단편을 증폭시킬 수 있다(바람직하게는 단일가닥 DNA의 급속한 형성을 예방하기 위해 E. coli DNA 결합 단백질 또는 ssb와 함께).
변형된 T7 타입의 DNA 폴리머라제는 표준반응 혼합물에서 다음과 같은 목적에 적합하다 ; a) 제한요소 절단으로 형성된 DNA 단편의 5' 돌출 말단을 충진하는데 이용 ; 예를 들면 3' 돌출말단이 없는 단일가닥 영역을 갖고 있는 선형 DNA분자로 부터 블런트-말단형의 이중가닥 DNA를 얻기위해 사용 ; b) 제한단편의 3' 말단을 라벨링하거나, S1 뉴클레아제 분석에 의한 mRNA출발 부위를 서열지도(map)화 하기 위해, 또는 Maxam과 Gilbert의 화학 변형 방법을 사용하여 DNA를 서열 결정하는데 이용 ; 그리고 c) 실험관내에서 클론화된 DNA단편의 돌연변이를 유발시키는데 이용한다.
예를들면, 특정의 잘못 짝지워진 염기를 포함하고 있는 화학적으로 합성된 프라이머가 DNA 템플레이트에 하이브리드된 뒤 변형 T7-타입의 DNA폴리머라제에 의해 신장된다. 이러한 방식으로 돌연변이는 합성가닥내에 영구적으로 도입된다. 상기 폴리머라제는 상기 프로이머로 부터 전갈이의 DNA를 합성하는데 매우 유리하게 사용된다. 이것은 진행성 DNA폴리머라제를 사용하여 가장 효율적으로 실행된다. 대안적으로, DNA합성 과정중에 잘못된 도입(misincorporation)을 유발시켜 돌연변이를 유도할 수 있다. 이러한 응용 방법은 클론화된 DNA 단편의 특정 영역들을 돌연변이 시키는데 사용된다. 사용되는 효소는 엑소뉴클레아제 활성도가 부족한 것을 사용한다는 점이 중요하다. 표준 반응 혼합물이란 상기 폴리머라제 및 필요한 임의의 데옥시 뉴클레오시드 또는 다른 화합물을 함유하는 완충용액을 의미한다.
Claims (83)
- 서열결정 하고자 하는 DNA 분자에 하이브리할 수 있는 프라이머분자와 상기 DNA 분자를 어닐링(annealing)시키는 단계 ; 최소한 4개의 용기내에서 어닐링된 혼합물을 분할해 가하고 항온 처리하는 단계로서, 여기에서 각 용기는 4종류의 상이한 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트, 변형된 T7 타입 DNA폴리머라제 그리고 4종류의 DNA 합성종료제 중 한가지를 포함하고 있으며, 상기 폴리머라제는 DNA 서열결정 반응의 신장반응에 일반적으로 사용되는 환경조건에서 분리되기 전까지 적어도 500염기 동안은 상기 DNA 분자에 결합된 상태를 유지하며, 또한 이 폴리머라제는 폴리머라제 1mg당 500유니트 이하의 엑소뉴클레이아제 활성을 갖으며, 상기 합성 종료제는 특정 뉴클레오티드 염기에서 DNA 합성을 종료 시키는 것으로서 이들 합성 종료제 각각은 상이한 뉴클레오티드 염기에서 DNA 합성을 종료시키는 것을 특징으로 하는 단계;각각의 항온처리 반응에서 얻어진 DNA 생성물을 크기에 따라 분리하는 단계를 포함하는 상기 DNA 분자의 뉴클레오티드 염기서열 적어도 일부를 결정할 수 있는 것을 특징으로 하는 상기 DNA 분자의 뉴클레오티드 염기서열을 결정하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리머라제는 분리되기전에 적어도 500염기 동안은 상기 DNA 분자에 결합된 상태로 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리머라제는 분리되기전에 적어도 1,000염기 동안은 상기 DNA분자에 결합된 상태로 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리머라제는 T7-타입의 파지로 감염된 세포에서 얻어진 폴리머라제인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 T7-타입의 파지는 T7, T3, øI, øⅡ, H, W31, gh-1, Y, A1122 또는 SP6인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리머라제는 디데옥시 뉴클레오티드 유사물을 식별하지 못하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리머라제는 폴리머라제 1mg당 50유니트 이하의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 변형 폴리머라제인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기의 변형 폴리머라제는 폴리머라제 1mg당 1유니트 이하의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기의 변형 폴리머라제는 폴리머라제 1mg당 0.1유니트 이하의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리머라제는 그로부터 엑소뉴클레아제 활성이 검출되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리머라제는 10염기쌍 또는 그 이상의 프라이머를 이용할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법
- 제1항에 있어서 상기 폴리머라제는 4염기쌍 또는 그 이상의 프라이머를 이용할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머는 4-20염기쌍을 포함하며, 상기 폴리머라제는 4-20염기쌍의 프라이머를 이용할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 플라머라제는 뉴클레오티드 유사물을 식별하지 못하며, 폴리머라제 1mg당 500유니트 이하의 엑소뉴클레아제 활성을 지니며, 상기 프라이머는 4-10개의 염기를 포함하는 단일 가닥 RNA 또는 DNA이며, 상기 폴리머라제는 4-10개 염기의 프라이머를 이용할 수 있으며, 상기 항온처리 단계는 펄스 및 체이스 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머는 단일가닥 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 어닐링 단계는 단기 DNA 분자와 상기 프라이머를 65℃ 이상으로 가열한뒤, 이 가열된 혼합물을 0℃~30℃로 냉각시키는 것을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 항온처리 단계는 펄스 및 체이스 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 펄스 단계는 상기 어닐링된 혼합물을 4종류의 모든 데옥시 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 변형된 T7-타입 DNA폴리머라제와 혼합하는 것을 포함하며, 여기에서 적어도 하나의 상기 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트는 라벨되어 제한 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 펄스단계 항온처리는 30초 내지 20분간 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제18항에 있어서, 상기의 체이스 단계는 상기 펄스단계를 실시한 후 얻어진 혼합물을 4개의 샘플로 분할하고, 여기에 일종의 사슬 종료제를 첨가하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제20항에 있어서, 상기의 체이스 단계 항온 처리는 1내지 60분간 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 종료제는 디데옥시뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 종료제는 제한농도로 가해진 일종의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기한 일종의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트는 dITP 또는 데아자구아노신에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 프라이머는 상기 어닐링 단계 이전에 라벨된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 항온처리 단계는 체이스 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 프라이머는 형광적으로 라벨된 것을 특징으로 하는 방법.
- 단일 세포내에서, 비누출성(non-leaky) 프로모터 조절하에 T7-타입 DNA 폴리머라제를 암호하는 유전자를 위치시키고, 상기 세포가 대수 증식기에 있거나 또는 정지기에 있을때 상기 유전자의 발현을 유도하여, 상기 세포로부터 상기 폴리머라제를 분리하는 것으로 구성된 클론화된 분체로 부터 활성 T-7타입 DNA폴리머라제를 생산하는 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 유전자중 하나는, 발현을 위해 T7 RNA폴리머라제를 필요로 하는 프로모터의 조절하에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 폴리머라제는 두개의 클론화된 유전자로 부터 생산된 활성 T7 DNA폴리머라제이며, 상기 유전자중 하나는 발현을 위해 T7 RNA폴리머라제를 필요로 하는 프로모터의 조절하에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- T7 DNA폴리머라제를 발현시키는 벡터를 함유하고 있는 세포를 용해시키는 단계 및, 상기 폴리머라제를 사이징 컬럼, DE52 DEAE 칼럼, 포스포셀룰로오즈 칼럼 및 히이드록시 아파타이트 칼럼상에 통과시키는 단계를 포함하는, 상기 폴리머라제를 발현시키는 벡터를 포함하는 세포로 부터 상기 T7 DNA폴리머라제를 정제하는 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 통과 단계 이전에 암모늄 셀페이트로 상기 폴리머라제를 침전시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 폴리머라제를 세파덱스 DEAE A-50 칼럼상에 통과시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제31항에 있어서, 상기의 사이징 칼럼은 세파덱스 G150 칼럼인 것을 특징으로 하는 방법.
- 재조합 DNA 기법에 의해 생산된 변형된 77-타입 DNA폴리머라제 용액중의 엑소뉴클레아제 활성을 불활성화시키는 방법으로서, 산소, 환원제 및 전이금속을 포함하고 있는 용기내에서 상기 용액을 항온처리 하는 단계를 포함하는 엑소뉴클레아제 활성의 불활성화 방법.
- 변형된 T7-타입 DNA폴리머라제 및 (a) dITP와 (b) 사슬 종료제로 부터 선택된 서열 결정반응을 위해 필요한 반응제를 포함하는 DNA 서열 결정용 키트로서, 여기에서 상기 폴리머라제는 분리되기 전에 적어도 500염기 동안은 DNA 분자에 결합된 상태를 유지하며, 상기 폴리머라제 1mg당 500유니트 이하의 엑소뉴클레아제 활성을 지니며, DNA 서열결정 반응의 신장 반응 단계에 일반적으로 사용되는 환경조건에서 그 자체의 진행성을 나타낼 수 있는 것을 특징으로 하는 DNA 서열 결정용 키트.
- 제36항에 있어서, 상기 반응제는 dITP인 것을 특징으로 하는 키트.
- 천연적으로 발생하는 엑소뉴클레아제 활성의 활성도를 감소시키기 위해 유전학적으로 변형시킨, T7-타입 DNA 폴리머라제를 암호하는 유전자.
- 제38항의 유전자로 부터 생산된 T7-타입 DNA폴리머라제.
- 3' 말단이 이중가닥이며 3' 돌출 말단을 갖고 있지 않는, 단일가닥의 영역을 지닌 선형 DNA 분자로 부터 블런트 말단의 이중가닥 DNA를 제조하는 방법으로서, 천연적으로 발생한 엑소뉴클레아제 활성이 거의 없는 변형된 T7-타입 DNA폴리머라제와 상기 DNA 분자를 항온처리시키는 단계를 포함하는 방법.
- 이중가닥 DNA 서열의 서로 반대되는 가닥들에 일차 및 이차 프라이머(여기에서 이 프라이머들은 상기 DNA 서열의 서로 반대되는 가닥에 어닐링됨)를 어닐링시키는 단계 ; 및 폴리머라제 1mg당 500유니트 이하의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 변형된 T7 타입 DNA폴리머라제로 상기 어닐링된 혼합물을 항온처리하는 단계를 포함하는 DNA 서열의 증폭방법.
- 제41항에 있어서, 상기 일차 및 이차 프라이머는 어닐링된 후 서로에 대해 그들의 3' 말단을 향해 진행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제41항에 있어서, 상기 방법은 상기 항온처리단계후에 얻어진 DNA를 변성시키고, 이렇게 얻어진 DNA 상기 일차 및 이차 프라이머를 어닐링시키며, 이 어닐링된 혼합물을 상기 폴리머라제와 함께 항온처리시키는 단계를 또한 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 변성, 어닐링 및 항온처리로 이루어진 사이클이 10-40회 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제41항에 있어서, 상기 엑소뉴클레아제 활성은 폴리머라제 1mg당 1유니트 이하인 것을 특징을 하는 방법.
- 1mg당 500유니트 이하의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 변형된 T7-타입 DNA폴리머라제 및 라벨된 데옥시뉴클레오티드와 함께 DNA 단편을 항온처리 하는 것을 포함하는, 상기 DNA 단편의 3' 말단을 라벨하는 방법.
- 특정하게 잘못 짝지워진 염기를 갖는 프라이머와 템플레이트를 제공하고, 이 프라이머를 변형된 T7 타입 DNA 폴리머라제를 사용하여 신장시키는 것을 포함하는 클론화된 단편을 실험관내에서 돌연변이 시키는 방법.
- 콜론화된 DNA 단편을 제공하고, 폴리머라제 1mg당 1유니트 이하의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 변형된 T7-타입 DNA 폴리머라제를 사용하여 뉴클레오티드 염기의 잘못된 도입을 유발시키는 조건하에서 DNA 가닥을 합성하는 것을 포함하는 상기 클론화된 DNA 단편을 실험관내에서 돌연변이 시키는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 혼합물이 T7 유전자 2.5 또는 유전자 4자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 혼합물은 T7 유전자 2.5 또는 유전자 4를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제38항에 있어서, 변형된 His 잔기를 갖는 유전자.
- 제51항에 있어서, 상기 His 잔기는 T7 DNA 폴리머라제의 His-123인 유전자.
- 제51항에 있어서, 상기 His 잔기가 결실된 유전자.
- 제52 또는 53항의 유전자로 부터 생산된 T7-타입 DNA 폴리머라제.
- 제33항에 있어서, 아미노산 118-123이 T7 타입 DNA 폴리머라제를 암호하는 유전자로 부터 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 유전자.
- DNA 서열 결정에 적합한 25개 이상의 올리고머를 포함하며, 각 올리고머들은 별도의 용기중에 포함되어 있고, 15염기 이하의 상이한 염기 서열을 갖고 있는 것을 특징으로 하는 키트
- 제56항에 있어서, 상기 올리고머 각각은 6-9개의 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리머라제는 DNA 서열결정 반응의 펄스 반응에 일반적으로 사용되는 이차환경 조건에서 그 자체의 진행성을 나타내지 못하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 폴리머라제는 DNA 서열결정 반응의 펄스 반응에 일반적으로 사용되는 이차환경 조건에서 그 자체의 진행성을 나타내지 못하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제4항에 있어서, 상기 T7-타입 파아지는 T-7인 것을 특징으로 하는 방법.
- 서열결정하고자 하는 DNA 분자에 하이브리드화할 수 있는 라벨된 프라이머분자와 상기 DNA 분자를 어닐링(annealing)시키는 단계 ; 최소한 4개의 용기내에 상기 어닐링된 혼합물을 분할해 가하고 항온처리하는 단계로서, 여기에서 각 용기는 4종류의 상이한 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트, 리버스트랜스크립타제를 제외한 DNA폴리머라제, 그리고 특정 뉴클레오티드 염기에서 DNA 합성 반응을 종료시키는 사슬 종료제를 포함하고 있으며, 여기에서 각각의 상기 사슬 종료제는 상이한 뉴클레오티드 염기에서 DNA 합성을 종료시키며, 상기 항온처리 단계의 개시싯점에서 상기 모든 4종류의 데옥시 뉴클레오티드 트리포스페이트의 농도는 상기 사슬 종료제에 의해 DNA 합성 반응이 종료될때까지 DNA 합성 반응을 지속시키는데 충분한 정도로 존재하는 것을 특징으로 하는 단계 ; 및 각각의 항온처리반응에서 얻어진 DNA 생성물을 크기에 따라 분리하는 단계를 포함하는 상기 DNA 분자의 뉴클레오티드 염기서열 적어도 일부를 결정할 수 있는 것을 특징으로 하는 상기 DNA 분자의 뉴클레오티드 염기서열 결정 방법.
- 서열결정 하고자하는 DNA 분자에 하이브리드화할 수 있는 프라이머 분자와 상기 DNA 분자를 단일용기내에서 어닐링(annealing)시키는 단계 ; 4종류의 상이한 데옥시 뉴클레오시드 트리포스페이트를 함유하고 있는 단일 용기내에서, 상기 프라이머가 신장될 수 있는 조건하에, 리버스트랜스 크립타제를 제외한 DNA폴리머라제와 함께 상기 단계에서 얻어진 어닐링된 혼합물을 항온처리하는 단계로서, 여기에서 상기 데옥시 뉴클레오시드 트리포스페이트중 적어도 일종의 라벨되어 있는 단계, 얻어진 신장된 프라이머 혼합물을 최소한 4개의 용기중에 분할해 가하고 항온처리하는 단계로서, 여기서 각각의 용기는 4종류의 상이한 데옥시 뉴클레오시드 트리포스페이트, 그리고 특정 뉴클레오티드염기에서 DNA 합성을 종료시키는 사슬 종료제를 포함하고 있고, 각각의 상기 사슬종료제는 상이한 뉴클레오티드 염기에서 합성 반응을 종료시키며, 상기 데옥시 뉴클레오시드 트리포스페이트는 상기 사슬 종료제에 의해 DNA 합성 반응이 종료될때까지 DNA 합성을 지속시키기에 충분한 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 단계, 및 각각의 항온처리반응에서 얻어진 DNA 생성물을 크기에 따라 분리하는 단계를 포함하는 상기 DNA 분자의 뉴클레오티드 염기서열 적어도 일부를 결정할 수 있는 것을 특징으로 하는 DNA 분자의 뉴클레오티드 염기서열을 결정하는 방법.
- 서열결정 하고자하는 DNA 분자에 하이브리드화할 수 있는 프라이머 분자와 상기 DNA 분자를 어닐링(annealing)시키는 단계 ; 4종류의 상이한 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트, 리버스트랜스크립타제를 제외한 DNA 폴리머라제, 그리고 특정 뉴클레오티드 염기에서 DNA 합성반응을 종료시키는 사슬 종료제의 존재하에, 단계에서 얻어진 어닐링된 혼합물을 항온처리하는 단계로서, 상기 이 항온처리단계의 개시싯점에서 상기 모든 4종류의 데옥시클레오시드 트리포스페이트의 농도는 상기 사슬 종료제에 의해 DNA 합성반응이 종료될 때까지 DNA 합성 반응을 지속시키는데 충분한 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 단계, 및 상기 항온처리반응에서 얻어진 DNA 생성물을 크기에 따라 분리하는 단계를 포함하는 상기 DNA 분자의 뉴클레오티드 염기서열 적어도 일부를 결정할 수 있는 것을 특징으로 하는 상기 DNA 분자의 뉴클레오티드 염기서열을 결정하는 방법.
- 서열결정 하고자하는 DNA 분자에 하이브리드화할 수 있는 프라이머 분자와 상기 DNA 분자를 어닐링(annealing)시키는 단계 ; 4종류의 상이한 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 존재하에, 상기 프라이머가 신장될 수 있는 고건에서 상기 어닐링된 혼합물을 리버트랜스크립타제를 제외한 DNA폴리머라제로 항온처리하는 단계로서, 상기 데옥시 뉴클레오시드 트리포스페이트중 적어도 하나가 라벨되어 있는 단계, 신장된 프라이머 혼합물을 4종류의 상이한 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 존재하에 특정 뉴클레오티드 염기에서 DNA 합성을 종료시키는 사슬 종료제와 함께 항온처리하는 단계로서, 상기 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트는 상기 사슬 종료제에 의해 DNA 합성 반응이 종료될때까지 DNA 합성반응을 지속시키는데 충분한 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 단계, 및 각각의 항온처리 반응에서 얻어진 DNA 생성물을 크기에 따라 분리하는 단계를 포함하는 상기 DNA 분자의 뉴클레오티드 염기서열 적어도 일부를 결정할 수 있는 것을 특징으로 하는 상기 DNA 분자의 뉴클레오티드 염기서열을 결정하는 방법.
- 제61또는 62항에 있어서, 상기 DNA폴리머라제는 진행성 DNA폴리머라제인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제65항에 있어서, 상기 DNA폴리머라제는 T7-타입 DNA폴리머라제인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제66항에 있어서, 상기 T7-타입 DNA폴리머라제는 T7 DNA폴리머라제인것을 특징으로 하는 방법.
- 제61 또는 62항에 있어서, 상기 폴리머라제는 상기 DNA 분자의 뉴클레오티드 염기서열을 결정할 수 있을 정도로 충분히 낮은 엑소뉴클레아제 활성 레벨을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제68항에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제는 이 폴리머라제에 고유하게 결합되어 있는 엑소뉴클레아제 활성레벨의 10% 이하에 해당하는 엑소뉴클레아제 활성 레벨을 갖는 것을 특징으로 하는방법.
- 제69항에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제는 이 폴리머라제에 고유하게 결합되어 있는 엑소뉴클레아제 활성레벨의 1% 이하에 해당하는 엑소뉴클레아제 활성 레벨을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제65항에 있어서, 상기 DNA폴리머라제는 분리되기 전에 적어도 500 염기동안의 상기 DNA 분자에 결합된 상태를 유지하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제71항에 있어서, 상기 폴리머라제는 분리되기전에 적어도 1000 염기동안의 상기 DNA 분자에 결합된 상태를 유지하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제66항에 있어서, 상기 폴리머라제는 T7-타입 파아지로 감연된 세포내에 존재하는 것과 거의 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
- 제66항에 있어서, 상기 T7-타입파아지는 T7, T3, øI, øII, H, W31, gh-1, Y, A1122 또는 Sp6인 방법.
- 제61또는 62항에 있어서, 상기 폴리머라제는 디데옥시 뉴클레오티드 유사체를 식별하지 못하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제61 또는 62항에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제는 DNA폴리머라제 1mg당 500유니트 이하의 엑소뉴클레아제 활성을 갖고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제76항에 있어서, 상기 DNA폴리머라제는 DNA폴리머라제 1mg당 50유니트 이하의 엑소뉴클레아제 활성을 갖고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제77항에 있어서, 상기 DNA폴리머라제는 DNA폴리머라제 1mg당 1유니트 이하의 엑소뉴클레아제 활성을 갖고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제78항에 있어서, 상기 DNA폴리머라제는 그로부터 엑소뉴클레아제 활성을 검출할 수 없는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제61또는 62항에 있어서, 상기 DNA폴리머라제는 10염기쌍 또는 그 이상의 프라이머를 이용할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제80항에 있어서, 상기 폴리머라제는 4염기쌍 또는 그 이상의 프라이머를 이용할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제61 또는 62항에 있어서, 상기 종료제는 디데옥시뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제63항에 있어서, 상기 프라이머는 라벨인 것임을 특징으로 하는 방법.
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