JPH0746990A - Ｔ７ｄｎａポリメラーゼ - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 ＤＮＡ配列決定に適したＤＮＡポリメラーゼ
を提供する。 【構成】 修飾バクテリオファージＴ７型ＤＮＡポリメ
ラーゼをコードする、精製した修飾遺伝子であって、前
記のポリメラーゼは前記のＤＮＡポリメラーゼ活性のた
めに必要な任意の宿主因子と組合せたときにＤＮＡ配列
決定で用いるのに十分なＤＮＡポリメラーゼ活性を含
み、前記の修飾遺伝子を天然に存在するＤＮＡポリメラ
ーゼの天然に存在するエキソヌクレアーゼ活性を減じる
ために修飾する。
を提供する。 【構成】 修飾バクテリオファージＴ７型ＤＮＡポリメ
ラーゼをコードする、精製した修飾遺伝子であって、前
記のポリメラーゼは前記のＤＮＡポリメラーゼ活性のた
めに必要な任意の宿主因子と組合せたときにＤＮＡ配列
決定で用いるのに十分なＤＮＡポリメラーゼ活性を含
み、前記の修飾遺伝子を天然に存在するＤＮＡポリメラ
ーゼの天然に存在するエキソヌクレアーゼ活性を減じる
ために修飾する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＤＮＡ配列決定に適し
たＤＮＡポリメラーゼに関するものである。
たＤＮＡポリメラーゼに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡ配列決定は、１つの所定末端及び
１つの可変末端を有する一本鎖ＤＮＡ断片の４種の群の
生成を含む。可変末端は常に特定の所定ヌクレオチド塩
基（グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）若
しくはヒトシン（Ｃ）のいずれか）にて終端する。４群
の異なる断片はそれぞれ、その長さに基づき高分離能ポ
リアクリルアミドゲルで分離する。ゲル上の各バンド
は、ＤＮＡ配列における特定ヌクレオチドに共直線的に
対応し、したがって所定ヌクレオチド塩基の配列におけ
る位置と一致する。
１つの可変末端を有する一本鎖ＤＮＡ断片の４種の群の
生成を含む。可変末端は常に特定の所定ヌクレオチド塩
基（グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）若
しくはヒトシン（Ｃ）のいずれか）にて終端する。４群
の異なる断片はそれぞれ、その長さに基づき高分離能ポ
リアクリルアミドゲルで分離する。ゲル上の各バンド
は、ＤＮＡ配列における特定ヌクレオチドに共直線的に
対応し、したがって所定ヌクレオチド塩基の配列におけ
る位置と一致する。
【０００３】一般に、ＤＮＡ配列決定には２種の方法が
存在する。１つの方法（マクサム及びギルバートの配列
決定法）は単離したＤＮＡ断片の化学的分解を含み、各
断片をその所定末端にて単一の放射性ラベルで標識し、
４種の塩基（Ｇ、Ａ、Ｔ若しくはＣ）の各反応は１若し
くはそれ以上の特異的な限定的開裂を生じる。他の方法
（ジデオキシ配列決定法）はＤＮＡ鎖の酵素的合成を含
む。４種の別々の合成を行なうが、各反応は適当な連鎖
停止性ジデオキシヌクレオチドの取込みを介して特定の
塩基（Ｇ、Ａ、Ｔ若しくはＣ）で停止される。後者の方
法は、ＤＮＡ断片が均一に標識され（末端標識でな
く）、したがってＤＮＡ断片が大きい程漸増する多量の
放射能を有するので好適である。さらに、32Ｐ標識ヌク
レオチドの代りに35Ｓ標識ヌクレオチドを使用して一層
明確な解像力を生ずることができる。反応生成物は、各
レーンがＧ、Ａ、Ｔ若しくはＣのいずれかにのみ対応す
るので容易に判読することが出来る。大抵のジデオキシ
配列決定法に用いられる酵素は、大腸菌ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ大型断片（「クレノー」）である。用いられる他
のポリメラーゼはＡＭＶ逆転写酵素である。
存在する。１つの方法（マクサム及びギルバートの配列
決定法）は単離したＤＮＡ断片の化学的分解を含み、各
断片をその所定末端にて単一の放射性ラベルで標識し、
４種の塩基（Ｇ、Ａ、Ｔ若しくはＣ）の各反応は１若し
くはそれ以上の特異的な限定的開裂を生じる。他の方法
（ジデオキシ配列決定法）はＤＮＡ鎖の酵素的合成を含
む。４種の別々の合成を行なうが、各反応は適当な連鎖
停止性ジデオキシヌクレオチドの取込みを介して特定の
塩基（Ｇ、Ａ、Ｔ若しくはＣ）で停止される。後者の方
法は、ＤＮＡ断片が均一に標識され（末端標識でな
く）、したがってＤＮＡ断片が大きい程漸増する多量の
放射能を有するので好適である。さらに、32Ｐ標識ヌク
レオチドの代りに35Ｓ標識ヌクレオチドを使用して一層
明確な解像力を生ずることができる。反応生成物は、各
レーンがＧ、Ａ、Ｔ若しくはＣのいずれかにのみ対応す
るので容易に判読することが出来る。大抵のジデオキシ
配列決定法に用いられる酵素は、大腸菌ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ大型断片（「クレノー」）である。用いられる他
のポリメラーゼはＡＭＶ逆転写酵素である。
【０００４】
【発明の要点】一面において本発明はＤＮＡ分子のヌク
レオチド塩基配列の決定方法に関し、この方法は前記Ｄ
ＮＡ分子をこのＤＮＡ分子にハイブリダイズしうるプラ
イマー分子とアニールさせ、このアニールした混合物の
別々に分けたアリコートを少なくとも４個の容器でイン
キュベートし、各容器は４種の異なるデオキシヌクレオ
シド三リン酸とプロセッシブ（processive）ＤＮＡポリ
メラーゼ（このポリメラーゼは一般にＤＮＡ配列決定反
応の伸長反応で用いられる環境条件にて解離前に少なく
とも５００塩基にわたって前記ＤＮＡ分子に結合し続
け、前記ポリメラーゼはこのポリメラーゼ１ｍｇ当り５
００単位未満のエキソヌクレアーゼ活性しか有しない）
と特定ヌクレオチド塩基にてＤＮＡ合成を停止する４種
のＤＮＡ合成停止剤の１種とを含有する。この剤は、４
個の容器のそれぞれにて異なる特定のヌクレオチド塩基
で停止させる。インキュベーション反応のＤＮＡ生成物
を、ＤＮＡ分子のヌクレオチド塩基配列の少なくとも１
部を決定しうるようにその寸法に応じて分離する。
レオチド塩基配列の決定方法に関し、この方法は前記Ｄ
ＮＡ分子をこのＤＮＡ分子にハイブリダイズしうるプラ
イマー分子とアニールさせ、このアニールした混合物の
別々に分けたアリコートを少なくとも４個の容器でイン
キュベートし、各容器は４種の異なるデオキシヌクレオ
シド三リン酸とプロセッシブ（processive）ＤＮＡポリ
メラーゼ（このポリメラーゼは一般にＤＮＡ配列決定反
応の伸長反応で用いられる環境条件にて解離前に少なく
とも５００塩基にわたって前記ＤＮＡ分子に結合し続
け、前記ポリメラーゼはこのポリメラーゼ１ｍｇ当り５
００単位未満のエキソヌクレアーゼ活性しか有しない）
と特定ヌクレオチド塩基にてＤＮＡ合成を停止する４種
のＤＮＡ合成停止剤の１種とを含有する。この剤は、４
個の容器のそれぞれにて異なる特定のヌクレオチド塩基
で停止させる。インキュベーション反応のＤＮＡ生成物
を、ＤＮＡ分子のヌクレオチド塩基配列の少なくとも１
部を決定しうるようにその寸法に応じて分離する。
【０００５】好適具体例において、ポリメラーゼは解離
前に少なくとも１，０００塩基にわたってＤＮＡ分子に
結合し続ける；ポリメラーゼは、Ｔ７型ファージ［すな
わちＤＮＡポリメラーゼが宿主チオレドキシンをサブユ
ニットとして必要とするファージ、たとえばＴ７型ファ
ージはＴ７、Ｔ３、φＩ、φII、Ｈ、Ｗ３１、ｇｈ−
１、Ｙ、Ａ１１２２又はＳＰ６である、スツジエール、
バイコロジー、第９５巻、第７０頁、（１９７９）］に
感染した細胞におけるものと実質的に同じである；この
ポリメラーゼはジデオキシヌクレオチドアナログを区別
しない。このポリメラーゼはポリメラーゼ１ｍｇ当り５
０単位未満のエキソヌクレアーゼ活性を有するよう、よ
り好ましくは１単位未満、特に好ましくは０．１単位未
満のエキソヌクレアーゼ活性を有するように修飾され、
最も好ましくは検出しうるエキソヌクレアーゼ活性を持
たない；このポリメラーゼは１０塩基程度の短い、好ま
しくは４塩基程度の短いプライマーを利用することがで
きる；このプライマーは４〜４０ヌクレオチド塩基対を
含み、一本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡである。アニーリン
グ工程は、ＤＮＡ分子及びプライマーを６５℃以上、好
ましくは６５〜１００℃の温度まで加熱しかつ加熱混合
物を６５℃未満、好ましくは０〜３０℃の温度まで冷却
することからなっている；インキュベーション工程はパ
ルス及びチェース工程からなり、パルス工程はしたアニ
ール混合物を４種の異なるデオキシヌクレオシド三リン
酸の全部及びプロセッシブＤＮＡポリメラーゼと混合す
ることからなり、ここでデオキシヌクレオシド三リン酸
の少なくとも１種が標識されている。最も好ましくはポ
リメラーゼがそのプロセッシビティ（processivity）を
示さないような条件下でパルス工程を行ない、それは０
〜２０℃にて３０秒間〜２０分間であり、或いはヌクレ
オシド三リン酸の少なくとも１種を制限的とする。チェ
ース工程は、連鎖停止剤の１種をパルス工程後に混合物
の４種の別々のアリコートに添加することを含み、好ま
しくはチェース工程は３０〜５０℃で１〜６０分間行な
う。停止剤はジデオキシヌクレオチド又は制限レベルの
１種のデオキシヌクレオシド三リン酸である。４種のデ
オキシヌクレオチドの１種はｄＩＴＰ若しくはデアザグ
アノシンとする。パルス工程が必要とされないよう標識
プライマーが用いられ、好ましくは標識は放射性又は蛍
光性である。このポリメラーゼは、一般にＤＮＡ配列決
定反応のパルス反応に用いられる第２の環境条件下でそ
のプロセッシビティを示すことができない。
前に少なくとも１，０００塩基にわたってＤＮＡ分子に
結合し続ける；ポリメラーゼは、Ｔ７型ファージ［すな
わちＤＮＡポリメラーゼが宿主チオレドキシンをサブユ
ニットとして必要とするファージ、たとえばＴ７型ファ
ージはＴ７、Ｔ３、φＩ、φII、Ｈ、Ｗ３１、ｇｈ−
１、Ｙ、Ａ１１２２又はＳＰ６である、スツジエール、
バイコロジー、第９５巻、第７０頁、（１９７９）］に
感染した細胞におけるものと実質的に同じである；この
ポリメラーゼはジデオキシヌクレオチドアナログを区別
しない。このポリメラーゼはポリメラーゼ１ｍｇ当り５
０単位未満のエキソヌクレアーゼ活性を有するよう、よ
り好ましくは１単位未満、特に好ましくは０．１単位未
満のエキソヌクレアーゼ活性を有するように修飾され、
最も好ましくは検出しうるエキソヌクレアーゼ活性を持
たない；このポリメラーゼは１０塩基程度の短い、好ま
しくは４塩基程度の短いプライマーを利用することがで
きる；このプライマーは４〜４０ヌクレオチド塩基対を
含み、一本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡである。アニーリン
グ工程は、ＤＮＡ分子及びプライマーを６５℃以上、好
ましくは６５〜１００℃の温度まで加熱しかつ加熱混合
物を６５℃未満、好ましくは０〜３０℃の温度まで冷却
することからなっている；インキュベーション工程はパ
ルス及びチェース工程からなり、パルス工程はしたアニ
ール混合物を４種の異なるデオキシヌクレオシド三リン
酸の全部及びプロセッシブＤＮＡポリメラーゼと混合す
ることからなり、ここでデオキシヌクレオシド三リン酸
の少なくとも１種が標識されている。最も好ましくはポ
リメラーゼがそのプロセッシビティ（processivity）を
示さないような条件下でパルス工程を行ない、それは０
〜２０℃にて３０秒間〜２０分間であり、或いはヌクレ
オシド三リン酸の少なくとも１種を制限的とする。チェ
ース工程は、連鎖停止剤の１種をパルス工程後に混合物
の４種の別々のアリコートに添加することを含み、好ま
しくはチェース工程は３０〜５０℃で１〜６０分間行な
う。停止剤はジデオキシヌクレオチド又は制限レベルの
１種のデオキシヌクレオシド三リン酸である。４種のデ
オキシヌクレオチドの１種はｄＩＴＰ若しくはデアザグ
アノシンとする。パルス工程が必要とされないよう標識
プライマーが用いられ、好ましくは標識は放射性又は蛍
光性である。このポリメラーゼは、一般にＤＮＡ配列決
定反応のパルス反応に用いられる第２の環境条件下でそ
のプロセッシビティを示すことができない。
【０００６】他面において本発明は、（ａ）３’突出末
端を持たない線状ＤＮＡ分子から平滑末端二重鎖ＤＮＡ
分子を生成させる方法を特徴とし、その際エキソヌクレ
アーゼ活性を持たないプロセッシブＤＮＡポリメラーゼ
を使用し；（ｂ）ＤＮＡ配列の増幅方法を特徴とし、こ
の方法は第１及び第２のプライマーを二重鎖ＤＮＡ配列
の対向鎖にアニールさせると共にアニールした混合物を
ポリメラーゼ１ｍｇ当り５００単位未満、好ましくは１
単位未満のエキソヌクレアーゼ活性を有するプロセッシ
ブＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートすることを
含み、該第１及び第２のプライマーはＤＮＡ配列の対向
鎖にアニールし、好適的具体例においてこれらプライマ
ーはその３’末端を互いに向け合い、そして、この方法
はさらにこのインキュベーション工程の後で、得られた
ＤＮＡを変性させ、第１及び第２プライマーを得られた
ＤＮＡにアニールさせると共にアニール混合物をポリメ
ラーゼと共にインキュベートし、好ましくは変性、アニ
ーリング及びインキュベーションのサイクルを１０〜４
０回反復することを特徴とし；さらに（ｃ）クローン化
断片を供給しかつポリメラーゼ１ｍｇ当り１単位未満の
エキソヌクレアーゼ活性を有するプロセッシブＤＮＡポ
リメラーゼを用いてＤＮＡ鎖を合成するクローン化ＤＮ
Ａ断片のインビトロ突然変異法を特徴とし；また（ｄ）
同じ細胞における非リーク性プロモーター（下記参照）
の制御下にクローン化ＤＮＡ断片から活性Ｔ７型ＤＮＡ
ポリメラーゼを産生させる方法を特徴とし、その際細胞
が対数増殖期又は定常期にある時のみ遺伝子の発現を誘
発させると共にポリメラーゼを細胞から分離し、好まし
くはクローン化断片を発現にＴ７ＲＮＡポリメラーゼを
必要とするプロモーターの制御下に置き；さらに（ｅ）
天然に存在するエキソヌクレアーゼ活性を低下させるよ
う遺伝的に修飾したＴ７型ＤＮＡポリメラーゼをコード
する遺伝子を特徴とし、特に好ましくはヒスチジン（Ｈ
ｉｓ）残基が修飾され、遺伝子５のＨｉｓ−１２３の修
飾は一層好適であり；また（ｆ）遺伝的に修飾したポリ
メラーゼをコードする遺伝子の産物を特徴とし；さらに
（ｇ）ポリメラーゼを発現させるベクターを含む細胞か
らＴ７ＤＮＡポリメラーゼを精製する方法を特徴とし、
この方法は細胞を溶解しかつポリメラーゼをイオン交換
カラム、ＤＥ５２ ＤＥＡＥカラム、ホスホセルロース
カラム及びヒドロキシアパタイトカラムに通過させる工
程を含み、好ましくはこの通過工程前にポリメラーゼを
硫酸アンモニウムで沈澱させる工程を含み、さらにポリ
メラーゼをセファデックスＤＥＡＥ Ａ５０カラムに通
過させる工程を含み、またイオン交換カラムはＤＥ５２
ＤＥＡＥカラムであり；（ｈ）酸素と還元剤と遷移金
属とを含有する容器中でＤＮＡポリメラーゼ溶液をイン
キュベートすることからなるＤＮＡポリメラーゼ溶液に
おけるエキソヌクレアーゼ活性の失活方法をも包含し；
さらに（ｉ）上記に規定したようなポリメラーゼ１ｍｇ
当り５００単位未満のエキソヌクレアーゼ活性を有する
プロセッシブＤＮＡポリメラーゼからなるＤＮＡ配列決
定用のキットを特徴とし、ここでポリメラーゼは第１の
環境条件下でそのプロセッシビティを示すことができ、
好ましくは第２の環境条件下でそのプロセッシビティを
示すことができず、又配列決定に必要とされる試薬は連
鎖停止剤及びｄＩＴＰから選択され；（ｊ）ＤＮＡ断片
の３’末端を標識する方法をも包含し、この方法はポリ
メラーゼ１ｍｇ当り５００単位未満のエキソヌクレアー
ゼ活性を有するプロセッシブＤＮＡポリメラーゼ及び標
識デオキシヌクレオチドと共にＤＮＡ断片をインキュベ
ートすることを特徴とし；（ｋ）プライマーとテンプレ
ートとを供給し、このプライマーとテンプレートとが特
定の不適正塩基を有しかつプライマーをプロセッシブＤ
ＮＡポリメラーゼにより伸長させるクローン化ＤＮＡ断
片のインビトロ突然変異法を特徴とし；さらに（ｌ）ク
ローン化断片を供給すると共に５０単位未満のエキソヌ
クレアーゼ活性を有するプロセッシブＤＮＡポリメラー
ゼを用いてＤＮＡ鎖をヌクレオチド塩基の取込みミスを
生ぜしめる条件下で合成するクローン化ＤＮＡ断片のイ
ンビトロ突然変異法を特徴とする。
端を持たない線状ＤＮＡ分子から平滑末端二重鎖ＤＮＡ
分子を生成させる方法を特徴とし、その際エキソヌクレ
アーゼ活性を持たないプロセッシブＤＮＡポリメラーゼ
を使用し；（ｂ）ＤＮＡ配列の増幅方法を特徴とし、こ
の方法は第１及び第２のプライマーを二重鎖ＤＮＡ配列
の対向鎖にアニールさせると共にアニールした混合物を
ポリメラーゼ１ｍｇ当り５００単位未満、好ましくは１
単位未満のエキソヌクレアーゼ活性を有するプロセッシ
ブＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートすることを
含み、該第１及び第２のプライマーはＤＮＡ配列の対向
鎖にアニールし、好適的具体例においてこれらプライマ
ーはその３’末端を互いに向け合い、そして、この方法
はさらにこのインキュベーション工程の後で、得られた
ＤＮＡを変性させ、第１及び第２プライマーを得られた
ＤＮＡにアニールさせると共にアニール混合物をポリメ
ラーゼと共にインキュベートし、好ましくは変性、アニ
ーリング及びインキュベーションのサイクルを１０〜４
０回反復することを特徴とし；さらに（ｃ）クローン化
断片を供給しかつポリメラーゼ１ｍｇ当り１単位未満の
エキソヌクレアーゼ活性を有するプロセッシブＤＮＡポ
リメラーゼを用いてＤＮＡ鎖を合成するクローン化ＤＮ
Ａ断片のインビトロ突然変異法を特徴とし；また（ｄ）
同じ細胞における非リーク性プロモーター（下記参照）
の制御下にクローン化ＤＮＡ断片から活性Ｔ７型ＤＮＡ
ポリメラーゼを産生させる方法を特徴とし、その際細胞
が対数増殖期又は定常期にある時のみ遺伝子の発現を誘
発させると共にポリメラーゼを細胞から分離し、好まし
くはクローン化断片を発現にＴ７ＲＮＡポリメラーゼを
必要とするプロモーターの制御下に置き；さらに（ｅ）
天然に存在するエキソヌクレアーゼ活性を低下させるよ
う遺伝的に修飾したＴ７型ＤＮＡポリメラーゼをコード
する遺伝子を特徴とし、特に好ましくはヒスチジン（Ｈ
ｉｓ）残基が修飾され、遺伝子５のＨｉｓ−１２３の修
飾は一層好適であり；また（ｆ）遺伝的に修飾したポリ
メラーゼをコードする遺伝子の産物を特徴とし；さらに
（ｇ）ポリメラーゼを発現させるベクターを含む細胞か
らＴ７ＤＮＡポリメラーゼを精製する方法を特徴とし、
この方法は細胞を溶解しかつポリメラーゼをイオン交換
カラム、ＤＥ５２ ＤＥＡＥカラム、ホスホセルロース
カラム及びヒドロキシアパタイトカラムに通過させる工
程を含み、好ましくはこの通過工程前にポリメラーゼを
硫酸アンモニウムで沈澱させる工程を含み、さらにポリ
メラーゼをセファデックスＤＥＡＥ Ａ５０カラムに通
過させる工程を含み、またイオン交換カラムはＤＥ５２
ＤＥＡＥカラムであり；（ｈ）酸素と還元剤と遷移金
属とを含有する容器中でＤＮＡポリメラーゼ溶液をイン
キュベートすることからなるＤＮＡポリメラーゼ溶液に
おけるエキソヌクレアーゼ活性の失活方法をも包含し；
さらに（ｉ）上記に規定したようなポリメラーゼ１ｍｇ
当り５００単位未満のエキソヌクレアーゼ活性を有する
プロセッシブＤＮＡポリメラーゼからなるＤＮＡ配列決
定用のキットを特徴とし、ここでポリメラーゼは第１の
環境条件下でそのプロセッシビティを示すことができ、
好ましくは第２の環境条件下でそのプロセッシビティを
示すことができず、又配列決定に必要とされる試薬は連
鎖停止剤及びｄＩＴＰから選択され；（ｊ）ＤＮＡ断片
の３’末端を標識する方法をも包含し、この方法はポリ
メラーゼ１ｍｇ当り５００単位未満のエキソヌクレアー
ゼ活性を有するプロセッシブＤＮＡポリメラーゼ及び標
識デオキシヌクレオチドと共にＤＮＡ断片をインキュベ
ートすることを特徴とし；（ｋ）プライマーとテンプレ
ートとを供給し、このプライマーとテンプレートとが特
定の不適正塩基を有しかつプライマーをプロセッシブＤ
ＮＡポリメラーゼにより伸長させるクローン化ＤＮＡ断
片のインビトロ突然変異法を特徴とし；さらに（ｌ）ク
ローン化断片を供給すると共に５０単位未満のエキソヌ
クレアーゼ活性を有するプロセッシブＤＮＡポリメラー
ゼを用いてＤＮＡ鎖をヌクレオチド塩基の取込みミスを
生ぜしめる条件下で合成するクローン化ＤＮＡ断片のイ
ンビトロ突然変異法を特徴とする。
【０００７】本発明は、プロセッシブかつ非区別性であ
って短いプライマーを利用しうるＤＮＡポリメラーゼを
提供する。さらに、このポリメラーゼは関連エキソヌク
レアーゼ活性を持たない。これらは上記の方法に対し理
想的な性質であり、特にＤＮＡ配列決定反応には理想的
な性質である。何故なら、ポリアクリルアミドゲルにお
ける放射能のバックグランドレベルがごく僅かであり、
殆んど又は全くアーティファクトのバンドが存在せず、
かつバンドが明確であってＤＮＡ配列の読取りを容易に
するからである。さらに、この種のポリメラーゼは、以
下詳細に説明するように、長いＤＮＡ配列の新規な配列
決定法を可能にする。
って短いプライマーを利用しうるＤＮＡポリメラーゼを
提供する。さらに、このポリメラーゼは関連エキソヌク
レアーゼ活性を持たない。これらは上記の方法に対し理
想的な性質であり、特にＤＮＡ配列決定反応には理想的
な性質である。何故なら、ポリアクリルアミドゲルにお
ける放射能のバックグランドレベルがごく僅かであり、
殆んど又は全くアーティファクトのバンドが存在せず、
かつバンドが明確であってＤＮＡ配列の読取りを容易に
するからである。さらに、この種のポリメラーゼは、以
下詳細に説明するように、長いＤＮＡ配列の新規な配列
決定法を可能にする。
【０００８】本発明の他の特徴及び利点は、その好適実
施例を参照して以下の記載から明らかとなるであろう。
施例を参照して以下の記載から明らかとなるであろう。
【０００９】
【好適具体例の説明】ＤＮＡポリメラーゼ 一般に、本発明のＤＮＡポリメラーゼはプロセッシブで
あり、関連するエキソヌクレアーゼ活性を持たず、ヌク
レオチドアナログの取込みに対し非区別性であり、かつ
特定プライマーとして小型オリゴヌクレオチド（たとえ
ばテトラマー、ヘキサマー及びオクタマー）を利用する
ことができる。これらの性質を以下詳細に説明する。
あり、関連するエキソヌクレアーゼ活性を持たず、ヌク
レオチドアナログの取込みに対し非区別性であり、かつ
特定プライマーとして小型オリゴヌクレオチド（たとえ
ばテトラマー、ヘキサマー及びオクタマー）を利用する
ことができる。これらの性質を以下詳細に説明する。
【００１０】プロセッシビティ プロセッシビティという用語は、ＤＮＡポリメラーゼが
一般にＤＮＡ配列決定の伸長反応に用いられる条件下で
テンプレートから解離することなく同じプライマー−テ
ンプレートを用いて多くのヌクレオチドを連続取込みし
うることを意味する。プロセッシビティの程度は異なる
ポリメラーゼに応じて変化する。或る種のものは解離前
に数個の塩基のみを取込む［たとえばクレノー（約１５
塩基）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（約１０塩基）、Ｔ５
ＤＮＡポリメラーゼ（約１８０塩基）及び逆転写酵素
（約２００塩基）］［ダス等、ジャーナル・バイオロジ
カル、ケミストリー、第２５４巻、第１２２７頁（１９
７９）；バンバラ等、ジャーナル・バイオロジカル、ケ
ミストリー、第２５３巻、第４１３頁（１９７８）］
が、他方、たとえば本発明におけるもの等は、適する環
境条件下で少なくとも５００塩基、好ましくは少なくと
も１，０００塩基にわたって結合し続ける。この種の環
境条件は４種のデオキシヌクレオシド三リン酸の全ての
充分な供給及び１０〜５０℃のインキュベーション温度
を含む。プロセッシビティは大腸菌の一本鎖結合性（ｓ
ｓｂ）蛋白質の存在下で著しく増大する。
一般にＤＮＡ配列決定の伸長反応に用いられる条件下で
テンプレートから解離することなく同じプライマー−テ
ンプレートを用いて多くのヌクレオチドを連続取込みし
うることを意味する。プロセッシビティの程度は異なる
ポリメラーゼに応じて変化する。或る種のものは解離前
に数個の塩基のみを取込む［たとえばクレノー（約１５
塩基）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（約１０塩基）、Ｔ５
ＤＮＡポリメラーゼ（約１８０塩基）及び逆転写酵素
（約２００塩基）］［ダス等、ジャーナル・バイオロジ
カル、ケミストリー、第２５４巻、第１２２７頁（１９
７９）；バンバラ等、ジャーナル・バイオロジカル、ケ
ミストリー、第２５３巻、第４１３頁（１９７８）］
が、他方、たとえば本発明におけるもの等は、適する環
境条件下で少なくとも５００塩基、好ましくは少なくと
も１，０００塩基にわたって結合し続ける。この種の環
境条件は４種のデオキシヌクレオシド三リン酸の全ての
充分な供給及び１０〜５０℃のインキュベーション温度
を含む。プロセッシビティは大腸菌の一本鎖結合性（ｓ
ｓｂ）蛋白質の存在下で著しく増大する。
【００１１】プロセッシブ酵素により、配列決定反応の
停止はたとえばジデオキシヌクレオチドのような連鎖停
止剤を取込んだ塩基においてのみ生ずる。ＤＮＡポリメ
ラーゼが非プロセッシブであれば、配列決定反応の際に
アーティファクトのバンドがポリメラーゼの解離したヌ
クレオチドに対応する位置で生ずる。しばしば解離は不
正確な位置におけるバンドのバックグランドを形成し、
真のＤＮＡ配列を不明瞭にする。この問題は、高濃度の
基質と共に反応混合物を長時間（３０〜６０分間）イン
キュベートすることにより部分的に修正され、ゲルの頂
部の高分子量までのアーティファクトのバンドをＤＮＡ
配列を読取る領域から「追放」する。これは、非プロセ
ッシブＤＮＡポリメラーゼがコンパクトな二次構造、す
なわちヘアピンの領域でテンプレートから解離する高い
確率を有するので理想的な解決策でない。これらの部位
におけるプライマー伸長の再開始は非効率的であり、か
つ通常の結果は４種の全ヌクレオチドにつき同じ位置に
バンドを形成し、したがってＤＮＡ配列を不明瞭にす
る。
停止はたとえばジデオキシヌクレオチドのような連鎖停
止剤を取込んだ塩基においてのみ生ずる。ＤＮＡポリメ
ラーゼが非プロセッシブであれば、配列決定反応の際に
アーティファクトのバンドがポリメラーゼの解離したヌ
クレオチドに対応する位置で生ずる。しばしば解離は不
正確な位置におけるバンドのバックグランドを形成し、
真のＤＮＡ配列を不明瞭にする。この問題は、高濃度の
基質と共に反応混合物を長時間（３０〜６０分間）イン
キュベートすることにより部分的に修正され、ゲルの頂
部の高分子量までのアーティファクトのバンドをＤＮＡ
配列を読取る領域から「追放」する。これは、非プロセ
ッシブＤＮＡポリメラーゼがコンパクトな二次構造、す
なわちヘアピンの領域でテンプレートから解離する高い
確率を有するので理想的な解決策でない。これらの部位
におけるプライマー伸長の再開始は非効率的であり、か
つ通常の結果は４種の全ヌクレオチドにつき同じ位置に
バンドを形成し、したがってＤＮＡ配列を不明瞭にす
る。
【００１２】アナログの区別 本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ジデオキシヌクレオチ
ドアナログと通常のヌクレオチドとを顕著には区別しな
い。すなわち、アナログの取込みのチャンスは正常なヌ
クレオチドにおけるとほぼ同じであるか、或いは少なく
とも正常なヌクレオチドの１／１０の効率でアナログを
取込む。本発明のポリメラーゼはさらに、或る種の他の
アナログをも有意には区別しない。これは、４種の正常
なデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＧＴＰ、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ）の他に配列決定反応が他の
種類のヌクレオチド誘導体、たとえば放射能標識された
又は蛍光標識されたヌクレオシド三リン酸の取込みを一
般に35Ｓ、32Ｐなどの化学薬品での合成鎖の標識につき
必要とするので重要である。ＤＮＡポリメラーゼがアナ
ログを区別しない場合、正常なヌクレオチドに対すると
同じ確率がアナログの取込みについても存在する。標識
ヌクレオシド三リン酸について、最少量の放射能を用い
て合成ＤＮＡ鎖を効率的に標識するにはこのことが重要
である。さらに、この種の酵素は、低レベルのアナログ
しか必要とせず、区別性の酵素を用いるよりも配列決定
反応を安価にする。
ドアナログと通常のヌクレオチドとを顕著には区別しな
い。すなわち、アナログの取込みのチャンスは正常なヌ
クレオチドにおけるとほぼ同じであるか、或いは少なく
とも正常なヌクレオチドの１／１０の効率でアナログを
取込む。本発明のポリメラーゼはさらに、或る種の他の
アナログをも有意には区別しない。これは、４種の正常
なデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＧＴＰ、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ）の他に配列決定反応が他の
種類のヌクレオチド誘導体、たとえば放射能標識された
又は蛍光標識されたヌクレオシド三リン酸の取込みを一
般に35Ｓ、32Ｐなどの化学薬品での合成鎖の標識につき
必要とするので重要である。ＤＮＡポリメラーゼがアナ
ログを区別しない場合、正常なヌクレオチドに対すると
同じ確率がアナログの取込みについても存在する。標識
ヌクレオシド三リン酸について、最少量の放射能を用い
て合成ＤＮＡ鎖を効率的に標識するにはこのことが重要
である。さらに、この種の酵素は、低レベルのアナログ
しか必要とせず、区別性の酵素を用いるよりも配列決定
反応を安価にする。
【００１３】区別性ポリメラーゼは、これらがプロセッ
シブ様式にて重合反応を行なう場合と、二次構造障害の
ために合成が妨げられて停滞する場合とで、異なる程度
の区別を示す。この種の障害に際し、ゲル上の異なる放
射性バンドに強度の変化が生じて配列を不明瞭にする。
シブ様式にて重合反応を行なう場合と、二次構造障害の
ために合成が妨げられて停滞する場合とで、異なる程度
の区別を示す。この種の障害に際し、ゲル上の異なる放
射性バンドに強度の変化が生じて配列を不明瞭にする。
【００１４】エキソヌクレアーゼ活性 本発明のＤＮＡポリメラーゼは、正常な又は天然に存在
するレベルのエキソヌクレアーゼ活性（ポリメラーゼ１
分子当りの活性の量）の５０％未満、好ましくは１％未
満、特に好ましくは０．１％未満を有する。正常又は天
然に存在するレベルという用語は、未修飾Ｔ７型ポリメ
ラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を意味する。一般に、
関連活性はチェース等［ジャーナル・バイオロジカル・
ケミストリー、第２４９巻、第４５４５頁（１９７
４）］の修飾法により下記するように測定してポリメラ
ーゼ１ｍｇ当り約５，０００単位のエキソヌクレアーゼ
活性である。エキソヌクレアーゼは、新たに合成されテ
ンプレートに対し不正確に塩基対となった塩基を切断す
ることにより、ＤＮＡ合成の信頼性を増大させる。この
種の関連エキソヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡ配列決定反
応の質に悪影響がある。これらは、反応に加えねばなら
ないヌクレオチド先駆体の最小必要濃度を増大させる。
何故なら、ヌクレオチド濃度が低下すると、ポリメラー
ゼ活性がエキソヌクレアーゼ活性に匹敵する速度まで低
下して正味のＤＮＡ合成を与えず、或いは合成ＤＮＡの
分解さえ生ぜしめるからである。
するレベルのエキソヌクレアーゼ活性（ポリメラーゼ１
分子当りの活性の量）の５０％未満、好ましくは１％未
満、特に好ましくは０．１％未満を有する。正常又は天
然に存在するレベルという用語は、未修飾Ｔ７型ポリメ
ラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を意味する。一般に、
関連活性はチェース等［ジャーナル・バイオロジカル・
ケミストリー、第２４９巻、第４５４５頁（１９７
４）］の修飾法により下記するように測定してポリメラ
ーゼ１ｍｇ当り約５，０００単位のエキソヌクレアーゼ
活性である。エキソヌクレアーゼは、新たに合成されテ
ンプレートに対し不正確に塩基対となった塩基を切断す
ることにより、ＤＮＡ合成の信頼性を増大させる。この
種の関連エキソヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡ配列決定反
応の質に悪影響がある。これらは、反応に加えねばなら
ないヌクレオチド先駆体の最小必要濃度を増大させる。
何故なら、ヌクレオチド濃度が低下すると、ポリメラー
ゼ活性がエキソヌクレアーゼ活性に匹敵する速度まで低
下して正味のＤＮＡ合成を与えず、或いは合成ＤＮＡの
分解さえ生ぜしめるからである。
【００１５】より重要なことに、関連エキソヌクレアー
ゼ活性は、二次構造障害を有するテンプレート中の領域
でＤＮＡポリメラーゼを停滞（idle）させる。ポリメラ
ーゼがこのような構造に達すると通過しにくくなるの
で、その合成速度は次第に低下する。関連エキソヌクレ
アーゼは、新たに合成されたＤＮＡをポリメラーゼが停
滞した際に切断する。その結果、多くの合成及び切断の
サイクルが生ずる。これは、ヘアピンを通過して最終的
にポリメラーゼの合成をもたらし（配列決定反応の質に
悪影響を及ぼさない）、或いはポリメラーゼが合成鎖か
ら解離して４種の配列決定反応の全てにおいて同じ位置
にアーティファクトのバンドをもたらし、或いは連鎖停
止剤が高頻度で取込まれて配列決定用ゲルにおける異な
る断片の強度変化を大きくする。これは、任意所定部位
における連鎖停止剤の取込み頻度がポリメラーゼにより
連鎖停止性ヌクレオチドを取込まれねばならないチャン
スの回数と共に増大し、したがってＤＮＡポリメラーゼ
が停滞部位において他の部位におけるよりもずっと高い
頻度で連鎖停止剤を取込むために生ずる。
ゼ活性は、二次構造障害を有するテンプレート中の領域
でＤＮＡポリメラーゼを停滞（idle）させる。ポリメラ
ーゼがこのような構造に達すると通過しにくくなるの
で、その合成速度は次第に低下する。関連エキソヌクレ
アーゼは、新たに合成されたＤＮＡをポリメラーゼが停
滞した際に切断する。その結果、多くの合成及び切断の
サイクルが生ずる。これは、ヘアピンを通過して最終的
にポリメラーゼの合成をもたらし（配列決定反応の質に
悪影響を及ぼさない）、或いはポリメラーゼが合成鎖か
ら解離して４種の配列決定反応の全てにおいて同じ位置
にアーティファクトのバンドをもたらし、或いは連鎖停
止剤が高頻度で取込まれて配列決定用ゲルにおける異な
る断片の強度変化を大きくする。これは、任意所定部位
における連鎖停止剤の取込み頻度がポリメラーゼにより
連鎖停止性ヌクレオチドを取込まれねばならないチャン
スの回数と共に増大し、したがってＤＮＡポリメラーゼ
が停滞部位において他の部位におけるよりもずっと高い
頻度で連鎖停止剤を取込むために生ずる。
【００１６】理想的な配列決定反応は、ゲル全体に均一
な強度のバンドをもたらす。これは、各放射性断片に対
しＸ線フィルムを最適に露出するのに必須である。種々
異なる強度の放射性バンドが存在すれば、より希薄なバ
ンドは未検出となるチャンスを有する。全断片につき均
一な放射性強度を得るには、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮ
Ａ上の各位置にて同じ時間間隔を費して、任意所定部位
におけるヌクレオチドの付加若しくは除去に対する選択
性を示さないことが必要である。これはＤＮＡポリメラ
ーゼが関連エキソヌクレアーゼを欠損するならば生じ、
テンプレートに沿った各位置において、連鎖停止性ヌク
レオチドを取込む一の機会のみを有することになる。
な強度のバンドをもたらす。これは、各放射性断片に対
しＸ線フィルムを最適に露出するのに必須である。種々
異なる強度の放射性バンドが存在すれば、より希薄なバ
ンドは未検出となるチャンスを有する。全断片につき均
一な放射性強度を得るには、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮ
Ａ上の各位置にて同じ時間間隔を費して、任意所定部位
におけるヌクレオチドの付加若しくは除去に対する選択
性を示さないことが必要である。これはＤＮＡポリメラ
ーゼが関連エキソヌクレアーゼを欠損するならば生じ、
テンプレートに沿った各位置において、連鎖停止性ヌク
レオチドを取込む一の機会のみを有することになる。
【００１７】短プライマー 本発明のＤＮＡポリメラーゼは、１０塩基若しくはそれ
以下のプライマー、並びにそれより長いプライマー、特
に好ましくは４〜２０塩基のプライマーを利用すること
ができる。短プライマーを利用する能力は、ＤＮＡ配列
決定に対し多くの重要な利点を与える。短プライマー
は、通常の１５〜２０量体のプライマーよりも安価かつ
合成容易である。さらに、これらはＤＮＡテンプレート
における相補部位に対しより迅速にアニールする結果、
配列決定反応をより迅速にする。さらに、小型（たとえ
ば６個若しくは７個の塩基）のオリゴヌクレオチドプラ
イマーをＤＮＡ配列決定用に利用しうる能力は、そうで
なければ出来ないような長いＤＮＡ断片を配列決定する
計画をも可能にする。たとえば８０個のランダムヘキサ
マーを含有するキットを形成することができ、そのいず
れもクローン化用ベクターにおける全ゆる部位に対し相
補的でない。統計上、８０ヘキサマー配列の１つは、配
列決定すべきＤＮＡ断片に沿って平均５０個の塩基当り
存在する。３，０００塩基の配列の決定は、５回の配列
決定サイクルのみを必要とする。最初に、挿入体の一端
部における約６００塩基を配列決定するには、「ユニバ
ーサル」プライマー（たとえばニューイングランド・バ
イオラブ社、Ｎｏ．１２１１、配列５’ＧＴＡＡＡＡＣ
ＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ ３’）が使用される。この配列
決定反応の結果を用いて、決定された配列の末端近くの
領域に相同な新たなプライマーをキットから釣上げる。
第二サイクルにおいて、次の６００塩基の配列をこのプ
ライマーを用いて決定する。この工程を５回反復して、
サブクローン化の必要なしにかつ新たなオリゴヌクレオ
チドプライマーの化学合成を要せずに、３，０００塩基
の完全配列を決定することができる。このような短プラ
イマーの使用は、配列決定反応にＴ７の遺伝子２．５及
び４蛋白質を含ませることにより向上させることができ
る。
以下のプライマー、並びにそれより長いプライマー、特
に好ましくは４〜２０塩基のプライマーを利用すること
ができる。短プライマーを利用する能力は、ＤＮＡ配列
決定に対し多くの重要な利点を与える。短プライマー
は、通常の１５〜２０量体のプライマーよりも安価かつ
合成容易である。さらに、これらはＤＮＡテンプレート
における相補部位に対しより迅速にアニールする結果、
配列決定反応をより迅速にする。さらに、小型（たとえ
ば６個若しくは７個の塩基）のオリゴヌクレオチドプラ
イマーをＤＮＡ配列決定用に利用しうる能力は、そうで
なければ出来ないような長いＤＮＡ断片を配列決定する
計画をも可能にする。たとえば８０個のランダムヘキサ
マーを含有するキットを形成することができ、そのいず
れもクローン化用ベクターにおける全ゆる部位に対し相
補的でない。統計上、８０ヘキサマー配列の１つは、配
列決定すべきＤＮＡ断片に沿って平均５０個の塩基当り
存在する。３，０００塩基の配列の決定は、５回の配列
決定サイクルのみを必要とする。最初に、挿入体の一端
部における約６００塩基を配列決定するには、「ユニバ
ーサル」プライマー（たとえばニューイングランド・バ
イオラブ社、Ｎｏ．１２１１、配列５’ＧＴＡＡＡＡＣ
ＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ ３’）が使用される。この配列
決定反応の結果を用いて、決定された配列の末端近くの
領域に相同な新たなプライマーをキットから釣上げる。
第二サイクルにおいて、次の６００塩基の配列をこのプ
ライマーを用いて決定する。この工程を５回反復して、
サブクローン化の必要なしにかつ新たなオリゴヌクレオ
チドプライマーの化学合成を要せずに、３，０００塩基
の完全配列を決定することができる。このような短プラ
イマーの使用は、配列決定反応にＴ７の遺伝子２．５及
び４蛋白質を含ませることにより向上させることができ
る。
【００１８】本発明のＤＮＡポリメラーゼ（すなわち上
記性質を有するもの）は、修飾Ｔ７型ポリメラーゼを包
含する。すなわち、このＤＮＡポリメラーゼはサブユニ
ットとして宿主チオレドキシンを必要とし、かつ修飾Ｔ
７ＤＮＡポリメラーゼ或いはたとえばＴ３、φＩ、φI
I、Ｈ、Ｗ３１、ｇｈ−１、Ｙ、Ａ１１２２及びＳＰ６
のような関連ファージから分離された同等の酵素と実質
的に同一である。これら酵素のそれぞれは、修飾Ｔ７酵
素の性質と同様な性質を有するよう修飾することができ
る。ファージ感染した細胞から酵素を直接に分離するこ
ともできるが、好ましくは酵素はこれを過剰産生する細
胞から分離される。実質的に同一という用語は、酵素が
この酵素の全体的性質に影響しないようなアミノ酸の置
換を有することを意味する。特に望ましいアミノ酸置換
の１例は、天然酵素を修飾して全てのエキソヌクレアー
ゼ活性を除去したものである。この修飾は、遺伝子レベ
ル又は化学レベルで行なうことができる（下記参照）。
記性質を有するもの）は、修飾Ｔ７型ポリメラーゼを包
含する。すなわち、このＤＮＡポリメラーゼはサブユニ
ットとして宿主チオレドキシンを必要とし、かつ修飾Ｔ
７ＤＮＡポリメラーゼ或いはたとえばＴ３、φＩ、φI
I、Ｈ、Ｗ３１、ｇｈ−１、Ｙ、Ａ１１２２及びＳＰ６
のような関連ファージから分離された同等の酵素と実質
的に同一である。これら酵素のそれぞれは、修飾Ｔ７酵
素の性質と同様な性質を有するよう修飾することができ
る。ファージ感染した細胞から酵素を直接に分離するこ
ともできるが、好ましくは酵素はこれを過剰産生する細
胞から分離される。実質的に同一という用語は、酵素が
この酵素の全体的性質に影響しないようなアミノ酸の置
換を有することを意味する。特に望ましいアミノ酸置換
の１例は、天然酵素を修飾して全てのエキソヌクレアー
ゼ活性を除去したものである。この修飾は、遺伝子レベ
ル又は化学レベルで行なうことができる（下記参照）。
【００１９】Ｔ７ポリメラーゼのクローニング 本発明の１例として、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼのクロー
ン化、過剰産生、精製、修飾及び使用につき説明する。
このプロセッシブ酵素は、１：１の化学量論にて緊密に
複合化した２つのポリペプチドよりなっている。一方は
８４，０００ダルトンのファージＴ７にコードされた遺
伝子５蛋白質であり［モドリッチ等、ジャーナル・バイ
オロジカル・ケミストリー、第１５０巻、第５５１５頁
（１９７５）］、他方は１２，０００ダルトンの大腸菌
にコードされたチオレドキシンである［タバー等、ジャ
ーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６２巻、
第１６頁、第２１６頁（１９８７）］。チオレドキシン
は修飾蛋白質であって、遺伝子５蛋白質（非プロセッシ
ブな実際のＤＮＡポリメラーゼ）をプライマーテンプレ
ートに結合させる。天然ＤＮＡポリメラーゼは、これに
結合した極めて活性な３’→５’エキソヌクレアーゼを
有する。この活性はＤＮＡ配列決定に対しポリメラーゼ
を無効にするので、ポリメラーゼを使用する前に失活さ
せ又は修飾せねばならない。これは下記するように、化
学的に、エキソヌクレアーゼ領域の局部酸化により或い
は遺伝学的に、この活性をコードするポリメラーゼ遺伝
子のコード領域を修飾することにより容易に行なわれ
る。
ン化、過剰産生、精製、修飾及び使用につき説明する。
このプロセッシブ酵素は、１：１の化学量論にて緊密に
複合化した２つのポリペプチドよりなっている。一方は
８４，０００ダルトンのファージＴ７にコードされた遺
伝子５蛋白質であり［モドリッチ等、ジャーナル・バイ
オロジカル・ケミストリー、第１５０巻、第５５１５頁
（１９７５）］、他方は１２，０００ダルトンの大腸菌
にコードされたチオレドキシンである［タバー等、ジャ
ーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６２巻、
第１６頁、第２１６頁（１９８７）］。チオレドキシン
は修飾蛋白質であって、遺伝子５蛋白質（非プロセッシ
ブな実際のＤＮＡポリメラーゼ）をプライマーテンプレ
ートに結合させる。天然ＤＮＡポリメラーゼは、これに
結合した極めて活性な３’→５’エキソヌクレアーゼを
有する。この活性はＤＮＡ配列決定に対しポリメラーゼ
を無効にするので、ポリメラーゼを使用する前に失活さ
せ又は修飾せねばならない。これは下記するように、化
学的に、エキソヌクレアーゼ領域の局部酸化により或い
は遺伝学的に、この活性をコードするポリメラーゼ遺伝
子のコード領域を修飾することにより容易に行なわれ
る。
【００２０】ｐＴｒｘ−２ 大腸菌のｔｒｘＡ（チオレドキシン）遺伝子をクローン
化するには、野生型大腸菌ＤＮＡをＳａｕ３Ａによって
部分切断しかつこれら断片を菌株Ｔ７ ＳＴ９から分離
されたＢａｍＨＩ−切断Ｔ７ＤＮＡに結合させる［タバ
ー等、「チオレドキシン及びグルタルレドキシン系：構
造及び機能」、ホルムグレン等編、第２８５〜３００
頁、ラーベンプレス社、ＮＹ；並びにタバー等、（上
記）］。結合したＤＮＡを大腸菌ｔｒｘＡ- 細胞にトラ
ンスフェクトし、この混合物をｔｒｘＡ- 細胞上にプレ
ートし、そして得られたＴ７プラークを釣上げる。Ｔ７
は活性大腸菌ｔｒｘＡ遺伝子なしには増殖しえないの
で、ｔｒｘＡ遺伝子を含有するようなファージのみがプ
ラークを形成する。クローン化したｔｒｘＡ遺伝子は４
７０塩基対のＨｉｎｃII断片に位置した。
化するには、野生型大腸菌ＤＮＡをＳａｕ３Ａによって
部分切断しかつこれら断片を菌株Ｔ７ ＳＴ９から分離
されたＢａｍＨＩ−切断Ｔ７ＤＮＡに結合させる［タバ
ー等、「チオレドキシン及びグルタルレドキシン系：構
造及び機能」、ホルムグレン等編、第２８５〜３００
頁、ラーベンプレス社、ＮＹ；並びにタバー等、（上
記）］。結合したＤＮＡを大腸菌ｔｒｘＡ- 細胞にトラ
ンスフェクトし、この混合物をｔｒｘＡ- 細胞上にプレ
ートし、そして得られたＴ７プラークを釣上げる。Ｔ７
は活性大腸菌ｔｒｘＡ遺伝子なしには増殖しえないの
で、ｔｒｘＡ遺伝子を含有するようなファージのみがプ
ラークを形成する。クローン化したｔｒｘＡ遺伝子は４
７０塩基対のＨｉｎｃII断片に位置した。
【００２１】チオレドキシンを過剰産生させるため、プ
ラスミドｐＴｒｘ−２を同様に作成した。要するに、ｔ
ｒｘＡ遺伝子を含有する４７０塩基対のＨｉｎｃII断片
を標準法［マニアチス等、クローン化：ラボラトリー・
マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー研究所、
コールド・スプリング・ハーバー、Ｎ．Ｙ．］によって
分離し、かつＰｔａｃプロモーター［ｐｔａｃ−１２、
アマン等、ジーン、第２５巻、第１６７頁（１９８
３）］を含有するｐＢＲ３２２の誘導体に結合させた。
第１図を参照して、β−ラクタマーゼ及びＣｏｌ Ｅ１
オリジンを含有するｐｔａｃ−１２をＰｖｕIIで切断し
て２２９０ｂｐの断片を生成させ、次いでこれを市販の
リンカー（ＳｍａＩ−ＢａｍＨＩポリリンカー）を用い
てｔｒｘＡの２個の直列コピー（ＨｉｎｃII断片）に結
合させてｐＴｒｘ−２を生成させた。ｐＴｒｘ−２の完
全ヌクレオチド配列を第７図に示す。チオレドキシン産
生はこの場合ｔａｃプロモーターの制御下にあり、した
がってたとえばＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガ
ラクトシド）によって特異的に誘発することができる。
ラスミドｐＴｒｘ−２を同様に作成した。要するに、ｔ
ｒｘＡ遺伝子を含有する４７０塩基対のＨｉｎｃII断片
を標準法［マニアチス等、クローン化：ラボラトリー・
マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー研究所、
コールド・スプリング・ハーバー、Ｎ．Ｙ．］によって
分離し、かつＰｔａｃプロモーター［ｐｔａｃ−１２、
アマン等、ジーン、第２５巻、第１６７頁（１９８
３）］を含有するｐＢＲ３２２の誘導体に結合させた。
第１図を参照して、β−ラクタマーゼ及びＣｏｌ Ｅ１
オリジンを含有するｐｔａｃ−１２をＰｖｕIIで切断し
て２２９０ｂｐの断片を生成させ、次いでこれを市販の
リンカー（ＳｍａＩ−ＢａｍＨＩポリリンカー）を用い
てｔｒｘＡの２個の直列コピー（ＨｉｎｃII断片）に結
合させてｐＴｒｘ−２を生成させた。ｐＴｒｘ−２の完
全ヌクレオチド配列を第７図に示す。チオレドキシン産
生はこの場合ｔａｃプロモーターの制御下にあり、した
がってたとえばＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガ
ラクトシド）によって特異的に誘発することができる。
【００２２】ｐＧＰ５−５及びｍＧＰ１−２ Ｔ７の或る種の遺伝子生成物は、大腸菌で発現させると
致死的になる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの誘発性発現に
基づき、致死的遺伝子のクローン化及び発現を容易化さ
せるべく発現系を開発した。遺伝子５蛋白質は或る種の
大腸菌菌株において致死的であり、かつこの種の系の例
はタバー等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ
ー・サイエンス、第８２巻、第１０７４頁（１９８５）
に記載されており、ここでＴ７遺伝子５はφ１０プロモ
ーターの制御下に置かれかつＴ７ＲＮＡポリメラーゼが
細胞内に存在する場合のみ発現される。
致死的になる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの誘発性発現に
基づき、致死的遺伝子のクローン化及び発現を容易化さ
せるべく発現系を開発した。遺伝子５蛋白質は或る種の
大腸菌菌株において致死的であり、かつこの種の系の例
はタバー等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ
ー・サイエンス、第８２巻、第１０７４頁（１９８５）
に記載されており、ここでＴ７遺伝子５はφ１０プロモ
ーターの制御下に置かれかつＴ７ＲＮＡポリメラーゼが
細胞内に存在する場合のみ発現される。
【００２３】要するに、ｐＧＰ５−５（第３図）を合成
ＢａｍＨＩリンカーを用いる標準法により作成して遺伝
子５を有する１４３０６（ＮｄｅＩ）から１６８６９
（ＡｈａIII ）に至るＴ７断片を、Ｔ７ＲＮＡポリメラ
ーゼによって区別されるφ１．１Ａ及び１．１Ｂの両方
のプロモーターを含有する５６６７（ＨｉｎｃII）から
６１６６（Ｆｎｕ４ＨＩ）に至るＴ７の５６０ｂｐ断片
及びｐＡＣＹＣ１７７の３ｋｂ ＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｃ
II断片に結合させた［チャング等、ジャーナル・バクテ
リオロジー、第１３４巻、第１１４１頁（１９７
８）］。Ｔ７挿入体及びリンカーのヌクレオチド配列を
第８図に示す。このプラスミッドにおいて、遺伝子５は
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが菌体内に供給された際のみ発
現される。
ＢａｍＨＩリンカーを用いる標準法により作成して遺伝
子５を有する１４３０６（ＮｄｅＩ）から１６８６９
（ＡｈａIII ）に至るＴ７断片を、Ｔ７ＲＮＡポリメラ
ーゼによって区別されるφ１．１Ａ及び１．１Ｂの両方
のプロモーターを含有する５６６７（ＨｉｎｃII）から
６１６６（Ｆｎｕ４ＨＩ）に至るＴ７の５６０ｂｐ断片
及びｐＡＣＹＣ１７７の３ｋｂ ＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｃ
II断片に結合させた［チャング等、ジャーナル・バクテ
リオロジー、第１３４巻、第１１４１頁（１９７
８）］。Ｔ７挿入体及びリンカーのヌクレオチド配列を
第８図に示す。このプラスミッドにおいて、遺伝子５は
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが菌体内に供給された際のみ発
現される。
【００２４】第２図を参照して、Ｔ７ＲＮＡポリメラー
ゼはファージベクターｍＧＰ１−２に形成される。これ
はｐＧＰ１−２［タバー等、上記］と同様であるが、た
だしＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含有する３１３３（Ｈａ
ｅIII ）から５８４０（ＨｉｎｆI ）に至るＴ７の断片
がリンカー（ＢｇｌII及びＳａｌＩのそれぞれ）により
ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ切断されたＭ１３ ｍｐ８に結合
され、ポリメラーゼ遺伝子はｌａｃプロモーターの制御
下にある。ｍＧＰ１−２の完全ヌクレオチド配列を第９
図に示す。
ゼはファージベクターｍＧＰ１−２に形成される。これ
はｐＧＰ１−２［タバー等、上記］と同様であるが、た
だしＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含有する３１３３（Ｈａ
ｅIII ）から５８４０（ＨｉｎｆI ）に至るＴ７の断片
がリンカー（ＢｇｌII及びＳａｌＩのそれぞれ）により
ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ切断されたＭ１３ ｍｐ８に結合
され、ポリメラーゼ遺伝子はｌａｃプロモーターの制御
下にある。ｍＧＰ１−２の完全ヌクレオチド配列を第９
図に示す。
【００２５】ｐＧＰ５−５及びｐＴｒｘ−２は異なる複
製オリジン（それぞれＰ１５Ａ及びＣｏｌＥ１オリジ
ン）を有するので、これらは同時に１つの菌体に形質転
換することができる。ｐＴｒｘ−２は多量のチオレドキ
シンをＩＰＴＧの存在下に発現する。ｍＧＰ１−２はこ
れら２種のプラスミッドと同じ菌体内に共存することが
でき、これを使用して単にたとえばＩＰＴＧによりｌａ
ｃプロモーターを誘発させてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを
産生させることによりｐＧＰ５−５からのＴ７−ＤＮＡ
ポリメラーゼの発現を制御することができる。
製オリジン（それぞれＰ１５Ａ及びＣｏｌＥ１オリジ
ン）を有するので、これらは同時に１つの菌体に形質転
換することができる。ｐＴｒｘ−２は多量のチオレドキ
シンをＩＰＴＧの存在下に発現する。ｍＧＰ１−２はこ
れら２種のプラスミッドと同じ菌体内に共存することが
でき、これを使用して単にたとえばＩＰＴＧによりｌａ
ｃプロモーターを誘発させてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを
産生させることによりｐＧＰ５−５からのＴ７−ＤＮＡ
ポリメラーゼの発現を制御することができる。
【００２６】Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼの過剰産生 ｔｒｘ Ａ及び遺伝子５の２種の遺伝子生成物を過剰産生
させかつ再構成するには幾つかの有力な方法が存在す
る。これら全ての方法には同じ菌株及びプラスミッドを
利用することができる。好適方法においては、２種の遺
伝子を同じ菌体内に同時発現させる（これはチオレドキ
シンが結合するまで遺伝子５がプロテアーゼに対し感受
性であるからである）。下記に詳細に説明するように、
１つの方法は２種の遺伝子を同じ菌体における２つの適
合プラスミッドのそれぞれに別々に載せることである。
或いは、２種の遺伝子を同じプラスミッドに対し直列に
載せることもできる。Ｔ７−遺伝子５はたとえばＴ７の
φ１．１Ａ、φ１．１Ｂ及びφ１０のような非リーク性
の誘発性プロモーターの制御下に置かれることが重要で
ある。何故なら、少量の２種のポリペプチドの合成でさ
え大抵の大腸菌細胞において毒性であるからである。非
リーク性という用語は、遺伝子の発現を制御するプロモ
ーターが活性化されないと、５００分子未満の遺伝子生
成物しか菌体生成時間当りに遺伝子から生成されないこ
とを意味する。好ましくは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの
発現系が用いられるが、誘発性プロモーターを利用する
他の発現系も用いることができる。リーク性プロモータ
ー（たとえばｐｌａｃ）は誘発されなくても５００分子
より多くの蛋白質を合成することができ、したがってこ
の種のプロモーターの制御下で致死的遺伝子を有する菌
体の増殖は貧弱でありかつ本発明に適していない。勿
論、菌体が致死的でない場合にはこれら生成物を菌体内
に産生させることができ、たとえばｐｌａｃプロモータ
ーがこの種の菌体に適している。
させかつ再構成するには幾つかの有力な方法が存在す
る。これら全ての方法には同じ菌株及びプラスミッドを
利用することができる。好適方法においては、２種の遺
伝子を同じ菌体内に同時発現させる（これはチオレドキ
シンが結合するまで遺伝子５がプロテアーゼに対し感受
性であるからである）。下記に詳細に説明するように、
１つの方法は２種の遺伝子を同じ菌体における２つの適
合プラスミッドのそれぞれに別々に載せることである。
或いは、２種の遺伝子を同じプラスミッドに対し直列に
載せることもできる。Ｔ７−遺伝子５はたとえばＴ７の
φ１．１Ａ、φ１．１Ｂ及びφ１０のような非リーク性
の誘発性プロモーターの制御下に置かれることが重要で
ある。何故なら、少量の２種のポリペプチドの合成でさ
え大抵の大腸菌細胞において毒性であるからである。非
リーク性という用語は、遺伝子の発現を制御するプロモ
ーターが活性化されないと、５００分子未満の遺伝子生
成物しか菌体生成時間当りに遺伝子から生成されないこ
とを意味する。好ましくは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの
発現系が用いられるが、誘発性プロモーターを利用する
他の発現系も用いることができる。リーク性プロモータ
ー（たとえばｐｌａｃ）は誘発されなくても５００分子
より多くの蛋白質を合成することができ、したがってこ
の種のプロモーターの制御下で致死的遺伝子を有する菌
体の増殖は貧弱でありかつ本発明に適していない。勿
論、菌体が致死的でない場合にはこれら生成物を菌体内
に産生させることができ、たとえばｐｌａｃプロモータ
ーがこの種の菌体に適している。
【００２７】第２の方法において、各遺伝子は別々にク
ローン化しかつ過剰発現させることができる。この方法
を用いて、個別に過剰産生されたポリペプチドを含有す
る菌体を合せた後に抽出物を作成し、この時点で２種の
ポリペプチドは活性Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼを形成す
る。
ローン化しかつ過剰発現させることができる。この方法
を用いて、個別に過剰産生されたポリペプチドを含有す
る菌体を合せた後に抽出物を作成し、この時点で２種の
ポリペプチドは活性Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼを形成す
る。
【００２８】例１：Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼの産生 イー・コリ菌株７１．１８［メッシング等、プロシーデ
ィング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、第７４
巻、第３６４２頁（１９７７）］を用いて、ｍＧＰ１−
２の保存物を作成した。大腸菌７１．１８を５０％グリ
セリン中に−８０℃で貯蔵し、かつ標準最小寒天培地プ
レートに塗抹した。単一のコロニーを２５ｍｌの標準Ｍ
９培地にて３７℃で１晩増殖させ、かつ新たに作成した
７１．１８菌体を用いて保存物を力価測定することによ
りｍＧＰ１−２の単一プラークを得た。このプラークを
用いて、ＪＭ１０３を含有する１０ｍｌの２ｘＬＢ（２
％バクト−トリプトン、１％酵母抽出物、０．５％Ｎａ
Ｃｌ、８ｍＭ ＮａＯＨ）に接種し、Ａ590 ＝０．５ま
で増殖させた。この培養物は、ｍＧＰ１−２の多量培養
物を作成するためのファージ保存物を与えた。３〜１２
時間後、１０ｍｌの培養物を遠心分離し、かつ上澄液を
用いて多量（２Ｌ）培養物に接種した。多量培養物につ
き、４×５００ｍｌの２ｘＬＢに対しＭ９で増殖させた
４×５ｍｌの７１．１８菌体を接種し、かつ３７℃で振
とうした。菌体の多量培養物をＡ590＝１．０まで増殖
させた後（約３時間）、これらにｍＧＰ１−２の出発溶
菌物を含有する１０ｍｌの上澄液を接種した。次いで、
接種した菌体を３７℃で１晩増殖させた。翌日遠心分離
して菌体を除去しかつ上澄液を直ちに使用してＫ３８／
ｐＧＰ５−５／ｐＴｒｘ−２を誘発させた（下記参
照）。上澄液を４℃にて約６か月間にわたり力価〜５×
１０11φ／ｍｌで貯蔵することができた。この力価にお
いて、１リットルのファージを１２リットルの菌体にＡ
590 ＝５で接種し、１５倍の接種倍率とした。力価が低
ければ、ｍＧＰ１−２ファージを上澄液から濃縮するこ
とができ、その際ＮａＣｌ（６０ｇ／ｌ）及びＰＥＧ−
６０００（６５ｇ／ｌ）を上澄液に溶解させ、混合物を
０℃にて１〜７２時間沈降させ、次いで遠心分離するこ
とができる（７０００ｒｐｍにて２０分間）。ｍＧＰ１
−２ファージを含有する沈澱物を、初期容積の１／２０
のＭ９培地に再懸濁させた。
ィング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、第７４
巻、第３６４２頁（１９７７）］を用いて、ｍＧＰ１−
２の保存物を作成した。大腸菌７１．１８を５０％グリ
セリン中に−８０℃で貯蔵し、かつ標準最小寒天培地プ
レートに塗抹した。単一のコロニーを２５ｍｌの標準Ｍ
９培地にて３７℃で１晩増殖させ、かつ新たに作成した
７１．１８菌体を用いて保存物を力価測定することによ
りｍＧＰ１−２の単一プラークを得た。このプラークを
用いて、ＪＭ１０３を含有する１０ｍｌの２ｘＬＢ（２
％バクト−トリプトン、１％酵母抽出物、０．５％Ｎａ
Ｃｌ、８ｍＭ ＮａＯＨ）に接種し、Ａ590 ＝０．５ま
で増殖させた。この培養物は、ｍＧＰ１−２の多量培養
物を作成するためのファージ保存物を与えた。３〜１２
時間後、１０ｍｌの培養物を遠心分離し、かつ上澄液を
用いて多量（２Ｌ）培養物に接種した。多量培養物につ
き、４×５００ｍｌの２ｘＬＢに対しＭ９で増殖させた
４×５ｍｌの７１．１８菌体を接種し、かつ３７℃で振
とうした。菌体の多量培養物をＡ590＝１．０まで増殖
させた後（約３時間）、これらにｍＧＰ１−２の出発溶
菌物を含有する１０ｍｌの上澄液を接種した。次いで、
接種した菌体を３７℃で１晩増殖させた。翌日遠心分離
して菌体を除去しかつ上澄液を直ちに使用してＫ３８／
ｐＧＰ５−５／ｐＴｒｘ−２を誘発させた（下記参
照）。上澄液を４℃にて約６か月間にわたり力価〜５×
１０11φ／ｍｌで貯蔵することができた。この力価にお
いて、１リットルのファージを１２リットルの菌体にＡ
590 ＝５で接種し、１５倍の接種倍率とした。力価が低
ければ、ｍＧＰ１−２ファージを上澄液から濃縮するこ
とができ、その際ＮａＣｌ（６０ｇ／ｌ）及びＰＥＧ−
６０００（６５ｇ／ｌ）を上澄液に溶解させ、混合物を
０℃にて１〜７２時間沈降させ、次いで遠心分離するこ
とができる（７０００ｒｐｍにて２０分間）。ｍＧＰ１
−２ファージを含有する沈澱物を、初期容積の１／２０
のＭ９培地に再懸濁させた。
【００２９】Ｋ３８／ｐＧＰ５−５／ｐＴｒｘ−２は、
２種の適合性プラスミッドｐＧＰ５−５及びｐＴｒｘ−
２を含有する大腸菌菌株［ゲノタイプＨｆｒＣ（λ）］
である。ｐＧＰ５−５プラスミッドはＰ１５Ａ複製オリ
ジンを有し、かつカナマイシン（Ｋｍ）耐性遺伝子を発
現する。ｐＴｒｘ−２はＣｏｌＥＩ複製オリジンを有
し、かつアンピシリン（Ａｐ）耐性遺伝子を発現する。
これらプラスミッドを常法によってＫ３８に導入し、そ
れぞれＫｍR 及びＡｐR を選択した。これら菌体Ｋ３８
／ｐＧＰ５−５／ｐＴｒｘ−２を５０％グリセリン中に
−８０℃で貯蔵した。使用に先立ち、これらを５０μｇ
／ｍｌのアンピシリンとカナマイシンとを含有するプレ
ートに塗抹し、３７℃で１晩増殖させ、かつ単一コロニ
ーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及びカナマイシンを
含有する１０ｍｌのＬＢ培地で３７℃にて４〜６時間増
殖させた。１０ｍｌの菌体培養物を用いて、５０μｇ／
ｍｌのアンピシリン及びカナマイシンを含有する５００
ｍｌのＬＢ培地に接種し、かつ３７℃で１晩振とうし
た。翌日、５００ｍｌの培養物を用いて、１２リットル
の２ｘＬＢ−ＫＰＯ4 培地（２％バクト−トリプトン、
１％酵母抽出物、０．５％ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＫＰＯ
4 、０．２％デキストロース及び０．２％カザミノ酸、
ｐＨ７．４）に接種し、かつ通気しながら３７℃にて醗
酵装置で増殖させた。菌体がＡ590 ＝５．０（すなわち
対数増殖期又は定常期）に達した後、これらに接種倍率
１０にてｍＧＰ１−２を接種し、かつＩＰＴＧを加えた
（最終濃度０．５ｍＭ）。ＩＰＴＧはｍＧＰ１−２にお
けるチオレドキシン及びＴ７ＤＮＡポリメラーゼの産生
を誘発し、したがってクローン化ＤＮＡポリメラーゼの
産生を誘発させた。これら細胞をさらに撹拌及び通気し
ながら２．５時間増殖させ、次いで収穫した。菌体ペレ
ットを１．５リットルの１０％蔗糖／２０ｍＭトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／２５ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁
し、かつ再び回転させた（re-spun ）。最後に、菌体ペ
レットを２００ｍｌの１０％蔗糖／２０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８）／１．０ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁し、か
つ液体窒素中で凍結させた。１２リットルの誘発菌体か
ら７０ｇの菌体ペーストが得られ、これは約７００ｍｇ
の遺伝子５蛋白質と１００ｍｇのチオレドキシンとを含
有した。
２種の適合性プラスミッドｐＧＰ５−５及びｐＴｒｘ−
２を含有する大腸菌菌株［ゲノタイプＨｆｒＣ（λ）］
である。ｐＧＰ５−５プラスミッドはＰ１５Ａ複製オリ
ジンを有し、かつカナマイシン（Ｋｍ）耐性遺伝子を発
現する。ｐＴｒｘ−２はＣｏｌＥＩ複製オリジンを有
し、かつアンピシリン（Ａｐ）耐性遺伝子を発現する。
これらプラスミッドを常法によってＫ３８に導入し、そ
れぞれＫｍR 及びＡｐR を選択した。これら菌体Ｋ３８
／ｐＧＰ５−５／ｐＴｒｘ−２を５０％グリセリン中に
−８０℃で貯蔵した。使用に先立ち、これらを５０μｇ
／ｍｌのアンピシリンとカナマイシンとを含有するプレ
ートに塗抹し、３７℃で１晩増殖させ、かつ単一コロニ
ーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及びカナマイシンを
含有する１０ｍｌのＬＢ培地で３７℃にて４〜６時間増
殖させた。１０ｍｌの菌体培養物を用いて、５０μｇ／
ｍｌのアンピシリン及びカナマイシンを含有する５００
ｍｌのＬＢ培地に接種し、かつ３７℃で１晩振とうし
た。翌日、５００ｍｌの培養物を用いて、１２リットル
の２ｘＬＢ−ＫＰＯ4 培地（２％バクト−トリプトン、
１％酵母抽出物、０．５％ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＫＰＯ
4 、０．２％デキストロース及び０．２％カザミノ酸、
ｐＨ７．４）に接種し、かつ通気しながら３７℃にて醗
酵装置で増殖させた。菌体がＡ590 ＝５．０（すなわち
対数増殖期又は定常期）に達した後、これらに接種倍率
１０にてｍＧＰ１−２を接種し、かつＩＰＴＧを加えた
（最終濃度０．５ｍＭ）。ＩＰＴＧはｍＧＰ１−２にお
けるチオレドキシン及びＴ７ＤＮＡポリメラーゼの産生
を誘発し、したがってクローン化ＤＮＡポリメラーゼの
産生を誘発させた。これら細胞をさらに撹拌及び通気し
ながら２．５時間増殖させ、次いで収穫した。菌体ペレ
ットを１．５リットルの１０％蔗糖／２０ｍＭトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／２５ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁
し、かつ再び回転させた（re-spun ）。最後に、菌体ペ
レットを２００ｍｌの１０％蔗糖／２０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８）／１．０ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁し、か
つ液体窒素中で凍結させた。１２リットルの誘発菌体か
ら７０ｇの菌体ペーストが得られ、これは約７００ｍｇ
の遺伝子５蛋白質と１００ｍｇのチオレドキシンとを含
有した。
【００３０】Ｋ３８／ｐＴｒｘ−２（ｐＴｒｘ−２のみ
を含有するＫ３８）はチオレドキシンを過剰産生し、か
つこれを「ブースター」としてＫ３８／ｐＧＰ５−５／
ｐＴｒｘ−２の抽出物へ添加することにより、チオレド
キシンを精製の開始時点で遺伝子５蛋白質よりも過剰に
なるようにした。Ｋ３８／ｐＴｒｘ−２菌体を５０％グ
リセリン中に−８０℃にて貯蔵した。使用に先立ち、こ
れらを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するプレー
トに塗抹し、３７℃にて２４時間増殖させ、かつ単一コ
ロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２５
ｍｌのＬＢ培地中で３７℃にて１晩増殖させた。２５ｍ
ｌの培養物を用いて、２リットルの２ｘＬＢ培地に接種
しかつ３７℃で振とうした。菌体がＡ590 ＝３．０に達
した後、ｐｔａｃプロモーターを、したがってチオレド
キシンの産生をＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）の添加
によって誘発させた。菌体を振とうしながら３７℃にて
さらに１２〜１６時間増殖させ、収穫し、６００ｍｌの
１０％蔗糖／２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／
２５ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁させ、そして再び回転させ
た（re-spun ）。最後に、菌体を４０ｍｌの１０％蔗糖
／２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）／０．５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡに再懸濁させ、かつ液体窒素で凍結させた。２リ
ットルの菌体から１６ｇの菌体ペーストが得られ、これ
は１５０ｍｇのチオレドキシンを含有した。
を含有するＫ３８）はチオレドキシンを過剰産生し、か
つこれを「ブースター」としてＫ３８／ｐＧＰ５−５／
ｐＴｒｘ−２の抽出物へ添加することにより、チオレド
キシンを精製の開始時点で遺伝子５蛋白質よりも過剰に
なるようにした。Ｋ３８／ｐＴｒｘ−２菌体を５０％グ
リセリン中に−８０℃にて貯蔵した。使用に先立ち、こ
れらを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するプレー
トに塗抹し、３７℃にて２４時間増殖させ、かつ単一コ
ロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２５
ｍｌのＬＢ培地中で３７℃にて１晩増殖させた。２５ｍ
ｌの培養物を用いて、２リットルの２ｘＬＢ培地に接種
しかつ３７℃で振とうした。菌体がＡ590 ＝３．０に達
した後、ｐｔａｃプロモーターを、したがってチオレド
キシンの産生をＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）の添加
によって誘発させた。菌体を振とうしながら３７℃にて
さらに１２〜１６時間増殖させ、収穫し、６００ｍｌの
１０％蔗糖／２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／
２５ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁させ、そして再び回転させ
た（re-spun ）。最後に、菌体を４０ｍｌの１０％蔗糖
／２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）／０．５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡに再懸濁させ、かつ液体窒素で凍結させた。２リ
ットルの菌体から１６ｇの菌体ペーストが得られ、これ
は１５０ｍｇのチオレドキシンを含有した。
【００３１】ポリメラーゼの分析は、基質として一本鎖
の牛胸腺ＤＮＡ（６ｍＭ）の使用を伴った。これは、二
重鎖牛胸腺ＤＮＡを５０ｍＭ ＮａＯＨで２０℃にて１
５分間変性させ、次いでＨＣｌで中和することにより使
用直前に作成した。任意の精製ＤＮＡをポリメラーゼ分
析用のテンプレートとして使用しうるが、好ましくはこ
れは１，０００塩基より大きい長さを有する。
の牛胸腺ＤＮＡ（６ｍＭ）の使用を伴った。これは、二
重鎖牛胸腺ＤＮＡを５０ｍＭ ＮａＯＨで２０℃にて１
５分間変性させ、次いでＨＣｌで中和することにより使
用直前に作成した。任意の精製ＤＮＡをポリメラーゼ分
析用のテンプレートとして使用しうるが、好ましくはこ
れは１，０００塩基より大きい長さを有する。
【００３２】使用した標準Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ分析
は、グリッポ等により記載された方法［ジャーナル・バ
イオロジカル・ケミストリー、第２４６巻、第６８６７
頁（１９７１）］の変法である。標準反応混合物（最終
容積２００μｌ）は４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）と１０ｍＭのＭｇＣｌ2 と５ｍＭのジチオスレ
イトールと１００ｎモルのアルカリ変性された牛胸腺Ｄ
ＮＡと０．３ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及び
［Ｈ3 ］ｄＴＴＰ（２０ｃｐｍ／ｐｍ）と５０μｇ／ｍ
ｌのＢＳＡと種々の量のＴ７ＤＮＡポリメラーゼとを含
有した。インキュベーションは、３７℃（１０〜４５
℃）にて３０分間（５〜６０分間）行なった。この反応
を、３ｍｌの冷（０℃）１Ｎ ＨＣｌ−０．１Ｍピロホ
スフェートの添加によって停止させた。酸不溶性の放射
能をヒンクル等の方法［ジャーナル・バイオロジカル・
ケミストリー、第２５０巻、第５５２３頁（１９７
４）］によって測定した。ＤＮＡを氷上で１５分間（５
分間〜１２時間）にわたり沈澱させたるこれらフィルタ
を４ｍｌの冷（０．１Ｍ ＨＣｌ−０．１Ｍピロホスフ
ェートで５回洗浄し、かつ冷（０℃）９０％エタノール
で２回洗浄した。乾燥後、これらフィルタ上の放射能
を、非水性シンチレーションフルオール（fluor ）で計
数した。
は、グリッポ等により記載された方法［ジャーナル・バ
イオロジカル・ケミストリー、第２４６巻、第６８６７
頁（１９７１）］の変法である。標準反応混合物（最終
容積２００μｌ）は４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）と１０ｍＭのＭｇＣｌ2 と５ｍＭのジチオスレ
イトールと１００ｎモルのアルカリ変性された牛胸腺Ｄ
ＮＡと０．３ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及び
［Ｈ3 ］ｄＴＴＰ（２０ｃｐｍ／ｐｍ）と５０μｇ／ｍ
ｌのＢＳＡと種々の量のＴ７ＤＮＡポリメラーゼとを含
有した。インキュベーションは、３７℃（１０〜４５
℃）にて３０分間（５〜６０分間）行なった。この反応
を、３ｍｌの冷（０℃）１Ｎ ＨＣｌ−０．１Ｍピロホ
スフェートの添加によって停止させた。酸不溶性の放射
能をヒンクル等の方法［ジャーナル・バイオロジカル・
ケミストリー、第２５０巻、第５５２３頁（１９７
４）］によって測定した。ＤＮＡを氷上で１５分間（５
分間〜１２時間）にわたり沈澱させたるこれらフィルタ
を４ｍｌの冷（０．１Ｍ ＨＣｌ−０．１Ｍピロホスフ
ェートで５回洗浄し、かつ冷（０℃）９０％エタノール
で２回洗浄した。乾燥後、これらフィルタ上の放射能
を、非水性シンチレーションフルオール（fluor ）で計
数した。
【００３３】１単位のポリメラーゼ活性は、酸可溶性物
中への１０ｎモルの全ヌクレオチドの３７℃にて３０分
間の取込みを上記条件下で触媒する。天然Ｔ７ＤＮＡポ
リメラーゼ及び修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（下記参
照）は、同じ比ポリメラーゼ活性±２０％を有し、これ
は上記の標準分析条件を用いて作成法に応じ原ポリメラ
ーゼにつき５，０００〜２０，０００単位／ｍｇかつ修
飾ポリメラーゼにつき５，０００〜５０，０００単位／
ｍｇの範囲である。
中への１０ｎモルの全ヌクレオチドの３７℃にて３０分
間の取込みを上記条件下で触媒する。天然Ｔ７ＤＮＡポ
リメラーゼ及び修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（下記参
照）は、同じ比ポリメラーゼ活性±２０％を有し、これ
は上記の標準分析条件を用いて作成法に応じ原ポリメラ
ーゼにつき５，０００〜２０，０００単位／ｍｇかつ修
飾ポリメラーゼにつき５，０００〜５０，０００単位／
ｍｇの範囲である。
【００３４】Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼを上記抽出物から
沈澱及びクロマトグラフィー技術により精製した。この
種の精製の例は次の通りである。
沈澱及びクロマトグラフィー技術により精製した。この
種の精製の例は次の通りである。
【００３５】凍結菌体の抽出物（２００ｍｌのＫ３８／
ｐＧＰ５−５／ｐＴｒｘ−２及び４０ｍｌのＫ３８／ｐ
Ｔｒｘ−２）を０℃にて１晩解凍した。これら菌体を合
し、かつ５ｍｌのリゾチーム（１５ｍｇ／ｍｌ）及び１
０ｍｌのＮａＣｌ（５Ｍ）を添加した。０℃にて４５分
間後、菌体を、その温度が２０℃に達するまで３７℃の
水浴に入れた。次いで、菌体を液体窒素中で凍結させ
た。さらに５０ｍｌのＮａＣｌ（５Ｍ）を添加し、かつ
菌体を３７℃の水浴内で解凍した。解凍後、菌体を０℃
にて６０分間にわたりゆっくり混合した。溶菌物をベッ
クマン４５Ｔｉ型ロータにて３５，０００ｒｐｍで１時
間遠心分離した。上澄液（２５０ｍｌ）をフラクション
Ｉとした。これは約７００ｍｇの遺伝子５蛋白質と２５
０ｍｇのチオレドキシンとを含有した（チオレドキシン
対遺伝子５蛋白質の比２：１）。
ｐＧＰ５−５／ｐＴｒｘ−２及び４０ｍｌのＫ３８／ｐ
Ｔｒｘ−２）を０℃にて１晩解凍した。これら菌体を合
し、かつ５ｍｌのリゾチーム（１５ｍｇ／ｍｌ）及び１
０ｍｌのＮａＣｌ（５Ｍ）を添加した。０℃にて４５分
間後、菌体を、その温度が２０℃に達するまで３７℃の
水浴に入れた。次いで、菌体を液体窒素中で凍結させ
た。さらに５０ｍｌのＮａＣｌ（５Ｍ）を添加し、かつ
菌体を３７℃の水浴内で解凍した。解凍後、菌体を０℃
にて６０分間にわたりゆっくり混合した。溶菌物をベッ
クマン４５Ｔｉ型ロータにて３５，０００ｒｐｍで１時
間遠心分離した。上澄液（２５０ｍｌ）をフラクション
Ｉとした。これは約７００ｍｇの遺伝子５蛋白質と２５
０ｍｇのチオレドキシンとを含有した（チオレドキシン
対遺伝子５蛋白質の比２：１）。
【００３６】９０ｇの硫酸アンモニウムをフラクション
Ｉ（２５０ｍｌ）に溶解し、かつ６０分間撹拌した。懸
濁物を６０分間静置させ、かつ得られた沈澱物を８，０
００ｒｐｍでの６０分間の遠心分離により集めた。沈澱
物を３００ｍｌの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）／５ｍＭ２−メルカプトエタノール／０．１ｍＭＥ
ＤＴＡ／１０％グリセリン（緩衝液Ａ）に再溶解させ
た。これをフラクションIIとした。
Ｉ（２５０ｍｌ）に溶解し、かつ６０分間撹拌した。懸
濁物を６０分間静置させ、かつ得られた沈澱物を８，０
００ｒｐｍでの６０分間の遠心分離により集めた。沈澱
物を３００ｍｌの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）／５ｍＭ２−メルカプトエタノール／０．１ｍＭＥ
ＤＴＡ／１０％グリセリン（緩衝液Ａ）に再溶解させ
た。これをフラクションIIとした。
【００３７】ワットマンＤＥ５２ ＤＥＡＥのカラム
（１２．６ｃｍ2 ×１８ｃｍ）を作成し、かつ緩衝液Ａ
で洗浄した。フラクションIIを１リットルの緩衝液Ａに
対し２回交換してそれぞれフラクションIIの電導度が１
００ｍＭ ＮａＣｌを含有する緩衝液Ａの電導度に等し
くなるまで１晩透析した。透析フラクションIIをカラム
に対し１００ｍｌ／ｈｒの流速で加え、かつ１００ｍＭ
ＮａＣｌ含有の緩衝液Ａ ４００ｍｌで洗浄した。蛋
白質を３．５リットルの緩衝液Ａにおける１００〜４０
０ｍＭ濃度勾配のＮａＣｌにて６０ｍｌ／ｈｒの流速で
溶出させた。２００ｍＭ ＮａＣｌで溶出するＴ７ＤＮ
Ａポリメラーゼを含有するフラクションを集めた。これ
をフラクションIII とした（１９０ｍｌ）。
（１２．６ｃｍ2 ×１８ｃｍ）を作成し、かつ緩衝液Ａ
で洗浄した。フラクションIIを１リットルの緩衝液Ａに
対し２回交換してそれぞれフラクションIIの電導度が１
００ｍＭ ＮａＣｌを含有する緩衝液Ａの電導度に等し
くなるまで１晩透析した。透析フラクションIIをカラム
に対し１００ｍｌ／ｈｒの流速で加え、かつ１００ｍＭ
ＮａＣｌ含有の緩衝液Ａ ４００ｍｌで洗浄した。蛋
白質を３．５リットルの緩衝液Ａにおける１００〜４０
０ｍＭ濃度勾配のＮａＣｌにて６０ｍｌ／ｈｒの流速で
溶出させた。２００ｍＭ ＮａＣｌで溶出するＴ７ＤＮ
Ａポリメラーゼを含有するフラクションを集めた。これ
をフラクションIII とした（１９０ｍｌ）。
【００３８】ワットマンＰ１１型ホスホセルロースのカ
ラム（１２．６ｃｍ2 ×１２ｃｍ）を作成し、かつ２０
ｍＭ ＫＰＯ4 （ｐＨ７．４）／５ｍＭ２−メルカプト
エタノール／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ／１０％グリセリン
（緩衝液Ｂ）で洗浄した。フラクションIII を緩衝液Ｂ
で２倍量（３８０ｍｌ）に希釈し、次いでカラムに対し
６０ｍｌ／ｈｒの流速で加え、かつ１００ｍＭ ＫＣｌ
を含有する緩衝液Ｂ２００ｍｌで洗浄した。蛋白質を
１．８リットルの緩衝液Ｂにおける１００〜４００ｍＭ
濃度勾配のＫＣｌにより６０ｍｌ／ｈｒの流速で溶出さ
せた。３００ｍＭ ＫＣｌで溶出するＴ７ＤＮＡポリメ
ラーゼを含有するフラクションを集めた。これをフラク
ションIVとした（３７０ｍｌ）。
ラム（１２．６ｃｍ2 ×１２ｃｍ）を作成し、かつ２０
ｍＭ ＫＰＯ4 （ｐＨ７．４）／５ｍＭ２−メルカプト
エタノール／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ／１０％グリセリン
（緩衝液Ｂ）で洗浄した。フラクションIII を緩衝液Ｂ
で２倍量（３８０ｍｌ）に希釈し、次いでカラムに対し
６０ｍｌ／ｈｒの流速で加え、かつ１００ｍＭ ＫＣｌ
を含有する緩衝液Ｂ２００ｍｌで洗浄した。蛋白質を
１．８リットルの緩衝液Ｂにおける１００〜４００ｍＭ
濃度勾配のＫＣｌにより６０ｍｌ／ｈｒの流速で溶出さ
せた。３００ｍＭ ＫＣｌで溶出するＴ７ＤＮＡポリメ
ラーゼを含有するフラクションを集めた。これをフラク
ションIVとした（３７０ｍｌ）。
【００３９】ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０のカラ
ム（４．９ｃｍ2 ×１５ｃｍ）を作成し、かつ２０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）／０．１ｍＭジチオスレ
イトール／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ／１０％グリセリン
（緩衝液Ｃ）で洗浄した。フラクションIVを、１リット
ルの緩衝液Ｃを２回交換して１００ｍＭ ＮａＣｌを含
有する緩衝液Ｃと等しい最終電導度まで透析した。この
透析フラクションIVをカラムに対し４０ｍｌ／ｈｒの流
速で加え、かつ１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する１５０
ｍｌの緩衝液Ｃで洗浄した。蛋白質を１リットルの１０
０〜３００ｍＭ勾配の緩衝液ＣにおけるＮａＣｌにより
４０ｍｌ／ｈｒの流速で溶出させた。２１０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌで溶出するＴ７ＤＮＡポリメラーゼを含有するフラ
クションを集めた。これをフラクションＶとした（１２
０ｍｌ）。
ム（４．９ｃｍ2 ×１５ｃｍ）を作成し、かつ２０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）／０．１ｍＭジチオスレ
イトール／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ／１０％グリセリン
（緩衝液Ｃ）で洗浄した。フラクションIVを、１リット
ルの緩衝液Ｃを２回交換して１００ｍＭ ＮａＣｌを含
有する緩衝液Ｃと等しい最終電導度まで透析した。この
透析フラクションIVをカラムに対し４０ｍｌ／ｈｒの流
速で加え、かつ１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する１５０
ｍｌの緩衝液Ｃで洗浄した。蛋白質を１リットルの１０
０〜３００ｍＭ勾配の緩衝液ＣにおけるＮａＣｌにより
４０ｍｌ／ｈｒの流速で溶出させた。２１０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌで溶出するＴ７ＤＮＡポリメラーゼを含有するフラ
クションを集めた。これをフラクションＶとした（１２
０ｍｌ）。
【００４０】ビオラドＨＴＰ型ヒドロキシアパタイトの
カラム（４．９ｃｍ2 ×１５ｃｍ）を作成し、かつ２０
ｍＭ ＫＰＯ4 （ｐＨ７．４）／１０ｍＭ２−メルカプ
トエタノール／２ｍＭクエン酸ナトリウム／１０％グリ
セリン（緩衝液Ｄ）で洗浄した。フラクションＶを、５
００ｍｌの緩衝液Ｄをそれぞれ２回交換して透析した。
この透析フラクションＶをカラムに対し３０ｍｌ／ｈｒ
の流速で加え、そして１００ｍｌの緩衝液Ｄで洗浄し
た。蛋白質を緩衝液Ｄにおける濃度勾配０〜１８０ｍＭ
ＫＰＯ4 （ｐＨ７．４）の９００ｍｌにより３０ｍｌ
／ｈｒの流速で溶出させた。５０ｍＭ ＫＰＯ4 で溶出
したＴ７ＤＮＡポリメラーゼを含有するフラクションを
集めた。これをフラクションVIとした（１３０ｍｌ）。
これは２７０ｍｇの均質なＴ７ＤＮＡポリメラーゼを含
有した。
カラム（４．９ｃｍ2 ×１５ｃｍ）を作成し、かつ２０
ｍＭ ＫＰＯ4 （ｐＨ７．４）／１０ｍＭ２−メルカプ
トエタノール／２ｍＭクエン酸ナトリウム／１０％グリ
セリン（緩衝液Ｄ）で洗浄した。フラクションＶを、５
００ｍｌの緩衝液Ｄをそれぞれ２回交換して透析した。
この透析フラクションＶをカラムに対し３０ｍｌ／ｈｒ
の流速で加え、そして１００ｍｌの緩衝液Ｄで洗浄し
た。蛋白質を緩衝液Ｄにおける濃度勾配０〜１８０ｍＭ
ＫＰＯ4 （ｐＨ７．４）の９００ｍｌにより３０ｍｌ
／ｈｒの流速で溶出させた。５０ｍＭ ＫＰＯ4 で溶出
したＴ７ＤＮＡポリメラーゼを含有するフラクションを
集めた。これをフラクションVIとした（１３０ｍｌ）。
これは２７０ｍｇの均質なＴ７ＤＮＡポリメラーゼを含
有した。
【００４１】フラクションVIを２０ｍＭ ＫＰＯ4 （ｐ
Ｈ７．４）／０．１ｍＭジチオスレイトール／０．１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ／５０％グリセリンに対し透析した。これ
を濃縮フラクションVI（−６５ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ）と
し、−２０℃で貯蔵した。
Ｈ７．４）／０．１ｍＭジチオスレイトール／０．１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ／５０％グリセリンに対し透析した。これ
を濃縮フラクションVI（−６５ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ）と
し、−２０℃で貯蔵した。
【００４２】分離したＴ７ポリメラーゼは、これに結合
したエキソヌクレアーゼ活性を有する。上記したよう
に、これは失活させねばならない。化学修飾による失活
の例は次の通りである。
したエキソヌクレアーゼ活性を有する。上記したよう
に、これは失活させねばならない。化学修飾による失活
の例は次の通りである。
【００４３】濃縮フラクションVIを２０ｍＭ ＫＰＯ4
（ｐＨ７．４）／０．１ｍＭジチオスレイトール／１０
％グリセリンに対し１晩透析して、貯蔵緩衝液中に存在
するＥＤＴＡを除去した。透析後、濃度を２０ｍＭ Ｋ
ＰＯ4 （ｐＨ７．４）／０．１ｍＭジチオスレイトール
／１０％グリセリンにより２ｍｇ／ｍｌまで調整し、か
つ３０ｍｌ（２ｍｇ／ｍｌ）のアリコートを５０ｍｌの
ポリプロピレンチューブに入れた（２ｍｇ／ｍｌにおい
て、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼのモル濃度は２２μＭであ
る）。
（ｐＨ７．４）／０．１ｍＭジチオスレイトール／１０
％グリセリンに対し１晩透析して、貯蔵緩衝液中に存在
するＥＤＴＡを除去した。透析後、濃度を２０ｍＭ Ｋ
ＰＯ4 （ｐＨ７．４）／０．１ｍＭジチオスレイトール
／１０％グリセリンにより２ｍｇ／ｍｌまで調整し、か
つ３０ｍｌ（２ｍｇ／ｍｌ）のアリコートを５０ｍｌの
ポリプロピレンチューブに入れた（２ｍｇ／ｍｌにおい
て、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼのモル濃度は２２μＭであ
る）。
【００４４】ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び硫酸第
一鉄アンモニウム［Ｆｅ（ＮＨ4 ）2 （ＳＯ4 ）2 ・６
Ｈ2 Ｏ］を使用直前に新たに作成し、かつ３０ｍｌ量の
Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼに対し５ｍＭのＤＴＴ（０．６
ｍｌの２５０ｍＭ保存物）及び２０μＭのＦｅ（ＮＨ
4 ）2 （ＳＯ4 ）2 ・６Ｈ2 Ｏ（０．６ｍｌの１ｍＭ保
存物）の濃度まで加えた。修飾に際し、Ｔ７ＤＮＡポリ
メラーゼ及び鉄のモル濃度はそれぞれ約２０μＭであ
り、ＤＴＴは２５０倍のモル過剰で存在した。
一鉄アンモニウム［Ｆｅ（ＮＨ4 ）2 （ＳＯ4 ）2 ・６
Ｈ2 Ｏ］を使用直前に新たに作成し、かつ３０ｍｌ量の
Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼに対し５ｍＭのＤＴＴ（０．６
ｍｌの２５０ｍＭ保存物）及び２０μＭのＦｅ（ＮＨ
4 ）2 （ＳＯ4 ）2 ・６Ｈ2 Ｏ（０．６ｍｌの１ｍＭ保
存物）の濃度まで加えた。修飾に際し、Ｔ７ＤＮＡポリ
メラーゼ及び鉄のモル濃度はそれぞれ約２０μＭであ
り、ＤＴＴは２５０倍のモル過剰で存在した。
【００４５】修飾は飽和酸素雰囲気下で０℃にて次のよ
うに行なった。反応混合物をデシケータ内の氷上に載置
し、このデシケータを減圧により空気パージし、次いで
１００％酸素を満たした。このサイクルを３回反復し
た。反応は空気中（２０％酸素）で行なうこともできる
が、その速度は１／３となる。
うに行なった。反応混合物をデシケータ内の氷上に載置
し、このデシケータを減圧により空気パージし、次いで
１００％酸素を満たした。このサイクルを３回反復し
た。反応は空気中（２０％酸素）で行なうこともできる
が、その速度は１／３となる。
【００４６】エキソヌクレアーゼ活性の喪失に関する時
間経過を第４図に示す。Ｈ3 −標識された二重鎖ＤＮＡ
（６ｃｐｍ／ｐモル）を、リチャードソンにより記載さ
れたようにバクテリオファージＴ７から作成した［ジャ
ーナル・モレキュラ・バイオロジー、第１５巻、第４９
頁（１９６６）］。Ｈ3 −標識された一本鎖Ｔ７ＤＮＡ
を使用直前に作成し、その際二重鎖Ｈ3 −標識Ｔ７ＤＮ
Ａを５０ｍＭ ＮａＯＨで２０℃にて１５分間変性さ
せ、次いでＨＣｌにより中和した。用いた標識エキソヌ
クレアーゼ分析はチェース等（上記）により記載された
方法の変法である。この標準反応混合物（最終容積１０
０μｌ）は４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）と
１０ｍＭのＭｇＣｌ2 と１０ｍＭのジチオスレイトール
と６０ｎモルのＨ3 −標識された一本鎖Ｔ７ＤＮＡ（６
ｃｐｍ／ｐｍ）と種々の量のＴ７ＤＮＡポリメラーゼと
を含有した。Ｈ3 −標識された二重鎖Ｔ７ＤＮＡも基質
として使用することができる。さらに、任意の均一に放
射能標識されたＤＮＡ（一本鎖若しくは二重鎖）もこの
分析に使用することができる。さらに、３’末端標識さ
れた一本鎖若しくは二重鎖ＤＮＡもこの分析に使用する
ことができる。３７℃にて１５分間インキュベートした
後、３０μｌのＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）及び２５μｌ
のＴＣＡ（１００％ｗ／ｖ）の添加により反応を停止さ
せた。この分析は１０〜４５℃で１〜６０分間行なうこ
とができる。ＤＮＡを氷上で１５分間（１分間〜１２時
間）沈澱させ、次いで１２，０００ｇにて３０分間（５
分間〜３時間）遠心分離した。１００μｌの上澄液を使
用して酸可溶性の放射能を測定し、その際これを４００
μｌの水及び５ｍｌの水性シンチレーションカクテルに
加えた。
間経過を第４図に示す。Ｈ3 −標識された二重鎖ＤＮＡ
（６ｃｐｍ／ｐモル）を、リチャードソンにより記載さ
れたようにバクテリオファージＴ７から作成した［ジャ
ーナル・モレキュラ・バイオロジー、第１５巻、第４９
頁（１９６６）］。Ｈ3 −標識された一本鎖Ｔ７ＤＮＡ
を使用直前に作成し、その際二重鎖Ｈ3 −標識Ｔ７ＤＮ
Ａを５０ｍＭ ＮａＯＨで２０℃にて１５分間変性さ
せ、次いでＨＣｌにより中和した。用いた標識エキソヌ
クレアーゼ分析はチェース等（上記）により記載された
方法の変法である。この標準反応混合物（最終容積１０
０μｌ）は４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）と
１０ｍＭのＭｇＣｌ2 と１０ｍＭのジチオスレイトール
と６０ｎモルのＨ3 −標識された一本鎖Ｔ７ＤＮＡ（６
ｃｐｍ／ｐｍ）と種々の量のＴ７ＤＮＡポリメラーゼと
を含有した。Ｈ3 −標識された二重鎖Ｔ７ＤＮＡも基質
として使用することができる。さらに、任意の均一に放
射能標識されたＤＮＡ（一本鎖若しくは二重鎖）もこの
分析に使用することができる。さらに、３’末端標識さ
れた一本鎖若しくは二重鎖ＤＮＡもこの分析に使用する
ことができる。３７℃にて１５分間インキュベートした
後、３０μｌのＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）及び２５μｌ
のＴＣＡ（１００％ｗ／ｖ）の添加により反応を停止さ
せた。この分析は１０〜４５℃で１〜６０分間行なうこ
とができる。ＤＮＡを氷上で１５分間（１分間〜１２時
間）沈澱させ、次いで１２，０００ｇにて３０分間（５
分間〜３時間）遠心分離した。１００μｌの上澄液を使
用して酸可溶性の放射能を測定し、その際これを４００
μｌの水及び５ｍｌの水性シンチレーションカクテルに
加えた。
【００４７】１単位のエキソヌクレアーゼ活性は、この
分析の条件下に３０分間で１０ｎモルの全ヌクレオチド
の酸溶解を触媒する。原Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼは、上
記の標準分析条件を用いて５，０００単位／ｍｇの比エ
キソヌクレアーゼ活性を有する。修飾Ｔ７ＤＮＡポリメ
ラーゼの比エキソヌクレアーゼ活性は化学的修飾の程度
に依存するが、理想的には原Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼよ
り少なくとも１０〜１００倍低く、或いは上記の標準分
析条件を用いて５００〜５０単位／ｍｇ若しくはそれ以
下である。二重鎖基質を用いると、エキソヌクレアーゼ
活性は約７倍高くなる。
分析の条件下に３０分間で１０ｎモルの全ヌクレオチド
の酸溶解を触媒する。原Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼは、上
記の標準分析条件を用いて５，０００単位／ｍｇの比エ
キソヌクレアーゼ活性を有する。修飾Ｔ７ＤＮＡポリメ
ラーゼの比エキソヌクレアーゼ活性は化学的修飾の程度
に依存するが、理想的には原Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼよ
り少なくとも１０〜１００倍低く、或いは上記の標準分
析条件を用いて５００〜５０単位／ｍｇ若しくはそれ以
下である。二重鎖基質を用いると、エキソヌクレアーゼ
活性は約７倍高くなる。
【００４８】上記条件下においてエキソヌクレアーゼ活
性は対数的に減少し、減衰の半減期は８時間である。毎
日１回、反応容器を混合して溶存酸素を分配させた。さ
もないと、反応は酸素の濃度がより高い表面にて一層急
速に進行する。毎日１回２．５ｍＭのＤＴＴ（３０ｍｌ
の反応物に対し０．３ｍｌの新鮮な２５０ｍＭ保存物）
を加えて酸化ＤＴＴを補充した。
性は対数的に減少し、減衰の半減期は８時間である。毎
日１回、反応容器を混合して溶存酸素を分配させた。さ
もないと、反応は酸素の濃度がより高い表面にて一層急
速に進行する。毎日１回２．５ｍＭのＤＴＴ（３０ｍｌ
の反応物に対し０．３ｍｌの新鮮な２５０ｍＭ保存物）
を加えて酸化ＤＴＴを補充した。
【００４９】８時間後、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼのエキ
ソヌクレアーゼ活性は５０％低下し、ポリメラーゼ活性
の損失は無視しうる。５０％損失は、ポリメラーゼ分子
の半分のエキソヌクレアーゼ活性が完全に失活した結果
であって、全分子におけるエキソヌクレアーゼ活性の割
合の一般的低下ではない。したがって８時間の反応後、
全分子は正常なポリメラーゼ活性を有し、分子の半分が
正常なエキソヌクレアーゼ活性を有したのに対し、他の
半分が初期エキソヌクレアーゼ活性の＜０．１％を有し
た。
ソヌクレアーゼ活性は５０％低下し、ポリメラーゼ活性
の損失は無視しうる。５０％損失は、ポリメラーゼ分子
の半分のエキソヌクレアーゼ活性が完全に失活した結果
であって、全分子におけるエキソヌクレアーゼ活性の割
合の一般的低下ではない。したがって８時間の反応後、
全分子は正常なポリメラーゼ活性を有し、分子の半分が
正常なエキソヌクレアーゼ活性を有したのに対し、他の
半分が初期エキソヌクレアーゼ活性の＜０．１％を有し
た。
【００５０】分子の５０％を修飾する場合（８時間の反
応）、ＤＮＡ配列決定には酵素が適しているが、最適で
はない。より最適なＤＮＡ配列決定には反応を９９％よ
り大きい修飾（５０単位未満のエキソヌクレアーゼ活性
を有する）まで進行させ、これには４日間を要する。
応）、ＤＮＡ配列決定には酵素が適しているが、最適で
はない。より最適なＤＮＡ配列決定には反応を９９％よ
り大きい修飾（５０単位未満のエキソヌクレアーゼ活性
を有する）まで進行させ、これには４日間を要する。
【００５１】４日後、反応混合物を２５０ｍｌの２０ｍ
Ｍ ＫＰＯ4 （ｐＨ７．４）／０．１ｍＭジチオスレイ
トール／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ／５０％グリセリンを２
回交換して透析し、鉄を除去した。修飾されたＴ７ＤＮ
Ａポリメラーゼ（〜４ｍｇ／ｍｌ）を−２０℃で貯蔵し
た。
Ｍ ＫＰＯ4 （ｐＨ７．４）／０．１ｍＭジチオスレイ
トール／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ／５０％グリセリンを２
回交換して透析し、鉄を除去した。修飾されたＴ７ＤＮ
Ａポリメラーゼ（〜４ｍｇ／ｍｌ）を−２０℃で貯蔵し
た。
【００５２】Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼの化学的修飾に対
する反応メカニズムは、たとえばＦｅ2+のような還元型
遷移金属と酸素との存在下で発生した反応性酸素物質に
依存する。水酸基を発生させるための可能な反応メカニ
ズムは下記の通りである： （１）Ｆｅ2+＋Ｏ2 →Ｆｅ3+＋Ｏ・ 2 （２）２Ｏ・ 2＋２Ｈ+ →Ｈ2 Ｏ2 ＋Ｏ2 （３）Ｆｅ2+＋Ｈ2 Ｏ2 →Ｆｅ3+＋ＯＨ・ ＋ＯＨ-
する反応メカニズムは、たとえばＦｅ2+のような還元型
遷移金属と酸素との存在下で発生した反応性酸素物質に
依存する。水酸基を発生させるための可能な反応メカニ
ズムは下記の通りである： （１）Ｆｅ2+＋Ｏ2 →Ｆｅ3+＋Ｏ・ 2 （２）２Ｏ・ 2＋２Ｈ+ →Ｈ2 Ｏ2 ＋Ｏ2 （３）Ｆｅ2+＋Ｈ2 Ｏ2 →Ｆｅ3+＋ＯＨ・ ＋ＯＨ-
【００５３】式１において、還元型金属イオンの酸化は
過酸化基（Ｏ・ 2）を生成する。この過酸化基は不均化反
応を受けて、過酸化水素を発生することができる（式
２）。最後に、過酸化水素は還元型金属イオンと反応し
て水酸基（ＯＨ・ ）を生成することができる（フェント
ン反応、式３）。酸化された金属イオンを、たとえばジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）のような還元剤によって還
元型に循環させる。
過酸化基（Ｏ・ 2）を生成する。この過酸化基は不均化反
応を受けて、過酸化水素を発生することができる（式
２）。最後に、過酸化水素は還元型金属イオンと反応し
て水酸基（ＯＨ・ ）を生成することができる（フェント
ン反応、式３）。酸化された金属イオンを、たとえばジ
チオスレイトール（ＤＴＴ）のような還元剤によって還
元型に循環させる。
【００５４】これらの反応性酸素は、恐らく非可逆的に
特定アミノ酸残基を化学変化させることにより蛋白質を
失活させる。この種の損傷は、ＣＮＢｒ若しくはトリプ
シンにより生成された遺伝子５の断片のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅに見られる。幾つかの断片が消失し、高分子量の架橋
が生じ、かつ幾つかの断片が２つの小さい断片に分解さ
れる。
特定アミノ酸残基を化学変化させることにより蛋白質を
失活させる。この種の損傷は、ＣＮＢｒ若しくはトリプ
シンにより生成された遺伝子５の断片のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅに見られる。幾つかの断片が消失し、高分子量の架橋
が生じ、かつ幾つかの断片が２つの小さい断片に分解さ
れる。
【００５５】上記したように、酸素と還元剤（たとえば
ＤＴＴ、２−メルカプトエタノール）と遷移金属（たと
えば鉄）とは修飾反応の必須成分である。反応は空気中
で生ずるが、１００％酸素の使用により３倍刺戟され
る。この反応は、微量の遷移金属（１〜２μＭ）が大抵
の緩衝剤に存在するので遷移金属の添加なしに徐々に生
ずる。
ＤＴＴ、２−メルカプトエタノール）と遷移金属（たと
えば鉄）とは修飾反応の必須成分である。反応は空気中
で生ずるが、１００％酸素の使用により３倍刺戟され
る。この反応は、微量の遷移金属（１〜２μＭ）が大抵
の緩衝剤に存在するので遷移金属の添加なしに徐々に生
ずる。
【００５６】予想通り、修飾反応の阻止剤は嫌気性条件
（たとえばＮ2 ）及び金属キレート化剤（たとえばＥＤ
ＴＡ、クエン酸、ニトリロ三酢酸）を包含する。さら
に、酵素カタラーゼ及びスーパーオキシドジスムターゼ
はこの反応を阻害し、修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼの発
生において反応性酸素物質の必須の役割に一致する。
（たとえばＮ2 ）及び金属キレート化剤（たとえばＥＤ
ＴＡ、クエン酸、ニトリロ三酢酸）を包含する。さら
に、酵素カタラーゼ及びスーパーオキシドジスムターゼ
はこの反応を阻害し、修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼの発
生において反応性酸素物質の必須の役割に一致する。
【００５７】他の方法として、Ｔ７遺伝子５を遺伝学的
に変異させて蛋白質のエキソヌクレアーゼ領域を特異的
に失活させることもできる。この種の突然変異体から精
製されたＴ７遺伝子５蛋白質は、酸化によるエキソヌク
レアーゼの化学的失活を必要とすることなくかつ化学的
修飾に際し蛋白質に不可避的に生ずる二次的損傷なしに
ＤＮＡ配列決定に使用するのに理想的である。
に変異させて蛋白質のエキソヌクレアーゼ領域を特異的
に失活させることもできる。この種の突然変異体から精
製されたＴ７遺伝子５蛋白質は、酸化によるエキソヌク
レアーゼの化学的失活を必要とすることなくかつ化学的
修飾に際し蛋白質に不可避的に生ずる二次的損傷なしに
ＤＮＡ配列決定に使用するのに理想的である。
【００５８】遺伝学的に修飾したＴ７ＤＮＡポリメラー
ゼは、遺伝子５をランダムに突然変異させかつ次いでエ
キソヌクレアーゼ活性を喪失したこれら突然変異体をス
クリーニングすることにより、ポリメラーゼ活性の損失
なしに分離することができる。突然変異は次のように行
なわれる。遺伝子５を含有する一本鎖ＤＮＡ（たとえば
一本鎖ＤＮＡの複製に対するオリジンを含有するプラス
ミッドであるｐＥＭＢＬ−８におけるクローン化）をＴ
７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下で標準法に
より作成し、かつ２種の異なる化学ムタゲン、すなわち
Ｃ及びＴを突然変異させるヒドラジン、並びにＧ及びＡ
を突然変異させる蟻酸で処理する［マイヤー等、サイエ
ンス、第２２９巻、第２４２頁（１９８５）］。ＤＮＡ
は、プラスミッド分子１個当りに変化される平均して１
塩基を生ぜしめる投与量で突然変異される。一本鎖の突
然変異されたプラスミッドを次いで普遍的１７量体プラ
イマー（上記参照）でプライムし、かつテンプレートと
して使用することにより対向鎖を合成する。合成された
鎖は、テンプレートにおける突然変異塩基に対応する位
置にランダム取込みされた塩基を有する。次いで、二重
鎖突然変異ＤＮＡを用いて菌株Ｋ３８／ｐＧＰ１−２を
形質転換させ、これはプラスミッドｐＧＰ１−２を有す
る菌株Ｋ３８である［タバー等、上記］。加熱誘発する
と、この菌株はＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する。形
質転換された菌体を３０℃にてプレート１枚当り約２０
０コロニーの割合で塗抹する。
ゼは、遺伝子５をランダムに突然変異させかつ次いでエ
キソヌクレアーゼ活性を喪失したこれら突然変異体をス
クリーニングすることにより、ポリメラーゼ活性の損失
なしに分離することができる。突然変異は次のように行
なわれる。遺伝子５を含有する一本鎖ＤＮＡ（たとえば
一本鎖ＤＮＡの複製に対するオリジンを含有するプラス
ミッドであるｐＥＭＢＬ−８におけるクローン化）をＴ
７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下で標準法に
より作成し、かつ２種の異なる化学ムタゲン、すなわち
Ｃ及びＴを突然変異させるヒドラジン、並びにＧ及びＡ
を突然変異させる蟻酸で処理する［マイヤー等、サイエ
ンス、第２２９巻、第２４２頁（１９８５）］。ＤＮＡ
は、プラスミッド分子１個当りに変化される平均して１
塩基を生ぜしめる投与量で突然変異される。一本鎖の突
然変異されたプラスミッドを次いで普遍的１７量体プラ
イマー（上記参照）でプライムし、かつテンプレートと
して使用することにより対向鎖を合成する。合成された
鎖は、テンプレートにおける突然変異塩基に対応する位
置にランダム取込みされた塩基を有する。次いで、二重
鎖突然変異ＤＮＡを用いて菌株Ｋ３８／ｐＧＰ１−２を
形質転換させ、これはプラスミッドｐＧＰ１−２を有す
る菌株Ｋ３８である［タバー等、上記］。加熱誘発する
と、この菌株はＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する。形
質転換された菌体を３０℃にてプレート１枚当り約２０
０コロニーの割合で塗抹する。
【００５９】エキソヌクレアーゼ活性を欠損したＴ７Ｄ
ＮＡポリメラーゼを有する菌体のスクリーニングは次の
知見に基づいている。ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’
エキソヌクレアーゼは校正の機能を有する。塩基を誤っ
て取込むと、エキソヌクレアーゼは新たに取込まれた塩
基を除去し、これは「異常」として認められる。これは
ｄＡＴＰのアナログ、すなわちｄＡＴＰの代りにＴ７Ｄ
ＮＡポリメラーゼにより容易に取込まれるエテノ−ｄＡ
ＴＰの場合である。しかしながら、Ｔ７ＤＮＡポリメラ
ーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼの存在下で、これ
は取込まれると直ちに切断されて真正なＤＮＡ合成を与
えない。第５図に示したように、テンプレートとして交
互共重合体ポリｄ（ＡＴ）を用いることにより、原Ｔ７
ＤＮＡポリメラーゼはｄＡＴＰの存在下にのみ長大なＤ
ＮＡ合成を触媒するが、エテノ−ｄＡＴＰの存在下では
触媒しない。これに対し、修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ
は、関連エキソヌクレアーゼを欠損しているため、エテ
ノ−ｄＡＴＰをｄＡＴＰに匹敵する割合でＤＮＡ中に安
定に取込む。かくして、テンプレートとしてポリｄ（Ａ
Ｔ）を用いかつ先駆体としてｄＴＴＰ及びエテノ−ｄＡ
ＴＰを用いることにより、原Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼは
このテンプレートからＤＮＡを合成することができない
のに対し、エキソヌクレアーゼ活性を喪失したＴ７ＤＮ
Ａポリメラーゼはこのテンプレートを用いてＤＮＡを合
成することができる。
ＮＡポリメラーゼを有する菌体のスクリーニングは次の
知見に基づいている。ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’
エキソヌクレアーゼは校正の機能を有する。塩基を誤っ
て取込むと、エキソヌクレアーゼは新たに取込まれた塩
基を除去し、これは「異常」として認められる。これは
ｄＡＴＰのアナログ、すなわちｄＡＴＰの代りにＴ７Ｄ
ＮＡポリメラーゼにより容易に取込まれるエテノ−ｄＡ
ＴＰの場合である。しかしながら、Ｔ７ＤＮＡポリメラ
ーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼの存在下で、これ
は取込まれると直ちに切断されて真正なＤＮＡ合成を与
えない。第５図に示したように、テンプレートとして交
互共重合体ポリｄ（ＡＴ）を用いることにより、原Ｔ７
ＤＮＡポリメラーゼはｄＡＴＰの存在下にのみ長大なＤ
ＮＡ合成を触媒するが、エテノ−ｄＡＴＰの存在下では
触媒しない。これに対し、修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ
は、関連エキソヌクレアーゼを欠損しているため、エテ
ノ−ｄＡＴＰをｄＡＴＰに匹敵する割合でＤＮＡ中に安
定に取込む。かくして、テンプレートとしてポリｄ（Ａ
Ｔ）を用いかつ先駆体としてｄＴＴＰ及びエテノ−ｄＡ
ＴＰを用いることにより、原Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼは
このテンプレートからＤＮＡを合成することができない
のに対し、エキソヌクレアーゼ活性を喪失したＴ７ＤＮ
Ａポリメラーゼはこのテンプレートを用いてＤＮＡを合
成することができる。
【００６０】多数のコロニーを溶菌しかつスクリーニン
グするための方法は、レッツ［プロシーディング・ナシ
ョナル・アカデミー・サイエンス、第７２巻、第２２７
４頁（１９７５）］に記載されている。要するに、突然
変異遺伝子５を含有するプラスミッドで形質転換された
Ｋ３８／ｐＧＰ１−２菌体を、これらがプレート１枚当
り約２００個のコロニーとして存在するペトリ皿から濾
紙片に移す（「レプリカプレーティング」）。この濾紙
円盤を次いで４２℃に６０分間置くことによりＴ７ＲＮ
Ａポリメラーゼを誘発させ、これは次いで遺伝子５蛋白
質を発現する。チオレドキシンはクロモソーム遺伝子か
ら構成的に生成する。リゾチームを濾紙に加えて菌体を
溶菌させる。凍結溶解工程を行なって菌体を溶菌させた
後、濾紙円盤をポリｄ（ＡＴ）、［α32Ｐ］−ｄＴＴＰ
及びエテノ−ｄＡＴＰと共に３７℃にて６０分間インキ
ュベートする。次いで、濾紙円盤を酸で洗浄して取込ま
れてない［32Ｐ］ｄＡＴＰを除去する。ＤＮＡは酸中で
濾紙上に沈澱する一方、ヌクレオチドは溶解する。次い
で、洗浄した濾紙を用いてＸ線フィルムに露出させる。
エキソヌクレアーゼを欠損した活性Ｔ７ＤＮＡポリメラ
ーゼを誘発したコロニーは酸不溶性32Ｐを取込み、かつ
放射線写真技術によって見ることができる。原Ｔ７ＤＮ
Ａポリメラーゼを発現し又はポリメラーゼ活性を欠損し
たＴ７ＤＮＡポリメラーゼを発現するコロニーは、放射
線写真には出現しない。
グするための方法は、レッツ［プロシーディング・ナシ
ョナル・アカデミー・サイエンス、第７２巻、第２２７
４頁（１９７５）］に記載されている。要するに、突然
変異遺伝子５を含有するプラスミッドで形質転換された
Ｋ３８／ｐＧＰ１−２菌体を、これらがプレート１枚当
り約２００個のコロニーとして存在するペトリ皿から濾
紙片に移す（「レプリカプレーティング」）。この濾紙
円盤を次いで４２℃に６０分間置くことによりＴ７ＲＮ
Ａポリメラーゼを誘発させ、これは次いで遺伝子５蛋白
質を発現する。チオレドキシンはクロモソーム遺伝子か
ら構成的に生成する。リゾチームを濾紙に加えて菌体を
溶菌させる。凍結溶解工程を行なって菌体を溶菌させた
後、濾紙円盤をポリｄ（ＡＴ）、［α32Ｐ］−ｄＴＴＰ
及びエテノ−ｄＡＴＰと共に３７℃にて６０分間インキ
ュベートする。次いで、濾紙円盤を酸で洗浄して取込ま
れてない［32Ｐ］ｄＡＴＰを除去する。ＤＮＡは酸中で
濾紙上に沈澱する一方、ヌクレオチドは溶解する。次い
で、洗浄した濾紙を用いてＸ線フィルムに露出させる。
エキソヌクレアーゼを欠損した活性Ｔ７ＤＮＡポリメラ
ーゼを誘発したコロニーは酸不溶性32Ｐを取込み、かつ
放射線写真技術によって見ることができる。原Ｔ７ＤＮ
Ａポリメラーゼを発現し又はポリメラーゼ活性を欠損し
たＴ７ＤＮＡポリメラーゼを発現するコロニーは、放射
線写真には出現しない。
【００６１】陽性と思われるコロニーを、初期コロニー
を含有するマスターペトリ皿から回収する。それぞれ強
力な陽性クローンを含有する菌体を大規模（１リット
ル）で誘発させ、かつＴ７ＤＮＡポリメラーゼを各調製
物から精製して各突然変異体に関連するエキソヌクレア
ーゼのレベルを確認する。エキソヌクレアーゼの低レベ
ルが、ＤＮＡ配列決定に適している。
を含有するマスターペトリ皿から回収する。それぞれ強
力な陽性クローンを含有する菌体を大規模（１リット
ル）で誘発させ、かつＴ７ＤＮＡポリメラーゼを各調製
物から精製して各突然変異体に関連するエキソヌクレア
ーゼのレベルを確認する。エキソヌクレアーゼの低レベ
ルが、ＤＮＡ配列決定に適している。
【００６２】指向性の突然変異を用いて、Ｔ７遺伝子５
蛋白質のエキソヌクレアーゼ領域における遺伝学的突然
変異種を分離することもできる。以下がこの手順の例で
ある。
蛋白質のエキソヌクレアーゼ領域における遺伝学的突然
変異種を分離することもできる。以下がこの手順の例で
ある。
【００６３】さらにエキソヌクレアーゼ活性の減少した
Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラー
ゼ）を、二次構造の領域を介して合成する能力によって
原Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼから区別することもできる。
すなわち、修飾ＤＮＡポリメラーゼを用いて、二次構造
を有するテンプレートの標識プライマーからのＤＮＡ合
成は、未修飾若しくは原ＤＮＡポリメラーゼと比較して
極めて長い伸長部をもたらす。この分析は、小パーセン
テージのＤＮＡポリメラーゼ分子から修飾型への変換の
スクリーニングに対する基礎を与える。
Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラー
ゼ）を、二次構造の領域を介して合成する能力によって
原Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼから区別することもできる。
すなわち、修飾ＤＮＡポリメラーゼを用いて、二次構造
を有するテンプレートの標識プライマーからのＤＮＡ合
成は、未修飾若しくは原ＤＮＡポリメラーゼと比較して
極めて長い伸長部をもたらす。この分析は、小パーセン
テージのＤＮＡポリメラーゼ分子から修飾型への変換の
スクリーニングに対する基礎を与える。
【００６４】上記分析を用いて、多数の化学的試薬での
処理の後に、修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼをスクリーニ
ングした。３種の反応が酵素から修飾型への変換をもた
らした。第１の反応は、上記したような鉄と還元剤とに
よる処理である。他の２種の反応は、光の存在下におけ
る光酸化性染料、すなわちローズ・ベンガル及びメチレ
ンブルーによる酵素の処理である。これらの染料は慎重
に滴定せねばならず、最適条件下においてもポリメラー
ゼ活性に対するエキソヌクレアーゼ活性の失活の特異性
は鉄誘発の酸化における高い特異性と比較して低いもの
である。これらの染料はヒスチジン残基の修飾に対し極
めて特異性であるため、これはエキソヌクレアーゼ活性
部位における必須成分としてヒスチジン残基を強力に示
唆する。
処理の後に、修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼをスクリーニ
ングした。３種の反応が酵素から修飾型への変換をもた
らした。第１の反応は、上記したような鉄と還元剤とに
よる処理である。他の２種の反応は、光の存在下におけ
る光酸化性染料、すなわちローズ・ベンガル及びメチレ
ンブルーによる酵素の処理である。これらの染料は慎重
に滴定せねばならず、最適条件下においてもポリメラー
ゼ活性に対するエキソヌクレアーゼ活性の失活の特異性
は鉄誘発の酸化における高い特異性と比較して低いもの
である。これらの染料はヒスチジン残基の修飾に対し極
めて特異性であるため、これはエキソヌクレアーゼ活性
部位における必須成分としてヒスチジン残基を強力に示
唆する。
【００６５】Ｔ７遺伝子５蛋白質には２３個のヒスチジ
ン残基が存在する。これら残基のうち８個は蛋白質のア
ミノ半部に存在し、すなわち大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉの大型断片との類似性に基づきエキソヌクレアーゼ領
域が位置する領域に存在する［オリス等、ネイチャー、
第３１３巻、第８１８頁（１９８４）］。下記するよう
に、８個のヒスチジン残基のうち７個は適当なオリゴヌ
クレオチドの合成によって個々に突然変異され、次いで
これは遺伝子５に取込まれる。これらは第１表における
突然変異種１並びに６〜１０に相当する。
ン残基が存在する。これら残基のうち８個は蛋白質のア
ミノ半部に存在し、すなわち大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉの大型断片との類似性に基づきエキソヌクレアーゼ領
域が位置する領域に存在する［オリス等、ネイチャー、
第３１３巻、第８１８頁（１９８４）］。下記するよう
に、８個のヒスチジン残基のうち７個は適当なオリゴヌ
クレオチドの合成によって個々に突然変異され、次いで
これは遺伝子５に取込まれる。これらは第１表における
突然変異種１並びに６〜１０に相当する。
【００６６】突然変異は、先ず最初にｐＧＰ５−３［タ
バー等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、
第２８２巻（１９８７）］からのＴ７遺伝子５をベクタ
ーＭ１３ ｍｐ１８のＳｍａＩ及びＨｉｎｄIII 部位に
クローン化させてｍＧＰ５−２を生成させることにより
行なわれた（用いたベクター及び遺伝子５の原料はこの
手順に臨界的でない）。一本鎖ｍＧＰ５−２ＤＮＡを、
デオキシチミジンの代りにデオキシウラシルを取込む菌
株から作成した［クンケル、プロシーディング・ナショ
ナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８２巻、第
４８８頁（１９８５）］。この手順は、野生型大腸菌に
接種した際、合成鎖（これは突然変異を含む）の生存に
対する強力な選択を与える。何故なら、ウラシルを含有
する鎖が優先的に分解するからである。
バー等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、
第２８２巻（１９８７）］からのＴ７遺伝子５をベクタ
ーＭ１３ ｍｐ１８のＳｍａＩ及びＨｉｎｄIII 部位に
クローン化させてｍＧＰ５−２を生成させることにより
行なわれた（用いたベクター及び遺伝子５の原料はこの
手順に臨界的でない）。一本鎖ｍＧＰ５−２ＤＮＡを、
デオキシチミジンの代りにデオキシウラシルを取込む菌
株から作成した［クンケル、プロシーディング・ナショ
ナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８２巻、第
４８８頁（１９８５）］。この手順は、野生型大腸菌に
接種した際、合成鎖（これは突然変異を含む）の生存に
対する強力な選択を与える。何故なら、ウラシルを含有
する鎖が優先的に分解するからである。
【００６７】突然変異種であるオリゴヌクレオチド、す
なわち長さ１５〜２０個の塩基を標準法により合成し
た。各オリゴヌクレオチドをテンプレートにアニールさ
せ、原Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、かつＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。共有結合した円
形分子をアガロースゲル電気泳動により分離し、この電
気泳動は０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムの存在下に
行なった。次いで、得られた精製分子を用いて大腸菌７
１．１８を形質転換させた。得られたプラークからのＤ
ＮＡを分離し、かつ適切な領域を配列決定して各突然変
異を確認した。
なわち長さ１５〜２０個の塩基を標準法により合成し
た。各オリゴヌクレオチドをテンプレートにアニールさ
せ、原Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し、かつＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。共有結合した円
形分子をアガロースゲル電気泳動により分離し、この電
気泳動は０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムの存在下に
行なった。次いで、得られた精製分子を用いて大腸菌７
１．１８を形質転換させた。得られたプラークからのＤ
ＮＡを分離し、かつ適切な領域を配列決定して各突然変
異を確認した。
【００６８】以下、遺伝子５エキソヌクレアーゼに遺伝
子突然変異体を発生させるために用いたオリゴヌクレオ
チドを要約する。発生した突然変異に下線を施こす。ア
ミノ酸及び塩基対のＮｏ．は、ジュン等の［ジャーナル
・モレキュラ・バイオロジー、第１６６巻、第４７７頁
（１９８３）］から採用した。突然変異した遺伝子５の
領域における適切な野生型配列をも下記に示す。
子突然変異体を発生させるために用いたオリゴヌクレオ
チドを要約する。発生した突然変異に下線を施こす。ア
ミノ酸及び塩基対のＮｏ．は、ジュン等の［ジャーナル
・モレキュラ・バイオロジー、第１６６巻、第４７７頁
（１９８３）］から採用した。突然変異した遺伝子５の
領域における適切な野生型配列をも下記に示す。
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【化２３】
【化２４】
【化２５】
【化２６】
【化２７】
【化２８】
【化２９】
【化３０】
【化３１】
【化３２】
【化３３】
【化３４】
【化３５】
【化３６】
【化３７】
【化３８】
【化３９】
【化４０】
【化４１】
【化４２】
【化４３】
【化４４】
【化４５】
【化４６】
【化４７】
【００６９】各突然変異遺伝子５蛋白を、下記するよう
にＫ３８／ｐＧＰ１−２への突然変異ファージの接種に
より生成させた。菌体を３０℃にてＡ590 ＝１．０まで
増殖させた。温度を４２℃まで３０分間上昇させて、Ｔ
７ＤＮＡポリメラーゼを誘発させた。ＩＰＴＧを０．５
ｍＭまで添加し、各ファージの溶菌物をｍｏｉ＝１０に
て添加した。接種した菌体を３７℃にて９０分間増殖さ
せた。次いで、菌体を収穫し、Ｔ７遺伝子５蛋白につき
標準法により抽出物を作成した。
にＫ３８／ｐＧＰ１−２への突然変異ファージの接種に
より生成させた。菌体を３０℃にてＡ590 ＝１．０まで
増殖させた。温度を４２℃まで３０分間上昇させて、Ｔ
７ＤＮＡポリメラーゼを誘発させた。ＩＰＴＧを０．５
ｍＭまで添加し、各ファージの溶菌物をｍｏｉ＝１０に
て添加した。接種した菌体を３７℃にて９０分間増殖さ
せた。次いで、菌体を収穫し、Ｔ７遺伝子５蛋白につき
標準法により抽出物を作成した。
【００７０】抽出物を、ホスホセルロース及びＤＥＡＥ
Ａ−５０カラムに通して部分精製し、かつ上記したよ
うにポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性を直接測
定して分析した。その結果を下記第１表に示す。
Ａ−５０カラムに通して部分精製し、かつ上記したよ
うにポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性を直接測
定して分析した。その結果を下記第１表に示す。
【表１】 Ｔ７遺伝子５突然変異種のエキソヌクレアーゼ及びポリメラーゼ活性の要約 エキソヌクレ ポリメラー 突然変異種 アーゼ活性％ ゼ活性％ 野生型 [１００]a [１００]b 突然変異種１（His 123 →Ser 123 ） １０〜２５ ＞９０ 突然変異種２（ΔSer 122、 His 123） ０．２〜０．４ ＞９０ 突然変異種３（Ser 122、 His 123→Ala 122、 Glu 123） ＜２ ＞９０ 突然変異種４（Lys 118、 Arg 119→Glu 118、 Glu 119） ＜３０ ＞９０ 突然変異種５（Arg 111、 Ser 112、 Lys 114 → ＞７５ ＞９０ Glu 111、 Ala 112、 Glu 114 ） 突然変異種６（His 59、 His 62→Ser 59、 Ser 62） ＞７５ ＞９０ 突然変異種７（His 82→Ser 62） ＞７５ ＞９０ 突然変異種８（Arg 96、 His 99→Leu 96、 Ser 99） ＞７５ ＞９０ 突然変異種９（His 190 →Ser 190 ） ＞７５ ＞９０ 突然変異種１０（His 218 →Ser 218 ） ＞７５ ＞９０ 突然変異種１１（ΔLys 118、 Arg 119、 Phe 120、 ＜０．０２ ＞９０ Gly 121、 Ser 122、 His 123 ） 突然変異種１２（His 123 →Glu 123 ） ＜３０ ＞９０ 突然変異種１３ ＜３０ ＞９０ （Arg 131、 Lys 136、 Lys 140、 Lys 144、 Arg 145 → Glu 131、 Glu 136、 Glu 140、 Glu 144、 Glu 145 ） （ａ）エキソヌクレアーゼ活性は、一本鎖［Ｈ3 ］Ｔ７
ＤＮＡにつき測定した。１００％エキソヌクレアーゼ活
性は、５，０００単位／ｍｇに相当する。 （ｂ）ポリメラーゼ活性は、一本鎖牛胸腺ＤＮＡを用い
て測定した。１００％ポリメラーゼ活性は８，０００単
位／ｍｇに相当する。
ＤＮＡにつき測定した。１００％エキソヌクレアーゼ活
性は、５，０００単位／ｍｇに相当する。 （ｂ）ポリメラーゼ活性は、一本鎖牛胸腺ＤＮＡを用い
て測定した。１００％ポリメラーゼ活性は８，０００単
位／ｍｇに相当する。
【００７１】試験した７種のヒスチジンのうち１種（Ｈ
ｉｓ１２３：突然変異種１）のみが、修飾Ｔ７ＤＮＡポ
リメラーゼの特徴である酵素活性を有した。Ｔ７遺伝子
５蛋白を、ＤＥＡＥセルロース、ホスホセルロース、Ｄ
ＥＡＥ−セファデックス及びヒドロキシルアパタイトク
ロマトグラフィーを用いてこの突然変異種から精製し
た。ポリメラーゼ活性はほぼ正常であったが（原酵素の
＞９０％レベル）、このエキソヌクレアーゼ活性は４〜
１０倍低下した。
ｉｓ１２３：突然変異種１）のみが、修飾Ｔ７ＤＮＡポ
リメラーゼの特徴である酵素活性を有した。Ｔ７遺伝子
５蛋白を、ＤＥＡＥセルロース、ホスホセルロース、Ｄ
ＥＡＥ−セファデックス及びヒドロキシルアパタイトク
ロマトグラフィーを用いてこの突然変異種から精製し
た。ポリメラーゼ活性はほぼ正常であったが（原酵素の
＞９０％レベル）、このエキソヌクレアーゼ活性は４〜
１０倍低下した。
【００７２】Ｈｉｓ１２３とＳｅｒ１２２との両者が欠
失したこの突然変異種の変種を作成した。この突然変異
種から精製された遺伝子５蛋白は２００〜５００倍低い
エキソヌクレアーゼ活性を有し、これもポリメラーゼ活
性の＞９０％を保持した。
失したこの突然変異種の変種を作成した。この突然変異
種から精製された遺伝子５蛋白は２００〜５００倍低い
エキソヌクレアーゼ活性を有し、これもポリメラーゼ活
性の＞９０％を保持した。
【００７３】これらのデータは、Ｈｉｓ１２３がＴ７遺
伝子５蛋白のエキソヌクレアーゼ領域の活性部位に存在
することを強力に示唆する。さらに、Ｈｉｓ１２３は実
際に、鉄、酸素及び還元剤を含む酸化により修飾された
残基であると思われる。何故なら、この種の酸化は他の
蛋白においてヒスチジン残基を修飾することが示されて
いるからである［レビン、ジャーナル・バイオロジカル
・ケミストリー、第２５８巻、第１１８２３頁（１９８
３）；及びホジソン等、バイオケミストリー、第１４
巻、第５２９４頁（１９７５）］。突然変異種１１にお
ける残存エキソヌクレアーゼのレベルは、化学修飾によ
り得られるレベルに匹敵する。
伝子５蛋白のエキソヌクレアーゼ領域の活性部位に存在
することを強力に示唆する。さらに、Ｈｉｓ１２３は実
際に、鉄、酸素及び還元剤を含む酸化により修飾された
残基であると思われる。何故なら、この種の酸化は他の
蛋白においてヒスチジン残基を修飾することが示されて
いるからである［レビン、ジャーナル・バイオロジカル
・ケミストリー、第２５８巻、第１１８２３頁（１９８
３）；及びホジソン等、バイオケミストリー、第１４
巻、第５２９４頁（１９７５）］。突然変異種１１にお
ける残存エキソヌクレアーゼのレベルは、化学修飾によ
り得られるレベルに匹敵する。
【００７４】Ｈｉｓ残基における突然変異につき説明し
たが、近接部位或いは遠隔部位における突然変異も、た
とえばＬｙｓ及びＡｒｇのように本発明に適した突然変
異酵素を産生することができる（突然変異種４及び１
５）。同様に、或る種のＨｉｓ残基における突然変異は
エキソヌクレアーゼ活性に対し殆んど影響を持たず、こ
れはこれら残基の近傍の突然変異がエキソヌクレアーゼ
活性に影響を与えないことを必ずしも示すものでない。
たが、近接部位或いは遠隔部位における突然変異も、た
とえばＬｙｓ及びＡｒｇのように本発明に適した突然変
異酵素を産生することができる（突然変異種４及び１
５）。同様に、或る種のＨｉｓ残基における突然変異は
エキソヌクレアーゼ活性に対し殆んど影響を持たず、こ
れはこれら残基の近傍の突然変異がエキソヌクレアーゼ
活性に影響を与えないことを必ずしも示すものでない。
【００７５】特に効果的である突然変異は、Ｈｉｓ−１
２３領域の近傍に２個若しくはそれ以上のアミノ酸、好
ましくはたとえば６〜８個のアミノ酸を欠失したものを
包含する。他の突然変異は、さらに又は完全にエキソヌ
クレアーゼ活性を低下する筈である。
２３領域の近傍に２個若しくはそれ以上のアミノ酸、好
ましくはたとえば６〜８個のアミノ酸を欠失したものを
包含する。他の突然変異は、さらに又は完全にエキソヌ
クレアーゼ活性を低下する筈である。
【００７６】これら突然変異株の使用の例として、次の
ものが例示される。ｐＧＰ５−６（突然変異株１１）を
含有する菌株は、ＡＴＣＣに寄託されている（下記参
照）。この菌株は、上記したように増殖させかつタバー
等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２
６２巻、第１６２１２頁（１９８７）に記載したように
誘発させた。Ｋ３８／ｐＴｒｘ−２菌体を添加して、遺
伝学的に修飾されたＴ７ＤＮＡポリメラーゼの収率を増
大させることができる。
ものが例示される。ｐＧＰ５−６（突然変異株１１）を
含有する菌株は、ＡＴＣＣに寄託されている（下記参
照）。この菌株は、上記したように増殖させかつタバー
等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２
６２巻、第１６２１２頁（１９８７）に記載したように
誘発させた。Ｋ３８／ｐＴｒｘ−２菌体を添加して、遺
伝学的に修飾されたＴ７ＤＮＡポリメラーゼの収率を増
大させることができる。
【００７７】さらに上記の寄託菌株は、Ｔ７ＲＮＡポリ
メラーゼを発現するプラスミッドｐＧＰ１−２を含有す
る。このプラスミッドはタバー等、プロシーディング・
ナショナル・アカデミー・サイエンス・ＵＳＡ、第８２
巻、第１０７４頁（１９８５）に記載されており、１９
８５年３月２２日付けでＡＴＣＣに寄託しかつ受託番号
４０，１７５が付与された。
メラーゼを発現するプラスミッドｐＧＰ１−２を含有す
る。このプラスミッドはタバー等、プロシーディング・
ナショナル・アカデミー・サイエンス・ＵＳＡ、第８２
巻、第１０７４頁（１９８５）に記載されており、１９
８５年３月２２日付けでＡＴＣＣに寄託しかつ受託番号
４０，１７５が付与された。
【００７８】第１０図を参照して、ｐＧＰ５−６は次の
セグメントを含む： １．Ｍ１３ｍｐ１０（２１ｂｐ）からのＥｃｏＲＩ−Ｓ
ａｃＩ−ＳｍａＩ−ＢａｍＨＩポリリンカー配列。 ２．次の修飾を伴ってＴ７遺伝子５を含有するＴ７ｂｐ
１４３０９〜１６７４７：Ｔ７ｂｐ１４７０３はＡから
Ｇまで変化されて、ＳｍａＩ部位を形成する。Ｔ７ｂｐ
１４３０４〜１４３２１は欠損している（１８ｂｐ）。 ３．Ｍ１３ｍｐ１０（１５ｂｐ）からのＳａｌＩ−Ｐｓ
ｔＩ−ＨｉｎｄIII ポリリンカー配列。 ４．ｐＢＲ３２２ ｂｐ２９（ＨｉｎｄIII 部位）〜ｐ
ＢＲ３２２ ｂｐ３７５（ＢａｍＨＩ部位）。 ５．Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターφ１０を含有
するＴ７ｂｐ２２８５５〜Ｔ７ｂｐ２２９２７であり、
これらはＢａｍＨＩリンカーが各末端に挿入されている
（８２ｂｐ）。 ６．ｐＢＲ３２２ ｂｐ３７５（ＢａｍＨＩ部位）〜ｐ
ＢＲ３２２ ｂｐ４３６１（ＥｃｏＲＩ部位）。
セグメントを含む： １．Ｍ１３ｍｐ１０（２１ｂｐ）からのＥｃｏＲＩ−Ｓ
ａｃＩ−ＳｍａＩ−ＢａｍＨＩポリリンカー配列。 ２．次の修飾を伴ってＴ７遺伝子５を含有するＴ７ｂｐ
１４３０９〜１６７４７：Ｔ７ｂｐ１４７０３はＡから
Ｇまで変化されて、ＳｍａＩ部位を形成する。Ｔ７ｂｐ
１４３０４〜１４３２１は欠損している（１８ｂｐ）。 ３．Ｍ１３ｍｐ１０（１５ｂｐ）からのＳａｌＩ−Ｐｓ
ｔＩ−ＨｉｎｄIII ポリリンカー配列。 ４．ｐＢＲ３２２ ｂｐ２９（ＨｉｎｄIII 部位）〜ｐ
ＢＲ３２２ ｂｐ３７５（ＢａｍＨＩ部位）。 ５．Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターφ１０を含有
するＴ７ｂｐ２２８５５〜Ｔ７ｂｐ２２９２７であり、
これらはＢａｍＨＩリンカーが各末端に挿入されている
（８２ｂｐ）。 ６．ｐＢＲ３２２ ｂｐ３７５（ＢａｍＨＩ部位）〜ｐ
ＢＲ３２２ ｂｐ４３６１（ＥｃｏＲＩ部位）。
【００７９】修飾Ｔ７型ＤＮＡポリメラーゼを用いるＤ
ＮＡ配列決定 修飾Ｔ７型ＤＮＡポリメラーゼを用いるＤＮＡ合成反応
は、長さ数個の塩基から数千個の塩基の範囲にわたり均
一な放射能強度の連鎖停止断片をもたらす。実質上、連
鎖停止剤取込みとは無関係な部位の停止により、バック
グランドが存在しない（すなわち停止部位又は二次構造
阻害）。
ＮＡ配列決定 修飾Ｔ７型ＤＮＡポリメラーゼを用いるＤＮＡ合成反応
は、長さ数個の塩基から数千個の塩基の範囲にわたり均
一な放射能強度の連鎖停止断片をもたらす。実質上、連
鎖停止剤取込みとは無関係な部位の停止により、バック
グランドが存在しない（すなわち停止部位又は二次構造
阻害）。
【００８０】修飾Ｔ７型ＤＮＡポリメラーゼを用いる配
列決定反応はパルス及びチェースよりなっている。パル
スとは短い標識ＤＮＡ断片が合成されることを意味し、
またチェースという用語は短い断片が連鎖停止剤を取込
むまで伸長されることを意味する。各工程の意味は、慣
用のＤＮＡ配列決定反応とは異なっている。パルスにお
いて、反応物は高レベルの３種のヌクレオチド三リン酸
（たとえばｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）及び制限
レベルの１種の他の標識されたキャリヤフリーのヌクレ
オチド三リン酸（たとえば［35Ｓ］ｄＡＴＰ）の存在下
で０〜３７℃にて０．５〜４分間インキュベートされ
る。これらの条件下で、修飾ポリメラーゼはそのプロセ
ッシブ特性を示すことができず、かつ放射性断片の量は
数個の塩基〜数１００個の塩基の寸法範囲にわたって合
成される。パルスの目的は各プライマーを放射能標識し
かつ最大放射能を取込み、その際最小レベルの放射性ヌ
クレオチドを用いることにある。この例において、パル
ス反応における２つの条件（低温度、たとえば０〜２０
℃及び制限レベルのｄＡＴＰ、たとえば０．１μＭ〜１
μＭは、修飾Ｔ７型ＤＮＡポリメラーゼがそのプロセッ
シブ特性を示さないようにする。この混合物の他の必須
環境要件は同様な作用を有したとえば１種より多くヌク
レオチド三リン酸を制限し或いは反応のイオン強度を増
大する。プライマーが既に標識されていれば（たとえば
キナーゼによる）、パルス工程は必要でない。
列決定反応はパルス及びチェースよりなっている。パル
スとは短い標識ＤＮＡ断片が合成されることを意味し、
またチェースという用語は短い断片が連鎖停止剤を取込
むまで伸長されることを意味する。各工程の意味は、慣
用のＤＮＡ配列決定反応とは異なっている。パルスにお
いて、反応物は高レベルの３種のヌクレオチド三リン酸
（たとえばｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）及び制限
レベルの１種の他の標識されたキャリヤフリーのヌクレ
オチド三リン酸（たとえば［35Ｓ］ｄＡＴＰ）の存在下
で０〜３７℃にて０．５〜４分間インキュベートされ
る。これらの条件下で、修飾ポリメラーゼはそのプロセ
ッシブ特性を示すことができず、かつ放射性断片の量は
数個の塩基〜数１００個の塩基の寸法範囲にわたって合
成される。パルスの目的は各プライマーを放射能標識し
かつ最大放射能を取込み、その際最小レベルの放射性ヌ
クレオチドを用いることにある。この例において、パル
ス反応における２つの条件（低温度、たとえば０〜２０
℃及び制限レベルのｄＡＴＰ、たとえば０．１μＭ〜１
μＭは、修飾Ｔ７型ＤＮＡポリメラーゼがそのプロセッ
シブ特性を示さないようにする。この混合物の他の必須
環境要件は同様な作用を有したとえば１種より多くヌク
レオチド三リン酸を制限し或いは反応のイオン強度を増
大する。プライマーが既に標識されていれば（たとえば
キナーゼによる）、パルス工程は必要でない。
【００８１】チェースにおいては、反応物を高レベル
（５０〜５００μＭ）の４種の全デオキシヌクレオシド
三リン酸と制限レベル（１〜５０μＭ）の４種の連鎖停
止剤の間の任意の１種（たとえばジデオキシヌクレオシ
ド三リン酸）との存在下で４５℃にて１〜３０分間イン
キュベートし、ＤＮＡ合成を平均して５０〜６００塩基
の後に停止させる。チェースの目的は、各放射能標識さ
れたプライマーをプロセッシブＤＮＡ合成の条件下で伸
長させて各伸長を専ら４種の別の反応にて正確な部位で
停止させることであり、その際４種のジデオキシヌクレ
オシド三リン酸のそれぞれを用いる。チェースの２つの
条件、すなわち高温度（たとえば３０〜５０℃）及び高
レベル（５０μＭより高い）の４種の全デオキシヌクレ
オシド三リン酸の条件は、修飾Ｔ７型ＤＮＡポリメラー
ゼが数万個の塩基につきそのプロセッシブ特性を示すこ
とを可能にする。かくして、同じポリメラーゼ分子は、
ジデオキシヌクレオチドが取込まれるまでプライマー−
テンプレートから合成される。４５℃のチェース温度に
おいて、合成は＞７００ヌクレオチド／ｓｅｃ．にて生
ずる。かくして、配列決定反応につき、チェースは１秒
以内に完結する。ｓｓｂは、たとえばｄＩＴＰを用いる
場合に或いは低温度若しくは高イオン強度を用いる場合
に或いは配列決定反応全体にわたり低レベルの三リン酸
を用いる場合にプロセッシビティを増大させる。
（５０〜５００μＭ）の４種の全デオキシヌクレオシド
三リン酸と制限レベル（１〜５０μＭ）の４種の連鎖停
止剤の間の任意の１種（たとえばジデオキシヌクレオシ
ド三リン酸）との存在下で４５℃にて１〜３０分間イン
キュベートし、ＤＮＡ合成を平均して５０〜６００塩基
の後に停止させる。チェースの目的は、各放射能標識さ
れたプライマーをプロセッシブＤＮＡ合成の条件下で伸
長させて各伸長を専ら４種の別の反応にて正確な部位で
停止させることであり、その際４種のジデオキシヌクレ
オシド三リン酸のそれぞれを用いる。チェースの２つの
条件、すなわち高温度（たとえば３０〜５０℃）及び高
レベル（５０μＭより高い）の４種の全デオキシヌクレ
オシド三リン酸の条件は、修飾Ｔ７型ＤＮＡポリメラー
ゼが数万個の塩基につきそのプロセッシブ特性を示すこ
とを可能にする。かくして、同じポリメラーゼ分子は、
ジデオキシヌクレオチドが取込まれるまでプライマー−
テンプレートから合成される。４５℃のチェース温度に
おいて、合成は＞７００ヌクレオチド／ｓｅｃ．にて生
ずる。かくして、配列決定反応につき、チェースは１秒
以内に完結する。ｓｓｂは、たとえばｄＩＴＰを用いる
場合に或いは低温度若しくは高イオン強度を用いる場合
に或いは配列決定反応全体にわたり低レベルの三リン酸
を用いる場合にプロセッシビティを増大させる。
【００８２】［α35Ｓ］ｄＡＴＰ、［α32Ｐ］ｄＡＴＰ
又は蛍光標識されたヌクレオチドのいずれかを、修飾Ｔ
７型ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ配列決定反応に使
用することができる。蛍光性アナログがプライマーの
５’末端に存在する場合、パルス工程は必要でない。
又は蛍光標識されたヌクレオチドのいずれかを、修飾Ｔ
７型ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ配列決定反応に使
用することができる。蛍光性アナログがプライマーの
５’末端に存在する場合、パルス工程は必要でない。
【００８３】２種の因子が合成反応の平均した伸長を決
定する。第１の因子はパルス反応の時間の長さである。
パルスは連鎖停止剤の不存在下に行なわれるので、パル
ス反応時間が長い程、プライマー伸長も長くなる。０℃
において、ポリメラーゼ伸長は平均１０ヌクレオチド／
ｓｅｃ．となる。第２の因子は、チェース反応における
連鎖停止剤に対するデオキシヌクレオシド三リン酸の比
である。修飾Ｔ７型ＤＮＡポリメラーゼはこれらアナロ
グの取込みを区別せず、したがってチェースにおける平
均伸長の長さはチェース反応における連鎖停止剤濃度に
対するデオキシヌクレオシド三リン酸濃度の比の４倍で
ある。したがって、伸長の平均寸法を短縮するには、パ
ルス時間をたとえば３０秒まで短縮しかつ／又はデオキ
シヌクレオシド三リン酸濃度に対する連鎖停止剤の比を
チェース反応において上昇させる。これは、連鎖停止剤
の濃度を増大させるか又はデオキシヌクレオシド三リン
酸の濃度を低下させて行なうことができる。伸長の平均
長さを増大させるには、パルス時間をたとえば３〜４分
間まで増大させかつ／又は連鎖停止剤の濃度をチェース
反応にて低下させる（たとえば２０μＭから２μＭま
で）。
定する。第１の因子はパルス反応の時間の長さである。
パルスは連鎖停止剤の不存在下に行なわれるので、パル
ス反応時間が長い程、プライマー伸長も長くなる。０℃
において、ポリメラーゼ伸長は平均１０ヌクレオチド／
ｓｅｃ．となる。第２の因子は、チェース反応における
連鎖停止剤に対するデオキシヌクレオシド三リン酸の比
である。修飾Ｔ７型ＤＮＡポリメラーゼはこれらアナロ
グの取込みを区別せず、したがってチェースにおける平
均伸長の長さはチェース反応における連鎖停止剤濃度に
対するデオキシヌクレオシド三リン酸濃度の比の４倍で
ある。したがって、伸長の平均寸法を短縮するには、パ
ルス時間をたとえば３０秒まで短縮しかつ／又はデオキ
シヌクレオシド三リン酸濃度に対する連鎖停止剤の比を
チェース反応において上昇させる。これは、連鎖停止剤
の濃度を増大させるか又はデオキシヌクレオシド三リン
酸の濃度を低下させて行なうことができる。伸長の平均
長さを増大させるには、パルス時間をたとえば３〜４分
間まで増大させかつ／又は連鎖停止剤の濃度をチェース
反応にて低下させる（たとえば２０μＭから２μＭま
で）。
【００８４】例２：修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼを用い
るＤＮＡ配列決定 以下は、停止剤としてジデオキシヌクレオチドを用いる
配列決定法の例である。
るＤＮＡ配列決定 以下は、停止剤としてジデオキシヌクレオチドを用いる
配列決定法の例である。
【００８５】０．７ｍＭの濃度における９μｌの一本鎖
Ｍ１３ＤＮＡ（ｍＧＰ１−２、常法により作成）を１μ
ｌの相補配列決定用プライマー（標準的な普遍性１７量
体、０．５ｐモルプライマー／μｌ）及び２．５μｌの
５×アニーリング緩衝液（２００ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ）と混合し、６
５℃まで３分間加熱しかつ３０分間かけて室温まで徐々
に冷却した。パルス反応において、１２．５μｌの上記
アニール混合物を１μｌのジチオスレイトール０．１
Ｍ、２μｌの３ｄＮＴＰ（ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴ
Ｐのそれぞれ３ｍＭ）［テネシー州、Ｐ．Ｌ．バイオケ
ミカルス社］、２．５μｌの［α35Ｓ］ｄＡＴＰ（１，
５００Ｃｉ／ミリモル、ニュー・イングランド・ヌクレ
ア社）及び１μｌの例１に記載された修飾Ｔ７ＤＮＡポ
リメラーゼ（０．４ｍｇ／ｍｌ、２，５００単位／ｍ
ｌ、すなわち０．４μｇ、２．５単位）と混合し、ボル
テックスミキサーにかけた後、０℃にて２分間インキュ
ベートしかつ微量遠心分離器にて１秒間遠心分離した。
インキュベーション時間は３０秒間〜２０分間まで変化
することができ、温度は０℃〜３７℃まで変化すること
ができる。プライマーから離間した配列を決定するには
より長時間を用いる。
Ｍ１３ＤＮＡ（ｍＧＰ１−２、常法により作成）を１μ
ｌの相補配列決定用プライマー（標準的な普遍性１７量
体、０．５ｐモルプライマー／μｌ）及び２．５μｌの
５×アニーリング緩衝液（２００ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ）と混合し、６
５℃まで３分間加熱しかつ３０分間かけて室温まで徐々
に冷却した。パルス反応において、１２．５μｌの上記
アニール混合物を１μｌのジチオスレイトール０．１
Ｍ、２μｌの３ｄＮＴＰ（ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴ
Ｐのそれぞれ３ｍＭ）［テネシー州、Ｐ．Ｌ．バイオケ
ミカルス社］、２．５μｌの［α35Ｓ］ｄＡＴＰ（１，
５００Ｃｉ／ミリモル、ニュー・イングランド・ヌクレ
ア社）及び１μｌの例１に記載された修飾Ｔ７ＤＮＡポ
リメラーゼ（０．４ｍｇ／ｍｌ、２，５００単位／ｍ
ｌ、すなわち０．４μｇ、２．５単位）と混合し、ボル
テックスミキサーにかけた後、０℃にて２分間インキュ
ベートしかつ微量遠心分離器にて１秒間遠心分離した。
インキュベーション時間は３０秒間〜２０分間まで変化
することができ、温度は０℃〜３７℃まで変化すること
ができる。プライマーから離間した配列を決定するには
より長時間を用いる。
【００８６】上記パルス反応物の４．５μｌを、チェー
ス混合物を含有する４本のチューブのそれぞれに添加し
て４５℃まで予備加熱した。４本のチューブ、すなわち
標識されたＧ、Ａ、Ｔ、Ｃのそれぞれは微量のジデオキ
シ（ｄｄ）Ｇ、Ａ、Ｔ若しくはＣ（Ｐ−Ｌバイオケミカ
ルス社）を含有する。特定のチェース溶液は下記する通
りである。各チューブは１．５μｌのｄＡＴＰ（１ｍ
Ｍ）、０．５μｌの５×アニーリング緩衝液（２００ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＭｇＣｌ
2 ）及び１．０μｌのｄｄＮＴＰ（１００μＭ）を含有
する（ここでｄｄＮＴＰは各チューブにおけるｄｄＧ、
Ａ、Ｔ若しくはＣに相当する）。各チェース反応物を４
５℃（又は３０〜５０℃）にて１０分間インキュベート
し、次いで６μｌの停止溶液（９０％ホルムアミド、１
０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％キシレンシアノール）を各
チューブに添加し、かつチューブを氷上に置いた。チェ
ース時間は１〜３０分間の範囲で変化することができ
る。
ス混合物を含有する４本のチューブのそれぞれに添加し
て４５℃まで予備加熱した。４本のチューブ、すなわち
標識されたＧ、Ａ、Ｔ、Ｃのそれぞれは微量のジデオキ
シ（ｄｄ）Ｇ、Ａ、Ｔ若しくはＣ（Ｐ−Ｌバイオケミカ
ルス社）を含有する。特定のチェース溶液は下記する通
りである。各チューブは１．５μｌのｄＡＴＰ（１ｍ
Ｍ）、０．５μｌの５×アニーリング緩衝液（２００ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＭｇＣｌ
2 ）及び１．０μｌのｄｄＮＴＰ（１００μＭ）を含有
する（ここでｄｄＮＴＰは各チューブにおけるｄｄＧ、
Ａ、Ｔ若しくはＣに相当する）。各チェース反応物を４
５℃（又は３０〜５０℃）にて１０分間インキュベート
し、次いで６μｌの停止溶液（９０％ホルムアミド、１
０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％キシレンシアノール）を各
チューブに添加し、かつチューブを氷上に置いた。チェ
ース時間は１〜３０分間の範囲で変化することができ
る。
【００８７】配列決定反応は、７Ｍ尿素における標準的
６％ポリアクリルアミド配列決定用ゲルにて３０ワット
で６時間行なった。ゲル上に走行させるに先立ち、反応
物を７５℃まで２分間加熱した。ゲルを１０％酢酸、１
０％メタノールで固定し、ゲル乾燥器で乾燥させ、かつ
コダックＯＭ１型高コントラスト放射線写真フィルムに
１晩露出した。
６％ポリアクリルアミド配列決定用ゲルにて３０ワット
で６時間行なった。ゲル上に走行させるに先立ち、反応
物を７５℃まで２分間加熱した。ゲルを１０％酢酸、１
０％メタノールで固定し、ゲル乾燥器で乾燥させ、かつ
コダックＯＭ１型高コントラスト放射線写真フィルムに
１晩露出した。
【００８８】例３：制限濃度のｄＮＴＰを用いるＤＮＡ
配列決定 この例においては、ｍＧＰ１−２ＤＮＡのＤＮＡ配列決
定分析を、制限レベルの４種の全デオキシリポヌクレオ
シド三リン酸をパルス反応で用いて行なった。この方法
は、例２の方法よりも多くの利点を有する。第１に、パ
ルス反応が完結するのに対し、前者の方法では時間経過
を中断する必要がある。この結果、本方法では反応が操
作容易である。第２に、この方法を用いれば、パルスに
おける伸長程度を調整するのが一層容易であり、かつプ
ライマー近傍の配列（最初の５０個の塩基）の標識の効
率が約１０倍増大する。
配列決定 この例においては、ｍＧＰ１−２ＤＮＡのＤＮＡ配列決
定分析を、制限レベルの４種の全デオキシリポヌクレオ
シド三リン酸をパルス反応で用いて行なった。この方法
は、例２の方法よりも多くの利点を有する。第１に、パ
ルス反応が完結するのに対し、前者の方法では時間経過
を中断する必要がある。この結果、本方法では反応が操
作容易である。第２に、この方法を用いれば、パルスに
おける伸長程度を調整するのが一層容易であり、かつプ
ライマー近傍の配列（最初の５０個の塩基）の標識の効
率が約１０倍増大する。
【００８９】７μｌの０．７５ｍＭ一本鎖Ｍ１３ＤＮＡ
（ｍＧＰ１−２）を１μｌの相補的配列決定用プライマ
ー（１７量体、０．５ｐモルプライマー／μｌ）及び２
μｌの５×アニーリング緩衝液（２００ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭＭｇＣｌ2 、２５０ｍＭ
ＮａＣｌ）と混合し、６５℃にて２分間加熱しかつ３０
分間かけて室温まで徐々に冷却した。パルス反応におい
ては１０μｌの上記アニール混合物を１μｌのジチオス
レイトール（０．１Ｍ）、２μｌの３ｄＮＴＰ（ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、それぞれ１．５μＭ）、０．
５μｌの［α35Ｓ］ｄＡＴＰ、（α１０μＭ）（約１０
μＭ、１５００Ｃｉ／ミリモル、ニュー・イングランド
・ヌクレア社）及び２μｌの修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラー
ゼ（０．１ｍｇ／ｍｌ、１，０００単位／ｍｌ、すなわ
ち０．２μｇ、２．５単位）と混合し、かつ３７℃にて
５分間インキュベートした（温度及びインキュベーショ
ン時間は２０〜４５℃かつ１〜６０分間にそれぞれ変化
させることができる）。
（ｍＧＰ１−２）を１μｌの相補的配列決定用プライマ
ー（１７量体、０．５ｐモルプライマー／μｌ）及び２
μｌの５×アニーリング緩衝液（２００ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭＭｇＣｌ2 、２５０ｍＭ
ＮａＣｌ）と混合し、６５℃にて２分間加熱しかつ３０
分間かけて室温まで徐々に冷却した。パルス反応におい
ては１０μｌの上記アニール混合物を１μｌのジチオス
レイトール（０．１Ｍ）、２μｌの３ｄＮＴＰ（ｄＧＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、それぞれ１．５μＭ）、０．
５μｌの［α35Ｓ］ｄＡＴＰ、（α１０μＭ）（約１０
μＭ、１５００Ｃｉ／ミリモル、ニュー・イングランド
・ヌクレア社）及び２μｌの修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラー
ゼ（０．１ｍｇ／ｍｌ、１，０００単位／ｍｌ、すなわ
ち０．２μｇ、２．５単位）と混合し、かつ３７℃にて
５分間インキュベートした（温度及びインキュベーショ
ン時間は２０〜４５℃かつ１〜６０分間にそれぞれ変化
させることができる）。
【００９０】３．５μｌの上記パルス反応物を、チェー
ス混合物を含有する３７℃まで予備加熱された４本のチ
ューブのそれぞれに添加した。４本のチューブ、すなわ
ち標識Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃのそれぞれは微量のジデオキシ
Ｇ、Ａ、Ｔ若しくはＣを含有した。特定のチェース溶液
は下記する通りである。各チューブは０．５μｌの５×
アニーリング緩衝液（２００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
７．５、５０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ）と１μｌの４ｄＮＴＰ（ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、それぞれ２００μＭ）と１．０μｌの
ｄｄＮＴＰ（２０μＭ）とを含有する。各チェース反応
物を３７℃にて５分間（又はそれぞれ２０〜４５℃にて
１〜６０分間）インキュベートし、次いで４μｌの停止
溶液（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．
０５％キシレン−シアノール）を各チューブに添加し、
そしてこのチューブを氷上に載置した後、上記と同様に
標準ポリアクリルアミド配列決定用ゲルで操作した。
ス混合物を含有する３７℃まで予備加熱された４本のチ
ューブのそれぞれに添加した。４本のチューブ、すなわ
ち標識Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃのそれぞれは微量のジデオキシ
Ｇ、Ａ、Ｔ若しくはＣを含有した。特定のチェース溶液
は下記する通りである。各チューブは０．５μｌの５×
アニーリング緩衝液（２００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
７．５、５０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ）と１μｌの４ｄＮＴＰ（ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、それぞれ２００μＭ）と１．０μｌの
ｄｄＮＴＰ（２０μＭ）とを含有する。各チェース反応
物を３７℃にて５分間（又はそれぞれ２０〜４５℃にて
１〜６０分間）インキュベートし、次いで４μｌの停止
溶液（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．
０５％キシレン−シアノール）を各チューブに添加し、
そしてこのチューブを氷上に載置した後、上記と同様に
標準ポリアクリルアミド配列決定用ゲルで操作した。
【００９１】例４：ＤＮＡ配列決定に対するｄＩＴＰに
よるｄＧＴＰの置換 ＤＮＡにおける圧縮領域、すなわち圧縮二次構造を有す
る領域に対する配列決定を行なうには、ｄＩＴＰ［ミル
ス等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サ
イエンス、第７６巻、第２２３２頁（１９７９）］又は
デアザグアノシン三リン酸［デアザＧＴＰ、ミズサワ
等、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第１４巻、第
１３１９頁（１９８６）］を用いるのが共通している。
両アナログはＴ７型ポリメラーゼを用いて、特にｓｓｂ
の存在下でｄＩＴＰを用いて良好に機能する。好ましく
は、これらの反応は上記の遺伝学的に修飾したＴ７ポリ
メラーゼを用いて行なうことができ、或いはチェース反
応は１〜２分間及び（又は）２０℃で行なってエキソヌ
クレアーゼ分解を減少させることができる。
よるｄＧＴＰの置換 ＤＮＡにおける圧縮領域、すなわち圧縮二次構造を有す
る領域に対する配列決定を行なうには、ｄＩＴＰ［ミル
ス等、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サ
イエンス、第７６巻、第２２３２頁（１９７９）］又は
デアザグアノシン三リン酸［デアザＧＴＰ、ミズサワ
等、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第１４巻、第
１３１９頁（１９８６）］を用いるのが共通している。
両アナログはＴ７型ポリメラーゼを用いて、特にｓｓｂ
の存在下でｄＩＴＰを用いて良好に機能する。好ましく
は、これらの反応は上記の遺伝学的に修飾したＴ７ポリ
メラーゼを用いて行なうことができ、或いはチェース反
応は１〜２分間及び（又は）２０℃で行なってエキソヌ
クレアーゼ分解を減少させることができる。
【００９２】修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼは、ｄＧＴＰ
の代りにｄＩＴＰ若しくはデアザ−ＧＴＰを効果的に利
用する。両パルス及びチェース混合物においてはｄＩＴ
ＰをｄＧＴＰの代りに、ｄＧＴＰが用いられる量の２〜
５倍の濃度で用いられる。ｄｄＧチェース混合物におい
ても、ｄｄＧＴＰが用いられる（ｄｄＩＴＰでない）。
の代りにｄＩＴＰ若しくはデアザ−ＧＴＰを効果的に利
用する。両パルス及びチェース混合物においてはｄＩＴ
ＰをｄＧＴＰの代りに、ｄＧＴＰが用いられる量の２〜
５倍の濃度で用いられる。ｄｄＧチェース混合物におい
ても、ｄｄＧＴＰが用いられる（ｄｄＩＴＰでない）。
【００９３】ｄＩＴＰを用いるチェース反応は、エキソ
ヌクレアーゼ活性の残留低レベル（約０．０１単位）に
対し感受性である。この問題を回避するには、チェース
反応時間を、ｄＩＴＰを用いる場合は５分間を越えては
ならない。４種のｄＩＴＰ反応はｄＧＴＰを用いる４種
の反応を排除せずにこれらと組合せて行なうことが推奨
される。ｄＧＴＰ及びｄＩＴＰの両者を一般に用いれ
ば、次のことにより所要混合物の数を最少化することが
できる： （１）チェース混合物からｄＧＴＰ及びｄＩＴＰを残
し、これは４種のチェース混合物を両ｄＧＴＰ及びｄＩ
ＴＰチェース反応に使用しうることを意味する。（２）
高濃度のｄＧＴＰ若しくはｄＩＴＰ（それぞれ０．５ｍ
Ｍ及び１〜２．５ｍＭにて２μｌ）を適当なパルス混合
物に添加する。次いで、２種のパルス混合物はそれぞれ
低濃度のｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及び［α35Ｓ］ｄＡＴＰ及
び高濃度のｄＧＴＰ若しくはｄＩＴＰのいずれかを含有
する。この修飾は一般に配列決定反応の質に悪影響を及
ぼさず、したがってｄＧＴＰ及びｄＩＴＰの両者を用い
る反応を行なうためのパルス及びチェース混合物の所要
数を６まで低下させる。
ヌクレアーゼ活性の残留低レベル（約０．０１単位）に
対し感受性である。この問題を回避するには、チェース
反応時間を、ｄＩＴＰを用いる場合は５分間を越えては
ならない。４種のｄＩＴＰ反応はｄＧＴＰを用いる４種
の反応を排除せずにこれらと組合せて行なうことが推奨
される。ｄＧＴＰ及びｄＩＴＰの両者を一般に用いれ
ば、次のことにより所要混合物の数を最少化することが
できる： （１）チェース混合物からｄＧＴＰ及びｄＩＴＰを残
し、これは４種のチェース混合物を両ｄＧＴＰ及びｄＩ
ＴＰチェース反応に使用しうることを意味する。（２）
高濃度のｄＧＴＰ若しくはｄＩＴＰ（それぞれ０．５ｍ
Ｍ及び１〜２．５ｍＭにて２μｌ）を適当なパルス混合
物に添加する。次いで、２種のパルス混合物はそれぞれ
低濃度のｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及び［α35Ｓ］ｄＡＴＰ及
び高濃度のｄＧＴＰ若しくはｄＩＴＰのいずれかを含有
する。この修飾は一般に配列決定反応の質に悪影響を及
ぼさず、したがってｄＧＴＰ及びｄＩＴＰの両者を用い
る反応を行なうためのパルス及びチェース混合物の所要
数を６まで低下させる。
【００９４】配列決定反応は例３と同様であるが、ただ
しパルス混合物の２種は（ａ）ｄＧＴＰにつき３ｄＮＴ
Ｐミックス（すなわち１．５ｍＭのｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ
及び１ｍＭのｄＧＴＰ）を含有し、かつ（ｂ）ｄＩＴＰ
については３ｄＮＴＰミックス（すなわち１．５μＭの
ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及び２ｍＭのｄＩＴＰ）を含有す
る。チェース反応において、ｄＧＴＰはチェース混合物
から除去され（すなわちチェース混合物は３０μＭのｄ
ＡＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰを含有しかつ４種のジデ
オキシヌクレオチドのうち１種を８μＭにて含有す
る）、かつｄＩＴＰを用いるチェース時間は５分を越え
ない。
しパルス混合物の２種は（ａ）ｄＧＴＰにつき３ｄＮＴ
Ｐミックス（すなわち１．５ｍＭのｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ
及び１ｍＭのｄＧＴＰ）を含有し、かつ（ｂ）ｄＩＴＰ
については３ｄＮＴＰミックス（すなわち１．５μＭの
ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及び２ｍＭのｄＩＴＰ）を含有す
る。チェース反応において、ｄＧＴＰはチェース混合物
から除去され（すなわちチェース混合物は３０μＭのｄ
ＡＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰを含有しかつ４種のジデ
オキシヌクレオチドのうち１種を８μＭにて含有す
る）、かつｄＩＴＰを用いるチェース時間は５分を越え
ない。
【００９５】寄託 菌株Ｋ３８／ｐＧＰ５−５／ｐＴｒｘ−２、Ｋ３８／ｐ
Ｔｒｘ−２及びＭ１３ｍＧＰ１−２はＡＴＣＣに寄託さ
れ、かつそれぞれ受託番号６７，２８７、６７，２８６
及び４０，３０３が付与されている。これらの寄託は１
９８７年１月１３日に行なった。菌株Ｋ３８／ｐＧＰ１
−２／ｐＧＰ５−６はＡＴＣＣに１９８７年１２月４日
付けで寄託し、受託番号６７５７１が付与されている。
Ｔｒｘ−２及びＭ１３ｍＧＰ１−２はＡＴＣＣに寄託さ
れ、かつそれぞれ受託番号６７，２８７、６７，２８６
及び４０，３０３が付与されている。これらの寄託は１
９８７年１月１３日に行なった。菌株Ｋ３８／ｐＧＰ１
−２／ｐＧＰ５−６はＡＴＣＣに１９８７年１２月４日
付けで寄託し、受託番号６７５７１が付与されている。
【００９６】本出願人は、これらの培養物が培養物に要
求された５年後又は３０年間のいずれか長い方の特許権
の期間前に死滅した場合には、これら培養物を交換する
責任を認めかつ第三者に対し寄託物を特許期間中に随時
利用しうるよう責任を負う。
求された５年後又は３０年間のいずれか長い方の特許権
の期間前に死滅した場合には、これら培養物を交換する
責任を認めかつ第三者に対し寄託物を特許期間中に随時
利用しうるよう責任を負う。
【００９７】他の具体例 その他の具体例につき下記に説明する。本発明の修飾Ｄ
ＮＡポリメラーゼの他の用途は、そのプロセッシビティ
を利用しかつエキソヌクレアーゼ活性を欠損したものに
ついては、ゲノムＤＮＡ配列の直接的酵素増幅を包含す
る。これはサイキ等により他のポリメラーゼにつき記載
されている［サイエンス、第２３０巻、第１３５０頁
（１９８５）；及びシャーフ、サイエンス、第２３３
巻、第１０７６頁（１９８６）］。
ＮＡポリメラーゼの他の用途は、そのプロセッシビティ
を利用しかつエキソヌクレアーゼ活性を欠損したものに
ついては、ゲノムＤＮＡ配列の直接的酵素増幅を包含す
る。これはサイキ等により他のポリメラーゼにつき記載
されている［サイエンス、第２３０巻、第１３５０頁
（１９８５）；及びシャーフ、サイエンス、第２３３
巻、第１０７６頁（１９８６）］。
【００９８】第６図を参照して、特定ＤＮＡ領域の酵素
的増幅は、問題とする領域における二重鎖ＤＮＡ配列の
対向鎖にアニールする２種のプライマーを使用し、その
３’末端が互いに指向する（矢印参照）実際の方法は変
性、アニーリング及びＤＮＡ合成の複数サイクル（１０
〜４０回、好ましくは１６〜２０回）を含む。この方法
を用いて、ヒトゲノムＤＮＡの特定領域を２００，００
０倍以上増幅することができる。その結果、特定遺伝子
断片は最初の１，０００，０００部中１部でなく５部中
約１部となる。これは、ゲノムＤＮＡのクローン化及び
直接的分析を著しく容易化させる。診断用途について
は、数週間から１〜２日まで分析をスピードアップする
ことができる。
的増幅は、問題とする領域における二重鎖ＤＮＡ配列の
対向鎖にアニールする２種のプライマーを使用し、その
３’末端が互いに指向する（矢印参照）実際の方法は変
性、アニーリング及びＤＮＡ合成の複数サイクル（１０
〜４０回、好ましくは１６〜２０回）を含む。この方法
を用いて、ヒトゲノムＤＮＡの特定領域を２００，００
０倍以上増幅することができる。その結果、特定遺伝子
断片は最初の１，０００，０００部中１部でなく５部中
約１部となる。これは、ゲノムＤＮＡのクローン化及び
直接的分析を著しく容易化させる。診断用途について
は、数週間から１〜２日まで分析をスピードアップする
ことができる。
【００９９】増幅工程が長さ２００塩基の断片に限られ
るクレノー断片と異なり、修飾Ｔ７型ＤＮＡポリメラー
ゼは、好ましくは一本鎖ＤＮＡの「スナップバック形
成」を防止するための大腸菌ＤＮＡ結合蛋白若しくはｓ
ｓｂと組合せて長さ数千個の塩基のＤＮＡ断片の増幅を
可能にする。
るクレノー断片と異なり、修飾Ｔ７型ＤＮＡポリメラー
ゼは、好ましくは一本鎖ＤＮＡの「スナップバック形
成」を防止するための大腸菌ＤＮＡ結合蛋白若しくはｓ
ｓｂと組合せて長さ数千個の塩基のＤＮＡ断片の増幅を
可能にする。
【０１００】さらに、修飾Ｔ７型ＤＮＡポリメラーゼは
標準反応混合物に適している：たとえば（ａ）制限酵素
切断により発生したＤＮＡ断片の５’突出末端における
充填；たとえば３’突出末端を持たない一本鎖領域を有
する線状ＤＮＡ分子からの平滑末端二重鎖ＤＮＡを作成
するため；（ｂ）制限断片の３’末端を標識し、Ｓ１ヌ
クレアーゼ分析によりｍＲＮＡ開始部位をマッピングす
るため、又はマキサム及びギルバート化学修飾法を用い
てＤＮＡを配列決定するため；及び（ｃ）クローン化Ｄ
ＮＡ断片のインビトロ突然変異のため。たとえば、特定
の不整合塩基を有する化学合成されたプライマーをＤＮ
Ａテンプレートにハイブリッド化し、次いで修飾Ｔ７型
ＤＮＡポリメラーゼにより伸長化させる。このようにし
て、突然変異は永久的に合成鎖に取込まれる。ポリメラ
ーゼはＤＮＡの全長にわたりプライマーから合成するの
が有利である。これはプロセッシブＤＮＡポリメラーゼ
を用いて最も効率的に行なわれる。或いは、突然変異は
ＤＮＡ合成に際し取込みを行なわずに行なわれる（上記
参照）。この応用は、クローン化ＤＮＡ断片の特定領域
を突然変異するために用いられる。使用する酵素はエキ
ソヌクレアーゼ活性を欠損することが重要である。標準
反応混合物という用語は、ポリメラーゼ及び任意の必要
なデオキシヌクレオシド又はその他の化合物を含有する
緩衝された溶液を意味する。
標準反応混合物に適している：たとえば（ａ）制限酵素
切断により発生したＤＮＡ断片の５’突出末端における
充填；たとえば３’突出末端を持たない一本鎖領域を有
する線状ＤＮＡ分子からの平滑末端二重鎖ＤＮＡを作成
するため；（ｂ）制限断片の３’末端を標識し、Ｓ１ヌ
クレアーゼ分析によりｍＲＮＡ開始部位をマッピングす
るため、又はマキサム及びギルバート化学修飾法を用い
てＤＮＡを配列決定するため；及び（ｃ）クローン化Ｄ
ＮＡ断片のインビトロ突然変異のため。たとえば、特定
の不整合塩基を有する化学合成されたプライマーをＤＮ
Ａテンプレートにハイブリッド化し、次いで修飾Ｔ７型
ＤＮＡポリメラーゼにより伸長化させる。このようにし
て、突然変異は永久的に合成鎖に取込まれる。ポリメラ
ーゼはＤＮＡの全長にわたりプライマーから合成するの
が有利である。これはプロセッシブＤＮＡポリメラーゼ
を用いて最も効率的に行なわれる。或いは、突然変異は
ＤＮＡ合成に際し取込みを行なわずに行なわれる（上記
参照）。この応用は、クローン化ＤＮＡ断片の特定領域
を突然変異するために用いられる。使用する酵素はエキ
ソヌクレアーゼ活性を欠損することが重要である。標準
反応混合物という用語は、ポリメラーゼ及び任意の必要
なデオキシヌクレオシド又はその他の化合物を含有する
緩衝された溶液を意味する。
【図１】ベクターｐＴｒｘ−２を示す図面である。
【図２】ベクターｍＧＰ１−２を示す図面である。
【図３】ベクターｐＧＰ５−５を示す図面である。
【図４】Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼの選択的酸化を示す特
性曲線図である。
性曲線図である。
【図５】エテノ−ｄＡＴＰの存在下でＤＮＡを合成する
修飾Ｔ７ポリメラーゼの能力を示す特性曲線図である。
修飾Ｔ７ポリメラーゼの能力を示す特性曲線図である。
【図６】修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼを用いるゲノムＤ
ＮＡの酵素的増幅を示す図面である。
ＮＡの酵素的増幅を示す図面である。
【図７】ｐＴｒｘ−２のヌクレオチド配列図である。
【図８】ｐＧＰ５−５の部分のヌクレオチド配列図であ
る。
る。
【図９】ｍＧＰ１−２のヌクレオチド配列図である。
【図１０】ｍＧＰ１−２のヌクレオチド配列図（続き）
である。
である。
【図１１】ｐＧＰ５−６を示す図面である。
Claims (10)
- 【請求項１】 修飾バクテリオファージＴ７型ＤＮＡポ
リメラーゼをコードする、精製した修飾遺伝子であっ
て、前記のポリメラーゼは前記のＤＮＡポリメラーゼ活
性のために必要な任意の宿主因子と組合せたときにＤＮ
Ａ配列決定で用いるのに十分なＤＮＡポリメラーゼ活性
を含み、前記の修飾遺伝子を天然に存在するＤＮＡポリ
メラーゼの天然に存在するエキソヌクレアーゼ活性を減
じるために修飾する、上記の精製した修飾遺伝子。 - 【請求項２】 請求項１に記載の遺伝子によりコードさ
れる修飾バクテリオファージＴ７型ＤＮＡポリメラー
ゼ。 - 【請求項３】 天然に存在するＨｉｓ残基の欠失又は他
のアミノ酸による置換を有し、それにより前記のエキソ
ヌクレアーゼ活性が減じた修飾バクテリオファージＴ７
型ＤＮＡポリメラーゼをコードする、請求項１に記載の
遺伝子。 - 【請求項４】 天然に存在するＴ７ＤＮＡポリメラーゼ
の１１８位及び１２３位に対応するアミノ酸が欠失又は
他のアミノ酸によって置換された修飾バクテリオファー
ジＴ７ＤＮＡポリメラーゼをコードする、請求項１に記
載の遺伝子。 - 【請求項５】 前記の天然に存在する遺伝子がバクテリ
オファージＴ７の遺伝子５である、請求項１に記載の修
飾遺伝子。 - 【請求項６】 修飾バクテリオファージＴ７型ＤＮＡポ
リメラーゼをコードする精製した修飾遺伝子であって、
前記のポリメラーゼは、前記のＤＮＡポリメラーゼ活性
に必要な任意の宿主因子と結合したときにＤＮＡ配列決
定で用いるのに十分なＤＮＡポリメラーゼ活性を含み、
且つ前記の修飾遺伝子は、天然に存在するＤＮＡポリメ
ラーゼの天然に存在するエキソヌクレアーゼ活性を除去
するために天然に存在する遺伝子を修飾することによっ
て生じる、上記の精製した修飾遺伝子。 - 【請求項７】 修飾バクテリオファージＴ７型ＤＮＡポ
リメラーゼをコードする修飾遺伝子であって、前記のポ
リメラーゼは、前記のＤＮＡポリメラーゼ活性に必要な
任意の宿主因子と結合したときにＤＮＡ配列決定で用い
るのに十分なＤＮＡポリメラーゼ活性を含み、且つ前記
の修飾遺伝子は、天然に存在するＤＮＡポリメラーゼの
天然に存在するエキソヌクレアーゼ活性を少なくとも３
０％だけ減じるために天然に存在する遺伝子を修飾する
ことによって生じる、上記の精製した修飾遺伝子。 - 【請求項８】 ＤＮＡポリメラーゼ活性に必要な任意の
宿主因子と結合したときにＤＮＡ配列決定で用いるのに
十分なＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、天然のＤＮＡポ
リメラーゼと比較して１つ以上のアミノ酸を欠失してお
り、それによりエキソヌクレアーゼ活性が減じている、
精製した修飾バクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラー
ゼ。 - 【請求項９】 ＤＮＡポリメラーゼ活性に必要な任意の
宿主因子と結合したときにＤＮＡ配列決定で用いるのに
十分なＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、天然のＤＮＡポ
リメラーゼと比較して１つ以上のアミノ酸が天然に存在
するものと異なるアミノ酸で置換されており、それによ
りエキソヌクレアーゼ活性が減じている、精製した修飾
バクテリオファージＴ７型ＤＮＡポリメラーゼ。 - 【請求項１０】 プロセッシブ修飾ＤＮＡポリメラーゼ
をコードする修飾遺伝子であって、前記のポリメラーゼ
は前記のＤＮＡポリメラーゼ活性のために必要な任意の
宿主因子と組合せたときにＤＮＡ配列決定で用いるのに
十分なＤＮＡポリメラーゼ活性を含み、且つ天然に存在
するＤＮＡポリメラーゼの天然に存在するエキソヌクレ
アーゼ活性を減じるために天然に存在する遺伝子を修飾
することによって生じる、上記の修飾遺伝子。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/003,227 US4795699A (en) | 1987-01-14 | 1987-01-14 | T7 DNA polymerase |
| US003227 | 1987-01-14 | ||
| US132569 | 1987-12-14 | ||
| US07/132,569 US4942130A (en) | 1987-01-14 | 1987-12-14 | T7 DNA polymerase |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63003927A Division JP2584644B2 (ja) | 1987-01-14 | 1988-01-13 | Ｄｎａ配列決定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0746990A true JPH0746990A (ja) | 1995-02-21 |
Family
ID=26671499
Family Applications (7)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63003927A Expired - Lifetime JP2584644B2 (ja) | 1987-01-14 | 1988-01-13 | Ｄｎａ配列決定法 |
| JP4333525A Pending JPH0670772A (ja) | 1987-01-14 | 1992-11-19 | Ｔ７ｄｎａポリメラーゼ |
| JP4333524A Pending JPH06237765A (ja) | 1987-01-14 | 1992-11-19 | Ｔ７ｄｎａポリメラーゼ |
| JP4333528A Expired - Lifetime JP2606777B2 (ja) | 1987-01-14 | 1992-11-19 | Ｄｎａ配列決定法 |
| JP4333527A Pending JPH0746990A (ja) | 1987-01-14 | 1992-11-19 | Ｔ７ｄｎａポリメラーゼ |
| JP4333526A Pending JPH0670773A (ja) | 1987-01-14 | 1992-11-19 | Ｔ７ｄｎａポリメラーゼ |
| JP5138959A Pending JPH06141898A (ja) | 1987-01-14 | 1993-05-18 | Ｄｎａ配列決定用キット |
Family Applications Before (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63003927A Expired - Lifetime JP2584644B2 (ja) | 1987-01-14 | 1988-01-13 | Ｄｎａ配列決定法 |
| JP4333525A Pending JPH0670772A (ja) | 1987-01-14 | 1992-11-19 | Ｔ７ｄｎａポリメラーゼ |
| JP4333524A Pending JPH06237765A (ja) | 1987-01-14 | 1992-11-19 | Ｔ７ｄｎａポリメラーゼ |
| JP4333528A Expired - Lifetime JP2606777B2 (ja) | 1987-01-14 | 1992-11-19 | Ｄｎａ配列決定法 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4333526A Pending JPH0670773A (ja) | 1987-01-14 | 1992-11-19 | Ｔ７ｄｎａポリメラーゼ |
| JP5138959A Pending JPH06141898A (ja) | 1987-01-14 | 1993-05-18 | Ｄｎａ配列決定用キット |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4942130A (ja) |
| EP (5) | EP0386859B1 (ja) |
| JP (7) | JP2584644B2 (ja) |
| KR (1) | KR930005660B1 (ja) |
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| AT (2) | ATE118039T1 (ja) |
| AU (1) | AU604824B2 (ja) |
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| DD (1) | DD301731A9 (ja) |
| DE (9) | DE3751042T2 (ja) |
| DK (1) | DK13288A (ja) |
| ES (5) | ES2056366T3 (ja) |
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| RO (1) | RO107769B1 (ja) |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6384264A (ja) * | 1986-09-27 | 1988-04-14 | Toshiba Corp | 画像読取装置 |
| US4962020A (en) * | 1988-07-12 | 1990-10-09 | President And Fellows Of Harvard College | DNA sequencing |
| GB8827167D0 (en) * | 1988-11-21 | 1988-12-29 | Apothekernes Lab | In vitro mutagenesis |
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