CN1174098C

CN1174098C - Dna片段和含有该dna片段的重组载体以及应用其之后外源基因的表达方法

Info

Publication number: CN1174098C
Application number: CNB961905204A
Authority: CN
Inventors: ��ɭ; 森冈真二; 植木润
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1995-03-29
Filing date: 1996-03-28
Publication date: 2004-11-03
Anticipated expiration: 2016-03-28
Also published as: AU720681B2; JP3329822B2; CN1154141A; AU5120796A; EP0769553B1; ATE360688T1; US5801016A; EP0769553A1; DE69637041D1; WO1996030510A1; EP0769553A4

Abstract

本文公开了可大大促进外源基因表达的新DNA，它与已知的可促进外源基因表达的DNA序列不同。本发明提供了具有序列表中序列号1所示的碱基序列的分离出来的DNA片段；而且在该DNA碱基序列中，扩增、插入、缺失或置换一个或数个核苷酸，都对其下游基因的表达有促进作用。

Description

DNA片段和含有该DNA片段的重组载体以及应用其之后外源基因的表达方法

技术领域

本发明是关于对基因的表达起促进作用的新DNA片段和含有DNA片段的重组载体，以及应用其后外源基因的表达方法的。

技术背景

促进外源基因表达的技术是将基因工程技术应用于植物时最必要的技术之一。其方法之一就是利用具有能促进基因表达的碱基序列的DNA。

促进外源基因表达的碱基序列，众所周知有蓖麻的过氧化氢酶的内含子等[特开平03-103182；Tanaka et al.Nucleic Acids Res.18，6767-6770(1990)]。可是，所要的的植物种类繁多，也有必要促进生育阶段或组织器官中的外源基因的表达；因此，期待着开发可利用的能促进多种基因表达的DNA。

发明内容

因此，本发明的目的就提供一种可促进外源基因表达的新DNA，它与已知的能促进外源基因表达的DNA序列不同。

经本专利的发明者们的精心研究，完成了本发明，其发明点是通过比较稻子的磷脂酶D(以下称为“PLD”)的cDNA和稻子的染色体组DNA的碱基序列，发现了PLD的基因的内含子，而且发现了其中一个内含子对其下游基因的表达有明显促进作用。

也就是说，本发现提供了具有序列表中序列号1所示的碱基序列的分离的DNA片段以及在该碱基顺序中增加、插入、缺失或置换一个或数个核苷酸，并对其下游基因的表达有促进作用的分离的DNA片段。本发明还提供了含有上述本发明中的DNA片段和与其下游功能性连接的应表达的外源基因的重组载体。本发明还提供了外源基因的表达方法，即将本发明中上述重组载体导入宿主细胞以使上述外源基因表达出来。

通过下面的实验可以确认，本发明中的DNA片段大大促进了其下游基因的表达。因此，本发明在利用基因工程技术来使外源基因表达方面做出了很大贡献。

附图简述

图1示在本发明实施例中插入了本发明的DNA片段的pBI221的基因图的关键部位。

发明的最佳实施方案

如上所述，本发明的DNA片段具有序列表中序列号1的碱基序列。本发明的DNA片段象下述实施例中所讲的那样，通过比较稻子PLD基因的cDNA和与其相应的稻子的染色体组DNA的碱基序列来鉴定稻子PLD基因上游的(内含子区，用PCR制备含有173bp内含子序列的片段(该内含子位于上述内含子的5′端)与非编码区域相应的位置上)，并组装到载体中报告基因的上游。通过比较该报告基因的表达活性，确认了对下游基因表达起了促进作用的片段。本发明的DNA片段的碱基序列相当于序列表中序列号3所表示的稻子基因组PLD基因碱基序列的第1661～1843碱基。

还将位于稻子PLD基因上游的上述173bp内含子区序列的碱基序列以序列表的序列号4表示。序列号4所表示的序列对下游基因的表达当然具有促进作用。序列号4所表示的碱基序列相当于序列表中序列号3所表示的稻子基因组PLD基因碱基序列的第1666～第1838碱基。

本发明的DNA片段是位于稻子PLD基因上游的内含子区，通过本发明明确了其碱基序列；所以，可以采用把稻子的染色体组DNA为模板的PCR法，很容易制备出本发明的DNA片段。PCR法是基因工程领域中经常采用的方法，采用此方法要用的成套仪器市场上均可买到；因此，专业人员很容易实施此方法。在下述实施例中，详细叙述一具体实施例。

一般在具有生理作用的DNA序列中，即使增加、插入、缺失或置换一个或数个核苷酸，也可以维持其生理活性的观点，在专业人员当中正在得到广泛的承认。本发明也进行了这种修饰，而且包含对下游基因的表达有促进作用的DNA片段。也就是说，在序列表中序列号1所示的碱基序列中，增加、缺失或置换一个或数个核苷酸，而且对其下游基因的表达有促进作用的DNA片段也包括在本发明的范围内。特别是序列号1所示的碱基序列中5′末端的5碱基及3′末端的6碱基是外显子部分，所以缺失这些序列的DNA片段对基因的发现也有促进作用，这些片段也包括在本发明的范围之内。

核苷酸的扩增、插入、缺失或置换可以采用众所周知的定点突变法(例如：核酸研究，Vol.10，No.20，P6487-6500，1982)技术就可以做到；本说明书中讲的“一个或数个核苷酸”的意思就是采用定点突变法，可以增加、插入、缺失或置换的核苷酸的数量。

除了所要求的变异不一致之外，可以按下述方法用互补合成的寡核苷酸引物对应接受变异的主链噬菌体DNA进行定点突变。即以上述合成的寡核苷酸为引物给噬菌体合成互补链，用所得到的双链DNA转化成含噬菌体的宿主细菌。将转化了的细菌培养物做成琼脂培养基，使其从含有噬菌体的单一细胞形成噬菌斑。这样，理论上讲50％的新集落含有单链变异的噬菌体，剩余的50％具有原来的序列。使所得到的噬菌斑与其具有上述所要求的变异的DNA完全相同的DNA形成混合物，在与具有原来链的不相同的DNA不形成混合物的温度下，使其与激子酶处理过的合成探针形成混合物。然后，挑选出与该探针形成混合物的噬菌斑，进行培养，回收DNA。

另外，在碱基序列中，做为对下游基因的表达不丧失促进作用的置换、缺失、扩增或插入一个或数个核苷酸的方法，除了上述定点突变之外，还有用变异原处理基因的方法以及选择性地分裂基因，然后把选择出来的核苷酸除去、增加、插入或置换，并进行连接的方法。

本发明中的DNA片段对其下游基因的表达有促进作用。因此，通过把本发明中的DNA片段插到的外源基因的转录部位的5′末端，就可以促进该外源基因的表达。外源基因的表达方法在基因工程领域中已被确立。这种方法是把所希望得到的外源基因插到表达载体的克隆部位，并将其导入宿主细胞，即可使外源基因表达。而且，本发明是按着这种常规方法来使外源基因表达的，方法是将上述本发明中的DNA片段，在与该外源基因功能性连接的状态下，插到该外源基因的上游，这样来使该外源基因表达。这里所谓的本发明的片断与其应找出的下游基因“功能性连接”的意思是指插入本发明的DNA片段，与不插入该DNA片段相比，上述外源基因的表达水平增加了，并可以检测出来。本发明中的DNA即可插到待促进表达的外源基因的紧上游，也可以在本发明中的DNA与该外源基因之间夹杂其它序列。此序列的长度没有特别限定，但通常为0～1000bp左右。本发明中的DNA片段的上游虽还有启动子序列，但本发明的DNA片段即可以插到启动子的紧下游，也可以在启动子和本发明的DNA之间夹杂其它序列。该序列的长度没有特别的限定，但通常为0～1000bp左右。关键是由于插入本发明的DNA片段与未插入该DNA片段相比，对于上述外来基因的表达水平增加了，并可以检测出来，其重组载体均包括在本发明的范围内。

因知道已有载体的克隆部位的碱基序列，所以使用适当的限制酶和连接程序(根据需要)即可很容易将本发明的DNA片段插到载体中。

众所周知，在该领域中有多种这种被发现的载体，而且在市场上有销售。这些被发现的载体至少要包含在宿主细胞内进行复制的复制起点、启动子、给出用于插入外源基因的限制性酶切位点的克隆部位以及抗药性基因等的选择标记，一般包含有稳定结束复制的终止子和SD序列(宿主为细菌时)。本发明方法采用这些众所周知的被发现的任何一种载体均可。

实施例：

下面，用实施例对本发明的内容做进一步具体说明。当然，本发明不限于下述实施例。

1.米糖PLD的纯化

纯化时，请参考米糠PLD的纯化的有关文献[高野等人，日本食品工业学会志34，8-13(198)]。酶活性是以磷脂酰胆碱为底物，用胆碱氧化酶法定量测定酶反应生成的胆碱。[Imamura er al.，J.Blochem.83，677-680(1978)]，但是，PLD的酶反应是在95℃的条件下进行5分钟的热处理后停止。

也就是将1立升己烷加到100g“舆光”(コシヒカリ)稻(Oryza，Sativa)的米糠中，搅拌一昼夜，脱脂后加入由10g波里古拉鲁AT(ボリワラ-ル)(商品名：聚乙烯吡咯烷酮、GAF Chemical公司制)、500ml的1mMCaCl₂、5mM2-巯基乙醇组成的10mMTris-HCl缓冲液(pH7)，搅拌1小时，将酶提取出来。把提取液用8层纱布过滤，然后用15,000xg离心20分钟，将中层做为粗提取液。将粗提取液用硫铵处理(65％饱和)、用离心分离(15,000xg，20分钟)方法，收集生成的沉淀，将沉淀溶解后，透析到上述缓冲液中。透析后，离心，除去沉淀做为硫铵试样(画分)。

将此硫铵试样用缓冲液A(10mMTris-HCl pH7，1mM CaCl₂，1mM2-巯基乙醇)注入老化过的DEAE-纤维素[瓦特曼(ワシトマン)公司制]的色谱柱(2.0×10cm)中。用约100ml含有50mM NaCl的缓冲液A清洗，然后用120ml NaCl线性浓度梯度为50～350mM的缓冲液A洗脱。PLD用浓度约为0.2M的NaCl进行洗脱。回收代表PLD活性的级分，做为洗脱液(DEAE-纤维素)。

在洗脱液(DEAE-纤维素)中加入3M的硫铵，配成1M的硫铵溶液，用含有1M的硫铵的缓冲液A注入老化过的Phenyl sepharose色谱柱[法马西亚(フマルマシア)公司制，2.6×10cm]中。用240ml硫铵浓度梯度为1.0～0M的缓冲液A抽提。PLD用浓度约为0.1M的硫铵抽提。回收代表活性的级分，透析到缓冲液A中，做为洗脱液(Phenylsepharose)。

将洗脱液(Phenyl sepharose)用缓冲液A注入老化过的Phenylsepharose色谱柱(法马西亚(フマルマシア)公司制，2.6×10cm)中。用240ml硫铵浓度梯度为1.0～0M的缓冲液A抽提。PLD用浓度约为0.1的硫铵抽提。回收代表活性的级分，透析到缓冲液A中，做为洗脱液(Phenyl sepharose)。

将冼脱液(Phenyl sepharose)用缓冲液A注入老化过的Mono Q色谱柱(法马西亚(フマルマシア)公司制的阴离子交换柱16×10cm)，用150ml浓度梯度为50～35mM的NaCl缓冲液A洗脱。PLD用浓度为210mM～235mM的NaCl洗脱。回收代表PLD活性的级分(分画)，将此溶液透析到缓冲液A上，做为洗脱液(Mono Q 1se)。

将洗脱液(Mono Q 1st)用离心超级过滤浓缩至0.5ml，用浓度为0.1M的NaCl缓冲液A注入老化过的Superose6色谱柱[法马西亚(フマルマシア)公司制1.0×30cm]，用同样的缓冲液洗脱。推测PLD的分子量为78KDa。回收代表PLD活性的级分，做为洗脱液(Superose6)。

洗脱液(Superose6)中加入2.5ml40％的两性载体(Pharmacia.pH4.0-6.0)和蒸馏水至50ml，用Rotofore[巴伊屋拉多(バイオラツド)公司制]做等电点电泳。在2℃、12W恒定功率的条件下，电泳4个小时。PLD活性约为pH 4.9。回收代表PLD活性的级分，将此溶液透析到缓冲液A中，做为等电点电泳试样。

把等电点电泳试样用缓冲液A注入老化过的Mono Q色谱柱[法马西亚(フマルマシア)公司制0.5×5cm]，用线性浓度梯度为50～35mM的NaCl缓冲液A洗脱。PLD用浓度约为210mM和235mM的NaCl洗脱。回收代表PLD活性的2个级分，做为洗脱液(Mono Q 2nd-I、II)。

通过SDS-聚丙烯酰胺(用7.5％的丙烯酰胺制得的)电泳[laemmli(1970)]来检验洗脱液(Mono Q 2nd-I、II)的纯度。电泳后用染料考马斯亮兰R250将凝胶染色。发现洗脱液在任何情况下主带都在分子量为82KDa的位置上；洗脱液(Mono Q 2nd-II)是单一带。

通过以上纯化，洗脱液(Mono Q 2nd-I、II)的纯化倍率分别是粗洗脱液的380倍、760倍。

对2个级分进行酶的性状分析。其结果示于表1。用于测定最适宜pH值的缓冲液有醋酸钠(pH4-6)，MES-NaOH(pH5.5-7.0)，Tris-HCl(pH7-9)，均为100mM。pH值的稳定性是在25℃，各种pH值的条件下，放置30分钟后，测定其残留活性，看不出活性下降。温度的稳定性，是在4℃、25℃、37℃及50℃的各种温度条件下，放置30分钟后，测定其残留活性。在底物浓度为5mM的条件下测定底物的特异性，以酶对磷脂酰胆碱的作用为100的相对活性表示。

表1

	Nono Q 2nd-I	Nono Q 2nd-II
	Nono Q 2nd-I	Nono Q 2nd-II	Km值最适pHpH稳定性温度稳定性Ca²⁺依赖性底物特异性磷脂酰胆碱溶血磷脂酰胆碱鞘髓磷脂	0.29mM67-84-37℃≥20mM100136	0.29mM67-84-37℃≥20mM100124

2.证明纯化蛋白质是PLD

与检验纯度一样，分别用SDS-聚丙烯酰胺电泳来分离洗脱液

(Mono Q 2nd-I、II)，转移到PVDF膜[Millipore公司制]上，然后染色。切下82Kda蛋白质带，用氨基酸序列分析仪(岛津制作所.PSQ-1)来测定N末端氨基酸序列。均可分析到10个残基，序列也相同。其序列如下所述。

Val Gly Lys Gly Ala Thr Lys Val Tyr Ser

在两个活性试样中看到的82KDa蛋白质的关系虽不明确，但至少氨基酸序列等级非常相似，在制备用来制作抗体的抗原时，使用两试样的混合液是没问题的。

用SDS-聚丙烯酰胺(用7.5％的丙烯酰胺制得的)电泳来分离洗脱液(Mono Q 2nd-I、II)的混合液，用考马斯亮兰染料将凝胶染色。切下82KDa的蛋白质带，用电洗脱(25mM Tris、192mM乙氨酸、0.025％SDS、100V、10小时)回收。再用电透析(15mM碳酸氢铵、200V、5小时)除去SDS后，冷冻干燥。电洗脱、电透析时使用BIOTRAP(Schleicher和Schuell公司制)。

把用上述方法高度纯化的82KDa蛋白质每隔7天，每次50μg给兔子进行免疫，用免疫前及免疫3次后的血清、进行免疫滴定实验。在8.6×10^-3单位的PLD溶液中加入0～50μl的免疫前或免疫3次后的血清，50μl的250mMTris-HCl(pH7.0)，5μl的50mMCaCl₂，50μl的0.2％Triton X-100(商品名)和水，总量为250μl，在室温下，放置2.5个小时。加入200μl的Protein A Sepharose(Pharmacia)，在室温下缓慢振动2小时，然后离心(500xg、5分钟)测定上清液的酶活性。以不加血清时的酶活性为100％，加入20μl、50μl免疫前的血清，其酶活性分别为95％、88％、而加入20μl、50μl免疫3次后的血清，其酶活性分别为75％、30％。其结果证明了82KDa蛋白质为PLD。

3.内部氨基酸序列的测定

PLD蛋白质的片段化采用了在凝胶中电泳分离的方法[Clevelandet al，J.Biol.Chem.，252，1102(1977)]。将含有PLD蛋白质(用与2同样的方法提出的)的凝胶插到用肽分离制备的15％丙烯酰胺凝胶的电泳槽中，将PLD蛋白质量的1/10的金黄色葡萄球菌V8蛋白酶(和光纯药公司制)混合后，开始电泳。溴酚蓝到达凝胶的中央时，暂停电泳，30分钟后再开始电泳。电泳完以后转移到PVDF膜上，染色。在分子量为20、14、13、11及10KDa的位置上可以看到清晰的带型。切除分子量为20、14及13KDa的肽片段的带，用氨基酸序列分析仪测定氨基酸的序列。其序列如下所示：

20Kda Asn Tyr Phe His Gly Ser Asp Val Asn ？ Val

Leu ？ Pro Arg Asn Pro Asp Asp (Asp) ？？

Ile

14Kda Thr ？ Asn Val Gln Leu Phe Arg Ser Ile Asp

Gly Gly Ala Ala Phe Gly Phe Pro Asp Thr

Pro Glu Glu Ala Ala Lys ？ Gly Leu Val Ser

Gly

13Kda Ile Ala Met Gly Gly Tyr Gln Phe Tyr His Leu

Ala Thr Arg Gln Pro Ala Arg Gly Gln Ile His

Gly Phe Arg Met Ala Leu ？ Tyr Glu His Leu

Gly Met Leu ？ Asp Val Phe

(其中：？—表示不能确定是氨基酸的残基 ()—表示很可能是其它的氨基酸的残基。)

4.稻子未成熟的种子cDNA基因文库的制备

根据SDS苯酚法，从开花5天后的未成熟的种子中萃取出所有的RNA，并用氯化锂沉淀进行调制。Poly(A)+RNA的调制是用Oligotex-dT30(宝酒造公司制)按制造商的说明书来进行的。

把cDNA合成系统プラス[阿玛霞目(アマシヤム)公司制]、cDNA克隆系统λgt10[阿玛霞目(アマシヤム)公司制]用于cDNA克隆，但要把λZAPII载体[斯托拉塔金(ストラタジ-ン)公司制]做为克隆载体使用，把XL1-Blue做为宿主细胞使用。

5.探针的制备

利用DNA合成装置[阿甫拉依多巴依奥(アプライドバイオシステムズ)系统公司制]合成与PLD的氨基酸序列相应的寡核苷酸。其序列和与这些序列相应的氨基酸序列如下所述。

20KF 5′AAYTAYTTYCAYGG 3′

20KR1 5′RTCRTCRTCNGGRTT 3′

(其中：R表示嘌呤类A或G，Y表示嘧啶类T或C，N表示G、A、T及C中任何一种)

20KF是32种寡核苷酸的混合物，它包括了对在分子量为20KDa的肽中发现的氨基酸序列Asn Tyr Phe His Gly进行了编码的DNA碱基序列；

20KR1是128种寡核苷酸的混合物，它包括了对在分子量为20KDa的肽中发现的氨基酸序列Asn Pro Asp Asp(Asp)进行了编码的DNA碱基序列的互补链。

cDNA合成反应液总体积为10μl，参与反应的物质有10ng poly(A)+RNA，0.3μg的随机六聚体dN₆、10U的RNA酶抑制剂[RNA Guard、法马西亚(Pharmacia)公司制]、1mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP、1×PCR缓冲液(宝酒造公司制)、50mM的氯化镁以及100U的逆转录酶(M-MuLV RTase，BRL公司制)。在37℃下反应30分钟，然后在95℃下进行5分钟热处理，保持在冰上。

进行聚合酶链式反应(PCR)时，以上述cDNA为模板，20KF和20KR1为引物。反应液的总容积为50μl，参与反应的物质有10μlcDNA合成反应液，50pmol各种引物的混合物，200μM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP、1×PCR缓冲液(宝酒造公司制)及2.5U AmliTaq DNA聚合酶(宝酒造公司制)。按下述温度条件反应，反复进行30个循环；在DNA的PCR仪[拍金爱尔马·喜塔斯(パ—キンエルマ—シ—タス)公司制]中，94℃下，反应1分钟；40℃下，反应1分钟；72℃下，反应2分30秒钟。

在2％的琼脂凝胶上将PCR产物分离，用溴化乙锭染色法检测几个片段。其中一个的长度为94bp，与预想的大小相同。

从凝胶中提出PCR片段，在pUC19质粒中进行亚克隆。根据双脱氧法(该方法使用T7 sequencing成套仪器)来决定做了亚克隆的PCR片段的DNA序列。在二个引物之间发现了对预测到的氨基酸的碱基序列进行了编码的DNA碱基序列。引物之间的DNA碱基序列和其编了码的氨基酸如下所述。

C TCT GAC GTG AAC TGT GTT CTA TGC CCT CGC

Ser Asp Val Asn Cys Val Leu Cys Pro Arg

使用DNA 5′末端标记的成套仪器MEGALABEL(宝酒造公司)让同位素³²P[阿玛霞目(アマシヤム)公司制]掺入上述寡核苷酸，制成放射性寡核苷酸探针。

6.含有PLD基因的克隆的筛选

以上述放射性寡核苷酸为探针来筛选cDNA基因文库。杂交溶液是0.5M的磷酸钠缓冲液(pH7.2)，7％SDS，1mM EDTA，100μg/ml鲑鱼精子，将探针加到杂交溶液中，在45℃下，杂交16个小时。清洗液为0.3M NaCl、30mM柠檬酸钠，在45℃下，清洗2次，每次20分钟。分离阳性噬菌斑，按λZAPII克隆载体制造商给出的方法，在体外(in vivo)对pBluescript质粒[斯托拉塔金(ストラタジ—ン)公司制]进行克隆。用双脱氧法决定碱基序列的部位，存在有对3.中测定的内部氨基酸地碱基序列进行编码的区域。

7.测定5′末端区域的碱基序列

6.中所写的方法不能分离包含全长的cDNA的克隆，所以用RACE法[Edwards et al，Nucleic Acids Res.，19，5227-5232(1991)]来制备含有5′末端区的DNA片段。按着所附的说明5′-Ampli FINDER RACE Kit[固伦铁固(クロ—ンテツケ)公司制]，以按6.测定的cDNA的碱基序列为基础，合成低聚DNA，用4中所述的方法制成的mRNA为模板，进行PCR。将PCR产物克隆在PCRII载体[因毕特罗金(インビトロヅエン)公司制]上，用双脱氧法测定碱基序列。将这样决定了稻子PLD的cDNA的碱基序列及碱基序列编码，由此推测出的氨基酸序列示于序列表的序列2。译码推测是从示于序列表2的第182号碱基开始。其根据是36碱基上游存在终止密码子。

8.与PLD cDNA克隆相应的PLD染色体组克隆的分离及引物区域的鉴定

为了分离负责PLD基因的调节序列的染色体组DNA的克隆，要建立一个“舆光”稻的染色体文库；该PLD基因与在pBluescript质粒中进行克隆的按6.测定的PLD cDNA相对应。将“舆光”种子发芽长出来的叶DNA用MboI进行部分消化，通过蔗糖梯度离心分离，纯化出16～20kb的大的部分，使用λDASHII[斯托拉塔金(ストラタジ—ン)公司制]、Gigapack II Cold[斯托拉塔金(ストラタジ—ン)公司制]来建立基因文库。把PLD cDNA克隆做为探针来筛选染色体组文库。按6.所述内容进行筛选。但在65℃下，杂交16小时，用0.5×SSC、0.1％SDS的清洗液在65℃下清洗两次，每次20分钟。用双脱氧法测定杂交过的染色体组克隆的碱基序列，存在有与按6测定的cDNA序列相同的范围。

复制开始的部位用7.所述的方法测定。在复制开始的位点旁边发现了“TATA”共有序列序列框。ATG编码开始的部位通过测定DNA序列来判断，则定为克隆的译码阅读框内的最上游的ATG密码子，还有在稻子中合成的mRNA的起始存在ATG密码子。

杂交在cDNA克隆的染色体组克隆的部分DNA序列示于序列号3。在染色体组DNA中以ATG译码开始的密码子开始，鉴定了与其相应的cDNA序列重合的阅读框。启动子位于ATG编码开始密码子的上游，从紧靠其上游开始。

9.内含子的确定以及基因表达作用的分析

通过cDNA(序列号2)和染色体组(序列号3)的比较，明确了PLD的基因上有3个内含子。之后，调查了173bp内含子对发现植物细胞内的基因的影响。173bp内含子区(即序列号3中所示的碱基序列的第1666～第1838号碱基，将该序列示于序列号4)位于与mRNA的5′末端非编码区相应的位置上。合成每5个基数含有一个外显子部分的15聚体的引物(5′-ACCCGGTAAGCCCAG-3′，3′-CCCCCGCGTCCATCC-5′)，以染色体克隆为模板，采用“5.探针的制作”中所述的方法来进行PCR。将PCR产物亚克隆到PCR II载体上，将从这里用EcoRI酶切提出来的片段做平末端处理；然后装到质粒pBI221(东洋纺公司制)的SmaI位点(参照图1)。下面，根据已经报导[Shimamoto et al.Nature，338，274-276(1989)]的方法，将上述重组质粒导入稻子的培养细胞[Babaet al.Plant Cell Physiol。27，463-471(1986)]，测定β-葡萄糖苷酸酶(GUS)活性。如表2所示，发现由于内含子的导入，GUS活性增大了。如表3有所示，还发现了内含子反向进入时，GUS活性也增大。另外，利用内含子序列中的BgIII部位和pBI 221的BamHI部位，根据用双酶提出的片段的长度来决定内含子的方向。

表2 原生质体的GUS活性

质粒	GUS活性
质粒	GUS活性	pBI221	10.4
pBI221+内含子	105.7	pBI221	10.4

(pmol MU/min./mg蛋白)

表3 原生质体的GUS活性

质粒	GUS活性
质粒	GUS活性	pBI 221	8.3
pBI 221+内含子	79.4	pBI 221	8.3
pBI 221+内含子	79.4	pBI 221+内含子(反向)	54.2

(pmol MU/min./mg蛋白)

序列表

序列号：1

序列长度：183

序列类型：核酸

序列种类：基因组DNA

起源

生物名：稻

序列

ACCCGGTAAG CCCAGTGTGC TTAGGCTAAG CGCACTAGAG CTTCTTGCTC GCTTGCTTCT 60

TCTCCGCTCA GATCTGCTTG CTTGCTTGCT TCGCTAGAAC CCTACTCTGT GCTGCGAGTG 120

TCGCTGCTTC GTCTTCCTTC CTCAAGTTCG ATCTGATTGT GTGTGTGGGG GGGCGCAGGT 180

AGG 183

序列号：2

序列长度：3040

序列类型：核酸

序列种类：cDNA到mRNA

起源

生物名：稻

序列

AGTCTCTCTT CTCCCGCAAT TTTATAATCT CGATCGATCC AATCTGCTCC CCTTCTTCTT 60

CTACTCTCCC CATCTCGGCT CTCGCCATCG CCATCCTCCT CTCCCTTCCC GGAGAAGACG 120

CCTCCCTCCG CCGATCACCA CCCGGTAGGG CGAGGAGGGA GCCAAATCCA AATCAGCAGC 180

C ATG GCG CAG ATG CTG CTC CAT GGG ACG CTG CAC GCC ACC ATC TTC GAG 229

Met Ala Gln Met Leu Leu His Gly Thr Leu His Ala Thr Ile Phe Glu

1 5 10 15

GCG GCG TCG CTC TCC AAC CCG CAC CGC GCC AGC GGA AGC GCC CCC AAG 277

Ala Ala Ser Leu Ser Asn Pro His Arg Ala Ser Gly Ser Ala Pro Lys

20 25 30

TTC ATC CGC AAG TTT GTG GAG GGG ATT GAG GAC ACT GTG GGT GTC GGC 325

Phe Ile Arg Lys Phe Val Glu Gly Ile Glu Asp Thr Val Gly Val Gly

35 40 45

AAA GGC GCC ACC AAG GTG TAT TCT ACC ATT GAT CTG GAG AAA GCT CGT 373

Lys Gly Ala Thr Lys Val Tyr Ser Thr Ile Asp Leu Glu Lys Ala Arg

50 55 60

GTA GGG CGA ACT AGG ATG ATA ACC AAT GAG CCC ATC AAC CCT CGC TGG 421

Val Gly Arg Thr Arg Met Ile Thr Asn Glu Pro Ile Asn Pro Arg Trp

65 70 75 80

TAT GAG TCG TTC CAC ATC TAT TGC GCT CAT ATG GCT TCC AAT GTG ATC 469

Tyr Glu Ser Phe His Ile Tyr Cys Ala His Met Ala Ser Asn Val Ile

85 90 95

TTC ACT GTC AAG ATT GAT AAC CCT ATT GGG GCA ACG AAT ATT GGG AGG 517

Phe Thr Val Lys Ile Asp Asn Pro Ile Gly Ala Thr Asn Ile Gly Arg

100 105 110

GCT TAC CTG CCT GTC CAA GAG CTT CTC AAT GGA GAG GAG ATT GAC AGA 565

Ala Tyr Leu Pro Val Gln Glu Leu Leu Asn Gly Glu Glu Ile Asp Arg

115 120 125

TGG CTC GAT ATC TGT GAT AAT AAC CGC GAG TCT GTT GGT GAG AGC AAG 613

Trp Leu Asp Ile Cys Asp Asn Asn Arg Glu Ser Val Gly Glu Ser Lys

130 135 140

ATC CAT GTG AAG CTT CAG TAC TTC GAT GTT TCC AAG GAT CGC AAT TGG 661

Ile His Val Lys Leu Gln Tyr Phe Asp Val Ser Lys Asp Arg Asn Trp

145 150 155 160

GCG AGG GGT GTC CGC AGT ACC AAG TAT CCA GGT GTT CCT TAC ACC TTC 709

Ala Arg Gly Val Arg Ser Thr Lys Tyr Pro Gly Val Pro Tyr Thr Phe

165 170 175

TTC TCT CAG AGG CAA GGG TGC AAA GTT ACC TTG TAC CAA GAT GCT CAT 757

Phe Ser Gln Arg Gln Gly Cys Lys Val Thr Leu Tyr Gln Asp Ala His

180 185 190

GTC CCA GAC AAC TTC ATT CCA AAG ATT CCG CTT GCC GAT GGC AAG AAT 805

Val Pro Asp Asn Phe Ile Pro Lys Ile Pro Leu Ala Asp Gly Lys Asn

195 200 205

TAT GAA CCC CAC AGA TGC TGG GAG GAT ATC TTT GAT GCT ATA AGC AAT 853

Tyr Glu Pro His Arg Cys Trp Glu Asp Ile Phe Asp Ala Ile Ser Asn

210 215 220

GCT CAA CAT TTG ATT TAC ATC ACT GGC TGG TCT GTA TAC ACT GAG ATC 901

Ala Gln His Leu Ile Tyr Ile Thr Gly Trp Ser Val Tyr Thr Glu Ile

225 230 235 240

ACC TTG GTT AGG GAC TCC AAT CGT CCA AAA CCT GGA GGG GAT GTC ACC 949

Thr Leu Val Arg Asp Ser Asn Arg Pro Lys Pro Gly Gly Asp Val Thr

245 250 255

CTT GGG GAG TTG CTC AAG AAG AAG GCC AGT GAA GGT GTT CGG GTC CTC 997

Leu Gly Glu Leu Leu Lys Lys Lys Ala Ser Glu Gly Val Arg Val Leu

260 265 270

ATG CTT GTG TGG GAT GAC AGG ACT TCA GTT GGT TTG CTA AAG AGG GAT 1045

Met Leu Val Trp Asp Asp Arg Thr Ser Val Gly Leu Leu Lys Arg Asp

275 280 285

GGC TTG ATG GCA ACA CAT GAT GAG GAA ACT GAA AAT TAC TTC CAT GGC 1093

Gly Leu Met Ala Thr His Asp Glu Glu Thr Glu Asn Tyr Phe His Gly

290 295 300

TCT GAC GTG AAC TGT GTT CTA TGC CCT CGC AAC CCT GAT GAC TCA GGC 1141

Ser Asp Val Asn Cys Val Leu Cys Pro Arg Asn Pro Asp Asp Ser Gly

305 310 315 320

AGC ATT GTT CAG GAT CTG TCG ATC TCA ACT ATG TTT ACA CAC CAT CAG 1189

Ser Ile Val Gln Asp Leu Ser Ile Ser Thr Met Phe Thr His His Gln

325 330 335

AAG ATA GTA GTT GTT GAC CAT GAG TTG CCA AAC CAG GGC TCC CAA CAA 1237

Lys Ile Val Val Val Asp His Glu Leu Pro Asn Gln Gly Ser Gln Gln

340 345 350

AGG AGG ATA GTC AGT TTC GTT GGT GGC CTT GAT CTC TGT GAT GGA AGG 1285

Arg Arg Ile Val Ser Phe Val Gly Gly Leu Asp Leu Cys Asp Gly Arg

355 360 365

TAT GAC ACT CAG TAC CAT TCT TTG TTT AGG ACA CTC GAC AGT ACC CAT 1333

Tyr Asp Thr Gln Tyr His Ser Leu Phe Arg Thr Leu Asp Ser Thr His

370 375 380

CAT GAT GAC TTC CAC CAG CCA AAC TTT GCC ACT GCA TCA ATC AAA AAG 1381

His Asp Asp Phe His Gln Pro Asn Phe Ala Thr Ala Ser Ile Lys Lys

385 390 395 400

GGT GGA CCT AGA GAG CCA TGG CAT GAT ATT CAC TCA CGG CTG GAA GGG 1429

Gly Gly Pro Arg Glu Pro Trp His Asp Ile His Ser Arg Leu Glu Gly

405 410 415

CCA ATC GCA TGG GAT GTT CTT TAC AAT TTC GAG CAG AGA TGG AGA AAG 1477

Pro Ile Ala Trp Asp Val Leu Tyr Asn Phe Glu Gln Arg Trp Arg Lys

420 425 430

CAG GGT GGT AAG GAT CTC CTT CTG CAG CTC AGG GAT CTG TCT GAC ACT 1525

Gln Gly Gly Lys Asp Leu Leu Leu Gln Leu Arg Asp Leu Ser Asp Thr

435 440 445

ATT ATT CCA CCT TCT CCT GTT ATG TTT CCA GAG GAC AGA GAA ACA TGG 1573

Ile Ile Pro Pro Ser Pro Val Met Phe Pro Glu Asp Arg Glu Thr Trp

450 455 460

AAT GTT CAG CTA TTT AGA TCC ATT GAT GGT GGT GCT GCT TTT GGG TTC 1621

Asn Val Gln Leu Phe Arg Ser Ile Asp Gly Gly Ala Ala Phe Gly Phe

465 470 475 480

CCT GAT ACC CCT GAG GAG GCT GCA AAA GCT GGG CTT GTA AGC GGA AAG 1669

Pro Asp Thr Pro Glu Glu Ala Ala Lys Ala Gly Leu Val Ser Gly Lys

485 490 495

GAT CAA ATC ATT GAC AGG AGC ATC CAG GAT GCA TAC ATA CAT GCC ATC 1717

Asp Gln Ile Ile Asp Arg Ser Ile Gln Asp Ala Tyr Ile His Ala Ile

500 505 510

CGG AGG GCA AAG AAC TTC ATC TAT ATA GAG AAC CAA TAC TTC CTT GGA 1765

Arg Arg Ala Lys Asn Phe Ile Tyr Ile Glu Asn Gln Tyr Phe Leu Gly

515 520 525

AGT TCC TAT GCC TGG AAA CCC GAG GGC ATC AAG CCT GAA GAC ATT GGT 1813

Ser Ser Tyr Ala Trp Lys Pro Glu Gly Ile Lys Pro Glu Asp Ile Gly

530 535 540

GCC CTG CAT TTG ATT CCT AAG GAG CTT GCA CTG AAA GTT GTC AGT AAG 1861

Ala Leu His Leu Ile Pro Lys Glu Leu Ala Leu Lys Val Val Ser Lys

545 550 555 560

ATT GAA GCC GGG GAA CGG TTC ACT GTT TAT GTT GTG GTG CCA ATG TGG 1909

Ile Glu Ala Gly Glu Arg Phe Thr Val Tyr Val Val Val Pro Met Trp

565 570 575

CCT GAG GGT GTT CCA GAG AGT GGA TCT GTT CAG GCA ATC CTG GAC TGG 1957

Pro Glu Gly Val Pro Glu Ser Gly Ser Val Gln Ala Ile Leu Asp Trp

580 585 590

CAA AGG AGA ACA ATG GAG ATG ATG TAC ACT GAC ATT ACA GAG GCT CTC 2005

Gln Arg Arg Thr Met Glu Met Met Tyr Thr Asp Ile Thr Glu Ala Leu

595 600 605

CAA GCC AAG GGA ATT GAA GCG AAC CCC AAG GAC TAC CTC ACT TTC TTC 2053

Gln Ala Lys Gly Ile Glu Ala Asn Pro Lys Asp Tyr Leu Thr Phe Phe

610 615 620

TGC TTG GGT AAC CGT GAG GTG AAG CAG GCT GGG GAA TAT CAG CCT GAA 2101

Cys Leu Gly Asn Arg Glu Val Lys Gln Ala Gly Glu Tyr Gln Pro Glu

625 630 635 640

GAA CAA CCA GAA GCT GAC ACT GAT TAC AGC CGA GCT CAG GAA GCT AGG 2149

Glu Gln Pro Glu Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Arg Ala Gln Glu Ala Arg

645 650 655

AGG TTC ATG ATC TAT GTC CAC ACC AAA ATG ATG ATA GTT GAC GAT GAG 2197

Arg Phe Met Ile Tyr Val His Thr Lys Met Met Ile Val Asp Asp Glu

660 665 670

TAC ATC ATC ATC GGT TCT GCA AAC ATC AAC CAG AGG TCG ATG GAC GGC 2245

Tyr Ile Ile Ile Gly Ser Ala Asn Ile Asn Gln Arg Ser Met Asp Gly

675 680 685

GCT AGG GAC TCT GAG ATC GCC ATG GGC GGG TAC CAG CCA TAC CAT CTG 2293

Ala Arg Asp Ser Glu Ile Ala Met Gly Gly Tyr Gln Pro Tyr His Leu

690 695 700

GCG ACC AGG CAA CCA GCC CGT GGC CAG ATC CAT GGC TTC CGG ATG GCG 2341

Ala Thr Arg Gln Pro Ala Arg Gly Gln Ile His Gly Phe Arg Met Ala

705 710 715 720

CTG TGG TAC GAG CAC CTG GGA ATG CTG GAT GAT GTG TTC CAG CGC CCC 2389

Leu Trp Tyr Glu His Leu Gly Met Leu Asp Asp Val Phe Gln Arg Pro

725 730 735

GAG AGC CTG GAG TGT GTG CAG AAG GTG AAC AGG ATC GCG GAG AAG TAC 2437

Glu Ser Leu Glu Cys Val Gln Lys Val Asn Arg Ile Ala Glu Lys Tyr

740 745 750

TGG GAC ATG TAC TCC AGC GAC GAC CTC CAG CAG GAC CTC CCT GGC CAC 2485

Trp Asp Met Tyr Ser Ser Asp Asp Leu Gln Gln Asp Leu Pro Gly His

755 760 765

CTC CTC AGC TAC CCC ATT GGC GTC GCC AGC GAT GGT GTG GTG ACT GAG 2533

Leu Leu Ser Tyr Pro Ile Gly Val Ala Ser Asp Gly Val Val Thr Glu

770 775 780

CTG CCC GGG ATG GAG TAC TTT CCT GAC ACA CGG GCC CGC GTC CTC GGC 2581

Leu Pro Gly Met Glu Tyr Phe Pro Asp Thr Arg Ala Arg Val Leu Gly

785 790 795 800

GCC AAG TCG GAT TAC ATG CCC CCC ATC CTC ACC TCA TAGACGAGGA AGCACT 2633

Ala Lys Ser Asp Tyr Met Pro Pro Ile Leu Thr Ser

805 810

ACACTACAAT CTGCTGGCTT CTCCTGTCAG TCCTTCTGTA CTTCTTCAGT TTGGTGGCGA 2693

GATGGTATGG CCGTTGTTCA GAATTTCTTC AGAATAGCAG TTGTTACAGT TGTGAATCAT 2753

AAAGTAATAA GTGCAGTATC TGTGCATGGT TGAGTTGGGA AGAAGATCGG GGATGCAATG 2813

ATGCTTGTGA AGTTGTGATG CCGTTTGTAA GATGGGAAGT TGGGAACTAC TAAGTAATTG 2873

GCATGATTGT ACTTTGCACT ACTGTTTAGC GTTGTTGATA CTGGTTAACC GTGTGTTCAT 2933

CTGAACTTGA TTCTTGATGC AGTTTGTGGC ATTACCAGTT TATCATCGTT CTTCAGGAAA 2993

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 3040

序列号：3

序列长度：2799

序列类型：核酸

序列种类：基因组DNA

起源

生物名：稻

序列

CAAGGGTGTA CATAGATTTG TCTCGTAAAA TAGTATTATA ATATTATAAA CTTATTACTC 60

TATCCGTTCT AAAATATAAG AACCTTATGA CTGGATGGAA CATTTCCTAG TACTACGAAT 120

CTGAACACAT GTCTAGATTC ATAGTACTAG GAAATGTCTC ATCGCGGTAC TAGGTTCTTA 180

TATTTTAGGA TGGAGGGAGT TTAATATAAA ACTAATGGTT AGAACTTTGA AAGTTTGATT 240

TTAAATGTCA AATATTTATG GCTGGAGGTA GTATAATATG TTTTTTTTGG GACGTAGACT 300

AGGTAGTATA ATATGTTTGG TTGTGTTTAG ATCCAATATT TGGATCCAAA CTTCAGTCAT 360

TTTCCATCAC ATCAACTTGT CATATACACA TAACTTTTCA GTCACATCAT CCCCAATTTC 420

AACCAAAATC AAACTTTGCG CTGAACTAAA CACAACCTTT GGGCCCGTTT AGTTCCCCAA 480

TTTTTTTCCC AAAAACATCA CATCGAATCT TTGGACACAT GCATGAAGCA TTAAATATAG 540

ATAAAAAGAA AAACTAATTG CACAGTTATG GAGGAAATCG CGAGACGAAT CTTTTAAGCC 600

TAATTAGTCC GTGATTAGCC ATAAGTGCTA CAGTAACCCA ATTGTGCTAA TGACGGCTTA 660

ATTAGTCTCC ACAAGATTCG TCTCGCAGTT TCCAGGCGAG TTCTGAAATT AGTTTTTTCA 720

TTCGTGTCCG AAAACCCCTT CCGACATCCG GTCAAACGTT CGATATGACA CCCACAAATT 780

TTCTTTTCCC CAACTAAACA CACCCTTTAT CTCTTACCCT CTGGCTCTTT CAGTAGGCAT 840

ATCCAAGACA GCTGGTAATG CAGGCTCGGA CATAATTTGA CAGTTACGTT CATGTGACCG 900

ACGGTTGATG CTAGTGCAAC TGCAACATAC TGTTCAGATG GATGTCCCAA CGAGCTCAAA 960

ACAACTTAGG TGGCGCGTCG CGATTCATCA ATAACTCAAA TGGAAGCGCA AGTGCACGTA 1020

CGAAAATGAC AGCGAGTGAG GTGGCGAGCC TCACCTTGGT GATCCCAACC GGATAAGCTA 1080

TGCATCAGCC AGTTTCGTGG GGCTGCACAT TTCGTCGAAC ACCTGGAGTC CACGCCGCCG 1140

GCGACGTCGG CACAGCGCGC CCGCCCACCG CCCACGCACG CGCTTGACTC CACCCATGTT 1200

CTCCCTTCTC GACGCCCGCG AAGCCAGCGA ACCGATCCGA GGAAGTCAAG CCCCCACCGC 1260

CACTTGGACC GACCTCGGGA CGACGACGCC CCCGCGCTCT TCTAGACGCG CGGACGACGC 1320

GGGCGCTGGC TCCGCGACGC GACGTCGCGG TCATGGAGTA ACCGCGACGG ACAGATACTT 1380

CTACCCGTTT TTAACCTCGC CTCCTCCTCC TCCCGGCTCG AGATCCGTGG CCACGACGCG 1440

TGGTGGGAAA CCGGGAACGA CGTGCACGCA CGCACACAGG GCAAGTTTCA GTAGAAAAAT 1500

CGCCGGCATC CAGATCGGGA CAGTCTCTCT TCTCCCGCAA TTTTATAATC TCGCTCGATC 1560

CAATCTGCTC CCCTTCTTCT TCTACTCTCC CCATCTCGGC TCTCGCCATC GCCATCCTCC 1620

TCTCCCTTCC CGGAGAAGAC GCCTCCCTCC GCCGATCACC ACCCGGTAAG CCCAGTGTGC 1680

TTAGGCTAAG CGCACTAGAG CTTCTTGCTC GCTTGCTTCT TCTCCGCTCA GATCTGCTTG 1740

CTTGCTTGCT TCGCTAGAAC CCTACTCTGT GCTGCGAGTG TCGCTGCTTC GTCTTCCTTC 1800

CTCAAGTTCG ATCTGATTGT GTGTGTGGGG GGGCGCAGGT AGGGCGAGGA GGGAGCCAAA 1860

TCCAAATCAG CAGCC ATG GCG CAG ATG CTG CTC CAT GGG ACG CTG CAC GCC 1911

Met Ala Gln Met Leu Leu His Gly Thr Leu His Ala

1 5 10

ACC ATC TTC GAG GCG GCG TCG CTC TCC AAC CCG CAC CGC GCC AGC GGA 1959

Thr Ile Phe Glu Ala Ala Ser Leu Ser Asn Pro His Arg Ala Ser Gly

15 20 25

AGC GCC CCC AAG TTC ATC CGC AAG GTTCGGACCC TTCTCCTTAA TCTACTCGTC 2013

Ser Ala Pro Lys Phe Ile Arg Lys

30 35

TTTGCTCTTG CTCTTTTTCT TTTGTGTCCC TTTCTTGTGT GTGCGTTTGC ATGAGCCCGA 2073

ATTTGATCTG CTAGTGCACA GTACAGTCAG ATACACTGAA ACGATCTGGA AATTCTGGAT 2133

TATTAGGAAA AATAAAGAGG TAGTAGACAA GAATTGGAGA TACTTTCTAT CAAGATTGGT 2193

CTATTATGCT TGGCCATTTC TTGTTTGACC CAAGTACTTC TTTGAATCTA GAGTTTGCTG 2253

TGTGTGATGT GGTGTGTGTT TGTGTCACCA AAAATCTTCA TTAGCTAAAA CTGAAATTTT 2313

ATTTATTAAC TGACCTACTA AAAATGTAGA GTTCTCTGTG TGTGATGTGT GCTTGTGTCA 2373

CCAAAAATCT TGATTTGATA GAGTTTTTAT TTATTTATTA ACTGACCTAC TACAAATCTA 2433

TTGCTGTATG CTATGTGTGT CTGTATCACC TGAAATGCAA TGTCTTCTTC TTTGTTGTTC 2493

TTGATCTAAC ACGTGAGCTC ATGTCAACAG TTT GTG GAG GGG ATT GAG GAC ACT 2547

Phe Val Glu Gly Ile Glu Asp Thr

40

GTG GGT GTC GGC AAA GGC GCC ACC AAG GTG TAT TCT ACC ATT GAT CTG 2595

Val Gly Val Gly Lys Gly Ala Thr Lys Val Tyr Ser Thr Ile Asp Leu

45 50 55 60

GAG AAA GCT CGT GTA GGG CGA ACT AGG ATG ATA ACC AAT GAG CCC ATC 2643

Glu Lys Ala Arg Val Gly Arg Thr Arg Met Ile Thr Asn Glu Pro Ile

65 70 75

AAC CCT CGC TGG TAT GAG TCG TTC CAC ATC TAT TGC GCT CAT ATG GCT 2691

Asn Pro Arg Trp Tyr Glu Ser Phe His Ile Tyr Cys Ala His Met Ala

80 85 90

TCC AAT GTG ATC TTC ACT GTC AAG ATT GAT AAC CCT ATT GGG GCA ACG 2739

Ser Asn Val Ile Phe Thr Val Lys Ile Asp Asn Pro Ile Gly Ala Thr

95 100 105

AAT ATT GGG AGG GCT TAC CTG CCT GTC CAA GAG CTT CTC AAT GGA GAG 2787

Asn Ile Gly Arg Ala Tyr Leu Pro Val Gln Glu Leu Leu Asn Gly Glu

110 115 120

GAG ATT GAC AGA 2799

Glu Ile Asp Arg

125

序列号：4

序列长度：173

序列类型：核酸

序列种类：基因组DNA

起源

生物名：稻

序列

GTAAGCCCAG TGTGCTTAGG CTAAGCGCAC TAGAGCTTCT TGCTCGCTTG CTTCTTCTCC 60

GCTCAGATCT GCTTGCTTGC TTGCTTCGCT AGAACCCTAC TCTGTGCTGC GAGTGTCGCT 120

GCTTCGTCTT CCTTCCTCAA GTTCGATCTG ATTGTGTGTG TGGGGGGGCG CAG 173

Claims

1.具有序列表中序列号1中所示的碱基序列的分离的DNA片段以及对在该碱基序列中增加、插入、缺失或置换一个或数个核苷酸后而且对其下游的基因的表达有促进作用的分离的DNA片段。

2.权利要求1所述的DNA片段，其具有序列表中序列号1所示的碱基序列。

3.权利要求1的DNA片段，其具有序列表中序列号4所示的碱基序列的分离的DNA片段以及对该碱基序列增加、插入、缺失或置换一个或数个核苷酸后并且对其下游的基因的表达具有促进作用的分离的DNA片段。

4.权利要求3中所述的DNA片段，其具有序列表中序列号4所示的碱基序列。

5.包含权利要求1中所述的DNA片段和在其下游功能性连接的应表达的外源基因的重组载体。

6.权利要求5中所述的重组载体，其中所述的DNA片段具有序列表中序列号1中所示的碱基序列。

7.权利要求5中所述的重组载体，其中所述的DNA片段具有序列表中序列号4中所示的碱基序列。

8.外源基因的表达方法，包括将权利要求6或7中所述的重组载体导入宿主细胞而表达上述外源基因的步骤。

9.权利要求8的方法，其中所述的DNA片段具有序列表中序列号1中所示的碱基序列。

10.权利要求9的方法，其中所述的DNA片段具有序列表中序列号4中所示的碱基序列。