JP3329822B2 - Ｄｎａ断片、それを含む組換えベクター及びそれを用いた外来遺伝子の発現方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、遺伝子の発現を促進する作用を有する新規
なDNA断片、それを含む組換えベクター及びそれを用い
た外来遺伝子の発現方法に関する。

背景技術 外来遺伝子の発現を促進することは、遺伝子工学の手
法を植物に応用する際に最も必要とされる技術のひとつ
である。その方法のひとつとして遺伝子の発現を促進す
る塩基配列を持つDNAの利用が挙げられる。

外来遺伝子の発現を促進する塩基配列としては、ヒマ
のカタラーゼのイントロン（特開平03−103182;Tanaka
et al.Nucleic Acids Res.18,6767−6770（1990））等
が知られている。しかしながら、対象とする植物が多岐
にわたること、また目的とする生育段階あるいは組織器
官での発現促進が必要になることから、多くの種類の遺
伝子発現を促進するDNAが利用できることが望まれる。

発明の開示 従って、本発明の目的は、外来遺伝子の発現を促進す
ることができる公知のDNAとは異なる配列を有する、新
規なDNAであって、外来遺伝子の発現を促進することが
できるDNAを提供することである。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、イネのホスホリハ
ーゼＤ（以下、「PLD」ということがある）のcDNAとイ
ネのゲノムDNAとの塩基配列を比較することによりイネP
LD遺伝子のイントロンを見出し、かつ、これらのイント
ロンのうちの１つがその下流の遺伝子の発現を顕著に促
進する効果を有することを見出し本発明を完成した。

すなわち、本発明は、配列表の配列番号１で示される
塩基配列を有する単離されたDNA断片又は該DNA断片中の
１若しくは複数のヌクレオチドを欠失させた断片から成
りその下流に存在する遺伝子の発現を促進する作用を有
する単離されたDNA断片を提供する。また、本発明は、
前記本発明のDNA断片と、その下流に機能的に連結され
た発現すべき外来遺伝子とを含む組換えベクターを提供
する。さらに、本発明は、前記本発明の組換えベクター
を宿主細胞に導入し、前記外来遺伝子を発現させること
から成る、外来遺伝子の発現方法を提供する。

下記実施例において実験的に確認されたように、本発
明のDNA断片は、その下流に位置する遺伝子の発現を大
幅に促進する。従って、本発明は、遺伝子工学的手法に
より外来遺伝子を発現させることに大いに貢献するもの
と考えられる。

図面の簡単な説明 図１は、本発明の実施例において本発明のDNA断片を
挿入したpBI221の遺伝子地図の要部である。

発明を実施するための最良の形態 上述のように、本発明のDNA断片は配列表の配列番号
１に示す塩基配列を有する。本発明のDNA断片は、下記
実施例において詳述するように、イネPLD遺伝子のcDNA
と、対応するイネゲノムDNAとの塩基配列を比較するこ
とによりイネPLD遺伝子上流のイントロンを同定し、こ
れらのイントロンのうち5'非翻訳領域に対応する位置に
存在する173bpのイントロン配列を含む断片をPCRにより
調製してレポーター遺伝子を有する発現ベクターの該レ
ポーター遺伝子の上流に組み込み、該レポーター遺伝子
の発現活性を比較することにより、下流の遺伝子の発現
を促進する作用を確認したものである。本発明のDNA断
片の塩基配列は、イネゲノム中のPLD遺伝子の塩基配列
を示す配列表の配列番号３に示されるイネゲノミックPL
D遺伝子の塩基配列の第1661塩基から第1843塩基に相当
する。

なお、イネPLD遺伝子上流に存在する上記173bpのイン
トロン配列の塩基配列を配列表の配列番号４に示す。配
列番号４に示される配列も、当然、下流の遺伝子の発現
を促進する作用を有する。配列番号４に示す塩基配列
は、イネゲノム中のPLD遺伝子の塩基配列を示す配列表
の配列番号３に示されるイネゲノミックPLD遺伝子の塩
基配列の第1666塩基から第1838塩基に相当する。

本発明のDNA断片は、イネPLD遺伝子の上流に存在する
イントロンであり、本発明によりその塩基配列が明確に
なっているので、イネのゲノムDNAを鋳型とするPCRによ
り容易に調製することができる。PCRは遺伝子工学の分
野において多用される常法であり、そのためのキットも
市販されているので当業者ならば容易に実施可能であ
る。また、その具体的な一例が下記実施例に詳述されて
いる。

なお、一般に、生理作用を有するDNA配列において、
１又は複数のヌクレオチドが付加、挿入、欠失若しくは
置換された場合であっても、その生理活性を維持する場
合があることは当業者において広く認められているとこ
ろである。本発明には、上記配列番号１に記載した塩基
配列を有する単離されたDNA断片中の１若しくは複数の
ヌクレオチドを欠失させた断片から成りその下流に存在
する遺伝子の発現を促進する作用を有する単離されたDN
A断片も本発明の範囲内に含まれる。特に、配列番号１
で示される塩基配列のうち5'末端側の５塩基及び3'末端
側の６塩基はエキソン部分であるので、これらの配列が
欠失しているものも遺伝子発現促進作用を有するものと
考えられ、これらも本発明の範囲に含まれる。

本発明のDNA断片は、その下流の遺伝子の発現を促進
する作用を有する。従って、発現させるべき所望の外来
遺伝子の転写領域、好ましくは転写領域の5'末端側の領
域に本発明のDNA断片を挿入することにより、該外来遺
伝子の発現を促進することができる。外来遺伝子の発現
方法は遺伝子工学の分野において既に確立されている。
すなわち、発現ベクターのクローニング部位に所望の外
来遺伝子を挿入し、これを宿主細胞に導入して発現させ
ることにより外来遺伝子を発現させることができる。そ
して、本発明の方法では、このような常法による外来遺
伝子の発現方法において、該外来遺伝子の上流に上記本
発明のDNA断片を、該外来遺伝子と機能的に連結された
態様で挿入して、該外来遺伝子の発現を行う。ここで、
本発明のDNA断片がその下流の発現すべき遺伝子と「機
能的に連結された」とは、本発明のDNA断片を挿入する
ことにより、これを挿入しない場合に比べて前記外来遺
伝子の発現が検出可能な程度に増加することを意味す
る。本発明のDNAは発現を促進すべき外来遺伝子の直上
流に挿入されていてもよいが、本発明のDNAと該外来遺
伝子の間に他の配列が介在していてもよい。この介在す
る配列の長さは特に限定されないが、通常０〜1000bp程
度である。また、本発明のDNA断片の上流には、プロモ
ーター配列が存在するが、本発明のDNA断片はプロモー
ターの直下流に挿入されていてもよいし、プロモーター
と本発明のDNAの間に他の配列が介在していてもよい。
この介在する配列の長さは特に限定されないが、通常０
〜1000bp程度である。要は、本発明のDNA断片を挿入す
ることにより、これを挿入しない場合に比べて前記外来
遺伝子の発現が検出可能な程度に増加する組換えベクタ
ーは、全て本発明の範囲内に含まれる。

本発明のDNA断片のベクター中への挿入は、発現ベク
ターのクローニング部位の塩基配列がわかっているの
で、適当な制限酵素や必要によりリンカーを用いること
により容易に行うことができる。

なお、このような発現ベクターは、種々のものがこの
分野において周知であり、かつ市販されている。これら
の発現ベクターは、宿主細胞内で複製するための複製開
始点、プロモーター、外来遺伝子を挿入するための制限
酵素部位を与えるクローニング部位及び薬剤耐性遺伝子
等の選択マーカーを少なくとも含み、通常、転写を安定
に終了させるターミネーターや、宿主が細菌の場合には
SD配列を含む。本発明の方法においては、これらの公知
の発現ベクターのいずれをも採用することができる。

実施例 以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明す
る。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるもので
はない。

1.米ぬかPLDの精製 精製にあたり、米ぬかPLDの精製に関する文献（高野
ら、日本食品工業学会誌34,8−13（1987））を参考にし
た。酵素活性は、ホスファチジルコリンを基質とし、酵
素反応によって生成したコリンをコリンオキシダーゼ法
により定量して測定した（Imamura et al.,J.Biochem.8
3,677−680（1978））。ただし、PLDの酵素反応は、95
℃、５分の熱処理によって停止した。

すなわち、イネ（Oryza sativa）“コシヒカリ”の米
ぬか100gに１リットルのヘキサンを加え一昼夜撹拌、脱
脂した後、10gのポリクラールAT（商品名：ポリビニル
ピロリドン、GAF Chemical社製）、500mlの1mM CaCl₂、
5mM2−メルカプトエタノールを含む10mM Tris−HCl緩衝
液（pH7）を加え１時間攪拌し酵素を抽出した。抽出液
を８層ガーゼで濾したのち15,000x gで20分遠心し、中
間層を粗抽出液とした。粗抽出液を硫安で処理し（65％
飽和）、生じた沈澱を遠心分離（15,000x g,20分）によ
り集め、溶解後上記緩衝液に透析した。透析後、遠心し
て沈殿を取り除き硫安画分とした。

硫安画分を緩衝液Ａ（10mM Tris−HCl pH7,1mM CaC
l₂,ImM 2−メルカプトエタノール）で平衡化したDEAE−
Cellulose（ワットマン社製）のカラム（2.0 x 10cm）
に添加した。約100mlの50mM NaClを含む緩衝液Ａで洗浄
した後、50−350mM NaClの直線的な濃度勾配を持つ緩衝
液A120mlで溶離した。PLDはNaCl濃度0.2M付近で溶離し
た。PLD活性を示すフラクションを回収し、溶離液（DEA
D−Cellulose）とした。

溶離液（DEAE−cellulose）に3M硫安を加え1M硫安溶
液とし、1M硫安を含む緩衝液Ａで平衡化したPhenyl sep
haroseカラム（ファルマシア社製、2.6 x 10cm）に添加
した。1.0−0M硫安の濃度勾配を持つ緩衝液A240mlで溶
離した。PLDは、硫安濃度0.1M付近で溶離した。活性を
示すフラクションを回収し、緩衝液Ａに対して透析し、
溶解液（Phenyl sepharose）とした。

溶離液（Phenyl sepharose）を緩衝液Ａで平衡化した
Mono Qカラム（ファルマシア社製陰イオン交換カラム、
16 x 10cm）に添加し、50−350mM NaClの濃度勾配を持
つ緩衝液A150mlで溶離した。PLDは、NaCl濃度210mMから
235mMにかけて溶離した。PLD活性を示す分画を回収して
この溶液を緩衝液Ａに対して透析し、溶離液（Mono Q 1
st）とした。

溶離液（Mono Q 1st）を遠心限外濾過により0.5mlに
濃縮し、0.1M NaClを含む緩衝液Ａで平衡化したSuperos
e6カラム（ファルマシア社製、1.0 x 30cm）に添加し、
同様の緩衝液で溶離した。PLDは、分子量78kDaと推定さ
れた。PLD活性を示す分画を回収し溶離液（Superose6）
とした。

溶離液（Superose6）に2.5mlの40％キャリアアンフォ
ライト（Pharmacia、pH4.0−6.0）と蒸留水を加えて50m
lとし、Rotofore（バイオラッド社製）を使用して、等
電点電気泳動を行った。泳動は２℃にて12W定電力で４
時間行った。PLD活性は、pH4.9付近に認められた。PLD
活性を示す分画を回収し、この溶液を緩衝液Ａに対して
透析し、等電点電気泳動画分とした。

等電点電気泳動画分を緩衝液Ａで平衡化したMono Qカ
ラム（ファルマシア社製、0.5 x 5cm）に添加し、50−3
50mM NaClの直線的な濃度勾配を持つ緩衝液Ａで溶離し
た。PLDは、NaCl濃度210mM付近と235mM付近で溶離し
た。PLD活性を示す２つの分画を回収し、溶離液（Mono
Q 2nd−Ｉ、II）とした。

溶離液（Mono Q 2nd−Ｉ、II）の純度検定を、7.5％
のアクリルアミドを用いたSDS−ポリアクリルアミド電
気泳動［laemmli（1970）］で行った。泳動後、ゲルを
クーマシー・ブリリアント・ブルーR250で染色した。い
ずれの溶離液の場合も、分子量82kDaの位置に主たるバ
ンドが認められ、溶離液（Mono Q 2nd−II）では、単一
のバンドであった。

以上の精製により、溶離液（Mono Q 2nd−Ｉ、II）の
精製倍率は、粗抽出液に対してそれぞれ380倍、760倍と
なった。

２画分について酵素の性状解析を行った。その結果を
下記表１に示す。至適pH測定に用いた緩衝液は酢酸ナト
リウム（pH4−６）,MES−NaOH（pH5.5−7.0）,Tris−HC
l（pH7−９）でいずれも100mMとした。pH安定性は、各p
Hに25℃で30分間置いた後、残存活性を測定し、活性の
低下が認められない範囲を示した。温度安定性は、４
℃、25℃、37℃および50℃の各温度に30分間置いた後、
残存活性を測定した。基質特異性は、基質濃度5mMで測
定し、ホスファチジルコリンに対する酵素作用を100と
した相対活性で示した。

2.精製したタンパク質がPLDであることの証明 純度検定の場合と同様に、溶離液（Mono Q 2nd−Ｉ、
II）をそれぞれSDS−ポリアクリルアミド電気泳動にて
分離し、PVDF膜（ミリポア社製）に転写後、染色した。
82kDaタンパク質のバンドを切り出し、プロテインシー
ケンサー（島津製作所、PSQ−１）にてＮ末端アミノ酸
配列を決定した。いずれも10残基まで解析可能で、同一
の配列であった。その配列を以下に記す。

Val Gly Lys Gly Ala Thr Lys Val Tyr Ser ２つの活性画分に認められる82kDaタンパク質の関係
は明らかでないが、少なくともアミノ酸配列のレベルで
類似性は高いと考えられ、抗体作製のための抗原調製に
おいて、両画分の混合液を用いて問題はないと判断し
た。

溶離液（Mono Q 2nd−Ｉ、II）の混合液を、7.5％の
アクリルアミドを用いたSDS−ポリアクリルアミド電気
泳動で分離し、ゲルをクーマシー・ブリリアント・ブル
ーR250で染色した。82kDaタンパク質のバンドを切り出
し、電気溶出（25mM Tris、192mMグリシン、0.025％SD
S、100V、10時間）により回収した。

さらに電気透析（15mM ammonium bicarbonate、200
V、５時間）によりSDSを除去後、凍結乾燥した。電気溶
出、電気透析には、BIOTRAP（Schleicher＆Schuell社
製）を用いた。

上記の方法で高度に精製した82kDaタンパク質を、50
μｇずつ７日間隔でウサギに免疫した。免疫前および免
疫３回後の血清を用いて、免疫滴定実験を行った。PLD
溶液8.6 x 10^-3unitに０−50μｌの免疫前または免疫３
回後の血清、50μｌの250mM Tris−HCl（pH7.0）、５μ
ｌの50mM CaCl₂、50μｌの0.2％Triton X−100（商品
名）および水を加えて全量を250μｌとし、室温で2.5時
間放置した。200μｌのProtein A Sepharose（Pharmaci
a）を加え、室温で２時間ゆるやかに振とうした後、遠
心（500x g、5min）し、上清の酵素活性を測定した。血
清無添加の場合の酵素活性を100％とすると、免疫前の
血清20μｌ、50μｌで酵素活性がそれぞれ95％、88％で
あったのに対し、免疫３回後の血清20μｌ、50μｌでは
それぞれ75％、30％であった。この結果は、82kDaタン
パク質がPLDであることを証明するものである。

3.内部アミノ酸配列の決定 PLDタンパク質の断片化は、ゲル中で断片化する方法
（Cleveland et al,J.Biol.Chem.,252,1102（1977））
で行った。２と同様の方法で切り出したPLDタンパク質
を含むゲルを、ペプチド分離用に調製した15％アクリル
アミドゲル上のスタッキングゲルウェルに挿入し、PLD
タンパク質の1/10量のStaphylococcus aureus V8 prote
ase（和光純薬社製）を重層後、泳動を開始した。ブロ
モフェノールブルーが、スタッキングゲルの中央に到達
した時点で泳動を中断し、30分後再び泳動を開始した。
泳動終了後、PVDF膜に転写し、染色した。分子量20、1
4、13、11および10kDaの位置に明瞭なバンドが認められ
た。分子量20、14および13kDaのペプチド断片のバンド
を切り出し、プロテインシーケンサーにてアミノ酸配列
を決定した。以下、それらの配列を記す。

（式中、？は、アミノ酸を特定することのできなかった
残基を、また（ ）は、他のアミノ酸である可能性も高
い残基を示している。） 4.イネ未熟種子cDNAライブラリーの作製 全RNAは、開花５日後の未熟種子から、SDS−フェノー
ル法にしたがって抽出し、塩化リチウム沈澱により調製
した。Poly（Ａ）⁺RNAの調製は、Oligotex−dT30（宝酒
造社製）を使用して、製造者の手引書にしたがって行っ
た。cDNAクローニングには、cDNA合成システムプラス
（アマシャム社製）、cDNAクローニングシステムλgt10
（アマシャム社製）を使用した。ただし、クローニング
ベクターとして、λZAP IIベクター（ストラタジーン社
製）、宿主細胞としてXL1−Blueを使用した。

5.プローブの作製 PLDのアミノ酸配列に該当するオリゴヌクレオチドをD
NA合成装置（アプライドバイオシステムズ社製）を用い
て合成した。その配列とそれらが該当するアミノ酸配列
を下記する。

（式中、Ｒはプリン類ＡまたはＧを示し、Ｙはピリミジ
ン類ＴまたはＣを示し、ＮはＧ、Ａ、ＴまたはＣの何れ
かを示す。） 20KFは、分子量20kDaのペプチド中に見いだされるア
ミノ酸配列 Asn Tyr Phe His Gly をコードしているDNA塩基配列を包含する32種のオリゴ
ヌクレオチドの混合物であり、20KR1は同ペプチド中に
見いだされるアミノ酸配列 Asn Pro Asp Asp（Asp） をコードしているDNA塩基配列の相補鎖を包含する128種
のオリゴヌクレオチドの混合物である。

cDNA合成反応は10ngのPoly（Ａ）⁺RNA、0.3μｇのラ
ンダムヘキサマー（dN6）、10UのRNaseの阻害剤（RNAGu
ard、ファルマシア社製）、1mMのdATP、dCTP、dGTPおよ
びdTTP,1 x PCR緩衝液（宝酒造社製）、50mMの塩化マグ
ネシウムおよび100Uの逆転写酵素（Ｍ−MuLV RTase,BRL
社製）を使用して全容積10μｌで行った。反応は37℃で
30分間行った後、95℃で５分間熱処理し氷上で保持し
た。

複製連鎖反応（PCR）を、鋳型として上記cDNA、プラ
イマーとして20KFと20KR1を使用して実施した。反応
は、10μｌのcDNA合成反応液、50pmolの各々のプライマ
ーの混合物、200μＭのdATP,dCTP,dGTPおよびdTTP、1 x
PCR緩衝液（宝酒造社製）および2.5U AmpliTaq DNAポ
リメラーゼ（宝酒造社製）を使用して全容積50μｌで行
った。反応は下記の温度条件に従って30周期を繰り返し
た;DNAサーモサイクラー（パーキン エルマー シータ
ス社製）中で:1分間にわたり94℃、１分間にわたり40
℃、および２分30秒間にわたり72℃。

PCR生成物を、２％のアガロースゲル上で分離した。
若干数の断片が、エチジウムブロマイド染色法により検
出された。その１つは94bpの長さであり、予想通りの大
きさであった。

PCR断片をゲルから切り出し、pUC19プラスミド中にサ
ブクローニングした。サブクローニングしたPCR断片のD
NA配列を、T7 sequencingキット（ファルマシア社製）
を使用するジデオキシ法により決定した。２つのプライ
マー間には、予想されたアミノ酸配列をコードするDNA
塩基配列が認められた。以下に、プライマー間のDNA塩
基配列とそれがコードするアミノ酸を記す。

上記オリゴヌクレオチドにDNA5'末端標識キットMEGAL
ABEL（宝酒造社製）を使用してアイソトープ³²P（アマ
シャム社製）を取り込ませ、放射性オリゴヌクレオチド
プローブとした。

6.PLD遺伝子含有クローンのスクリーニング 上記放射性オリゴヌクレオチドをプローブとして、cD
NAライブラリーをスクリーニングした。ハイブリダイゼ
イション溶液は、0.5Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
2）、７％SDS、1mM EDTA、100μg/mlサケ精子DNAとし、
ハイブリダイゼイションはこれにプローブを加え45℃で
16時間行った。洗浄液は0.3M NaCl、30mMクエン酸ナト
リウムとし、45℃、20分の洗浄を２回行った。陽性プラ
ークを単離し、λZAP IIクローニングベクターの製造者
により記述されている方法で、in vivoでpBluescriptプ
ラスミド（ストラタジーン社製）にサブクローニングし
た。ジデオキシ法により塩基配列を決定したところ、３
で決定した内部アミノ酸配列をコードする領域が存在し
た。

7.5'末端領域の塩基配列決定 ６に記載した方法では完全長のcDNAを含むクローンを
単離できなかったため、RACE法（Edwards et al,Nuclei
c Acids Res.,19,5227−5232（1991））により5'末端領
域を含むDNA断片を調製した。5'−AmpliFINDER RACE Ki
t（クローンテック社製）を、添付マニュアルに従って
使用した。６で決定したcDNAの塩基配列をもとにオリゴ
DNAを合成し、４に記載した方法で調製したmRNAを鋳型
としてPCRを行った。PCR産物をPCR IIベクター（インビ
トロジェン社製）にサブクローニングし、ジデオキシ法
にて塩基配列を決定した。このようにして決定されたイ
ネPLDのcDNAの塩基配列及びそれがコードする推定アミ
ノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。翻訳は配列表２
に示した182番目の塩基から開始されると推定された。
それは、36塩基上流に終始コドンが存在していることに
よる。

8.PLDcDNAクローンに対応するPLDゲノムクローンの単離
およびプロモーター領域の同定 pBluescriptプラスミド中にクローニングした、６で
決定したPLDcDNAに対応するPLD遺伝子の調節配列を担う
ゲノムDNAクローンを単離するため、イネコシヒカリの
ゲノムライブラリーを構築した。これは、コシヒカリ実
生葉DNAをMbo Iで部分消化し、シュクロース勾配遠心分
離によって16〜20kb大のフラクションを精製し、ラムダ
DASH II（ストラタジーン社製）、Gigapack II Gold
（ストラタジーン社製）を使用することにより行った。
PLDcDNAクローンをプローブとして、ゲノムライブラリ
ーをスクリーニングした。スクリーニングは６に従っ
た。ただし、ハイブリダイゼイションは65℃で16時間、
洗浄液は、0.5xSSC、0.1％SDSとし、65℃、20分の洗浄
を２回行った。ハイブリダイズしたゲノムクローンの塩
基配列をジデオキシ法により決定したところ、６で決定
したcDNA配列と相同な領域が存在した。

転写開始部位は、７に記載した方法で決定した。転写
開始部位近傍には“TATA"コンセンサス配列ボックスが
認められた。ATG翻訳開始部位は、DNA配列決定により判
ったところでは、クローンの翻訳読み枠内の最も上流の
ATGコドンとして、またイネにおいて合成されるmRNA上
の最初にアクセス可能なATGコドンとして決定した。

cDNAクローンにハイブリダイズしたゲノムクローンの
一部のDNA配列を配列番号３に示す。ゲノムDNA配列にお
いて、ATG翻訳開始コドンで始まり、その対応cDNA配列
と重なり合う読み枠が同定されている。プロモーター領
域は、ATG翻訳開始コドンの上流にあって、その直前か
ら開始している。

9.イントロンの特定と遺伝子発現に及ぼす作用の解析 cDNA（配列番号２）とゲノムDNA（配列番号３）の比
較から、PLDの遺伝子に３箇所イントロンが存在するこ
とが明かとなった。そのうち、mRNAの5'末端非翻訳領域
に対応する位置に存在する173bp（すなわち、配列番号
３で示される塩基配列の第1666塩基から第1838塩基、こ
の配列を配列番号４に示す）のイントロンについて、植
物細胞における遺伝子発現におよぼす影響を調べた。エ
キソン部分を５ベースずつ含む15merのプライマー（5'
−ACCCGGTAAGCCCAG−3',3'−CCCCCGCGTCCATCC−5'）を
合成し、ゲノムクローンを鋳型として「5.プローブの作
製」の項に記した方法でPCRを行った。PCR産物をPCR II
ベクターにサブクローニングし、そこからEcoR Iで切り
出した断片を平滑末端処理した後プラスミドpBI221（東
洋紡社製）のSma Iサイトに組み込んだ（図１参照）。
以下、既報（Shimamoto et al.Nature,338,274−276（1
989））の方法にしたがってイネ培養細胞（Baba et al.
Plant Cell Physiol.27,463−471（1986））に上記組換
えプラスミドを導入後、β−glucuronidase（GUS）活性
を測定した。表２に示したように、イントロンの導入に
よりGUS活性の増大が認められた。また、表３に示した
とおり、イントロンが逆方向に組み込まれた場合にもGU
S活性の増大が認められた。なお、イントロンの方向
は、イントロン配列中に存在するBgl IIサイトとpBI221
に存在するBamH Iサイトを利用して、両酵素で切り出さ
れる断片の長さにより特定した。

配列表 配列番号:1 配列の長さ:183 配列の型：核酸 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:Oryza sativa 配列 配列番号:2 配列の長さ:3040 配列の型：核酸 配列の種類:cDNA to mRNA 起源 生物名:Oryza sativa 配列 配列番号:3 配列の長さ:2799 配列の型：核酸 配列の種類:genomic DNA 起源 生物名:Oryza sativa 配列 配列番号:4 配列の長さ:173 配列の型：核酸 配列の種類:Genomic DNA 起源 生物名:Oryza sativa 配列

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列表の配列番号１で示される塩基配列を
   有する単離されたDNA断片又は該DNA断片中の１若しくは
   複数のヌクレオチドを欠失させた断片から成りその下流
   に存在する遺伝子の発現を促進する作用を有する単離さ
   れたDNA断片。
2. 【請求項２】配列表の配列番号１で示される塩基配列を
   有する請求項１記載のDNA断片。
3. 【請求項３】配列表の配列番号４で示される塩基配列を
   有する単離されたDNA断片又は該DNA断片中の１若しくは
   複数のヌクレオチドを欠失させた断片から成りその下流
   に存在する遺伝子の発現を促進する作用を有する単離さ
   れたDNA断片。
4. 【請求項４】配列表の配列番号４で示される塩基配列を
   有する請求項３記載のDNA断片。
5. 【請求項５】請求項１記載のDNA断片と、その下流に機
   能的に連結された発現すべき外来遺伝子とを含む組換え
   ベクター。
6. 【請求項６】前記DNA断片は配列表の配列番号１で示さ
   れる塩基配列を有する請求項５記載の組換えベクター。
7. 【請求項７】前記DNA断片は配列表の配列番号４で示さ
   れる塩基配列を有する請求項５記載の組換えベクター。
8. 【請求項８】請求項３記載の組換えベクターを宿主細胞
   に導入し、前記外来遺伝子を発現させることから成る、
   外来遺伝子の発現方法。
9. 【請求項９】前記DNA断片は配列表の配列番号１で示さ
   れる塩基配列を有する請求項８記載の方法。
10. 【請求項１０】前記DNA断片は配列表の配列番号４で示
    される塩基配列を有する請求項９記載の方法。