CN1165621C - 法呢基二磷酸合酶 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种能合成比原始酶所合成的链更短的异戊二烯二磷酸的突变型异戊二烯二磷酸合酶，它经过修饰存在于异戊二烯二磷酸合酶II区富含天冬氨酸区DDXX(XX)D(X指任意氨基酸且括号中的XX可以不存在)上游的氨基酸序列而产生。

Description

法呢基二磷酸合酶
本发明的背景
1、本发明的领域
本发明涉及合成对有机体重要的化合物，如类固醇，泛醌，多萜醇，类胡萝卜素，异戊烯化蛋白质，动物激素，植物激素等的前体的线型异戊二烯二磷酸的新的突变酶，编码该酶的遗传系统；及生产和使用该酶的方法。
2、相关技术
在有机体中具有重要功能的物质中，许多是使用异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)作为构成单元经生物合成的。这些化合物也称为类异戊二烯，类萜或萜，并根据碳原子数分成半萜(C5)，单萜(C10)，倍半萜(C15)，双萜(C20)，蛾萜(C25)，三萜(C30)，四萜(C40)等。实际的生物合成从甲羟戊酸途径开始，通过该途经合成甲羟戊酸-5-二磷酸，接着合成异戊二烯二磷酸(IPP)，IPP是活性异戊二烯单位。
发现认为是前体的异戊二烯单位鉴定为异戊二烯二磷酸，即所谓的活性异戊二烯单位。二甲丙烯基二磷酸(DMAPP)异是异戊二烯二磷酸的异构体，在异戊烯腺嘌呤的合成中用作底物，异戊烯腺嘌吟称为细胞分裂素，是一种植物激素还已知DMAPP与异戊二烯二磷酸进行缩合反应合成链型活性类异戊二烯，如牻牛儿基二磷酸(GPP)，橙花基二磷酸，法呢基二磷酸(FPP)，牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(GGPP)，牻牛儿基法呢基二磷酸(GFPP)，六异戊二烯二磷酸(HexPP)，七异戊二烯二磷酸(HepPP)等。
有Z型和E型缩合反应。牻牛儿基二磷酸是E型缩合的产物、橙花基二磷酸是Z型缩合的产物。尽管认为全部E型是法呢基二磷酸和牻牛儿基二磷酸的活性形式，但Z型缩合反应导致合成天然橡胶，多萜醇，细菌萜醇(十一萜醇)和在植物中发现的各种多聚萜醇。认为它们使用分子中存在的焦磷酸与碳主链的磷酸酯键能量进行缩合反应并产生作为反应副产物的焦磷酸盐。
法呢基二磷酸或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸用作反应底物导致合成异戊烯化的蛋白质(从法呢基二磷酸或牻牛儿基牻牛儿基二磷酸)，其代表为：在细胞信号转导机制中重要的G蛋白质，archaea的细胞膜脂类(从牻牛儿基牻牛儿基二磷酸)，作为类固醇前体的鲨烯(从法呢基二磷酸)；和作为类胡萝卜素前体的八氢番茄红素(从牻牛儿基牻牛儿基二磷酸)。异戊二烯二磷酸从分别具有6个和7个异戊二烯单位的六异戊二烯二磷酸和七异戊二烯二磷酸到具有十个异戊二烯单位的异戊二烯二磷酸用作在电子传递系统中起作用的泛醌和甲基萘醌类(维生素K2)的合成前体。
而且，经过这些活性形式的类异戊二烯的生物合成，已合成了许多类对生命所必须的化合物。仅提及的一些有作为植物激素的细胞分裂素，使用半萜作为其合成前体的异戊烯基腺苷修饰的tRNA，属于单萜且是玫瑰油香料主要成份的牛儿醇和其异构体橙花醇，以及作为杀虫剂的樟脑树提取物，樟脑。倍半激素包括昆虫保幼激素，双萜包括植物激素赤霉素，昆虫追踪信息素，作为视色素前体，高嗜盐性archaea的紫色膜蛋白结合成份和维生素A发挥功能的视黄醇和视黄醛。
而且，使用鲨烯(一种三萜)已合成许多类固醇化合物，例如，包括动物性激素，维生素D，蜕皮激素(昆虫蜕皮的激素)，植物激素brassinolide(构成胞质膜等)。作为有机体各种色素和维生素A的前体的四萜的各种类胡萝卜素也是来自活性类异戊二烯的重要化合物。诸如叶绿素，脱镁叶绿素，生育酚(维生素E)和叶绿醌(维生素K1)的化合物也来自四萜。
依次缩合异戊二烯二磷酸与诸如二甲丙烯基二磷酸，牻牛儿基二磷酸，法呢基二磷酸，牻牛儿基牻牛儿基二磷酸，牻牛儿基法呢基二磷酸等的烯丙基类底物的活性类异戊二烯合酶称为异戊二烯二磷酸合酶，且根据具有最大链长的主要反应产物的化合物名称也称为(例如)法呢基二磷酸合酶(FPP合酶)，牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPP合酶)等。关于来自细菌，archaea，真菌，植物和动物的诸如法呢基二磷酸合酶，牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶，六异戊二烯二磷酸合酶，七异戊二烯二磷酸合酶，八异戊二烯二磷酸合酶，九异戊二烯二磷酸合酶(茄橙花基二磷酸合酶)，十一异戊二烯二磷酸合酶等的酶的纯化，活性测量，遗传克隆和编码该酶的DNA顺序已有报道。
这些构成在工业上和生命科学学术领域上重要的大量化合物的化学合成基础的活性类异戊二烯合酶由于其不稳定性和低比活而在工业应用中具有很少的实际用途。然而，随着从嗜热菌和archaea中分离出耐热性异戊二烯二磷酸合酶及编码这些酶的基团，增强了它们作为酶的可利用性。
关于法呢基二磷酸合酶，从嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacilusstearothermophilus)，一种培养基嗜热菌中分离出了基因，使用大肠杆菌作宿主细胞制备了具有培养基热稳定性的酶[T.Koyama等，(1993)生化杂志，133：355-363；日本未审专利公开号5(1993)-219961]。关于牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶，从高嗜热菌，如酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)和Thermusthermophilus分离了基因[s.-I.Ohnuma等，(1994)生物化学杂志，269：14792-14797；日本未审专利公开号7(1995)-308193和日本未审专利公开号7(1995)-294956]，制备了具有高热稳定性的酶。
另外，关于具有法呢二磷酸合酶和牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶功能的异戊二烯二磷酸合酶，从高嗜热菌热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)分离出了该酶及编码它的基因[A.Chen和D.Poulter(1993)生物化学杂志，268：11002-11007；A.Chen和D.Poulter(1994).ARCHIVESOF BIOCHEMSTRY AND BIOPHYTSICS 314]，已证实了该酶的热稳定性。
然而，在来自热自养甲烷杆菌的法呢基二磷酸/牻牛儿基牻牛儿基二磷酸的合成中，没有报道能限定反应产物链长的薄层色谱分析等及酶活性分析的数据；经过测定牻牛儿基二磷酸作为烯丙基类底物估计了链的长度。由于牻牛儿基二磷酸也能作为牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶的底物，因此不可能测定的活性仅包括法呢基二磷酸合酶的活性。
而且，在预期存在具有更高热稳定性，更高盐稳定性和更低PH值稳定性的酶的archaea中未证实法呢基二磷酸合酶的存在。
如上所述使用来自嗜热脂肪芽孢杆菌的法呢基二磷酸合酶解决了酶不稳定且难以处理的部分问题。但具有更高热稳定性的酶应更稳定并且更适合于工业应用。
而且，一些具有更长链长度的异戊二烯二磷酸合酶使用法呢基二磷酸作底物。当该长链异戊二烯二磷酸合酶与法呢基二磷酸合酶同时用于提供前一种酶的底物时，后一种酶应具有的稳定性等于或高于长链异戊二烯二磷酸合酶。当涉及法呢基二磷酸的工业生产时，酶应固定或回收用于再循环。再生时，酶本身应更稳定，应具有更高热稳定性，更高盐稳定性和在大范围PH内的更高的稳定性。
已发现根据异戊二烯二磷酸合酶的氨基酸序列推断的2个富含天冬氨酸区中，位于氨基末端一侧的富含天冬氨酸区从保守序列I(DDXX(XX)D)(其中X代表任意氨基酸，括号中的2个“X”可以不存在)起N端方向第5位的氨基酸残基负责控制反应产物的链长度。因此，为了延长反应产物的链长度发明了控制反应产物的方法[于1996年7月3日申请的题目为“突变的异戊二烯二磷酸合酶”的日本专利申请号8-191635]。使用该方法生产的酶使产生的反应产物具有一些链长度。然而，尚不知道诱导牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶突变以控制反应产物以短链长度侧链产生法呢基二磷酸的方法。
本发明的概述
本发明的一个目的是经过修饰异戊二烯二磷酸酶的氨基酸序列建立生产法呢基二磷酸合酶的方法。更稳定或具有更高比活，更适于工业应用的新酶使其可能立即获得突变的异戊二烯二磷酸合酶或其基因，该酶产生法呢基二磷酸并保留突变前异戊二烯二磷酸合酶所具有的特征。
从突变体酸热硫化叶菌(S.acidocaldarius)牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶的基因的核苷酸序列上的信息，清楚了根据异戊二烯二磷酸合酶的氨基酸序列分析提出了两个富含天冬氨酸的区域中，在氨基末端侧的富含天冬氨酸区的保守序列I(DDXX(XX)D)内的氨基酸残基或从所说的保守序列I的氨基末端N端侧的5个氨基酸残基涉及控制反应产物的链长度。
因此，本发明提供了具有修饰的氨基酸序列的突变异戊二烯二磷酸合酶，其中：
至少一个氨基酸残基选自：(a)存在于II区的富含天冬氨酸区DDXX(XX)D从N端的D起N端方向的第5位氨基酸残基与位于从所说的N端的D起N端方向第一位的氨基酸残基之间的氨基酸残基，和(b)所说的富含天冬氨酸区从C端的D起N端方向第一位的氨基酸残基的氨基酸残基已被另一氨基酸取代，
和/或另外的氨基酸已插入到从所说的富含天冬氨酸区的C端的D起N端方向的第一位氨基酸残基和C端的D之间，
其中DDXX(XX)D中X指任意氨基酸，括号中的两个“X”可以不存在，
优选地，藉此与天然型异戊二烯二磷酸合酶合成的异戊二烯二磷酸相比，所述的突变型异戊二烯二磷酸合酶能够合成链长较短的法呢基二磷酸，该天然异戊二烯二磷酸合酶具有Seq.Id.No：1的序列。
本发明提供了产生法呢基二磷酸的突变型异戊二烯二磷酸合酶，它保留天然异戊二烯二磷酸合酶所具有的特性。
本发明还提供了编码上述酶的DNA或RNA，优选地，该RNA由上述DNA转录而得。
本发明进一步提供了一种重组载体，更具体地说是包含上述DNA的表达载体。
本发明进一步提供了由上述载体转化的宿主，优选地，宿主为微生物。
本发明进一步提供了生产具有不超过15个碳原子的异戊二烯二磷酸的方法，包括将上述酶与选自异戊二烯二磷酸，二甲丙烯基二磷酸，和牻牛儿基二磷酸的底物接触。
本发明进一步提供了本发明的突变酶的方法，所说的方法包含培养上述宿主并从培养基中收获表达产物的步骤。
附图的简要解释：
图1是显示各种异戊二烯二磷酸合酶的区域(I)至(V)和富含天冬氨酸区I的图示。在该图中，该序列代表牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶的氨基酸序列，ATGERPYRS来自Arabidopsis thaliana，LA15778.p来自Lupinas albus，CAGERDIS来自Capsicum annuum，ATGGPSRP来自Arabidopsis thaliana，GGPS-pep来自酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldaris)，SPCRT.pep来自Rhodobactor sphaeroides，RCPHSYNG来自Rhodobactor capsulatus，EHCRTS.pe.来自草生欧文氏杆菌，MXCRTNODA来自Myxococcus thaliana，NCAL3.pep来自粗糙链孢霉(Neurospora crassa)。各氨基酸序列左侧标出的数字代表在氨基酸序列N端从各牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶N端侧的位置。
图2显示了突变的异戊二烯二磷酸合酶热稳定性的图示。纵坐标表示在60℃培养时对100％的相对活性。横坐标表示培养温度。SacGGPS是突变前的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶。其它代表各突变型酶。BstFPS是来自嗜热脂肪芽孢杆菌的法呢基二磷酸合酶。
图3显示了当牻牛儿基二磷酸用作烯丙基类底物时突变的异戊二烯二磷酸合酶的脱磷酸化反应产物的薄层色谱的形成方式。在图中，ori.代表形成起点，s.f.体的情况下是一个亚基)[A.Chem等，蛋白质料学vol.3.pp.600-607，1994]。已知在5个保守区中，在II区中有一个富含天冬氨酸的保守序列I[DDXX(XX)D](其中X指任意氨基酸，括号中的两个“X”可以不存在)。尽管在V区中也有一个表示为DDXXD的富含天冬氨酸区，但用于限定本发明的氨基酸序列修饰区的富含天冬氨酸区是在II区中存在的富含天冬氨酸区，且该区域与存在于V区的富含天冬氨酸区II相比称为富含天冬氨酸区I。
对于具有上面所述的富含天冬氨酸区的异戊二烯二磷酸合酶，可提及的有法呢基二磷酸合酶，牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶，六异戊二烯二磷酸合酶，七异戊二烯二磷酸合酶，八异戊二烯二磷酸合酶，九异戊二烯二磷酸合酶，十一戊烯二磷酸合酶，等。更具体的例子包括嗜热脂肪芽孢杆菌的法呢基二磷酸合酶，大肠杆菌的法呢基二磷酸合酶，啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的法呢基二磷酸合酶，大鼠的法呢基二磷酸合酶，人的法呢基二磷酸合酶，粗糙链孢霉的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶，啤酒糖酵母的六异戊二烯二磷酸合酶，等。
关于其中的一些例子，牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶的氨基酸序列I至V区及II区中的富含天冬氨酸区I(在盒中)在图1中显示。
本发明可应用于具有富含天冬氨酸I的任意异戊二烯二磷酸合酶。
根据本发明，在异戊二烯二磷酸合酶的氨基酸序列中，至少一个氨基酸残基选自：(a)存在于II区的富含天冬氨酸区DDXX(XX)D从N端的D起N端方向的第5位氨基酸残基与位于从所说的N端的D起N端方向第一位的氨基酸残基之间的氨基酸残基，和(b)所说的富含天冬氨酸区从C端的D起N端方向第一位的氨基酸残基的氨基酸残基已被另一氨基酸取代，
和/或另外的氨基酸已插入到从所说的富含天冬氨酸区的C端的D起N端方向的第一位氨基酸残基和C端的D之间，
其中DDXX(XX)D中X指任意氨基酸，括号中的两个“X”可以不存在，优选地，藉此与天然型异戊二烯二磷酸合酶合成的异戊二烯二磷酸相比，所述的突变型异戊二烯二磷酸合酶能够合成链长较短的法呢基二磷酸，
根据本发明，以实施例的方式，将高嗜热的archaea.酸热硫化叶菌的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶的基因用作起始材料。酸热硫化叶菌可从ATCC以ATCC号33909获得。克隆该基因的方法在日本未审专利公开号7-308193中已有详细描述。在诸如Gen Bank的基因信息数据库中以保藏号D28748已进行了公开。经过使用该序列，以本领域已知的常规方法可克隆该基因。其它克隆方法的例子在本文实施例1中说明，其核苷酸序列在SEQ ID NO：2中显示。
更具体地说，本发明的突变体酶是突变的异戊二烯二磷酸合酶，其特征在于选自77位的苯丙氨酸，78位的苏氨酸，80位的缬氨酸，81位的组氨酸和84位的异亮氨酸的至少一个氨基酸被另一氨基酸取代，和/或一个或多个氨基酸已插入到具有SEQ ID NO：1所述氨基酸序列的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶的84位异亮氨酸和85位的甲硫氨酸之间。
以实施例的方式提供了氨基酸序列，其中氨基酸已作了如下所示的取代：
突变酶1：78位的苏氨酸变为苯丙氨酸，81位的组氨酸变为丙氨酸；
突变酶2：78位的苏氨酸变为苯丙氨酸，81位的组氨酸变为亮氨酸；
突变酶3：77位的苯丙氨酸变为酪氨酸，78位的苏氨酸变为苯丙氨酸，81位的组氨酸变为亮氨酸；
突变酶4：77位的苯丙氨酸变为酪氨酸，78位的苏氨酸变为苯丙氨酸，81位的组氨酸变为丙氨酸；
突变酶5：77位的苯丙氨酸变为酪氨酸，78位的苏氨酸变为丝氨酸，80位的缬氨酸变为异亮氨酸，84位的异亮氨酸变为亮氨酸，脯氨酸和丝氨酸插入在84位的异亮氨酸和85位的甲硫氨酸之间。
根据本发明，表明突变的异戊二烯二磷酸合酶保留了天然异戊二烯二磷酸合酶所具有的特征性特性。以实施例的方式，上述5个突变酶显示了几乎相当于天然牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶所具有的热抗性。
已知酶有些能表现出其原始酶活性。即使当它与原始氨基酸序列相比经添加，去掉和/或取代一个或几个氨基酸。因此，本发明试图包含与SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列相比经添加，缺失和/或取代一个或几个，例如多达5个或多达10个氨基酸而进行修饰且能执行其原始功能的那些酶。
本发明还提供了编码上述各种突变酶的基因，含有该基因的载体，特别是表达载体和由所说载体转化的宿主。本发明的基因(DNA)可易于获得，例如，使用诸如定点诱变，PCR等的常规方法将突变导入编码SEQ ID NO：1所述的原始氨基酸序列的DNA中。
而且，一旦测定了所需酶的氨基酸序列，可测定编码它的合适的核苷酸序列，且可根据常规DNA合成方法化学合成该DNA。
本发明进一步提供了包含诸如上面提到的一种的DNA的表达载体，以所说表达载体转化的宿主，和使用这些宿主生产本发明的酶或肽的方法。
表达载体含有复制起点，表达调节序列等，但它们可根据使用的宿主而变化。至于宿主，有所述的原核生物，例如，细菌，如大肠杆菌，芽孢杆菌属生物，如枯草芽孢杆菌，和真核微生物，例如真菌，如酵母，例如糖酵母属(Saccharomyces)中的啤酒糖酵母和毕赤氏酵母属(Pichia)的巴斯德毕赤氏酵母(PichiaPastoris)，丝状真菌，例如，曲霉属(Aspergillus)，如黑色曲霉，动物细胞，如培养的蚕细胞，培养的高等动物细胞，例如CHO细胞等。而且，植物也可用作宿主。
如实施例所述，根据本发明，经过培养用本发明的DNA转化的宿主，在培养基中可集累法呢基二磷酸，可进行收获以生产其法呢基二磷酸。而且，根据本发明，也可以将用本发明的方法生产的突变异戊二烯二磷酸合酶与底物异戊二烯二磷酸和诸如二甲丙烯基二磷酸和牻牛儿基二磷酸的各烯丙基类底物接触来生产法呢基二磷酸。
当大肠杆菌用作宿主时，已知宿主在从DNA转录mRNA和从mRNA翻译蛋白质阶段具有调节功能。至于调节mRNA合成的启动子序列，除了天然存在的序列(例如，lac，trp，bla，lpp，PL，PR，ter，T3，T7等)外，已知其突变体(例如，lac UV5)和其中将天然存在的启动子进行人工融合的序列(如，tac，trc等)，它们可用于本发明。
已知核糖体结合位点序列(GGAGG和其相似序列)与起始密码子ATG之间的距离作为调节从mRNA合成蛋白质的能力的序列是重要的。也熟知在3’端指导转录终止的终止子(例如，含rrn PT1T2的载体可从Pharmacia买到)影响经重组合成蛋白质的效率。
至于可用于制备本发明的重组载体的载体，可使用商业上可获得的载体，或根据目的用途选用的所述各种载体。例如，可提及的有pBR322，pBR327，pKK223-3，pKK233-3，pTrc99，及具有来自pMB1的复制子的类似载体；
pUC18，pUC19，pUC118，pUC119，pTV118N，pTV119N，pBluescript，pHSG298，pHSG396和已改变成拷贝数增加的类似载体。和pACYC177，pACYC184，和具有来自p15A的复制子的类似载体，而且还有来自pSC101，ColE1，R1，F因子的质粒等。
而且，可使用诸如pGEX-2T，pGEX-3X，pMal-C2的易于纯化的融合蛋白表达载体。用作本发明起始材料的基因的一个例子已在日本未审专利公开号7-308193中描述。
而且，除了质粒外，诸如入噬菌体或M13噬菌体的病毒载体或转座子可用于基因的转化。至于将基因转化进非大肠杆菌的微生物，经pUB110(可从Sigma买到)或pHY300PLK(可从Takara Shuzo买到)将基因转化进芽孢杆菌属生物中是已知的。这些载体在《分子克隆》(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，冷泉港实验室出版社)和《克隆载体》(P.H.Pouwels，BB.Enger，Valk，和W.J.Brammar，Elsevier)和产品目录中有描述。
使用合适的限制性酶和连接酶经已知的方法可将编码异戊二烯二磷酸合酶和(如果需要的话)具有调节所述酶的基因表达之功能的DNA片段整合进这些载体中。由此构建的质粒的具体例子包括，(例如)pBs-SacGGPS。
使用该重组载体可直接导入基因的微生物包括大肠杆菌和芽孢杆菌属微生物。使用一般方法。例如CaCl2方法和原生质体方法也可进行该转化，如“分子克隆”(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港实验室出版社)和“DNA克隆”Vol.I至III(D.M.Clover编辑.IRL出版社)所述。
为了产生本发明的突变酶，培养上面转化的宿主细胞，然后对所说的培养基进行包含盐析，用有机溶剂沉淀，凝胶色谱，亲和色谱，疏水色谱，离子交换色谱等的任何方法以回收并纯化所说的酶。
本发明还提供了使用本发明的酶生产法呢基二磷酸的方法。根据该方法，本发明的酶与培养基中，特别是含水培养基中的底物反应，然而，如果需要，从反应培养基中收获异戊二烯二磷酸。至于酶，不仅可使用纯化的酶，还可使用半纯化成各种状态的粗制酶，或微生物培养基的混合物。作为选择，可使用根据一般方法从所说的酶，所说的粗制酶，或含该酶的产品制备的固相酶。
至于底物，可使用二甲基烯丙基二磷酸或牻牛儿基二磷酸和异戊二烯二磷酸。至于反应培养基，可使用水，含水缓冲溶液，例如，Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液等。
经过使用本发明获得的生产突变的异戊二烯二磷酸合酶的方法，可生产更稳定的因而更易于操作的生产异戊二烯二磷酸的来自archaea的突变异戊二烯二磷酸合酶。而且，还期望生产加入其中的具有突变前的异戊二烯二磷酸合酶特征(例如，盐稳定性或在大范围PH内的稳定性)的产法呢基二磷酸的突变型异戊二烯二磷酸合酶。
在本发明的权利要求和说明书中，氨基酸残基以下文所述的单字母代码或三字母代码表示：
A；Ala；丙氨酸
C；Cys；半胱氨酸
D；Asp；天冬氨酸
E；Glu；谷氨酸
F；Phe；苯丙氨酸
G；Gly；甘氨酸
H；His；组氨酸
I；Ile；异亮氨酸
K；Lys；赖氨酸
L；Leu；亮氨酸
M；Met；甲硫氨酸
N；Asn；天冬酰酸
P；Pro；脯氨酸
Q；Gln；谷氨酰胺
R；Arg；精氨酸
S；Ser；丝氨酸
T；Thr；苏氨酸
V；Val；缬氨酸
W；Trp；色氨酸
Y；Tyr；酪氨酸
氨基酸的取代以单字母代码的氨基酸表示的“取代前的氨基酸残基”、“氨基酸残基号”和“取代后的氨基酸残基”的顺序来表达。例如，81位的酪氨酸残基被甲硫氨酸残基取代的突变表达为Y81M。而且，氨基酸残基的插入表达为“插入前插入位点N端侧的氨基酸残基号”，“插入的氨基酸残基”和“插入前插入位点的C端侧的氨基酸残基号”。例如，在84位氨基酸和85位氨基酸之间插入丙氨酸表达为84A85。
实施例：
现在参考具体实施例解释本发明，但它们不应以任何方式构成限制本发明。
实施例1含牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶的基因的质粒的构建
来自酸热硫化叶菌的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(下文称为SacGGPS)的基因在可从Toyoboseki买到的质粒载体pBluescript II(KS+)的HindIII位点进行亚克隆。质粒DNA命名为pBs-SacGGPS。SacGGPS基因可从大肠杆菌DH5α(pGGPS1)获得，后者以保藏号FERM BP-4982于1994年1月31日保藏于生物科学和人类技术国家研究所(工业科学和技术机构，日本，Ibalaki)。
SacGGPS基因的完整的核苷酸序列也在日本未审专利公开号7-308193，Shin-ichi Ohnuma等(1994)，生物化学杂志Vol.269：14792-14797，或在诸如GenBank的遗传信息数据库中以保藏号D28748公开。由于酸热硫化叶菌也可从诸如ATCC等的各种微生物保藏单位获得(如ATCC号33909)，SacGGPS的基因区DNA可经过常规基因克隆方法获得。
实施例2导入突变的寡核苷酸的合成
为了对牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶的基因导入突变，设计并合成了下列寡核苷酸：
引物DNA(T78F，H81A)：
5’-CATACTTTTTTCCTTGTGGCTGATGATATCATGGATC-3’(SEQ ID No：3)
引物DNA(T78F，H81L)：
5’A-CTACTTTTTTCCTTGTGCTTGATGATATCATGGATC-3’(SEQ ID No：4)
引物DNA(F77Y，T78F，H81L)：
5’-CATACTTATTTCCTTGTGCTTGATGATATCATGGATC-3’(SEQ ID No：5)
引物DNA(F77Y，T78F，H81A)：
5’CATACTTATTTCCTTGTGGCTGATGATATCATGGATC-3’(SEQ ID NO：6)
引物DNA在(F77Y，T78S，V80I，I84L，84PS85)：
5’-GTTCTTCATACTTATTCGCTTATTCATGATAGTATT-3’(SEQ ID No：7)，和5’-ATTCATGATGATCTTCCATCGATGGATCAAGAT-3’(SEQ ID No：8)
使用2个核苷酸影响突变的导入(F77Y，T78S，V80I，I84L，84PS85。首先使用寡核苷酸5’-GTTCTTCAT ACTTATTCGCTTATTCATGATAGTATT-3’(SEQ ID No：7)按实施例3所述导入突变，按照实施例4制备转化子，然后使用寡核苷酸5’-ATTCATGATGATCTTCCATCCATGGATCAAGAT-3’(SEQ ID No：8)将突变导入由此获得的质粒。
这些核苷酸在编码至少一个选自Sac GGPS77位苯丙氨酸，78位苏氨酸，80位缬氨酸，81位组氨酸，84位异亮氨酸的氨基酸残基的密码子中具有突变。除了导入插入84位异亮氨酸和85位甲硫氨酸之间的编码一个氨基酸的密码子外，将它们设计成新导入限制性酶BspHI(5’TGATGA3’)的裂解位点，限制性酶EcoRV的裂解位点(5’GATATC3’)，或限制性酶ClaI的裂解位点(5’ATCGAT3’)。在导入BspHI裂解位点时，由SacGGPS基团编码的氨基酸序列由于密码子的简并性而不改变，或其作为导入突变的位点。用合适的限制性酶消化后借助于琼脂糖凝胶电泳用于检测取代突变的质粒，由于经取代将突变导入了SacGGPS基因，同时产生了新的限制性酶的裂解位点。
这些引物DNA在下面所示的反应培养基中37℃进行磷酸化处理30分钟，接着在70℃变性处理10分钟：
10Pmol/μl引物DNA 2μl
10×激酶缓冲液    1μl
10×mM ATP        1μl
H2O              5μl
T4多核苷酸激酶    1μl
其中，10X激酶缓冲液是1000mM Tris-Cl(pH8.0)，100mM MgCl2，和70mM DTT.
实施例3取代突变导入SacGGPSS基团
使用实施例2构建的各引物DNA，根据Kunkel方法将取代突变导入实施例1制备的质粒。使用可从Takara Shuzo买到的Mutan-K试剂盒进行Kunkel方法。实验程序如试剂盒说明书所述。质粒的取代突变不必以Kunkel方法进行。例如，经过使用聚合酶链式反应(PCR)的方法可获得相同的结果。
使用Mutan-K试剂盒中的大肠杆菌CJ236作为宿主细胞，可获得单链DNA，其中质粒pBS-SacGGPS的胸腺嘧啶碱基被脱氧尿嘧啶碱基取代。
由此获得的单链DNA用作反应中的模板，其中合成互补链的引物DNA在下面反应溶液中65℃处理15分钟，然后使链在37℃处理15分钟进行退火：
单链DNA                  0.6pmol
退火缓冲溶液             1μl
引物DNA溶液(实施例2)     1μl
加水使终体积为                10μl
其中退火缓冲液是200mM Tris-Cl(pH8.0)，100mM MgCl2，500mM NaCl，和10mMDTT。
而且，加入25μl的延长缓冲溶液，60单位的大肠杆菌DNA连接酶，和1单位的T4 DNA聚合酶以便在25℃下合成互补链2小时。延长缓冲溶液是50mMTris-Cl(pH8.0)，60mM乙酸铵，5mM MgCl2，5mM DTT，1mM NAD和0.5mM dNTP。
反应结束后，加入3μl 0.2M EDTA(pH8.0)并在65℃进行处理5分钟以终止反应。
实施例4构建具有已导入取代突变的SacGGPS基因的重组体
按照实施例3配制的DNA溶液用于以CaCl2方法转化大肠杆菌XL1-Blue。其它的方法，如电穿孔产生相似的结果。非大肠杆菌XL1-Blue的宿主细胞，例如JM109等也产生相似的结果。
以CaCl2方法获得的转化子涂布到含氨苄青霉素(转化子的一种可选择的标记)的琼脂板上，在37℃培养过夜。
在按上面所述获得的转化子中，选择具有BspHI，EcoRV或ClaI裂解位点的取代突变的pBs-SacGGPS质粒。以双脱氧法测定了相应选定的取代突变的pBs-SacGGPS质粒中进行SacGGPS基因突变的氨基酸残基的密码子周围的核苷酸序列。结果获得了含有下列5个突变的SacGGPPS基因的pBs-SacGGPS质粒。编码从77位氨基酸到85位氨基酸的氨基酸序列的核苷酸序列如下所示：
突变           核苷酸序列
T77F，H81A：5’-TTTTTCCTTGTGGCTGATGATATCATG-3’(SEQ ID No：9)
T78F，H81L：5’-TTTTTCCTTGTGCTTGATGATATCATG-3’(SEQ ID No：10)
F77Y，T78F，H81L：5’-TATTTCCTTGTGCTTGATGATATCATG-3’(SEQ ID No：11)
F77Y，T78F，H81A：5’-TATTTCCTTGTGGCTGATGATATCATG-3’(SEQ ID No：12)
F77Y，T78S，V80I，I84L，84PS85：
5’- ATTCATGATGATCTTCCATCGATG-3’(SEQ ID No：13)
野生型：5’-TTTACGCTTGTGCATGATGATATTATG-3’(SEQ ID No：14)。
实施例5测量突变的异戊二烯二磷酸合酶的活性
从实施例4中获得的6个包含5个突变SacGGPS基因和一个野生型SacGGPS基因的转化子中按如下方法制备粗制酶溶液。
离心在2×LB培养基中培养过夜的转化子以收获细胞，然后将细胞悬浮于缓冲液中进行细胞匀浆(50mM磷酸钙缓冲溶液(pH5.8)，10mM β-巯基乙醇，1mMEDTA)。经声处理匀浆，然后在4℃以10,000r.p.m离心10分钟。获得的上清在55℃处理12小时以灭活来自大肠杆菌的异戊二烯二磷酸合酶的活性。在相同条件下进一步离心且获得的上清液用作粗制酶提取物。研究热稳定性时，酶提取物在反应前于60℃，70℃(对于来自嗜热脂肪芽孢杆菌的酶用60℃，65℃，67℃或70℃)培养1小时。反应在55℃下在下列反应溶液中进行15分钟：
[1-14C]-异戊二烯二磷酸(1Ci/mol)        25nmol
烯丙基类二磷酸(牻牛儿基二磷酸)          25nmol
磷酸钾缓冲液(pH5.8)                     10mM
MgCl2                                  5mM
酶溶液                                  100μg
H2O                                    至终体积为200μl
反应完成后，向反应溶液中加入200μl饱和的NaCl，并向其中加入1ml水饱和的丁醇，然后搅拌，离心并分成两相。向800μl获得的丁醇层中加3ml液闪体，然后以闪烁计数器测定放射活性。结果在图2中显示。
突变的异戊二烯二磷酸合酶表现出的热稳定性等于天然牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶，高于来自嗜热脂肪芽孢杆菌的法呢基二磷酸合酶。
经过在加热丁醇层时向其中通入氮气从丁醇层残留物中蒸发溶剂以便将体积浓缩为大约0.5ml。向浓缩物中加入2ml甲醇和1ml马铃薯酸性磷酸酶溶液(2mg/ml马铃薯酸性磷酸酶，0.5M乙酸钠(pH4.7))在37℃影响去磷酸反应。随后用3ml n-戊烷提取磷酸化的反应产物。
经过向其中通入氮气并蒸发溶剂进行浓缩，然后以TLC进行分析(反相TLC平板，LKC18(Whatman)，形成溶剂：丙酮/水＝9/1)。以Bio Image AnalyzerBAS2000(Fuji Photo Film)分析形成的去磷酸化反应产物以测定放射活性的位置。当牻牛儿基二磷酸用作烯丙基类底物时结果在图3中显示。
突变的异戊二烯二磷酸合酶的反应产物显示为法呢基二磷酸。
序列表
SEQ ID No：1
长度：330
类型：氨基酸
拓扑：线型
分子类型：蛋白质
原始来源：
生物：酸热硫化叶菌
菌株：ATCC 33909
特征：
关键特征：富含Asp区
位置：82-86
Met Set Tyr Phe Asp Asn Tyr Phe Asn Glu Ile Val Asn Ser Val Asn
                  5                  10                  15
Asp Ile Ile Lys Ser Tyr Ile Ser Gly Asp Val Pro Lys Leu Tyr Glu
             20                  25                  30
Ala Set Tyr His Leu Phe Thr Set Gly Gly Lys Arg Leu Arg Pro Leu
         35                  40                  45
Ile Leu Thr Ile Ser Ser Asp Leu Phe Gly Gly Gln Arg Glu Arg Ala
     50                  55                  60
Tyr Tyr Ala Gly Ala Ala Ile Glu Val Leu His Thr Phe Thr Leu Val
 65                  70                  75                  80
His Asp Asp Ile Met Asp Gln Asp Asn Ile Arg Arg Gly Leu Pro Thr
                 85                  90                  95
Val His Val Lys Tyr Gly Leu Pro Leu Ala Ile Leu Ala Gly Asp Leu
            100                 105                 110
Leu His Ala Lys Ala Phe Gln Leu Leu Thr Gln Aln Leu Arg Gly Leu
        115                 120                 125
Pro Ser Glu Thr Ile Ile Lys Alo Phe Asp Ile Phe Thr Arg Ser Ile
    130                 135                 140
Ile Ile Ile Ser Glu Gly Gln Aln Val Asp Met Glu The Glu Asp Arg
145                 150                 155                 160
Ile Asp Ile Lys Glu Gln Glu Tyr Leu Asp Met Ile Ser Arg Lys Thr
                165                 170                 175
Ala Ala Leu Phe Ser Ala Ser Ser Ser Ile Gly Ala Leu Ile Ala Gly
            180                 185                 190
Ala Asn Asp Asn Asp Val Arg Leu Met Ser Asp Phe Gly Thr Asn Leu
        195                 200                 205
Gly Ile Ala Phe Gln Ile Val Asp Asp Ile Leu Gly Leu Thr Ala Asp
    210                 215                 220
Glu Lys Glu Leu Gly Lys Pro Val Phe Ser Asp Ile Arg Glu Gly Lys
225                 230                 235                 240
Lys Thr Ile Leu Val Ile Lys Thr Leu Glu Leu Cys Lys Glu Asp Glu
                245                 250                 255
Lys Lys Ile Val Leu Lys Ala Leu Gly Asn Lys Ser Ala Ser Lys Glu
            260                 265                 270
Glu Leu Met Ser Ser Ala Asp Ile Ile Lys Lye Tyt Set Leu Asp Tyr
        275                 280                 285
Ala Tyr Asn Leu Ala Glu Lys Tyr Tyr Lys Asn Ala Ile Asp Ser Leu
    290                 295                 300
Asn Gln Val Ser Ser Lys Ser Asp Ile Pro Gly Lys Alu Leu Lys Tyr
305                 310                 315                 320
Leu Ala Glu Phe Ihr Ile Arg Arg Arg Lys
                325                 330
SEQ ID No：2
长度：993
类型：核酸
链型：双链
拓扑：线型
分子类型：基因组DNA
生物来源：
生物：酸热硫化叶菌
菌株：ATCC33909
特征：特征关键：编码富含Asp区、
位置：246-258
ATGAGTTACT TTGACAACTA TTTTAATGAG ATTGTTAATT CTGTAAACGA CATTATTAAG    60
AGCTATATAT CTGGAGATGT TCCTAAACTA TATGAAGCCT CATATCATTT GTTTACATCT   120
GGAGGTAAGA GGTTAAGACC ATTAATCTTA ACTATATCAT CAGATTTATT CGGAGGACAG   180
AGAGAAAGAG CTTATTATGC AGGTGCAGCT ATTGAAGTTC TTCATACTTT TACGCTTGTG   240
CATGATGATA TTATGGATCA AGATAATATC AGAAGAGGGT TACCCACAGT CCACGTGAAA   300
TACGGCTTAC CCTTAGCAAT ATTAGCTGGG GATTTACTAC ATGCAAAGGC TTTTCAGCTC   350
TTAACCCAGG CTCTTAGAGG TTTGCCAAGT GAAACCATAA TTAAGGCTTT CGATATTTTC   420
ACTCGTTCAA TAATAATTAT ATCCGAAGGA CAGGCAGTAG ATATGGAATT TGAGGACAGA   480
ATTGATATAA AGGAGCAGGA ATACCTTGAC ATGATCTCAC GTAAGACAGC TGCATTATTC   540
TCGGCATCCT CAAGTATAGG CGCACTTATT GCTGGTGCTA ATGATAATGA TGTAAGACTG   600
ATGTCTGATT TCGGTACGAA TCTAGGTATT GCATTTCAGA TTGTTGACGA TATCTTAGGT   650
CTAACAGCAG ACGAAAAGGA ACTTGGAAAG CCTGTTTTTA GTGATATTAG GGAGGGTAAA   720
AAGACTATAC TTGTAATAAA AACACTGGAG CTTTGTAAAG AGGACGAGAA GAAGATTGTC   780
CTAAAGGCGT TAGGTAATAA GTCAGCCTCA AAAGAAGAAT TAATGAGCTC AGCAGATATA   840
ATTAAGAAAT ACTCTTTAGA TTATGCATAC AATTTAGCAG AGAAATATTA TAAAAATGCT   900
ATAGACTCTT TAAATCAAGT CTCCTCTAAG AGTGATATAC CTGGAAAGGC TTTAAAATAT   950
CTAGCTGAAT TTACGATAAG AAGGAGAAAA TAA
SEQ ID No：3
长度：37
类型：核酸
链型：单链
拓扑：线型
分子类型：合成的DNA
序列描述
CATACTTTTT TCCTTGTGGC TGATGATATC ATGGATC
SEQ ID No：4
长度：37
类型：核酸
链型：单链
拓扑：线型
分子类型：合成的DNA
序列描述
CATCTTTTT TCCTGTGCT TGATGATATC ATGGATC
SEQ ID No：5
长度：37
类型：核酸
链型：单链
拓扑：线型
分子类型：合成的DNA
序列描述
CATACTTATT TCCTTGTGCT TGATGATATC ATGGATC
SEQ ID No：6
长度：37
类型：核酸
链型：单链
拓扑：线型
分子类型：合成的DNA
序列描述
CATACTTATT TCCTTGTGGC TGATGATATC ATGGATC
SEQ ID No：7
长度：36
类型：核酸
链型：单链
拓扑：线型
分子类型：合成的DNA
序列描述
GTTCTTCATA CTTATTCGCT TATTCATGAT AGTATT
SEQ ID No：8
长度：33
类型：核酸
链型：单链
拓扑：线型
分子类型：合成的DNA
序列描述
ATTCATGATG ATCTTCCATC GATGGATCAA GAT
SEQ ID No：9
长度：27
类型：核酸
链型：单链
拓扑：线型
分子类型：合成的DNA
序列描述
TTTTTCCTTG TGGCTGATGA TATCATG
SEQ ID No：10
长度：27
类型：核酸
链型：单链
拓扑：线型
分子类型：合成的DNA
序列描述
TTTTTCCTTG TGCTTGATGA TATCATG
SEQ ID No：11
长度：27
类型：核酸
链型：单链
拓扑：线型
分子类型：合成的DNA
序列描述
TATTTCCTTG TGCTTGATGA TATCATG
SEQ ID No：12
长度：27
类型：核酸
链型：单链
拓扑：线型
分子类型：合成的DNA
序列描述
TATTTCCTTG TGGCTGATGA TATCATG
SEQ ID No：13
长度：33
类型：核酸
链型：单链
拓扑：线型
分子类型：合成的DNA
序列描述
TATTCGCTTA TTCATGATGA TCTTCCATCG ATG
SEQ ID No：14
长度：27
类型：核酸
链型：单链
拓扑：线型
分子类型：合成的DNA
序列描述
TTTACGCTTG TGCATGATGA TATTATG

Claims (15)

1、一种具有修饰的氨基酸序列的突变型异戊二烯二磷酸合酶，其中：
至少一个氨基酸残基选自：(a)存在于II区的富含天冬氨酸区DDXX(XX)D从N端的D起N端方向的第5位氨基酸残基与位于从所说的N端的D起N端方向第一位的氨基酸残基之间的氨基酸残基，和(b)所说的富含天冬氨酸区从C端的D起N端方向第一位的氨基酸残基的氨基酸残基已被另一氨基酸取代，
和/或另外的氨基酸已插入到从所说的富含天冬氨酸区的C端的D起N端方向的第一位氨基酸残基和C端的D之间，
其中DDXX(XX)D中X指任意氨基酸，括号中的两个“X”可以不存在，
藉此与天然型异戊二烯二磷酸合酶合成的异戊二烯二磷酸相比，所述的突变型异戊二烯二磷酸合酶能够合成链长较短的法呢基二磷酸，该天然异戊二烯二磷酸合酶具有Seq.Id.No：1的序列。
2、根据权利要求1的突变型异戊二烯二磷酸合酶，其中的异戊二烯二磷酸合酶是同型二聚体。
3、根据权利要求1或2的突变型异戊二烯二磷酸合酶，其中的异戊二烯二磷酸合酶来自archaea。
4、根据权利要求1或2的突变型异戊二烯二磷酸合酶，其中的异戊二烯二磷酸合酶来自酸热硫化叶菌。
5、根据权利要求1或2的突变型异戊二烯二磷酸合酶，其中的异戊二烯二磷酸合酶保留突变前异戊二烯二磷酸合酶所具有的特性。
6、根据权利要求1或2的突变型异戊二烯二磷酸合酶，其中异戊二烯二磷酸合酶是热稳定性酶。
7、根据权利要求1或2的突变型异戊二烯二磷酸合酶，其中，SEQ ID No：1所述的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶中，至少一个选自77位的苯丙氨酸，78位的苏氨酸，80位的缬氨酸，81位的组氨酸和84位的异亮氨酸的氨基酸被另一氨基酸取代，或一个或多个氨基酸插入到84位的异亮氨酸和85位的甲硫氨酸之间。
8、根据权利要求1或2的突变型异戊二烯二磷酸合酶，其中，SEQ ID No：1所述的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶中，至少一个选自77位的苯丙氨基，78位的苏氨酸，80位的缬氨酸，81位的组氨酸和84位的异亮氨酸的氨基酸被另一氨基酸取代，和/或2个氨基酸84位的亮氨酸和85位的甲硫氨酸之间，其中77位的苯丙氨酸被酪氨酸取代，78位的苏氨酸被苯丙氨酸或丝氨酸取代，80位的缬氨酸被异亮氨酸取代，81位的组氨酸被亮氨酸或丙氨酸取代时或84位的异亮氨酸被亮氨酸取代，或脯氨酸和丝氨酸插入到84位的异亮氨酸和85位的甲硫氨酸之间。
9、根据权利要求1或2的突变型异戊二烯二磷酸合酶，其中的突变型异戊二烯二磷酸合酶来自选自Arabidopsis thaliana，Lupinas  albus，Capsicum annuum，酸热硫化叶菌，Rhodobactor sphaeroides，Rhodobactorcapsulatus，草生欧文氏杆菌，Myxococcus thaliana和粗糙链孢霉的生物体的天然牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶。
10、一种编码根据权利要求1至9中任意一项的酶的DNA。
11、一种由根据权利要求10的DNA转录而得的RNA。
12、一种包含根据权利要求10的DNA的重组载体。
13、一种用根据权利要求12的重组载体转化的宿主微生物体。
14、一种生产根据权利要求1至9中任意一项的突变酶的方法，所说的方法包含培养根据权利要求13的宿主并从培养物中收获表达产物的步骤。
15、一种生产具有不超过15个碳的异戊二烯二磷酸的方法，包含将根据权利要求1至9中任意一项的酶或由根据权利要求14的方法产生的酶与选自异戊二烯二磷酸，二甲烯丙基二磷酸和牻牛儿基二磷酸的底物接触。
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