JP3087575B2

JP3087575B2 - ヘプタプレニル二リン酸合成酵素およびそれをコードするｄｎａ

Info

Publication number: JP3087575B2
Application number: JP06179336A
Authority: JP
Inventors: あゆみ小池; 充生小畑; 協三小倉; 種俊古山
Original assignee: Toyota Motor Corp
Current assignee: Toyota Motor Corp
Priority date: 1994-07-29
Filing date: 1994-07-29
Publication date: 2000-09-11
Anticipated expiration: 2015-09-11
Also published as: US6020177A; EP0699761A2; EP0699761B1; JPH0838168A; DE69501069D1; DE69501069T2; EP0699761A3; US5773265A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、バチラス・ステアロサ
ーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のヘプタプレニル二リン酸
（以下、「ＨＤＰ」と略記する場合がある）合成酵素、
該酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んで成る発現
ベクター、該発現ベクターにより形質転換された宿主、
該宿主によるヘプタプレニル二リン酸合成酵素の製造方
法、並びに前記酵素又は前記宿主を用いてのヘプタプレ
ニル二リン酸の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＨＤＰは４分子のイソペンテニル二リン
酸と１分子のファルネシル二リン酸の縮合により生じ、
プレニルキノン等のイソプレノイドの重要な生合成中間
体である。ＨＤＰ合成酵素の存在は、バシルス・ズブチ
リス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５，ｐ４５３９−４５４３（１
９８０））など一部の微生物において知られているが、
そのアミノ酸配列やそれをコードする遺伝子の塩基配列
は知られていない。

【０００３】プレニルトランスフェラーゼをコードする
遺伝子としては、ファルネシル二リン酸合成酵素をコー
ドする遺伝子（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，ｐ４
６０７−４６１４（１９９０））、及びゲラニルゲラニ
ル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９ｐ６７６１
−６７６４）が知られている。しかしながら、それらが
ホモダイマーであるのに対して、バシルス・ズブチリス
のＨＤＰ合成酵素はヘテロダイマーであり（ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｌ．１６１，２５７−２６０（１９８３））であ
り、前二者と後者の間のアミノ酸配列の相同性について
は全く情報が存在しない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、その
存在が知られていなかった、バシラス・ステアロサーモ
フィラス由来のＨＤＰ合成酵素、該酵素をコードするＤ
ＮＡ、及び該ＤＮＡを用いて該ＨＤＰ合成酵素を組換え
生産する方法、等を提供しようとするものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するため、既知のプレニルトランスフェラーゼ
の配列の一部を使用し、ＰＣＲ法で幾つかの遺伝子断片
を得、それをプローブとして用いて近傍の遺伝子領域を
クローニングし、発現した活性を測定することにより、
初めてバシラス・ステアロサーモフィラス由来のＨＤＰ
合成酵素遺伝子のクローニングに成功し、本発明を完成
させた。

【０００６】従って本発明は、配列番号：１の１位のア
ミノ酸Ｍｅｔから２２０位のアミノ酸Ｇｌｙまでのアミ
ノ酸配列又はこのアミノ酸配列に対して１〜少数個のア
ミノ酸が置換、欠失又は付加されているアミノ酸配列を
有するペプチド、配列番号：２の１位のアミノ酸Ｍｅｔ
から２３４位のアミノ酸Ａｒｇまでのアミノ酸配列又は
このアミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸が置
換、欠失又は付加されているアミノ酸配列を有するペプ
チド、及び配列番号：３の１位のアミノ酸Ｖａｌから３
２３位のアミノ酸Ｔｙｒまでのアミノ酸配列又はこのア
ミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸が置換、欠失
又は付加されているアミノ酸配列を有するペプチドを含
んで成り、ヘプタプレニル二リン酸合成酵素活性を有す
るバシラス・ステアロサーモフィラス由来の蛋白質を提
供する。

【０００７】本発明はさらに、配列番号：１の１位のア
ミノ酸Ｍｅｔから２２０位のアミノ酸Ｇｌｙまでのアミ
ノ酸配列又はこのアミノ酸配列に対して１〜少数個のア
ミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を有す
るバシラス・ステアロサーモフィラス由来のペプチドを
提供する。本発明はまた、配列番号：３の１位のアミノ
酸Ｖａｌから３２３位のアミノ酸Ｔｙｒまでのアミノ酸
配列又はこのアミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ
酸が置換、欠失又は付加されているアミノ酸配列を有す
るバシラス・ステアロサーモフィラス由来のペプチドを
提供する。

【０００８】本発明はまた、配列番号：１の１位のアミ
ノ酸Ｍｅｔから２２０位のアミノ酸Ｇｌｙまでのアミノ
酸配列又はこのアミノ酸配列に対して１〜少数個のアミ
ノ酸が置換、欠失もしくは付加されているアミノ酸配列
を有するペプチド、及び配列番号：３の１位のアミノ酸
Ｖａｌから３２３位のアミノ酸Ｔｙｒまでのアミノ酸配
列又はこのアミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸
が置換、欠失もしくは付加されているアミノ酸配列を有
するペプチド、を含んで成り、ヘプタプレニル二リン酸
合成酵素活性を有するバチラス・ステアロサーモフィラ
ス由来の蛋白質を提供する。

【０００９】本発明はさらに、配列番号：１の１位のア
ミノ酸Ｍｅｔから２２０位のアミノ酸Ｇｌｙまでのアミ
ノ酸配列又はこのアミノ酸配列に対して１〜少数個のア
ミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているアミノ酸配
列を有するペプチド、及び配列番号：２の１位のアミノ
酸Ｍｅｔから２３４位のアミノ酸Ａｒｇまでのアミノ酸
配列又はこのアミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ
酸が置換、欠失もしくは付加されているアミノ酸配列を
有するペプチド、を含んで成り、ヘプタプレニル二リン
酸合成酵素活性を有するバチラス・ステアロサーモフィ
ラス由来の蛋白質を提供する。

【００１０】本発明はまた配列番号：２の１位のアミノ
酸Ｍｅｔから２３４位のアミノ酸Ａｒｇまでのアミノ酸
配列又はこのアミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ
酸が置換、欠失もしくは付加されているアミノ酸配列を
有するペプチド、及び配列番号：３の１位のアミノ酸Ｖ
ａｌから３２３位のアミノ酸Ｔｙｒまでのアミノ酸配列
又はこのアミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸が
置換、欠失もしくは付加されているアミノ酸配列を有す
るペプチド、を含んで成り、ヘプタプレニル二リン酸合
成酵素活性を有するバチラス・ステアロサーモフィラス
由来の蛋白質を提供する。

【００１１】本発明はさらに、前記の蛋白質又は種々の
ペプチドをコードするＤＮＡを提供する。本発明はさら
に、前記のＤＮＡを含んで成る発現ベクターを提供す
る。本発明はまた、前記発現ベクターにより形質転換さ
れた宿主を提供する。本発明はさらに、前記宿主を培養
し、該培養物からヘプタプレニル二リン酸合成酵素を採
取することを特徴とするヘプタプレニル二リン酸合成酵
素の製造方法を提供する。

【００１２】本発明はまた、前記の形質転換体を培養
し、該培養物からヘプタプレニル二リン酸を採取するこ
とを特徴とする、ヘプタプレニル二リン酸の製造方法を
提供する。本発明はさらに、前記の酵素を基質と反応せ
しめることによるヘプタプレニル二リン酸の製造方法を
提供する。

【００１３】

【具体的な説明】バシラス・ステアロサーモフィラスか
らクローニングされ、ヘプタプレニル二リン酸合成酵素
活性を発現するＤＮＡの塩基配列のオープンリーデイン
グフレーム部分を配列番号：１〜３に示す。３個のオー
プンリーデイングフレーム（ＯＲＦ）が存在する。第一
のオープンリーデイングフレーム（ＯＲＦＩ）は配列番
号：１において１位のアミノ酸ＭｅｔをコードするＡＴ
Ｇから始まり２２０位のＧｌｙをコードするＧＧＧで終
ると推定される。しかしながら、１９位のアミノ酸Ｍｅ
ｔをコードするＡＴＧ，２０位のアミノ酸Ｍｅｔをコー
ドするＡＴＧ又は２２位のアミノ酸Ｍｅｔをコードする
ＡＴＧから始まる可能性もある。

【００１４】第二のオープンリーデイングフレーム（Ｏ
ＲＦII）は配列番号：２の１位のアミノ酸Ｍｅｔをコー
ドするＡＴＧから始まり、２３４位のアミノ酸Ａｒｇを
コードするＣＧＧで終ると推定される。但し、このＯＲ
ＦIIはアミノ酸番号：２３のＭｅｔをコードするＡＴＧ
から始まる可能性もある。第三のオープンリーデイング
フレーム（ＯＲＦIII ）は配列番号：３の１位のアミノ
酸ＶａｌをコードするＧＴＧから始まり、３２３位のア
ミノ酸ＴｙｒをコードするＴＡＴで終ると推定される。
しかしながら、このＯＲＦIII は４のアミノ酸Ｍｅｔを
コードするＡＴＧ又は９位のアミノ酸Ｍｅｔをコードす
るＡＴＧから始まる可能性もある。

【００１５】なお、クローニングされたＯＲＦＩ〜III
を含むＤＮＡにおいては、ＯＲＦＩの３′−末端の翻訳
終止コドンＴＡＧとＯＲＦIIの翻訳開始コドンＡＴＧ
（Ｍｅｔ）の間にはヌクレオチドＡＡＣＧが存在し、Ｏ
ＲＦIIの翻訳終止コドンＴＧＡとＯＲＦIII の翻訳開始
コドンＧＴＧ（Ｖａｌ）の間にはヌクレオチドＧＴＴＡ
ＡＧが存在する。

【００１６】前記のＤＮＡをその全長のままで、又は制
限酵素で切断し、各々のオープンリーデイングフレーム
に分けて別々に発現させたところ、全長ＤＮＡの発現生
成物が最も強いヘプタプレニル二リン酸合成酵素活性を
発現した。しかし、ＯＲＦＩとＯＲＦIII とによりコー
ドされるペプチドもヘプタプレニル二リン酸合成酵素活
性を発現した。従って、本発明の１つの態様によれば、
ＯＲＦＩ，ＯＲＦII及びＯＦＦIII のすべてを含んで成
るＤＮＡ、及びそれによりコードされているペプチドか
ら成るヘプタプレニル二リン酸合成酵素、並びにその製
造方法を提供する。

【００１７】本発明はまた、ＯＲＦＩとＯＲＦIII を含
んで成り、完全な形でのＯＲＦIIを含まないＤＮＡ、及
びこのＤＮＡにより発現される、ヘプタプレニル二リン
酸合成酵素活性を有するペプチド、並びにその製造方法
を提供する。発明はさらにＯＲＦＩとＯＲＦII、又はＯ
ＲＦIIとＯＲＦIIIを含んで成り完全な形での他のＯＲ
Ｆを含まないＤＮＡ、及びこれにより発現されるペプチ
ド、並びにその製造方法を提供する。

【００１８】植物由来の酵素は、それが由来する植物の
品種によって少数のアミノ酸が異なる場合があり、また
天然突然変異により少数のアミノ酸が異る場合がある。
さらに、アミノ酸配列を人為的に変異させても生来の酵
素の活性を維持する場合がある。従って、本発明は、配
列番号：１〜３に示されるアミノ酸配列を有するペプチ
ド数の他に、配列番号：１〜３に示されるアミノ酸配列
に対して１又は少数個、例えば５個まで、又は１０個ま
でのアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加により変化し
ているアミノ酸配列を有し、なお生来の機能を果すこと
ができるペプチド類をも包含する。

【００１９】本発明はまた、上記のごとく変異したペプ
チドをコードするＤＮＡ、及び変異したペプチドの製造
方法を提供する。本発明のＤＮＡは、実施例に詳細に説
明するごとく、バチラス・ステアロサーモフィラスから
クローニングすることができる。また、ＯＲＦＩ，ＯＲ
ＦII及びＯＲＦIII の内の１個のみ又はこのすべて、あ
るいはＯＲＦＩとＯＲＦIII 、ＯＲＦＩとＯＲＦII、又
はＯＲＦIIとＯＲＦIII を含み完全な形での他のＯＲＦ
を含まないＤＮＡは、目的とするＯＲＦ内を切断せず、
その外側、例えば他のＯＲＦ内を切断する制限酵素を用
いて全長ＤＮＡを切断することにより得られる。また、
変異させたペプチドをコードするＤＮＡは、例えば変異
誘発プライマーを用いての部位特定変異誘発法により得
ることができる。

【００２０】さらに、一個目的とするペプチドのアミノ
酸配列が定まれば、それをコードする適当な塩基配列を
決定することができ、常用のＤＮＡ合成法によりＤＮＡ
を化学合成することもできる。特に、本発明の個々のＯ
ＲＦは特別に長いものではなく、常用のＤＮＡ合成法に
より当業者が容易に合成することができる。本発明はま
た、前記のごときＤＮＡを含んで成る発現ベクター、該
発現ベクターにより形質転換された宿主、及びこれらの
宿主を用いての本発明の酵素又はペプチドの製造方法を
提供する。

【００２１】発現ベクターはその複製開始点、発現制御
配列等を含有するが、これらは宿主により異る。宿主と
しては、原核性生物、例えば細菌、例えば大腸菌、バチ
ラス属細菌、例えばバチラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、真核性微生物、例えば真
菌、例えば酵母、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ）属に属すサッカロミセス・セレビシエ
ー（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えばアス
ペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属のアスペルギ
ルス・オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス
・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、動物細胞、例えばカイコ
の培養細胞、高等動物の培養細胞、例えばＣＨＯ細胞、
等が挙げられる。また植物を宿主とすることも可能であ
る。

【００２２】本発明によれば、実施例に示すごとく、本
発明のＤＮＡにより形質転換した宿主を培養することに
より、培養物中にヘプタプレニル二リン酸を蓄積するこ
とができ、これを採取することによりヘプタプレニル二
リン酸を製造することができる。本発明によればまた、
本発明の方法により製造したＨＤＰ合成酵素を基質イソ
ペンテニル二リン酸及びファルネシル二リン酸に作用さ
せることによってもヘプタプレニル二リン酸を製造する
ことができる。

【００２３】宿主に大腸菌を用いる場合を例にとれば、
ＤＮＡからｍＲＮＡを転写する過程とｍＲＮＡからタン
パク質を翻訳する過程など遺伝子の発現調節機能がある
ことが知られている。ｍＲＮＡの合成を調節するプロモ
ーター配列として、天然に存在する配列（たとえばｌａ
ｃ，ｔｒｐ，ｂｌａ，ｌｐｐ，Ｐ_L，Ｐ_R，ｔｅｒ，Ｔ
３，Ｔ７など）以外にも、それらの変異体（例えばｌａ
ｃＵＶ５）や天然にあるプロモーター配列を人工的に融
合した（例えばｔａｃ，ｔｒｃなど）配列が知られてお
り、本発明にも使用できる。

【００２４】ｍＲＮＡからタンパク質を合成する能力を
調節する配列として、リボソームバインディングサイト
（ＧＡＧＧおよびその類似配列）配列と開始コドンであ
るＡＴＧまでの距離が重要であることは既知である。ま
た、３′側に転写終了を指令するターミネーター（例え
ば、ｒｒｎＢＴ₁Ｔ₂を含むベクターがファルマシア社
から市販されている）が組換え体でのタンパク質合成効
率に影響する事はよく知られている。

【００２５】本発明の組換えベクターを調製するのに使
用できるベクターとしては、市販のものをそのまま用い
るか、または目的に応じて誘導した各種のベクターを挙
げることができる。例えば、ｐＭＢ１由来のｒｅｐｌｉ
ｃｏｎを持つｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２７，ｐＫＫ２２
３−３，ｐＫＫ２３３−２，ｐＴｒｃ９９等や、コピー
数が向上するように改変したｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９，
ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９，ｐＨＳＧ２９８，ｐＨＳ
Ｇ３９６等、またｐ１５Ａ由来のｒｅｐｌｉｃｏｎを持
つｐＡＣＹＣ１７７やｐＡＣＹＣ１８４等、さらにはｐ
ＳＣ１０１やＣｏｌＥ１やＲ１やＦ因子などに由来する
プラスミドが挙げられる。

【００２６】また、プラスミド以外にも、λファージや
Ｍ１３ファージのようなウイルスベクターやトランスポ
ゾンによっても遺伝子導入が可能である。大腸菌以外の
微生物への遺伝子導入では、ｐＵＢ１１０（Ｓｉｇｍａ
社から販売）やｐＨＹ３００ＰＬＫ（宝酒造より販売）
などによるＢａｃｉｌｌｕｓ属への遺伝子導入が知られ
ている。これらベクターについてはＭｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆ
ｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒ
ｅｓｓ発行）やＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒ（Ｐ．
Ｈ．Ｐｏｕｗｅｌｓ，Ｂ．Ｅ．Ｅｎｇｅｒ・Ｖａｌｋ，
Ｗ．Ｊ．Ｂｒａｍｍａｒ著Ｅｌｓｅｖｉｅｒ発行）や各
社カタログに記載されている。

【００２７】特に、ｐＴｒｃ９９（ファルマシア社より
販売）は、選択マーカーのアンピシリン耐性遺伝子以外
に、プロモーター及び制御遺伝子としてＰｔｒｃ及びｌ
ａｃＩ^q、リボソームバインディングサイトとしてＡＧ
ＧＡという配列、ターミネーターとしてｒｒｎＢＴ₁Ｔ
₂を持ち、ＨＤＰ合成酵素遺伝子の発現調節機能を持
つ、好ましいベクターとして挙げられる。

【００２８】これらのベクターへの、ＨＤＰ合成酵素を
コードするＤＮＡ断片および必要により前記酵素の遺伝
子を発現調節する機能を有するＤＮＡ断片の組み込み
は、適当な制限酵素とリガーゼを用いる既知方法で行う
ことができ、具体的には後述の方法に従うのが都合よ
い。こうして作製される発明のプラスミドの具体的なも
のとしてはｐＴＬ６が挙げられる。

【００２９】このような組換えベクターで遺伝子導入で
きる微生物としてはエシェリヒアコリー（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）属などに属する微生物も利用することができる。こ
の形質転換も常法、たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｌ
ｏｎｉｎｇ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔ
ｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ
発行）やＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇＶｏｌ．Ｉ〜III
（Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編ＩＲＬＰＲＥＳＳ発行）な
どに記載された、ＣａＣｌ₂法やプロトプラスト法によ
り行うことができる。

【００３０】得られる本発明の形質転換体の代表的なも
のとしては、ｐＴＬ６／ＪＭ１０９が挙げられる。これ
らの形質転換体または組換え微生物細胞は、通常大腸菌
の培養に用いられる培地で培養すると、ヘプタプレニル
二リン酸（ＨＤＰ）を菌体内に蓄積する。菌体からのＨ
ＤＰの採取は、菌体を物理的または適当な細胞溶解性酵
素の存在する環境下で処理して溶菌した後、細胞破砕物
を除去し、次いで、酵素の一般的な単離精製方法によっ
て行うことができる。

【００３１】細胞溶解性酵素としてはリゾチームを用い
ることが好ましく、また物理的処理には超音波を用いる
ことが好ましい。また５５℃程度の熱処理をすることに
より、多くの大腸菌由来のタンパク質は不溶性の沈澱と
して除去できる。酵素の単離精製には、ゲル濾過・イオ
ン交換・疎水性・逆相・アフィニティーなどの各種クロ
マトグラフィー処理や限外濾過法などを単独または組み
合わせて行えばよい。

【００３２】単離・精製工程を通じて、目的とする酵素
の安定化を図るための安定剤として、たとえば、β−メ
ルカプトエタノールやジチオスレイトールなどの還元
剤、ＰＭＳＦやＢＳＡなどのプロテアーゼへの保護剤、
マグネシウムなどの金属イオンを処理液に共存させても
よい。前記ＨＤＰ合成酵素活性は、たとえば次のように
測定できるので、その酵素の単離・精製は、後述の実施
例１のｆ）で使用するアッセイ用反応液を用いて、その
酵素活性を確認しながら進めることが推奨できる。

【００３３】

【実施例】以下、本発明のＤＮＡ配列、プラスミド、形
質転換体の調製法の１例を記載するが、本発明の範囲は
これに限定されるものではない。実施例１実験法は主として前述のＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎ
ｉｎｇとＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇと宝酒造のカタログに
従った。酵素は主に宝酒造から購入した物を用いた。用
いたバチラスステアロサーモフィラスはアメリカン
タイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ
ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：
ＡＴＣＣ）に登録されている公知の菌株である。本研究
にはＡＴＣＣ１０１４９株をもちいた。

【００３４】ａ）バチラスステアロサーモフィラスの
染色体ＤＮＡの調製ＬＢ培地（１％Ｔｒｙｐｔｏｎ，０．５％Ｙｅａｓｔ
ｅｘｔｒａｃｔ，１％ＮａＣｌ）で５５℃で培養し、集
菌した。Ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒに懸濁後、リゾチー
ム（Ｓｉｇｍａ社製ニワトリ卵白由来）を１０mg／mlに
なるように加えた。溶菌後、１／１０量の１ＭＴｒｉｓ
・ＨＣｌ（pH８．０）、１／１０量の１０％ＳＤＳ、１
／５０量の５ＭＮａＣｌを加えた。Ｐｒｏｔｅｉｎａｓ
ｅＫ（Ｓｉｇｍａ社製）を１０mg／mlになるように加
え、５０℃に加温した。

【００３５】等量のフェノールを加え、穏やかに攪拌
後、遠心して除蛋白を行った。遠心上清を広口ピペット
でビーカーにとり、２．５倍量のエタノールを静かに重
層後、ガラス棒で染色体ＤＮＡを巻きとった。ＴＥ（１
０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（pH８．０）、１ｍＭＥＤＴ
Ａ）に溶解後、ＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ社製）処理、
ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ処理、フェノール処理後、２．
５倍量のエタノールを静かに重層し、ガラス棒で染色体
ＤＮＡを巻きとった。７０％エタノールで洗浄後、ＴＥ
に溶解し、以下の実験に用いた。

【００３６】ｂ）ｐＣＲ６４の取得これまでに知られているプレニルトランスフェラーゼの
アミノ酸配列における保存領域をもとに合成ＤＮＡプラ
イマーＰ１（配列番号：４）、Ｐ２（配列番号：５）、
Ｐ４（配列番号：６）、Ｐ６（配列番号：７）、Ｐ８
（配列番号：８）、Ｐ９（配列番号：９）、Ｐ１０（配
列番号：１０）、Ｐ１１（配列番号：１１）、Ｐ１２
（配列番号：１２）及び、Ｐ１３（配列番号：１３）を
作製した。

【００３７】染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで限
定分解し、合成ＤＮＡＰ１とＰ４、Ｐ１とＰ６、Ｐ１と
Ｐ８、Ｐ２とＰ４、Ｐ２とＰ６、Ｐ２とＰ８、Ｐ９とＰ
１１、Ｐ９とＰ４、Ｐ９とＰ６、Ｐ９とＰ８、Ｐ９とＰ
１３、Ｐ１とＰ１１、Ｐ２とＰ１１、Ｐ１２とＰ４、Ｐ
１２とＰ６、Ｐ１２とＰ８、Ｐ１２とＰ１３、Ｐ１とＰ
１３、Ｐ２とＰ１３、Ｐ１０とＰ４、Ｐ１０とＰ６、Ｐ
１０とＰ８、Ｐ１０とＰ１３の組み合わせでＰＣＲ（ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）
を行った。

【００３８】Ｐ１０とＰ８の組み合わせのＰＣＲ産物
を、プラスミドｐＵＣ１１８（宝酒造から購入）のＨｉ
ｎｃII分解物とＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、大腸菌Ｊ
Ｍ１０９を形質転換した。アルカリＳＤＳ法でプラスミ
ドを調製し、２７クローンをアプライドバイオシステム
３７３Ａ蛍光ＤＮＡシーケンサーでＤＮＡ配列を解析し
た。その中の１つをｐＣＲ６４とした。

【００３９】

【表１】

【００４０】ｃ）ｐＣＲ６４をプローブにした周辺領域
のクローニングｃ−１）ｐＣＲ６４の制限酵素ＫｐｎＩ，ＨｉｎｄII
I 分解物約５００ｂ．ｐ．のＤＮＡ断片を、ＤＩＧＤ
ＮＡＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥ
ＲＭＡＮＮＨＥＩＭから購入）を用いてＤＩＧで標識
した。方法はキットの手順書に従った。

【００４１】ｃ−２）ライブラリーの作製染色体ＤＮＡを制限酵素ＡｃｃＩで分解し、ｃ−１）の
プローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行っ
たところ、約３ｋｂ．ｐ．の位置にバンドが検出され
た。そこで、３ｋｂ．ｐ．程度のＤＮＡ断片をアガロー
ス電気泳動で分画し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し
た。プラスミドｐＵＣ１８のＳｍａＩ分解物とＴ４ＤＮ
Ａリガーゼで連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し
た。

【００４２】ｃ−３）スクリーニングｃ−１で作製したプローブで、ｃ−２で作製したライブ
ラリーをスクリーニングした。ＤＩＧＤＮＡＤｅｔ
ｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲＭＡＮＮ
ＨＥＩＭから購入）を用いて検出し、プラスミドｐＡＣ
２を得た。方法はキットの手順書に従った。挿入遺伝子
約２．５ｋｂ．ｐ．のＤＮＡ配列の解析をアプライドバ
イオシステム３７３Ａ蛍光シーケンサーで行った。

【００４３】ｄ）ｐＰＲ２の単離ｃ−３）で得たＤＮＡ配列をもとに作製した合成ＤＮＡ
プライマーＰ６４−４（配列番号：１４）とＭ１３Ｐ
ｒｉｍｅｒＲＶ（宝酒造から購入）でｃ−２）の遺伝
子ライブラリーをＰＣＲした。増幅産物をｐＴ７Ｂｌｕ
ｅＴ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎから購入）に挿
入してｐＰＲ２を得た。ｅ）ｐＡＣ２とｐＰＲ２の連結ｐＡＣ２及びｐＰＲ２のＢａｍＨＩ分解物、それぞれ約
１ｋｂ．ｐ．と５ｋｂ．ｐ．のＤＮＡ断片を連結してｐ
ＴＬ６を得た。

【００４４】ｆ）イソプレノイド合成酵素活性の測定大腸菌ＪＭ１０５のｐＴＬ６での形質転換体を５０μｇ
／mlのアンピシリンを含むＬＢ培地５０mlで一晩培養
後、集菌した。４mlのＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒに懸濁
し、超音波で菌体を破砕した。５５℃に１時間加温し、
大腸菌由来のプレニルトランスフェラーゼを失活させ、
遠心分離で大腸菌由来の変性タンパク質を除き、アッセ
イに用いた。アッセイ用反応液を１時間あるいは１４時
間５５℃で反応させた。反応液を１−ブタノールで抽出
し、液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定
した。

【００４５】

【表２】

【００４６】ｐＴＬ６を持つＪＭ１０５を上記のように
反応させた時の１−ブタノール抽出物を加水分解し、薄
層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で分析した。その結
果、生成したイソプレノイドはヘプタプレニル二リン酸
であると同定され、ｐＴＬ６はヘプタプレニル二リン酸
合成酵素の遺伝子を含むことが判明した（図２）。さら
に、アリル性基質Ｐｒｉｍｅｒに対する特異性を下記の
アッセイ系（表３）にて検討した結果、（ａｌｌ−Ｅ）
ファルネシル二リン酸及び（ａｌｌ−Ｅ）ゲラニルゲラ
ニル二リン酸で特に酵素活性が認められたが、ジメチル
アリル二リン酸、ゲラニル二リン酸、（２Ｚ，６Ｅ）フ
ァルネシル二リン酸、（２Ｚ，６Ｅ，１０Ｅ）ゲラニル
ゲラニル二リン酸、（２Ｚ，６Ｅ，１０Ｅ，１４Ｅ）フ
ァルネシルゲラニル二リン酸は好ましい基質ではなかっ
た（表４）。

【００４７】

【表３】

【００４８】

【表４】

【００４９】大腸菌はヘプタプレニルトランスフェラー
ゼおよび５５℃で活性のあるプレニルトランスフェラー
ゼを持っていない。ｐＴＬ６で形質転換した大腸菌はヘ
プタプレニル二リン酸を合成することができるようにな
った。また、５５℃で活性があることから、ｐＴＬ６が
コードしているバチラスステアロサーモフィラス由来
のプレニルトランスフェラーゼは非常に熱に安定である
ことがここに示された。また、組換え体が安定なヘプタ
プレニル二リン酸の製造に有効であることがここに示さ
れた。

【００５０】ｇ）ｐＴＬ６の欠失変異体の作製とＨＤＰ
合成酵素遺伝子の特定ｐＴＬ６は約３ｋｂ．ｐ．の挿入遺伝子を持ち、その中
に３つのＯＲＦを含んでいた。ｐＴＬ６を制限酵素で切
断してＯＲＦＩの欠失したプラスミドｐＴＬＤ９、ＯＲ
ＦIIの欠失したプラスミドｐＴＬＤ１７、及びＯＲＦII
I の欠失したプラスミドｐＴＬＤ７を作製し、イソプレ
ノイド合成酵素活性を測定したところ、ｐＴＬ６，ｐＴ
ＬＤ９、及びｐＴＬＤ１７に活性が見られた。ｐＴＬ６
及びｐＴＬＤ１７の反応生成物の１−ブタノール抽出物
を加水分解し、ＴＬＣで分析し、生成したイソプレノイ
ドはヘプタプレニル二リン酸であることを確認した。

【００５１】

【表５】

【００５２】

【発明の効果】本発明によれば、バチラスステアロサ
ーモフィラス由来のヘプタプレニル二リン酸合成酵素を
コードするＤＮＡ配列が提供される。このようなＤＮＡ
配列を発現ベクターに組み込み、適当な大腸菌を形質転
換した組換え微生物細胞は、安全なヘプタプレニル二リ
ン酸合成活性物質及びヘプタプレニル二リン酸を生産す
る。この効果は、従来技術文献に未載のバチラスステ
アロサーモフィラス染色体から前記ＤＮＡ配列を調製す
ることによって得られる。

【００５３】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：６６３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ起源生物名：バチラスステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）配列： ATG CTC GAT GGC GCT TCA ACG GCG CCG AGT GAG GCG GAG CGG TGC 45 Met Leu Asp Gly Ala Ser Thr Ala Pro Ser Glu Ala Glu Arg Cys 5 10 15 ATC ATC GCC ATG ATG CTC ATG CAG ATC GCC CTT GAT ACC CAC GAT 90 Ile Ile Ala Met Met Leu Met Gln Ile Ala Leu Asp Thr His Asp 20 25 30 GAG GTG ACA GAT GAC GGC GGC GAC TTG CGG GCG CGG CAG CTT GTC 135 Glu Val Thr Asp Asp Gly Gly Asp Leu Arg Ala Arg Gln Leu Val 35 40 45 GTC CTG GCC GGC GAC TTG TAC AGC GGG CTG TAC TAT GAG TTG TTG 180 Val Leu Ala Gly Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Tyr Glu Leu Leu 50 55 60 GCG CGT TCG GGC GAA ACG GCG CTC ATC CGC TCG TTC GCC GAG GCG 225 Ala Arg Ser Gly Glu Thr Ala Leu Ile Arg Ser Phe Ala Glu Ala 65 70 75 GTC CGC GAT ATT AAC GAG CAA AAA GTG CGG CTT TAC GAA AAA AAA 270 Val Arg Asp Ile Asn Glu Gln Lys Val Arg Leu Tyr Glu Lys Lys 80 85 90 GTA GAG CGG ATC GAG TCG TTG TTT GCG GCG GTC GGC ACG ATC GAA 315 Val Glu Arg Ile Glu Ser Leu Phe Ala Ala Val Gly Thr Ile Glu 95 100 105 TCG GCG TTG CTT GTC AAG CTC GCC GAC CGC ATG GCG GCG CCG CAG 360 Ser Ala Leu Leu Val Lys Leu Ala Asp Arg Met Ala Ala Pro Gln 110 115 120 TGG GGG CAG TTT GCC TAT TCG TAT TTG CTG ATG CGG CGC CTG CTG 405 Trp Gly Gln Phe Ala Tyr Ser Tyr Leu Leu Met Arg Arg Leu Leu 125 130 135 CTC GAG CAG GAA GCG TTC ATC CGC ACG GGA GCT TCG GTG CTC TTT 450 Leu Glu Gln Glu Ala Phe Ile Arg Thr Gly Ala Ser Val Leu Phe 140 145 150 GAG CAA ATG GCG CAA ATC GCG TTC CCG CGC GCG GAA ACG TTG ACG 495 Glu Gln Met Ala Gln Ile Ala Phe Pro Arg Ala Glu Thr Leu Thr 155 160 165 AAA GAG CAA AAG CGG CAT TTG CTC CGC TTT TGC CGC CGC TAT ATC 540 Lys Glu Gln Lys Arg His Leu Leu Arg Phe Cys Arg Arg Tyr Ile 170 175 180 GAC GGC TGC CGG GAG GCG CTG TTT GCG GCG AAA CTG CCG GTC AAC 585 Asp Gly Cys Arg Glu Ala Leu Phe Ala Ala Lys Leu Pro Val Asn 185 190 195 GGC CTG CTG CAG CTC CGC GTG GCC GTG CTT TCC GGC GGG TTT CAA 630 Gly Leu Leu Gln Leu Arg Val Ala Val Leu Ser Gly Gly Phe Gln 200 205 210 GCC ATC GCC AAA AAG ACG GTG GAA GAA GGG TAG 663 Ala Ile Ala Lys Lys Thr Val Glu Glu Gly *** 215 220

【００５４】配列番号：２配列の長さ：７０５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ起源生物名：バチラスステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）配列： ATG CGT CAA TCG AAA GAA GAG CGA GTC CAT CGC GTA TTT GAA AAC 45 Met Arg Gln Ser Lys Glu Glu Arg Val His Arg Val Phe Glu Asn 5 10 15 ATT TCT GCG CAT TAT GAC CGG ATG AAC TCC GTC ATC AGC TTC CGC 90 Ile Ser Ala His Tyr Asp Arg Met Asn Ser Val Ile Ser Phe Arg 20 25 30 CGC CAC TTG AAG TGG CGC AAA GAC GTG ATG CGG CGG ATG AAT GTG 135 Arg His Leu Lys Trp Arg Lys Asp Val Met Arg Arg Met Asn Val 35 40 45 CAA AAA GGC AAA AAA GCG CTC GAT GTG TGC TGT GGG ACG GCT GAC 180 Gln Lys Gly Lys Lys Ala Leu Asp Val Cys Cys Gly Thr Ala Asp 50 55 60 TGG ACG ATC GCC TTG GCG GAG GCG GTC GGT CCG GAA GGG AAA GTG 225 Trp Thr Ile Ala Leu Ala Glu Ala Val Gly Pro Glu Gly Lys Val 65 70 75 TAC GGC CTT GAT TTC AGC GAA AAC ATG CTG AAA GTC GGC GAA CAG 270 Tyr Gly Leu Asp Phe Ser Glu Asn Met Leu Lys Val Gly Glu Gln 80 85 90 AAG GTA AAA GCG CGC GGG TTG CAT AAT GTG AAG CTC ATT CAC GGC 315 Lys Val Lys Ala Arg Gly Leu His Asn Val Lys Leu Ile His Gly 95 100 105 AAT GCG ATG CAG CTG CCG TTT CCT GAC AAT TCG TTC GAT TAT GTG 360 Asn Ala Met Gln Leu Pro Phe Pro Asp Asn Ser Phe Asp Tyr Val 110 115 120 ACG ATC GGC TTC GGT TTG CGC AAC GTC CCT GAC TAT ATG ACC GTG 405 Thr Ile Gly Phe Gly Leu Arg Asn Val Pro Asp Tyr Met Thr Val 125 130 135 CTT AAG GAA ATG CAC CGG GTG ACG AAG CCG GGC GGC ATA ACC GTC 450 Leu Lys Glu Met His Arg Val Thr Lys Pro Gly Gly Ile Thr Val 140 145 150 TGC CTG GAA ACG TCG CAG CCG ACG CTG TTC GGG TTT CGC CAG CTT 495 Cys Leu Glu Thr Ser Gln Pro Thr Leu Phe Gly Phe Arg Gln Leu 155 160 165 TAC TAT TTT TAC TTC CGG TTT ATT ATG CCG CTG TTT GGC AAG CTG 540 Tyr Tyr Phe Tyr Phe Arg Phe Ile Met Pro Leu Phe Gly Lys Leu 170 175 180 CTG GCG AAA AGC TAT GAG GAG TAC TCG TGG CTG CAG GAA TCG GCG 585 Leu Ala Lys Ser Tyr Glu Glu Tyr Ser Trp Leu Gln Glu Ser Ala 185 190 195 CGC GAG TTT CCG GGG CGG GAC GAG CTG GCC GAG ATG TTC CGC GCC 630 Arg Glu Phe Pro Gly Arg Asp Glu Leu Ala Glu Met Phe Arg Ala 200 205 210 GCC GGT TTT GTC GAT GTC GAG GTC AAA CCG TAC ACG TTT GGC GTG 675 Ala Gly Phe Val Asp Val Glu Val Lys Pro Tyr Thr Phe Gly Val 215 220 225 GCG GCG ATG CAC TTG GGC TAT AAA CGG TGA 705 Ala Ala Met His Leu Gly Tyr Lys Arg *** 230

【００５５】配列番号：３配列の長さ：９７２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ起源生物名：バチラスステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）配列： GTG AAC AAC ATG AAG TTA AAG GCG ATG TAT TCG TTT TTA AGC GAT 45 Val Asn Asn Met Lys Leu Lys Ala Met Tyr Ser Phe Leu Ser Asp 5 10 15 GAT TTA GCG GCG GTC GAA GAG GAG CTT GAG CGG GCG GTT CAG TCG 90 Asp Leu Ala Ala Val Glu Glu Glu Leu Glu Arg Ala Val Gln Ser 20 25 30 GAA TAC GGG CCG CTT GGG GAA GCG GCG CTC CAT CTG TTG CAG GCG 135 Glu Tyr Gly Pro Leu Gly Glu Ala Ala Leu His Leu Leu Gln Ala 35 40 45 GGC GGA AAG CGG ATC CGT CCC GTT TTT GTC TTG CTT GCC GCC CGC 180 Gly Gly Lys Arg Ile Arg Pro Val Phe Val Leu Leu Ala Ala Arg 50 55 60 TTC GGC CAA TAT GAC CTT GAG CGG ATG AAG CAT GTT GCC GTT GCG 225 Phe Gly Gln Tyr Asp Leu Glu Arg Met Lys His Val Ala Val Ala 65 70 75 CTC GAG CTC ATT CAT ATG GCT TCG CTC GTC CAC GAC GAT GTG ATC 270 Leu Glu Leu Ile His Met Ala Ser Leu Val His Asp Asp Val Ile 80 85 90 GAC GAC GCC GAT TTG CGC CGC GGC CGG CCG ACG ATC AAG GCG AAA 315 Asp Asp Ala Asp Leu Arg Arg Gly Arg Pro Thr Ile Lys Ala Lys 95 100 105 TGG AGC AAC CGG TTC GCC ATG TAC ACA GGG GAT TAT TTG TTT GCC 360 Trp Ser Asn Arg Phe Ala Met Tyr Thr Gly Asp Tyr Leu Phe Ala 110 115 120 CGC TCG CTC GAA CGG ATG GCG GAG CTC GGC AAC CCG CGC GCC CAT 405 Arg Ser Leu Glu Arg Met Ala Glu Leu Gly Asn Pro Arg Ala His 125 130 135 CAA GTG TTG GCG AAA ACG ATC GTG GAA GTG TGC CGC GGG GAA ATT 450 Gln Val Leu Ala Lys Thr Ile Val Glu Val Cys Arg Gly Glu Ile 140 145 150 GAG CAA ATT AAA GAC AAG TAC CGG TTT GAT CAG CCG CTG CGC ACG 495 Glu Gln Ile Lys Asp Lys Tyr Arg Phe Asp Gln Pro Leu Arg Thr 155 160 165 TAT TTG CGG CGC ATC CGT CGG AAA ACG GCG CTG CTC ATC GCC GCG 540 Tyr Leu Arg Arg Ile Arg Arg Lys Thr Ala Leu Leu Ile Ala Ala 170 175 180 AGC TGC CAG CTT GGC GCC CTC GCT GCC GGC GCG CCG GAG CCG ATT 585 Ser Cys Gln Leu Gly Ala Leu Ala Ala Gly Ala Pro Glu Pro Ile 185 190 195 GTG AAG CGG CTG TAC TGG TTC GGC CAT TAT GTC GGC ATG TCG TTT 630 Val Lys Arg Leu Tyr Trp Phe Gly His Tyr Val Gly Met Ser Phe 200 205 210 CAA ATT ACC GAC GAC ATT CTC GAT TTC ACT GGG ACG GAG GAA CAG 675 Gln Ile Thr Asp Asp Ile Leu Asp Phe Thr Gly Thr Glu Glu Gln 215 220 225 CTC GGC AAA CCG GCC GGA AGC GAC TTG CTA CAA GGA AAC GTC ACC 720 Leu Gly Lys Pro Ala Gly Ser Asp Leu Leu Gln Gly Asn Val Thr 230 235 240 CTT CCT GTG CTG TAT GCC TTG AGC GAT GAG CGG GTG AAG GCG GCC 765 Leu Pro Val Leu Tyr Ala Leu Ser Asp Glu Arg Val Lys Ala Ala 245 250 255 ATT GCA GCT GTC GGT CCG GAA ACG GAC GTT GCG GAA ATG GCG GCG 810 Ile Ala Ala Val Gly Pro Glu Thr Asp Val Ala Glu Met Ala Ala 260 265 270 GTC ATT TCC GCC ATT AAG CGG ACG GAC GCC ATT GAG CGG TCG TAT 855 Val Ile Ser Ala Ile Lys Arg Thr Asp Ala Ile Glu Arg Ser Tyr 275 280 285 GCG TTA AGC GAC CGT TAC CTT GAC AAG GCG CTT CAC CTT CTT GAC 900 Ala Leu Ser Asp Arg Tyr Leu Asp Lys Ala Leu His Leu Leu Asp 290 295 300 GGA CTG CCG ATG AAT GAG GCG CGC GGC CTG TTG CGC GAC CTC GCC 945 Gly Leu Pro Met Asn Glu Ala Arg Gly Leu Leu Arg Asp Leu Ala 305 310 315 CTT TAC ATC GGG AAA AGG GAT TAT TAA 972 Leu Tyr Ile Gly Lys Arg Asp Tyr *** 320

【００５６】配列番号：４配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 CTNATHCAYG AYGAYYTNCC NTCNATGGAC 30

【００５７】配列番号：５配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GAYAAYGAYG AYYTNMGNMG NGGC 24

【００５８】配列番号：６配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ATCRTCNCKD ATYTGRAANG CNARNCC 27

【００５９】配列番号：７配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 ATCNARDATR TCRTCNCKDA TYTGRAA 27

【００６０】配列番号：８配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GTCRCTNCCN ACNGGYTTNC C 21

【００６１】配列番号：９配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 YTNGARGCNG GNGGNAARMG 20

【００６２】配列番号：１０配列の長さ：２０配列の型：鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 TAYWSNYTNA THCAYGAYGA 20

【００６３】配列番号：１１配列の長さ：２１配列の型：鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 YTCCATRTCN GCNGCYTGNC C 21

【００６４】配列番号：１２配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 YTNGARTAYA THCAYMGNCA YAARAC 26

【００６５】配列番号：１３配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 DATRTCNARD ATRTCRTC 18

【００６６】配列番号：１４配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GATCACATCG TCGTGGACGA 20

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のプラスミドｐＡＣ２，ｐＰＲ２，ｐＴ
Ｌ６，ｐＴＬＤ９，ｐＴＬＤ１７、及びｐＴＬＤ７の位
置的関係及び制限酵素地図である。

【図２】本発明のＤＮＡ配列が含まれるプラスミド産物
が触媒した反応の生成物をＴＬＣで解析した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｐ 9/00 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献ＦＥＢＳＬＥＴＴＥＲＳ，Ｖｏｌ. 161，Ｎｏ．２，（1983），ｐ．257− 260 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/00 - 14/825 C12N 1/00 - 5/28 C12N 9/00 - 9/99 C12P 1/00 - 41/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（ＧＥＮＥＴＹＸ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：１の１位のアミノ酸Ｍｅｔか
ら２２０位のアミノ酸Ｇｌｙまでのアミノ酸配列又はこ
のアミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸が置換、
欠失又は付加されているアミノ酸配列を有するペプチ
ド、配列番号：２の１位のアミノ酸Ｍｅｔから２３４位
のアミノ酸Ａｒｇまでのアミノ酸配列又はこのアミノ酸
配列に対して１〜少数個のアミノ酸が置換、欠失又は付
加されているアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列
番号：３の１位のアミノ酸Ｖａｌから３２３位のアミノ
酸Ｔｙｒまでのアミノ酸配列又はこのアミノ酸配列に対
して１〜少数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されて
いるアミノ酸配列を有するペプチドを含んで成り、ヘプ
タプレニル二リン酸合成酵素活性を有するバチラス・ス
テアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒ
ｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の蛋白質。
【請求項２】配列番号：１の１位のアミノ酸Ｍｅｔか
ら２２０位のアミノ酸Ｇｌｙまでのアミノ酸配列又はこ
のアミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸が置換、
欠失又は付加されているアミノ酸配列を有するバチラス
・ステアロサーモフィラス由来のペプチド。
【請求項３】配列番号：３の１位のアミノ酸Ｖａｌか
ら３２３位のアミノ酸Ｔｙｒまでのアミノ酸配列又はこ
のアミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸が置換、
欠失又は付加されているアミノ酸配列を有するバチラス
・ステアロサーモフィラス由来のペプチド。
【請求項４】配列番号：１の１位のアミノ酸Ｍｅｔか
ら２２０位のアミノ酸Ｇｌｙまでのアミノ酸配列又はこ
のアミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸が置換、
欠失もしくは付加されているアミノ酸配列を有するペプ
チド、及び配列番号：３の１位のアミノ酸Ｖａｌから３
２３位のアミノ酸Ｔｙｒまでのアミノ酸配列又はこのア
ミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸が置換、欠失
もしくは付加されているアミノ酸配列を有するペプチ
ド、を含んで成り、ヘプタプレニル二リン酸合成酵素活
性を有するバチラス・ステアロサーモフィラス由来の蛋
白質。
【請求項５】配列番号：１の１位のアミノ酸Ｍｅｔか
ら２２０位のアミノ酸Ｇｌｙまでのアミノ酸配列又はこ
のアミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸が置換、
欠失もしくは付加されているアミノ酸配列を有するペプ
チド、及び配列番号：２の１位のアミノ酸Ｍｅｔから２
３４位のアミノ酸Ａｒｇまでのアミノ酸配列又はこのア
ミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸が置換、欠失
もしくは付加されているアミノ酸配列を有するペプチ
ド、を含んで成るバチラス・ステアロサーモフィラス由
来の蛋白質。
【請求項６】配列番号：２の１位のアミノ酸Ｍｅｔか
ら２３４位のアミノ酸Ａｒｇまでのアミノ酸配列又はこ
のアミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸が置換、
欠失もしくは付加されているアミノ酸配列を有するペプ
チド、及び配列番号：３の１位のアミノ酸Ｖａｌから３
２３位のアミノ酸Ｔｙｒまでのアミノ酸配列又はこのア
ミノ酸配列に対して１〜少数個のアミノ酸が置換、欠失
もしくは付加されているアミノ酸配列を有するペプチ
ド、を含んで成るバチラス・ステアロサーモフィラス由
来の蛋白質。
【請求項７】請求項１に記載の３個のペプチドをコー
ドする塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項８】請求項２に記載のペプチドをコードする
ＤＮＡ。
【請求項９】請求項３に記載のペプチドをコードする
ＤＮＡ。
【請求項１０】請求項４に記載の２個のペプチドをコ
ードするＤＮＡ。
【請求項１１】請求項５に記載の２個のペプチドをコ
ードするＤＮＡ。
【請求項１２】請求項６に記載の２個のペプチドをコ
ードするＤＮＡ。
【請求項１３】請求項７〜１２のいずれか１項に記載
のＤＮＡを含んで成る発現ベクター。
【請求項１４】請求項１３に記載の発現ベクターによ
り形質転換された宿主。
【請求項１５】前記宿主が細菌である請求項１４に記
載の宿主。
【請求項１６】前記宿主がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ）である、請求項１５に記載の宿主。
【請求項１７】請求項１４〜１６のいずれか１項に記
載の宿主を培養し、該培養物からヘプタプレニル二リン
酸合成酵素活性を有するペプチド又はその関連ペプチド
を採取することを特徴とする、ヘプタプレニル二リン酸
合成酵素活性を有するペプチド又はその関連ペプチドの
製造方法。
【請求項１８】請求項１４〜１６のいずれか１項に記
載の宿主を培養し、該培養物からヘプタプレニル二リン
酸を採取することを特徴とする、ヘプタプレニル二リン
酸の製造方法。
【請求項１９】請求項１又は２に記載のヘプタプレニ
ル二リン酸合成酵素又はそれを含有するものを基質イソ
ペンテニル二リン酸、ファルネシル二リン酸、ゲラニル
ゲラニル二リン酸、ファルネシルゲラニル二リン酸又は
ヘキサプレニル二リン酸に作用させることを特徴とする
ヘプタプレニル二リン酸の製造方法。