DE69501069T2

DE69501069T2 - Heptaprenyldiphosphat synthaze und diese kodierende DN

Info

Publication number: DE69501069T2
Application number: DE69501069T
Authority: DE
Inventors: Ayumi Koike; Tanetoshi Koyama; Shusei Obata; Kyozo Ogura
Original assignee: Toyota Motor Corp
Current assignee: Toyota Motor Corp
Priority date: 1994-07-29
Filing date: 1995-07-26
Publication date: 1998-04-09
Anticipated expiration: 2015-07-27
Also published as: US6020177A; EP0699761A2; EP0699761B1; JPH0838168A; DE69501069D1; JP3087575B2; EP0699761A3; US5773265A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDDNG

1. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf die von Bacillus stearothermophilus abstammende Heptaprenyldiphosphat-Synthetase (nachstehend manchmal als "HDP" abgekürzt), auf eine DNA, die das Enzym codiert, auf einen Expressionsvektor, der die DNA enthält, auf einen durch den Expressionsvektor transformierten Wirt, auf ein Verfahren zur Herstellung des heptaprenyldiphosphat-synthetisierenden Enzyms mittels des Wirts, und auf ein Verfahren zur Herstellung des Heptaprenyldiphosphats unter Verwendung des Enzyms oder des Wirts.

2. In Beziehung stehender Stand der Technik

HDP, das mittels einer Kondensationsreaktion von 4 Molekülen Isopentenyldiphosphat und einem Molekül Farnesyldiphosphat durch die HDP-Synthetase hergestellt wird, ist ein wichtiges biosynthetisches Zwischenprodukt von Isoprenoiden, wie Prenylchinon. Obwohl von der HDP-Synthetase, die in die Kategorie der Prenyl-Transferasen eingeordnet wird, bekannt ist, daß sie in einigen Mikroorganismen, wie Bacillus subtilis (J. Biol. Chem. 255, S. 4539 bis 4543 (1980)), auftritt, ist ihre Aminosäuresequenz und die DNA-Sequenz des Gens, das sie codiert, bislang nicht bekannt gewesen.
Gene für die Codierung anderer Prenyl-Transferasen, Farnesyldiphosphat-Synthetase ([2.5.1.1.] J. Biol. Chem. 265, S. 4607 bis 4614 (1990)), Geranylgeranyldiphosphat-Synthetase (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, S. 6761 bis 6764) sind bekannt. Die tertiären (tertially) Strukturen der bekannten Prenyl-Transferasen sind jedoch Homodimere, die zwei genau gleiche Untereinheiten umfassen, und sich von dem charakteristischen Heterodimer der Bacillus subtilis-HDP-Synthetase (FEBA Letl. 161, 257 bis 260 (1983)) unterscheiden. Deshalb existieren absolut keine Informationen, was die strukturelle Ähnlichkeit zwischen den Aminosäuresequenzen der beiden ersten Synthetasen und der letztgenannten Synthetase angeht.
Dementsprechend ist es eine Aufgabe der Erfindung eine aus Bacillus stearothermophilus stammende HDP-Synthetase, die in der Spezies bislang unbekannt war, eine DNA, die das Enzym codiert, und ein Verfahren der Herstellung einer rekombinanten HDP-Synthetase unter Verwendung der DNA zur Verfügung zu stellen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Mit der Absicht die vorstehend erwähnte Aufgabe zu lösen, gelang es den Erfindern als Ersten mittels des PCR-Verfahrens unter Verwendung von synthetisierten Primern, die aus einem Abschnitt der bekannten Sequenz der Prenyl-Transferase gestaltet worden waren, gefolgt von einer Hybridisierung unter Verwendung der PCR-amplifizierten Fragmente als Probe bzw. Sonde und dem Messen der Expressionsaktivität der Genexpressionsprodukte ein von Bacillus stearothermophilus abstammendes HDP-Synthetase-Gen zu klonen.
Somit stellt die Erfindung ein von Bacillus stearothermophilus abstammendes Protein mit Heptaprenyldiphosphat- Synthetase-Aktivität zur Verfügung, das die nachstehenden Bestandteile umfaßt: ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich von der ersten Aminosäure Met zu der 220ten Aminosäure Gly der Sequenz Nr. 1 erstreckt, oder einer Aminosäuresequenz, die aus einer Substitution, einer Deletion oder einem Hinzufügen einer oder einiger Aminosäuren in bzw. zu der Aminosäuresequenz resultiert; ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich von der ersten Aminosäure Met zu der 234ten Aminosäure Arg der Sequenz Nr. 3 erstreckt, oder einer Aminosäuresequenz, die aus einer Substitution, einer Deletion oder einem Hinzufügen einer oder einiger Aminosäuren in bzw. zu der Aminosäuresequenz resultiert; und ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich von der ersten Aminosäure Val zu der 323ten Aminosäure Tyr der Sequenz Nr. 5 erstreckt, oder einer Aminosäuresequenz, die aus einer Substitution, einer Deletion oder einem Hinzufügen einer oder einiger Aminosäuren in bzw. zu der Aminosäuresequenz resultiert, unter der Bedingung, daß das sich aus einer Variation (d.h. einer Substitution, einer Deletion oder einem Hinzufügen einer oder einiger Aminosäuren) der Aminosäuresequenz ableitende Peptid noch die Heptaprenyldiphosphat-Synthetase-Aktivität aufweist.
Die Erfindung stellt auch ein von Bacillus stearothermophilus abstammendes Peptid zur Verfügung, das eine Aminosäuresequenz, die sich von der ersten Aminosäure Met zu der 220ten Aminosäure Gly der Sequenz Nr. 1 erstreckt, oder eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus einer Substitution, einer Deletion oder einem Hinzufügen einer oder einiger Aminosäuren in bzw. zu der Aminosäuresequenz resultiert; unter der Bedingung, daß das sich aus einer Variation der Aminosäuresequenz ableitende Peptid noch die Heptaprenyldiphosphat-Synthetase- Aktivität aufweist.
Die Erfindung stellt ferner ein von Bacillus stearothermophilus abstammendes Peptid zur Verfügung, das eine Aminosäuresequenz, die sich von der ersten Aminosäure Val zu der 323ten Aminosäure Tyr der Sequenz Nr. 5 erstreckt, oder eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus einer Substitution, einer Deletion oder einem Hinzufügen einer oder einiger Aminosäuren in bzw. zu der Aminosäuresequenz resultiert; unter der Bedingung, daß das sich aus einer Variation der Aminosäuresequenz ableitende Peptid noch die Heptaprenyldiphosphat-Synthetase- Aktivität aufweist.
Die Erfindung stellt ferner ein von Bacillus stearothermophilus abstammendes Protein mit Heptaprenyldiphosphat-Synthetase-Aktivität zur Verfügung, das die nachstehenden Bestandteile umfaßt: ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich von der ersten Aminosäure Met zu der 220ten Aminosäure Gly der Sequenz Nr. 1 erstreckt, oder einer Aminosäuresequenz, die aus einer Substitution, einer Deletion oder einem Hinzufügen einer oder einiger Aminosäuren in bzw. zu der Aminosäuresequenz resultiert; und ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich von der ersten Aminosäure Val zu der 323ten Aminosäure Tyr der Sequenz Nr. 5 erstreckt, oder einer Aminosäuresequenz, die aus einer Substitution, einer Deletion oder einem Hinzufügen einer oder einiger Aminosäuren in bzw. zu der Aminosäuresequenz resultiert; unter der Bedingung, daß das sich aus einer Variation der Aminosäuresequenz ableitende Peptid noch die HeptaprenyldiphosphatSynthetase- Aktivität aufweist.
Die Erfindung stellt ferner ein von fadilus stearothermophilus abstammendes Protein mit Heptaprenyldiphosphat-Synthetase-Aktivität zur Verfügung, das die nachstehenden Bestandteile umfaßt: ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich von der ersten Aminosäure Met zu der 220ten Aminosäure Gly der Sequenz Nr. 1 erstreckt, oder eine Aminosäuresequenz, die aus einer Substitution, einer Deletion oder einem Hinzufügen einer oder einiger Aminosäuren in bzw. zu der Aminosäuresequenz resultiert; ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich von der ersten Aminosäure Met zu der 234ten- Aminosäure Arg der Sequenz Nr. 3 erstreckt, oder einer Aminosäuresequenz, die aus einer Substitution, einer Deletion oder einem Hinzufügen einer oder einiger Aminosäuren in bzw. zu der Aminosäuresequenz resultiert; unter der Bedingung, daß das sich aus einer Variation der Aminosäuresequenz ableitende Peptid noch die Heptaprenyldiphosphat-Synthetase-Aktivität aufweist.
Die Erfindung stellt ferner ein von Bacillus stearothermophilus abstammendes Protein mit Heptaprenyldiphosphat-Synthetase-Aktivität zur Verfügung, das die nachstehenden Bestandteile umfaßt: ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich von der ersten Aminosäure Met zu der 234ten Aminosäure Arg der Sequenz Nr. 3 erstreckt, oder einer Aminosäuresequenz, die aus einer Substitution, einer Deletion oder einem Hinzufügen einer oder einiger Aminosäuren in bzw. zu der Aminosäuresequenz resultiert; und ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich von der ersten Aminosäure Val zu der 323ten Aminosäure Tyr der Sequenz Nr. 5 erstreckt, oder einer Aminosäuresequenz, die aus einer Substitution, einer Deletion oder einem Hinzufügen einer oder einiger Aminosäuren in bzw. zu der Aminosäuresequenz resultiert; unter der Bedingung, daß das sich aus einer Variation der Aminosauresequenz stammende Peptid noch die Heptaprenyldiphosphat-Synthetase- Aktivität aufweist.
Die Erfindung stellt ferner eine DNA zur Verfügung, die das vorstehend erwähnte Protein und verschiedene Peptide codiert.
Die Erfindung stellt ferner einen Expressionsvektor zur Verfügung, der die vorstehend erwähnte DNA umfaßt.
Die Erfindung stellt ferner einen Wirt zur Verfügung, der durch den vorstehend erwähnten Expressionsvektor transformiert wurde.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung von Heptaprenyldiphosphat-Synthetase zur Verfügung, das durch die Züchtung des vorstehend erwähnten Wirts und der Gewinnung von Heptaprenyldiphosphat-Synthetase aus dem gezüchteten Produkt gekennzeichnet ist.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung von Heptaprenyldiphosphat zur Verfügung, das durch die Züchtung des vorstehend erwähnten Transformanten und der Gewinnung von Heptaprenyldiphosphat aus dem gezüchteten Produkt gekennzeichnet ist.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung von Heptaprenyldiphosphat zur Verfügung, das durch die Umsetzung des vorstehend erwähnten Enzyms mit einem Substrat gekennzeichnet ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die Lageverhältnisse und die Restriktionsenzymkarten für die Plasmide pAC2, pPR2, pTL6, pTLD9, pTLD17 und pTLD7 der Erfindung.
Fig. 2 ist ein Dünnschicht-Radiochromatogramm der Reaktionsmischung, die mittels Inkubation von Isopentenyldiphosphat und Farnesyldiphosphat mit dem Expressionsprodukt eines DNA-Fragments der Erfindung hergestellt wurde.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

Die Abschnitte der offenen Leserahmen der Nucleotidsequenzen der von Bacillus stearothermophilus geklonten DNA, die Heptaprenyldiphosphat-Synthetase-Aktivität exprimieren, sind als die SEQ ID NO. 1, 3 und 5 gezeigt. Die reinen Aminosäuresequenzen, die sich von den offenen Leserahmen der in den SEQ ID NO. 1,3 und 5 gezeigten DNA-Sequenzen ableiten, sind in den SEQ ID NO. 2, 4 und 6 gezeigt. Es existieren 3 offene Leserahmen. Es wird angenommen, daß die erste Leserahmen (ORFI) an der ATG-Codierung für die erste Aminosäure Met der SEQ ID NO: 1 beginnt und mit der GGG-Codierung für das 220te Gly endet. Er kann jedoch möglicherweise an der ATG-Codierung für die 19te Aminosäure Met, an der ATG-Codierung für die 20te Aminosäure Met, oder an der ATG-Codierung für die 22te Aminosäure Met beginnen.
Es wird angenommen, daß der zweite offene Leserahmen (ORFII) an der ATG-Codierung für die erste Aminosäure Met der SEQ ID NO. 3 beginnt und mit der CGG-Codierung für die 234te Aminosäure Arg endet. Dieser ORFII kann jedoch möglicherweise an der ATG-Codierung für die 23te Aminosäure Met der Aminosäuresequenz beginnen. Es wird angenommen, daß der dritte offene Leserahmen (ORFIII) an der GTG-Codierung für die erste Aminosäure Val der SEQ ID NO. 5 beginnt und mit der TAT-Codierung für die 323te Aminosäure Tyr endet. Dieser ORFIII kann jedoch möglicherweise an der ATG-Codierung für die 4te Aminosäure Met oder der ATG-Codierung für die 9te Aminosäure Met beginnen.
In der DNA, die die geklonten ORFI-III enthält, liegt das Nucleotid AACG zwischen dem Translationsterminations- bzw. Translationsstoppcodon TAG am 3'-Ende des ORFI und dem Translationsinitiations- bzw. Translationsstartcodon ATG (Met) des ORFII, und das Nucleotid GTTAAG liegt zwischen dem Translationsstoppcodon TGA des ORFII und dem Transiationsstartcodon GTG (Val) des ORFIII.
Das DNA-Expressionsprodukt in voller Länge wies die stärkste Heptaprenyldiphosphat-Synthetase-Aktivität auf und die Expressionsprodukte des ORFI und ORFIII, OREI und ORFII; und des ORFII und des ORFIII zeigten ebenfalls Heptaprenyldiphosphat-Synthetase-Aktivität. Dementsprechend werden gemäß einer Ausführungsform der Erfindung eine DNA, die die gesamten ORFI, ORFII und ORFIII umfaßt, Heptaprenyldiphosphat- Synthetase, bestehend aus dem dadurch codierten Peptid, und ein Verfahren zur Herstellung dafür zur Verfügung gestellt.
Die Erfindung stellt auch eine DNA, die die ORFI und ORFII enthält, die aber den ORFII nicht in seiner kompletten Form enthält, ein Peptid mit Heptaprenyldiphosphat-Synthetase- Aktivität, das durch die DNA exprimiert wird, und ein Verfahren für die Herstellung dafür zur Verfügung. Die Erfindung stellt ferner eine DNA, die die ORFI und ORFII, oder die ORFII und ORFIII enthält, die aber keinen anderen ORE in seiner vollständigen Form enthält, ein Peptid, das dadurch exprimiert wird, und ein Verfahren für die Herstellung dafür zur Verfügung.
Aus Pflanzen stammende Enzyme unterscheiden sich manchmal in Abhängigkeit von der Art der Pflanzen, aus der sie gewonnen wurden, um einige Aminosäuren, und sie unterscheiden sich oft aufgrund natürlicher Mutationen um einige Aminosäuren. Außerdem wird die natürliche Aktivität eines Enzyms manchmal selbst bei einer künstlichen Mutation der Aminosäuresequenz beibehalten. Dementsprechend schließt die Erfindung zusätzlich zu den Peptiden, die die durch die SEQ ID NOS: 1 bis 6 repräsentierten Aminosäuresequenzen aufweisen, auch Peptide mit Aminosäuresequenzen ein, die aus Variationen aufgrund einer Substitution, einer Deletion und/oder einem Hinzufügen einer oder einiger Aminosäuren, zum Beispiel 5 oder 10, der durch die SEQ ID NOS. 1 bis 6 repräsentierten Aminosäure- Sequenzen resultieren, unter der Bedingung, daß die Peptide noch die Enzymaktivität aufweisen.
Die Erfindung stellt ferner eine DNA, die ein Peptid codiert, das eine Mutatin auf die vorstehend beschriebene Weise erfuhr, als auch ein Verfahren-zur Herstellung des mutierten Peptids zur Verfügung.
Wie nachstehend im Detail anhand von Beispielen erklärt wird, kann die DNA der Erfindung aus Bacillus stearothermophilus geklont werden. Auch eine DNA, die einen der ORFI, ORFII und ORFIII, alle drei, oder die ORFI und ORFIII, die ORFI und ORFII oder die ORFII und ORFIII und keinen anderen ORF in vollständiger Form enthält, kann durch Zerschneiden der vollständigen DNA unter Anwendung von Restriktions-Endonucleasen erhalten werden, die zum Beispiel andere ORFs außerhalb des gewünschten ORF zerschneiden, ohne letzteren zu zerschneiden. Oder aber die DNA, die ein mutiertes Peptid codiert, kann durch eine regiospezifische Mutagenese unter Anwendung, zum Beispiel, eines mutagenen Primers erhalten werden.
Ferner ist es möglich, sobald die Aminosäuresequenz eines Peptids ermittelt ist, eine geeignete Nucleotidsequenz für ihre Codierung festzulegen, die dann eine chemische Synthese der DNA mittels herkömmlicher DNA-Syntheseverfahren gestattet. Jeder einzelne ORF der Erfindung ist nicht besonders lang und kann somit leicht von einem Fachmann auf diesem Gebiet mittels herkömmlicher DNA-Syntheseverfahren hergestellt werden.
Die Erfindung stellt ferner Expressionsvektoren, die die wie vorstehend beschriebene DNA umfassen, Wirte, die durch die Expressionsvektoren transformiert wurden, und ein Verfahren der Herstellung des Enzyms oder der Peptide der Erfindung unter Verwendung dieser Wirte zur Verfügung.
Die Expressionsvektoren schließen einen Replikationsursprung, die die Expression regulierende Sequenz und ähnliches ein, die sich in Abhängigkeit von dem Wirt unterscheiden. Der Wirt kann ein prokaryotischer Organismus sein, zum Beispiel ein Bakterium, wie E. coli, oder ein Bazillus, wie Bavcillus subtilis; ein eukaryotischer Organismus, zum Beispiel Hefe, ein Pilz, ein Beispiel dafür ist S. cerevisiae, der zur Gattung Saccharomyces gehört, oder ein Pilz, ein Beispiel dafür ist eine Art wie A. nigeroder A. oryzae, die zur Gattung Asperigillus gehört; tierische Zellen, wie gezüchtete Seidenraupenzellen, ader die gezüchteten Zellen höherer liere, zum Beispiel Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen). Pflanzenzellen-können ebenfalls als Wirte verwendet werden.
Erfindungsgemäß ist es möglich, wie in den Beispielen gezeigt werden wird, Heptaprenyldiphosphat-Synthase durch die Züchtung eines Wirts, der mit der DNA der Erfindung transformiert wurde, wodurch das Enzym in der Kultur angereichert wird, und dessen Gewinnung herzustellen. Erfindungsgemäß kann Heptaprenyldiphosphat auch dadurch hergestellt werden, indem es der durch das Verfahren der Erfindung hergestellten HDP-Synthetase gestattet wird mit Isopentenyldiphosphat und allylischem Diphosphat, wie Farnesyldiphosphorsäure, als Substrate zu reagieren.
Was zum Beispiel die Verwendung von E. coli als Wirt angeht, so sind Mechanismen für die Regulierung der Genexpression in dem Prozeß der mRNA-Transkription von der DNA, dem Prozeß der Protein-Translation von der mRNA und ähnliches bekannt. Als Promotersequenz, die die mRNA-Synthese reguliert, sind zusätzlich zu den natürlich auftretenden Sequenzen (zum Beispiel, lac, trp, bla, lpp, PL, PR, ter, T3, T7 und ähnliches) auch Mutanten davon (zum Beispiel lacUV5) und Sequenzen bekannt, die durch die künstliche Verschmelzung natürlicher Promotersequenzen (zum Beispiel tac, trc und ähnliches) erhalten wurden, und sie können ebenfalls gemäß der Erfindung verwendet werden.
Was die Sequenzen mit einem Regulierungsvermögen für die Synthese von Protein aus mRNA angeht, so ist die Bedeutung der Ribosom-Bindungsstelle (GAGG und ähnliche Sequenzen) und des Abstands zu dem Startcodon ATG bereits bekannt. Es ist ebenfalls gut bekannt, daß Stoppsequenzen, die die Vervollständigung der Transkription am 3'-Ende regulieren (Vektoren, die rrnBT&sub1;T&sub2; einschließen, sind im Handel zum Beispiel von Pharmacia Co. erhältlich), die Wirksamkeit der Proteinsynthese in Rekombinanten beeinflussen.
Vektoren, die verwendet werden können, um die Rekombinationsvektoren der Erfindung herzustellen, können welche sein, die im Handel erhältlich sind, oder sie können in Abhängigkeit vom Zweck Vektoren aus einer Vielzahl von abgeleiteten Vektoren sein. Als Beispiele seien pBr322, pBR327, pKK223-3, pKK233-2, pTrc99 und ähnliches, die das vom pMB1 abgeleitete Replikon tragen; pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pHSG298, pHSG396 und ähnliches, die für eine erhöhte Anzahl von Kopien modifiziert wurden; pACYC177, pACYC184 und ähnliches, die das vom p15A Abgeleitete Replikon tragen; und Plasmide, die sich von pSC101, ColE1, R1 oder F-Faktor ableiten, erwähnt.
Zusätzlich zu den Plasmiden ist auch eine Geneinfügung bzw. Gen-Einbau mittels Virusvektoren, wie -Phage und M13-Phage, und Transposonen möglich. Für den Gen-Einbau in andere Mikro- Organismen als E. coli sind der Gen-Einbau in die Gattung Bacillus mittels pUB110 (von Sigma Co. erhältlich) und pHY3000PLK (von Takara Shuzo erhältlich) bekannt. Diese Vektoren werden in Molecular Cloning (J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory Press), Cloning Vector (P.H. Pouwels, B.E. Enger/Valk, W.J. Brammar, veröffentlicht von Elsevier) und verschiedenen Verlagskatalogen beschrieben.
Insbesondere pTrc99 (von Pharmacia Co. erhältlich) ist als Vektor bevorzugt, der zusätzlich zu dem Ampicillinresistenz- Gen als selektiven Marker, Ptrc und lacIq als ein Promoter- und Steuer-Gen, die Sequenz AGGA als Ribosom-Bindungsstelle, und rrnBT&sub1;T&sub2; als Terminator einschließt, und für das HDP- synthetisierende Enzym-Gen eine expressionsregulierende Funktion aufweist.
Der Einbau eines DNA-Fragments, das die HDP-Synthetase codiert, und falls erforderlich, eines DNA-Fragments mit der Funktion der Expressionsregulierung des Gens für das vorstehend erwähnte Enzym, in diese Vektoren, kann durch durch ein bekanntes Verfahren unter Verwendung einer geeigneten Restriktions-Endonuclease und Ligase erreicht werden. Insbesöndere das nachstehend beschriebenen Verfahren kann einfach nachvollzogen werden. pTL6 kann als ein bestimmtes - Plasmid der Erfindung erwähnt werden, das auf diese Weise hergestellt wurde.
Als Mikroorganismen für den Einbau von Genen mittels solcher Rekombinationsvektoren können Escherichia coli, als auch Mikroorganismen, die zur Gattung Bacillus gehören, verwendet werden. Die Transformation kann auch mittels eines herkömmlichen Verfahrens, zum Beispiel mittels des CaCl&sub2;-Verfahrens oder mittels des Protoplast-Verfahrens, beschrieben in Molecular doning (J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory Press) oder in DNA Cloning Bd. I bis III (her. von D.M. Glover, veröffentlicht von IRL PRESS), und ähnlichem erfolgen.
Eine repräsentative, erfindungsgemäße Transformante, die erhalten werden kann, ist pTL6/JM109.
Wenn diese Transformanten oder rekombinanten Mikroorganismuszellen in einem Medium kultiviert werden, das normalerweise für E. coli verwendet wird, häuft sich Heptaprenyldiphosphat- Synthetase (HDP-Synthase) in den Zellen an. Das HDP in den Zellen kann durch eine physikalische Behandlung in Abwesenheit oder in Anwesenheit eines zytolytischen Enzyms für eine Lyse und ein herkömmliches Isolierungs- und Reinigungsverfahren für Enzyme gewonnen werden.
Lysozym wird bevorzugt als das zytolytische Enzym verwendet und Ultraschallwellen werden bevorzugt für eine physikalische Behandlung eingesetzt. Das meiste aus E. coli stammende Protein kann als unlöslicher Niederschlag durch ein Erwärmen bei ungefähr 55 ºC beseitigt werden. Für die Isolierung und die Reinigung des Enzyms kann eine Gelfiltration, ein Ionenaustausch, eine hydrophobe, reverse Phasen-, Affinitäts- oder ein anderer Typ von Chromatographie, oder Ultrafiltration, alleine oder als Kombination, angewandt werden.
Während des Verfahrens der Isolierung und Reinigung kann ein Reagens zur Stabilisierung des gewünschten Enzyms mit der Behandlungslösung-kombiniert werden, zum Beispiel ein Reduktionsmittel, wie β-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol, ein Schutzmittel gegen Proteasen, wie PMSF oder BSA, oder ein Metallion, wie Magnesium.
Da die vorstehend erwähnte HDP-Synthetase-Aktivität gemessen werden kann, zum Beispiel auf die nachstehend beschriebene Weise, ist es empfehlenswert, daß die Isolierung und die Reinigung des Enzyms durchgeführt wird, während ein Nachweis der Enzymaktivität unter Verwendung der in f) in dem nachstehenden Beispiel 1 angewandten Analysen-Reaktionslösung erfolgt.

BEISPIELE

Ein Beispiel eines Verfahrens der Herstellung einer DNA- Sequenz, eines Plasmid und einer Transformante gemäß der Erfindung wird nun beschrieben, wobei der Geltungsbereich der Erfindung jedoch in keinster Weise auf dieses Beispiel beschränkt ist.

Beispiel 1

Das Experiment wurde im wesentlichen in Übereinstimmung mit Molecular Cloning, DNA Cloning und dem Takara Shuzo-Katalog, der bereits erwähnt wurde, durchgeführt. Die meisten der verwendeten Enzyme wurden von Takara Shuzo erworben. Das verwendete Bacillus stearothermophilus war das bekannte Bakterium, das in der American Type Culture Collection (ATCC) aufbewahrt wird. Der Stamm ATCC 10149 wurde für dieses Experiment verwendet.

a) Herstellung chromosomaler DNA von Bacillus stearothermophilus

Die Züchtung wurde in einem LB-Medium (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% NaCl) bei 55 ºC durchgeführt und die Zellen wurden gesammelt. Nach dem Suspendieren in einem Lysepuffer wurde Lysozym (aus Hühneralbumin stammend, ein Produkt von Sigma Co.) bis zu 10 mg/ml hinzugegeben. Nach der Lyse wurde 1/10 Volumen 1 M Tris HCl (pH 8,0), 1/10 Volumen 10% SDS und 1/50 Volumen 5 M NaCl hinzugegeben. Proteinase K (Produkt von Sigma Co.) wurde bis zu 10 mg/ml hinzugegeben und die Mischung wurde auf 50 ºC erwärmt.
Ein Phenolequivalent wurde zugegeben und die Mischung wurde gerührt und zentrifugiert, um das Protein zu entfernen. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit einer Weithalspipette in einen Becher gegeben und nachdem darüber vorsichtig die 2,5fache Menge Ethanol gegeben worden war, wurde die chromosomale DNA auf einem Glasstab aufgewickelt. Nach dem Lösen in TE (10 mM Tris HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA) wurde die DNA mit Rnasea (Produkt von Sigma Co.), Proteinase K und Phenol behandelt, dann wurde vorsichtig die 2,5fache Menge Ethanol darauf geschichtet und die chromosomale DNA wurde auf einen Glasstab aufgewickelt. Nach einem Waschen mit 70%igen Ethanol wurde sie in TE gelöst und in dem nachstehenden Experiment verwendet.

b) Gewinnung von pCR64

Die DNA-Primer P1 (Sequenz Nr. 7), P2 (Sequenz Nr. 8), P4 (Sequenz Nr. 9), P6 (Sequenz Nr. 10), P8 (Sequenz Nr. 11), P9 (Sequenz Nr. 12), P10 (Sequenz Nr. 13), P11 (Sequenz Nr. 14), P12 (Sequenz Nr. 15) und P13 (Sequenz Nr. 16) wurden basierend auf den bekannten, konservierten Bereichen der Aminosäuresequenz der Prenyltransferase hergestellt.
Die chromosomale DNA wurde einer partiellen Digestion mit Sau3AI unterzogen und die PCR (Polymerasekettenreaktion) erfolgte mit Kombinationen synthetischer DNA P1 und P4, P1 und P6, P1 und P8, P2 und P4, P2 und P6, P2 und P8, P9 und P11, P9 und P4, P9 und P6, P9 und P8, P9 und P13, P1 und P11, P2 und P11, P12 und P4, P12 und P6, P12 und P8, P12 und P13, P1 und P13, P2 und P13, P10 und P4, P10 und P6, P10 und P8, und P10 und P13.
Das PCR-Produkt der P10- und P8-Kombination wurde mit dem HincII-Digestionsprodukt des Plasmids pUC118 (von Takara Shuzo erworben) unter Verwendung von T4DNA-Ligase verknüpft, und E. coli JM109 transformiert. Plasmide wurdenmittels des Alkali-SDS-Verfahrens hergestellt und die DNA-Sequenzen von 27 Klonen wurden mit einem 373A Fluoreszenz-DNA-Sequenzer von Applied Biosystems analysiert. Auf eine der Sequenzen wird als pCR64 Bezug genommen. Tabelle 1

c) Klonen des Umgebungsbereichs mit pCR64 als Sonde

c-1) Ein DNA-Fragment, das aus einem ungefähr 500 bp pCR64- Digestionsprodukt mittels der Restriktions-Endonucleasen KpnI und HindIII bestand, wurde mit DIG unter Verwendung eines DIG DNA-Markierungskits (erworben von BOEHRINGER MANNHEIM) markiert. Die Anweisungen in dem Kit-Handbuch wurden befolgt.

c-2) Herstellung der Bibliothek

Die chromosomale DNA wurde mit der Restriktions-Endonuclease AccI zerlegt und bei der Southern-Hybridisierung unter Verwendung der Sonde aus c-1) wurde in der Position bei ungefähr 3 kbp ein Band entdeckt. Das DNA-Fragment von ungefähr 3 kbp wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese isoliert und mit T4DNA-Polymerase behandelt. Diese wurde mit dem SmaI-Digestionsprodukt des Plasmids pUC18 unter Verwendung der T4DNA- Ligase verknüpft und E. coli JM109 wurde transformiert.

c-3) Screening

Die in c-2) hergestellte Bibliothek wurde mit der in c-1) hergestellten Sonde gescreent. Die Ermittlung erfolgte unter Verwendung eines DIG DNA-Ermittlungs-Kits (von BOEHRINGER MANNHEIM erworben) und das Plasmid pAC2 wurde erhalten. Die Anweisungen in dem Kit-Handbuch wurden befolgt. Eine DNA- Sequenz des eingefügten Gens von ungefähr 2,5 kbp wure mit einem 373A Fluoreszenz-DNA-Sequenzer von Applied Biosystems analysiert.

d) Isolierung von pPR2

Die genomische DNA-Bank bzw.-bibliothek von c-2) wurde unter Verwendung eines synthetischen DNA-Primers P64-4 (Sequenz Nr. 17), der basierend auf der in c-3) erhaltenen DNA-Sequenz hergestellt worden war, und eines M13-Primer RV (von Takara Shuzo erworben), einer PCR unterzogen. Das Amplifikationsprodukt wurde in den pT7-Blue T-Vektor (von Novagen erworben) eingefügt, um pBR2 zu erhalten.

e) Verknüpfung von pAC2 und pPR2

DNA-Fragmente mit ungefähr 1 kbp und 5 kbp als BamHI-Digestionsprodukte des pAC2 und pPR2 wurden ligiert, um pTL6 zu erhalten.

f) Messung der Isoprenoid-Synthetase-Aktivität

Das mit pTL6 transformierte E. coli wurde über Nacht in 50 ml LB-Medium, das 50 µl Ampicillin enthielt, gezüchtet, und die Zellen wurden gesammelt. Sie wurden in 4 ml Lyse-Buffer suspendiert und mit Ultraschallwellen zerstört. Es erfolgt bei 55 ºC ein einstündiges Erwärmen, um die aus E. coli stammende Prenyltransferase zu inaktivieren, und das aus E. coli stammende denaturierte Protein wurde durch Zentrifugieren entfernt und die überstehende Flüssigkeit wurde für das Nachweisverfahren (assay) verwendet. Der Assay- bzw. Analysen- Reaktionsmischung wurde es gestattet eine Stunde oder 14 Stunden lang bei 55 ºC zu reagieren. Die Reaktionsmischung wurde mit 1-Butanol extrahiert und die Radioaktivität wurde unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers gemessen. Tabelle 2 (Zusammensetzung de Lyse-Puffers)
Der aus der vorstehend erwähnten Umsetzung des JM105, das das pTL6 trug, erhaltene 1-Butanolextrakt, wurde hydrolysiert und mittels Dünnschicht-Chromatographie (TLC) analysiert. Als Ergebnis wurde das erzeugte Isoprenoid als Heptaprenyldiphosphat identifiziert, wodurch gezeigt wurde, daß das pTL6 das Gen für die Heptaprenyldiphosphat-Synthetase (Fig. 2) enthält. Ferner wurde bei der Untersuchung der Spezifität gegenüber allylischen Substratprimern in dem nachstehend beschriebenen (Tabelle 3) Analysen-System eine besondere Enzymaktivität für (All-E)-Farnesyldiphosphat und (All-E)-Geranylgeranyldiphosphat gefunden, wohingegen Dimethylallyldiphosphat, Geranyldiphosphat, (2Z, 6E)-Farnesyldiphosphat, (2Z, 6E, 10E)-Geranylgeranyldiphosphat und (2Z, 6E, 10E, 14E)-Farnesylgeranyldiphosphat keine zufriedenstellenden Substrate waren (Tabelle 4). Tabelle 3 Zusammensetzung der Analysen-Reaktionslösung (Gesamtvolumen: 1 ml)) Tabelle 4 Substratspezifität von HDP-Synthetase, die mittels der DNA- Sequenz der Erfindung gewonnen wurde.
E. coli weist normalerweise keine Heptaprenyl-Transferase oder Prenyl-Transferase mit Aktivität bei 55 ºC auf. E. coli, das mit pTL6 transformiert wurde, ist in der Lage Heptaprenyldiphosphat zu synthetisieren. Auch die Tatsache, daß die Aktivität bei 55 ºC auftritt, zeigt, daß die aus dem Bacillus stearothermophilus abstammende Prenyl-Transferase, die durch das pTL6 codiert wird, sehr wärmebeständig ist. Dies zeigt auch, daß die Rekombinante für die stabile Herstellung von Heptaprenyldiphosphat nützlich ist.

g) Herstellung von pTL6-Deletionsmutanten und Identifizierung des HDP-Synthetase-Gens

pTL6 wies eine Geninsertion von ungefähr 3 kbp auf, die drei ORFs enthielt. Bei der Spaltung von pTL6 mit Restriktions- Endonuclease und der Herstellung des Plasmids pTLD9 mittels der Deletion von ORFI, des Plasmids pTLD17 mittels der Deletion von ORFII und des Plasmids pTLD7 mittels der Deletion von ORFIII, und durch die Messung der Isoprenoid-Synthetase- Aktivitäten, wurde für pTL6, pTLD9 und pTLD17 eine Aktivität gefunden. 1-Butanol-Extrakte der Reaktionsprodukte von pTL6 und pTLD17 wurden hydolysiert und mittels TLC analysiert, und es bestätigte sich, daß das erzeugte Isoprenoid Heptaprenyldiphosphat war. Tabelle 5 HDP-Synthetase-Aktivitäten, die auf die DNA-Sequenzen der Erfindung zurückgehen (Radioaktivität von 1-Butanolextrakten, die in dpm-Einheiten ausgedrückt wird)
* = 14 Stunden-Reaktion
Erfindungsgemäß werden DNA-Sequenzen zur verfügung gestellt, die das von Bacillus stearothermophilus abstammende Heptaprenyldiphosphat-Synthetase-Enzym codieren. Rekombinante Mikroorganismen, die durch den Einbau der DNA-Sequenzen in Expressionsvektoren, die dann verwendet werden, um geeignete E. coli-Stämme zu transformieren, erhalten wurden, erzeugen auf sichere Weise Substanzen mit Heptaprenyldiphosphat- Synthetase-Aktivität und Heptaprenyldiphosphat.
Diese Wirkung wird durch die Herstellung der vorstehend erwähnten DNA-Sequenzen aus Chromosomen von Bacillus stearothermophilus erreicht, die bislang in der wissenschaftlichen Literatur nicht gelehrt wurde.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER:
(A) NAME: Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha
(B) STRASSE: 1, Toyota-cho
(C) STADT: Toyota-shi
(D) BUNDESLAND: Aichi
(E) LAND: Japan
(F) POSTLEITZAHL: Keine
(ii) ANMELDETITEL: Heptaprenyldiphosphat synthaze und diese kodierende DN
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 17
(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) DATENTRAGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
(v) GEGENWÄRTIGE ANMELDEDATEN: ANMELDENUMMER: BP 95111754.7

(2) INFORMATIONEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 653 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Bacillus stearothermophilus
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..663
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 220 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 705 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch)
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Bacillus stearothermophilus
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..705
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 234 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 972 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS DNS (genomisch)
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Bacillus stearothermophilus
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..972
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 6:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 323 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 7:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS DNS (synthetisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
CTNATHCAYG AYGAYYTNCC NTCNATGGAC 30

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (synthetisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
GAYAAYGAYG AYYTNMGNMG NGGC 24

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLE: DNS (synthetisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
ATCRTCNCKD ATYTGRAANG CNARNCC 27

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (synthetisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
ATCNARDATR TCRTCNCKDA TYTGRAA 27

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (synthetisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
GTCRCTNCCN ACNGGYTTNC C 21

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 12:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (synthetisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
YTNGARGCNG GNGGNAARMG 20

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 13:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsaure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (synthetisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
TAYWSNYTNA THCAYGAYGA 20

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 14:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (synthetisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
YTCCATRTCN GCNGCYTGNC C 21

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 15:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 26 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (synthetisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO. 15:
YTNGARTAYA THCAYMGNCA YAARAC 26

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 16:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS DNS (synthetisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
DATRTCNARD ATRTCRTC 18

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 17:

(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS DNS (synthetisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
GATCACATCG TCGTGGACGA 20

Claims

1. Von Bacillus stearothermophilus abstammendes Protein mit Heptaprenyldiphosphat-Synthetase-Aktivität, das die nachstehenden Bestandteile umfaßt: ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich von der ersten Aminosäure Met bis zur 220ten Aminosäure Gly der Sequenz Nr. 1 erstreckt, oder einer Aminosäuresequenz, die aus einer Substitution, einer Deletion oder einem Hinzufügen einer oder einiger Aminosäuren in bzw. zu der Aminosäuresequenz resultiert; ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich von der ersten Aminosäure Met bis zur 234ten Aminosäure Arg der Sequenz Nr. 3 erstreckt, oder einer Aminosäuresequenz, die aus einer Substitution, einer Deletion oder einem Hinzufügen einer oder einiger Aminosäuren in bzw. zu der Aminosäuresequenz resultiert; und ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich von der ersten Aminosäure Val bis zur 323ten Aminosäure Tyr der Sequenz Nr. 5 erstreckt, oder einer Aminosäuresequenz, die aus einer Substitution, einer Deletion oder einem Hinzufügen einer oder einiger Aminosäuren in bzw. zu der Aminosäuresequenz resultiert, unter der Bedingung, daß das sich aus einer Variation der Aminosäuresequenz ableitende Peptid noch die Heptaprenyldiphosphat-Synthetase-Aktivität aufweist.

2. Von Bacillus stearothermophilus abstammendes Peptid, das eine Aminosäuresequenz, die sich von der ersten Aminosäure Met bis zur 220ten Aminosäure Gly der Sequenz Nr. 1 erstreckt, oder eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus einer Substitution, einer Deletion oder einem Hinzufügen einer oder einiger Aminosäuren in bzw. zu der Aminosäuresequenz resultiert; unter der Bedingung, daß das sich aus einer Variation der Aminosäuresequenz ableitende Peptid noch die Heptaprenyldiphosphat-synthetase-Aktivität aufweist.

3. Von Bacillus stearothermophilus abstammendes Peptid, das eine Aminosäuresequenz, die sich von der ersten Aminosäure Val bis zur 323ten Aminosäure Tyr der Sequenz Nr. 5 erstreckt, oder eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus einer Substitution, einer Deletion oder einem Hinzufügen einer oder einiger Aminosäuren in bzw. zu der Aminosäuresequenz resultiert; unter der Bedingung, daß das sich aus einer Variation der Aminosäuresequenz ableitende Peptid noch die Heptaprenyldiphosphat-Synthetase-Aktivität aufweist.

4. Von Bacillus stearothermophilus abstammendes Protein mit Heptaprenyldiphosphat-Synthetase-Aktivität, das die nachstehenden Bestandteile umfaßt: ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich von der ersten Aminosäure Met bis zur 220ten Aminosäure Gly der Sequenz Nr. 1 erstreckt, oder einer Aminosäuresequenz, die aus einer Substitution, einer Deletion oder einem Hinzufügen einer oder einiger Aminosäuren in bzw. zu der Aminosäuresequenz resultiert, und ein Peptid mit einer Aminosäureseqnenz, die sich von der ersten Aminosäure Val bis zur 323ten Aminosäure Tyr der Sequenz Nr. 5 erstreckt, oder einer Aminosäuresequenz, die aus einer Substitution, einer Deletion oder einem Hinzufügen einer oder einiger Aminosäuren in bzw. zu der Aminosäuresequenz resultiert; unter der Bedingung, daß das sich aus einer Variation der Aminosäuresequenz ableitende Peptid noch die Heptaprenyldiphosphat- Synthetase-Aktivität aufweist.

5. Von Bacillus stearothermophilus abstammendes Protein, das die nachstehenden Bestandteile umfaßt: ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich von der ersten Aminosäure Met bis zur 220ten Aminosäure Gly der Sequenz Nr. 1 erstreckt, oder einer Aminosäuresequenz, die aus einer Substitution, einer Deletion oder einem Hinzufügen einer oder einiger Aminosäuren in bzw. zu der Aminosäuresequenz resultiert; und ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich von der ersten Aminosäure Met bis zur 234ten Aminosäure Arg der Sequenz Nr. 3 erstreckt, oder einer Aminosäuresequenz, die aus einer Substitution, einer Deletion oder einem Hinzufügen einer oder einiger Aminosäuren in bzw. zu der Aminosäuresequenz resultiert; unter der Bedingung, daß das sich aus einer Variation der Aminosäuresequenz ableitende Peptid noch die Heptaprenyldiphosphat-Synthetase-Aktivität aufweist.

6. Von Bacillus stearothermophilus abstammendes Protein, das die nachstehenden Bestandteile umfaßt: ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich von der ersten Aminosäure Met bis zur 234ten Aminosäure Arg der Sequenz Nr. 3 erstreckt, oder einer Aminosäuresequenz, die aus einer Substitution, einer Deletion oder einem Hinzufügen einer oder einiger Aminosäuren in bzw. zu der Aminosäuresequenz resultiert; und ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich von der ersten Aminosäure Val bis zur 323ten Aminosäure Tyr der Sequenz Nr. 5 erstreckt, oder eine Aminosäuresequenz, die aus einer Substitution, einer Deletion oder einem Hinzufügen einer oder einiger Aminosäuren in bzw. zu der Aminosäuresequenz resultiert; unter der Bedingung, daß das sich aus einer Variation der Aminosäuresequenz ableitende Peptid noch die Heptaprenyldiphosphat-Synthetase-Aktivität aufweist.

7. DNA, die eine Basensequenz enthält, die die 3 Peptide nach Anspruch 1 codiert.

8. DNA, die das Peptid nach Anspruch 2 codiert.

9. DNA, die das Peptid nach Anspruch 3 codiert.

10. DNA, die die beiden Peptide nach Anspruch 4 codiert.

11. DNA, die die beiden Peptide nach Anspruch 5 codiert.

12. DNA, die die beiden Peptide nach Anspruch 6 codiert.

13. Expressionsvektor, der die DNA nach Anspruch 7 umfaßt.

14. Wirt, der durch den Expressionsvektor nach Anspruch 13 transformiert wurde.

15. Wirt nach Anspruch 14, der ein Bakterium ist.

16. Wirt nach Anspruch 15, der Escherichia ist.

17. Verfahren zur Herstellung eines Peptids mit Heptaprenyldiphosphat-Synthetase-Aktivität oder eines verwandten Peptids, das die Schritte der Züchtung eines Wirts nach Anspruch 14 und die Gewinnung eines Peptids mit Heptaprenyldiphosphat-Synthetase-Aktivität oder eines verwandten Peptids mit Heptaprenyldiphosphat-Synthetase-Aktivität aus der Kultur umfaßt.

18. Verfahren zur Herstellung von Heptaprenyldiphosphat, das die Schritte der Züchtung eines Wirts nach Anspruch 14 und die Gewinnung von Heptaprenyldiphosphat aus der Kultur umfaßt.

19. Verfahren zur Herstellung von Heptaprenyldiphosphat, das einen Schritt umfaßt, in dem es dem Heptaprenyldiphosphate synthetisierenden Enzym nach Anspruch 1 oder einer Substanz, die es enthält, gestattet wird, auf ein Isopentenyldiphosphat-, Farnesyldiphosphat-, Geranylgeranyldiphosphat-, Farnesylgeranyldiphosphat - oder Hexaprenyldiphosphatsubstrat einzuwirken.