DE3786556T2

DE3786556T2 - Herstellung von phenylalanin-ammonialyase.

Info

Publication number: DE3786556T2
Application number: DE87905772T
Authority: DE
Inventors: John Anson; Harold Gilbert; Nigel Minton; Jon Oram
Original assignee: HEALTH LAB SERVICE BOARD; Public Health Laboratory Service Board
Current assignee: Health Protection Agency
Priority date: 1986-09-08
Filing date: 1987-09-08
Publication date: 1993-11-18
Anticipated expiration: 2007-09-09
Also published as: GB8621626D0; GB2213486B; JPH01503673A; ATE91505T1; DK254288A; GB2213486A; EP0321488B1; JP2647883B2; DK175010B1; EP0321488A1; NO881977L; DE3786556D1; WO1988002024A1; NO881977D0; GB8903492D0; DK254288D0; EP0321488B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein genetisches Material, das für das Protein Phenylalaninammoniaklyase (im folgenden als "PAL" abgekürzt) kodiert, und insbesondere ein derartiges genetisches Material, dem die dazwischenliegende nichtkodierende DNA (Introns), die normalerweise bei dem für PAL kodierenden Gen in seinem natürlichen Zustand gefunden wird, fehlt.
Phenylalaninammoniaklyase (PAL; EC 4.3.1.5), das in Pflanzen, Hefen, Pilzen und Streptornyceten vorkommt, katalysiert die nicht-oxidative Desaminierung von L-Phenylalanin zu trans-Zimtsäure (vgl. Gilbert et al., 1985). Dieses Enzym besitzt eine potentielle Rolle bei der Behandlung und Diagnose von Phenylketonune (Ambrus et al, 1978). Ferner wird es industriell bei der Synthese von L-Phenylalanin aus trans-Zimtsäure eingesetzt (Yamada et al., 1981). In Pflanzen wird das in eine Flavanoid-Biosynthese involvierte Enzym durch Lichteinwirkung induziert, während es in Gurken- und Senfsämlingen als Ergebnis der Aktivierung eines konstitutiven Pools eines inaktiven Enzyms (Attridge et al, 1974) induziert wird. Eine Lichteinstrahlung fördert eine de novo-Synthese des Enzyms in anderen botanischen Gattungen (Schroder et al., 1979) zutage. Ferne wird Gurken , Apfel-, Süßkartoffel- und Sonnenblumen-PAL durch ein spezifisches Inaktivierungssystem (Tan, 1980) reguliert.
In einigen Basidiomycetenhefepilzen kann Phenylalanin als alleinige Quelle von Kohlenstoff, Stickstoff und Energie wirken. Da PAL die anfängliche Katalysation im Katabolismus der Aminosäure katalysiert, spielt das Enzym bei der Regulierung des Phenylalaninmetabolismus eine Schlüsselrolle In Rhodosporidium toruloides wird PAL durch die Anwesenheit von L-Phenylalanin oder L-Tyrosin induziert (Marusich et al., 1981). Glucose und Ammoniak in Gegenwart von Glucose unterdrücken eine PAL-Synthese (Marusich et al., 1981), während eine Induktion einer PAL-Aktivität eher das Ergebnis einer de novo Synthese des Enzyms ist als eine Aktivierung einer inaktiven Vorstufe oder eine Abnahme der PAL-Abbaurate (Gilbert und Tully, 1982). Glucose unterdrückt eine PAL-Synthese, hat jedoch keine Wirkung auf die Stabilität des Enzyms, wohingegen Ammoniak eine Aufnahme von Phenylalanin verhindert und so durch Ausschluß des Induktors eine Enzymsynthese unterdrücken kann (Gilbert und Tully, 1982). In vitro-Translationsdaten einer mRNA, isoliert aus unter verschiedenen physiologischen Bedingungen gewachsenen R. toruloides, zeigten, daß Phenylalanin, Ammoniak und Glucose durch Einstellen des Levels funktionaler PAL-mRNA eine PAL-Synthese regulieren (Gilbert et al., 1983).
In jüngsten Jahren wurden genetische Konstruktionsverfahren entwickelt, durch die allgemein bekannte oder leicht in industriellem Maßstab züchtbare Mikroorganismen, insbesondere bestimmte Bakterien oder Hefen, derart modifiziertes genetisches Material (DNA-Sequenzen) aufweisen, daß sie eine gewünschte Verbindung, z.B. ein Protein, herstellen. Allgemein wird dies durch Insertieren eines aus einem Gen, bei dem es sich um eine für die Verbindung kodierende Polynucleotidsequenz handelt, bestehenden Plasmids zusammen mit weiterem genetischen Material, das den genetischen Apparat des Wirts zur Synthese der Verbindung instruiert, in den Wirtsmikroorganismus erreicht.
Das für PAL kodierende Gen wurde jüngst als ein 8,5 kB langes genomisches PstI-Fragment kloniert (Gilbert et al, 1985). Diese Studien zeigten, daß PAL aus einer monocistronischen mRNA von 2,5 kB synthetisiert wird, und daß das Gen als eine einzelne Kopie in dem R. toruloides-Genom vorliegt. Die Einführung des klonierten PAL-Gens sowohl in E. coli (Gilbert et al., 1985) sowie Saccharomyces cerevisae (Tully and Gilbert, 1985) führten nicht zur Produktion eines PAL- Proteins.
Obwohl entsprechend den obigen Ausführungen Versuche zur Einführung des klonierten, für PAL kodierenden Gens aus R. toruloides in den Mikroorganismus E. coli (Gilbert et al., 1985) und in die Hefe Saccharomyces cerevisae (Tully und Gilbert, 1985) unternommen wurden, lieferten diese heterologen Wirte anschließend kein PAL-Protein.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, genetisches Material, das in sich von R. toruloides unterscheidende Wirtsorganismen, die anschließend PAL-Protein liefern, eingeführt werden kann, bereitzustellen. Weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung offensichtlich.
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein intronfreies Strukturgen, das aus einem intronhaltigen strukturgen aus einem eukaroyontischen Mikroorganismus stammt, wobei beide Gene für dasselbe Genprodukt kodieren, vorausgesetzt, daß das intronfreie Gen das Produkt in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Mikroorganismus zu exprinieren vermag, bereitgestellt. Das Genprodukt kann eine chemische Verbindung, deren Herstellung erwünscht ist, beispielsweise ein Protein, sein.
Gemäß einem zweiten bevorzugten Aspekt der Erfindung wird ein intronfreies Strukturgen, das für PAL oder ein Polypeptid, das PAL-Aktivität zeigt, kodiert, bereitgestellt. Das Gen stammt vorzugsweise aus einem PAL-produzierendem Stamm eines eukaryontischen Organismus, insbesondere einem Stamn von R. toruloides.
Ein Teil der genetischen DNA-Polynucleotid-Sequenz von R. toruloides ist in Fig. 3 abgebildet. Die von den Erfindern zur Bestimmung dieser Sequenz verwendeten Verfahren werden im folgenden beschrieben. Die insgesamt 6 Introns werden als IVS 1 bis IVS 6 bezeichnet. Ebenfalls abgebildet sind die verschiedenen Restriktionsstellen. Das Gen nach dem zweiten Aspekt der Erfindung besteht deshalb vorzugsweise aus einem Intron-freien Gen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine Struktur aufweist, die identisch ist mit der Struktur des PAL-Gens, das in cDNA enthalten ist, es ist erhältlich entweder durch
(a) Reassozueren der gesamten mRNA von PAL-induzierten Zellen von R. torubides mit pUC9 mit Oligo(dT)- Schwänzen, Synthetisieren des ersten Strangs der cDNA- Kopie unter Verwendung von reverser Transkriptase in Gegenwart aller vier dNTPs, Anfügen von Oligo(dC)- Schwänzen an die neu synthetisierten Stränge unter Verwendung von terminaler Deoxynucleotidyl-Transferase, Fraktionieren mit einem alkalischen Saccharosegradienten, Reassozueren der einzelsträngigen Plasmid- DNA, die cDNA-Sequenzen trägt, mit denaturiertem pUC9 mit Oligo(dG)-Schwänzen, und Synthetisieren des zweiten Strangs mit Klenow-DNA-Polymerase in Gegenwart aller vier dNTPs, oder
(b) Synthetisieren eines cDNA-Strangs von der gesamten mRNA unter Verwendung von reverser Transkriptase und eines 19-mer-Primers mit der Sequenz GATGAGAGGGTTGTCGGTC, der zur PAL-mRNA komplementär ist, Erzeugen eines Einzelstrangabbruchs der RNA in dem so erzeugten RNA-DNA- Hybrid mit RNAaseH und Ersetzen der RNA durch DNA unter Verwendung von DNA-Polymerase von E. coli unter Verwendung der einzelstrangabgebrochenen RNA als Primer,
oder ein Gen, das eine Nucleotidsequenz aufweist, die die gleichen Aminosäuren wie diese Sequenz codiert.
Es ist im Bereich der Genetik wohlbekannt, daß mit einer definierten Sequenz verwandte oder davon abgeleitete DNA- Sequenzen für dasselbe Protein oder ein Polypeptid mit einer der von der definierten Sequenz exprimierten Aktivität ähnlichen Aktivität kodieren können. Beispielsweise können der verwandten oder davon abgeleiteten Sequenz einige Basen fehlen oder sie kann einige zusätzliche Basen umfassen. Ferner ist es bekannt, daß der genetische Code dahingehend degeneriert ist, daß mehrere Codons für dieselbe Aminosäure kodieren können. Die verwandte oder davon abgeleitete Sequenz kann deshalb einige Codons enthalten, die sich von den in Fig. 3 aufgelisteten unterschieden, die jedoch vorzugsweise für dieselbe Aminosäure kodieren. Gene, die mit dieser Sequenz an Codons in einer oder mehr dieser Arten verwandt sind oder davon abgeleitet sind, sind in dieser Erfindung enthalten.
Mit dieser Sequenz verwandte oder davon abgeleitete Gene können ferner durch den Grad an Konformität zu dieser Sequenz definiert werden. Dieser ist vorzugsweise so hoch wie möglich, idealerweise 100%, im allgemeinen genügen jedoch 70% oder mehr, beispielsweise 85% oder mehr Konformität zu dieser Sequenz.
Um zu gewährleisten, daß ein Gen gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung in einen Wirtsorganismus eingeführt wird, ist es allgemein üblich, das Gen in ein rekombinantes DNA-Molekül einzubauen. Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung wird ein rekombinantes DNA-Molekül, insbesondere ein Plasmid, das ein Gen gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung enthält, bereitgestellt.
Das Plasmid gemäß diesem Aspekt der Erfindung kann als ein Vektor zur Einführung des Gens in einen Wirt verwendet werden und kann deshalb ferner weiteres für einen Wirt, in den das Plasmid eingeführt werden soll, geeignetes genetisches Material enthalten. Derartiges genetisches Material kann vorzugsweise eine operativ mit dem Gen verknüpfte Expressionskontrollsequenz und/oder Transkriptions/Translationssignale aus für den Organismus, in den das Plasmid eingeführt werden soll und aus dem eine Expression des Produkts, z.B. PAL erhofft wird, geeigneten anderen Genen enthalten.
Die Struktur des Plasmids gemäß diesem Aspekt der Erfindung schwankt gemäß dem Wirtsorganismus, für den es als ein Vektor eingesetzt werden soll, durch Anordnen des Gens des ersten oder zweiten Aspekts der Erfindung stromab der geeigneten Regulatorsignale können jedoch Vektoren hergestellt werden, bei deren Verwendung eine Expression von R. toruloides-PAL in jedem beliebigen der gegenwärtig verwendeten Produktionsorganismen erhalten werden kann. Diese umfassen E. coli K12, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisae, Pseudomonas putida, Erwinia chrysanthemi und Säugetierzellinien.
In ähnlicher Weise ist die Natur der Regulator-DNA-Sequenzen unmittelbar stromauf des PAL-cDNA-Kodierbereichs im Plasmid aus geeigneten, charakterisierten Transkriptions/Translationssignalen zusammengesetzt. Zur Verwendung in S. cerevisae können beispielsweise eine Ribosomenbindungsstelle (encsprehend der Sequenz CCACCTT) an einer geeigneten Stelle stromauf des Translationsstarts des PAL-Gens und starke Transkriptionssignale, z.B. die aus S. cerevisae Phosphoglyceratkinase stammenden Signale, sowie Matingfaktor-Gene, die sich 5' zu der Ribosomenbindungsstelle befinden, angeordnet sein. Das Plasmid selbst kann Standardreplikons (eg 2p) und auswählbare Marker (z.B. Leu2 Trp usw.) Verwenden. In ähnlicher Weise kann man sich zur Verwendung in E. coli der PL, tac trp, rac oder lac-Promoter mit geeigneten bakteriellen Ribosomenbindungsstellen und der Plasmide auf der Basis von Co1E1 (z.B. pBR322 und pUC Plasmide), RSF1010 und Ausreißerreplikons von RI bedienen. Da die in dem natürlichen PAL-Gen vorhandenen Introns als eine Barriere für die Expression von PAL in sich von R. torubides unterscheidenden Mikroorganismen wirkt, kann die Erfindung zur Herstellung von PAL in einem weiten Bereich prokaryontischer und eukaryontischer Wirte, die zur Exprimierung des natürlichen PAL-Gens infolge der Anwesenheit der 6 Introns nicht fähig sind, eingesetzt werden.
Gemäß einem vierten Aspekt der Erfindung wird ein Wirtsorganismus, insbesondere ein Stamm von E. coli, Erwinia sp., Clostridia sp., Streptomyces sp., B. subtilis, B. stearothermophilus, Pseudomonas, weitere Mikroorganismen, z.B. Bazillen, Hefen, weitere Pilze, Tier- oder Pflanzenwirte und vorzugsweise ein prokaryontischer Wirt, der mit mindestens einen rekombinanten DNA-Molekül gemäß dem dritten Aspekt transformiert ist, bereitgestellt.
Die Erfindung liefert ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Gens, aus dem Introns deletiert worden sind. Dieses Verfahren umfaßt die folgenden Schritte:
(i) Isolieren von PAL-mRNA aus einem Stamm von R. toruloides,
(ii) Synthetisieren zweier intronfreier komplementärer DNA ("cDNA")-Sequenzen aus der mRNA, wobei die beiden cDNA- Sequenzen jeweils einen Teil eines Gens, das für PAL oder ein Polypeptid, das PAL-Aktivität zeigt, kodiert, enthalten, wobei die beiden Teile zusammen die 3' und 5' Enden des Gens enthalten.
(iii) Verbinden der beiden in (ii) vorgeschlagenen cDNA- Sequenzen zur Bildung eines intronfreien Strukturgens, das für PAL oder ein Polypeptid, das PAL-Aktivität zeigt, kodiert.
Das im Schritt (ii) eingesetzte Verfahren kann sich eines Klonierungsverfahrens, das die in den Plasmiden enthaltenden cDNA-Sequenzen bildet, bedienen. In einem derartigen Fall können die Sequenzen aus den Plasmiden, die sie durch Spaltung der Plasmide an einer geeigneten Restriktionsstelle und anschließende Ligation der beiden Sequenzen unter Ausbildung des Gens enthalten, isoliert werden. Das Gen kann anschließend mit weiterem genetischem Material zur Bildung eines es enthaltenden Plasmids, beispielsweise in Anschluß an eine Spaltung eines geeigneten bekannten Plasmids, z.B. pUC9, an geeigneten Stellen kombiniert werden. Wenn gewünscht, kann das Gen anschließend seinerseits aus diesem Plasmid herausgeschnitten werden und mit einem noch weiteren genetischen Material zur Bildung weiterer Plasmide, die als Vektoren verwendet werden können, kombiniert werden. Rekombinante Standard-DNA-Techniken, mit denen der Fachmann auf diesem Gebiet vertraut ist, können für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden.
Das in der Stufe (iii) dieses Verfahrens hergestellte Gen und/oder Plasmid ist vorzugsweise eines der Gene oder Plasmide, die vom zweiten und/oder dritten Aspekt der Erfindung umschlossen werden, wobei die in Stufe (ii) gebildeten cDNA- Sequenzen folglich vorzugsweise Teile von diesen sind. Die in Stufe (ii) hergestellten cDNA-Sequenzen und die sie enthaltenden Plasmide sind weitere Aspekte der Erfindung.
Die Erfindung umfaßt deshalb ferner DNA-Polynucleotid- Sequenzen, z.B. Plasmide, die den durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten entsprechen oder im wesentlichen entsprechen oder von ihnen abgeleitet sind oder mit diesen verwandt sind.
Die Erfindung wird im folgenden lediglich anhand eines Beispiels unter Bezugnahme auf die begleitenden Figuren beschrieben:
Fig. 1 ist ein schematisches Diagramm, das darstellt, wie die das PAL-Gen tragende genetische DNA sequenziert wurde.
Fig. 2 stellt die Herstellung der beiden das PAL-Gen tragenden Plasmide, denen die Intron-Sequenzen des natürlichen Gens fehlen, dar.
Fig. 3 zeigt die vollständige Nucleotid-Sequenz des genomischen Klons, der in der Erfindung entfernten Intron- Sequenzen, die als IVS1 bis IVS6 bezeichnet werden.
Fig. 4 zeigt die Bildung des das intronfreie Gen enthaltenden rekombinanten Plasmids pPAL3 durch Kombination der beiden cDNA-Plasmide pPAL1 und pPAL2.
Fig. 5 und 6 stellen die DNA-Nucleotid-Seauenzen der überlappenden cDNA-Klonen pPAL1 bzw. pPAL2 dar.
Fig. 7 zeigt die Expression eines PAL-Proteins aus dem Plasmid pPAL4.
In dieser Beschreibung und den Figuren werden die folgenden Abkürzungen benutzt: Aminosäure Symbol Nucleotidbasen Symbol Alanin Arginin Asparagin Aspartamsäure Urazil Thymin Cytosin Adenin Guanin Aminosäure Symbol Cystein Glutamin Glutaminsäure Glycin Histidin Isoleucin Leucin Lysin Methionin Phenylalanin Prolin Serin Threonin Tryptophan Tyrosin Valin
Auf die Fig. 1 bis 6 wird detaillierter Bezug genommen:
Fig. 1: Die Region 2 wurde aus dem geeigneten Klon (pHG3) isoliert, durch Behandlung durch T4 DNA-Ligase zirkularisiert, durch Beschallung fragmentiert, worauf die Fragmente zwischen 500 und 1000 Basenpaaren in M13mp8 insertiert wurden. Der Bereich 1 wurde in M13mp8 und M13mp9 als verschiedene spezifische Fragmente unter Verwendung der Restriktionsstellen BamHI, BclI und SalI insertiert. Die Sequenz der die BamHI-Stelle umspannenden DNA wurde durch Klonieren des angegebenen Fragments 3 in M13mp8 erhalten.
Fig. 2: Der Klon 1 (pPal1) wurde nach dem Verfahren von Heidecker und Messing (1983) erhalten. Eine Gesamt-mRNA aus pal-induzierten R. toruloides-Zellen wurde mit pUC9 mit Oligo(dT)-Schwänzen wieder doppelsträngig gemacht, worauf der erste Strang cDNA-Kopie unter Verwendung reverser Transkriptase in Gegenwart aller vier dNTP's synthetisiert wurde. Die neu synthetisierten Stränge wurden unter Verwendung terminaler Desoxynucleotidyl-Transferase mit Oligo(dc)-Schwänzen versehen. Nach einer Fraktionierung mit Hilfe eines alkalischen Saccharosegradienten wurde die die cDNA-Sequenzen tragende einsträngige Plasmid-DNA mit denaturiertem pUC9 mit Oligo(dG)-Schwänzen wieder doppelsträngig gemacht wurde, worauf unter Verwendung von DNA-Polymerase (Klenow) und der Zugabe aller vier dNTP's der zweite Strang synthetisiert wurde. Klon 2 (pPAL2) wurde unter Verwendung des Vorgehens von Gubler und Hoffman (1982) konstruiert. Der erste Strang cDNA-Kopie wurde unter Verwendung reverser Transkriptase und eines zu pal mRNA komplementären 19-mer Oligodesoxynucleotidprimers (GATCAGAGGGTTGTCGGTC) synthetisiert. Die RNA in dem RNA-DNA- Hybrid wurde anschließend mit Rnase H eingeschnitten, worauf der RNA-Strang durch E. coli DNA-Polymerase unter Verwendung der eingeschnittenen RNA als Primer mit DNA ersetzt wurde. Die doppelsträngige DNA wurde anschließend durch die Wirkung von T4 DNA-Polymerase stumpfendig gemacht, mit einem Oligo(dC)-Ende versehen und mit pBR322 mit Oligo(dG)-Schwanz wieder doppelsträngig gemacht. Unter Verwendung beider Verfahren hergestellte cDNA-Klonen wurden in E. coli JM83 transformiert, worauf unter Verwendung [α-³²p] dATP- markierter pHG3-Restriktionsfragmente Kolonien auf Pal cDNA- Sequenzen gescreent wurden.
Fig. 3: Die bestimmten Aminosäuresequenzen der 5 zufällig abgeleiteten Peptidfragmente sind durch Überstreichen der relevanten Reste angegeben. Die Introns sind die markierten IVS 1-6, wobei die allen sechs gemeinsame Sequenz durch Unterstreichen des relevanten Bereichs angegeben ist. Eine gestrichelte Überstreichung im 5' Nicht-Kodierbereich stellt den TC reichen Bereich der Sequenz dar, während das Über- und Unterstreichen unmittelbar stromab einen repetitiven Bereich markiert. Die Sequenz erstreckt sich von der am meisten links befindlichen BclI-Stelle der Fig. 1 bis zum 3'-Ende des cDNA-Klons PPAL1 (Fig. 2).
Fig. 4: Die einzelne Linie der kreisrunden pPAL1- und pPAL3- Karten stellt von pUC9 bzw. pUC8 stammende DNA dar, während die einzelne Linie von pPAL2 pBR322-DNA darstellt (vgl. Fig. 2 zur Konstruktion von pPAL1 und pPAL2). Die Doppellinie von pPAL2 stellt das "intronfreie" 5'-Ende des PAL-Gens dar, während die dicke Linie von pPAL1 das 3'-Ende des Gens darstellt. Das 5'-Ende des PAL-Gens wurde als 1,0 kB langes Pst1 - Fsp1-Fragment aus pPAL2 isoliert und an ein 1,25 kB langes Fsp1 - BamHI-Fragment ligiert, das aus dem das 3'- Ende des Gens tragenden pPAL1 isoliert wurde. Das ligierte Fragment wurde zwischen die BamHI und Psti-Stellen von pUC8 insertiert, um pPAL3 zu erzielen. Die Positionen des Translationsstart(ATG)- und -stop(TAG)-Kodons des PAL-Gens (vgl. Fig. 3) sind durch Pfeile markiert. Die Orientierung der Insertion des PAL-Gens ist derart, daß ein transkriptionelles Durchlesen aus dem aus lac-Promotor (lac po) geborenen Vektors nicht auftritt.
Fig. 5 und 6: Die zur Verbindung dieser beiden Klonen zur Bildung von pPAL3 eingesetzte Fsp 1-Stelle ist durch Unterstreichen der relevanten Nucleotide angegeben.
Fig. 7: Das Plasmid pPAL4 enthält das komplette PAL-Gen aus pPAL3 (Fig. 4), das derart in pUC9 als ein EcoRI - Hind III Fragment kloniert ist, daß ein transkriptionelles Durchlesen aus dem benachbarten lac-Promotor erfolgen kann. Eine Gen produktbildung wurde unter Verwendung eines Plasmid-gerichteten in vitro Translationskits, das von Amersham International PLC erhalten wurde, bestimmt. Die Prüflinge in den numerierten Spuren waren die folgenden: 1, keine zugesetzte DNA; 2, Plasmid pUC9; 3, Plasmid pPAL4. Molekulargewichte der Proteinmarker sind als Mr angegeben.
In der folgenden Beschreibung wird auf die folgenden allgemeinen Vorgehensweisen Bezug genommen:

MIKROBIELLE STÄMME UND PLASMIDE

Die erfindungsgemäß eingesetzten mikrobiellen Stämme und Plasmide sind in Tabelle 1 aufgelistet.

MEDIEN

E. coli-Stämme wurden in L-Brühe (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl) gezüchtet. Die Medien wurden durch Zugabe von 2% (g/v) Bacto-Agar (Difco) verfestigt. Zur Auswahl und zum Wachstum der Transformanten wurde Ampicillin (100 µg x ml&supmin;¹) eingesetzt. Funktionelle β-Galactosidase wurde durch Zugabe von 5-Brom-4-chlor-indoyl-β-D-galactosid (X-Gal) zu einer Endkonzentration von 2 µg x ml&supmin;¹ detektiert.

CHEMIKALIEN

[α³²p] dATP und das cDNA-Synthesekit wurden von Amersham International erhalten. Agarose, die Restriktionsenzyme, T4 DNA-Ligase, terminale Desoxynucleotidyltransferase und 17mer Universal Sequenzprimer wurden von Bethesda Research Laboratories bezogen. Klenow-DNA-Polymerase stammte von Boehringer Mannheim, während pUC9 mit dT-Schwänzen von PL- Biochemicals stammt. Reverse Transkriptase wurde von Anglicon Biotechnology Ltd. bezogen, während alle anderen Reagenzien von Sigma Chemical Co. oder BDH erhalten wurden. TABELLE 1 Eingesetzte mikrobielle Stämme und Vektoren Stamm E. coli Plasmide Bacteriophage Vieria und Messing Bolivar et al Gilbert et al. Neue Plasmide Messing und Vieria

DNA-MANIPULATIONEN

Alle Restriktionsenzyme und DNA/RNA modifizierenden Enzyme wurden in den Puffern und bei den Bedingungen, die die Hersteller angeben, eingesetzt. Die Plasmid-Transformationstechniken und jegliche Manipulation von DNA wurden zuvor beschrieben (Minton et al., 1984).

PLASMID DNA-ISOLIERUNG

E. coli-Plasmide wurden aus 1 l Ampicillin enthaltenden L- Boullionkulturen durch "Brij lysis" und nachfolgende CsCl- Dichtegradientenzentrifugation (Clewell und Helinski, 1969) gereinigt. Die schnelle Kochmethode von Holmes und Quigley (1981) wurde zur Plasmidisolierung in kleinem Maßstab zu Screeningzwecken eingesetzt.

MATRIZENERZEUGUNG DURCH BESCHALLUNG

Die zu sequenzierende DNA wurde nach dem Verfahren von Deininger (1983) in zufällig stumpfendig gemachte Bruchstücke fragmentiert. Die erhaltenen Fragmente wurden in die SmaI-Stelle von M13mp8 kloniert, worauf Matrizen-DNA, wie von Sanger et al. (1980) beschrieben, hergestellt wurde.

NUCLEOTIDSEQUENZIERUNG

Die Nucleotidsequenzierung erfolgte nach der Dideoxymethode von Sanger et al. (1980). Die erhaltenen Daten wurden unter Verwendung der Computerprogramme von Staden (1980) zu einer kompletten Sequenz zusammengesammelt.

ISOLIERUNG VON PAL mRNA

PAL-mRNA wurde wie zuvor beschrieben (Gilbert et al., 1985) unter Verwendung eines im Handel erhältlichen R. torubides Stamms IFO 0559 (äquivalent zu dem bei National Collection of Yeast Cultures, Norwich (GB) unter den Bedingungen des Budapester Vertrags vom 8. September 1986 hinterlegen NCYC 1589) isoliert.

cDNA-KLONEN (SYNTHESE)

i) Heidecker-Messing-Verfahren
Das eingesetzte Verfahren entsprach im wesentlichen dem von Heidecker und Messing (1983) beschriebenen Verfahren. Gesamt-mRNA aus PAL induzierten R. torubides-Zellen wurde mit pUC9 mit Oligo dT-Schwänzen wieder doppelsträngig gemacht, worauf der erste Strang cDNA-Kopie unter Verwendung reverser Transkriptase in Gegenwart aller vier dNTP's synthetisiert wurde. Die neu synthetisierten Stränge wurden unter Verwendung terminaler Desoxynucleotidyltransferase mit Oligo dC-Schwänzen versehen. Im Anschluß an eine Fraktionierung durch einen alkalischen Saccharosegradienten wurde die cDNA-Sequenzen tragende einsträngige Plasmid-DNA mit denaturiertem pUC9 mit Oho dG-Schwanzen wieder doppelsträngig gemacht, worauf der zweite Strang unter Verwendung von Klenow-DNA-Polymerase und unter Zugabe aller vier dNTP's synthetisiert wurde.
ii) Gubler-Hoffman-Verfahren
Das zweite bei der Synthese von cDNA eingesetzte Verfahren war das von Gubler und Hoffman (1983). Der erste Strang cDNA-Kopie wurde unter Verwendung von reverser Transkriptase und eines zu PAL-mRNA komplementären 19-mer Primers (GATGAGAGGGTTGTCGGTC) synthetisiert. Die RNA in dem RNA-DNA- Hybrid wurde anschließend mit Rnaseh eingeschnitten, worauf der RNA-Strang unter Verwendung der eingeschnittenen RNA als Prirner mittels E. coli DNA-Polymerase durch DNA ersetzt wurde. Die doppelsträngige DNA wurde anschließend durch die Wirkung von T4 DNA-Polymerase glattendig gemacht, mit Oligo dC-Schwänzen versehen und mit P8R322 mit Oligo dG-Schwänzen wieder doppelsträngig gemacht.

NACHWEIS DER PAL cDNA-KLONEN

Plasmid-DNA tragende cDNA-Inserte wurden in E. coli JM83 transformiert, worauf die AmpR-Transformanten auf PAL-spezifische DNA gescreent wurden. Dies erfolgte durch in situ Koloniehybridisierung (Grundstein und Hogness, 1975) unter Verwendung radioaktiv markierter pHG3 DNA-Subfragmente, die einen Teil des PAL-Gens trugen.

AMINOSÄURE-SEQUENZIERUNG

Peptidfragmente gereinigten (gemgß Gilbert et al., 1985) PAL-Proteins wurden, wie zuvor beschrieben (Minton et al., 1984), isoliert. Ein Aminosäure-Sequenzierung erfolgte unter Verwendung eines automatisierten Edman Abbaus mit Hilfe einer Gasphasen-Sequenziervorrichtung, Modell 470A von Applied Biosystems.

IN VITRO TRANSLATION

Das verwendete bakterielle, ionenfreie, gekuppelte Transkriptions/Translationssytem war eine Modifikation des ersten von De Vries und Zubay (1967) beschriebenen Systems. Der E. coli S-30-Extrakt und die für eine in vitro Expression von auf einem bakteriellen Plasmid enthaltenen Genen erforderlichen Ergänzungslösungen wurden als ein Kit von Amersham International PLC bezogen. Gebildete Proteine wurden mit ³&sup5;S-Methionin (Amersham) markiert und durch SDS- PAGE auf 12%igen Acrylamidgelen (Laemmli, 1970) analysiert. Die Gele wurden 16 h lang vor einer Autoradiographie getrocknet.

1. NUCLEOTID-SEQUENZIERUNG DES GENOMISCHEN PAL-KLONS

Das PAL-Gen besaß, wie zuvor dargestellt (Gilbert et al, 1985), einen 2,5 kB langen DNA-Bereich in einem 6,7 kB langen Bcli-Fragment, das in pUC8 zur Bildung des rekombi nanten Plasmids pHG3 (vgl. Fig. 1) kloniert war. Die Mehrheit des Gens lag auf einem 3 kB langen BamHI-Fragment, während das verbleibende 5'-Ende des Gens auf einem 0,7 kB langen BamHI-Bcli-Fragment lag. Demzufolge war das 3 kB lange Fragment von einem geeigneten Klon (Fragment 2, Fig. 1) und durch Beschallung (Deininger, 1983) erzeugten Zufallssubfragmenten, die in M13mp8 kloniert waren, isoliert. Insgesamt wurden einige 250 Matrizen hergestellt und sequenziert, wobei die erhaltenen Daten unter Verwendung der Computerprogramme von Staden (1980) zu einer kompletten Sequenz kompiliert wurden. Die Sequenz des 5'-Endes des Gens wurde durch das ortsspezifische Klonieren der relevanten Bcl1-BamHI, BclI-SalI und BamHI-SalI-Fragmenten (Bereich 1, Fig. 1) in geeignete Stellen von Ml3mp8 und M13mp9 erhalten. Eine Sequenzbestimmung der die BamHI-Stelle umspannenden DNA wurde durch Klonieren des in Fig. 1 angegebenen SalI-XhoI- Fragments (3) erreicht.
Die Translation des geeigneten DNA-Strangs des sequenzierten Bereichs zeigte, daß ein offener Leserahmen (ORF) mit der Fähigkeit zur Kodierung für PAL nicht vorhanden war. Eine Bestätigung, daß dieser Bereich jedoch für PAL kodiert, wurde durch Vergleich der translatierten Aminosäureseqenzen mit der bestimmten Sequenz von 5 zufällig abgeleiteten Peptidfragmenten erhalten. Alle 5 Peptidsequenzen befanden sich in der translatierten Sequenz, traten jedoch in verschiedenen Translationsleserahmen (Fig. 2) auf. Die Abwesenheit eines angrenzenden offenen Leserahmens legte die Vermutung nahe, daß in Gemeinsamkeit mit anderen Pilzgenen das PAL-Gen Introns enthält.

2. ISOLIERUNG DER DAS PAL-GEN TRAGENDEN cDNA-KLONEN

Um die Identifizierung der PAL-Introns zu ermöglichen, wählten wir ein Reklonieren des Gens aus cDNA. In den anfänglichen Untersuchungen wurde das Vorgehen von Heidecker-Messing (1983) unter Verwendung des Vektors pUC9 und gereiniger PAL mRNA angewandt. PAL DNA-Sequenzen tragende Klonen wurden unter Verwendung des 3 kb langen BamHI-Bcli-Fragments von pHG3 als einer DNA-Sonde identifiziert. Der größte erhaltene Klon pPALL enthielt einige 1,3 kb lange aus dem 3'-Ende des PAL-Gens (Fig. 3). Das 5'-Ende des Gens wurde durch Klonieren von cDNA mit C- Schwänzen, hergestellt nach dem Verfahren von Gubler und Hoffman (1983), in P8R322 mit G-Ende unter Herstellung von pPAL2 erhalten. In diesem Fall war der während der Synthese des ersten Strangs eingesetzte Primer ein synthetisiertes 19-mer Oligonucleotid, komplementär zu dem für PAL kodierenden Strang 150 Basenpaare stromab vom 5'-Ende der zuvor erhalten cDNA (siehe Fig. 3). Die Nucleotidsequenz der beiden cDNA-Klonen wurde durch ortsspezifisches Klonieren geeigneter Restriktionsfragmente in M13mp8 und M13mp9 bestimmt.

3. IDENTIFIZIERUNG DER PAL-INTRONS

Eine Sequenzbestimmung der beiden Klonen bestätigte die Anwesenheit von 6 Introns in der für PAL kodierenden Sequenz. Somit waren die als IVS1 bis IVS6 markierten DNA-Bereiche aus den geeigneten Bereichen von pPAL1 und PPAL2 vollständig entfernt. Eine Untersuchung der 6 fehlenden Bereiche zeigte, daß sie alle die Nudeotide CAG an ihren 3'-Enden enthielten. Damit zeigten sie perfekte Übereinstimmung mit der Konsensus-Intronakzeptorsequenz, wie sie allgemein in eucaryontischen Genen beobachtet wird (Mount, 1982). Eine Zahl von Sequenzen am 5'-Ende einiger dieser Introns zeigte eine geringere Konformität zu der eucaryontischen Konsensus- Donorsequenz (GTA/GAGT) . Somit waren die Donorsequenzen von IVS2, 4 und 5 GTGCGT, GTGCGC bzw. GTGCGC. Es wurde allgemein gezeigt, daß die Introns von eucaryontischen Genen die zum akkuraten Spleißen der dazwischenliegenden Nicht-Kodierbereiche notwendigen Sequenzen enthalten. Mit den Konsensus- Sequenzen, wie sie in den Introns anderer Eucaryontika beobachtet wurden, konforme Sequenzen (z.B. TACTTAACA in S. cerevisae, vgl. Orbach et al, 1986) waren in den R. torubides-Introns nicht vorhanden. An ihrer Stelle war eine Sequenz vorhanden, die mit dem Konsens G/ANG/CTGAC konform war (die relevante Sequenz in jedem Intron wurde in Fig. 3 unterstrichen) . Eine derartige Sequenz kann für R. toruloides und eng verwandte Organismen spezifisch sein.
Es wurde gezeigt, daß das PAL-Gen weder in E. coli (Gilbert et al, 1985) noch in S. cerevisae (Tully und Gilbert, 1985) exprimiert. Der Grund für das Fehlen einer Expression in dem ersten ist unzweifelhaft auf die Anwesenheit von Introns in dem PAL-Gen zurückzuführen. Obwohl S. cerevisae Introns zu spleißen vermag, erklären die Unterschiede in den Nucleotid- Sequenzen der PAL-Introns und der in S. cerevisae-Intron gefundenen wahrscheinlich die Unfähigkeit dieser Hefe, das R. toruloides PAL-Gen zu exprimieren.

4. DERIVATISIERUNG EINES ANGRENZENDEN cDNA PAL-GENS

Die beim Klonieren des PAL-Gens aus cDNA eingesetzte Vorgehensweise hatte zu zwei Klonen, pPALL, das das 3'-Ende des Gens trug, und pPAL2, das das 5'-Ende des Gens trug, geführt. Ein dritter Plasmid wurde konstruiert, der durch Amalgamieren der Inserte der obigen zwei Plasmide das gesamte PAL-Struktur-Gen trug. Dies wurde durch Isolieren eines 1,0 kb langen FspI - Psti-Fragment aus pPAL2, das das 5'-Ende von PAL trug, und Ligieren desselben an ein 1,5 kb langes FspI - BamHI-Fragment, das das 3'-Ende des aus pPAL1 isolierten Gens trug, erreicht. Die ligierte DNA wurde anschließend in mit Psti und BamHI gespaltenes pUC9 insertiert (Fig. 4). Das Plasmid pPAL3 trug folglich das gesamte PAL-Struktu£gen, ihm fehlten jedoch alle 6 Introns, die in dem natürlichen R. toruloides-Chromosonengen gefunden wurden.

5. SYNTHESE EINES PAL-PROTEINS

Das das vollständige intronfreie PAL-Gen aus pPAL3 enthaltende Fragment wurde in die pUC-Plasmide in beide Orientierungen relativ zu dem lac-Promotor kloniert, wobei pPAL3 (pUC8) und pPAL4 (pUC9) erhalten wurden. In pPAL4 war das PAL-Gen in Phase mit dem lacz-Promotor aus ppUCg, wobei eine PAL-Proteinsynthese in einem Plasmid-gerichteten in vitro Translationssystem gezeigt wurde. Dies ist in Fig. 7 dargestellt. Mit dem PAL-Gen in der entgegengesetzten Orientierung (pPAL3) wurde kein PAL-Protein gebildet. Wir entwickeln gegenwärtig Vektorsysteme, die uns erlauben, das PAL-Gen in Saccharomyces cerevisiae zu exprimieren.
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Claims

1. Intron-freies Strukturgen, abgeleitet von einem entsprechenden Intron-haltigen Strukturgen aus dem eukaryontischen Mikroorganismus R. torubides, wobei beide Gene für dasselbe Produkt kodieren, dadurch gekennzeichnet, daß das Intron-freie Gen Phenylalaninammoniaklyase ("PAL") oder ein PAL-Aktivität zeigendes Polypeptid in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Mikroorganismus zu exprimieren vermag.

2. Intron-freies Gen, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Struktur aufweist, die identisch ist mit der Struktur des PAL-Gens, das in cDNA enthalten ist, erhältlich durch

(a) Reassozueren der gesamten mRNA von PAL-induzierten Zellen von R. torubides mit pUC9 mit Oligo(dT)- Schwänzen, Synthetisieren des ersten Strangs der cDNA-Kopie unter Verwendung von reverser Transkriptase in Gegenwart aller vier DNTPS, Anfügen von Oligo(dC)-Schwänzen an die neu synthetisierten Stränge unter Verwendung von terminaler Deoxynucleotidyl-Transferase, Fraktionieren mit einem alkalischen Saccharose-gradienten, Reassozueren der einzelsträngigen Plasmid-DNA, die cDNA-Sequenzen trägt, mit denaturiertem pUC9 mit Oligo (dG) -Schwänzen, und Synthetisieren des zweiten Strangs mit Klenow-DNA-Polymerase in Gegenwart aller vier dNTPs, oder

(b) Synthetisieren eines cDNA-Strangs von der gesamten mRNA unter Verwendung von reverser Transkriptase und eines 19-mer-Primers mit der Sequenz GATGAGAGGGTTGTCGGTC, der zur PAL-mRNA komplementär ist, Erzeugen eines Einzelstrangabbruchs der RNA in dem so erzeugten RNA-DNA-Hybrid mit RNAaseH und Ersetzen der RNA durch DNA unter Verwendung von DNA- Polymerase von E. coli unter Verwendung der einzelstrangabgebrochenen RNA als Primer,

oder ein Gen, das eine Nücleotidsequenz aufweist, die die gleichen Aminosäuren wie diese Sequenz codiert.

3. Gen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ihm einige Basen fehlen, daß es einige zusätzliche Basen aufweist oder daß einige Codons durch andere Codons ersetzt sind unter der Voraussetzung, daß das Gen PAL oder ein PAL-Aktivität zeigendes Polypeptid codiert.

4. Rekombinantes DNA-Molekül, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Gen nach Anspruch 1 enthält.

5. Rekombinantes DNA-Molekül, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Gen nach Anspruch 2 oder 3 enthält.

6. Molekül nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Plasmid handelt.

7. Plasmid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Vektor ist und ferner eine operativ mit dem Gen verknüpfte Expressionskontrollsequenz und/oder für PAL oder ein PAL-Aktivität zeigendes Polypeptid geeignete Transkriptions/Translations-Signale von E. coli K12, Bacillus subtilis, Saccharomvces cerevisiae, Pseudomonas putida, Erwinia chrysanthemi oder Säugetierzellinien enthält.

8. Plasmid nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Ribosomenbindungsstelle stromauf des Translationsstarts des Gens und von S. cerevisiae-Phosphoglyceratkinase stammende Transkriptionssignale sowie 5' zur Ribosomenbindungsstelle angeordnete Matingfaktorgene enthält.

9. Rekombinantes DNA-Molekül, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem in das Plasmid pUC9 eingefügten Gen nach Anspruch 2 besteht, wobei sich das Gen in Phase mit dem lac Z Promotor von pUC9 befindet.

10. Wirtsmikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 5 transformiertes E. coli handelt.

11. Verfahren zur Herstellung eines Gens, aus dem Introns deletiert worden sind, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt:

(i) Isolieren von PAL mRNA aus einem Stamm von R. torubides,

(ii) Synthetisieren zweier Intron-freier cDNA-Sequenzen aus der RNRNA, wobei die beiden cDNA-Sequenzen jeweils einen Teil eines für PAL oder ein PAL-Aktivität zeigendes Polypeptid kodierenden Gens und die beiden Teile zusammen das 3' und 5' Ende des Gens enthalten,

(iii) Verbinden der beiden cDNA-Sequenzen zur Bildung eines Intron-freien Strukturgens, das für PAL oder ein PAL-Aktivität zeigendes Polypeptid kodiert.