DK175010B1 - Intronfri struktursekvens, DNA-molekyle indeholdende denne, hermed transformeret værtsorganisme samt fremgangsmåde til fremstilling af en sådan intronfri struktursekvens - Google Patents

Description

i DK 175010 B1

Opfindelsen angår genetisk materiale, der koder for proteinet phenylalanin ammoniaklyase (herefter forkortet "PAL"), nemlig sådant genetisk materiale, der mangler indskudt ikke-kodende DNA (introner), der nor-5 malt findes i den naturlige sekvens kodende for PAL.

Phenylalanin ammoniaklyase (PAL; EC 4.3.1.5), der forekommer i planter, gærarter, svampe og strepto-mycetes, katalyserer for den ikke-oxidative deaminering af L-phenylalanin til trans-kanel syre (se Gilber et al., 1985). Enzymet har en potentiel rolle ved behandling og diagnose af phenylketonuria (Ambrus et al., 1978) og har industriel anvendelse ved syntesen af L-phenylalanin fra trans-kanelsyre (Yamada et al., 1981).

I planter induceres enzymet, der er involveret i flava- noid biosyntese, ved belysning, hvorimod induktionen i 15 agurkefrø og sennepsfrø er resultatet af aktivering af en konstitutiv mængde inaktivt enzym (Attridge et al., 1974). Belysning fører til frisk syntese af enzymet hos andre botaniske specier (Schroder et al., 1979). PAL fra agurker, æbler, søde kartofler og sol-20 sikker reguleres også af et specifikt inaktiverende system (Tan, 1980).

I visse basidiomycete gærarter kan phenylalanin fungere som eneste kilde for carbon, nitrogen og energi. Da PAL katalyserer den første reaktion ved kat-abolismen af aminosyren, spiller enzymet en nøglerolle ved regulering af phenylalanin metabolismen. I Khodo-sporidium toruloides induceres PAL ved tilstedeværelse af L-phenylalanin eller L-tyroein (Marusich et al., 1981). Glucose, og ammoniak ved tilstedeværelse af glucose, undertrykker PAL syntese (Marusich et al., 1981), hvorimod induktion af PAL-aktivitet er et resultat af ny syntese af enzymet snarere end af aktivering af en inaktiv precursor eller af et fald i hastigheden for PAL-nedbrydning (Gilbert og Tully, 1982). Glucose un- DK 175010 B1 2 dertrykker PAL-syntese, men har ingen virkning på stabiliteten af enzymet, hvorimod ammoniak forhindrer optagelse af phenylalanin og på denne måde kan undertrykke enzymsyntensen ved eksklusion af inducer (Gilbert og 5 Tully, 1982). In vitro translationsdata for mRNA isole ret fra R.toruloidee dyrket under forskellige fysiologiske betingelser viste, at phenylalanin, ammoniak og glucose regulerer PAL-syntese, idet de tilpasser niveauet for funktionel PAL mRNA (Gilbert et al., 1983).

10 I de senere år er genteknologiske fremgangsmåder blevet udviklet, hvorved mikroorganismer, der er almindelige eller som let kan dyrkes i en industriel skala, især visse bakterier eller gærarter, får deres genetiske materiale (DNA-sekvenser) modificeret, så de derved pro-15 ducerer en ønsket forbindelse f.eks. et protein. I grove træk opnår man dette ved i hver mikroorganisme at indsætte et plasmid, der består af et gen, der er en po-lynucleotidsekvens, der koder for forbindelsen sammen med et andet genetisk materiale, der giver instruktioner 20 til værtens genetiske apparat ora at syntetisere forbindelsen.

Genet, der koder for PAL, er fornyligt blevet klonet som et 8,5 kb genomisk PstI-fragment (Gilbert et al., 1985). Disse studier tydede på, at PAL syntetise-25 res fra et monocistronisk mRNA på 2,5 kb, og at genet findes som en enkelt kopi i R.toruloidee genomet. Indførelsen af det klonede PAL-gen både i E.coli (Gilbert et al., 1985) og i Saccharomyces cerevisae (Tully og Gilbert, 1985) førte ikke til produktion af PAL-30 protein.

Skønt man har forsøgt ved lignende fremgangsmåder at indføre det klonede PAL-kodende gen fra R.toruloidee i mikroorganismen E.coli (Gilbert et al., 1985) og i gærarten Saccharomyces cerevisae (Tully og 35 Gilbert, 1965) producerede disse heterologe værter ikke på det tidspunkt PAL-protein.

3 DK 175010 B1

Det er et mål for opfindelsen at tilvejebringe genetisk materiale, der lean indføres i andre værtorga-nismer end R.toruloides, så disse værtsorganismer der-refter vil producere PAL-protein. Andre mål og fordele 5 ved opfindelsen vil fremgå af den følgende beskrivelse.

Opfindelsen tilvejebringer en intronfri struktursekvens stammende fra den tilsvarende intronholdige struktursekvens fra den eukaryotiske mikroorganisme R. toruloides, idet begge sekvenser koder for samme pro-10 dukt, og er ejendommelig ved, at den intronfrie sekvens er i stand til at eksprimere phenylalanin ammoniaklyase ("PAL") eller et polypeptid, der opviser PAL aktivitet, i en prokaryotisk eller eukaryotisk mikroorganisme.

En del af den genetiske polynucleotidsekvens fra 15 R. toruloides er vist på figur 3. Opfindernes metoder til bestemmelse af denne sekvens beskrives senere. De i alt seks introner er mærket IVS 1 til IVS 6. Også de forskellige restriktionssteder vises. Sekvensen ifølge opfindelsen består derfor i et andet aspekt foretrukket 20 af en intronfri sekvens, der er ejendommelig ved at have en struktur identisk med strukturen for PAL genet fundet i cDNA opnåeligt ved enten at (a) anneale total mRNA fra PAL inducerede R. toruloides celler til med oligo dT endeforlænget pUC9, syntetisere den første streng cDNA ko-25 pi ved brug af revers transkriptase i nærvær af alle 4 dNTP"er, endeforlænge de nysyntetiserede strenge med oligo dC ved brug af terminal desoxynucleotidyltransferase, fraktionere på en alkalisk saccharosegradient, anneale enkeltstrenget plasmid DNA bærende cDNA sekvenser 30 til denatureret oligo dG endeforlænget pUC9 og syntetisere den anden streng med Klenow DNA polymerase i nærvær af alle 4 dNTP'er; eller (b) syntetisere en cDNA streng fra total mRNA ved brug af revers transkriptase og en 4 DK 175010 B1 19-mer primer med sekvensen GATGAGAGGGTTGTCGGTC, der er komplementær til PAL mRNA, hakmærke RNA i den herved producerede RNA-DNA hybrid med RNAaseH og erstatte det med DNA ved brug af E. coli DNA polymerase og ved brug 5 af det hakmærkede RNA som primer; eller en sekvens med en nucleotidsekvens, der koder for samme aminosyrer som denne sekvens.

Det er velkendt i genetiken, at DNA-sekvens er, der er relateret til eller afledt fra en bestemt sek-10 vens, kan kode for samme protein eller for et polypeptid med lignende aktivitet til det, der éksprimeres af den bestemte sekvens. F.eks. kan den relaterede eller afledte sekvens mangle visse baser eller kan inkludere visse yderligere baser. Det vides også, at den genetiske 15 kode er degenereret, idet adskillige codoner kan kode for den samme aminosyre. Den relaterede eller afledte sekvens kan derfor ‘indeholde visse codoner, der er forskellige fra de, der er opregnet i fig. 3, men som foretrukket koder for den samme aminosyre.

20 Gener relateret til eller afledt fra denne sek vens kan også defineres ved, i hvor høj grad de svarer til denne sekvens. Dette er foretrukket så højt som muligt, ideelt set 100%, men 70% eller højere, f.eks. 85% eller højere konformitet med denne sekvens er i almindelighed tilfredsstillende.

Til opnåelse af, at en sekvens ifølge opfindelsen eller det andet aspekt af opfindelsen kan indføres i en værtsorganisme vil man normalt inkludere sekvensen i et rekombinant DNA molekyle. I overensstemmelse hermed til-30 vejebringes ifølge et tredie aspekt af opfindelsen et rekombinant DNA molekyle, især et plasmid, der indeholder en sekvens ifølge opfindelsen eller dennes andet aspekt.

5 DK 175010 B1

Plasmidet ifølge dette aspekt af opfindelsen kan benyttes som en vektor til indførelse af struktursekvensen i en vært og kan derfor også indeholde yderligere genetisk materiale, der passer til en vært hvori man øn-5 sker at indføre plasmidet. Sådant genetisk materiale kan foretrukket indeholde en kontrolsekvens for eksprimering operativt forbundet til nævnte struktursekvens og/eller transkriptions/translationssignaler fra andre gener, der passer til den organisme hvori plasmidet skal indføres 10 og fra hvilken man håber på eksprimering af produktet, nemlig PAL.

Strukturen af plasmidet ifølge dette aspekt af opfindelsen vil variere afhængig af den værtsorganisme, det benyttes i som en vektor, men ved at anbringe struk-15 tursekvensen ifølge det første eller andet aspekt af opfindelsen nedstrøms for de passende regulerende signaler kan man fremstille vektorer hvori man kan opnå eksprimering af R. toruloides PAL i en hvilken som helst af de nuværende produktionsorganismer. Disse inkluderer E.coli 20 K12, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Pseu domonas putida, Ervinia chrysanthemi og pattedyrcellelinier.

På lignende måde vil arten af de regulerende DNA-sekvenser, der findes umiddelbart opstrøms for PAL

cDNA koderegionen i plasmidet, være udgjort af passende 25 karakteriserende transkription/translationssignaler.

F.eke. til anvendelse i S.cerevisae kan man embringe et ribosorabindingssted (der svarer til sekvensen CCACCTT) i passende stilling opstrøms for translationsstarten af PAL-genet og kraftige transkriptionssignaler, såsom så-30 danne der afledes fra S.cerevisae phosphoglyceratkinase og mating faktor sekvenser anbragt 5' i forhold til riboeombindingsstedet. Plasmidet selv kan benytte standard replikon (f.eke. 2p) og udvælgelige markører 6 DK 175010 B1 (f.eks. Leu2, Trp osv.)· Tilsvarende vil man i S.coli benytte PL, tac, trp, rac eller lac promotorer med passende bakterielle ribosombindingssteder og plaemider baseret på ColEl (f.eks. pBR32 og pUC plasmider), 5 RSF1010 og runaway replikons af RI. Idet Intronerne, der findes i det naturlige PAL-gen, fungerer som en bremse for eksprimering af PAL i organismer forskellig fra R.toruloides, kan opfindelsen benyttes til at fremstille PAL i en lang rakke prokaryotiske og eukaryotis-10 ke værter, der ikke er i stand til at eksprimere det naturlige PAL-gen p.g.a tilstedeværelsen af de 6 intro-ner.

Ifølge et fjerde aspekt af opfindelsen tilvejebringes en værtsorganisme, nemlig en stamme af E. coli 15 transformeret med et rekombinant DNA-molekyle ifølge det tredie aspekt af opfindelsen.

Opfindelsen tilvejebringer også en fremgangsmåde til fremstilling af en sekvens, hvorfra introner er slettet, hvorved man i trin: 20 (a) isolerer PAL mRNA fra en stamme af R. toruloides; (b) syntetiserer to intronfrie cDNA sekvenser fra dette mRNA, idet de to DNA sekvenser hver indeholder en del af en sekvens, der koder for PAL eller et polypeptid, der opviser PAL aktivitet, så de to dele sammen indeholder 25 3'- og 5'-enderne af denne sekvens; og (c) forbinder de to sekvenser til dannelse af en intron-fri struktursekvens, der koder for PAL eller for et polypeptid, der opviser PAL aktivitet.

Fremgangsmåden der benyttes i trin (b), kan udnyt-30 te en kloningsfremgangsmåde der til dannelse af cDNA-sekvenser, der findes i plasmider. I så tilfælde kan man isolere sekvenserne fra plasmideme, der indeholder dem, ved spaltning af plasmiderne ved et passende restrikti- 7 DK 175010 B1 onssted, hvorefter man ligerer de to sekvenser til dannelse af struktursekvensen. Man kan derefter kombinere denne med andet genetisk materiale til opnåelse af et plasmid der indeholder det, f. eks. efter spaltning af 5 et passende kendt plasmid, såsom pUC9 på passende steder. Om nødvendigt kan man derefter udskære struktursekvensen fra dette plasmid og kombinere det med yderligere andet genetisk materiale til dannelse af andre plasmider, der kan benyttes som vektorer. Standard re-10 kombinant DNA-teknik, kendt for fagmanden, kan benyttes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Struktursekvensen, der frembringes i trin (c) ved denne fremgangsmåde, er foretrukket en af de struktursekvenser eller plasmider, der omfattes af det andet 15 aspekt af opfindelsen, og cDNA-sekvenserne anbragt i trin (b) er som følge deraf foretrukket dele af denne.

Opfindelsen vil nu blive beskrevet ved hjælp af eksempler under reference til tegningen# hvori Fig.l er et skematisk diagram, der illustrerer hvordan 20 det genetiske DNA med indhold af PAL-genet blev sekvensopdelt;

Fig.2 illustrerer produktionen af de to plasmider, der bærer PAL-genet, der mangler intronsekvenserne fra det naturligt forekommende gen;

Fig.3 viser den fuldstændige nucleotidsekvens for den 25 genomiske klon i de intronsekvenser, der fjernes ifølge opfindelsen og er mærket XVS1 til IVS6, og den tilsvarende aminosyresekvens for PAL;

Fig.4 viser dannelsen af det rekombinante plasmid pPAL3, der indeholder det intronfrie gen ved ^ kombinering af de to cDNA-plasmider pPALl og pPAL2; é 8 DK 175010 B1

Figurerne 5 & 6, illustrerer DNA nucleotidsekvenserne for de over· lappende cDNA kloner, henholdsvis pPALl og pPAL2; og 5 Fig.7 viser eksprimering af PAL-protein fra plasmidet pPAL4.

I beskrivelsen og på figurerne benyttes følgende forkortelser:

Aminosyrer symbol Nucleotidbaser symbol

Alanin Ala Uracil U

Ar ginin Arg Thymin T

Asparagin Asn Cytosin C

Asparaginsyre Asp Adenin A

15 Asn + Asp Asx Guanin G

Cyetein Cys

Glutamin Gin

Glutaminsyre Glu

Gin + Glu Glx 20 Glyein Gly

Histidin Ris

Isoleucin Ile

Leucin Leu

Lysin Lys

Methionin Met 25

Phenylalanin Phe

Prolin Pro

Serin Ser

Threonin Thr

Tryptophan Trp 30 Tyrosin Tyr

Valin Val 9 DK 175010 B1

Pigurene 1-6 beskrives nu mere detaljeret: I fig.l isolerede man region 2 fra en passende klon (pHG3), ringslutet ved behandling med T4 DNA-ligase, fragmenteret ved lydbehandling, og hvor man hav-5 de indsat fragmenter på 500-1000 · bp i M13mp8. Region (1) blev indsat i M13mp8 og M13nq?9 som forskellige specifikke fragmenter, idet man benyttede restriktionsste-derne BamHI, Bell og Sall. Sekvensen for DNA, der omfattede BamHI-stedet, blev opnået ved kloning af fragmentet 10 betegnet (3) i M13mp8.

I fig. 2 opnåede man klon 1 (pPALl) ved fremgangsmåden ifølge Heidecker og Messing (1983). Total mRNA fra pal-inducerede R. toruloides celler blev sammenføjet med oligo(dT)endeforlænget pUC9, og man synte-15 tiserede den første streng cDNA kopi under anvendelse af revers transkriptase og under tilstedeværelse af alle fire dNTP'er. Man forsynede de frisk syntetiserede stre-neg med oligo(dC)endeforlængelser under anvendelse af en terminal desoxynucleotidyltransferase. Efter fraktione-20 ring over alkalisk saccharosegradient føjede man enkelt-strengede plasmid DNA, der bar cDNA sekvenser, til denatureret oligo(dG)endeforlænget pUC9 og man syntetiserede den anden streng under anvendelse af DNA-polymerase (Klenow) og tilsætning af alle fire dNTP'er. Man kon-25 struerede klon 2 (pPAL2) under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Gubier og Hoffman (1982). Den første streng cDNA-kopi blev syntetiseret under anvendelse af revers transkriptase og en 19-mer oligodesoxynucleotid primer (GATCAGAGGGTTGTCGGTC), der var komplementær til pal 30 mRNA. RNA i RNA-DNA-hybriden blev derefter hakket med RNase H, og man erstattede RNA-strengen med DNA ved hjælp af E. coli DNA-polymerase, idet man benyttede det hakkede RNA som skabelon. Det dobbeltstrengede DNA blev 10 DK 175010 B1 derefter forsynet med lige ender ved hjælp af T4 DNA-polymerase, endeforlænget med oligo(dC) og føjet til oligo(dG)endeforlænget pBR322. Man transformerede cDNA-kloner frembragt under anvendelse af begge fremgangsmå-5 der i E.coli JM83, og gennemsøgte kolonier for PAL cDNA-sekvenser under anvendelse af [a-32P] dATP-mærkede pHG3 restriktionsfragmenter.

I fig. 3; de fundne aminosyresekvenser i de fem tilfældigt afledte peptidfragmenter betegnes ved streg-10 markering ovenover de relevante aminosyrerester. Intro-nerne er mærket IVS 1-6, og sekvensen, der er fælles for alle seks, er betegnet ved understregning af den relevante region, en punkteret linie over den 5' ikke-kodende region repræsenterer den TC rige region i denne 15 sekvens, hvorimod understregningen og stregmarkeringen ovenover umiddelbart nedstrøms derefter betegner en re-petitiv region. Sekvensen strækker sig fra BclI-stedet anbragt mest til venstre i fig. 1 og til 3'-enden af cDNA-klonen PPAL1 (fig. 2).

20 derefter betegner en repetitiv region. Sekvensen strækker sig fra BclI-stedet anbragt mest til venstre i fig.

1 og til 3'-enden af cDNA-klonen PPAL1 (fig.2).

I fig.4? den enkelte linie i pPALl og pPAL3 cirkulære afbildninger repræsenterer pUC9 og pUC8 afledt 25 DNA, hvorimod den enkelte linie i pPAL2 repræsenterer pBR322 DMA (se fig.2 ang. konstruktion af pPALl og pPAL2). Den dobbelte linie i pPAL2 repræsenterer en "intronfri" 5'-ende af PAL-genet, hvorimod den tykke linie i pPALl repræsenterer 3'-enden af genet. Man isolerede 5'-enden af PAL-genet som et l.Okb Pstl -30

Fspl-fragment fra pPAL2 og ligererede det til 1,25 kb Fspl-BamHl-fragment isoleret fra pPASl, der bar 3'-enden af genet. Man indsatte det ligerede fragment 11 DK 175010 B1 mellem BamHI- og Pstl-stederne 1 pUC8 til opnåelse af pPAL3. Positionerne for det translationelle start-codon (ATG) og stopcodon (TAG) i PAL-genet (se fig.3) er mærket med pile. Orienteringen af indsætningen i PAL-genet 5 er sådanti at transkriptionsgennemlæsning fra vektor-båret lac promotor (lac po) ikke vil forekomme.

I fig. 5 & 6; Fspl-stedet benyttet til at sammenføje disse to kloner til dannelse af pPAL3 er betegnet ved understrengning af de relevante nucleotider.

I fig.7; plasmidet pPAL4, der indeholder det komplette PAL-gen fra pPAL3 (fig.4), klonet i pUC9 som et EcoRI- Hind Ill-fragment, sådan at der kan foregå transkriptionel gennemlæsning fra den nabostillede lac promotor. Man bekræftede dannelse af genprodukt under anvendelse af plasmidrettet in vitro translationsud-15 styr fra Amersham International PLC. Prøver i de nummererede spor er som følger: 1, ingen DMA tilsat; 2, plasmid pUC9; 3, plasmid pPAL4. Molekylvægte for proteinmarkørerne gives som Mr.

I den følgende beskrivelse vil vi referere til 20 følgende almindelige fremgangsmåder:

Mikroorganisme stammer og plasmider

Mikrobestammer og plasmider anvendt ifølge op-findelsen er opregnet i tabel 1.

Medier E.coli-stammer blev dyrket i L-urt (1% trypton, 30 0,5% gærekstrakt, 0,5% NaCl). Medierne blev bragt til størkning ved tilsætning af 2% (w/v) Bactoagar (Difeo).

Man benyttede Ampicillin (100 yg ml"*·) til udvælgelse af væksttransformanter. Man påviste funktionel B— 12 DK 175010 B1 galactosidase ved tilsætning af 5-brora—4-chlor-indoyl— e-D-galaetoeid (X-Gal) til en slutkoncentration på 2 pg ml***·

Kemikalier 5 [a32p] dATP og cDNA-synteseudstyr stammede fra Amersham International. Agarose, restriktionsenzymer, T4 DNA-ligase, terminal desoxynucleotidtyl transferase og 17-mer universel sekvensprimer blev indkøbt fra 10 Bethesda Research Laboratories. Klenow DNA-polymerase stammede fra Boehringer Mannheim, og dT-behængt pUC9 var fra PL-Biochemicals. Man indkøbte revers transkrip-tase fra Anglicon Biotechnology Ltd. og alle andre reagenser fra Sigma Chemical Co. eller BDØ.

15

Tabel 1

Anvendte mikroorganismestammer og vektorer

Stamme 20 E.coli JM83 ara, (lac-pro), rpsL, thi, 080d lad, ZM15, Vieria & Messing (1982)

E.coli JM101 (lac-pro), supE, Thi/PlacI

ZM15 traD pro, Messing & Vieria (1982) 25 30 13 DK 175010 B1

Plasmider pUC9 AmpR Vieria & Messing (1982) pBR322 AmpR TetR Bolivar et al· (1977) 5 pGH3 AmpR (PAL genomisk klon)

Gilbert et al. (1977) pPAbl AmpR (3'-ende PAL cDNA klon)

Nyt plasmid pPAL2 AmpR (5‘-ende PAL cDNA clon) xg Nyt plasmid pPAL3 AmpR (bele PAL cDNA-gen)

Nyt plasmid pPAL4 AmpR (bele PAL cDNA-gen)

Nyt plasmid

Bacteriofaq 15 - M13mp8 Messing & Vieria (1982) M13mp9 Messing & Vieria (1982) DNA Manipulationer 20

Alle restriktionsenzymer og DNA/RNA modificerende enzymer blev benyttet i de puffere og under de betingelser som fabrikanten anbefalede. Transformations-teknik for plasmider og alle DNA manipulationer er tid-__ ligere blevet beskrevet (Minton et al., 1984).

2 b

Isolering af plasmid DNA

Man oprensede E.coli plasmider fra 1 liter L-urt-kulturen indeholdende ampicillin ved "Brij lysis” 30 og påfølgende CsCl-densitet gradientcentrifugering (Clewell og Helinski, 1969). Man benyttede hurtigkogningsmetoden ifølge Holmes og Quigley (1981), til gennemsøgning og isolering i lille skala for plasmider.

14 DK 175010 B1

Fremstilling af skabeloner ved lydbehandling

Kan fragmenterede det DMA/ der skulle sekvensopdel es i tilfældige stumpendede fragmenter ved frem- g gangemåden ifølge Deininger (1983). De opnåede fragmenter blev klonede i Smal-stedet på M13np8, og man fremstillede skabelon DMA som beskrevet af Sanger et al (1980).

10 Sekvensopdeling for nucleotider

Man benyttede til nucleotideekvensopdeling de-desoxymetoden ifølge Sanger et al (1980). De opnåede data blev samlet til en fuldstændig sekvens under anven-15 delse af computerprogrammer ifølge Staden (1980).

Isolering af PAL tnRNA

Man isolerede PAL mRNA på en m&de/ som tidligere er blevet beskrevet (Gilbert et al., 1985) under anven- 20 delse af en offentlig tilgængelig R.toruloides stamme IPO 0559 (ækvivalent til MCYC 1589 deponeret hos National Collection of Yeast Cultures, Norwich (GB) under Budapest traktats betingelser den 8. eeptemper 1986).

25 cDNA Kloning (syntese) i) Heidecker-Messing fremgangsmåden

Den anvendte fremgangsmåde var i det væsentlige som beskrevet af Heidecker og Messing (1983) . Total nlRNA 30 fra PAL inducerede R. toruloides celler blev sammenføjet med oligo dT-endeforlænget pUC9 og man syntetiserede den første streng cDNA-kopi under anvendelse af revers transkriptase og under tilstedeværelse af alle 4 15 DK 175010 B1 dNTP'er. De nylig syntetiserede strenge blev endeforlænget med oligo dC under anvendelse af terminal desoxy-nucleotidyl transferase. Efter fraktionering på en alkalisk saccharosegradient sammenføjede man enkeltstrenget 5 plasmid DNA, der bar cDNA-sekvenser, til denatureret oligo dG-endeforlænget pUC9, og man syntetiserede den anden streng under anvendelse af Klenow DNA-polymerase og tilsætning af alle 4 dNTP^er.

10 ii) Gubler-Hoffman fremgangsmåden

Den anden fremgangsmåde anvendt til syntese af c DNA var ifølge Gubier og Hoffman (1983). Man syntetiserede den første streng cDNA-kopi under anvendelse af revers transkriptase og en 19-mer primer (GATGA-15 GAGGGTTGTCGGTC), der var komplementær til PAL mRNA. Derefter "hakkede" man RNA-DNA-hybridet med RNaseH og erstattede RNA-strengen med DNA ved hjælp af E. coli DNA polymerase, idet man benyttede det hakkede RNA som skabelon. Man forsynede det dobbelt-strengede DNA med stum-20 pe ender ved hjælp af T4 DNA-polymerase, endeforlænget med oligo dC, og sammenføjede det med oligo-dG endeforlænget pBR322.

Påvisning af PAL cDNA-kloner 25

Man transformerede plasmid DNA-bær ende cDNA indsætningsstykker i E.coli JM83 og gennemsøgte Amp^ -trans formanterne for PAL specifik DNA. Dette blev gjort ved lokal kolonihybridiBering (Grunstein og Ho- gness, 1975), idet man benyttede radioaktivt mærkede 30 pHG3 DNA-under fragmenter, der bar dele af PAL-genet.

16 DK 175010 B1

Aminoeyresekvens

Man isolerede peptidfragmenter af renset (ifølge Gilbert et al., (1985)) PAL-protein som tidligere bes-^ krevet (Minton et al., 1984). Man foretog aminosyresek-veneopdeling under anvendelse af automatiseret Edman-nedbrydning på en Applied Biosysteras gasfasesekvensopdeler, model 470A.

In vitro translatering 10

Det anvendte bakterielle ionfrie koblede transkriptions-translationssystem var en modifikation af syetemet først beskrevet af De Vries og Zubay (1967). E.coli S-30-ekstrakten og de supplementerende 15 opløsninger, der var nødvendige til in vitro eksprime-ring af gener indeholdt i et bakterielt plasmid, blev indkøbt som udstyr fra Amersham International PLC. De producerede proteiner blev mærket med 35g-methionin (Amersham) og analyseret ved hjælp af SDS-PAGE på 12% 20 acrylamidgel (Laemmli, 1970). Man tørrede gel'erne, før de blev autoradiograferet i 16 timer.

1. Nucleotidsekvensopdeling af den PAL genomiske klon.

2^ Det er tidligere blevet vist (Gilbert et al, 1985), at PAL-genet optager en 2,5 kb region DMA i et 6,7 kb BclI-fragment klonet i pUC8 til opnåelse af det rekombinante plasmid pHG3 (se fig.l). Største parten af genet fandtes på et 3 kb BamHI-fragment, mens den 30 resterende 5'-ende af genet lå på et 0,7 kb BamHI-BClI- fragment. I overensstemmelse hermed isolerede man 3 kb fragmentet fra en passende klon (fragment 2, fig 1) og man klonede tilfældige underfragmenter frembragt ved 17 DK 175010 B1 lydbehandling (Deininger, 1983), i Ml3mp8. Man fremstillede ca. 250 skabeloner og sekvensopdelte dem, idet man samlede opnåede data til en fuldstændig sekvens under benyttelse af computerprogramer fra Staden (1980)· 5 Sekvensen for 5'-enden af genet blev opnået ved posi-tionsdirigeret kloning af relevante BclI-BamHI, BclI-Sall og BamHI-Sall-fragmenter (region 1, fig.l) i passende steder på M13mp8 og M13mp9. Bestemmelse af sekvensen for DMA, der omfatter BamHX-stedet blev opnået ved kloning af Sall-Xhol-fragmentet 3, der ses 1 10 fig.l.

Translatering af den relevante DNA-streng fra den eekvensopdelte region tydede på, at der ikke fandtes en åben læseramme (ORF), der var i stand til at kode for PAL. Man fik dog bekræftet, at denne region virkelig ko-15 dede for PAL, ved at sammenligne de translaterede ami-nosyresekvenser med den påviste sekvens for 5 tilfældige afledte peptidfragmenter. Alle 5 peptidsekvenser lå inden i den translaterede sekvens, men fandtes i forskellige tranelationelle læserammer (fig.2.). Fraværet 2o af en sammenhængende åben læseramme var et tegn på, at PAL-genet i lighed med andre fungale gener indeholdt introner.

2. Isolering af cDNA kloner, der bærer PAL-genet* 25

Til opnåelse af identifikation af de afbrydende sekvenser i PAL besluttede man sig til at onflclone genet fra cDNA. I de første eksperimenter benyttede man sig af fremgangsmåden ifølge Heidecker-Messing (1983) under anvendelse af vektoren pUC9 og renset PAL mRNA. Kloner, 30 der bar PAL DNA-sekvenser, blev identificeret under anvendelse af 3 kb BamHI-BclI-fragmenter fra pHG3 som en DNA-sonde. Den største opnåede klon pPALl indeholdt ca.

1,3 kb fra 3*-enden af PAL-genet (fig.3). Mern opnåede 18 DK 175010 B1 5' »enden af genet ved kloning af C-behængt cDNA fremstillet ved fremgangsmåden ifølge Gubier og Hoffman (1983), i G-behængt pBR322 til opnåelse af pPAL2. I dette tilfælde var prime ren, der blev benyttet under 5 syntesen af den første streng, et syntetiseret 19-mer oligonucleotid, der var komplementær til den PAL-kodende streng 150 bp nedstrøms fra 5'-enden af det tidligere opnåede cDNA (se fig. 3). Man bestemte nu-cleotideekvensen for de to cDNA kloner ved positionsdi-lQ rigeret kloning af passende restriktionsfragmenter i M13mp8 og M13rap9.

3. Identifikation af PAL intronerne·

Sekvenspåvisning i de to kloner bekræftede til-15 etedeværelsen af 6 introner i den kodende sekvens for PAL. Således findes de seks regioner af PAL, der er mærkede IVS1 til IVS6, slet ikke i de tilsvarende regioner af pPALl og pPAL2. Undersøgelse af de seks manglende regioner viste, at de alle indeholdt nucleoti-20 derae CAG ved deres 3'-ender og udviste fuldstændig overensstemmelse til consensus intronacceptorsekvensen, som man almindeligvis observerer hos eukaryotiske gener (Mount, 1982). Et antal sekvenser ved 5'-enden af visse af disse introner udviste mindre konformitet til den eukaryotiske consensus donorsekvens (GTA/GAGT). Således 25 var donorsekvenserne i IVS2, 4 og 5 henholdsvis GTGCGT, GTGCGC og GTGCGC. Man har vist, at intronerne i eukaryotiske gener almindeligvis indeholder sekvenser, der er nødvendige til nøjagtig sammensplejsning af de mellemliggende ikke-kodende regioner. Sekvenser, der sva-30 rer til consensussekvenser, som man ser hos introner i aindre eukaryoter (f.eks. TACTTAACA i S.cerevisae; se Orbach et al., 1986), findes ikke i R.toruloides intro- 19 DK 175010 B1 nerne. På deres sted findes en sekvens, der svarer til consensus G/ANG/CTGAC (den relevante sekvens i hver in-tron er blevet understreget i fig.3). En sådan sekvens 5 kan evt. være specifik for R.toruloides og tætbeslægte-de organismer.

Man har vist, at PAL-genet ikke eksprimeres hverken i E.coli (Gilbert et al., 1985) eller S.cerevisae (Tully og Gilbert, 1985). Grunden til mangel på ek-10 spression i den først nævnte er uden tvivl tilstedeværelsen af introner i PAL-genet. Yderligere forklarer forskellene i nucleotidsekvenserne i PAL-intronerne og hvad man finder i S.cerevisae introner, skønt S.cerevisae er i stand til at splejse, introner sandsynligvis, at denne gær ikke kan eksprimere R.toruloides 15 PAL-genet.

4. Frembringelse af et sammenhængende cDNA PAL-gen.

Fremgangsmåden benyttet ved kloningen af PAL-20 genet fra cDNA førte til to kloner, pPALl der bar 3'-enden af genet, og pPAL2, der bar 5'-enden af genet.

Man konstruerede et tredie plasmid, der bar hele PAL- struktursekvensen, idet man amalgamerede indsætnings- stykkerne fra de ovennævnte to plasmider. Dette opnåede 25 man ved at isolere et 1,0 kb Fspl-PstI-fragment fra * pPAL2, der bar 5"-enden af plasmidet og ligering af dette til et 1,25 kb Fspl-BamHI-fragment, der bar 3'enden af struktursekvensen og var isoleret fra pPALl. Derefter indsatte man det ligerede DNA i pUC9, spaltet med Pst I 30 og BamHI (fig. 4) . Af denne grund bærer plasmidet pPAL3 den fuldstændige PAL-struktursekvens, men mangler alle 6 introner fundet i det naturlige R. toruloides kromosomgen.

_ / 20 DK 175010 B1 5. Syntese af PAL-protein.

Man klonede fragmentet, der indeholdt det fuldstændige intronfrie PAL-gen fra pPAL3, i pUC-plasmider 5 i begge orienteringer i forhold til lac promotoren til opnåelse af pPAL3 (pUC8) og pPAL4 (pUC9). I pPAL4 er PAL-genet i fase med lacZ promotoren fra pUC9 og man har påvist syntese af PAL-proteiner i et plasmidrettet in vitro translationssystem. Dette vises i fig. 7 . Mår PAL-genet står i modsat orientering (pPAL3), frembringes ingen PAL-protein. I Øjeblikket udvikles vektorsystemer til opnåelse af eksprimering af PAL-genet i Saccharoray-ces cerevisie.

21 DK 175010 B1

LITTERATUR

Ambrus, C.M., J.L. Ambrus, C. Hoarvath, H. Pedersen, S. Sharma. C. Kent, E. Mirand, R. Guthrie, og T. Paul. 1978. Phenylalanine depletion for the management of phenylketonuria: use of enzyme reactors with immobilized 5 enzymes. Science 201: 837-839.

Attridge, T.H., C.8. Jdnscn, og H. Smith. 1974. Density-labelling evidence for the phytochrome-mediated activation of phenylalanine ammonia-lyase in mustard cotyledons. Biochim. Biophys. Acta. 143: 440-451.

10 Boulivar, F.> R.L. Rodriquez, P.J. Green, M.C. Betlach, H.L. Heyneker og H.W. Boyer. 1977. Construction and characterisation of new cloning vehicles II. A multipurpose cloning system. Gene 2: 95-113.

Clewell, D.B., og D.R. He1inski. 1969. SupercoLied circular DNA-pcotein complex in E. co1i. Purification and induced conversion to an open circular form. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62: 1159-1166.

15

DeVries, J.K.f0g G- Zubay. 1967. DNA-directed peptide synthesis n. The synthesis of the -fragment of the enzyme A -gaiactosidase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 57: 1010-1012.'

Gilbert, H.J., J.R. Stephenson, og , M. Tully. 1983. Control of synthesis of functional mRNA coding for phenylalanine ammonia-lyase for • Rhodospor id mm toruloides. J. Bacteriol. 153·: 1147-1154.

20

Gilbert, H.J., og. M. Tully. 1982. Synthesis and degradation of phenylalanine ammonia-lyase of Rhodosporidiurn toruloides. J. Bacteriol. 150: 498-505.

Gilbert, H.J., I.N. Clarke, R.K. Gibson, J.R. Stephenson, and M. Tully.

1985. Molecular cloning of the phenylalanine ammonia lyase gene from 25 Rhodosporidium toruloides in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 161: 314-320.

Grunstein, M., og D.S. Hogness. 1975. Colony hybridisation: a method for the isolation of cloned DNA's that contain a specific gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3961-3965.

Gubier, U., og . B.J. Hoffman. 19831 A simple and very efficient method of 30 generating cDNA libraries. Gene 25: 263-269.

Heidecker, G., og j. Messing. 1983. Sequence analysis of zein cDNA; obtained by an efficient mRNA cloning method. Nacl. . Acids. Res. 11.: 4691-4906.

Holmes, D.S., og M. Quigley. 1981. A rapid boiling method for the 35 preparation of bacterial pLasmids. Anal. Biochem. 114: 193-197.

Claims (10)

1. 23 DK 175010 B1
2. 1. Intronf ri strukturselcvens stammende fra den tilsvarende intronholdige struktursekvens fra den euka-ryotiske mikroorganisme R. toruloides, idet begge se-5 kvenser koder for samme produkt, kendetegnet ved, at den intronfrie sekvens er i stand til at ekspri-mere phenylalanin ammoniaklyase ("PAL") eller et poly-peptid, der opviser PAL aktivitet, i en prokaryotisk eller eukaryotisk mikroorganisme.
3. 2. Intronfri struktursekvens kendeteg net ved, at den har en struktur identisk med strukturen for PAL genet fundet i cDNA opnåeligt ved enten at (a) anneale total mRNA fra PAL inducerede R. toruloides celler til med oligo dT endeforlænget pUC9, syntetisere 15 den første streng cDNA kopi ved brug af revers tran-skriptase i nærvær af alle 4 dNTP'er, endeforlænge de nysyntetiserede strenge med oligo dC ved brug af terminal desoxynucleotidyltransferase, fraktionere på en alkalisk saccharosegradient, anneale enkeltstrenget plas- 20 mid DNA bærende cDNA sekvenser til denatureret oligo dG endeforlænget pUC9 og syntetisere den anden streng med Klenow DNA polymerase i nærvær af alle 4 dNTP-er; eller (b) syntetisere en cDNA streng fra total mRNA ved brug af revers transkriptase og en 19-mer primer med sekven- 2. sen GATGAGAGGGTTGTCGGTC, der er komplementær til PAL mRNA, hakmærke RNA i den herved producerede RNA-DNA hybrid med RNAaseH og erstatte det med DNA ved brug af E. coli DNA polymerase og ved brug af det hakmærkede RNA som primer; 30 eller en sekvens med en nucleotidsekvens, der koder for samme aminosyrer som denne sekvens. 24 DK 175010 B1
4. 3. Sekvens ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den mangler nogle baser eller inkluderer nogle yderligere baser eller har visse codoner erstattet med andre codoner, forudsat at sekvensen koder for PAL eller 5 for et polypeptid, der opviser PAL .aktivitet.
5. 4. Rekombinant DNA molekyle, kendetegnet ved at indeholde en sekvens ifølge krav 1.
6. 5. Rekombinant DNA molekyle, kendeteg -net ved at indeholde en sekvens ifølge krav 2 eller 10 krav 3.
7. 6. Molekyle ifølge krav 4 eller krav 5, kendetegnet ved, at det er et plasmid.
8. 7. Plasmid ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det er en vektor og også indeholder en ekspres- 15 sionskontrolsekvens operativt forbundet til den nævnte sekvens og/eller transkriptions/translations-signaler egnede til PAL eller et polypeptid, der opviser PAL aktivitet, fra E. coli K12, Bacillus subtilis, Saccharomy-ces cerevisiae, Pseudomonas putida, Erwinia chrysanthemi 20 eller en pattedyrscellelinie. S. Plasmid ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det indeholder et ribosombindingssted opstrøms for translationsstarten for nævnte sekvens og tran-skriptionssignaler stammende fra S. cerevisiae phos- 25 phoglyceratkinase og mating faktor sekvenser anbragt 5'-stillet for ribosombindingsstedet.
9. 9. Rekombinant DNA molekyle, kendetegnet ved, at det består af · en sekvens ifølge krav 2 indsat i plasmidet pUC9, hvor sekvensen er i fase med 30 lac Z promotoren fra pUC9.
10. 10. Værtsmikroorganisme, kendetegnet ved, at det er E. coli transformeret med et rekombinant DNA molekyle ifølge krav 5.